Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотиков у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотиков у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина"

На правах рукописи

СЕРГИЕНКО ОЛЬГА ВАСИЛЬЕВНА

>

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА КОМПОНЕНТНЫЙ СОСТАВ АНТИБИОТИКОВ У ШТАММОВ БКерШтусе* /гаШае ПРОДУЦЕНТА ТИЛОЗИНА И ХассИагоро^рога егуЛгаеа ПРОДУЦЕНТА

ЭРИТРОМИЦИНА.

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006 г.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии продуцентов антибиотиков Открытого Акционерного Общества «ГосНИИсинтезбелок»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Даниленко Валерий Николаевич Консультант: кандидат биологических наук

Елизаров Сергей Михайлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Яненко Александр Степанович доктор биологических наук Бибикова Маргарита Васильевна

Ведущая организация: Научно-Исследовательский Институт по изысканию новых антибиотиков Российской Академии Медицинских Наук им. Г.Ф.Гаузе

Защита состоится: _ на заседании

диссертационного совета ДМ.212.204.13 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д.9) в_.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «_» _2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, ДМ.212.204.13

¿oogA

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: В последнее время возросло внимание к

макролидным антибиотикам, связанное со значительными успехами в области

химической и биологической трансформации их молекул и проявлением новых

терапевтических свойств у модифицированных антибиотиков (Walsh С., 2003;

P. Katz L., Ashley G. W., 2005; McDaniel R., et. al. R., 2005). Получены, в

частности, новые производные эритромицина А, показавшие не только

измененный спектр антимикробного действия, но и антипаразитарный,

антиопухолевый, иммуносупрессантный, нейротрофический и

антивоспалительный эффект (Сазыкин Ю.В., и др. 2000). Поэтому является

актуальным получение новых штаммов макролидных антибиотиков с

повышенной продуктивностью и совершенствование технологии производства

на стадии ферментации.

Одной из основных проблем, которую необходимо решить при работе со

штаммами Saccharopolyspora erythraea и Streptomyces fradiae, является

получение монопродуцента, так как данные культуры образуют

антибиотические комплексы. Получение чистого целевого продукта

(эритромицина А, тилозина) является необходимым для дальнейшего

получения синтетических производных данных макролидных антибиотиков и в

значительной степени облегчит стадии выделения и очистки. Для решения этих

проблем проводились исследования в двух направлениях: отбор мутантов с

улучшенным компонентным составом и уровнем продуктивности и изучение

факторов, влияющих на компонентный состав антибиотического комплекса,

включая ионы кальция и состав питательных сред. В данной работе изучалось

влияние различных генетических и физиологических факторов на биосинтез

антибиотиков штаммами Sa erythraea и S. fradiae: мутации устойчивости к

антибиотикам; возможная активация лимитирующих путей биосинтеза

антибиотиков и присоединение Сахаров к лактонной части молекулы; влияние

ионов кальция (Norris V. et.al., 1996; Д^ нвоснИйцИ0flRji) изучение

БИБЛИОТЕКА I СП*—- - »

о»

возможной связи продукции тилозина и эритромицина с протеинкиназами; влияние ингибиторов протеинкиназ.

Цели и задачи исследования: Основная цель диссертационной работы состояла в изучении факторов, влияющих на компонентный состав образуемого антибиотического комплекса у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: изучено влияние различных факторов на биосинтез и антибиотическую продуктивность штамма S. fradiae 25А\ получены и охарактеризованы мутанты штамма S. fradiae 25А в отношении уровня и спектра продукции тилозинового комплекса; проведено сравнительное изучение исходного штамма S fradiae 25А и полученного S. fradiae 36 (kanr-Ca2+); отобраны и охарактеризованы мутанты штамма Sa. erythraea в отношении антибиотической продуктивности, компонентного состава эритромицинового комплекса и спектра устойчивости к различным антибиотикам; проведена идентификация Са2+-зависимых протеинкиназ у S. fradiae25A и изучена корелляция с биосинтезом тилозинового комплекса. Научная новизна работы: Впервые показано влияние ионов кальция (Са2+) и выявлена возможная роль Са2+- зависимых серин/треониновых протеинкиназ на компонентный состав тилозинового комплекса у штамма S fradiae. Разработаны новые методы селекции, основанные на получении мутантов в сигнал-трансдуцирующих системах, регулирующих биосинтез макролидов, и на их основе получены штаммы S fradiae и Sa. erythraea с улучшенным содержанием целевых продуктов (тилозина и эритромицина А). Практическая значимость и реализация результатов работы: В ходе исследований получены и охарактеризованы мутанты с улучшенным компонентным составом у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина за счет увеличения целевого продукта. Получен капг-Са2+-зависимый штамм S fradiae 36, способный синтезировать 7,7 г/л тилозина (что составляет 96% его в

синтезируемом антибиотическом комплексе) и превышает в 1,5 раза уровень целевого продукта в исходном штамме. Получен монопродуцент целевого продукта тилозина штамма 51 /гасНае.

Получен топг-Са2+-зависимый штамм Яа егуМгаеа 60, способный синтезировать 7,0 г/л эритромицина А (что составляет 80% его в синтезируемом антибиотическом комплексе) Продуктивность в отношении эритромицина А полученного мутанта в 1,3 раза выше по сравнению с таковой у исходного штамма 5« егуЖгаеа 254-К Осуществлена оптимизация ферментационной среды и разработаны основы метода регулируемого по углеводам биосинтеза, позволяющего получать преимущественно целевой продукт - эритромицин А.

Созданные штаммы и технологии биосинтеза антибиотиков эритромицина и тилозина могут бьпь использованы при организации конкурентоспособного производства этих антибиотиков на заводах России. Разработанные новые методы селекции могут быть использованы при создании высокопродуктивных штаммов других макролидных антибиотиков. Апробация работы: Основные положения работы докладывались на Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г.Саранск, 2001г.) и на 1-ом и 3-ем Международном конгрессе «Биотехнология- состояние и перспективы развития» (г.Москва,2002г., 2005г.). Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 работ: 1 статья в сборнике докладов Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», 2 - в сборнике статей 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» и 2 статьи в научных журналах.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из них иностранных 149

источников. Работа изложена на 155 страницах мишинописного текста, включает 30 таблиц и 16 рисунков.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В литературном обзоре рассмотрена общая характеристика и основные свойства антибиотиков группы макролидов. Освещен биогенез и регуляция биосинтеза эритромицина штаммом Sa erythraea, включая образование лактонной части молекулы и присоединение к ней сахарных компонентов. Рассмотрено участие серин/треониновых протеинкиназ в регуляции биосинтеза антибиотиков у актиномицетов. Рассмотрена роль ионов кальция в регуляции вторичного метаболизма и дифференциации актиномицетов. Обобщены и проанализированы работы, в которых приводятся данные о использовании мутаций устойчивости к антибиотикам для селекции штаммов актиномицетов с повышенной антибиотической активностью. Анализ литературных данных выявил проблемы, существующие в данной области, и позволил сформулировать цели и задачи данного исследования.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования являлись штаммы Streptomyces fradiae и Saccharopolyspora erythraea продуцентов антибиотиков тилозина и эритромицина соответственно Оптимизацию состава ферментационной среды проводили методом «Латинских прямоугольников» (Бирюков В.В., Кантере В.М., 1985). Количественное определение антибиотиков эритромицинового и тилозинового комплексов проводили методами ВЭЖХ и ТСХ в сочетании с оптической денситометрией (Waksman S. A. et.al., 1983). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы SuperCalc4. Спектры и уровень фосфорилирования белков у штаммов Streptomyces fradiae и Saccharopolyspora erythraea измеряли в экспериментах in vivo (в растущих культурах), in vitro (в экстрактах) и in situ (в акриламидном геле) (Elizarov S.M., et. al. 2000).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.

2.2.1. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А с увеличенным содержанием целевого продукта - тилозина. 2.2.1.1. Изучение влияния ионов Са2+ на компонентный состав тилозинового комплекса у штамма S. fradiae 25А.

Одной из физиологических особенностей исходного штамма S. fradiae25A является нестабильность компонентного состава синтезируемого антибиотического комплекса как в процессе повторных экспериментов, так и на уровне популяционной изменчивости и, прежде всего, по основному его компоненту - тилозину. Относи 1ельное содержание тилозина в составе комплекса в культурах различных клонов штамма S Jradiae25A колеблется от 30 до 90%. Основная часть клонов (64%) синтезирует комплекс с долей тилозина в пределах 50-70%

Проверка клонов S fradiae25A, выращенных в среде с СаСЬ (20 мМ), показала, что в присутствии ионов кальция подавляющая часть клонов (82%) образует комплекс с долей тилозина не менее 80% (рис. 1).

Рис.1. Распределение относительного содержания тилозина в комплексе, синтезируемом в кулыуре 100 клонов £ fradiae25A в отсутствие и в присутствии СаСЬ (20 мМ). По оси абсцисс - относительное содержание тилозина, %; по оси ординат - количество клонов (14).

N

60 50 40

30 20 10 0

□ Культура без CaCI2 ■ Культура с CaCI2

10 20 30 40 50 60 70 80 90 %

При концентрации 20-30 мМ кальций, вносимый в ферментационную среду, оказывал явное влияние на компонентный состав тилозинового комплекса (Миронов В.А. и др., 1997).

2.2.1.2. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 2SA, устойчивых к верапамилу.

