Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ауторегулятор культуры Streptomyces imbricatus и его влияние на биосинтез макролидных антибиотиков

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Ауторегулятор культуры Streptomyces imbricatus и его влияние на биосинтез макролидных антибиотиков"

На правах рукописи

ТОЛКОВА Оксана Владимировна

АУТОРЕГУЛЯТОР КУЛЬТУРЫ БТКЕРТОМУСЕЯ ШВШСАТШ НЕГО ВЛИЯНИЕ НА БИОСИНТЕЗ МАКРОЛИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□ОЗ 162294

Санкт-Петербург 2007

003162294

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии (ГОУ ВПО СПХФА Росздрава)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Яковлева Елена Павловна

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор

Сухаревич Валентина Ивановна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)

Защита состоится 7 ноября 2007 г в 14 00 часов на заседании Диссертационного совета К 208 088 01 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная химико-фармацевтическая академия» по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул проф Попова, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»

доктор биологических наук, профессор Рыбальченко Оксана Владимировна

Автореферат разослан «

»

/

Ученый секретарь Диссертационного совета канд биол наук

Караваева Анна Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Регуляция, то есть управление скоростью биохимических процессов, лежащих в основе взаимодействия различных клеток как внутри одного организма, так и между разными организмами, является одним из приоритетных направлений исследований в области фундаментальной биотехнологии Определенный прогресс и успехи в этом сегменте науки во мноюм связаны с обнаружением, выделением в индивидуальном состоянии и пониманием роли многочисленных специфических веществ, активно участвующих в таких взаимодействиях и названных аутобиорегуляторами Регуляюры человека и животных (гормоны, витамины, защитные вещества) исследуются уже в течение длительного времени В менее ясном состоянии находится изучение многочисленных ауторегуляторов микроорганизмов

Наиболее изучены низкомолекулярные микробные ауторегуляторы, образуемые микроорганизмами рода Б^ерЮтусез, среди которых основными являются А-фактор и его аналог и - низкомолекулярные соединения -бутиролактоны Известно, что эти соединения выполняют функцию «сигнальных молекул» при переключении этапов дифференциации и являются индукторами активации ферментов синтеза вторичных метаболитов

Представленные в литературе сведения об образовании аутобиорегуляторов продуцентами макролидных антибиотиков весьма немногочисленны Сведения об образовании регуляторных соединении продуцентами противогрибковых антибиотиков, в том числе продуцентом имбрицина Б тЫ ¡сспш, в источниках литературы отсутствуют

В связи с вышеизложенным важными и своевременными представляются исследования, направленные на изучение регулятора, обнаруженного у продуцента противогрибкового неполиенового макролидного антибиотика имбрицина и выяснение роли этого соединения в регуляции роста культуры и антибио гикообразоватшя

Исследование проводилось в рамках научных работ, выполняемых на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом по теме «Исследование молекулярно-биологических механизмов синтеза вторичных метаболитов из ряда макролидных антибиотиков и низкомолекулярных цитокинов»

Цель и задачи исследования. Изучение возможности регуляции биосинтеза противогрибкового антибиотика имбрицина и других макролидных антибиотиков эндорегулятором, образуемым культурой 81гер1отусез тЬпсиШз

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи

- изучить условия образования эндорегуляторного соединения продуцентом имбрицина и его влияние на биосинтез антибиотика различными штаммами 5 тЬпсаШя,

- исследовать влияние эндорегулятора 5 ¡тЬпсаШэ на морфолого-культуральные признаки собственного продуцента и продуцентов некоторых макролидных антибиотиков,

- выделить эндорегулятор из культуральной жидкости актиномицета 5 гтЬпсаШ, изучить некоторые его физико-химические и биологические свойства,

- исследовагь особенности основных путей обмена углеводов у 5 гтЬпсаш в условиях стимуляции биосинтеза имбрицина в присутствии регулятора

Научная новизна исследования. Впервые доказано наличие ауторегуляторной системы антибиотикообразования у культуры 5 ¡тЬпсаШ - продуцента противогрибкового макролидного неполиенового антибиотика имбрицина

Выявлено влияние условий культивирования продуцента на синтез эндорегулятора, максимальное накопление которого в кж совпадает с максимумом антибиотикообразования и зависит от состава питательной среды, значения рН и интенсивности аэрации

Установлено, что способностью образовывать эндорегуляторное соединение обладают мутантные штаммы актиномицета 5 тгЬпсмил, как низкоактивные, так и высокопродуктивные варианты Внесение эндорегулятора в агаризоваштую среду Чапека вызывает изменение морфолого-культуральных признаков всех мутантных штаммов продуцента

Доказана возможность увеличения интенсивности образования противогрибковых полиеновых антибиотиков - нистатина, леворина, амфотерицина В под воздействием эндорегуляторного соединения 5 1тЬпса1т на разных стадиях развития продуцентов указанных антибиотиков Для продуцентов этих антибиотиков эндорегулятор, образуемый кулыурой 5 ипЬпсШкз, является экзогенным стимулятором прорастания спор и/или индуктором дифференциации

Показано, что по ряду физико-химических и биологических свойств выделенный эндорегулятор является новым и отличается от описанных в литературе регуляторов, образуемых актиномицетами

Впервые для продуцента противогрибкового неполиенового антибиотика имбрицина установлено, что усиление антибиотикообразования в присутствии эндорегулятора происходит вследствие подавления активности ферментов цикла трикарбоновых кислот, что обеспечивает перераспределение пирувата в пу1ях образования поликетидной цепи молекулы антибиотика

Практическая значимость работы. При внесении ауторегулятора, содержащегося в кж 5 ¡тЬпсаша, в ферментационную среду синтез имбрицина увеличивается на 40 - 50 %

Составлена ведомость изменений к лабораторному регламенту на производство имбрицина, предусматривающая использование фильтратов кж 5 ипЬпсШт вместо воды при приготовлении питательных сред Это позволит сократить количество стоков в виде отработанного нативного раствора на стадии фильтрации культуральной жидкости (кж)

Разработан и оптимизирован состав синтетической питательной среды для культивирования 5 тЪпсагт, на которой уровень антибиотической активности продуцента близок к уровню синтеза имбрицина на комплексной питательной среде, а при добавлении ауторегулятора достигает максимальных значений активности высокопродуктивного штамма

Показано сохранение высокого уровня антибиотикообразования в течение длительного времени при хранении спорового посевного материала продуцентов имбрицина, леворина, нистатина и амфотерицина В на агаризованных средах с эндорегулятором 5 тЪпсаШз, что позволяет рекомендовать включение фильтратов кж 5 гтЬпсаЫз в состав прописей этих сред

Разработан метод получения и очистки сырца эндорегулятора из культуральной жидкости S imbricatus Выделен сырец со степенью очистки 90,0 %

Результаты представленной работы используются в лабораторном практикуме по дисциплине «Технология биосинтеза ЬАВ» для студентов факультета промышленной технологии лекарств (специальность 240901 -Биотехнология) на кафедре биотехнологии

Основные положения, выноснмые на защиту.

1 Продуцент имбрицина, культура Streptomyces imbricatus образует регулятор, стимулирующий биосинтез собственного антибиотика

2 Применение эндорегулятора S imbricatus на разных стадиях культивирования продуцентов леворина, амфотерицина В и нистатина обеспечивает повышение образования этих антибиотиков

3 Способ выделения и очистки эндорегулятора S imbricatus из культуральной жидкости обеспечивает получение сырца эндорегулятора со степенью чистоты 90 %

4 Эндорегулятор 5 imbricatus изменяет метаболизм продуцента в сторону увеличения синтеза имбрицина

Апробация работы. Результаты исследований обсуждены на заседании кафедр биотехнологии и микробиологии СПХФА, доложены на Международной научной конференции «Фармация в XXI веке инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999), научно-методической конференции СПХФА «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (Санк-Петербург, 2004), научной конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», (Санкт-Петербург, 2005)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ

Объем и структура работы. Диссертация сосюит из введения, обзора литератур, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 22 рисунка Библиография включает 191 источник

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы Представлены сведения о некоторых способах регуляции биосинтеза антибиотиков с использованием традиционных подходов, а также специфических экзорегуляторов Рассматриваются вопросы регуляции жизнедеятельности прокариотных организмов с помощью веществ - ауторегуляторов Приведены современные данные о низкомолекулярных ауторегуляторах микроорганизмов, в том числе образуемых актиномицетами, механизме их действия, влиянии на процессы клеточной дифференциации микроорганизмов - продуцентов биологически активных веществ Описаны методы, использующиеся в настоящее время для выделения ауторегуляторных веществ из культуральных жидкостей различных продуцентов БАВ Заключительная часть посвящена макролидным противогрибковым антибиотикам, изложены сведения о биогенезе молекул полиеновых и неполиеновых макролидов

Материалы и методы исследования В работе использовали штаммы актиномицетов - продуцентов макролидных антибиотиков из коллекции ВНИТИАФ Streptomyces imbricatus ЛИА 0112/90, Streptomyces levons 78, Streptomyces nodosus 143, Streptomyces nourseï 845, штамм

5аскагоро1у$рога егучкгеа 2-34, полученный в ЦЗЛ Курганского АКО «Синтез» и штаммы 5 ипЬпсШт 9М, С9, 1 5, полученные путем многоступенчатого мутагенеза на кафедре биотехнологии СПХФА

Стандартное культивирование продуцента имбрицина проводили на соево-кукурузной среде № 135 в колбах Эрленмейера (750 мл с 30 мл среды) на качалке (220 мин"1) при температуре 27±1 С в течение 96 ч Посевной материал выращивали на среде № 5 (в г/л соевая мука 10,0, глюкоза - 10,0, >]аС1 - 5,0, СаС03 - 1,0, 50 мл среды в колбе) в течение 48 часов и переносили в колбы с ферментационной средой в количестве 10 % (объем н )

Культивирование продуцентов макролидных антибиотиков проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл на качалке при 220 мин"1 Условия культивирования соответствуют регламентным условиям для каждого продуцента

Определение содержания имбрицина, леворина, амфотерицина В и нистатина в культуральной жидкости проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре БЬтаски иУпит-1240 (Япония) Концентрацию эритромицина в культуральной жидкости определяли методом ацидометрического титрования

Оптимизацию состава синтетической питательной среды для культивирования продуцента имбрицина проводили методом планирования эксперимента по схеме ортогональных латинских прямоугольников 8x4

Содержание редуцирующих веществ, аминного азота, суммарное содержание белка и пептидов, дегидрогеназную активность мицелия Б тЬпсаш, сухой вес, влажность мицелия, зольность фильтрата культуральной жидкости 5 тЬпсМж определяли стандартными общеизвестными методами

Продуктивность мицелия 5 тЬггсаШз, удельную скорость роста актиномицета, скорость утилизации у1леводов рассчитывали по формулам, описанным в литературе

Определение активности дегидрогеназ проводили по методу, предложенному Л Г Логиновой и Э П Гужевой В опытах определяли активность дегидрогеназ на следующих субстратах пировиноградная, глутаминовая, изолимонная, янтарная, яблочная кислоты и глкжозо-6-фосфат Концентрация растворов субстратов - 0,01 М, рН = 7,0-7,2

Определение активности альдолазы проводили по методике, описанной Пинто с соавт

Депигментацию фильтрата кж 5 ¡тЬпсШия сорбционным методом осуществляли на колонке размером 24x1 см, высота слоя сорбента - 7-10 см, скорость подачи фильтрата - 90 мл/ч Использовали сорбенты АВ-18-10П и АВ-17-И (аниониты) в СГ-форме и активированный уголь марки БАУ-А

Выделение эндорегулятора сорбционным методом проводили на колонках размером от 10x1 до 24x1 см с использованием сорбентов КУ-2-8 и Биокарб (катиониты), АВ-17-И и Оо\уех 2x8 (аниониты) и молекулярный сорбент СКН-2М Скорость пропускания фильтрата - 80 мл/ч Элюцию осуществляли 0,06 М фосфатным буфером с рН 3,2 - 4,0 для анионитов и 8,0-8,5 для катеонитов Элюцию эндорегулятора с СКН-2М проводили при рН 7,0 тем же фосфатным буфером с 40 % ацетона Скорость подачи элюента - 40-45 мл/ч

Процесс гель-фильтрации раствора эндорегулятора на Сефадексе ЬН-20 (Швеция) проводили на колонке диаметром 1,1 ±0,1 см, высота

слоя носителя - 21 см. скорость г гада ч и пюента (-очищенная вода) — 19-20 мл/ч. объем собираемых фракций -- 3 мл,

Качественный анализ химического состава сырца эндорегудятора проводили методом ТСХ с использованием готовых к употреблению пластин Silufol UV-256 или Sorbfil I1ТСХ-П-Х-УФ. Пластины после нанесения пробы обрабатывали соответствующими проявляющими реагентами для обнаружения определенных химических соединений или групп. Для идентификации лактонной группировки хромаю!рафичсскис пластины Sorbfil НТСХ-П-Х-УФ предварительно обрабатывали <Ш М фосфатным буфером (рН 7,0) и высущивалй при температуре НО °С. На настану ншосили пробы и доводили хроматхмрафщй з системе растворителей бензол - ди метило вый эфир (1.1). Детекцию полученной хроматограммы вели в УФ- свете.

Экспериментальные данные обрабатывали статистически с помощью методов, предложенных И.П. Ашмариным. путем вычисления средней арифметической величины и доверительного интервала с достоверностью не менее 95 %. Повтори ость всех экспериментов составляла не менее 5-ти раз.

Результаты исследования и их обсуждение.

