Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза антибиотика тобрамицина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза антибиотика тобрамицина"

На правахрукопи( /

Махортов Владимир Леонидович

РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩАЯ МАЛООТХОДНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ БИОСИНТЕЗА АНТИБИОТИКА ТОБРАМИЦИНА

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени КИ. Скрябина (МГАВМиБ)» и Центре военно-технических проблем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны Российской Федерации (ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ).

Научный руководитель: доктор биологических наук

Мирзаев Микаиль Нурбагандович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рубан Евгений Сергеевич кандидат биологических наук Тихонов Георгий Игоревич

Ведущая организация: Государственное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВНИИЭВ)"

Защита состоится 21 декабря 2004 года в 10.00 часов на заседании диссертационного советаД-220.042.01 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (095) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Брылина В.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В обеспечении эффективного лечения населения от инфекционных заболеваний, в том числе от опасных и особо опасных инфекций, важное место занимают антибиотические средства. Роль их значительно повышается при осложнении санитарно-эпидемической обстановки и ликвидации вспышек инфекционных заболеваний. Особое значение в расширении номенклатуры противомик-робных лекарственных средств имеет дальнейшее развитие производства антибиотиков, основанного на отечественных технологиях, сырье и оборудовании.

Значительное место в производстве антибиотиков отводится препаратам, относящимся к классу аминогликозидов. Данная группа антибиотиков обладает широким спектром антибактериального действия в отношении многих возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе особо опасных болезней человека и животных.

Из всего ряда аминогликозидов в бывшем СССР был организован промышленный выпуск стрептомицина, канамицина, гентамицина, не-омицина и сизомицина, тогда как производство тобрамицина не налажено и в настоящее время. Кроме того, общий уровень производства аминогликозидов за последние 8 лет в снизился России более чем в четыре раза. При этом основная масса антибактериальных лекарственных препаратов выпускается из импортных субстанций.

Анализ технологических схем получения аминогликозидных антибиотиков, и в частности тобрамицина, показывает, что процесс выделения и очистки готового продукта из культуральной жидкости сопровождается образованием большого количества как жидких, так и твердых отходов производства, в том числе и мицелиальных.

В 1992 году было издано распоряжение Правительство РФ № 1463-р "О создании на базе Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ производственных мощностей по выпуску антибиотиков аминогликозидного ряда". В этой связи представляется необходимым выбор экономически выгодных и экологически целесообразных способов утилизации выше упомянутых отходов производства.

Применяемые способы утилизации твердых мицелиальных отходов не всегда могут быть признаны удовлетворительными как по технико-экономическим, так и по экологическим показателям. С экономической точки зрения, уничтожение твердых отходов микробиологических производств, являющихся богатейшим потенциальным источником белко-

вых веществ, углеводов, липидов, а также свободных аминокислот и нуклеиновых кислот, является неоправданным.

Более перспективным представляется использование твердых ми-целиальных отходов в качестве компонентов питательных сред, применяемых при микробиологическом синтезе. Многочисленными исследованиями показано, что по химическому составу мицелиальные отходы являются полноценными источниками азота и вполне сравнимы с соевой мукой и кукурузным экстрактом. По мнению ряда отечественных и зарубежных специалистов, использование твердых мицелиальных отходов в качестве компонентов питательных сред может позволить эффективно утилизировать отработанные производственные отходы и значительно сократить их выбросы в окружающую среду.

В связи с вышеизложенным представляются актуальными исследования, направленные на разработку ресурсосберегающих малоотходных технологий производства аминогликозидных антибиотиков.

Цель и задачи исследований. Целью научных исследований является ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза антибиотика тобрамицина.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность использования гидролизатов мицелиальных отходов в качестве компонентов питательных сред.

2. Разработать лабораторную технологию биосинтеза тобрамицина с использованием ферментативных гидролизатов мицелиальных отходов.

3. Разработать ресурсосберегающую малоотходную технологию биосинтеза тобрамицина в ферментерах.

4. Наработать экспериментальные образцы и провести оценку воспроизводимости разработанной технологии биосинтеза тобрамицина.

5. Оценить экономическую эффективность разработанной технологии.

6. Разработать и утвердить нормативную документацию для лабораторного производства и контроля качества субстанции тобрамицина.

Научная новизна. Впервые в отечественной практике выявлена возможность использования различных видов гидролизатов мицелиаль-ных отходов производства тобрамицина в качестве компонентов питательных сред при культивировании Stгeptomyces cгemeus subsp. tobгami-cyni - продуцента небрамицинового комплекса, подобраны оптимальные условия получения гидролизатов и составы питательных сред.

Практическая значимость. Разработанная ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза тобрамицина позволяет получать культуральную жидкость с антибиотической активностью не менее 1000 МКГ'СМ5 с преобладанием карбамоилтобрамицина, полностью утилизировать мицелиальные отходы, а также использовать побочный продукт биосинтеза - апрамицин для ветеринарных целей.

Рекомендации и разработки по данной проблеме предполагается использовать в практической работе по созданию промышленного производства антибиотика тобрамицина.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научно-практических конференциях Центра ВТП БЗ НИИ МО РФ (г. Екатеринбург, 2000, 2001,2004 г.г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза тобрамицина позволяет воспроизводимо получать культу-ральную жидкость с антибиотической активностью не ниже регламентной и полностью утилизировать мицелиальные отходы, образующиеся на стадии выделения.

2. Полученные по разработанной технологии экспериментальные образцы субстанции тобрамицина и апрамицина сульфата полностью отвечают требованиям нормативной документации.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практическое использование полученных результатов исследований, библиографический список, приложения.

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 28 таблицами. Список использованной литературы включает 119 источников, из них 8 - зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа была выполнена на базе Центра военно-технических проблем биологической защиты научно-исследовательского института микробиологии Министерства обороны Российской Федерации и кафедры биотехнологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

В качестве продуцента тобрамицина использовали культуру Stгep-tomyces cгemeus subsp. tobгamycini штамм № 9871, продуцирующую

комплекс аминогликозидных антибиотиков (небрамициновый комплекс), основными компонентами которого являются карбамоилтобра-мицин, апрамицин и карбамоилканамицин В. Штамм № 9871 депонирован в коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики (№ S-794), с 1992 г. находится в коллекции Центра ВТП БЗ НИИ микробиологии МО РФ и систематически репродуцируется. Культурально-морфологические свойства используемых культур штамма соответствовали его паспортным характеристикам.

В качестве тест-микроорганизма использовали Bacillus, subtilis АТСС 6633.

При разработке малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина в колбах в качестве исходных сред использовали регламентные питательные среды, применяемые з существующей технологии производства тобрамицина и являющиеся контрольными [суммарная активность культуральной жидкости (КЖ), полученная на указанных средах, принималась за 100%].

При изучении влияния на биосинтез тобрамицина гидролизатов мицелиальных отходов в регламентных питательных средах соевую муку заменяли на вводимые компоненты с перерасчетом по общему азоту, учитывая, что в регламентных средах концентрация общего азота составляла в среднем 120 и 200 мг% соответственно. При проведении исследований использовали кислотные, щелочные и ферментативные гидролизаты мицелиальных отходов, приготовленные в отделе питательных сред Центра ВТП БЗ. Подробная технология приготовления всех вариантов гидролизатов отражена в соответствующих разделах диссертации. В экспериментальных исследованиях использовали также жидкие и плотные питательные среды, рекомендованные Государственной фармакопеей XI (ГФ) для выращивания культур референс-штамма, контроля стерильности и определения активности антибиотиков.

В работе использовали сырье, реактивы и материалы, прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

Выращивание вегетативного посевного материала (ВПМ) и биосинтез тобрамицина осуществляли в колбах вместимостью 750 см3 на круговой качалке, а также в ферментерах вместимостью 12 дм3 (Ф1) и 100дм3 (БИОР-0,1) соответственно.