Верапамил известен как ингибитор кальциевых каналов (Stowe D.J., et.al.,1999), его присутствие препятствует проникновению ионов Са2+ в клетки. Верг мутанты образуются, как правило, за счет изменений в Са2+ -каналах и, как следствие, снижения концентрации Са2+ в клетке. Представляло интерес получить мутанты, устойчивые к верапамилу (верг) и проверить их на способность синтезировать в условиях ферментации в колбах тилозиновый комплекс. Было отобрано 50 верг мутантов. У всех мутантов биосинтез антибиотика был или полностью или значительно подавлен. Среди последних обнаружены мутанты, накапливающие в культуральной жидкости только дезмикозин. Культивирование этих мутантов в ферментационной среде в присутствии СаС.Ь (0,2%) не изменяло количественно и качественно характер антибиотикообразования. Из чего можно предположить, что ионы кальция не

проникали внутрь клетки. Таким образом, Са2+ действительно является важным

/

фактором, способствующим процессам образования конечного продукта биосинтеза - тилозина,

2.2.1.3. Изучение влияния ионов Са2+ на чувствительность штамма S. fradiae 25А к аминогликозидным антибиотикам.

Чувствительность штамма Sfradiae25A к аминогликозидным антибиотикам определяли методом наложения бумажных дисков, при необходимости в среду добавляли 0,1% СаС12. Полученные результаты представлены в таблице 1. Наибольшую чувствительность штамм S. fradiae25A проявил к канамицину и гентамицину; слабее чувствительность штамма к тобрамицину и стрептомицину. В присутствии ионов Са2+ чувствительность штамма к гентамицину снижалась, а к тобрамицину повышалась.

Таблица 1.

Чувствительность штамма S fradiae25A к аминогликозидным антибиотикам.

Концентрация Диаметр зоны Степень влияния

Антибиотик антибиотика в просветления, мм Са2+ на

диске, мкг/диск без Са2+ с Са2+ чувствительность

Канамицин 30 32 20 снижение

Гентамицин 10 31 27 слабое снижение

Стрептомицин 10 17 18 без влияния

Тобрамицин 10 18 25 увеличение

В отличие от этою чувствительность штамма к канамицину и стрептомицину в присутствии Са2+ не изменялась, хотя и в присутствии, и в отсутствии ионов кальция шгамм гораздо чувствительнее к канамицину, чем к стрептомицину. На основании этой особенности в проявлении эффекта Са2+ на чувствительность к антибиотикам было решено использовать канамицин в качестве селективного aren га для отбора капг мутантов.

2.2.1.4. Получение и характеристика мутантов S.fradiae 25А, устойчивых к канамицину в отношении уровни продукции тилозинового комплекса.

Спонтанно у штамма S fradiae 25А на среде содержащей Са2+ (0,1 %) отобрано 605 мутантов, устойчивых к различным дозам канамицина. Большинство изолированных капг м>мигов проявляло повышенный уровень устойчивости только в присутствии ионов Са2'. Отобранные стабильные капг -Са2+-зависимые мутанты проверяли на уровень образования тилозинового комплекса. В таблице 2 представлены результаты анализа 13 лучших kanr -Са2' мутантов. Все стабильные мутанты, устойчивые к канамицину, показали увеличение доли гилозина в тилошновом комплексе, при этом суммарная продуктивность мутантов, устойчивых к канамицину (от 15 до 60 мкг/мл) выше, чем у исходного штамма, у лучших вариантов превышая этот уровень на 20%, а накопление тилозина, вследствие значительного повышения доли его в комплексе, выше на 65 - 90%.

Таблица 2.

Содержание антибиотиков тилозинового комплекса и доля тилозина в комплексе у капг-Са2+-зависимых мутантов штамма 51 /гасИае25А.

№ Устойчивость к канамицину, мкг/мл £ тилозинового комплекса, мг/л тилозин, мг/л % тилозина

25А < 1 6902 4072 59

5 2 6899 5519 80

12 15 7543 6940 92

13 15 7344 6830 93

24 15 7902 7190 91

36 20 8007 7687 96

37 20 7181 6822 95

48 20 7071 6717 95

64 55 8191 7618 93

77 55 7350 6982 95

89 55 7002 6652 95

102 60 7706 7244 94

123 60 8084 7356 91

150 60 7505 7055 94

У мутанта 1$. /гасЧае 36, устойчивого к 20 мкг/мл канамицина, доля тилозина в комплексе увеличилась до 96% и составила 7,7 г/л.

2.2.1.5. Сравнительное изучение спектра чувствительности к антибиотикам у исходного штамма S.fradiae 25А и S.fradiae 36 (kanr-Ca2+).

Проверку устойчивости к ряду антибиотиков исходного штамма S fradiae 25А и отобранного S. fradiae 36 (kanr-Ca2+) осуществляли методом наложения дисков следующих антибиотиков: амикацин (30 мкг/диск), гентамицин (10 мкг/диск), канамицин (30 мкг/диск), стрептомицин (10 мкг/диск), тобрамицин (10 мкг/диск), тетрациклин (30 мкг/диск), хлорамфеникол (30 мкг/диск),

g

рифампицин (5 мкг/диск). У штамма S fradiae 36 в присутствии ионов кальция повышается устойчивость к канамицину, амикацину, гентамицину и стрептомицину по сравнению с исходным штаммом S fradiae 25А, на среде не содержащей ионы Са2+ только к амикацину и гентамицину. Таким образом, у полученного штамма S fradiae 36 значительно повышается устойчивость ко всем проверенным аминогликоэидным антибиотикам, уровень и спектр устойчивости стимулируется ионами Са2+.

2.2.2. Получение, характеристика и разработка условий ферментации для мутантов штамма Saccharopolyspora erythraea 221 с увеличенной продукцией целевого продукта - эритромицина А.

2.2.2.1. Характеристика компонентного состава эритромицинового комплекса штамма Saccharopolyspora erythraea 221-К.

При выращивании в стандартных условиях исходный штамм Sa erythraea 221-К помимо основного компонента эритромицина А (ЕгА) синтезировал эритромицин С (ЕгС), эритромицин D (ErD),

ангидроэритромицин А (АЕА), дезоксиэритронолид В (ЕВ) и 0-микарозилэритронолид В (МЕВ), причем в наибольшей степени негликозилированные компоненты (ЕВ и МЕВ) (Weissman K.J., et.al.,1998; Cane D.E., et.al., 1986). Содержание ЕгА составляло 70-72%, ЕгС - 4-6%, ErD - 1-2%, АЕА - 5-7%, ЕВ- 9-11%, МЕВ- 6-8%. Суммарное содержание антибиотиков комплекса Sa. erythraea 221-К составило 7,6 мг/л.

Изучили влияние различных концентраций ионов Са2+ в составе посевных и ферментационной сред на уровень биосинтеза Sa. erythraea. Статистически достоверного влияния ионов Са2+ на биосинтез эритромицинов во многих повторных экспериментах не обнаружено.

2.2.2.2. Селекция мутантов, устойчивых к аминогликозидному антибиотику мономицину штамма Sa. erythraea 254-К.

Отбор спонтанных кальций-зависимых и независимых monr мутантов проводи методом градиентной концентрации. Предварительно проводили

исследования по влиянию ионов Га2+ на устойчивость штамма к мономицину и на частоту возникновения мутантов. Количество мутантов, выросших на среде с мономицином и с добавлением Са2+, в 50 раз превышало количество мутантов без Са2+. Проверено на уровень продукции 367 топг-Са2+-зависимых мутантов и 71 шопг мутант. Результаты по лучшим мутантам представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Содержание антибиотиков эритромицинового комплекса и доля эритромицина А у топг-Са2+-зависимых и независимых мутантов 5о егуЖгаеа 254-К.

№ Зави- Устойчивость I эритроми- %

симость к эритромицинов цин А, эритроми-

от Са2+ мономицину, мкг/мл мкг/мл цина А

мкг/мл

254-К - 1 7343 5360 73

5 - 5 7285 5974 82

6 - 10 8751 6826 78

10 - 10 7896 5922 75

18 + 5 8274 6701 81

19 + 5 7391 5765 78

37 + 10 8066 6291 78

60 + 10 8778 7022 80

182 + 10 8419 6988 83

245 + 10 8773 6580 75

Мутанты имеют продуктивность по основному компоненту эритромицинового комплекса (ЕгА) на 8 - 31 % (405 - 1662 мкг/мл) выше, чем у исходного штамма Ба егу/Ьгаеа. У шопг-Са2+-зависимых мутантов в отличие от шоп'-Са2+-независимых не синтезируется 0-микарозилэритронолид В. Для дальнейших исследований был выбран шопг-Са2+-зависимый мутант 60.

2.2.2.3. Характеристика компонентного состава эритромицинового комплекса, синтезируемого мутантом 5я. егунИгаеа 60.

В процессе ферментации исходным штаммом егуЖгаеа 254-К. и мутантом &. егуЛгаеа 60 (топг-Са2+) синтезируются следующие промежуточные компоненты эритромицинового комплекса: дезоксиэритронолид В (8-9%), эритромицин С (5-6%), ангидроэритромицин А (4-6%) и эритромицин Б (2-4 %), но в отличие от исходного штамма полученный мутант не продуцирует 0-микарозил-эритронолид В (6-8 %), за счет чего, и увеличивается доля ЕгА в его антибиотическом комплексе.

2.2.2.4. Характеристика спектра устойчивости к различным антибиотикам мутанта 5а. егуМгаеа 60 (тогГ).