Образование культурой S. imbricutus веществ, п имулирующих биосинтез антибиотиков. Изучая возможности регуляции биосинтеза им брил и на культурой Sírepiomyces imbricantí, обнаружили, что внесение в питательную среду фильтрата культуралыюй жидкости (к.ж) собственного продуцента значительно "стимулирует образование антибиотика. Это оказалось интересным как с точки зрения решения экологических проблем, существующих на производствах биологически активных продуктов, так и возможности регуляции а нтибиот и ко образования. Данные по изучению особенностей апткбиотикообразования S. imbricatus шт. 9М при выращивании продуцента на питательной среде, в которой водопровод пая вода полностью заменена фильтратом к.ж собственного продуцента, нредета в л

4500 -я JOOO -5 350« -лиа -

нд

- 2500 -

в г0"" -i 1500 -

* IflíW -

500 -

ti s

па рис. 1.

Времй т и в ирдаза Шя, час

Рисунок 1. Динамика накопления имбрицина на контрольной - 1 И ОПЫТНОЙ (со 100 %-ой заменой водопроводной воды на фильтрат кж продуцента) - 2 средах.

Как видно из представленных данных. максимум ант иб йот и к «образования в обоих вариантах приходил ей на 96 ч роста продуцента, однако на среде, содержащей фильтрат собственной кжг синтез имбрицина возрастал на 40-50 % по сравнению с контролем.

Установлено, что максимум накоплении веществ, с гимулируюших синтез имбрицина. совпадает с максимумом образования антибиотика Было изучено влияние условий культивирования на образование задоре гул ятор а. Показано, что важнейшими из этих условий являются рН, аэрация, состав питательной среды. Культура S. imbricatus образует эпдорсгулятор только при нейтральном значении рН в интервале от 7,0 до 7,5 и интенсивности аэрации 2,9 г О^/л/ч (рис. 2),

Для оценки влияния количества вносимого эндоретулятора на биосинтез шбрицина, варьироиали объем добавляемого в среду фильтрата кж продуцента. Фшьтрат вносили в питательную среду в количествах от 25 до 100% от объема питательной среды. Эксперименты показали прямо пропорциональную зависимость увеличения интенсивности антибиотикойбразованйя от количества внесенного фильтрата.

] SO

к А

4,5 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 Я,()

ри

2,9 1,7 0,9 г О ./л/ч

аэрации на

Рисунок 2. Влияние рН среды и интенсивности образование эпдорегулятора культурой 5. ¡тЬпсашх.

Образование Эндо регулятора различными штаммами ШЬистии. Для исследовании были выбраны различные по активности варианты штаммов продуцента 5. \mbricaius'. исходный "дикий" штамм 5'. /тЬпсаЫа Л.ИА--01 12/90, выделенный из почвенного образца; высокоактивные варианты 9М и С9, полученные □ результате индуцированной изменчивости на разных этапах селекции и низноактивный споро - и т ги гм е н то об разую 1 п и й а ар и ант 1.5, выделенный из «-» - вариантов ври обработке мутагенами штамма 9М. Результаты опытов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Образование эпдорегулятора биосинтеза имбрицина различными

Варианты штаммов 5. ¿тЫ'!Са!Щ Активность КЖ' и контроле, МК1'/МЛ Активность кж при выращивай ад штамма на среде с фильт ратом, мкг/мй %к контролю

Исходный штамм ЛИА 0112/90 2000±100 2000 ±100 100 ± 5

Вариант 9М, получен на Г этапе мутагенеза 2500±125 4000 ± 200 150 + 5

Вариант С9; получен на П этапе мутагенеза 3200±100 3400±170 116 ± 5

Вариант 1.5 низки активный 800 ± 40 1900 ± 190 214 ± И

Показано, что исходный штамм ЛИА 0112/90 не обладает способностью выделять в кж вещество, стимулирующее атибчатчкообрззо/шшс у Собственного продуцента, Стимулирующий эффект э и лор е гу;: яторг для низкоактивного варианта 1.5 намного превосходит стимулирующие эффекты для высокоактивных мутантов. Трим образом, можно полагать, что образование эндорегулятора напрямую связано не только с воздействием на культуру 5* imbricat.ua мутагенных факторов различной природы, но и с уровнем антибиотикообразования (для мутаитных штаммов).

Влияние состава питательной среды на образование _> л до регулятора культурой Б. \mbrieutm. В опытах для наработки фильтратов использовали штаммы 9М и 1.5, так как они образовывали наибольшее количество эндорегулятора биосинтеза имб рицина. Исследовали накопление регулятора на обедненной среде № 5 (2 % соевой муки, 1 % глюкозы), регламентной среде № 135 (4 % кукурузной муки. 2 % соевой муки, 5 % глюкозы), кукурузно-соевой среде № ¿5 (2 % кукурузной муки, 1 % соевой муки. '2 % глюкозы). Эксперименты показали, что оптимальными ДЛЯ синтеза эндо регулятор а являются обогащенные питательные среды, содержащие значительные количества источников углерода и азота.

Рисунок 3. Влияние состава питательной среды на стимулирующую активность фильтратов кж различных по активности штаммов 5. ¡тЫсаСж.

Полученный данные в определенной степени подтверждают существующую сегодня теорию реакций -'кворум-сенсинга" у микроорганизмов и, в частности, актино минетов. Известно, что а уторе гуля торы актином ицетов начинают свое действие лишь при достижении определенной концентрации в среде, которая, в свою очередь, зависит от плотности популяции продуцента. Для подтверждения этого предположения определили количество образующегося мицелия при культивировании 5. ипЬпсаш на выше указанных питательных средах. Показано, что интенсивное образование биомассы наблюдали на обогащенных, средах № 135 и № 25, и совсем незначительный прирост биомассы — на обедненной среде № 5. Следовательно, на этой среде плотность популяции 5. тЪгквШ не достигает величины, необходимой для накопления эндорегулятора в достаточном количестве.

Влияние *> 1 |д орегу л я го ра Л". 1тЬпаИи\ на а[Г1 ибиотикообразование у продуцентов некоторых макролидных" антибиотиков. Известно, что регуляторы типа А-фактора обладают как эндо гак и эюорегуляторным воздействием на стрслтаигшеты, развитие

150

Е 00 --

50

•ь:

I3?)®!

135 25 5

Л' N11 [ :] ( с. 1I |и Й I ре лы

□ К Р9М-0ПЫТ Ql.5-om.n-

которых ЗавйСйЦ от наличия в Сред© данных сое далекий, Критерием оценки 'Зиодогического действия таких регуляторов является усиление или индуцирование процессов морфогенеза и синтеза вторичных метаболитов (в том числе и антибиотиков) при внесении регулятора в соответствующую среду.

Изучено влияние эняфр&гулятора продуцента имбриципа на биосиитез антибиотиков у следующих продуцентов: 5асскагоро1уярога егучИгаеа штамм 2-34 (притом и цин). $1гер1отусе$ по((о$ш штамм 143 (амфотерицип В), ¿7гер1отусе$ поигхег штамм 845 (нистатин), ¿7герЮтусеь ¡еуогЫ штамм 78 (леворин).

(00

i so

с

i no

Ё 40 -i

20

^ ню

J 80

I 60

a

5 Щ

< 20

Рисунок Влияние фильтратов кж S. imbricatus на биосинтез эритромицина (а), леворин а (б), амфотерицина В (в) и нистатина (г).

Установлено, что а иди регулятор продуцента имбриципа оказывает различное влияние на процесс биосинтеза перечисленных антибиотиков. Выращивание продуцентов эритромицина, леворин а и амфотерицина В на средах, содержащих фильтраты кж $. imbricatus, приводило к ингибнроваиию ант и б но г и ко о б раз о ва ни я, Вместе с тем, культивирование продуцента нистатина S. noursei 845 на среде с фильтратом кж S, imbricatus оказывало положительное влияние на биосинтез этого антибиотика: образование нистатина увеличивалось на 27-40 %.

ВлиянШ зндорегулятора -S. imbricatus на морфолого-культуральные цризнакн собственного продуцента и продуцентов некоторых макролидных антибиотиков, В опытах использовали фильтрат кж S. imbricatus, который вносили в a rap изо панн ые среды.

=40

£

используемые для роста и поддержания культур Количество вносимого фильтрата, содержащего эндорегулятор, варьировали от 10 до 100 % В течение 14 суток выращивания продуцентов наблюдали за характером роста и внешним видом образующихся колоний

Показано, что эндорегулятор, вносимый с фильтратом кж 5 тЬпсаШБ в агаризованную среду Чапека с крахмалом, оказывает влияние на рост и развитие собственного продуцента Для всех трех вариантов наблюдали более раннее появление колоний на поверхности агара к 36-40 часам роста в опыте против 48-52 часов в контрольных вариантах Размеры колоний в опыте и контроле практически не различались, однако их форма и цвет на опытных чашках значительно отличались от контрольных (табл 3)

Таблица 3

Влияние эндорегулятора 5 тгЬпсаПи на морфолого-культуральные

Вариант штамма Среда Чапека на водопроводной воде(контроль) Среда Чапека с фильтратом кж (опыт)

9М Колонии слабо выпуклые с ровными краями, поверхность слабо шелушащаяся, с небольшими трещинами Воздушный мицелий хорошо развит, бледно-серый (аб) Спороносцы спиральные (4-5 витков) Споры подвижные, число спор - 6-8 Колонии сильно выпуклые, с ровными краями, центр обозначен легким углублением, поверхность сильно шелушащаяся Воздушный мицелий хорошо развит, серовато-фиолетовый -бледносеровато-фиопстовый (аЗ - а5) Спороносцы спиральные (4-5 витков) Споры подвижные, число спор - 6-8

С9 Колонии выпуклые, края неровные, центр обозначен легким углублением, сильно склатчатые, шелушащиеся Воздушный мицелий отсутствуе г Спороносцы спиральные (4-5 витков) Споры подвижные, число спор - 6-8 Колонии сильно выпуклые, края ровные, поверхность сильно складчатая, шелушащаяся Воздушный мицелий в виде слабого налета, белесый (д!) Спороносцы спиральные (4-5 виг ков) Споры подвижные, число спор - 6-8

1 5 Колонии плоские, с ровными краями, слабо шелушащиеся Воздушный мицелий слабо развит, белесый (д1) Спороносцы спиральные (2-3 витка) Споры подвижные, число спор - 5-6 Колонии выпуклые, с неровными краями, складчатые, сильно шелушащиеся Воздушный мицелий умеренно развит, жечтовато-серый (вЗ) Спороносцы спиральные (3-4 витка) Споры подвижные, число спор - 6-8

что внесение в агаризованную среду исследуемого регулятора практически не влияет на культуральные признаки По окончании срока выращивания на контрольных и опытных чашках наблюдали однотипные колонии, соответствующие типичному паспортному описанию культуры

Влияние регулятора на развитие S levons 78, S nodosus 143 и S nourseï 845 было сходным К 14 суткам роста выросшие на опытных чашках колонии этих продуцентов отличались от контроля большими размерами (в 1,5-2 раза) и более интенсивным развитием воздушного мицелия

Из полученных результатов можно сделать вывод, что эндорегулятор, образуемый культурой S imbricatus, является экзогенным стимулятором прорастания спор и/или индуктором дифференцировки для

продуцентов леворина, амфотерицина В, нистатина при внесении его в агаризованные среды Вероятно, как и А-фактор, эндорегулятор, образуемый продуцентом имбрицина, служит своего рода толчком к прорастанию большинства спор указанных продуцентов Наличие в среде этого регуляторного соединения "сигнализирует' спорам о том, что рядом уже проросла колония актиномицета, то есть условия для развития благоприятные

Важной характеристикой промышленного штамма микроорганизма-продуцента является срок его хранения на агаризованной среде без снижения биологической активности Было установлено, что вносимый в агаризованные среды эндорегулятор оказывает положительное влияние не только на характер роста и развития выше указанных продуцентов, но и на последующий синтез ими антибиотиков Кроме того, споровый посевной материал этих актиномицетов хорошо хранится на таких средах без снижения уровня антибиотикообразования, что позволяет рекомендовать включение в состав прописей агаризованных сред для длительного хранения продуцентов нистатина, имбрицина, леворина и амфотерицина В фильтратов кж Б тЪпсаш Результаты наблюдений представлены в габл 4

Влияние фильтрата кж £ тЬпсаЫв на образование имбрицина при его внесении на разных стадиях процесса культивирования. Фильтрат использовали в питательных средах на стадиях подготовки спорового и вегетативного посевного материала в отдельности, одновременно на обеих этих стадиях, а также на всех стадиях культивирования продуцента, включая ферментацию

Полученные результаты, представленные на рис 5, свидетельствуют о том, что стимулирующий эффект наблюдали только при одновременном внесении фильтрата кж 5 тЬпсагш, содержащего эндорегулятор, одновременно на всех стадиях культивирования для высокоактивных штаммов 9М и С9 продуцента имбрицина и не превышал результатов, полученных при добавлении фильтрата только в ферментационную среду (см табл 2) Для низкоактивного штамма 1 5 стимулирующий эффект проявлялся на всех стадиях культивирования При этом имел место кумулятивный эффект, который выражался в увеличении биосинтеза имбрицина на 260 % по сравнению с контролем

Таблица 4

Влияние эндорегулятора 5 ¡тЬпсаШя на уровень

Продуцент Срок хранения месяцы Активность, ЕД/мл %К контролю

Контроль Опыт

5 imbncatus 9М 6 12 18 2500±125 2500 +125 2300+ 115 2000 ± 100 27001 130 2700±130 2560+ 125 2500+ 125 1 OS 108 111 125

S tmbricatus С9 0 6 12 18 3200+ 160 30001150 3000±150 2750±130 3330+ 160 3100+150 3100+150 2900 + 145 104 103 103 105

S levoris 78 0 6 12 18 526501 1750 48600+1400 42480+ 1550 34140+1160 65800 ±2300 60750+ 1850 50970+ 1500 41160+ 1250 125 125 120 120

S. по do sus 143 0 6 ¡2 1S -it.utl ± 160 3480 ± MO 2800 ± [25 1750 + 75 4320 1210 4100+ 190 3300+ 140 2000 + 80 Ш 118 Ш 114

S. nounai 845 0 6 12 18 27800±1280 22600 + 1050 20240 + У80 Î9700 ±S5Ô 30580 ±1420 26400±1150 25850 + 1050 25000± 1150 110 117 Ш w

5

<

9 M C9

□ KSI □ 2 □ 3

Рисунок 5. Влияние фильтрата кж 5, ЩЪпссфЩ при внесении его в среды на разных стадиях процесса

культивирования на биосинтез имбрицина.