Для осуществления контроля процессов получения и выделения антибиотиков небрамицинового комплекса, оценки качества полуфабрикатов и готового препарата применялись микробиологические, хромато-

графические и фотометрические методы, методы поляриметрии, потен-циометрии, объемного и весового анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Характеристика мицелиальных отходов

Мицелиальные отходы получали из культуральной жидкости после выделения из нее антибиотиков. Характеристика мицелиальных отходов приведена в таблице 2.

Таблица 2 - Физико-химические показатели мицелиальных отходов производства тобрамицина

Представленные данные о физико-химических показателях мицели-альных отходов, образующихся при производстве тобрамицина, свидетельствовали об относительно высоком содержании в них общего азота.

Способы приготовления гидролизатов мицелиальных отходов

и оценка их качества Для более полного освобождения от антибиотиков и балластных веществ мицелиальные отходы промывали дистиллированной водой и фильтровали через бумажный фильтр. После чего мицелиальные отходы подвергали гидролизу тремя общепринятыми способами: кислотным, щелочным и ферментативным, которые чаще всего используют для расщепления белковых веществ. Кислотный гидролиз мицелиальных отходов проводили 3%-ми растворами соляной или серной кислот. Смесь выдерживали в автоклаве при температуре °С в течение

60 мин., после чего фильтровали. Щелочные гидролизаты получали, используя в качестве реагента 1%-й раствор гидроксида натрия. Гидро-

лиз проводили при температуре (100±1) °С в течение 60 мин, после чего фильтровали. Для приготовления ферментативного гидролизата использовали протеолитический фермент панкреатин из расчета 10 г-дм"3 и

поджелудочную железу в количестве 150 ГДМ . Гидролиз проводили при температуре (37±1) °С в течение 120 ч, после чего гидролизат фильтровали и в него добавляли консервант - хлороформ. Гидролизаты хранили при температуре (4±2) °С в течение 30 суток. Эффективность гидролиза оценивали как отношение концентрации аминного азота к концентрации общего азота. Характеристика гидролизатов мицелиаль-ных отходов представлена в таблице 3.

Таблица 3 - Физико-химические показатели гидролизатов мицели-альных отходов

Наименование гидролизата рн Общий азот, % Аминный азот,% Эффективность гидролиза, %

ФГМО* 7,7±0,1 41,2±0,8 28,3±0,7 68,7

СоКГМО 0,3+0,1 35,2±1,8 21,6±1,2 61,4

СеКГМО 0,6±0,1 26,3±1,6 11,6±0,4 44,1

ЩГМО 12,6+0,3 29,0±1,4 8,2±0,7 28,3

*ФГМО- ферментативный, СоКГМО-солянокислотный, СеКГМО-серкнокислотный, ЩГМО-щелочной гидролизаты МЦО

Сравнительный анализ данных показывает, что при использовании щелочного реагента наблюдается самая низкая эффективность гидролиза - 28 %. Наибольшую глубину расщепления пептидных связей обеспечивает ферментативный гидролиз: эффективность гидролиза составляла около 69 %.

Полученные данные явились основанием для проведения экспериментов по изучению влияния питательных сред, содержащих различные гидролизаты мицелиальных отходов, на рост, развитие культуры штамма-продуцента и ее способность синтезировать небрамициновый комплекс.

Изучение возможности использования гидролизатов мицелиальных отходов в качестве компонентов питательных сред

Результаты проведенных исследований, данные которых представлены в таблице 4, показали, что замена в питательной среде соевой муки на щелочные и кислотные гидролизаты оказывает неблагоприятное влияние на рост, развитие культуры и способность к антибиотикообра-зованию.

Таблица 4- Показатели качества посевного материала, выращенного на экспериментальных средах, содержащих гидролизаты М11О

Наименование гид-ролизата

Замена муки на гидролизаты МЦО,%

Показатели качества

Уровень накопления биомассы, %

Способность к антибиоти-кообразова-нию,%

Состав НБК

ФГМО

25

14,8

98,5

КТ>А

50

14,3

96,7

КТ>А

75

7,0

87,5

КТ=А

100

5,0

83,6

КТ~А

СоКГМО

25

14,0

94,0

КТ>А

50

6,0

82,3

КТ>А

75

5,3

79,6

КТ>А

100

18,2

34,1

А>КТ

СеКГМО

25

6,0

68,0

КТ=А

50

3,0

63,7

КТ=А

75

2,0

19,0

КТ=А

100

3,0

8,3

следы КТ и А

ЩГМО

Контроль

25 50 75 100

6,1 3,0 3,6 1,5 14,0-17,0

11,0

100,0

следы КТ и А

КТ>А

Наименьшее угнетающее влияние на способность культуры штамма 9871 продуцировать небрамициновый комплекс оказывало использование вегетативного посевного материала, выращенного на среде с 2550%-й заменой соевой муки на ферментативный гидролизат, суммарная активность культуральной жидкости составила 97- 98 % от контроля.

Следующим этапом наших исследований было изучение возможности использования гидролизатов мицелиальных отходов в качестве компонента питательной среды для биосинтеза. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Влияние экспериментальных питательных сред на

биосинтез небрамицинового комплекса

Наименование гидроли-зата Замена соевой муки на гидролизаты МЦО, % Характеристика КЖ на 5 сут культивирования

Уровень накопления биомассы, % Активность, % от контроля Состав НБК

ФГМО 10 43,5 103,4 КТ>А

20 41,0 101,1 КТ>А

30 34,6 86,7 КТ~А

50 27,2 66,4 А>КТ

СоКГМО 10 36,2 85,1 КТ>А

20 29,0 79,0 КТ>А

30 23,5 68,3 КТ~А

50 18,2 21,7 А>КТ

СеКГМО 10 38,0 82,8 КТ>А

20 34,0 74,5 КТ>А

30 29,6 66,4 КТ~А

50 10,0 21,3 АУСТ

ЩГМО 10 34,0 66,0 КТ>А

20 25,0 58,2 КТ>А

30 18,7 26,2 КТ=А

50 7,5 14,8 А>КТ

Контроль 0 35,0-49,0 100,0 КТ>А

Анализ полученных данных показал, что уже при 10-20 % замене соевой муки на кислотные и щелочные гидролизаты происходит снижение синтеза небрамицинового комплекса. Суммарная антибиотическая активность культуральной жидкости составляла от 58 до 83 % от контроля. При использовании 10-20%-й замены муки на ферментативный гидролизат активность культуральной жидкости составила соответственно 103 и 101 %.

При 50%-й замене соевой муки на различные гидролизаты мицели-альных отходов происходила не только задержка роста и развития культуры, но и достаточно выраженное угнетение способности культуры

синтезировать небрамициновый комплекс. При этом наблюдался сдвиг в соотношении антибиотиков в синтезируемом комплексе в сторону увеличения апрамицина.

Учитывая полученные данные, в последующих исследованиях по разработке малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина представлялось перспективным использование экспериментальных сред с 50%-й заменой соевой муки для получения вегетативного посевного материала и питательных сред для биосинтеза с 20%-й заменой соевой муки на ферментативный гидролизат мицелиальных отходов для биосинтеза тобрамицина.

По данным литературы, для гидролиза белоксодержащего сырья используется широкий спектр протеолитических ферментов, таких как панкреатин, проторезин, амморезин и др. В наших исследованиях в качестве протеолитических ферментов были выбраны панкреатин и поджелудочная железа как наиболее доступное сырье.

Из данных, представленных в таблице 6, видно, что процесс гидролиза мицелиальных отходов, независимо от вида используемого протео-литического агента, наиболее интенсивно протекает в течение первых 5 ч, после чего в течение 120 ч происходит лишь незначительное расщепление белков и накопление аминного азота.