Антибиотическая устойчивость штамма егуЖгаеа 254-К и мутанта Ба. егу/Игаеа 60 (топг-Са2+) представлена в таблице 4 У мутанта Ба. егу1Игаеа 60 повышается устойчивость ко всем проверенным антибиотикам, особенно к канамицину и стрептомицину.

Таблица 4.

Характеристика спектра устойчивости 5д. егуЛгаеа 254-К и Ба. егу^гаеа 60.

Антибиотик Антибиотик мкг/диск Диаметр зоны просветления, мм

254-К 60

Амикацин 30 52 43

Гентамицин 10 34 25

Канамицин 30 32 10

Стрептомицин 10 21 8

Тобрамицин 10 25 13

Ванкомицин 10 34 31

Доксицикпин 30 49 42

Тетрациклин 30 43 32

Хлорамфеникол 30 37 31

п

Т.е. мутант 60 (шопг-Са2+) проявляет фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) (БапПепко УК, ег.аК, 1995).

2.2.2.5. Биосинтез эрнтромицинов мутантом Ба. егуМгаеа 60 (топг-Са2+) на оптимизированной и контрольной ферментационных средах.

Оптимизацию проводили по четырем основным компонентам ферментационной среды. В результате проведенных исследований была получена новая среда следующего состава (%): соевая мука- 4,0; декстрин - 3,5; крахмал картофельный - 2,0; (Ш4)2804 - 0,2; КН2Р04 - 0,015; СаС03 - 1,0; масло соевое - 5,0. Оптимизированная среда отличалась от исходной пониженным содержанием декстрина и крахмала (на 0,5 и 1,0% соответственно) и повышенным содержанием муки соевой (на 1,0%).Сравнение оптимизированной и контрольной ферментационных сред для моноклонов мутанта 60 проводили в условиях ферментации (см. таблицу 5). Снижение общего количества углеводов и увеличение содержания азота привело к тому, что абсолютное содержание ЕгА при использовании новой ФС возросло в среднем на 3-5 %.

Таблица 5.

Биосинтез эритромицинов моноклонов мутанта Ба. егу^гаеа 60 (шопг-Са2+) на

оптимизированной и контрольной ферментационных средах

№ Содержание эри1ромицина А (мкг/мл) и его % в комплексе

Контрольная ФС Оптимизированная ФС

1 2 3 Сред. 1 2 3 Сред

К 5238(71) 6009(70) 5341(69) 5529(70) 5741(69) 5987(69) 5630(70) 5786(69)

5 5982(80) 6011(79) 6110(81) 6034(80) 6244(84) 6280(85) 6097(84) 6207(84)

6 6785(79) 6899(79) 6540(78) 6741(79) 6813(83) 6889(84) 6954(84) 6885(84)

18 6655(82) 6813(80) 6734(81) 6734(81) 6724(83) 6801(83) 6787(85) 6770(84)

38 6988(79) 7100(81) 7087(81) 7058(80) 7013(82) 7048(83) 6988(83) 7016(83)

Компонентный состав эритромицинов изменился за счет снижения концентрации АЕА в комплексе.

2.2.2.6. Изучение влияния дробного внесения углеводных компонентов на уровень и компонентный состав антибиотиков эритромицинового комплекса, синтезируемого мутантом Sa. erythraea 60 (monr-CaI+ ).

Исследовано влияние возможных вариантов подпиток и выбран тот из них, при использовании которого наблюдалась наибольшая продуктивность и доля ЕгА в комплексе у мутанта 60 (monr-Ca2+) Осуществлена проверка восьми вариантов подпиток: декстрин - 5,0 % и 2,5%; декстрин 2,5% + крахмал 2,5%; ФС (разведение 1/2, 1/3, 1/4); сахароза 2,5% и 5,0 %. Добавки вносились на 4 сутки ферментации (культивировние 8 суток). Наибольшая продуктивность получена при внесении раствора №3 (декстрин 2,5% + крахмал 2,5%). Содержание эритромицина А составило 6,9 г/л , 78% .

2.2.3. Изучение возможной роли серин/треониновых протеинкиназ в продукции макролидных антибиотиков тилозина и эритромицина. 2.2.3.1. Идентификация Са2+-зависимых протеинкиназ в штамме S. fradiae25A в продуценте тилозина в различных фазах роста. 2.2.3.1.1. Исследование фосфорилирования белков in vivo.

Первоначально исследовали фосфорилирование белков ш vivo в мицелии культур на стадиях средне-логарифмического (1), активно-логарифмического (2) и раннего стационарного (3) роста (см. рис.2). Культуры выращивали в среде с 32Р, без Са2+ или в присутствии 20мМ Са2+. Результаты анализа показали: фосфорилирование белков максимально в средне-логарифмической фазе роста и понижается в культурах, выращенных без Са2+, в активно-логарифмической фазе; в мицелии, выращенном с Са2+, фосфорилируется дополнительный полипепшд с мол. массой 54 кДа; во всех культурах фосфорилируется до 8 мажорных полипептидов с молекулярными массами (М. м.) 127, 88, 65, 62, 58, 31,5, 25 и 18 кДа; в мицелии, выращенном без Са2+, фосфорилируется дополнительный полипептид с М. м. 140 кДа.

J4 U А

а и 3

« 10 2

к ю JS*'

я 5 х J sr о ' г

щ

х ___,___j____ ,____

20 40 60 Время (час)

Рис.2. Рост штамма S fradiae25A в фермен (ационной среде в отсутствие

(__) и в присутствие 20мМ СаС12 (--------).

2.2.3.1.2. Исследование фосфорилирования белков in situ.

В экстрактах из мицелия срсдне-логарифмической фазы роста методом автофосфорилирования in situ ренатуриро ванных белков в гелях в присутствии [у-32Р]А'ГФ идентифицировали протеинкиназы (см. рис.3).

Рис.3. Авторадиограммы : (А) автофосфорилируемых белков (протеинкиназ) in situ в экстрактах из мицелия средне-логарифмической фазы роста штамма S. fradiae 25А; (В) фосфоаминокислот в кислотных гидролизатах протеинкиназ с М.м. 31,5; 65; 127 и 140 кДа.

Определяли их М. м. и фосфорилируемые аминокислоты. В мицелии, выращенном с Са2+, выявили 5 автофосфорилируемых протеинкиназ, а в мицелии, выращенном без Са2+ - дополнительно 140 кДа протеинкиназу (см. рис.3.А.). Фосфоаминокислотный анализ показал, что в 31,5 и 65 кДа протеинкиназах фосфорилируются остатки треонина, в 127 кДа протеинкиназе - серина и в 140 кДа протеинкиназе - тирозина (см рис.3 .В.). Установлено, что активность 127; 65 и 31,5 кДа протеинкиназ в среднелогарифмической фазе роста в культуре с Са2+ выше в 4 - 10 раз, чем в безкальциевой культуре. 2.2.3.1.3. Исследование фосфорилирования белков in vitro.

Анализ Са2+-зависимых изменений в фосфорилировании in vitro мембраносвязаных белков мицелия из активно-логарифмической фазы роста показал, что в мембранах мицелия, выращенного в присутствии или без ионов Са2+ происходит фосфорилирование эндогенными протеинкиназами полипептидов с М. м. 54, 50, 45, 40, 36, 29 и 27 кДа. В мембранах мицелия, выращенного с Са2+, выявили мажорный 65 кДа белок (рис.4.А.), являющийся, как показали предыдущие исследования (см. рис.3.), протеинкиназой.

Г

Рис.4. Авторадиограммы: (А) автофосфорилируемых in vitro мембраносвязанных белков из мицелия активно-логарифмической фазы; (В) фосфоаминокислот в кислотном гидролизате фосфорилированного in vitro 65 кДа белка.

Фосфорилирование 65 кДа протеинкиназы на порядок выше, чем остальных белков и стимулируется in vitro Са2+. Увеличение уровня фосфорилирования белков и активности ПК в условиях, когда клетки начинают продуцировать антибиотик, указывает на возможную связь Ser/Thr фосфорилирования белков с продукцией тилозина. Стимуляция активности киназы при добавлении ионов Са2+ в среду указывает на физиологическую значимость этой киназы и на возможный ее вклад в кальций-сигнальную систему растущих культур S fradiae.

2.2.3.2. Сравнительное изучение фосфорилирования белков у исходного штамма Sa. erythraea и му ганга Sa. erythraea 60 (monr-Ca2+).

При анализе исходного штамма 'Sa erythraea и мутанта Sa erythraea 60 выращенных в течение 24 часов наблюдали мечение компонентов с М. м. 17, 35, 59 (дублет), 65 (дублет), 85 и 127 кДа. Уровни мечения белков в экстрактах культур Sa erythraea более чем в 50 раз ниже, чем в S fradiae при тех же условиях. Это может объясняться: низкой активностью эндогенных киназ; наличием неспецифическою ингибитора (ингибиторов) фосфорилирования в штаммах Sa. erythraea. Отсутствие четких различий в наборах модифицируемых полипептидов в исследованных штаммах в присутствии и отсутствии Са2+ не позволяет связать фосфорилирование белков с функциональными особенностями мутантов и влиянием Са2+ на биосинтез эритромицина.

2.2.3.3. Изучение влияния ингибиторов серин/треоииновых протеинкиназ класса бисиндолилмалеимидов на уровень устойчивости к канамицину и мономицину мутанта S. fradiae 36 и мутанта Sa. erythraea 60.