К - контроль. Внесение фильтрата па стадии: I - получения спорового посевного; 2 - получения вегетативного посевного; 3 получения спорового и вегетативного посевного; 4 - на всех стадиях культивирования.

Качество спорового и вегетативного посевного материма, полученного в условиях регуляции, для всех трех исследуемых штаммов оценивали но накоплению мицелия И его окислительно-восстановительной (де гидр огеназ н ой) активности. При внесении фильтрата для низкоактивного штамма J.5 наблюдали увеличение количества образующегося шщелия на 30-3S % и возрастание его дегидрогеназной активности (таил. 5),

Таблица 5

Влияние фильтрата кж S- imbricalm на качество посевного материала собственного продуцента _

Стадия внесения фильтрата

Вариант штамма

Споровый ПМ

Вегетатив ешй ПМ

~9М~ С9 1.5

9М" С 9 1.5

Споровый+ вегетативный ПМ

~9М~ С 9 1.5

Масс'а сухого минеяия, мт/мл

Контроль

ш

4,24 ±0.12 4,17 ± 0.13 3,75 ±0,14

4.92 + 0,17 4,95 ±,0,15 3,85 ± tt.s;

5,06 1 0,15 4,95 ±0,25 3,82 + 0.14

Опыт

4,<10 ± 0,15 4.26 ±0,11 4,95 1- 0,22

4,90 + 0.16 4,98 M 0,22 4.04 ± 0.09

5.10 ±0,25 5,01 ±0,12 4,98 ± 0,22

Время

Обесцвечивания раствора метилсиового синего

К

6,0 '

5.2 14,0

5.3 14.0

6,0 5,2 14,(1

~ЗХ 5,2

6,2

5,6 5,0 6.5

"5.4 5,0 6,0

Следовательно, низкоактивный мутантный штамм 1 5 5 ипЬпсаШ более чувствителен к действию эндорегулятора на ранних стадиях развития актиномицета, чем высокопродуктивные штаммы 9М и С9 Вероятно, повреждение механизма биосинтеза антибиотика, возникшее в результате действия мутагенов при получении данного штамма, вызвало активацию резервных регулирующих систем у актиномицета, которые и отвечают за рецепцию эндорегулятора и, как следствие, восстановление способности к образованию имбрицина

Изучение физико-химических свойств фильтрата кж Б. тгЬпсшт, содержащего эндрегулятор. Предварительно определили некоторые физико-химические показатели фильтрата кж 5 тюпсаш.ч и содержащегося в нем регуляторного соединения Основные величины, характеризующие фильтраты кж Б тЪпсаЫз, приведены в табл 6

Анализ приведенных данных и их статистическая обработка позволили принять в качестве параметров стандартизации фильтратов такие показатели, как рН, цветность при ~К — 360 нм и содержание сухого остатка

Таблица 6

№ п/п Наименование показателей Размерность Значение показателя

1 рН - 5,9 ±0,1

2 рН-стабильность - 2,0- 10,0

j I ермостабильность "С -10 +120

4 Сухой остаток мг/мл 35,0 ± 1,7

5 Показатель поглощения ЕХ5»П 30,0 ± 0,5

6 Цветность Ех 360 Ех 4 50 16,5 + 0 5 1 6 + 0,2

7 Содержание общего азота мг/мл 11,5 + 1 2

8 Содержание редуцирующих веществ мг/мл 18,0 ± 1,8

9 Содержание соединений белковой природы М1 /мл 27,0 ±30

10 Стимулирующая способность фильтрата по уровню антибиотикообразования % 140+ 10

Очистка фильтрата, содержащего эндорегулятора. ипЬпсаШз.

Фильтрат кж Б ипЬпсШт представляет собой жидкость темно-коричневого цвета Была изучена возможность предварительной депигментации фильтрата сорбционным и ультрафильтрационным методами (табл 6)

Таблица 6

Метод депигментации Материал или сорбент для депигментации Цветность фильтрата (Ехзбо) Сухой остаток, мг/мл фильтрата Стимулирующая активность регулятора, % к контролю

Сорбционный АВ-18-1011 АВ-17-И БАУ-А 11,7 + 0,12 13,0 + 0,10 12,4 ±0,15 35.0+ 1,7 29,8+1,3 26,3 ± 1,3 115 130 137

Ультрафильтрация УПМ-П20 УАМ-150А 8,9 ± 0,20 7.4 + 0,18 27,3 + 1,2 22,7 ± 1,0 125 142

Фильтрат кж без обработки - 16,5 ±0,50 35,0 ± 1,7 142

Контроль - - - 100

Установлено, что оба применяемых метода позволяют уменьшить цветность фильтратов, но наибольшую степень депигментации (45-55 %) уменьшение* содержания сухого остатка на 35 % и сохранение стимулирующей активности на уровне неосветденного фильтрата (142 %) наблюдали при использовании метода ультрафильтрации через мембрану УАМ-150Л Сохранение стимулирующей активности фильтрата после ультрафильтрации позволяет сделать вывод, что исследуемое регуляторное соединение не задерживается данными мембранами и, следовательно, является веществом с относительно небольшой молекулярной массой

Выделение эндорегулятора ипЬпсШия из фильтрата кз/с продуцента. Для изучения процесса экстракции в качестве экстрагентов были использованы этиловый эфир, хлороформ и этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) Использование метода экстракции оказалось неэффективным - из фильтрата извлекались лишь примесные соединения

Возможность выделить эндорегулятор сорбкионным методом изучали с использованием различных катеонитов, анионитов и молекулярного сорбента СКН-2М Наилучшие результаты были получены при использовании анионита Оошех 2x8 очистка раствора регулятора по сухому остатку и цветности составляла 75 ± 3,5 %, а стимулирующая активность элюатов была на уровне стимулирующей активности необработанного фильтрата кж 5 ¡тЬпсаШ (табл 7)

Таблица 7

Сорбция эндорегулятора 5 тгЪпсМт сорбентами _различной структуры _

Сорбент Сухой остаток, мг/мл элюата Стимулирующая активность элюатов, % к контролю

КУ-2-8 - 100

Биокарб 26,8 + 0,6 112 ±5,6

СКН-2М 30,4 + 2,0 108 + 5,0

АВ-17-И 28,5 ± 1.5 110 ±2,5

Оотоех 2x8 (СГ - форма) 8,7 ± 0,3 140 ±3.0

Фильтрат без обработки 35,0+1,7 142+7,0

Контроль (среда без внесения элюатов) - 100

С целью выделения сырца эндорегулятора методом осаждения в качестве селективных органических растворителей использовали ацетон и этиловый спирт Установлено, что достаточное для последующей работы количество осадка (8,0 - 12,4 г из I л фильтрата) образовывалось только при использован™ ацетона в качестве селективного агента Стимулирующая активность полученного в этих условиях осадка регулятора была максимальная - содержание имбрицина в кж достигало 131 ± 5 % от контроля

Таким образом, для выделения регуляторного вещества из фильтрата кж и очистки его от сопу[ ствугощих примесей могут быть использованы методы осаждения и сорбции Вместе с тем, предпочтение следует отдать сорбционному методу, поскольку в этом случае отмечали более высокий выход по стимулирующей активности (140 ± 3 0 %) в сочетании с хорошей очисткой раствора от примесей и пигментов (75,0 ± 3,5 %), что позволяет отказаться от предварительной депигментации фильтрата

На основании анализа полученных данных предложена схема получения сырца эндорегулятора из фильтрата кж Б ¡тЬпса/ш в

лабораторных условиях Сырец, полученный по этой схеме, использовали для дальнейших экспериментов по определению физико-химических и биологических свойств эндорегулятора

Определение химической природы сырца эндорегулятора ¡тЬпсаШя. Идентификация химического состава сырца эндорегулятора методом ТСХ на пластинах 51Мо1 иУ-256 (БогЬГи ПТСХ-П-Х-УФ) с использованием специфических реагентов позволила выявить наличие в составе сырца регулятора аминокислот и аминов, редуцирующих веществ (углеводов) и органических кислот Белковые (пептидные) соединения в составе сырца были выявлены с помощью специфических цветных реакций Дальнейшую очистку сырца проводили методом гель-фильтрации

В работе использовали Сефадекс ЬН-20 (Швеция), предназначенный для отделения высокомолекулярных веществ от низкомолекулярных Хроматограмма разделения метаболитов представлена на рис 6

Номер фракции

Рисунок 6 Хроматограмма разделения метаболитов сырца эндорегулятора 5 тЬпсашз

Полученные после гель-фильтрации фракции были разделены на две части - I и II Проверка фракций обеих частей на наличие стимулирующей способности показала, что стимуляторы биосинтеза антибиотика локализовались во фракциях 10-14, и их стимулирующая активность составляла 153±2 % от контрольного уровня При анализе активных фракций 10-14 методом ТСХ на пластинах 8огЫт1 ПТСХ-П-Х-УФ в системе бензол - диметиловый эфир (1 1) с последующей детекцией хроматограммы в УФ-свете обнаружили четко светящееся пятно с характерным для лактонной группировки Основные показатели выделенного и очищенного сырца регулятора приведены в табл 8

Таблица 8

Состав и свойства эндорегулятора 5 гтЬпсаШ

после хроматографической очистки_

Показатели Необработанный фильтрат Раствор сырца эндорегулятора Раствор эндорегулятора после хроматографической очистки

фракции 10-14 фракции 15-20

Свойства эндорегулятора

Стимулирующая активность, % к контролю 142 0 + 7,0 140,0 ±3,0 155,0+3,0 120,0+2,0

Сухой остаток, мг/мл 35 + 1,7 8 7 ± 0 3 0,32+0,02 0,47±0,05

Состав эндоре! улятора

Соединения белковой или пептидной природы мг/мл 27,0 ± 3,0 1,5 ±0,08 0,02+0,01 -

Редуцирующие вещества (углеводы) + + Отсутствуют

Органические кислоты 4 + т

Аминокислоты + + +

Амины + + +

Молекулярная масса Не более 600

Разработка и оптимизация состава синтетической питательной среды для биосинтеза имбрицина. Разработку и оптимизацию синтетической питательной среды проводили методом ортогональных латинских прямоугольников по схеме 8x4

На основании проведенных исследований предложена новая синтетическая среда для биосинтеза имбрицина культурой 5 ипЬпссПш. на которой уровень антибиотикообразования близок к показателям активности на богатой комплексной среде В состав синтетической среды входят (%) глюкоза - 4,5, крахмал растворимый - 5,5 %, (Ш[4)504 - 0,05 %, КС1 - 0,4 %, СаСОз - 0,8 %

Изучение роста Б. ¡тЬпсШия в условиях регуляции биосинтеза имбрицина. Изучали изменение продуктивности и скорости роста 5 гтЬпсаШз при развитии продуцента на синтетической среде, а также потребление им основных элементов питания в контрольных условиях и условиях стимулирования антибиотикообразования при внесении в питательные среды сырца эндорегулятора в количестве 12 мг/мл среды

Установлено, что повышение образования имбрицина в присутствии сырца эндорегулятора обусловлено не увеличением биомассы, а более высокой продуктивностью актиномицета Уровень продуктивности мицелия 5 ¡тЬпсаШ в присутствии эндорегулятора превышал контрольные значения в среднем на 60 %, а наибольшую продуктивность отмечали при скорости роста в 10 раз ниже максимальной Кроме того, в опытном варианте наблюдали более интенсивную утилизацию у1леводов и возрастание количества аминного азот в первые 48 ч культивирования

Влияние эндорегулятора на активность некоторых ферментов 5 ¡тЬгкМш Изменение ферментативной активности актиномицета

исследовали в условиях стимуляции биосинтеза имбрицина при внесении в синтетическую пи тательную среду сырца эндорегулятора.

При определении активности двух ключевых ферментов начальных этапов гликолиза - фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11) и фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы (альдолазы) (КФ 4.1.2.13) показана их высокая активность (особенно в первые двое суток культивирования) в присутствии эндорегулятора (рис.7). Это свидетельствует о том, что гликолитические процессы в клетках тЬпсайщ под влиянием эндорегулятора усиливаются по сравнению с контрольными условиями биосинтеза. При сравнении кривых, отражающих скорость потребления углеводов 8. гтЬпсаШ и активность ал ь дол азы Щ условиях стимуляции биосинтеза имбрицина, становится очевидным существование коррелятивной зависимости между этими параметрами.

г 350У

ч

т

ЧЛ;1

/

К

2000 К

1500 | а £

ШИ> £

500 0

Крсмн кул1>тш5И|Юйл» ии„ час

0 24 45 "2 У 6 ^рРИЯ культи ни рои? мшк час

а)

б)

Рисунок 7. Активность ферментов гликолиза при выращивании ¡тЬгк-аШз в присутствии сырца эндорегулятора: а) ф о сф о ф ру кто к и н аза: б) альдолаза. Кривые: 1 и 2 - удельная активность ферментов; 3 и 4 -накопление имбрицина в кж\ 5 и 6 - скорость потребления РВ, Кривые I, 3,5- контроль, 2, 4, 6 — опыт.

Поскольку от обмена пировиноградной кислоты зависит биосинтез многих антибиотиков и нормальное функционирование ЦТК, определяли активность даруватдегидрогеназы и некоторых ферментов ЦТК,

Для пируватдегидрогеназы (КФ 1.2.4.1) показано, что в условиях регуляции биосинтеза имбрицина активность этого фермента была ниже,

чем в контроле, в течение периода

1400 -,

р 1200 н 1 100(1 -

£

х н ъ-

800 -600 -400 ■ 200 -0

I) 24 48 72 % В |)£ мя культищфиляпия, ч

интенсивного накопления

антибиотика, т.е. до 72 ч культивирования (рис, 8).