Таблица 6 - Эффективность гидролиза мицелиальных отходов в

зависимости от вида протеолитического агента

Продолжительное^ Показатель эффективности гидролиза,%,

гидролиза,ч при использовании...

панкреатина поджелудочной железы

1 21,8 43,7

2 28,8 49,5

3 39,6 51,1

4 44,6 53,1

5 54,0 60,1

6 55,1 60,4

12 56,4 62,0

24 57,3 61,1

48 59,3 61,7

72 59,3 66,0

96 62,0 67,0

120 62,2 67,4

Эффективность гидролиза при использовании поджелудочной железы на 5 и 120 ч составила соответственно 60 и 67 %, а при использовании панкреатина - 54 и 62 %. Процесс гидролиза практически прекращается только на 5 сутки. Поэтому для дальнейших исследований были выбраны 5- и 120-часовые ферментативные гидролизаты мицели-альных отходов, которые незначительно различались по показателю эффективности.

С целью изучения возможности использования данных гидролиза-тов мицелиальных отходов в качестве компонентов питательных сред были приготовлены экспериментальные среды для выращивания вегетативного посевного материала с 50 % заменой соевой муки и среды для биосинтеза небрамицинового комплекса с заменой 20 % соевой муки на различные ферментативные гидролизаты. Основные характеристики экспериментальных и регламентных питательных сред представлены в таблицах 7 и 8.

Таблица 7 - Рост и развитие культуры продуцента тобрамицина на средах, содержащих ФГМО при 50%-ной замене соевой муки

Характеристика ФГМО Характеристика ВПМ на 24-26ч роста Характеристика КЖ на 5 сут культивирования

Протео-литиче-ский агент Продолжительность гидролиза, ч

Уровень накопления биомассы, % Активность, % от контроля Состав НБК

Панкреатин 5 16,0±1,2 100,1 КТ>А

120 16,2±0,7 103,3 КТ>А

Поджелудочная железа 5 17,0±0,9 101,6 КТ>А

120 15,4±0,8 102,3 КТ>А

Контроль 17,8±0,5 100,0 КТ>А

Анализ представленных данных показывает, что экспериментальные питательные среды, в состав которых введены ферментативные гидролизаты, приготовленные различными способами, соответствуют по показателям качества требованиям регламента, в том числе и по антибиотической активности культуральной жидкости.

Принимая во внимание то обстоятельство, что себестоимость панкреатического гидролизата выше, чем гидролизатов, полученных с использованием поджелудочной железы (стоимость 1 кг поджелудочной железы-15-20 руб., а панкреатина-700-800 руб.), продолжение исследо-

12

ваний с панкреатическими гидролизатами мицелиальных отходов представлялось нецелесообразным. Поскольку применение 5 - часового

Таблица 8 - Влияние питательных сред, содержащих ФГМО при 20%-ной замене соевой муки, на биосинтез небрамицинового комплекса

ферментативного гидролизата было выгодным с экономической точки зрения (в сравнении со 120-часовым), дальнейшие исследования проводились только с 5-часовыми ферментативными гидролизатами, полученными с использованием поджелудочной железы.

Разработка ресурсосберегающей технологии биосинтеза тобра-мицина в ферментерах и оценка ее воспроизводимости

На следующем этапе работы были проведены исследования с использованием разработанных экспериментальных питательных сред, результаты которых представлены в таблице 9.

Представленные данные показывают, что при пересеве вегетативного посевного материала, выращенного на среде с 50%-й заменой соевой муки на ферментативный гидролизат, на среду для биосинтеза, содержащую 20 % ферментативного гидролизата, синтез небрамицино-вого комплекса протекал на уровне контроля.

Для дальнейшего экспериментального обоснования разрабатываемой технологии была проведена проверка качества полученного на экспериментальной среде вегетативного посевного материала при культивировании на экспериментальной среде в ферментере БИ0Р-0,1. Выбор режима биосинтеза проводили с учетом имеющихся экспериментальных данных, полученных ранее при отработке существующей технологии получения тобрамицина.

Таблица 9 - Биосинтез небрамицинового комплекса на средах,

Номер се- Замена со- Характеристика ВПМ на 24 проста Замена соевой муки в Показатели процесса биосинтеза на экспериментальной ФПС

рии евой муки в ППС, % РН Уровень накопления биомассы, % ФПС, % рн Уровень накопления биомассы, % Активность, % от контроля

1 50 7,2±0,2 14,5±2,5 20 7,5±0,2 48,0±2,4 101,2

0 7,3 ±0,3 17,0±2,7 0 7,7±0,2 49,4±2,2 100,0

2 50 7,4±0,1 16,3±3,5 20 7,5±0,3 44,3±3,1 103,4

0 7,4±0,2 17,4±1,9 0 7,6±0Д 49,1±2,3 100,0

3 50 7,4±0,2 17,2±2,3 20 7,6±0,1 43,2±3,4 98,3

Результаты изучения динамики накопления небрамицинового комплекса показывают, что разработанные режимы биосинтеза тобрамици-

Рисунок - Динамика накопления небрамицинового комплекса при культивировании в БИОР-0,1 14

на в ферментере БИОР-0,1 обеспечивают получение культуральной жидкости с суммарной антибиотической активностью не менее 1000 с преобладанием карбамоилтобрамицина как на регла-

ментных, так и на экспериментальных питательных средах, содержащих ферментативный гидролизат. При этом синтез небрамицинового комплекса заканчивался в период с 96 до 120 ч роста, что также соответствует требованиям ранее разработанной технологии. Следует подчеркнуть, что при данных условиях биосинтеза к 96 ч культивирования в культуральной жидкости содержится до 27-30 % апрамицина, используемого, как известно, в ветеринарной практике. Данный антибиотик выделяется и очищается по технологии разработанной ранее специалистами Центра ВТП БЗ.

Для сравнительной оценки качества экспериментальных питательных сред, содержащих в своем составе ферментативный гидролизат ми-целиальных отходов были проведено три цикла культивирования в ферментере БИОР-0,1.Полученные результаты (таблица 10) показывают, что разработанная малоотходная технология биосинтеза тобрами-

Таблица 10 - Показатели качества экспериментальных серий КЖ, приготовленных в ферментере БИОР-0,1

Наименование стадии Показатели качества Требование, внесенное в регламент Номер серии

1 2 3

Выращивание ВПМ 2-й генерации в ферментере Ф1 Способность к ан-тибиотикообразова-нию, мкгсм" Не менее 1000 1320 1410 1360

Состав НБК по данным тех КТ>А КТ>А КТ>А КТ>А

Биосинтез тобрамици-на в БИОР-0,1 Суммарная активность КЖ, мкгсм'3 Не менее 1000 1490 1370 1450

Активность тобра-мицина, мкг см"3 Не менее 800 1100 1050 1110

Состав НБК по данным тех КТ>А КТ>А КТ>А КТ>А

Продолжительность ферментации, ч 96-120 120 120 108

цина при замене соответственно 50 % и 20 % соевой муки в питательных средах на ферментативный гидролизат мицелиальных отходов, обеспечивает получение культуральной ЖИДКОСТИ с суммарной антибиотической активностью в пределах 1300 - 1400 МКГСМ"3. Активность тобрамицина составила 1000 -1100 мкг-см"3

Воспроизводимость разработанной технологии получения субстанции тобрамицина и апрамицина сульфата оценивали посредством наработки ряда установочных серий препаратов, характеристики трех из которых представлены в таблицах 11 и 12.