Для изучения возможной роли серин/треониновых протеинкиназ в активации устойчивости к аминогликозидам у мутантных штаммов S fradiae 36 и Sa. erythraea 60 были проведены эксперименты по подавлению устойчивости к этим антибиотикам специфическими ингибиторами Са2 -фосфолипид-зависимых протеинкиназ. Для исследования были взяты ингибиторы класса

бисиндолилмалеимида (bis 1 и bis 1126) (Zhou Т. Et.al., 1999). Анализ веществ осуществлялся методом наложения дисков в присутствии и отсутствии соответствующих аминогликозидных антибиотиков (канамицина для S. fradiae 36 и мономицина для Sa etythraea 60). В обоих случаях удалось установить, что бисиндолилмалеимиды снижают устойчивость к аминогликозидам. Наиболее активным в обоих случаях оказался ингибитор bis 1126. Вместе с тем, модулирующая активность bis 1126 проявлялась в большей степени для штамма S fradiae 36, чем для Sa. erythraea 60.

3. ВЫВОДЫ

1. Впервые показано влияние ионов кальция на компонентный состав продуцируемого тилозинового комплекса у штамма S fradiae. Охарактеризован механизм зависимого биосинтеза целевого продукта - тилозина.

2. Идентифицированы Са2+- зависимые серин/треониновые протеинкиназы и выявлена их возможная роль в биосинтезе сахарной части молекулы тилозина. Установлено, что мутация устойчивости к верапамилу (ингибитору Са2+-каналов) блокирует биосинтез сахарной части молекулы тилозина.

3. Разработан метод селекции штамма S. fradiae и с его использованием получен монопродуцент целевого продукта тилозина. Основой метода является отбор плейотропных Са2+-зависимых мутантов устойчивых к канамицину.

4. Разработан метод селекции и получены штаммы устойчивые к мономицину с повышенным содержанием целевою продукта - эритромицина А. Охарактеризованы две группы мутантов в качестве предшественников синтезирующие: а) дезоксиэритронолид В, О-микарозил-эритронолид В; б) дезоксиэритронолид В.

5. Осуществлена оптимизация ферментационной среды для отселектированного монопродуценга эритромицина А. Установлено, что снижение общего количества упеводов и увеличение содержания азота в среде приводит к увеличению содержания эритромицина А .

6. Разработаны основы метода ретушируемого по углеводам биосинтеза эритромицинов. Установлено, что оптимизировав время внесения и состав подпиток, можно увеличить суммарный выход антибиотиков комплекса. 4. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сергиенко О.В., Даниленко В.Н.// Влияние ионов кальция на частоту возникновения и уровень устойчнвостик аминогликозидным антибиотикам у штамма Saccharopolyspora en thraea продуцента эритромицина. // Тезисы. Международная научная конференция «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», г. Саранск, 2001 г., С. 21.

2. Сергиенко О.В., Елизаров С.М., Даниленко В.Н.// Са2"-зависимые изменения фосфорилирования белков и продукции тилозина в Streptomyces fradiae.ll Тезисы. 1-ый международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», г. Москва, 2002г., С. 41.

3. Елизаров С.M , Сергиенко О.В., Даниленко В.Н.// Фосфорилирование АРН VIII и предполагаемых энзимов биосинтеза окситетрациклина серин/треониновымп протешт тазами в Streptomyces rimosus // Тезисы. 1-ый международный конгресс «биотехнология - состояние и перспективы развития», г. Москва, 2002г., С 40.

4. Миронов В. А , Сергиенко О.В., Наст ас я к И.Н., Даниленко В.Н.// Биогенез и регуляция биосинтеза эритр мицина у Saccharopolyspora erythraea. И Обзор. Прикладная биохимия и микрг нюлогия, 2004, том 40, №6, С. 613-624.

5. Елизаров С.М., Сергг^чко О.В., Сизова И.А., Даниленко В.Н.// Зависимость активности ам1г>огликозид-Т-фосфотрансферазы типа VIII от серин-треонин-прогеинкиназ ' Streptomyces rimosusH Молекулярная биология, 2005, том 39, №2, С. 1-9.

✓ / с '

Заказ № ^_Объем л а ._Тираж 100 экз.

Издательский центр РХТУ им. Д.И. Менделеева

XDOG{\ >

"-592*

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сергиенко, Ольга Васильевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Антибиотики группы макролидов: характеристика, основные 10 свойства

2.2. Биогенез и регуляция биосинтеза эритромицина

2.2.1. Структура и биогенез эритромицинов

2.2.2. Биосинтез 6-деоксиэритронолида В (DEB)

2.2.3. Биосинтез сахарных компонентов эритромицинов

2.2.4. Биохимия и генетическая регуляция биосинтеза эритромицина

2.3. Участие серин/треониновых протеинкиназ в регуляции биосинтеза 28 антибиотиков

2.3.1. Протеинкиназы и сигналтрансдукция в клетках актиномицетов

2.3.2. Регуляция биосинтеза антибиотиков AfsR/AfsK - 37 сигналтрансдуцирующей системой

2.3.3. Двухкомпонентные системы в регуляции биосинтеза антибиотиков

2.3.4. Влияние мутаций устойчивости к антибиотикам на 41 функционирование протеинкиназ

2.4. Роль ионов кальция в регуляции внутриклеточных процессов 45 актиномицетов

2.5. Использование мутаций устойчивости к антибиотикам для селекции 54 штаммов актиномицетов с повышенной антибиотической активностью

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Штаммы, используемые в работе

3.2. Среды

3.2.1. Среды для проведения селекционной работы, поддержания, хранения и глубинного культивирования штаммов Streptomyces fradiae

3.2.1.1. Среда СР

3.2.1.2. Модифицированная среда Гаузе (МСГ)

3.2.1.3. Посевная среда для глубинного культивирования штамма 59 Streptomyces fradiae

3.2.1.4. Ферментационная среда для глубинного культивирования штамма 60 Streptomyces fradiae

3.2.2. Среды для проведения селекционной работы, поддержания, хранения и глубинного культивирования штаммов Saccharopolyspora erythraea

3.2.2.1. Среда CP

3.2.2.2. Модифицированная среда Гаузе (МСГ)

3.2.2.3. Посевная среда для глубинного культивирования штамма 61 Saccharopolyspora erythraea

3.2.2.4. Ферментационная среда для глубинного культивирования штамма 61 Saccharopolyspora erythraea

3.3. Получение мутантов устойчивых к верапамилу

3.4. Определение чувствительности штамма S. fradiae к различным 62 антибиотикам методом наложение дисков

3.5. Получение мутантов устойчивых к канамицину

3.6. Методика проведения мутагенеза низкими дозами N-метил-М- 63 нитро-N нитрозогуанидина на проростках спор для штамма

Sa. erythraea

3.1. Использование градиентной концентрации для отбора мутантов, устойчивых к антибиотикам

3.8. Оптимизация ферментационной среды

3.8.1. Оптимизация ферментационной среды методом Бокса-Уилсона

3.8.2. Оптимизация ферментационной среды методом «Латинских 67 прямоугольников»

3.9. Методики количественного определения антибиотиков

3.9.1. Количественное определение антибиотиков тилозинового комплекса 68 методом ТСХ в сочетании с оптической денситометрией

3.9.2. Количественное определение антибиотиков тилозинового комплекса 69 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

3.9.3. Количественное определение антибиотиков эритромицинового 70 комплекса методом ТСХ в сочетании с оптической денситометрией

3.9.4. Количественное определение антибиотиков эритромицинового 72 комплекса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

3.9.5. Методы анализа серин/треониновых протеинкиназ у исследуемых 74 штаммов Streptomyces fradiae и Saccharopolyspora erythraea

3.9.5.1. Анализ фосфорилирования белков in vitro

3.9.5.2. Электрофорез в геле

3.9.5.3. Анализ фосфорилирования белков in situ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4.1. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А с увеличенным содержанием целевого продукта - тилозина

4.1.1. Изучение влияния ионов Са на биосинтез тилозина и устойчивость 75 к антибиотикам штамма S. fradiae 25А

4.1.1.1. Изучение влияния ионов Са на компонентный состав тилозинового 75 комплекса штамма S. fradiae 25А

4.1.1.2. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А, 81 устойчивых к верапамилу

4.1.1.3. Влияние ионов Са на устойчивость штамма S. fradiae 25А к 81 аминогликозидным антибиотикам

4.1.2. Получение и характеристика мутантов штамма S. fradiae 25А, 82 устойчивых к канамицину, в отношении уровня и спектра продукции тилозинового комплекса

4.1.2.1. Селекция мутантов штамма S. fradiae 25А, устойчивых к 82 канамицину (капг)

4.1.2.2. Характеристика капг -Са2+-зависимых мутантов штамма 83 S. fradiae 25А в отношении способности продуцировать тилозин

4.1.2.3. Влияние верапамила, хлорпромазина и прениламин лактата на 84 устойчивость штамма S. fradiae 25А и мутанта S. fradiae 36 к канамицину

4.1.2.4. Сравнительное изучение спектра устойчивости к антибиотикам у 85 исходного штамма S. fradiae 25А и мутанта S. fradiae

4.1.2.5. Обсуждение раздела 4.1.