Рисунок 8. Активность

пируватдегидрогеназы в процессе роста тЬгксйгт на

синтетической среде (контроль - 1) и в присутствии эндорегулятора (2).

Активности двух дегидрогеназ ЦТК су кгашатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в условиях эндорегуляши биосинтеза имбрицина были значительно ниже, чем в контроле (рис. 9). Однако это не приводило к нарушению функционирования ЦТК И, как следствие* прекращению роста продуцента.

800 -[

я

700 -

■Л 600 -

500 -

г.

о 400 -

о

300 -

'—1 200 -

£ 100 -

.Ж

700

I 600 -

500 ■ 5 400 -= 300 ■

В 200 -

1 100 " 0

2

0 24 48 72 96 Время культов права пня, час

а)

(I 24 48 72 96 Время едаьтя п и р<» ва кня* час

б)

Рисунок 9. Активность дегидрогеназ цикла трикарбодааш кислот тфи росте 5. ¡тЬпсаШ на синтетической среде (контроль - 1) и в присутствии эйдо регулятора (опыт - 2): а) сукцин атдеги дрогеназа; о) малатде! "идро гет таз а,

В результате функционирования пентозофосфапюго пути образуется восстановленный НАДФ, необходимый для синтеза м а солидных антибиотиков, Функционирование этого пути у продуцента имбрицина £ тЬпсашя в условиях регуляции биосинтеза антибиотика оценивали по активности глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) и глутаматдегидрогетшы (КФ 1.4.1,). вследствие их специфичности к НАДФ и регулирующего воздействия глутаматдет идрогеназы на синтез глутамиповой кислоты, которая является предшественником аргинина. Аргинин, в свою очередь, может являться донором гуанидиновой группировки, входящей л состав боковой цепи молекулы имбрицина. Также определяли активность НАДФ-специфичного фермента ЦТК изоцитратдегидротевазы.

Как видно из рис. 10, а, активность Г-б-ФДГ в условиях эндор с гулянии находилась на достаточно высоком уровне по сравнении с контролем, начиная с 48 ч роста продуцента, то есть с момента, когда начинается интенсивный синтез антибиотика, формируются его циклические структуры.

Г>|ммя кулаги ил рОМм П Н» час

а)

800 -, ТОО 600 .

ам -

400 -

Зои -ш 100 о

Вреггн ^у-[ыипироракия. ч к

б)

Рисунок 10. Активность НАДФ-зависимыж ферментов при выращивании 5. ¡тЫчсатх в присутствии эндорегулятора:

а) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназз;

б) глутаматдегидрогеназа;

в) изо! щтратде г и дро геназ а, Кривые!

2 - активность ферментов; 3 и 4 - накопление имбрицина в кж.

Кривые I и 3 контроль; 2 и 4 -опыт.

И 43

ВЗН'ми ч^.>>,;>1-1,|гI и. час

В)

Активность НАДФ-специфичной глутаматде гидр о геназ ь{ (рис. 10, б) е присутствии эндорегулятора на 24 часа ферментации превышала контрольные значения в 3.5 раза. Это может быть связано не только с участием данного фермента в регенерации НАДФ-Н2 у 5'. %тЬпсаШ, но и с иитгчевйиым образованием в этот период глутаминовой кислоты, являющейся предшественником структурных единиц боковой цепи молекулы имбрицина Для из о цитр атдеги др о ге наз ъ; показано, что в присутствии эндорегулятора ее активность была значительно выше, чем в обычных условиях развития продуцента.

Полученные результаты дают возможность предположить, что в клетках продуцента имбрицина кроме ЦГК должен существовать дополнительный путь превращения субстрата, с помощью которого осуществляется синтез малата и оке ад »ацетата, Очевидно, таким путем может быть глиокей латный цикл. Из-за низкой активности сукцинатдегидрогеназы накапливающийся сукцинат может трансформироваться в метилмалонил-КоА, который, в свою очередь, участвует в синтезе имбрицина.

Уменьшение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот при усилении синтеза антибиотика связано не только с меньшим вовлечением в него ацетил-КоА. Как известно, ключевой метаболит ЦТК - оксадоацетат - участвует в реакции карбоксилирования ацетил-КоА и пропиотшл-КоЛ, являясь субстратом анаплеротического фермента — ФЕП-

карбоксилазы Низкая активность дегидрогеназ ЦТК дает возможность продуценту более интенсивно вовлекать оксалоацетат в образование малонил-КоА и метилмалонил-КоА, которые участвуют в построении молекулы имбрицина

Таким образом, проведенные исследования показали, что усиление биосинтеза имбрицина в присутствии эндорегулятора связано с изменением функционирования гликолиза и подавлением активности ферментов ЦТК, что обеспечивает перераспределение пирувата в сторону образования малонатных единиц, составляющих молекулу имбрицина Одновременно происходит увеличение активности НАДФ-зависимых систем, осуществляющих образование макролактонного кольца молекулы антибиотика

ВЫВОДЫ

1 Установлено наличие у продуцента противогрибкового макролидного неполиенового антибиотика имбрицина 5 тЬпсаш ауторегуляторной системы антибиотикообразования В процессе культивирования актиномицет 5 \mbricatus выделяет в среду ауторегулятор, стимулирующий образование собственного антибиотика на 40-50 %

2 Показано, что образование эндорегулятора культурой 5 гтЬпсаЬт начинается с первых часов культивирования и достигает максимума к 96 часам в условиях интенсивной аэрации при рН 7,0-7.5 и зависит от состава питательной среды

3 Показано, чго образование эндорегулятора возможно только мутантными штаммами 5 ¡тЬпсаш.ч причем как низкоактивным (штамм 1 5), так и высокопродуктивными ш гаммами 9М и С9 Исходный штамм ЛИА 0112/90, выделенный из почвенного образца, не обладает способностью образовывать эндорегулятор Добавление эндорегулятора в агаризованную среду Чапека вызывает изменение морфолою-культуральных признаков всех мутантных штаммов продуцента 5 апЬпсШш

4 Внесение эндорегуляторного соединения 5 тЪпсМт на разных стадиях развития продуцентов противогрибковых макролидных полиеновых антибиотиков — нистатина, амфотерицина В, леворина -способствует увеличению образования этих антибиотиков на 15-35 % Для этих продуцентов эндорегулятор, образуемый культурой 5 гтЬпсаШ является экзогенным стимулятором прорастания спор

5 Разработан метод получения и очистки сырца эндорегулятора из культуральной жидкости 5 тЬпсаП¿у, позволяющий получить стабильный сухой препарат сырца эндорегулятора со степенью очистки 90 % без потери стимулирующего эффекта

6 Усиление биосинтеза имбрицина при использовании сырца эндорегулятора связано с изменением функционирования гликолиза и подавлением активности ферментов ЦТК, что обеспечивает перераспределение пирувата в сторону образования малонатных единиц, составляющих молекулу имбрицина Одновременно происходит увеличение активности НАДФ-специфичных систем, осуществляющих образование макролактонного кочьца молекулы имбрицина

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Яковлева Е П, Яекович Г А, Толкова О В Биологические и химические свойства аутобиоактиватора синтеза имбрицина // Тезисы докладов международ науч конф «Фармция в XXI веке инновации и традиции», 7-8 апреля 1999, СПб - СПб, 1999 - С 44

2 Топкова О В, Яковлева Е II, Яекович Г А Изучение биосинтез неполиенового антибиотика имбрицина на среде, содержащей фильтрат ультуралыюй жидкости продуцента // Антибиотики и химиотерапия — 2000 - Т 45, № 10 - С 5-9

3 Топкова О В Изучение влияния состава питательной среды на образование ауторегулятора культурой Я1гер1отусе,ч тЬпсаш // Материалы науч -методич конф СГ1ХФА «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли», 20 февраля 2004 - СПб, 2004 - С 87

4 Топкова О В , Алексинцева О А , Яковлева Е П , Котова Н В Влияние ауторегулятора культуры Б^ерготусев ипЬпсшш на антибиотикообразование мутантных вариантов штамма продуцента // Сб науч трудов юбилейной конф «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», 9 декабря 2005, СПб - СПб Изд-во СПХФА, 2005 -С 86-88

5 Топкова О В , Яковлева Е П , Котова Н В , Яекович Г А Выбор способа выделения ауторегулятора из фильтрата культуральной жидкости Б1герСотусв5 ипЬпсаШ И Естественные и технические науки - 2006 - № 3 -С 65-69

J

Подписано в печать 02 10 07 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная Печать офсетная Объем 1,5 п л Тираж 100 экз Заказ № 155

Отпечатано в типографии ГНУ «ИОВ РАО» 191180, Санкт-Петербург, наб р Фонтанки, 78

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Топкова, Оксана Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Некоторые механизмы регуляции биосинтеза антибиотиков.

1.1.1. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы.

1.1.2. Характеристика ауторегуляторов, образуемых актиномицетами

1.2. Механизм биологического действия некоторых ауторегуляторов актиномицетов.

1.2.1. Влияние A-фактора на различные виды актиномицетов.

1.2.2. Роль других регуляторов, образуемых актиномицетами, в дифференциации некоторых представителей рода Streptomyces.

1.2.3. Методы и условия выделения и идентификации микробных ауторегуляторов.

1.3. Макролидные противогрибковые антибиотики.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. ОБРАЗОВАНИЕ КУЛЬТУРОЙ STREPTOMYCES IMBRICATUS ВЕЩЕСТВ, СТИМУЛИРУЮЩИХ БИОСИНТЕЗ АНТИБИОТИКОВ.

3.1. Условия образования эндорегулятора при культивировании.

S. imbrica tus на комплексной регламентной среде.

3.2. Образование эндорегулятора различными штаммами.

S. imbricatus.

3.3. Влияние состава питательной среды на образование эндорегулятора культурой S. imbrica tus.

3.4. Влияние эндорегулятора S. imbricatusна антибиотикообразование у продуцентов некоторых макролидных антибиотиков.

3.5. влияние эндорегулятора S. imbrica tus на морфолого-культуральные признаки собственного продуцента и продуцентов некоторых макролидных антибиотиков.

3.6. влияние фильтрата кж S. imbrica tus на образование имбрицина при его внесении на разных стадиях процесса культивирования.

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ СЫРЦА ЭНДОРЕГУЛЯТОРА S. IMBRICATUS ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ И ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ.

4.1. Изучение физико-химических свойств фильтрата кж.

S. imbricatus, содержащего эндрегулятор.

4.2. Очистка фильтрата, содержащего эндорегулятор S. imbricatus.

4.3. Выделение эндорегулятора S. imbricatus из фильтрата кж продуцента.

4.4. Определение химической природы сырца эндорегулятора

S. imbricatus.

4.5. Изучение биологических свойств сырца эндорегулятора

S. imbricatus.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ЭНДОРЕГУЛЯТОРА НА НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ STREPTOMYCESIMBRICATUS.

5.1. Разработка и оптимизация состава синтетической питательной среды для биосинтеза имбрицина.

5.2. Изучение роста S. imbricatus в условиях ауторегуляции биосинтеза имбрицина.

5.3. Влияние эндорегулятора на активность некоторых ферментов

S. imbricatus.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ауторегулятор культуры Streptomyces imbricatus и его влияние на биосинтез макролидных антибиотиков"

Регуляция, то есть управление скоростью биохимических процессов, лежащих в основе биосинтеза биологически активных веществ, является одним из приоритетных направлений исследований в области фундаментальной биотехнологии. Изучение процессов регуляции клеточной дифференциации актиномицетов и связанного с ними сверхсинтеза вторичных метаболитов, в частности антибиотиков, заключается в поиске путей управления скоростью биохимических реакций синтеза вследствие обратимого изменения количества посредников или промежуточных продуктов и их активности. По своей природе регуляторы делятся на две основные группы - эндо- и экзорегуляторы. Эндорегуляцию осуществляют соединения - аутобиорегуляторы, синтезируемые самим микроорганизмом и являющиеся, как правило, индукторами ферментов синтеза вторичных метаболитов; экзорегуляцию -специфические соединения, вносимые извне.

Наиболее изучены низкомолекулярные микробные ауторегуляторы, образуемые микроорганизмами рода Б^ер^тусез, среди которых основными являются А-фактор и его аналоги - низкомолекулярные соединения -бутиролактоны [1]. Известно, что эти соединения выполняют функцию «сигнальных молекул» при переключении этапов дифференциации и являются индукторами активации ферментов синтеза вторичных метаболитов [2].

В последние годы доказано полимодальное действие ауторегулятора, проявляющееся уже на уровне популяции и являющееся своеобразным биохимическим сигналом для более синхронного прорастания спор. Однако сведений о конечном результате этого воздействия - синтезе вторичных метаболитов, в источниках литературы не приводится.

Представленные в литературе сведения об образовании аутобиорегуляторов продуцентами макролидных антибиотиков весьма немногочисленны. Сведений об образовании регуляторных соединений продуцентами противогрибковых антибиотиков, в том числе продуцентом имбрицина Я. тЪпсаШ, в источниках литературы не обнаружено.

В связи с вышеизложенным важными и своевременными представляются исследования, направленные на изучение регулятора, обнаруженного у продуцента противогрибкового неполиенового макролидного антибиотика имбрицина и выяснение роли этого соединения в регуляции роста культуры и антибиотикообразования.

Исследование проводилось в рамках научных работ, выполняемых на кафедре биотехнологии Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии в соответствии с планом по теме «Исследование молекулярно-биологических механизмов синтеза вторичных метаболитов из ряда макроидных антибиотиков и низкомолекулярных цитокинов».

Цель и задачи исследования

Изучение возможности регуляции биосинтеза противогрибкового антибиотика имбрицина и других макролидных антибиотиков эндорегулятором, образуемым культурой Б^ер^тусеБ тЬпсШш.