Таблица 11 - Результаты испытаний экспериментальных серий тобрамицина, полученных по разработанной технологии

Номер серии Активность, мкг мг1 рН Потеря в массе при высушивании, % Сульфатная зола, % в пересчете на сухое вещество

1 950 10,4 5,0 0,04

2 920 10,3 3,6 0,10

3 949 10,4 4,4 0,07

М+т 0,95 940±12 10,4+0,1 4,3±0,4 0,07±0,03

Требования ВФС Не менее 900 От 9,0 до 11,0 Не более 8,0 Не бсшее0,3

Таблица 12 - Результаты испытаний экспериментальных серий апрамицина сульфата

Номер серии Активность, ми- мг"1 РН Потеря в массе при высушивании, % Сульфатная зола, % в пересчете на сухое вещество

1 465 5,3 з,з 0,73

2 520 5,8 4,0 0,85

3 508 5,5 4,3 0,68

М+m о,95 497±28 5,5±0,2 3,9±0,4 0,75±0,07

Требования ТУ Не менее 450 4,0-6,0 Не более 10,0 Не более 1,00

Как по представленным в таблицах показателям качества, так и по показателям, не отраженным в таблице, таким как растворимость, содержание специфических примесей, подлинность, безвредность полученные образцы субстанции тобрамицина и апрамицина сульфата соответствовали требованиям нормативной документации.

Экономическая эффективность разработанной технологии На заключительном этапе работы была проведена сравнительная оценка экономической эффективности существующей и разработанной технологий утилизации мицелиальных отходов. Расчетные данные представленные в таблице 12 показывают, что затраты на утилизацию мицелиальных отходов производства тобрамицина по предлагаемой технологии в 1,4 раза ниже, чем способом компостирования и в 3,1 раза -способом сушки.

Таблица 13 - Оценка экономической эффективности технологий утилизации мицелиальных отходов производства тобрамицина

Затраты на утилизацию 1 тонны мицелиальных отходов, (тыс. руб.) по

Наименование затрат технологии...

разработан- существующей

ной компостирование сушка

1 Материалы и сырье 8,10 10,90 10,56

2 Энергоресурсы 0,27 0,31 0,91

3 Содержание оборудования 12,70 37,56 92,37

4 Эксплуатация оборудования 4,32 12,52 30,79

5 Содержание сооружения 135,13 142,01 121,11

6 Эксплуатация сооружения 40,32 68,00 28,02

7 Транспортно-заготовигельные расходы 0,19 0,22 0,53

8 Оплата труда работающих 0,52 11,88 20,43

9 Общезаводские расходы 1,06 24,02 41,30

10 Отчисления на соцстрахование, пенсионный фонд, охрану труда 0,19 4,25 7,31

Себестоимость 202,80 311,47 353,33

Капитальные затраты (стоимость оборудования) 84,00 250,38 2158,20

Затраты на утилизацию 215,40 349,02 677,06

выводы

1. Впервые разработана ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза тобрамицина, заключающаяся в использовании ферментативных гидролизатов мицелиальных отходов производства данного аминогликозидного антибиотика в качестве компонента питательных сред, а также побочного продукта биосинтеза - апрамицина для ветеринарных целей.

2. Показана возможность использования различных видов гидроли-затов мицелиальных отходов (кислотных, щелочных, ферментативных) производства тобрамицина в качестве компонентов питательных сред для культивирования 81гер1ошусе8 сгешеш виЬвр. Югашюут - продуцента небрамицинового комплекса.

3. Показано, что введение пятичасового ферментативного гидроли-зата мицелиальных отходов в питательные среды взамен соответственно 50 % и 20 % соевой муки, позволяет полностью утилизировать мицели-альные отходы со стадии выделения и снизить количество соевой муки используемой в производстве тобрамицина.

4. Экспериментально подтверждено, что предлагаемая технология позволяет воспроизводимо получать субстанцию тобрамицина, полностью отвечающую требованиям нормативной документации, в том числе культуральную жидкость с антибиотической активностью не менее

1000мкгсм-3.

5. Затраты на утилизацию мицелиальных отходов производства тобрамицина по предлагаемой технологии в 1,4 раза ниже, чем способом компостирования и в 3,1 раза-способом сушки.

6. По результатам проведенных исследований разработан и утвержден в установленном порядке комплект нормативной документации, необходимой для лабораторного производства и контроля качества субстанции тобрамицина основания.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результаты исследований реализованы разработкой, согласованием и утверждением следующей нормативной документации:

- лабораторный регламент на производство субстанции тобрамици-на основания (Архив ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-461);

- лабораторный регламент на производство тобрамицина сульфата для инъекций 0,08 г (Архив ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - Инв. № Д-524);

- сборник методик по контролю процесса производства и оценке качества субстанции тобрамицина основания СТП-ОА-209-227-00

(Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № 148 И / М.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Бунаков Ю.П. Сравнение массообменных характеристик колб и ферментеров для биосинтеза антибиотиков / Бунаков Ю.П, Махортов В.Л., Махортова Е.Б. // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ (15 июля 1999 г.): "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". - Екатеринбург, 1999. - С. 26.

2. Забокрицкий А.Н. Морфологическая изменчивость и биосинтетическая активность культур штамма-продуцента тобрамицина / Забокрицкий А.Н.; Демина Л.В., Махортов В.Л. и др. // Материалы научной межучрежденчской конференции, посвященной 25-летию со дня создания отдела генетики бактерий НИИ микробиологии МО РФ (19-20 декабря 2000 г.): "Проблемы генетики, генной инженерии и генодиагностики опасных и особо опасных инфекций". Киров, 2000. - С. 79-81.

3. Забокрицкий А.Н. Изучение возможности использования антибиотиков в селекции продуцента тобрамицина / Забокрицкий А.Н., Демина Л.В., Махортов В.Л. и др. // Материалы научной межучреж-денчской конференции, посвященной 25-летию со дня создания отдела генетики бактерий НИИ микробиологии МО РФ (19-20 декабря 2000 г.): "Проблемы генетики, генной инженерии и генодиагностики опасных и особо опасных инфекций". Киров, 2000. - С. 79-81.

4. Забокрицкий А.Н. Хранение продуцента тобрамицина в лиофи-лизированном состоянии / Забокрицкий А.Н., Сапожникова О.Н., Махортов В.Л. и др. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2003. - № 1. - С. 63-65.

5. Махортов В.Л. Оптимизация процесса биосинтеза тобрамицина / Махортов В.Л., Бунаков Ю.П. // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ (15 июля 1999 г.): "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". - Екатеринбург, 1999. - С. 151.

6. Михайлов В.А. Разработка усовершенстсвованной технологии получения субстанции тобрамицина / Михайлов В.А., Садовой Н.В., Махортов В.Л. и др. // Сборник научных трудов ЦВТП БЗ. - Екатеринбург, 2000. - С. 1-178. - Не подлежит открытой публикации

7. Носков А.А. Способ выделения апрамицина / Носков АА, Вы-

дрин А.Ф., Махортов В.Л. и др. // Ветеринарная медицина. - 2003 -С. 28.

8. Протасов В.Л. Выделение и очистка тобрамицина / Протасов

B.Л., Михайлов ВА, Махортов ВЛ. // Материалы IX российского национального конгресса" Человек и лекарство" - М., 2002. - С. 2002. -

C.234.

9. Черкашина Н.В. Изучение возможности использования гидро-лизатов мицелиальных отходов производства антибиотиков в качестве компонентов питательных сред, применяемых при биосинтезе тобрами-цина / Черкашина Н.В., Епанчинцев АА., Махортов В.Л. и др. // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии Министерства обороны РФ (ноябрь-декабрь 1998г.): "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". - Киров, 1998. - С. 342.

10. Черкашина Н.В. Разработка технологии биосинтеза тобрамици-на и с использованием мицелиальных отходов / Черкашина Н.В., Ма-хортов В.Л., Бунаков Ю.П. и др. // Материалы Межучрежденческой научной конференции технологов (23-24 июня 2003 г.): "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". - Киров, 2003. - С. 56.

11. Черкашина Н.В. Изучение возможности использования гидро-лизатов мицелиальных отходов производства аминогликозидных антибиотиков в качестве компонентов ферментационных сред, применяемых при биосинтезе тобрамицина и гентамицина / Черкашина Н.В, Щербатова О.Н., Махортов ВЛ. и др. // Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 50-летию ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ (15 июля 1999 г.): "Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария". - Екатеринбург, 1999. - С. 278279.