4.2. Получение, характеристика и разработка условий ферментации для мутантов штамма Saccharopolyspora erythraea с увеличенной продукцией целевого продукта - эритромицина А

4.2.1. Характеристика компонентного состава эритромицинового 89 комплекса штамма Sa. erythraea 221-К, 254-К

4.2.2. Селекция мутантов штамма Sa. erythraea, устойчивых к 90 антибиотикам

4.2.2.1. Селекция мутантов штамма Sa. erythraea 221-К, устойчивых к 90 хлорамфениколу и их антибиотическая продуктивность

4.2.2.2. Селекция мутантов штамма Sa. erythraea 254-К, устойчивых к 92 аминогликозидному антибиотику мономицину

4.2.2.2.1. Селекция шопг-Са2+-зависимых мутантов штамма Sa. erythraea 221-К

4.2.2.2.2. Селекция monr- мутантов штамма Sa. erythraea 221-К

4.2.2.2.3. Проверка антибиотической продуктивности отобранных monr 93 мутантов штамма Sa. erythraea 221-К

4.2.2.2.4. Характеристика компонентного состава эритромицинового 94 комплекса, синтезируемого мутантом Sa. erythraea

4.2.2.2.5. Характеристика спектра устойчивости к различным антибиотикам 95 отобранного мутанта Sa. erythraea

4.2.3. Влияние источников углеводов, липидов и азота на уровень 96 активности и компонентный состав эритромицинового комплекса, синтезируемого мутантом Sa. erythraea

4.2.4. Оптимизация ферментационной среды для штамма Sa. erythraea

4.2.4.1. Оптимизация ферментационной среды методом Бокса-Уилсона

4.2.4.2. Оптимизация ферментационной среды методом "Латинских 101 прямоугольников"

4.2.4.3. Биосинтез эритромицинов штаммом Sa. erythraea 60 на 103 оптимизированной и контрольной ферментационных средах

4.2.5. Изучение влияния дробного внесения углеводных компонентов на 104 уровень и компонентный состав антибиотиков эритромицинового комплекса, синтезируемого штаммом Sa. erythraea

4.2.6. Влияние предшественников эритромицинов на уровень и 107 компонентный состав антибиотиков эритромицинового комплекса, синтезируемого штаммом Sa. erythraea

А.2.1. Обсуждение раздела 4.2.

4.3. Изучение возможной роли серин/треониновых протеинкиназ в продукции макролидных антибиотиков тилозина и эритромицина

4.3.1. Идентификация Са -зависмых протеинкиназ в штамме 113 S.fradiae 25А в продуценте тилозина в различных фазах роста

4.3.1.1. Исследование фосфорилирования белков in vivo

4.3.1.2. Исследование фосфорилирования белков in situ

4.3.1.3. Исследование фосфорилирования белков in vitro

4.3.2. Сравнительное изучение фосфорилирования белков у исходного 117 штамма Sa. erythraea 221 -К и мутанта Sa. erythraea

4.3.3. Изучение влияния ингибиторов серин/треониновых протеинкиназ 117 класса бисиндолилмалеимидов на уровень устойчивости к канамицину и мономицину мутанта S.fradiae 36 и мутанта Sa. erythraea

4.3.4. Обсуждение раздела 4.3.

5. ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотиков у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина"

Актуальность темы: В последнее время возросло внимание к макролидным антибиотикам, связанное со значительными успехами в области химической и биологической трансформации их молекул и проявлением новых терапевтических свойств у модифицированных антибиотиков [1,2,3]. Получены, в частности, новые производные эритромицина А, показавшие не только измененный спектр антимикробного действия, но и антипаразитарный, антиопухолевый, иммуносупрессантный, нейротрофический и противовоспалительный эффект [8]. Поэтому является актуальным получение новых штаммов макролидных антибиотиков с повышенной продуктивностью и совершенствование технологии производства на стадии ферментации.

Одной из основных проблем, которую необходимо решить при работе со штаммами Saccharopolyspora erythraea и Streptomyces fradiae, является получение монопродуцента, так как данные культуры образуют антибиотические комплексы. Получение чистого целевого продукта (эритромицина А, тилозина) является необходимым для дальнейшего получения синтетических производных данных макролидных антибиотиков и в значительной степени облегчит стадии выделения и очистки. Для решения этих проблем проводились исследования в двух направлениях: отбор мутантов с улучшенным компонентным составом и уровнем продуктивности и изучение факторов, влияющих на компонентный состав антибиотического комплекса, включая ионы кальция и состав питательных сред. В данной работе изучалось влияние различных генетических и физиологических факторов на биосинтез антибиотиков штаммами Sa. erythraea и S. fradiae: мутации устойчивости к антибиотикам; возможная активация лимитирующих путей биосинтеза антибиотиков и присоединение Сахаров к лактонной части молекулы; влияние ионов кальция [118,126] изучение возможной связи продукции тилозина и эритромицина с протеинкиназами; влияние ингибиторов протеинкиназ. Цели и задачи исследования: Основная цель диссертационной работы состояла в изучении факторов, влияющих на компонентный состав образуемого антибиотического комплекса у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и

Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: изучено влияние различных факторов на биосинтез и антибиотическую продуктивность штамма S. fradiae 2 5А; получены и охарактеризованы мутанты штамма S. fradiae 25А в отношении уровня и спектра продукции тилозинового комплекса; проведено сравнительное изучение исходного штамма S. fradiae 25А и полученного S. fradiae 36 (kanr-Ca2+); отобраны и охарактеризованы мутанты штамма Sa. erythraea в отношении антибиотической продуктивности, компонентного состава эритромицинового комплекса и спектра

2+ устойчивости к различным антибиотикам; проведена идентификация Са -зависимых протеинкиназ у S. fradiae25A и изучена корелляция с биосинтезом тилозинового комплекса. л I

Научная новизна работы: Впервые показано влияние ионов кальция (Са ) и выявлена возможная роль Са2+- зависимых серин/треониновых протеинкиназ на компонентный состав тилозинового комплекса у штамма S. fradiae. Разработаны новые методы селекции, основанные на получении мутантов в сигнал-трансдуцирующих системах, регулирующих биосинтез макролидов, и на их основе получены штаммы S. fradiae и Sa. erythraea с улучшенным содержанием целевых продуктов (тилозина и эритромицина А).

Практическая значимость и реализация результатов работы: В ходе исследований получены и охарактеризованы мутанты с улучшенным компонентным составом у штаммов Streptomyces fradiae продуцента тилозина и Saccharopolyspora erythraea продуцента эритромицина за счет увеличения целевого продукта. Получен капг-Са2+-зависимый штамм S. fradiae 36, способный синтезировать 7,7 г/л тилозина (что составляет 96% его в синтезируемом антибиотическом комплексе) и превышает в 1,5 раза уровень целевого продукта в исходном штамме. Получен монопродуцент целевого продукта тилозина штамма S. fradiae.

Получен шопг-Са2+-зависимый штамм Sa. erythraea 60, способный синтезировать 7,0 г/л эритромицина А (что составляет 80% его в синтезируемом антибиотическом комплексе). Продуктивность в отношении эритромицина А полученного мутанта в 1,3 раза выше по сравнению с таковой у исходного штамма

Sa. erythraea 254-K. Осуществлена оптимизация ферментационной среды и разработаны основы метода регулируемого по углеводам биосинтеза, позволяющего получать преимущественно целевой продукт - эритромицин А.

Созданные штаммы и технологии биосинтеза антибиотиков эритромицина и тилозина могут быть использованы при организации конкурентноспособного производства этих антибиотиков на заводах России. Разработанные новые методы селекции могут быть использованы при создании высокопродуктивных штаммов других макролидных антибиотиков.

Апробация работы: Основные положения работы докладывались на Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.) и на 1-ом и 3-ем Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2002 г., 2005 г.). Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 работ: 1 статья в сборнике докладов Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», 2 - в сборнике статей 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» и 2 статьи в научных журналах.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из них иностранных 149 источников. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 30 таблиц и 16 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Сергиенко, Ольга Васильевна

5. ВЫВОДЫ

1) Впервые показано влияние ионов кальция на компонентный состав продуцируемого тилозинового комплекса у штамма S. fradiae. Охарактеризован механизм Са2+- зависимого биосинтеза целевого продукта - тилозина.

2) Идентифицированы Са - зависимые серин/треониновые протеинкиназы и выявлена их возможная роль в биосинтезе сахарной части молекулы тилозина. Установлено, что мутация устойчивости к верапамилу (ингибитору Са -каналов) блокирует биосинтез сахарной части молекулы тилозина.

3) Разработан метод селекции штамма S. fradiae и с его использованием получен монопродуцент целевого продукта тилозина. Основой метода является отбор плейотропных Са2+-зависимых мутантов устойчивых к канамицину.

4) Разработан метод селекции и получены штаммы устойчивые к мономицину с повышенным содержанием целевого продукта - эритромицина А. Охарактеризованы две группы мутантов в качестве предшественников синтезирующие: а) дезоксиэритронолид В, О-микарозил-эритронолид В; б) дезоксиэритронолид В.

5) Осуществлена оптимизация ферментационной среды для отселектированного монопродуцента эритромицина А. Установлено, что снижение общего количества углеводов и увеличение содержания азота в среде приводит к увеличению содержания эритромицина А.

6) Разработаны основы метода регулируемого по углеводам биосинтеза эритромицинов. Установлено, что оптимизировав время внесения и состав подпиток, можно увеличить суммарный выход антибиотиков комплекса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сергиенко, Ольга Васильевна, Москва

1. Walsh С.// Antibiotics: actions, origins, resistance// Washngton, ASM Press, 2003, P. 10-13.

2. Katz L., Ashley G. W.// Translation and Protein Synthesis: Macrolides//Chem. Rev., 2005, №105, P. 499-527.

3. McDaniel R., Welch M., Hutchinson C. R.// Genetic Approaches to Polyketide Antibiotics// Chem. Rev., 2005, №105, P. 543-588.