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

- изучить условия образования эндорегуляторного соединения продуцентом имбрицина и его влияние на биосинтез антибиотика различными штаммами & тЬпсаШ;

- исследовать влияние эндорегулятора Б. тЬпсаШБ на морфолого-культуральные признаки собственного продуцента и продуцентов некоторых макролидных антибиотиков;

- выделить эндорегулятор из культуральной жидкости актиномицета Я. тЬНсаШ, изучить некоторые его физико-химические и биологические свойства;

- исследовать особенности основных путей обмена углеводов у & тЬпсаШ в условиях стимуляции биосинтеза имбрицина в присутствии регулятора.

Научная новизна исследования

Впервые доказано наличие ауторегуляторной системы антибиотикообразования у культуры & тЬпсШт - продуцента противогрибкового макролидного неполиенового антибиотика имбрицина.

Выявлено влияние условий культивирования продуцента на синтез эндорегулятора, максимальное накопление которого в культуральной жидкости (кж) совпадает с максимумом антибиотикообразования и зависит от состава питательной среды, значения рН и интенсивности аэрации.

Установлено, что способностью образовывать эндорегуляторное соединение обладают мутантные штаммы актиномицета Я. тЬпсаШ, как низкоактивные, так и высокопродуктивные варианты. Внесение эндорегулятора в агаризованную среду Чапека вызывает изменение морфолого-культуральных признаков всех мутантных штаммов продуцента.

Доказана возможность увеличения интенсивности образования противогрибковых полиеновых антибиотиков - нистатина, леворина, амфотерицина В под воздействием эндорегуляторного соединения & тЬпсаШ на разных стадиях развития продуцентов указанных антибиотиков. Для продуцентов этих антибиотиков эндорегулятор, образуемый культурой £ тЬпсаШ, является экзогенным стимулятором прорастания спор и/или индуктором дифференциации.

Показано, что по ряду физико-химических и биологических свойств выделенный эндорегулятор является новым и отличается от описанных в литературе регуляторов, образуемых актиномицетами.

Впервые для продуцента противогрибкового неполиенового антибиотика имбрицина установлено, что усиление антибиотикообразования в присутствии эндорегулятора происходит вследствие подавления активности ферментов цикла трикарбоновых кислот, что обеспечивает перераспределение пирувата в путях образования поликетидной цепи молекулы антибиотика.

Практическая значимость работы

При внесении ауторегулятора, содержащегося в кж 5. тЬгкаШз, в ферментационную среду синтез имбрицина увеличивается на 40 - 50 %.

Составлена ведомость изменений к лабораторному регламенту на производство имбрицина, предусматривающая использование фильтратов кж Я. ШЬгкШш вместо воды при приготовлении питательных сред. Это позволит сократить количество стоков в виде отработанного нативного раствора на стадии фильтрации культуральной жидкости.

Разработан и оптимизирован состав синтетической питательной среды для культивирования & тЬгкШт, на которой уровень антибиотической активности продуцента близок к уровню синтеза имбрицина на регламентной питательной среде, а при добавлении ауторегулятора достигает максимальных значений активности высокопродуктивного штамма.

Показано сохранение высокого уровня антибиотикообразования в течение длительного времени при хранении спорового посевного материала продуцентов имбрицина, леворина, нистатина и амфотерицина В на агаризованных средах с эндорегулятором Я. тЬНсШш, что позволяет рекомендовать включение фильтратов кж & тЬпсШш в состав прописей этих сред.

Разработан метод получения и очистки сырца эндорегулятора из культуральной жидкости £ тЬпсаШ. Выделен сырец со степенью очистки 90,0 %.

Результаты работы используются в лабораторном практикуме по дисциплине «Технология биосинтеза БАВ» для студентов факультета промышленной технологии лекарств (специальность 240901 - Биотехнология) на кафедре биотехнологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Продуцент имбрицина, культура БКер^тусез тЪпсаШз образует регулятор, стимулирующий биосинтез собственного антибиотика.

2. Применение эндорегулятора & тЬпсаШ на разных стадиях культивирования продуцентов леворина, амфотерицина В и нистатина обеспечивает повышение образования этих антибиотиков.

3. Способ выделения и очистки эндорегулятора & тЬНсШш из культуральной жидкости обеспечивает получение сырца эндорегулятора со степенью чистоты 90 %.

4. Эндорегулятор & тЪпсаШ изменяет метаболизм продуцента в сторону увеличения синтеза имбрицина.

Апробация работы

Результаты исследований обсуждены на заседании кафедр биотехнологии и микробиологии СПХФА, доложены на Международной научной конференции «Фармация в XXI веке: инновации и традиции» (Санкт-Петербург, 1999); научно-методической конференции СПХФА «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (Санкт-Петербург, 2004); научной конференции СПХФА «Подготовка кадров для фармацевтической промышленности», (Санкт-Петербург, 2005).

Личный вклад автора

Лично автором получены все результаты, представленные в главах 3 и 5 исследования. Результаты, изложенные в главе 4, получены при совместной работе с ведущим научным сотрудником лаборатории биотехнологии СПХФА Яскович Г.А.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литератур, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 22 рисунка. Библиография включает 191 источник.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Топкова, Оксана Владимировна

выводы

1. Установлено наличие у продуцента противогрибкового макролидного неполиенового антибиотика имбрицина S. imbrîcatus ауторегуляторной системы антибиотикообразования. В процессе культивирования актиномицет S. imbrîcatus выделяет в среду ауторегулятор, стимулирующий образование собственного антибиотика на 40-50 %.

2. Показано, что образование эндорегулятора культурой S. imbrîcatus начинается с первых часов культивирования и достигает максимума к 96 часам в условиях интенсивной аэрации при рН 7,0-7,5 и зависит от состава питательной среды.

3. Показано, что образование эндорегулятора возможно только мутантными штаммами S. imbrîcatus, причем как низкоактивным (штамм 1.5), так и высокопродуктивными штаммами 9М и С9. Исходный штамм ЛИА 0112/90, выделенный из почвенного образца, не обладает способностью образовывать эндорегулятор. Добавление эндорегулятора в агаризованную среду Чапека вызывает изменение морфолого-культуральных признаков всех мутантных штаммов продуцента S. imbrîcatus.

4. Внесение эндорегуляторного соединения S. imbrîcatus на разных стадиях развития продуцентов противогрибковых макролидных полиеновых антибиотиков - нистатина, амфотерицина В, леворина -способствует увеличению образования этих антибиотиков на 15-35 %. Для этих продуцентов эндорегулятор, образуемый культурой S. imbrîcatus является экзогенным стимулятором прорастания спор.

5. Разработан метод выделения и очистки эндорегулятора из культуральной жидкости S. imbrîcatus, позволяющий получить стабильный сухой препарат сырца эндорегулятора со степенью очистки 90 % без потери стимулирующего эффекта.

6. Усиление биосинтеза имбрицина в присутствии эндорегулятора связано с изменением функционирования гликолиза и подавлением активности ферментов ЦТК, что обеспечивает перераспределение пирувата в сторону образования малонатных единиц, составляющих молекулу имбрицина. Одновременно происходит увеличение активности НАДФ-специфичных систем, осуществляющих образование макролактонного кольца молекулы антибиотика.

заключение

Проблема достижения сверхсинтеза биологически активных веществ стоит перед исследователями практически с момента становления биотехнологии как отрасли промышленности. В последние годы решение этой проблемы связывают с изучением новых путей управления ходом биотехнологических процессов с использованием молекулярных механизмов регуляции.

Регуляция, то есть управление скоростью биохимических процессов, лежащих в основе биосинтеза биологически активных веществ, является одним из приоритетных направлений исследований в области фундаментальной биотехнологии. Регуляцию осуществляют специфические вещества, синтезируемые самими микроорганизмами - эндорегуляторы, или вносимые извне - экзорегуляторы. Наиболее известными эндорегуляторами стрептомицетов являются А-фактор и его аналоги - низкомолекулярные соединения бутиролактонной природы, выполняющие роль триггера при переключении этапов дифференциации и являющиеся индукторами активации ферментов синтеза вторичных метаболитов [1, 69, 95].

В результате проведенных нами исследований установлено, что в процессе культивирования актиномицет & ШЬпсШш выделяет в среду вещество, стимулирующее образование собственного антибиотика эндорегулятор. Максимальное накопление этого вещества в кж совпадает с максимумом образования имбрицина и приходится на 96 часов роста продуцента (рис. 3).

Обследование различных по уровню антибиотической активности вариантов штаммов 5. тЬпсШш показало, что не все они способны образовывать эндорегуляторное вещество. Исходный «дикий» штамм & тЬпсШш ЛИА-0112/90, выделенный из почвенного образца, вообще не обладает способностью к синтезу эндорегулятора, а высокоактивный мутантный вариант & тЬпсаШя С9 образует данное вещество в незначительных количествах. Очевидно, образование эндорегулятора напрямую связано с воздействием на культуру Я. тЪгкаШя различных мутагенных факторов.

Изучено влияние условий культивирования на образование эндорегулятора. Показано, что важнейшими из этих условий являются рН, аэрация, состав питательной среды. Культура & тЬНсаШ образует регулятор только в интервале рН 7,0-7,5, в условиях интенсивной аэрации. Оптимальными для синтеза эндорегулятора являются обогащенные питательные среды, содержащие значительные количества источников углерода и азота. Полученные данные в некоторой степени подтверждают существующую сегодня теорию реакций «кворум-сенсинга» у микроорганизмов, согласно которой ауторегуляторы начинают свое действие только при достижении определенной концентрации в среде и определенной плотности популяции продуцента [96,97].

При изучении условий, благоприятствующих наиболее полному проявлению стимулирующего действия эндорегулятора, было выяснено, что он оказывает стимулирующий эффект на образование имбрицина высокоактивными штаммами & ¡тЬпсаШя 9М и С9 только при прибавлении его в исходную ферментационную среду. Для низкоактивного штамма 1.5 стимулирующий эффект от внесения эндорегулятора проявляется на всех стадиях культивирования. Имеет место кумулятивный эффект от внесения эндорегулятора на всех стадиях культивирования этого штамма, который выражается в увеличении биосинтеза имбрицина на 260 % по сравнению с контролем.

Изучение микробных ауторегуляторов типа А-фактора показало, что они обладают не только эндо-, но и экзорегуляторным воздействием на стрептомицеты [1, 65, 69]. Критерием оценки действия таких регуляторов является усиление или индуцирование процессов морфогенеза и синтеза антибиотиков при внесении регулятора в среду культивирования.

Отмечено, что эндорегулятор & ЫЬпсаШ обладает экзорегуляторным воздействием на продуценты некоторых макролидных антибиотиков. При внесении фильтратов кж З1. тЬпсМш в соответствующие питательные среды наблюдали стимулирование биосинтеза нистатина культурой 5. поиг$е1 845 на 36 %, а также изменение морфолого-культуральных признаков у продуцентов леворина (& 1еуот 78), амфотерицина В (5. пойозт 143) и нистатина. Кроме того, было установлено, что при внесении в агаризованные питательные среды эндорегулятора & тЬпсШт споровый посевной материал указанных выше продуцентов антибиотиков хранится в течение 24 месяцев без снижения уровня антибиотикообразования.

Таким образом, в результате проведенных исследований у продуцента имбрицина обнаружен ауторегулятор, при внесении которого в ферментационную питательную среду синтез собственного антибиотика возрастает на 40-50 %.

Также ауторегулятор 5. тЪпсаШъ оказывает положительное влияние на биосинтез противогрибкового антибиотика нистатина.

В связи с этим при осуществлении ферментации 5. тЬНсШш и 5. поиг$е1 можно рекомендовать приготовление питательных сред с использованием нативного раствора со стадии фильтрации кж тЬпсаШ. Это позволит сократить количество промышленных стоков (приложение III).

В ходе дальнейших исследований были изучены физико-химические характеристики фильтратов кж 5. тЬпсШш и выбраны параметры для стандартизации фильтратов. В качестве таких параметров приняты рН, цветность при А, = 360 нм и содержание сухого остатка (табл. 10). Разработан способ выделения сырца эндорегулятора из кж продуцента имбрицина путем сорбции на анионите Оо\уех 2x8 (рис. 14).

Сырец эндорегулятора представляет собой лиофильно высушенный порошок белого с кремоватым оттенком цвета, гигроскопичный, хорошо растворимый в воде, термостабильный и является многокомпонентной смесью. Установлено, что эндорегулятор не является белком и представляет собой низкомолекулярное вещество (или вещества) органической природы.

Дальнейшую очистку сырца эндорегулятора проводили методом гель-фильтрации на Сефадексе ЬН-20 (см. раздел 4.4). Показано, что фракции стимуляторов антибиотикообразования (10-14) проявляли более высокую стимулирующую активность, чем исходный раствор сырца эндорегулятора. Можно полагать, что причиной этого являлось отсутствие высокомолекулярных соединений, оставшихся во фракциях 1-9.

Влияние сырца эндорегулятора на биосинтез имбрицина различными штаммами & тЬпсаШ зависит от вносимой дозы и времени его внесения в питательную среду для культивирования актиномицета. Наибольший стимулирующий эффект сырец эндорегулятора оказывает при добавлении его в среду перед посевом, в концентрации 12 мг/мл для высокоактивного штамма 9М и 0,1 мг/мл - для низкоактивного штамма 1.5 культуры Б. тЪпсМш. Очевидно, низкоактивный мутантный штамм 1.5 более чувствителен к действию эндорегулятора вследствие возникшей в результате воздействия мутагенов активации резервных регулирующих систем, отвечающих за рецепцию регуляторного фактора.

Изучение обменных процессов, протекающих в микробной клетке, проводят, как правило, на синтетических средах, позволяющих оценить метаболизм основных питательных веществ среды и уровень ферментативной активности.

Для этой цели нами была разработана синтетическая питательная среда, на которой уровень активности & тЬпсаШ сопоставим с активностью кж, полученной при ферментации продуцента на комплексной питательной среде.