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.06.2000 г. Подписано в печать 9.11.2004 Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,25

Печать авторефератов 730-47-74, 778-45-60 (сотовый)

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Махортов, Владимир Леонидович

ВВЕДЕНИЕ

I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Ресурсосберегающие малоотходные технологии в производстве антибиотиков - актуальная задача биотехнологии.

1.1 Основные направления разработки малоотходных технологий биосинтеза аминогликозидных антибиотиков.

1.2 Анализ применяемых способов утилизации твердых отходов микробиологических производств.

1.2.1 Использование твердых отходов для технических целей.

1.2.2 Применение твердых отходов в сельском хозяйстве в качестве кормовых добавок.

1.2.3 Переработка и утилизация твердых отходов методом биотермического обезвреживания (компостирования).

1.2.4 Использование твердых отходов и продуктов их переработки в качестве компонентов питательных сред при культивировании микроорганизмов.

II СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2 Материалы и методы.

2.1 Характеристика штамма-продуцента.

2.2 Питательные среды и растворы.

2.3 Методы.

3 Разработка ресурсосберегающей малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина.

3.1 Изучение возможности использования гидролизатов мицелиальных отходов в качестве компонентов питательных сред.

3.1.1 Получение гидролизатов мицелиальных отходов и приготовление на их основе питательных сред.

3.1.2 Изучение влияния питательных сред, содержащих гидролизаты мицелиальных отходов, на способность Streptomyces cremeus subsp. tobramycini (штамм 9871) синтезировать небрамициновый комплекс.

3.2 Разработка лабораторной технологии биосинтеза тобрамицина с использованием ферментативных гидролизатов мицелиальных отходов.

3.3 Разработка ресурсосберегающей малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина в ферментерах.

3.4 Наработка экспериментальных образцов и оценка воспроизводимости разработанной малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина.

3.5 Экономическая эффективность разработанной технологии.

III ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

IV ВЫВОДЫ.

V СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

VI РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза антибиотика тобрамицина"

В обеспечении эффективного лечения населения от инфекционных заболеваний, в том числе от опасных и особо опасных инфекций, важное место занимают антибиотические средства. Роль их значительно повышается при осложнении санитарно-эпидемической обстановки и ликвидации вспышек инфекционных заболеваний. Особое значение в расширении номенклатуры про-тивомикробных лекарственных средств имеет дальнейшее развитие производства антибиотиков, основанного на отечественных технологиях, сырье и обору; довании [3, 84].

Значительное место в борьбе с инфекционными заболеваниями отводится препаратам, относящимся к классу аминогликозидов. Данная группа антибиотиков обладает широким спектром антибактериального действия в отношении основных представителей грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Сходство структуры аминогликозидов определяет близкие свойства препаратов: антимикробное действие, фармакокинетические и токсические признаки. В терапевтических концентрациях они подавляют рост Е. coli, Salmonella, Shigella, Brucella, Versinia, Klebsiella, Enterobacter, Proteus, Serratic, Staphylococcus и др. Наибольшее практическое значение среди современные биосинтетических аминогликозидов имеют тобрамицин, гентамицин и сизоми-цин. Установлена высокая эффективность аминогликозидов при лечении гнойно-воспалительных процессов различной локализации: перитонита, сепсиса, послеоперационных нагноений, гнойных процессов мягких тканей, заболеваний органов дыхания [6,19,56,114].

Из всего ряда аминогликозидов в бывшем СССР был организован промышленный выпуск стрептомицина, канамицина, гентамицина, неомицина и сизомицина, тогда как производство тобрамицина не налажено и в настоящее время. Кроме того, общий уровень производства аминогликозидов за последние 8 лет снизился в России более чем в четыре раза [27,76,93]. При этом основная масса лекарственных препаратов выпускается из импортных субстанций.

Анализ технологических схем получения аминогликозидных антибиотиков, и в частности тобрамицина [63,74,109], позволяет выделить следующие основные особенности их производства:

- многостадийность процесса биосинтеза; высокие затраты сырьевых ресурсов, причем наибольшая доля расходуемого сырья приходится на стадию ферментации, поскольку выращивание продуцентов осуществляется с применением питательных сред, содержащих до 20-25 % сухих веществ [20];

- использование в качестве инградиентов питательных сред в значительном количестве органических продуктов, в частности пищевых, таких как глюкоза, крахмал, соевая мука и жиры;

- получаемые в результате ферментации культуральные жидкости, содержащие целевые продукты - антибиотики в концентрации, как правило, не более 1,5-2,0 %, представляют собой сложные многофазные системы, включающие наряду с клетками микроорганизмов непотребленные компоненты питательных сред, а также продукты метаболизма выращиваемых продуцентов; выделение и очистка готового продукта из культуральной жидкости, сопровождающаяся образованием большого количества как жидких, так и твердых отходов производства, в том числе и мицелиальных.

В 1992 году было издано распоряжение Правительство РФ № 1463-р " О создании на базе Центра ВТП БЗ производственных мощностей по выпуску антибиотиков аминогликозидного ряда". Планируемый промышленный выпуск аминогликозидных антибиотиков влечет за собой образование большого количества твердых мицелиальных отходов. В этой связи представляется необходимым выбор экономически выгодных и экологически целесообразных способов их утилизации.

Применяемые методы утилизации твердых отходов не всегда соответствуют требованиям как по технико-экономическим, так и по экологическим показателям. С экономической точки зрения, уничтожение твердых отходов микробиологических производств, являющихся богатейшим потенциальным источником белковых веществ (до 75 %), углеводов (до 50 %), липидов (до 20 %), а также свободных аминокислот и нуклеиновых кислот, является неоправданным [28,34].

Сложность осуществления переработки твердых отходов заключается чаще всего в технико-экономической нецелесообразности - дорогостоящее аппаратурное оформление - или в санитарных ограничениях. Так, например, в настоящее время для переработки твердых отходов, в том числе и мицелиальных, получил широкое распространение за рубежом способ компостирования, который начинает распространяться и в России [80]. Однако ограничением для распространения данного способа утилизации является необходимость достаточно большого пространства для приготовления буртов или приобретения специально предназначенных ферментеров с искусственно создаваемыми условиями.

Другим возможным направлением утилизации твердых отходов является их использование в сельском хозяйстве. Так, проведенные в 80-90-е годы прошлого века исследования подтверждают эффективность использования биомассы продуцентов гризеофульвина, олеандомицина, пенициллина, рибоксина, гентамицина в качестве корма, пищевых добавок, стимуляторов роста для пушных зверей [75,77], а также мицелиальных отходов производства тетрациклина и хлортетрациклина в промышленном птицеводстве. Мицелий продуцента тетрациклина, применяемый при выращивании цыплят, повышал сохранность и продуктивность бройлеров, что явилось основанием для рекомендации его использования в ветеринарной практике [29,30].

Однако одним из факторов, сдерживающих применение мицелиальных отходов при приготовлении кормов для сельскохозяйственных животных, является их низкая усвояемость, а также остаточное содержание антибиотиков медицинского назначения [75].

Более перспективным представляется использование твердых отходов в качестве компонентов питательных сред, применяемых при микробиологическом синтезе [5,16,62,96,103]. Так, сотрудниками ВНИИА проводились исследования по использованию мицелиальных отходов производства различных антибиотиков в составе ферментационных питательных сред для биосинтеза антибиотиков [58]. Авторы пришли к выводу, что по химическому составу мице-лиальные отходы являются полноценными источниками азота и вполне сравнимы с соевой мукой и кукурузным экстрактом. Показана возможность использования отработанного мицелия в составе ферментационных питательных сред для биосинтеза пенициллина, стрептомицина, тетрациклина и линкомицина.

