Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение молекулярно-генетических механизмов нестабильности признаков устойчивости к антибиотикам у Streptonyces cjelicolor АЗ(2) и Saccharopolyspora erytbraea

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение молекулярно-генетических механизмов нестабильности признаков устойчивости к антибиотикам у Streptonyces cjelicolor АЗ(2) и Saccharopolyspora erytbraea"

MIHICTEPCTBO ОХОРОИН ЗДОРОВ'Я yKPAÏHH Украшськнй науковии ппсшчиий центр

На правах рукопису

9 0 » пО

А Л ВОР ОТ H А Суеана Лиатолиаиа

ВИВЧЕННЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧННХ МЕХАНШПВ

: I ü CT AB 1Л ЫIQCT í 035i Л К CT Ш К OCT! ДО ЛНТНЫОТИКШ У STîiElTOMYCES COELICOLOR Л 3(2) ТА S ЛСС1 ! Л 'IО PC LYS PC) К А Е it YT11 It Л ЕЛ

03,00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ днсертаои на адобуття впепого ступеия

ican.tu.i3Ta 01олиг1Ч:шх паук

Kiiïn - 1У96

A'jcepmaiilem e рукопис

Роботу виконано у лзборатэрП генетики, селекцП та генетике! 1кженерП продуцент! в ачтиб1огик1в Львгьсыгого державного унгшзреитету 1м. к Франка.

НаукоякЯ кер1вюи - кандидат 01олог1чних наук.

доцент Федоренко В.О.

0ф!ц18н1 опонентн - доктор медичних наук

професор Бужиевська Т. I.

кандидат С1олог1чних наук Дуган О.М.

Проз1днд оргашзац!я - 1кституг и1кроб)'ологП 1 Eipyco-логП 1м. Д.К.Заболотиого HAH Украп:к

де)

Ззхист в!д6удеться ilff¿3^1996 року о годин! на вас1дакн1 Спец1зл1эоьано1 вчено'! вали А C/.S7.1B при Укра1нському пауковому г!г1ен1чному центр!

3 дисертац1ею можна ознайсмитись з науков!й ргблю-^и! Укра!нського паукового г1г1ен1чного центру

Автореферат роз!слало "/<2" 1995 р.

Вчений секретар Спец1ал1гоьано5 ьченоИ p-vi..', кандидат 61олог1чних наук

ЭАГЛШИ ХАРАХТШСТЗЖА FOSOHi

Актуальи1сть досл1дг5еиь. Досл1дження, виконан! на р!з-

них представниках роду Streptomyces, показали висогай cry-......

п1нь неста01льност1 1х геному. Найкращою мсделлю для вивчен-ня цього явища е генетичн1 детерм1нанти резистентност! акти-HOMineriB до актиб!отик1в. Встановлення ыехан1ам1в гекетич-но5 неста01льност1 мае важливе значения для розум!ння осоС-лквоетей орган i эагд! 1 геному актином 1цет1в та itoro перебудов, пошуку фактор!в, як! б влливали на його стаб1льн!сть.

АктиломШети. для. яких характерна природна миохинна ст!йк!сгь до ап7Иб!отяк1в, розглядаютьса як ucsxme джерело генетичних детерм!нант1в антибЮтикорезистектяосзЗ. В остан-н1й час пстсгзано гомолог1ю деяких ген1в сПйкосП до антиб!-отик1в актином1цет1в, клШчних штам1п !<1кроорган1зм1в та ракових кл1тин лодини. Тому важливнм для медкциии е роз/MiH-ня осоОливостей генетичного контролю ст1йкост1 актиксм!цет!в до антиб1отик1в, еволюцП i роэпрвсюджешт детери!нант1в ан-тиб!отикорезистентност1.

Актином!usra с прод'/центзш 61льшост1 в1домих антиб1о-тик1в. СункЩонуванчя ген1в ст!ккост! до антнб1откк1в в не-обхгдним для ззбеапеченяя хиттсздатност! кл1тш{, якг 1х про-дукують. Вивчення механизм!а зятеб!стикорезиетентноет! доз-ьоляе розробити нов! п!дходи до конструювання вксокожтиених ;нтам1в-продуцент!г аяти01отнк1в. Кр1м того, знания Mexanis-м1в нестаМльност! ген!в антибЮтакорезкстентност! дозволить вести пошу:: фактор1в, як! б дозволили покращити ефэкгивяЮТ антиб1отикотерап!1.