Показано, что, усиление образования имбрицина в присутствии сырца эндорегулятора обусловлено не увеличением биомассы актиномицета, а его более высокой продуктивностью. Уровень продуктивности мицелия тЬНсШш в присутствии эндорегулятора превышал контрольные значения в среднем на 60 %, а наибольшая продуктивность отмечалась при скорости роста, которая была в 10 раз меньше максимальной (табл. 22).

Усиление биосинтеза имбрицина в присутствии эндорегулятора обусловлено, очевидно, происшедшими изменениями в обменных процессах & ШЬпсаШ, обеспечивающих синтез антибиотика. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния эндорегулятора на некоторые ферментные системы первичного метаболизма, участвующие в биосинтезе имбрицина. Прежде всего, нас интересовали изменения в углеводном обмене, так как образование предшественников молекулы неполиенового антибиотика имбрицина связано с метаболизмом глюкозы.

В ряде работ, посвященных изучению биологического действия А-фактора, показано его воздействие на ферментативную активность продуцентов антибиотиков и, в частности, блокирование Г-6-ФДГ, приводящее к прекращению функционирования пентозофосфатного пути утилизации глюкозы. В свою очередь, взаимосвязь основных путей метаболизма углеводов - гликолитического и пентозофосфатного - с антибиотикообразованием давно и широко обсуждается в литературе [27, 113, 123,181, 182].

Именно поэтому нами было изучено влияние эндорегулятора & тЪпссйт на активность некоторых ферментов гликолиза и пентозофосфатного цикла. Показано, что в условиях аутостимуляции биосинтеза имбрицина активность исследованных ферментов гликолитического и пентозофосфатного путей была выше, чем в контрольном варианте (рис. 19, 20), особенно на 48 часов ферментации. В этот период начиналось и наибольшее превышение образования антибиотика в опытах с использованием сырца эндорегулятора по сравнению с обычными условиям культивирования & тЬпсаШ.

Полученные результаты представляются закономерными с учетом того, что в процессе гликолиза образуется фосфоенолпируват, участвующий в образовании предшественников макролидного кольца молекулы имбрицина.

Интересным представляется факт отсутствия блокирования активности Г-6-ФДГ при наличии в среде сырца эндорегулятора. Очевидно, это может свидетельствовать о различной природе А-фактора и исследуемого нами эндорегулятора & тЬпсаШ.

Синтез макролидного кольца полиеновых и неполиеновых антибиотиков осуществляется за счет конденсации малонатных и метилмалонатных единиц, которые образуются при карбоксилировании ацетил-КоА и пропионил-КоА [121, 125,126,191].

Наблюдаемое нами уменьшение активности пируватдегидрогеназного комплекса в период увеличения биосинтеза имбрицина (рис. 21) свидетельствует, что в условиях эндорегуляции образования антибиотика в начальный период усиливается активность карбоксилирующих систем, в том числе и ФЕП-карбоксилазы. Конкурирование ФЕП-карбоксилазы и пируваткиназы за общий субстрат (ФЕП) и объясняет низкую активность пируватдегидрогеназы у & тЬпсайю при стимулировании биосинтеза имбрицина.

Присутствие в среде культивирования сырца эндорегулятора приводило также к изменению активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот (рис. 22).

Активность сукцинатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы в условиях эндорегуляции биосинтеза имбрицина снижалась по сравнению с контролем.

Результаты наших исследований подтверждают точку зрения исследователей [27, 113, 127, 128], считающих, что низкая активность ферментов ЦТК создает условия для утилизации ацетата в основном для биосинтеза антибиотиков. Низкая активность дегидрогеназ ЦТК дает возможность продуценту более интенсивно вовлекать оксалоацетат в образование малонил-КоА и метилмалонил-КоА. Так, вероятно, осуществляется регуляция биосинтеза имбрицина в данном случае.

Важно подчеркнуть, что в наших опытах под влиянием сырца эндорегулятора возрастали активности ферментов, ответственных за регенерацию НАДФ-Н2: Г-6-ФДГ, глутаматдегидрогеназы и изоцитратдегидрогеназы. Можно полагать, что синтез имбрицина актиномицетом & тЪпсШш тесно связан с активностью этих ферментов. Подобное явление корреляции биосинтеза антибиотика с активностями НАДФ-зависимых дегидрогеназ отмечалось для продуцентов леворина [187] и новобиоцина [8]. Увеличение активности глутаматдегидрогеназы в опытных ферментациях связано, вероятно, и с интенсивным образованием глутаминовой кислоты, являющейся предшественником структурных единиц боковой цепи молекулы имбрицина.

В условиях эндорегуляции усиление образования имбрицина происходит на сравнительно высоком уровне катаболизма глюкозы как по гликолитическому, так и по пентозофосфатному пути, обеспечивая биосинтез антибиотика необходимыми предшественниками и восстановительными эквивалентами. Регуляция биосинтеза имбрицина осуществляется за счет снижения активности дегидрогеназ ЦТК и более интенсивного вовлечения оксалоацетата в образование малонил-КоА и метилмалонил-КоА.

Под влиянием эндорегулятора, образуемого 5. тЬпсаШз, происходило также увеличение образования макролидных полиеновых антибиотиков, таких, как нистатин, леворин, амфотерицин В.

Сопоставляя известные литературные и собственные экспериментальные данные, выявили определенные отличия изучаемого эндорегулятора Б. тЬпсаШя от наиболее известного и изученного актиномицетного регулятора дифференциации и антибиотикообразования - А-фактора [1, 166]. Сравнительная характеристика этих регуляторных соединений приведена в табл. 23.

Из представленных данных видно, что отличия между А-фактором и эндорегулятором Б. тЬпсШш существует на уровне как физико-химических, так и биологических свойств, что позволяет считать этот ауторегулятор новым, существенно отличным от описанных в литературе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Топкова, Оксана Владимировна, Санкт-Петербург

1. Хохлов, А. С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы М.: Наука, 1988.-272 с.

2. Люй, X., Нефедова, М. В., Захарчук, Л. М. Влияние теплового шока на образование и состав актиномицинов // Антибиотики и химиотерапия. 2000. -Т.45, № 2. - С.5-9.

3. Дубицкая, Л. П., Федоренко, В. А. Влияние глюкозы на антибиотическую активность и резистентность к антибиотикам у Streptomyces peuceticus subsp. caesius АТСС 27952-2 и его мутантов // Антибиотики и химиотерапия. 2002. -Т.47, № 6. - С.7-11.

4. Безбородое, А. М. Биохимические основы регуляции биосинтеза антибиотиков // Механизмы биосинтеза антибиотиков. М.: Наука, 1986. - С.34-45.

5. Яковлева, Е. П. Научные основы совместного культивирования продуцентовполиеновых антибиотиков с дрожжеподобными грибами: дис. д-р биол.наук: 03.00.23 -Л., 1986.-397 с.

6. Безрукова, И. П. Регуляция биосинтеза новобиоцина и микогептина: дис.канд. биол. наук: 03.00.23 Л., 1987. - 196 с.

7. Martin, J. F., Demain, A. L. Control of antibiotics biosynthesis // Microbiol. Rev. -1980.- V.44,№2.-P. 230-251.

8. Бирюков, В. В., Кантере, В. М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. М.: Наука, 1985. - 296 с.

9. Егоров, Н. С. Антибиотики / Н. С. Егоров // Промышленная микробиология. M.: Высшая школа, 1989. - С. 236-285.

10. Семенова, Л. Э., Бирюков, В. В., Орлова, Н. В. Изучение влияния параметров аэрации перемешивания на процесс биосинтеза окситетрациклина //Антибиотики. - 1976. -Т.21,№ 11. - С.971-978.

11. Лазникова, Т. Н., Фочкина, О. С., Орлова, Н. В. Значение pH для роста продуцента сизомицина и биосинтеза антибиотика // Антибиотики. 1981. -Т.26, № 6. - С.410-414.

12. Weinberg, Е. D. Mineral element control of microbial secondary methabolism // Microorganisms and minerals. Dekker, 1977. - P.289-316.

13. Сухаревич, В. И., Яковлева, Е. П., Цыганов, В. А. Влияние аэрации и редокс-потенциала среды на биосинтез леворинов А и Б // Микробиология. -1970. Т.34, вып.6. - С.981-985.

14. Сухаревич, В. И., Швецова, H. М., Яковлева, Е. П. О зависимости между редокс-потенциалом среды и процессом антибиотикообразования у Streptoverticillium mycoheptinicum шт.56 // Антибиотики. 1970. - Т. 15, № 11. -С.981-984.

15. Воробьева, Л. И. Техническая микробиология. М.: МГУ, 1987. - С. 139-150.

16. Навашин, С. М. Проблемы генетической инженерии в области антибиотиков // Механизмы биосинтеза антибиотиков. М.: Наука, 1986. - С.5-34.

17. Huckenhull, J. D. Antibiotic production by fermentation // Essays in Appl. Microbiol. / Eds. J. R. Norris, M. N. Richmond. New-York, 1981. - P.411.

18. Sankaren, L., Pogell, В. M. Biosynthesis of puromycin in Streptomyces alboniger: regulation and properties of O-demethylpuromycin O-methyltransferase // Antimicrob. Agents Chemother. 1975. - V.8, № 6. - P.721-732.

19. Satoh, A., Ogawa, H., Satomura, J. Regulation of N-acetylkanamycin-amidochydrolase in the idiophase in kanamycin fermentation // Agr. Biol. Chem. -1976. V.40, № 2. - P.191-196.

20. Hinnen, A., Naesch, J. Ensymatic hydrolysis of cephalosporin С by an extracellular acetylhydrolase of Cephalosporium acremonium // Antimicrob. Agents Chemother. 1976. - V.9, № 5. - P.824-830.

21. Грачева, В. И., Орлова, Н. В. Влияние концентрации фосфора на образование новобиоцина продуцентом Act. spheroides // Антибиотики. 1975. -Т.20, № 10. - С.871-876.

22. Behal, V., Gregorova-Prusakova, J., Hostalek, Z. The influence of inorganic phosphate and benzyl thiocyanate on the activity of anhydrotetracycline oxygenase in Streptomyces aureofaciens // Folia Microbiol. 1982. - V.27, № 2. - P. 102-107.

23. Алексинцева, О. А. Особенности биосинтеза леворина культурой Streptomyces levoris Krass: дис. канд. биол. наук: 03.00.23 JI., 1982. - 194 с.

24. Martin, J. F., Liras, P., Demain, A. L. Control by phosphate and ATPH of antibiotic formation: In. / 5th Int. Ferment. Symp. 4th Int. Spec. Symp. Yeasts. Berlin. 1976. Abstr. Pap. Berlin, 1976. - P. 146-152.

25. Martin, J. F. Phosphate regulation of gene expression of candicidin biosynthesis // Microbiology / Ed. by Schlessinger D. American Society for Microbiology. Washington.: D.C. - 1976. - P.548-552.

26. Gil, J. A., Campelo-Diez, A. B. Candicidin biosynthesis in Streptomyces griseus // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2003. - V.60, № 6. - P.633-642.

27. Гошталек 3. Метаболическая регуляция биосинтеза хлортетрациклина // Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды: тезисы докл. и сообщ. симп. ФЕМО. 1-7 июня 1983 г., Пущино. Пущино, 1983. - С.13-14.

28. Бакулин, М. К. и др. Влияние перфторорганических соединений на рост стрептомицетов и биосинтез ими антибиотика даунорубицина /М. К. Бакулин,

29. А. С. Кучеренко, JL В. Бакунина, В. В. Шведов // Антибиотики и химиотерапия.- 2003. Т. 48, № 12. - С.5-8.

30. Лойко, Н. Г. Ауторегуляторные факторы развития бактериальных культур: автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2003. - 24 с.

31. Demain, A. L. Regulatory mechanisms and industrial production of microbial metabolites // Lloydia 1968. - V.31. - P.395-418.

32. Навашин, С. M., Сазыкин, Ю. О. Перспективы современной биотехнологии в области антибиотиков // Биотехнология. М.: Наука, 1984. - 457 с.

33. Shapiro, J. A. The significances of bacterial colony patterns // BioEssays. 1995.- V.17, № 7. P.597-607.

34. Gray, К. M. Intercellular communication and group behaviour in bacteria // Trends Microbiol. 1997. - V.5, № 5. - P. 184-188.

35. Greenberg, E. P., Winans, S., Fuqua, C. Quorum sensing by bacteria // Ann. Rev. Microbiol. 1996. - V.50. - P.727-751.

36. Brandner, J. P., Kroos, L. Identification of the W 4400 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus // J. Bacteriol. 1998. - V.180, № 8. -P. 1995-2002.

37. Bowden, M. G., Kaplan, H. B. The Myxococcus xanthus lipopolysaccharide O-antigen is required for social motility and multicellular developme // Mol. Microbiol.- 1998.-V.30,№2.-P. 275-284.

38. Austin, D. J., Bu Lock, J. D., Gooday, G. W. Trisporic acids: Sexual gormones from Mucor mucedo and Blakeslea trispora // Nature. 1969. - V. 223. - P. 11781179.

39. Katayama, M., Marumo, S. Isolation of sclerosporin, a sporogenic substanse, from Sclerotinia fructicola// Agr. and Biol. Chem. 1978. - V. 42. - P. 505-506.

40. Батраков, С. Г. и др. Необычный полиольный липид 2-с-а-талопиранозил-5-алкил-(С1зС21)-резорцин из азотфиксирующей бактерии Azotobacter chroococcus / С. Г. Батраков, Н. И. Придачина, Е. Б. Кругляк // Биоорг. химия. 1982. - Т.8. -С.980-996.

41. Reusch, R. N., Sadoff, Н. С. 5-n Alkylresorcinols from Azotobacter vienelandii: isolation and characterisation // J.Bacteriol. 1979. - V.139. - P.448-453.