Коллективом авторов Санкт-Петербурского государственного технологического института (Технического университета) разработана новая питательная среда для культивирования продуцента тетрациклина, содержащая в качестве источника азота ферментативный гидролизат мицелиальных отходов производства тетрациклина. Использование такой среды для биосинтеза тетрациклина позволило полностью исключить из состава среды кукурузный экстракт, увеличить выход тетрациклина, эффективно утилизировать отработанные мицели-альные отходы, значительно сократить их выбросы в окружающую среду [52].

В связи с вышеизложенным представляются актуальными исследования, направленные на разработку ресурсосберегающих малоотходных технологий производства аминогликозидных антибиотиков.

Цель и задачи работы. Целью настоящих исследований является разработка ресурсосберегающей малоотходной технологии биосинтеза антибиотика тобрамицина.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- анализ применяемых способов утилизации твердых отходов микробиологических производств;

- изучение возможности использования гидролизатов мицелиальных отходов в качестве компонентов питательных сред при производстве тобрамицина;

- разработка лабораторной технологии биосинтеза тобрамицина с использованием ферментативных гидролизатов мицелиальных отходов

- разработка ресурсосберегающей малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина в ферментерах;

- наработка экспериментальных образцов и оценка воспроизводимости разработанной малоотходной технологии биосинтеза тобрамицина;

- оценка экономической эффективности разработанной технологии.

Научная новизна работы заключается в том, что на основе экспериментальных исследований впервые в отечественной практике показана возможность использования различных видов гидролизатов мицелиальных отходов производства тобрамицина в качестве компонентов питательных сред при культивировании. Streptomyces cremeus subsp. tobramicyni - продуцента небрамици-нового комплекса, подобраны оптимальные условия получения гидролизатов и составы питательных сред.

Практическая ценность работы заключается в том, что разработанная ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза тобрамицина позволяет получать культуральную жидкость с антибиотической активностью не менее 1000 мкг см"3 с преобладанием карбамоилтобрамицина, полностью утилизировать мицелиальные отходы со стадии выделения, а также использовать побочный продукт биосинтеза - апрамицин в ветеринарной практике.

Рекомендации и разработки по данной проблеме предполагается использовать в практической работе по созданию промышленного производства антибиотика тобрамицина.

Реализация работы. По результатам исследований разработан комплект нормативной документации, необходимой для лабораторного производства и оценки качества субстанции тобрамицина основания:

1. Лабораторный регламент на производство субстанции тобрамицина основания ЛР 42-08179493-082-00, инв. № Д-461, 2000 г.

2. Лабораторный регламент на производство тобрамицина сульфата для инъекций 0,08 г ЛР 42-08179493-089-01, инв. № Д-524, 2001 г.

3. Сборник методик по контролю процесса производства и оценке качества субстанции тобрамицина основания СТП-ОА-209 - 227-00, инв. № 148 / И-М. 2000 г.

Научные положения, выносимые на защиту:

Разработанная ресурсосберегающая малоотходная технология биосинтеза тобрамицина позволяет воспроизводимо получать культуральную жидкость с антибиотической активностью не ниже регламентной и полностью утилизировать мицелиальные отходы.

Полученные по разработанной технологии экспериментальные образцы субстанции тобрамицина и апрамицина сульфата полностью отвечают требованиям нормативных документов.

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками, 28 таблицами, состоит из перечня обозначений и сокращений, введения, обзора литературы, собственных исследований с включением материалов и методов исследований и экономической эффективности разработанной технологии, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и рекомендаций по использованию научных выводов. Библиографический список содержит 119 источников, включая работы отечественных и зарубежных авторов.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Махортов, Владимир Леонидович

ВЫВОДОВ

1. При разработке промышленной технологии получения субстанции тобрамицина рекомендуется осуществлять биосинтез антибиотика культурой Streptomyces cremeus subsp. tobramicyni (штамм 9871) с использованием питательных сред на основе ферментативного гидролизата мицелиальных отходов собственного производства.

2. Субстанцию тобрамицина, получаемую по разработанной технологии, рекомендуется использовать для приготовления готовых лекарственных форм.

3. Апрамицина сульфат, выделяемый в качестве побочного продукта в виде водорастворимого порошка, рекомендуется использовать в ветеринарной практике для лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Махортов, Владимир Леонидович, Москва

1. А.С. № 1476898А2 СССР от 3 января 1989 г. Штамм актиномицета Streptomyces cremeus subsp. tobramycini продуцент антибиотиков не-брамицинового комплекса / Преображенская Т.П., Лапчинская О.А., Синягина О.П. и др.

2. Агрохимические методы исследования почв. М.: Наука., 1975.

3. Алазов А.Н. Ситуация на российском рынке лекарств / Алазов А.Н. // Медицинский курьер. 1997. - № 2 (3). - С. 24-25.

4. Ашмарин И.Г. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.Г. Ашмарин, H.JI Воробьев. Л., 1962.

5. Баранова И.П. Применение ферментных гидролизатов биомассы микроорганизмов в средах для культивирования Str. Lactis, продуцента низина / Баранова И.П., Егоров Н.С., Головкина Г.П., Григорян А.Н. // Антибиотики. 1980. - № 10. - С. 735-738.

6. Бережинская В.В. Экспериментальные и клинические данные об ото-токсических свойствах антибиотиков аминогликозидов (аминоцик-литолов) / Бережинская В.В., Долгова Г.В., Эйромаджанц А.А. и др. // Антибиотики. - 1983. - № 3. - С. 58-67.

7. Васильев П.С. Современные кровозаменители / Васильев П.С., Сузда-лева В.В., Неклюдов А.Д. и др. М., 1980. - С. 28-43.

8. Великая Е.И. Лабораторный практикум по курсу общей технологии бродильных производств (общие методы контроля) / Великая Е.И., Суходол В.Ф. М., 1983.

9. Влияние макро- и микроэлементов на биосинтез тобрамицина на синтетической среде / М.О. Моткова, Т.Н. Дробышева, Е.Г. Гладких // Антибиотики. 1982. - №10. - С. 24-28.

10. Временная фармакопейная статья 42-2011-90. Тобрамицин. Введ. 25.10.1990.

11. Гиляров М.С. Зоологические методы компостирования органических отходов / Гиляров М.С.// Весник АН СССР. 1982. - № 9. - С. 80-83.

12. Государственная фармакопея СССР. XI изд.- М., 1989. Вып. 1. - 1990. - Вып. 2.

13. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. XI изд,-М., 1987. - Вып. 1.

14. Государственная фармакопея СССР. Общие методы исследований. Лекарственное растительное сырье XI изд.- М., 1990. - Вып. 2.

15. Григорян А.Н. Биотехнология и биоинженерия / Григорян А.Н., Голе вина Г.П // Сб. науч. ст. Рига, 1978. - № 2. - С. 56-57.

16. Добжицкий Я. Химический анализ в сахарном производстве / Я. Доб-жицкий М., 1985.

17. Евтушенко Н.С. Современное состояние анализа и стандартизация аминогликозидных антибиотиков / Евтушенко Н.С., Кудрявцева М.П // Фармация. 1988. - № 5. - С. 79-82.

18. Егоров Н.С. Учение об антибиотиках / Н.С. Егоров. М., 1994.

19. Жуковская С.А. Определение фильтрационных характеристик культу-ральных жидкостей продуцентов антибиотиков / Жуковская С.А., Линькова О.С. // Антибиотики. 1975. - № 3. - С. 217-221.

20. Забокрицкий А.Н. Хранение продуцента тобрамицина в лиофилизиро-ванном состоянии / Забокрицкий А.Н., Сапожникова О.Н., Махортов В.Л. и др. // Вестник уральской медицинской академической науки. -2003.-№ 1.-С. 63-65.