Иэта i заздалня досл1дяюнь. Метою роботи е генегичннй анализ множкнно! зм!ни ознак айтиЗ'отикоревистентност! модельного об'екта генетики актш!ом1цот1в S.coslicolor А3(2). а гакох 1дентиМкац1я та характеристика неааШлыш ознак у продуцента макрол!дного анткбЮтика еритром!цину S. erythraea.

В зв'яэку з цим було поставлено сл1дувч1 згвдання:

- охадактеризувати мгюжинн! зи!ки ознак резистентное?! до актяб1откк1а S.coelicolor А3(2);

- провести геяэтечктй statis та локал1зувати ибсгабШк! да-

■герм!начти ст!й;:ост! S.coolic-.lor A3(2) до хлорйг4-ен!колу та ристом1ципу;

- 1дентиф1кувати та вивчити генетичяо нс-стабШн! озиаки у

- fi -

продуцента еритроиЩину S.erythraea;

- досл1дити структурн1 перебудови в геномах штам1в з неста-61 льними ознакаия та вивчити 1х зв'язок а нестаб1лън1стю оа-нак.

Наукава новизна. Виявлено ряд закономерностей мнодинно! 8и1ни ознак антиб1отикорезистентност1 у S.coel icolor А3(2). Показано хроиосомну локал18ац1ю генетично нестаб!льного де-терм1нанта ст1йкост1 до ристом1цину. 1дентиф1ковано два не-еачеяних детеры!нанта ст1йкост1 до хлорамфен1колу S. сое 11 color А3(2), як1 локад1зуються у в1ды1нких районах хромосоми. Вперае в геноа1 иутант1в S.coellcolor А3(2) виявлено plan 1 пссл1дозност! ДНК, 8датн1 до ампл1ф1кацП.

В кл1ткнах S.erythraea 1дентиф1ковано иеописану ран1ше плазм1ду pSE201, яка мЮтять детеры1нанти ст1йкост1 до аш-ногл1коаидних антиб1отнк1в 1 вдатна трансформувати S.llvl-dans 1 переноситись кон'югативно у S.coellcolor А3(2). Показано, щр ел1ы1нац1я та вы!на коп1йност1 ц1е1 плазм1ди обу-мовлюе нестаб1льн1сть прояву ознак резистентност1 вказаних штам1в до ам1ногл1козидних антиб1отик1в.

Науково-праяткчна гЦкнЛста йося1джеш>. Шдходи до вив-чення генетично! нестаб1льност1. розроблен1 при досл!дденн1 модельного об'екту S.coelicolor А3(2), молсутъ бути эастосо-•ван1 до промислових штам1в-продуцент1в анткб1отик1в, зокре-ма, продуцента еритром1цнну S.erythraea. Система генетично нестаб1льних детерм!нант1в хлораь!фен1кол- та ристом1цин-ре-вистентност1 S.coelicolor А3(2) меже бути використана як тестсистема для скрин1нгу речовин, як1 впливають на частоту перебудов нуклеотидних посл1довностей (ампл1ф1кац<й, деамп-л1ф1кац1й, делец1й). Плазм1ду pSE201 мсоша використати для клонування та ампл1ф1кац11 посл1довностей ДНК з метою гп движения експресП певних ген!в.

Апрзбгц1я робота. Матер1али дисертацП представлялися на VII Националья1й конференцП по виробниц. та застосуванкю антиб1отик1в, Раэград (Болгар1я), 1990; Ы1кнародкому симno-si ум 1 "Генетика та утворення продукт 1 в аэткном1цетами", Ер-фурт (Н1меччкна), 1390; VI М1ккародному сшпоз1ум1 э генетики промкеловкх м!кроорган1зм1в, Страсбург (ФралШя). 19S0; I Всессюэн1й планово--<!?.1тн1й конференцП 'Тенна та кл!тинна 1нхенер1я", Пувдшо-на-0ц1 (Рос1я), 1990; VI з'1зд! Укра1нсь-