4. Staunton J., Wilkinson В.// Biosynthesis of Erythromycin and Rapamycin.// Chem Rev., 1997, №97(7), P. 2611-2630.

5. Hutchinson C.// Microbial polyketide synthases: more and more prolific.Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3336-8. Review.

6. Ikeda H, Omura S.//Combinatorial biosynthesis: engineered biosynthesis of polykelide compounds// Tanpakushitsu Kakusan Koso. Review. Japanese. 1998. Jul. 43(9): 126577.

7. Сазыкин Ю.В., Иванов В.П., Салова Т.В.//кетолиды производные эритромицина с активностью противмакролидорезистентных бактерий// Антибиотики и химиотерапия. 2000. №2. С. 3-4.

8. Reynolds К.// Combinatorial biosynthesis: lesson learned from nature.// Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Oct 27;95(22): 12744-6. Review.

9. Bonay P., Duran-Chica I, Fresno M., Alarcon В., Alcina A.// Antiparasitic effects of the intra-Golgi transport inhibitor megalomicin.// Antimicrob. Agents & Chemother. 1998. 42,2668-73.

10. Lacey E., Gill J., Power M. Rickards R., O'Shea M., Rothschild J.// Bafilolides, potent inhibitors of the motility and development of the free-living stages of parasitic nematodes. //1995. Int J Parasitol. 25, 349-357.

11. Bollag DM, McQueney PA, Zhu J, Hensens O, Koupal L, Liesch J, Goetz M, Lazarides E, Woods CM.// Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a taxol-like mechanism of action//1995. Cancer Res. 55 (11), 2325-33.

12. Jacobsen J., Hutchinson C., Cane D., Khosla C.//Precursor-directed biosynthesis of erythromycin analogs by an engineered polyketide synthase//1997. Science .277 (5324). P. 367-9.

13. Steiner J., Connolly M., Valentine H., Hamilton G., Dawson Т., Hester L., Snyder S.// Neurotrophic actions of nonimmunosuppressive analogues of immunosuppressive drugs FK506, rapamycin and cyclosporin A.// Nat Med. 1997 Apr;3(4):421-8/

14. Kudoh S.// Erythromycin treatment in diffuse panbronchiolitis.//Curr Opin Pulm Med. 1998 Mar;4(2):l 16-21. Review.

15. Peeters T.// Erythromycin and other macrolides as prokinetic agents.// Gastroenterology. 1993 Dec; 105(6): 1886-99. Review.

16. Nielsen J.// The role of metabolic engineering in the production of secondary metabolites.//Curr Opin Microbiol. 1998. V.l(3):330-6. Review.

17. Ruan X., Pereda A., Stassi D.L. et. al. // Acyltransferase domain substitutions in erythromycin polyketide synthase yield novel erythromycin derivatives.//J.Bacteriol. 1997. V.179(20):6416-25.

18. Weissman K.J., Bycroft M., Stannton J., Leadlay P.F. // Origin of starter units for erythromycin biosynthesis.//Biochemistry. 1998. V.37. №31. P. 11012- 7.122

19. Stassi DL, Kakavas SJ, Reynolds KA, Gunawardana G, Swanson S, Zeidner D, Jackson M, Liu H, Buko A, Katz L. // Ethyl-substituted erythromycin derivatives produced by directed metabolic engineering.//Proc Natl Acad Sci USA. 1998. V.23; №95(13):7305-9.

20. Lombo F., Pfeifer В., Leaf T. et.al. // Enhancing the atom economy of polyketide biosynthetic processes through metabolic engineering.//Biotechnol. Prog. 2001. V.17. №4. P. 612-7.

21. Frykman S., Leaf Т., Carreras C., Licari P. // Precursor-directed production of erythromycin analogs by Saccharopolyspora erythraeaJ/Biotechnol Bioeng. 2001. V.76. №4. P. 303 -10.

22. Gaisser S, Lill R, Staunton J, Mendez C, Salas J, Leadlay PF. //Parallel pathways for oxidation of 14-membered polyketide macrolactones in Saccharopolyspora erythraea JI 2002. Mol Microbiol. May. 44(3):771-81.

23. Andersen JF, Tatsuta K, Gunji H, Ishiyama T, Hutchinson CR.// Substrate specificity of 6-deoxyerythronolide В hydroxylase, a bacterial cytochrome P450 of erythromycin A biosynthesis.//Biochemistry. 1993. V.32. №8. P. 1905 1913.

24. Stassi D., Donaldio S., Stavor M.J., Kotz L. // Identification of a Saccharopolyspora erythraea gene required for the final hydroxylation step in erythromycin biosynthesis.//J Bacteriol. 1993. V.175. №1. P. 182- 189.

25. Lambalot R.H., Cane D.E. // Overproduction and characterization of the erythromycin C-12 hydroxylase, EryK. // Biochemistry. 1995. V.34. №6. P.1858-66.

26. Hessler P.E., Larsen P.E., Constantion A.I.// Isolation of isoflavones from soy-based fermentations of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea.il Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V.47. P. 398-404.

27. Patent USA. № 5 908 764; 1999.

28. Mirjalili N, Zormpaidis V V, Leadlay PF, Ison AP. // The Effect of Rapeseed Oil Uptake on the Production of Erythromycin and Triketide Lactone by Saccharopolyspora erythraea.//Bitechnol. Prog. 1999. V.15 P.911-8.

29. Hamedi Y, Malekzadeh F., Nirman V.// Improved production of erythromycin by Saccaharopolyspora erthraea by various plant oils //2002. Biotech. Lett. 24 :697-700.

30. Martin J.F.// Nonpolyene microlide antibiotics// 1979. Economic Microbiology. Rev.V.3 P. 239-291.

31. Seignez C, Adler N, Suard JC, Peringer P. //Aerobic and anaerobic biodegradability of 1-anthraquinone sulphonate.// 1996. Appl. Microbiol. Biotechnol. Jun. 45(5):719-22.

32. Грузина В.Д., Шищенко Л.Д., Трофимова H.T. /Коммуникативные сигналы бактерий // Антибиотики. 1981. Т.26. №26 С. 407-410.

33. Roszkowski J, Ruczaj Z, Sawnor-Korszynska D, Kotiuszko D, Morawska H, Siejko D, Raczynska-Bojanowska K.J/ NADPH-regenerating systems in microorganisms producing macrolide antibiotics// Acta Microbiol. Pol. B. 1971; V.3(2) P.97-106.

34. Hunaiti AA, Kolattukudy PE// Source of methylmalonyl-coenzyme A for erythromycin synthesis: methylmalonyl-coenzyme A mutase from Streptomyces erythreus.il Antimicrob. Agents Chemother. 1984. V.25 P. 173-8.

35. Hunaiti AA, Kolattukudy PE. // Malonyl-CoA decarboxylase from Streptomyces erythreus: purification, properties, and possible role in the production of erythromycin.// Antimicrob. Agents Chemother. 1984. V.229 P.426-39.

36. Hsieh YJ, Kolattukudy PE. // Inhibition of erythromycin synthesis by disruption of malonyl-coenzyme A decarboxylase geneeryM in Saccharopolyspora erythraea./П Bacteriol. 1994. V.176. P.714-24.

37. Kirsanov AIu, Mironov VA, Danilenko VN.//The role of propionyl-CoA carboxylase in the biosynthesis of antibiotics.// 1991. Antibiot Khimioter. T.36. V.4. P.32-35.

38. Hunaiti AR, Kolattukudy PE.// Isolation and characterization of an acyl-coenzyme A carboxylase from an erythromycin-producing Streptomyces erythreus. //Arch. Biochem. Biophys. 1982. V.216. №1. P. 362-71.

39. Cane D.E., Liang T.C., Taylor P.B. Chang C, Yang CCH Macrolide biosynthesis. 3. Stereochemistry of the chain-elongation steps of erythromycin biosynthesis// J. Am. Chem. Soc. 1986. V.108. P. 4957-64.

40. Madduri K., Waldron C., Merlo D.J.// Rhamnose biosynthesis pathway supplies precursors for primary and secondary metabolism in Saccharopolyspora spinosa //J. Bacteriol. 2001.V.183. №19. P.5632-8.

41. Vara J.A., Hutchinson C.R.// Purification of thymidine-diphospho-D-glucose 4,6-dehydratase from an erythromycin-producing strain of Saccharopolyspora erythraea by high resolution liquid chromatography //J Biol. Chem. 1988. V.263. №29. P. 14992-5.

42. Crossley MJ, Spowage M, Hunneyball IM.//Studies on the effects of pharmacological agents on antigen-induced arthritis in BALB/c// 1987. Drugs Exp Clin Res.l3(5):273-7.

43. Leon E, Seignez C, Adler N, Peringer P. //Growth inhibition of biomass adapted to the degradation of toluene and xylenes in mixture in a batch reactor with substrates supplied by pulses.// 1999. Biodegradation.l0(4):245-50.

44. Lynch H.C., Bushell M.E. // The physiology of erythromycin biosynthesis in cyclic fed batch culture. //Microbiology. 1995. V.141. P.3105-11.

45. Raczynska-Bojanowska K, Rafalski A, Ostrowska-Krysiak В.// Carboxylation of propionyl-CoA in erythromycin biosynthesis.//Acta Biochim. Polon.1970. V.17. №4. P.331-8.

46. Bosnjak M, Topolovec V, Johanides V //Growth kinetics and antibiotic synthesis during the repeated fed-batch culture of Streptomycetes.// 1979. Biotechnol Bioeng Symp. (9): 155-65.