21. Замена кукурузного экстракта мицелием при ферментации пенициллина / Орлов И.А, Березовская А.И., Соколовская А.Е. и др. // Антибиотики. 1970. - № 12. - С. 1067.

22. Иванов И.А. Утилизация некоторых отходов антибиотиков в бетоне и железобетонных конструкциях / Иванов И.А., Калашников В.И., Григорьев А.В. // Хим.-фарм. журнал. 1983. - № 6. - С. 1031-1033.

23. Инструкция по приготовлению питательной среды / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 1986. - Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-154.

24. Использование мицелиальных отходов в качестве добавки при производстве гранулированных активных углей / Якубова А.Р., Лагунов

25. B.М., Файнгольд З.Л. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1995. -Т. 40. -№5.-С. 35-37.

26. Использование мицелиальных отходов производства медицинских препаратов / Пономарева Л.В., Янкевич М.И., Яковлев В.И. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - Т. 35. - № 2. - С. 43-45.

27. Карпухин В.Ф. Биотехнология / В.Ф. Карпухин- М., 1985.

28. Карпухин В.Ф. Разработка и утилизация мицелиальных отходов / Карпухин В.Ф., Крымский М.В., Линькова О.С. // Успехи в области изучения и производства антибиотиков: Труды ВНИИА. М., 1982. - Вып. XI.-С. 85-91.

29. Кейлер В.А. Экономика предприятия / В.А Кейлер. М., 2001.

30. Коржова Л.П. Динамика реакции и свойства мелоноидов, образующихся при взаимодействии глицеринового альдегида с глицином / Коржова Л.П., Романов Ю.А // Прикладная биохимия и микробиология. 1979. - Т. 15, № 4. - С. 585-588.

31. Крестьянинова И. Н. Ферментные препараты для изучения белковых гидролизатов и смесей аминокислот, не содержащих пептидов / Крестьянинова И. Н., Васильева Л.И., Денякина Е.К. и др. // Прикл. био-хим. и микробиол. 1985. - Т. 21, вып. 1. - С. 48-57.

32. Крымский М.Б. Малоотходная технология и охрана окружающей среды на предприятиях Медпрома / Крымский М.Б., Карпухин В.Ф. // Тез. докл. Всесоюз. симп. М., 1981. - С. 53-54.

33. Кудрявцев P.M., Страшненко Е.С., Волков Е.Н. // Труды ВНИИ консервной и овощной промышленности. М., 1972. - № 16. - С. 38-41.36. .Кучеренко Н.Е. Биохимия: Практикум / Н.Е. Кучеренко Ю.Д., Бабе-нюк., А.Н. Васильев и др. Киев, 1988.

34. Кушманова О.Д. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / О.Д. Кушманова, Г.М. Ивченко М., 1974.

35. Лабораторный регламент на получение апрамицина сульфата / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2001. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-520.

36. Лабораторный регламент на производство субстанции тобрамицина основания / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2000 г. - Архив ЦВТП БЗ.-Инв.№ Д-461.

37. Лабораторный регламент на производство тобрамицина сульфата для инъекций 0,08 г / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 2001,- Архив ЦВТП БЗ. 7 Инв.№ Д-524.

38. Мадер X. Апралан антибиотик нового поколения / Мадер X. // Ветеринария. - 1994. - №6. - С. 31-32.

39. Матвеев В.Е. Изучение кинетики гидролиза дрожжей БВК / Матвее" В.Е., Роговер B.C., Зайцев З.М., Молчков B.C. // Хим. фарм. журн. -1984. - Т. 18, № 12. - С. 1499-1503.

40. Матвеев В.Е. Разрушение аминокислот в растворе при нагревании / Матвеев В.Е., Скворцов Г.Е., Куян Н.Б.// Биотехнология. 1986. - № 1. - С.53-55.

41. Махортов B.JI. Современное состояние и перспективы производства новых антибиотиков в Российской Федерации / Махортов B.JL, Литу-сов Н.В., Михайлов В.А. и др. // Медицина Урала. 2003. - В печати.

42. Михайлов В.А. Разработка технологии выделения и очистки гентами-цина из культуральной жидкости: Дис. . канд. Техн. наук: 02.00.03 / В.А. Михайлов; Уральский гос. Ун-т. Екатеринбург, 1996. - 180 с.

43. Михайлов В.А. Разработка усовершенствованной технологии получения субстанции тобрамицина / Михайлов В.А., Садовой Н.В., Махортов В.Л. // Сб. науч. тр. / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2000. - 178 с.

44. Мицелиальные отходы производства пенициллина как компонента клея /. Кадималиев Д.А,. Ревин В.В,. Ватолин А.К. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 2002. - Т. 47. - № 12. - С. 3-5.

45. Мицелиальные отходы производства тетрациклина как компонент питательной среды / Пономарева JI.B.,. Яковлев В.И., Цветкова Н.П. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1999. - С. 11-13.

46. Моткова М.О. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза антибиотика тобрамицина с помощью математического метода планирования эксперимента / Моткова М.О., Коробкова Т.Д., Гладких Е.Г // Антибиотики. 1981,- № 9. - С. 651-654.

47. Навашин С.М. Справочник по антибиотикотерапии. / Навашин С.М. -М., 1984.

48. Навашин С.М. Экологические аспекты в производстве антибиотиков и химико-фармацевтических препаратов / Навашин С.М., Карпухин В.Ф. // Тез. Докл. Пенза, 1989. - С. 3-4.

49. Навашин С.М. Антибиотики группы аминогликозидов / С.М. Навашин, И.П. Фомина, Ю.О. Сазыкин М., 1977.

50. Неклюдов А.Д. Получение белковых гидролизатов с заданными свойствами / Неклюдов А.Д., Навашин С.М. // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. - Т. 21, вып. 1. - С 3-17.

51. Новикова JI.M. Использование мицелиальных отходов производства антибиотиков в составе ферментационных сред для биосинтеза антибиотиков / Новикова JI.M. // Новые источники сырья для производства антибиотиков: Тез. докл. Всесоюз. совещ. М., 1981. - С.23.

52. Новые источники сырья: Сб. науч. тр. М., 1981.

53. О влиянии углеводов на возможность утилизации отходов производства антибиотиков в строительной индустрии / Тараканов О.В., Калашников В.И., Крымский М.В. и др. // Антибиотики и химиотерапия. -1989. Т. 34. - № 8. - С. 606-609.

54. Об использовании мицелиального жира Penicillium nigricans в качестве источника углеродного питания при биосинтезе антибиотиков / Иофина Э.И., Козлова Г.В., Кузнецова О.С. и др. // Антибиотики. -1968.-№1.-С. 37-40.

55. Опытно-промышленный регламент на получение антибиотика тобрамицина основания / ОХЗ. Омутнинск, 1989. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. №№2-200,2-201,2-205.

56. Опытно-промышленный регламент на получение тобрамицина сульфата для инъекций 0,08 г / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 1996,-Арх. ЦВТП Б3.-Инв.№ Д-110.

57. Опытно-промышленный регламент на получение тобрамицина сульфата для инъекций 0,08 г / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ, 1996,-Арх. ЦВТП Б3.-Инв.№ Д-110.

58. Оценка возможности утилизации мицелия нетрадиционным методом. Отчет о НИР / Руководитель М.Д. Гурьев. 1993. - Арх. ЦВТП БЗ. -Инв. № Д-109.

59. Пат. 2462597 США, НКИ/К. 260-529.

60. Перелыгин В.М. Гигиена почвы и санитарная очистка населенных мест / В.М. Перелыгин, В.В. Разнощик М., Медицина, 1987.

61. Першин С.А. Методы экспериментальной химиотерапии / С.А. Пер-шин-М. 1984.

62. Полюдов С.А. Разработка технологии утилизации мицелиальных отходов производства антибиотиков аминогликозидного ряда: Дис. . канд. биол. наук: 03.00.23 / С.А. Полюдов; Москов. гос. академ. вет. мед. и биотехн. -М, 2002.-115 с.