кого товариства генетик!в 1 селекц!онер!в 1м. M.1.Вав1лова, Полтава. 1992; II Всесошк1й плажшо-зв1тн1й конференцП " Генна та кл!шша 1;гжо;гер1я", Пу!яино-на-Оц1 (Рос1я), 1991-, I з"1зд! УкраЧнського м1кросюлог1чного товариства, Одеса, 1993; VI! МЮТародному симпоз1ум! з генетики промигловпх м!крооргаи1зм1в, Монреаль (Канада). 1994; IX »Яжнародисму симпоз1ум! з 01ологП акганом1цет1в, Москва (Pocin), 1994; X конференцП Шмецького товариства вагальноТ и!кроб1э.югН "Б1олог1я аг.тином1 цэт 1 в", Йена (Шмеччина), 1934; VII ь'Бро-пейському конгрес! з б1отехнологГ1, Шцца (Франц1я), 1995; пзукових конферешЦях сп!вроб1тник1в 01олог1чного факультету Льв1вського державного ун!верситету.

Публ1кацП. За матер1алами дисертацП олубл1коваио 18 ро(51т.

Структура та обе яг роботи. Дисертлц! я складаеться 1з б роздШв: "Вступ", "Огляд л!тератури", "Реаультати та 1х об-говорения", "Висновки" та "Список ж1тератури". Роботу викла-дено на 163 CToplHKax машинописного тексту, в тому числ! 22 таблиц! та 39 рисунк!в. Список л1тератури включаз 192 найме-нуьання.

ЯАТЕР1А5И ТА №Т0>№.

Бгктср1альн1 мтлмя та шшшдк. В poCoTí використаяо штами актином1цет1в: S. coelicolor Л3(?) А617, S507, S509, S510, S511 S18, S459 та S5Q8 з мувею культур ДШП генетика; S. erythraea ¡sravf Б. ЖК12338, hi8, S. llvídans 65 з музе» культур Д!!Д1 антиб1оти;«в (Москва,Рос1я); BTOCS, 5002. 5003, 5004, 2214 та 2215 люО'язно надак! д-ром Т.Тодоровим (Ihctu-тут »1кро51могП АН ВотгапП, Cofyin) ; пох1дн! перераховаяих cíTfSMín, отримак! при пиконзки! ai в í роботи; ятзми Е. coll С600, DHSrt, а таю* S.zaycoi'Jes НВ2. Як веетор було t.iv.-oр:;о-тачо ллазм1ду pUC19.

• С&редоюиа. ' Для виропування атам!в актккоы1цет!в вико-риатоаузалй ?íobkgí;!"tí ж-ярдаован! середов{ща СР-б, 1Ш-2, пка-5 глетэсвая н.л. " др.з, К2 гнпр^оои о. î>t. al., 1SS5Î, сютеуячч» глпнозо-аспараг1доео сер^довще (M?) U'opwxd 0. et. ai., 19351, piдк! середошщ YEME ШоркооЗ D. et., al., 19853 ça SCCP tU'-эЬег -»t-al.. Для г.кенглення rswaio-

ткчно! активяосП S. erythraea вшсоркстовува/ги ионном ¡:us

ферыентацШе середэввде, B.mycoldes та E.coli вирощуваяи на середовиц! Лур1я ШШер Дж., 1976]. В робот 1 використано 16 найбШи взиванкх у л1кувалън1й практиц! анти01отик!в.

Отрииання мутант!в. резиотентних або чутливих до аяти-01отик!в, ааал!з схрещувань проводшш зг!дно методик, описа-них ведоренво В.А., 1980.

Вид1ления сууарноТ та плазм!дно! ДНК та Ix рестрикц!й-ний анал1з, отрицания 1 трансФорыац!ю протопласт!в проводили ва ыетодикою, описаасж Hopwood D., (1985).

Вивначевня антиб!отично1 активност! штам!в S.erhythraea п!сля вирощування в р1дкому середовищ1 проводили 01олог1чним методом дифузП в агар в тест-культурою B.mycoldes НВг.