42. Дуда, В. И. и др. Образование покоящихся рефрактильных клеток у Bacillus cereus под влиянием ауторегулирующего фактора / В. И. Дуда, С. В. Пронин, Г. И. Эль-Регистан, А. С. Капрельянц, Л. Л. Митюшина// Микробиология. 1982. - Т.51. - С.77-81.

43. Капрельянц, А. С. и др. Изменение метаболизма и ультраструктурной организации клеток Вас. cereus под влиянием специфического ауторегуляторного фактора / А. С. Капрельянц, Г. И. Эль-Регистан, А. Н.

44. Козлова, JI. Л. Митюшина, М. В. Дужа, О. Г. Поплаухина, В. И. Дуда, Д. Н. Островский, С. Г. Игнатов // Экспериментальное изучение развития микроорганизмов. Пущино: НЦБИ, 1978. - С.24-25.

45. Кубарева, О. Г. Выделение ауторегуляторного фактора d2 Bacillus cereus и применение его для индукции автолиза клеток культуры продуцента: автореф. дис. канд. биол. наук. М.,1980. - 24 с.

46. Батраков, С. Г. и др. Тирозол ауторегуляторный фактор d дрожжей S. cerevisiae / С. Г. Батраков, Г. И. Эль-Регистан, Н. И. Придачина // Микробиология. - 1993. - Т.62, вып.4. - С.633-638.

47. Коновалова, Е. Ю., Эль-Регистан, Г. И., Бабьева, И. П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов dj и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloides // Биотехнология. 1985. - № 3. - С.71-74.

48. Мулюкин, А. Л. и др. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d в культуральной жидкости Micrococcus luteus / А. Л. Мулюкин, А. Н. Козлова, А. С. Капрельянц, Г. И .Эль-Регистан // Микробиология. 1996. - Т.65, № 1. - С.35-38.

49. Степаненко, И. Ю. и др. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку / И. Ю. Степаненко, А. Л. Мулюкин, А. Н. Козлова, Ю. А. Николаев, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. 2005. - Т.74, № 1. -С.2633.

50. Коновалова, Е. Ю. Ауторегуляция роста и развития дрожжей Rodospiridium toruloides факторами d: автореф. дис. . канд. биол. наук / Е. Ю. Коновалова. -Л., 1985.- 18 с.

51. Бабусенко, Е.С. Ауторегуляция роста и развития метанокисляющих бактерий: автореф. дис. канд. биол. наук / Е. С. Бабусенко М., 1992. - 25 с.

52. Лойко, Н. Г. и др. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thioalkalivibrio versutus / Н. Г. Лойко, А. Н. Козлова, Г. А. Осипов, Г. И. Эль-Регистан // Микробиология. 2002. - Т. 17, вып.З. - С.308-316.

53. Эль-Регистан, Г. И. Покой как форма адаптации микроорганизмов // В кн.: О. В. Бухарин, А. Л. Гинцбург, Ю. М. Романова, Г. И. Эль-Регистан // Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина, 2005. - 367 с.

54. Вахитов, Т. Я. Регуляторные функции бактериальных экзометаболитов на внутрипопуляционном и межвидовом уровнях : автореф. дис. . д-ра биол. наук: 03.00.23 / Т. Я. Вахитов. СПб., 2007. - 40 с.

55. Вахитов, Т. Я. и др. Динамика функции экзометаболитов в процессе роста периодической культуры Escherichia coli М-17 / Т. Я. Вахитов, Е. Н. Момот, Ю. Н. Толпаров // Журн. микробиол. 2005. - № 1. - С. 16-21.

56. Грузина, В. Д. Индукция роста, образования антибиотиков и морфологической дифференцировки при межвидовых взаимодействиях бактерий: автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2003. - 24 с.

57. Корницкая, Е. Я., Товарова, И. И., Хохлов, А. С. Изучение образования А-фактора различными актиномицетами // Микробиология. 1976. - Т.45. - С.302-305.

58. Ефременкова, О. В., Анисова, Л. Н., Бартошевич, Ю. Э. Регуляторы дифференциации актиномицетов // Антибиотики и мед. биотехнология. 1985. -Т.30, № 9. - С.687-707.

59. Ефременкова, О. В. и др. Поиск А-факторозависимых вариантов в популяциях актиномицетов / О. В. Ефременкова, В. Д. Грузина, И. Г. Сумарукова, В. Д. Кузнецов // Микробиология. 2003. - Т.72, № 6. - С.766-769.

60. Анисова, Л. Н. и др. Регуляторы развития Streptomyces coelicolor А3(2) / Л. Н. Анисова, И. Н. Блинова, О. В. Ефременкова, Ю. П. Козьмин, В. В. Оноприенко, Г. М. Смирнова, А. С. Хохлов // Изв. АН СССР: Сер. биол. 1984. - С.98-108.

61. Анисова, Л. Н. и др. Регуляторы дифференциации Streptomyces cyanofuscatus / Л. Н. Анисова, И. Н. Блинова, О. В. Ефременкова, Г. М. Смирнова, А. С. Хохлов // Микробиология. 1984. - Т.53. - С.890-895.

62. Yanagimoto, М. Novel actions of inducer in staphylomycin production by Streptomyces virginiae // J. Farm. Technol. 1983. - V.61. - P.443-448.

63. Yanagimoto, M., Yamada, Y., Terui, G. Extraction and purification of inducing material produced in staphylomycin fermentation // Hakkokogaku. -1979. V.57. -P.6-14.

64. Ефременкова, О. В., Анисова, Т. Н., Камзолкина, О. В. Образование регуляторов типа А-фактора представителями рода Micromonospora // Антибиотики и мед. биотехнология. 1987. - Т.32, № 9. - С.643-647.

65. Бушуева, О. А. и др. Влияние низкомолекулярных регуляторов на биосинтез рифамицина В штаммами Amycolatopsis mediterranei / О. А. Бушуева, О. В. Ефременкова, С. Е. Горин, Ю. Э. Бартошевич // Антибиотики и химиотерапия. -1991.-Т.36,№3.-С.11-14.

66. Biro, S., Birco, Z., van Wezel G. P. Transcriptional and functional analisis of the gene for factor C, an extracellular signal protein involved in cytodifferentiation of Streptomyces griseus // A. van Leeuwenhoek. 2000. - V.78, № 3/4. - P.277-285.

67. McCormic, J. R. D. et al. Cosynthesis of tetracyclines by pairs of Streptomyces aureofaciens mutants / I. R. D. McCormic, V. Hirsch, N. О. Sjolander, A. P. Doerschuk // J. Amer. Chem. Soc. 1960. - V.80. - P.5006-5007.

68. McCormic, J. R. D., Morton, G. D. Identity of cosynthetic factor I of Streptomyces aureofaciens and fragment FO from coenzyme F 420 of Methanobacterium species // J. Amer. Chem. Soc. 1982. - V.104. - P.4014-4015.

69. Jaenchen, R., Schönheit, P., Thauer, R. K. Studies on the biosynthesis of coenzyme F 420 in methanogenic bacteria // Arch. Microbiol. 1984. - Bd. 137. - P. 362-365.

70. Маркелова, С. И., Выпияч, А. Н., Егоров, Н. С. Спорообразование и прорастание спор Bacillus brevis var. G-B в связи с антибиотикообразованием // Антибиотики. 1984. - Т.29. - С.63-72.

71. Daher, Е., Demain, A. L. Germination-initiated spores of Bacillus brevis Nagano retain their resistance properties // J. Bacteriol. 1985. - V.161. - P.47-50.

72. Demain, A. L. How to antibiotic-producing microorganisms avoid suiside? // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1974. - V.22. - P.785-790.

73. Гоштялек, 3. и др. Действие хлортетрациклина на энзимы собственного продуцента Streptomyces aureofaciens / 3. Гоштялек, В. Ехова, В. Бегал, Э. Чурдова // Антибиотики. 1979. - Т.24. - С.254-258.

74. Егоров, Н. С., Торопова, Е. Г. Физиологическое значение антибиотиков для образующих их микроорганизмов // Онтогенез микроорганизмов. М.: Наука, 1979. - С.270-281.

75. Торопова, Е. Г., Егоров, Н. С., Бальджиновагийн, Ц. Антибиотики как регуляторы метаболизма микроорганизмов-продуцентов // Регуляция биохимических процессов у микроорганизмов: материалы симпоз. / Пущино: НЦБИ, 1979. С.300-303.

76. Грачева, И. В., Дмитриева, С. В., Орлова, Н. В. Влияние новобиоцина на рост и развитие Actinomyces spheroides //Антибиотики. -1971. Т.16. - С. 679-683.

77. Gräfe, U., Sarfert, Е. Reconstitution by a butyrolactone autoregulator of the parental protein pattern in an asporogenous mutant of Streptomyces griseus // FEMS Microbiol. Lett. 1985. - V.28. - P.249-253.

78. Воронина, О. И., Товарова, И. И., Хохлов, А. С. Механизм вызываемой А-фактором инактивации глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы в Actinomyces streptomycini // Биоорганическая химия. 1978. - Т.4. - С. 1538-1546.

79. Воронина, О. И. NAD- и ЫАО(Р)-гликогидролазы микроорганизмов и их роль в развитии продуцентов // Успехи современной биологии. 1985. - Т.99. -С.81-93.

80. Zaslavskaya Р. L. et al. Influence of A-factor on ultrastructure of the A-factor deficient mutant of Streptomyces griseus / P. L. Zaslavskaya, V. G. Zhukov, E. Ya. Kornitskaya, 1.1. Tovarova, A. S. Khokhlov // Microbios. -1979. V.25. - P. 145-153.

81. Eritt, I., Gräfe, U., Fleck, W. F. A screening method for autoregulators of anthracycline-producing streptomycetes // Ztschr. allg. Mikrobiol. 1982. - Bd.22. -S.91-96.

82. Gräfe, U., Eritt, I., Fleck, W. F. On the role of A-factor in cytodifferetiation of antracycline-producing strains of Streptomyces griseus // Actinomycetes. 19831984. - V.18. - P.220-246.

83. Олескин, А. В., Ботвинко, И. В., Цавкелова, Е. А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. -Т.69, вып. 3. - С.309-327.

84. Грузина, В. Д. Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, № 10. - С.32-39.

85. Fuqua, С., Winans, S., Greenberg, E. P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-Luxl family of cell density-responsive transcriptional regulators // J. Bacteriol. -1994. V.176, № 2. - P.269-275.

86. Szeszäk, F., Valu, G., Szabo, G. Some early effects of factor С on Streptomyces griseus mycelium // Biological, biochemical and biomedical aspects of actinomycetes / Ed. G. Szabo, S. Biro, M. Goodfellow. Budapest: Acad. Klado, 1986. - P.831-833.

87. O'Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. 1975. - V.250. - P.4007-4021.

88. Chou, W.-G., Pogell, В. M. Pamamycin inhibits nucleoside and inorganic phosphate transport in Staphylococcus aureus // Biochem. et biophys. acta. -1981. -V.100. P.344-350.

89. Kawaguchi, T. et al. B-factor, an essential regulatory substance inducing the production of rifamycin in a Nocardia sp. / T. Kawaguchi, T. Asahi, T. Sato, T. Uozumi, T. Beppu// J. Antibiot. 1984. - V.37. - P.l587-1595.

90. Клейнер, E. M. и др. Строение А-фактора биорегулятора из Streptomyces griseus / Е. М. Клейнер, С. А. Плинер, В. С. Сойфер, В. В. Оноприенко, Т. А. Балашова, Б. В. Розынов, А. С. Хохлов // Биоорганическая химия. - 1976. - Т.2. -С.1142-1147.

91. Плинер, С. А. и др. Выделение и первичная характеристика А-фактора / С. А. Плинер, Е. М. Клейнер, Е. Я. Корницкая, И. И. Товарова, Б. В. Розынов, Г. М. Смирнова, А. С. Хохлов // Биоорганическая химия. 1975. - Т.1. - С.70-76.

92. Вахитов, Т. Я. и др. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli / Т. Я. Вахитов, Е. А. Протасов, Н. В. Виснольд, Ю. Н.Толпаров, JI. Н. Петров // Журн. микробиол. 2003. - № 2. - С.7-12.

93. Eritt, I., Gräfe, U., Fleck, W. F. Inducers of both cytodifferentiation and antracycline biosynthesis of Streptomyces griseus and their occurence inactinomycetes and other microorganisms // Ztschr. allg. Mikrobiol. 1984. - V.24. -P.3-12.

94. Торопова, E. Г., Побединский, H. А., Егоров, H. С. Биосинтез нистатина неактивными мутантами Actinomyces noursei при их совместном культивировании //Антибиотики. 1976. - Т.21, № 8. - С.704-709.

95. Лещенко В. М. Плесневые микозы // Антибиотики. 1967. - Т. 12, № 6. -С.536-538.

96. Ариевич, А. М., Минскер, О. Б., Пинзур, Г. С. О методике внутримышечного введения амфотерицина В при лечении больных висцеральными микозами // Антибиотики. -1971. Т.16, № 9. - С.858-860.

97. Vanbreuseghem, R., Larsh, Н. W. Conclusions to the round table on the global problems due to opportunistic fungi // In: Recent Adv. Med. and Vet. Mycol. Proc. 6th Congr. Int. Soc. Hum. and Anim. Mycol.: Tokyo, 1975. Tokyo, 1977. - P.253.

98. Катлинский, А. В. и др. Антифунгальные агенты. Новые предпосылки их создания и новые трудности / А. В. Катлинский, Ю. О. Сазыкин, М. В. Бибикова, С. Н. Орехов // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, № 9. -С.20-27.

99. Ветлугина, Л. А., Никитина, Е. Н. Противогрибковые полиеновые антибиотики. Алма-Ата: Наука, 1980. - 322 с.

100. Aparicio, J.F. et al. Polyene antibiotic biosynthesis gene clusters / J.F.Aparicio, P.Caffrey, J.A.Gil, S.B.Zotchev // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2003. - V. 61, № 3. - P. 179-188.