47. Lieske R.//Morphologie und Biologie der Strahlenpilze.Bontraeger.// Leipzig. 1921.

48. Крисс A.E.//Изменчивость актиномицетов. 1937.Изд-во АН СССР.

49. Красильников Н.А.//Лучистые грибки и родственные им мокроорганизмы.1938. Изд-во АН СССР.

50. Красильников Н.А.//Лучистые грибки (высшие формы).1970. Изд-во «Наука».

51. Duggar ВМ, Backus EJ, Campbell ТН.// Types of variation in Actinomycetes. // 1954.Ann N Y Acad Sci. T.60.V.1.P.71-85.

52. WaksmanS.A.// The actinomycetes and their antibiotics// 1963. Adv Appl Microbiol.T.175.P.235-315.

53. Kutzner H. //Variability in streptomycetes. A review.// 1967. Zentralbl Bakteriol Parasitenkd Infektionskr Hyg. T.121.V.4.P.394-413.

54. Шигаева М.Х.//Изменчивость пигментных актиномицетов. 1968. Изд-во «Наука».

55. Алиханян С.И.//Селекция промышленных микроорганизмов. М.1968. С.29-355.

56. Kalakoutskii LV, Nikitina ЕТ.// Natural variability of developmental patterns in Streptomyces J1 1977 .Postepy Hig Med Dosw. T.31.V.3.P.313-55.

57. Nastasiak IN, Fedorenko VA, Kirichenko NV, Danilenko VN. //Isolation and characteristics of rifampicin-resistant mutants of Streptomyces erythraeus strain//1990.Antibiot Khimioter. T.35. V.12. P.l 1-3.

58. Fedorenko VA, Starodubtseva LI, Zavorotnaia SA, Lomovskaia ND, Danilenko VN.//Characterization of multiple changes of antibiotic resistance characters in Streptomyces coelicolor A3(2)// 1989.Genetika. T.25.V.4.P.626-34.

59. Настасяк И.Н., Заворотная С.А. и др.//Выделение и характеристика мутантов Saccharopolyspora erythraea, устойчивых к хлорамфениколу//Антибиотики и химиотерапия. 1999.Т.44.№З.С.5

60. Starodubtseva LI, Taisova AS, Danilenko VI. //Genetic instability of determinants of resistance to chloramphenicol and kanamycin in Streptomyces lividans 66.1 I 1989. Genetika. T.25. V.6. P.1001-12.

61. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N.//Calcium-induced alterations in the functioning of protein serine/threonine and tyrosine kinases in Str. fradiae.H 2000. IUBMB Life. V.50-.1-5.

62. Elizarov S .M., D anilenko V .N.// M ultiple p hosphorylation of membrane-assotiated calcium-dependent protein serine/threonine kinase in S. fradiae.ll 2001. FEMS Microbiology Letters.V 202:135-138.

63. Миронов B.A., Сергиенко O.B., Настасяк И.Н., Даниленко В.Н//Биогенез и регуляция биосинтеза эритромицинов Saccharopolyspora erythraea!I 2004, Прикл. Биохим. и Микробиол. Т.40, №6, С. 613-624.

64. Navashin SM, Fedorenko VA, Nastasiak IN, Mironov VA, Kirichenko NV, Danilenko VN.//Genetic and biochemical control of biosynthesis of macrolide antibiotics.// 1990 .Antibiot Khimioter. T.35. V.12. P.34-8.

65. Kirichenko VN, Basiliia LI, Nastasiak IN, Zakharova GM, Fedorenko VA, Danilenko VN.//Use of protoplast fusion in the selection of erythromycin-producing strains of Saccharopolyspora erythraea.il 1993. Antibiot Khimioter. T.38. V.6. P.3-8.

66. Nastasiak IN, Fedorenko VA, Danilenko VN.//The isolation and characteristics of mutants of the Saccharopolyspora erythraea strain resistant to thiostrepton// 1997.Antibiot Khimioter.T.42. V.l. P.7-11.

67. Даниленко B.H, Акопянц К.Э., Сизова И.А., Мичурина T.A. .// Определение нуклеотидной последовательности и характеристика нового гена аминогликозидфосфотрансферазы aph VIII из штамма Streptomyces rimosus //1997. Генетика. Т.ЗЗ. С. 1478-1486.

68. Braun V. // Energy-coupled transport and signal transduction through the gram-negative outer membrane via TonB-ExbB-ExbD-dependent receptor proteins.//1995. FEMS Microbiol. Rev. V.16(4):295-307.

69. Petrichkova K., Petrichek M.//Eukariotic-type protein kinases in Streptomyces coelicolor variations on common them//2003 .Microbiol.V. 149.P. 1609-1621.

70. Vomaster T. et. al.// Characterization of two putative protein Ser/Thr kinases from S. granaticolor both endowed with different properties.// 1998. Eur. J. Biochem. V.257: 55-61.

71. Neu J.M., Wright G.D.// Inhibition of sporulation, glicopeptide antibiotic production and resistance in Streptomyces toyocaensis NRRL 15009 by protein kinase inhibitors.// 2001. FEMS Microbiology Letters. V.l99.15-20.

72. Neu J.M. et. al.// StoPK-1, a Serine/Threonine protein kinase from the glicopeptide antibiotic producer Streptomyces toyocaensis NRRL 15009, affects oxidative stress response.// 2002. J. Molecular Microbiology. V.44(2):417-430.

73. Wang W. et. al.// Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signal transduction system, amrA-amkA, involved in rifamycin SV production in Amycolatopsis mediterranei U32.// 2002. J.Arch. Microbiology. V. 178(5):376-86.

74. Mikulik K., Janda I.// Protein kinase assotiated with ribosomes phosphorylates ribosomal proteins of S. collinus.//Biochem. Biophys. Res.Comm.l997,V.238: 370-76).

75. Horinouchi S., Beppu T.ll Regulation of secondary metabolism and cell differentiation in Streptomyces: A-factor as a microbial hormone and the AfsR protein as a component of a two-component regulatory system.//1992.Gene.V.l 15(1 -2): 167-72.

76. Lee PC, Umeyama T, Horinouchi S.ll afsS is a target of AfsR, a transcriptional factor with ATPase activity that globally controls secondary metabolism in Streptomyces coelicolorA3(2).//2002.Mol.Mkrobiol. V.43(6): 1413-30.

77. Floriano В., Bibb M.// afsR is a pleiotropic but conditionally required regulatory gene for antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2). 1996 Mol.Microbiol. V.21(2):385-96.

78. Anderson Т. B. et. al.// Genetic and transcriptional analysis of absA, an antibiotic gene cluster-linked two-component system that regulates multiple antibiotics in Streptomyces coelicolorll 2001. J. Molecular Microbiology. V.39(3):553-566.

79. Umeyama T, Horinouchi S.// Autophosphorylation of a bacterial serine/threonine kinase, AfsK, is inhibited by KbpA, an AfsK-binding protein.// Bacteriol. 2001.T183.V.19.P.5506-12.

80. Umeyama T, Lee PC., Horinouchi S.// Protein serine/threonine kinases in signal transduction for secondary metabolism and morphogenesis in Streptomyces. II 2002. Appl Microbiol Biotechnol. T.59.V.4.P.419-425.

81. Миронов В.А. и др.//. Влияние ионов Са2+ на биосинтез и компонентный состав тилозина у Str.fradiae.ll 1997.Антиб. и химиотер. 42(4):3-7.

82. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N.// Dinamics of serine/threonine protein kinase activity during the growth of the wild-type Streptomyces avermitilis strain and its chloramphenicol-resistant mutants.// 2000. Microbiology. V.69.N.3.P.281-286.

83. Елизаров C.M., Гаврилина A.B., Даниленко В.Н.//Модулирование активности серин-треониновых протеинкиназ у хлорамфеникол устойчивых мутантов Streptomyces avermitilis/fMojieKynnpHax биология. 2004. Т.38., №3., С.329-336.

84. Даниленко В.Н, Акопянц КЗ.// Нестабильность и «молчащие» гены актиномицетов.//1995. Биотехнология. Т. 7-8. С.104-112.

85. Davies J., Smith D.// Plasmid-determined resistance to antimicrobial agents.//1978. Ann. Rev. Microbiol. V.32. P.469-518.

86. Wright G.D., Thompson P.R.//Aminoglycoside phosphotransferases: proteins, structure, and mechanism.// 1999. Front. Biosci. V.4.D9-D21.

87. Wright G.D.//Aminoglycoside-modifying enzymes.// 1999. Curr. Opin. Microbiol. V.2. P. 499-503

88. Daigle D.M., McKay G.A., Thompson P.R., Wright G.D// Aminoglycoside antibiotic phosphotransferases are also serine protein kinases. .//1999. Chem. Biol. V.6. P.ll-18.

89. Boehr D.D., Thompson P.R., Wright G.D.// Molecular mechanism of aminoglycoside antibiotic kinase APH(3")-IIIa : roles of concerved active site residues.// 2001. J. Biol. Chem. V.276. P.23929-23936.

90. Daigle D.M., McKay G.A., Wright G.D.// Inhibition of aminoglycoside antibiotic resistance enzymes by protein kinase inhibitors.// 1997. J. Biol. Chem. V.272. P.24755-24758.

91. Boehr D.D., Lane W.S., Wright G.D.// Active site labeling of the gentamicin resistance enzymes ААССб')- APH(2") by the lipid kinase inhibitor wortmannin.// 2001. Chem. Biol. V.8. P.791-800.