63. Поминальник Г.А. Накопление и сбраживание мицелия в водоемах / Поминальник Г.А. // Проблемы утилизации мицелиальных масс при микробиологическом синтезе лекарственных средств: Тез. докл. Все-союз. Симп.-М., 1981.-С. 17.

64. Попова В.А. Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, здравоохранения, научных исследований / Попова В.А., Петрейкова М.М., Езерская М.Ф. // Сб. науч. ст. Фрунзе, 1981. -С. 43-44.

65. Проведение исследований по изучению кинетики процессов подготовки гидролизных сред и их биохимической переработки: Сб. науч. тр. / Ленинград. ВНИИ гидролиз. Л., 1984.

66. Производство антибиотиков / Под ред. С.М. Навашина. М., 1970.

67. Производство и применение антибиотиков в сельском хозяйстве за рубежом. ГУ микробиопром. Сер VI // Получение и применение микробиологических средств защиты растений, кормовых антибиотиков, бактериальных удобрений. М., 1982.

68. Рабкина Н. Сравнительный анализ производства и импорта медикаментов в 1996 и 1997гг. / Рабкина Н. // Фармацевтический вестник. -1997.-№19 (85).-С. 9.

69. Разработка и утверждение документации по утилизации отходов производства аминогликозидных антибиотиков (гентамицина): Отчет о НИР / АООТ НИТИАФ. Руководитель МБ. Моисеева. 1995. - Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № 734В.

70. Разработка опытно-промышленной технологии получения производства тобрамицина: Отчет / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководитель Н.В. Садовой. 1995. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-62.

71. Разработка технологии получения субстанции апрамицина сульфата и ее испытание в экспериментальной практике: Отчет / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2001. - Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д 521.

72. Разработка экспериментальной технологии утилизации твердых отходов производства антибиотиков аминогликозидного ряда: Отчет о НИР / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Руководитель Ю.Н. Орлов. 1997. - Арх. ЦВТП БЗ,-Инв. № 335.

73. Разработка экспериментальной технологии утилизации твердых отходов производства антибиотиков аминогликозидного ряда: Отчет / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 1998. - Арх. ЦВТП БЗ. -Инв. № 370.

74. Рассулин Ю.А. Изучение возможных путей усовершенствования промышленных гидролизатов / Рассулин Ю.А., Марданян М.М., Соковых В.Ц. и др. // Хим.-фарм. журн. 1983. - Т. 17, № 7. - С.850-855.

75. Регламент: ОПР-64-0482080 / НИИТИАФ. Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. №0-201.

76. Россия теряет собственный рынок лекарств. Официальная хроника // Медицинский курьер. 1997. - № 2 (3). - С. 21.

77. Руководство по доклиническим методам исследования фармакологических веществ. М., 2000.

78. Сборник методик определения физико-химических показателей питательных сред / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2000. - Архип ЦВТП БЗ. - Инв. № 3/4.

79. Сборник методик по контролю качества тобрамицина / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2000. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № 54 /И-М.

80. Сборник методик по контролю процесса производства и оценке качества апрамицина сульфата СТП-ОА-190-208-98 / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 1998. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-261.

81. Сборник методик по контролю процесса производства и оценке каче ства субстанции тобрамицина основания СТП-ОА-209-227-00 / ЦВТИ БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2000. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № 148 /И-М.

82. Сборник технологических инструкций / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. -Екатеринбург, 1999. Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № 63 /И-М.

83. Состояние производства и реализации медицинской продукции в Российской федерации в 1998 г. (ежегодный доклад Минэкономики России). М., 1999.

84. Степчков К.А. Проблемы парентерального питания / Степчков К.А. /У Сб. науч. ст. Рига, 1969. - С. 55-59.

85. Суздалева В.В. Улучшенные препараты гидролиза казеина для парентерального белкового питания / Суздалева В.В., Малахова Г.М., Васильев П.С. и др. // Пробл. гематол. и перелив, крови. 1974. - Т. 19, -С. 30-32.

86. Танькова И.Л. Возможные пути использования фугата культуральной жидкости Lactobacterium pentoaceticum для получения продуктов микробного синтеза / Танькова И.Л. Гернет М.В. Соколова И.А. // Биотехнология. 1987. - Т. 3, № 1. С. 66-68.

87. Технические условия на апрамицина сульфат (водорастворимый порошок) / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. Екатеринбург, 2003. - Архив ЦВТП БЗ. - Инв. № 208 /И-М.

88. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. / Пер. с англ. В.Г. Майзеля; Под. ред. И.В. Березина. М., 1983.

89. ТУ 9296-001-00482080-93. Мицелий гентамицина сухой для пушного звероводства. Введ. 06.06.1994.

90. Утилизация мицелиальных отходов производства антибиотиков в технологии обжиговых строительных материалов / Карпухин В.Ф., Крымский М.В., Иванов И.А и др. // Антибиотики. 1981. - № 1. - С. 32-36.

91. Утилизация модифицированных отходов производства антибиотиков для получения строительных материалов / Калашников В.И., Карпухин В.Ф., Крымский М.В. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1988. -Т. 33,-№5.-С. 339-342.

92. Утилизация отходов предприятий микробиологической промышленности методом вермикомпостирования / Жариков Г.А., Фортуков С.В., Туманский И.М. и др. // Биотехнология. 1993. - № 1. - С. 21-23.

93. Ферментативный гидролиз мицелиальных отходов производства тетрациклина / Пономарева Л.В., Пешкова И.П., Цветкова Н.П. и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1990. - № 4. - С. 42-45.

94. Физико-химические методы контроля ингредиентов, питательных сред и биопрепаратов (методическое пособие для биофабрик и ветеринарных лабораторий).- М. 1970.

95. Экспериментально-производственный регламент на биоспорин / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 1995. - Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-66.

96. Экспериментально-производственный регламент на получение субстанции тобрамицина основания / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. 1997. -Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-199.

97. Экспериментально производственный регламент. Вакцина сибиреязвенная живая сухая для подкожного и скарификационного применения / ЦВТП БЗ НИИМ МО РФ. - 2000. - Арх. ЦВТП БЗ. - Инв. № Д-296.

98. Якубова А.Р. Исследования возможности получения сорбентов из мицелиальных отходов производства антибиотиков / Якубова А.Р., Лагунов В.М., Файнгольд З.Л. // Антибиотики и химиотерапия. 1995. -Т. 41. -№6. - С. 7-9.

99. Apralan 75 Premix // YAHOO: //www. elanco.com /products /apralan /pdf/apralan7 5 .pdf.

100. Apralan soluble powder // YAHOO: www.elanco.com/products/msds / msdsapralansolublepowder.html.

101. Dee Т.Н. Gentamicini and tobramycini penetration into synovial fluid / Dec; Т.Н., Kozin F. // Antimicrob. Ag. Chemother. 1972. - № 12. - P. 548.

102. Goedinakers A. Ecological perspectives of changing agricultural land use in the European Community / Goedinakers A. // Agr. Ecosystem Environm. 1989. Vol. 27. № 1-4. P. 99-106.

103. O. Graff Bodenzoologische Untersuchungen mit besonderer Berucksichti-gung der terrikolen Oligochaen. 1963. - bd. - 61. - S. 72-77.

104. Huhta V. Biological succession in artifical soil made of sewage sludge and crushed bark. / Huhta V., Sundman V. Washington. - 1980. - P. 119-120.

105. Gould M. Sourse separation and composting of organic municipal solid waste / Gould M., Garrison R., Foster S. // Reour. Recucl. 1992. - № l i, № 17. - P. 38, 40-45.

106. Tratamiento aprovechamiento de residuos solidos urbanos Baguero Franco Sose // Agricultura. 1992. -№ 717. - P. 310, 313-317.