101. Fjaervik, E., Zotchev, S. B. Biosynthesis of the polyene macrolide antibiotic nystatin in Streptomyces noursei // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 2005. -V.67, № 4. - P.436-443.

102. Шенин, Ю. Д. Неполиеновые противогрибковые макролидные антибиотики //Антибиотики и химиотерапия. -1991. Т.36, № 10. - С.50-53.

103. Martin, J. F. Biosinthesis of polyene macrolide antibiotics // Annu Rev. Microbiol. 1977. - V.31, № 1. - P.13-38.

104. Liu, C. N., McDaniel, L. E., Schaffner, C. P. Studies on candicidin biosynthesis //J. Antibiot. 1972. - V.25, № 2. - P. 116-121.

105. Rafalski A., Raczynska-Bojanowska K. Non-specific acetyl-CoA carboxylase and methylmalonyl-CoA carboxyltransferase in Streptomyces noursei var. polifungini //Acta Biochim. Pol. 1975. - V.22, № 4. -P.311-317.

106. Rafalski A., Raczynska-Bojanowska K. Biochemical criteria in selection of productive strains of Streptomyces noursei var. polifungini II Acta Microbiol. Pol., Ser. B. 1973. - V.5. - P.87-93.

107. Rafalski A., Raczynska-Bojanowska K. Synthesis of malonate and methylmalonate and formation of polyene antibiotics // Ibid. 1972.- V.19, № 1. -P.71-87.

108. Janglova, Z., Suchy, J., Vanek, Z. Regulation of biosinthesis of secondary metabolites. VII. Intracellular adenosine-5'-triphosphate in Streptomyces aureofaciens // Folia Microbiol. 1969. - V. 14, № 3. - P.208-210.

109. Behal, V., Cudlin, J., Vanek, Z. Regulation of biosinthesis of secondary metabolites. III. Incorporation of 1-14C acetic acid into fatty acids and chlortetracycline in Streptomyces aureofaciens // Folia Microbiol. 1969. - V.14, № 2.-P. 117-120.

110. Dimroth, P., Ringelmann, E., Lynen, F. 6-methylsalicylic acid synthetase from Penicillium patulum // Europ. J. Biochem. 1976. - V. 68, № 3. - P. 591-596.

111. Caffrey, P. et al. Amphotericin biosynthesis in Streptomyces nodosus: deduction from analysis of polyketide synthase and late genes / P. Caffrey, S. Lynch, E. Flood, S. Finnan, M. Oliynyk // Chem. Biol. 2001. - V.8. - P.713-723.

112. Campleo, А. В., Gil, J. A. The candicidin gene cluster from Streptomyces griseus IMRU 3570 // Microbiology. 2002. - V. 148. - P.51-59.

113. Кирсанова P. В. Продуцент противогрибкового неполиенового антибиотика Actinomyces sp. 212/5 // Материалы IV науч. конф. / Ленинградский НИИ антибиотиков. Л., 1965. - С.69-70.

114. Цыганов В. А. и др. Образование антибиотиков типа азаломицина F культурой Actinomyces imbricatus п. sp. / В. А. Цыганов, Ю. В.Конев, Н. П. Барашкова, Л. Я. Петрова, С. Н. Соловьев // Антибиотики. 1970. - Т. 15, № 3. -С. 208-212.

115. Шенин, Ю. Д., Белахов, В. В., Рожкова, Н. Г. Фунгицидная активность имбрицина и его солей // Антибиотики и химиотерапия. 1996. - Т.41, № 6. -С Л 8-22.

116. Медведева, Н. Г. и др. Влияние имбрицина на рост и ультраструктуру клеточной поверхности микромицетов / Н. Г. Медведева, Н. Б. Гоголушко, М. Э. Сухаревич, О. В. Рыбальченко, Е. П. Яковлева // Микология и фитопатология. 1996. - Т.ЗО, № 1. - С. 17-21.

117. Сухаревич, М. Э. Регуляция биосинтеза имбрицина и механизм его действия на грибы: дис. канд. биол. наук: 03.00.23 СПб., 1997. - 156 с.

118. Горбунова, Н. А. Естественная и индуцированная изменчивость продуцента неполиенового противогрибкового антибиотика имбрицина: дис. . канд. биол. наук: 03.00.23 СПб., 2000. - 150 с.

119. Бирюков, В. В. Планирование экспериментов при оптимизации сложных процессов по схемам ортогональных латинских прямоугольников // Хим.-фарм. журнал. 1968. - Т.2, вып. 1. - С.57-62.

120. Пех, К., Треси М. В. Биохимические методы анализа растений. М.: Изд-воИЛ, I960.- 116с.

121. Асатиани В. С. Биохимическая фотометрия. М.: Изд-во АН СССР, 1957. -511 с.

122. Кочетов, Г. А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высш. школа, 1971.-352 с.

123. Лосев, В. В. Пути интенсификации биосинтеза гентамицина: автореф. дис. . канд. биол. наук: 14.00.31 М., 1982. - 20 с.

124. Егоров, Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: МГУ, 2004. - 512 с.

125. Иерусалимский, П. Д. Основы физиологии микробов. М.: Изд-во АН СССР, 1963.-244 с.

126. Логинова, Л. Г., Гужева, Э. П. Дегидрогеназная активность термотолерантных дрожжей // Микробиология. 1961. - Т.30, № 5. - С.917-920.

127. Pinto, P. V. S., Dreal, Р. А., Kaplan, A. Aldolase. Colorimetric determination // Clin. Chem. 1969. - V.15. - P. 339-345.

128. Ашмарин, И. П., Васильев, Н. Н., Амбросов, В. А. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов. Л.: ЛГУ, 1975. - 78 с.

129. Максимов, В. Н. Многофакторый эксперимент в биологии. М.: МГУ, 1980.-278 с.

130. Работнова, И. Л. Тактика оптимизации микробиологических процессов // Антибиотики. 1986. - Т.31, № 7. - С.508-513.

131. Белоусова, И. И., Лишневская, Е. Б., Эльгарт, Р. Е. К вопросу о естественной регуляции биосинтеза леворина // Материалы V науч. конф. Ленинградского научно-исследовательского института антибиотиков. Л., 1967. - С.22.

132. Нугуманов, Б. С., Торопова, Е. Г., Егоров, Н. С. Стимулирующее действие нативных растворов Actinomyces noursei на образование нистатина // Антибиотики. 1973. - Т. 18, № 6. - С.489-493.

133. Буданов, С. В., Васильев, А. Н. Кларитромицин: особенности антимикробного спектра и клинического применения // Антибиотики и хиимиотерапия. 2004. - Т.49, № 2. - С. 19-25.

134. Буданов, С. В., Васильев, А. Н., Смирнова, Л. Б. Макролиды в современной терапии бактериальных инфекций. Особенности спектра действия, фармакологические свойства // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, № 11. - С.15-22.

135. Яковлев, С. В., У хин, С. А. Азитромицин: основные свойства, оптимизация режимов применения на основе фармакокинетических и фармакодинамических параметров // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, № 2. - С.22-28.

136. Сазыкин, Ю. О., Иванов, В. П., Салова, Т. В. Кетолиды производные эритромицина с активностью против макролидорезистентных бактерий // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - Т.45, № 2. - С.3-4.

137. Шенин, Ю. Д. Противогрибковые полиеновые макролиды. Зависимость между структурой и биологической активностью // Антибиотики и химиотерапия. 1988. - Т.ЗЗ, № 8. - С.622-630.

138. Conover, C.D. et al. / C.D.Conover, Z.Hong, C.B.Longley // Bioconjugate Chem. 2003. - V.14, № 3. - P. 661-666.

139. Borowy-Borowski, H. et al. / H.Borowy-Borowski, C.Sodja, J.Docherty// J. Drug Target. 2004. - V.12, № 7. - P.415-424.

140. Вайнштейн, В. А. Исследование механизма полимерной солюбилизации полиеновых макролидных антибиотиков методом гель-хроматографии // Хим.-фарм. журнал. 1989. - Т.23, № 7. - С.859-863.

141. Lopez-Berestein, S. et al. Treatment of hepatosplenic candidiasis with liposomal-amphotericin В / S. Lopez-Berestein, G. P. Bodey, L. S. Frankel, К. Mehta //J. Clin. Oncol. 1987. - V.5, № 2. - P.310-317.

142. Колбин, А. С., Климко, H. Н., Карпов, О. И. Нежелательные эффекты системных антимикотиков // Антибиотики и химиотерапия. 2003. - Т.48, № 8. -С.37-43.

143. Белоусов, Д. Ю., Манешина, О. А. Терапия инвазивного аспергиллеза: обзор // Антибиотики и химиотерапия. 2006. - Т.51, № 3-4. - С. 26-46.

144. Падейская, Е. Н., Бакланова, О. В. Синтетические химиотерапевтические препараты для лечения микозов // Хим.-фарм. журнал. 1993. - Т.27, № 4. -С. 12-23.

145. Gräfe, U. et al. Isolation and structure of novel autoregulators from Streptomyces griseus /U. Gräfe, G. Reinhardt, W. Schade, D. Krebs, I. Eritt, W. F. Fleck // J. Antibiot. 1982. - V.35, № 5. - P.609-614.

146. Яковлева, E. П., Алексеева, JI. E. Выделение и изучение биологических свойств веществ, стимулирующих биосинтез леворина в совместной культуре актиномицета и дрожжей // Антибиотики. 1986. - Т.31, № 11. - С.830-835.

147. Бауер, К. Анализ органических соединений. М.: Изд-во ИЛ, 1953. - 488 с.

148. Хроматография в тонких слоях / под ред. Э. Шталя. М.: Изд-во «Мир», 1965.-508 с.

149. Лазникова, Т. Н., Грачева, И. В., Краснова, Т. П. и др. Синтетическая среда для биосинтеза гентамицина // Антибиотики. 1977. - Т.22, № 2. - С. 102-108.

150. Яковлева, Е. П. Синтетическая среда для биосинтеза пол неновых антибиотиков леворина и амфотерицина В // Антибиотики. - 1980. - Т.25, № 11.-С.817-822.

151. Королева, Т. А., Кузнецова, Н. А., Ларкин, А. И. Влияние минерального фосфора на биосинтез микогептина // Антибиотики. -1977. Т.22, № 2. - С.99-102.

152. Павлюк, Ю.В., Богацкий, М.А., Орлова, Н.В. и др. Влияние фосфора на биосинтез полимиксина В В. polimyxa 1538 на средах различного состава // Антибиотики. 1979. - Т.24, № 10. - С.723-727.

153. Левитов, M. М., Бринберг, С. Л. Физиология микроорганизмов -продуцентов и процесс биосинтеза антибиотиков // Антибиотики. 1967. -Т.12, № 11.-С. 985-999.

154. Петрова, Л. Я. Хроматография антибиотиков, близких к азаломицину F в тонком слое силикагеля // Антибиотики. 1970. - Т. 15, № 3. - С.395-397.

155. Петрова, Л. Я., Митрофанова, В. Г., Свешников, Ю. Ф. Выделение и физико-химическая характеристика основных компонентов имбрицина и препарата штамма ЛИА-0111 // Антибиотики. 1974. - Т.19, № 1. - С.68-71.

156. Оноприенко, В. В., Карапетян, М. Г., Гладкова, Л. Н. Изучение химии имбрицина: отчет о НИР / Ин-т биоорганической химии им. Шемякина АН СССР.-М., 1979.-С. 1-8.

157. Комов, В. П., Шведова В. Н. Биохимия: Учеб. для вузов. М.: Дрофа, 2004. -640 с.

158. Побединский, Н.А., Торопова, Е.Г., Егоров, Н.С. Изучение активности некоторых ферментов углеводного обмена Act. noursei П Антибиотики. 1976. - Т. 21, № 11.-С. 971-973.

159. Фадеева, JI. Е. Изучение биосинтеза нистатина культурой Actinomyces noursei в условиях регулируемой ферментации: автореф. дис. . канд. биол. наук-Л., 1980.-30 с.

160. Сотникова, И. В. и др. Активность ферментов гликолиза у Tolypocladium sp. продуцента циклоспорина / И. В. Сотникова, Г. Н. Телеснина, И. Н. Крахмалева, Ю. О. Сазыкин, С. М. Навашин // Антибиотики и химиотерапия. -1991. -Т.36, № 8. - С.10-13.

161. Ермакова, Г. Н., Филиппова, М. С., Нефелова, М. В. Активность некоторых ферментов Bacillus polymyxa 153 продуцента полимиксина В в процессе спорообразования и биосинтеза // Антибиотики и химиотерапия. - 1988. - Т.ЗЗ, № 8. - С.563-566.

162. Кузнецова, О. С. К механизму стимулирующего действия дрожжеподобных грибов на образование леворина культурой Actinomyces levoris Krass: дис. канд. биол. наук. Л., 1975. - 181 с.

163. Hostalek Z. et al. Specific primary pathways supplying secondary biosynthesis / Z. Hostalek, V. Behal, E. E. Gurdova, V. Jechova // In: Genet. Ind. Microorgan. Proc. 3-rd Int. Symp., Medison, Wise., 1978. Washington D.C., 1979. - P.225-232.

164. Raczynska-Bojanowska K. Biochemical criteria in evaluation of antibiotic producing microorganisms // Postepy Hig. Med. Dosw. 1974. - V.28. - P.499-514.

165. Raczynska-Bojanowska К., Rafalski A., Ostrowska-Krysiak B. Carboxylation of propionyl-CoA in erythromycin biosynthesis // Acta Biochim. Pol. 1970. -V.17, № 4. -P.331-338.

166. Нефедова, M. В. и др. Биосинтез полимиксина В и активность ферментов цикла трикарбоновых кислот / М. В. Нефедова, Г. А. Новикова, Г. Н. Ермакова, Н. С. Егоров // Антибиотики. 1978. - Т.23, № 8. - С.682-686.164