92. Danilenko VN, Puzynina GG, Lomovskaia ND. // Multiple antibiotic resistance in actinomycetes.// 1977. Genetika. T. 13. V.10.P. 1831-42.

93. Potekhin IaA, Danilenko VN. //Determinant of resistance to kanamycin in Streptomycin rimosus: amplification in the chromosome and reversible genetic instability//1985. Mol Biol (Mosk). T.19. V.3. P.805-17.

94. Даниленко B.H, Акопянц К.Э., Сизова И.А., Мичурина T.A. .// Определение нуклеотидной последовательности и характеристика нового гена аминогликозидфосфотрансферазы aph VIII из штамма Streptomyces rimosus //1997. Генетика. Т.ЗЗ. С. 1478-1486.

95. Danilenko V.N.,Starodubtseva L., Navashin S.//1985. Proc. 6 Intern. Symp. Biology Actinomycetes. Hungary: De brzen. P. 79-81.

96. Urabe H., Ogawara H.// Cloning, sequencing and expression of serine/threonine kinase-encoding genes from Streptomyces coelicolor A3(2).//1995. Gene. V.153. P.99-104.

97. Matsumoto A., Hong S.K., Ishizuka H., Horinouchi S., Beppu T. //Phosphorylation of the AfsR protein involved in secondary metabolism in Streptomyces species by a eukaryotic-type protein kinase. //1994. Gene. V.146. P.47-56.

98. Nadvornik R., V omastek TJanecek J., Technikova Z.,Branny P.// P kg2, a n ovel transmembrane protein Ser/Thr kinase of Streptomyces granaticolor.//\999. J. Bacteriol. V. 181. P. 15-23.

99. Umeyama Т., Lee P.C., Ueda K., Horinouchi S.// An AfsK/AfsR system involved in the response of aerial mycelium formation to glucose in Streptomyces griseus.ll 1999. J. Microbiology. V.145. P.2281-2292.

100. Elizarov S.M., Mironov V.A., Danilenko V.N.// Calcium-induced alterations in the functioning of protein serine/threonine and tyrosine kinases in Streptomyces fradiae cells.//IUBMB Life. 2000. 50(2):139-43. 2000. IUBMB Life.V.500. P.139-143.

101. Benveniste R., Davies J.I.// Aminoglycoside antibiotic-inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibiotic-resistant bacteria.// 1973. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V.70. P. 2276-2280.

102. Shaw K.J., Rather P.N., Hace R.C., Miller G.H.// Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes.//1993. Microbiol. Rev. V.57. P.138-163.

103. Акопянц К.Э., Сизова И.А., Мичурина Т.А., Даниленко В.Н.// Определение нуклеотидной последовательности «молчащего» гена аминогликозидфосфотрансферазы Streptomyces rimosus РЗ.//1997. Антиб. и химиотер. №42, С.3-13.

104. Hon W.C., McKay G.A., Thompson P.R.,Sweet R.M., Yong D.S.C., Wright G.D., Berghuis A.M.// Structure of an enzyme required for aminoglycoside antibiotic resistance reveals homology to eukaryotic protein kinases.//1997. Cell. V.89. P.887-895.

105. Demain A. L., Fang A.// Emerging concepts of secondary metabolism in Actinomycetes.//1995. Actinomycetol. V.9(2):98-l 17.

106. Bibb M.// 1995 Colworth Prize Lecture. The regulation of antibiotic production in Streptomyces coelicolor A3(2).//1996. J. Microbiology. V. 142:1335-44.

107. Norris V. et.al.// Calcium signaling in bacteria (minirev).// 1996. J.Bacteriol. V.l78 (13):3677-82.

108. Natsume M. et.al.// Calcium ion regulates aerial mycelium formation in actinomycetes.// 1989. J. Antibiotics. V.42(3):440-47.

109. Natsume M, Marumo S.// Calcium signal modulators inhibit aerial mycelium formation in Streptomyces alboniger.ll 1992. J.Antibiotics. V.45(6): 1026-28.

110. Natsume M. et.al.// Transient increase in intracellular calcium in Str. alboniger.il 1995. Biosci. Biotech. Biochem. V.59(l): 152-54.

111. Natsume M.// Differetion of aerial mycelia by pamamycins and calcium ion m Str. alboniger.//1999. Actinomycetol. V.l3(1): 11-19.

112. Leadlay P.F., Roberts G., Walker J.E.// Isolation of a novel calcium-binding protein from S. erythreus.il 1984. FEBS Lett. V.178(l):157-160.

113. Bylsma N. // Prokaryotic calcium-binding protein of the calmodulin superfamily.// 1992. FEBS Lett. V.299(l):44-47.

114. Tossavainen H. et.al.// NMR solution structure of calerythrin, an EF-hand calcium-binding protein from Sa. erythraea.//2003. Eur. J. Biochem. 270:2505-12. 2003. Eur. J. Biochem. V.270:2505-12.

115. Yonekawa T. et.al.// A calcium-binding protein with four EF-hand motifs in S. ambofaciens.//2001. BBB. V.65(l).156-160.

116. Иванова И.В. и др.// Влияние ионов кальция на дифференциацию актиномицетов.// 1994. Антиб. и Химиотер. V.39(l 1):21-27.

117. Данова С.Т. и др.// Роль кальция в жизненном цикле Str.albogriseolus 444.// 1997. Антиб. и Химиотер. V.42(4): 12-15.

118. Reed P., Lardy H.// A23187: a divalent cation ionophore. //1972. J.Biol.Chem. V.247:6970-6977.

119. Sverdlova AN, Agbenoko K, Iaglova LG, Egorov NS.// Calcium transport in cells of Streptomyces chrysomallus var. macrotetrolidi— a producer of macrotetrolide antibiotics.//1992. Antibiot Khimioter.T.37. V.l. P.8-11.

120. Moncheva P., Christova K., Sholeva Z., Ivanova I., Beijerinck //Centennial Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principales and Applications/W.A. Scheffers and J.P. van Dijken,ed//1995. V.l85-186.

121. Мончева П.А. и др.// Физиологическая роль внеклеточных протеаз и ионов кальция в процессах дифференциации и антибиотикообразования S.albogriseolus.II 1997. Антиб. и ХимиотерЛЛ42(9):14-19.

122. Mateles R.J., Ben-Bassat A.// Production of actinomycin D in complex media. The influence of metal ions.// 1973. Agr. Bid. Chem.V.37(10):2215-17.

123. Singh A. et.al.// Streptomycin: a fermentation study.// 1976. Enr. J. Appl. Microbiol. V.3(l):97-101.

124. Debnath M., Majumbar S.K.// Effect of minerals on the production by Str. kanamyceticus.il 1987.Appl.Microbiol.Biotichnol.V.26(2): 189-96.

125. Imail H. et.al.// Isenamicins: macrolide antibiotics preparated Micromonospora sp. fermentation.// 1989. J.Antibiotics. V.42(6): 1000-2.

126. CoverW.H. et.al//Calcium inhibition of efrotomycin production.// 1991. J. Ind. Microbiol. V.7(l):41-44.

127. Miguelez E.M. et.al//Hyphal death during colony development in Str.antibiocus.ll1999.J.Cell Biol. V.145(3);515-25.

128. Miguelez E.M. et.aV//Streptomyces: a new model to study cell death.// 2000. Int.Microbiol. V.3:153-58.

129. Nicieza R.J. et.al.// Purification, characterization and role ofnuclease and serine proteases m Streptomyces differentiation.// 1999. J. Biol. Chem. V.274(29):20366-75.

130. Fernandez M.,Sanchez J.// Nuclease activities and cell death processes associated with the development of surface cultures of Str.antibiocus.// 2002. Microbology. V.148(2):405-12.

131. Lee P.C. et.al.// Afs S is a target of AfsR, a transcriptional factor with ATPase activity in Str. coelicolor.il 2002.Mol.Microbiol. V.43(6):1413-30.

132. Aravind L. et.al.// The domains of death: evolution of apoptosis machinery.// 1999. TIBS. V.24:47-53.

133. Anderson P.// Kinase cascades regulating entry into apoptosis.// 1997. MMB Reviews. V.61(l):33-46.

134. Hosoya Y, Okamoto S, Muramatsu H, Ochi K.//Acquisition of certain streptomycin-resistant (str) mutations enhances antibiotic production in bacteria.// 1998. Antimicrob Agents Chemother. T.42.V.8.P.2041-7.

135. Ни H, Ochi K.//Novel approach for improving the productivity of antibiotic-producing strains by inducing combined resistant mutations.// 2001.Appl Environ Microbiol. T.67.V.4.P. 1885-92.

136. Ochi К. I I Streptomyces relC mutants with an altered ribosomal protein ST-L11 and genetic analysis of a Streptomyces griseus relC mutant.// 1990. Bacteriol. Т. 172.V.7.P.4008-16.

137. Hosokawa K, Park NH, Inaoka T, Itoh Y, Ochi K.//Streptomycin-resistant (rpsL) or rifampicin-resistant (rpoB) mutation in Pseudomonas putida KH146-2 confers enhanced tolerance to organic chemicals.//2002 .Environ Microbiol. T.4.V.1 l.P.703-12.

138. Inaoka T, Takahashi K, Yada H, Yoshida M, Ochi K.//RNA polymerase mutation activates the production of a dormant antibiotic 3,3'-neotrehalosadiamine via an autoinduction mechanism in Bacillus subtilis.// 2004J Biol Chem. T.279.V.5.P.3885-92.

139. Бирюков B.B., Кантере B.M.// Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.// 1985, Москва, Издательство Наука.