Визначення отрептом1цин-фоофо-трансфераано1 активност! проводили аг1дно а описании ран1ие б1олог!чним методом Tohyama Н. et. al. (1986).

ДНК-ДНК г!бридизац1р проводили зг1дно "The DIG System Users Guide for Filter Hybridisation" (Boehringer Mannhelm) (1994). фрагмент сумарно1 ДНК переносили з геля на нейлоно-вий ф1льтр Hybond (Amersham) 1 гЮридизували з плазмиою PSE201, яку «1тили ва допошгоо методу зиладкових гексанук-леотидних праймер1в а винористанням Кленов-фрагменту днк-по-л!мерази I E.coli (Fermentas, В1лънж) та д1гоксиген1н-11-д УТФ (Д1Г). Виявлення Д1Г-м1чено1 ДНК на ф!льтрах проводили колориметричним методой з використанням кон'югату анти-Д1Г-антит1л 1з лужною фосфатазою, розчину тетраэол1ю н!троголу-бого (ТНГ) у 702 диметилформам!д1 (75мг/мл) та 5-бром-4-хлор -3-1ндол1л фосфату (Х-фосфату) у диметклформашд! (50мг/мл).

РЕЗУЛ>ТАШ ТА !Х ОБГОБОРВШ. 1. Гечоткчна BsczaölJ^uicsb ознаа прнродно! резистентност! до aimsölonssiB у Streptosyces coelicolor A3(2) та продуцента еритрок1цкиу Saccbaropolyspora erythraea. 1.1. Вивчення властивсстей мутант!в S. coelicolor А3(2),чут-

ливих до хлора>4>ен1колу.

Досл1джуван1 штат S.coelicolor A3(2) А617 (pabAl uraAl argAl strAl NF SCP2+) та S18 (cysD18 adeC(VlO) strAl SCPi" S0P2") резистентн! до 10-ти з 16-ти в!Кор!!Стачих антиОюти-Kib. в тому чксл! до 10 мкг/мл ристомШшу (fön) та 20 мкг/мл хлсра^+юн1колу (Cm). 3 частотою 0,2-0,3Z Щ штамп здатча ут-

ворювати ~мутаят;;,"'"чу-л:а1- до On та 1ниих антиб!отик1з. - Ми йиьчаш'. "Mí "X 03HSK пктиб1откгарезистентноса1 у не-залехних хлорзьфен!ксичутдивт (ОnlS) nyrasxia вгаыХв A6í? (S507, S509, 3510, S51Í) та Si8 (S15d). три итами булн чутлнвкми до 20 икг/мл Cm (SS07, 5509, S459), а два - (S510, S511) - до 20 мкг/rj Cm тз 10 мкг/ы,- Jíi (Ritt). При яягплче.та} р!аяя чутливост! незаг.ежшк OnlS-мутант! в до хлорамин i колу було виявлено, щр вони суттево р1зкяться м!ж собой аа чутлив1стю до iscro áirTüSlOT'ira. Вк*чеиня спектр!в ст!йкост1 цих пггам1в до алтк51откк!в поглзало, тр в1доувавться зы!на розкстгят-ноет! дослШеяик CnlS-iíyraHriB i до 1нешх аяти51отик1в (ам1ногл!козид1в канаШиину, ыономЩину, гентамЩину та нео-иЩину, а такок до еритром1цину, олеандсм!цяяу, л1нком1цину, рнфаштЩкну, пол1н1ксину та тетрациклину).

0дн1пз з вяастивостей мутант1в S.coelicolor A3(2), чут-ливих до антиб1отик1в, в Ix здатШстъ ревертувати до антиб!-отикоргзкстевтност1. Мн назначили частоти утворекня спонтанных /.лсра^н^гагл--резне тснтких (Cm! R) peseprahtis я'ятьна OnlS-et3«a»ffî. Еуло показано, що ц! частота е р1зкимк у неза-лезя'лу. мутакт1з. С\пд в1дзначктн, ср утзореннн хлорамфек!-кол- та ристс^циЕ-рес-истентюк р-звсртант1в в1д5узаетьса !з аначко вгсгчкмк часгсгагдг, тл kyí¿aí! вихдоах ет£«1г до OnlS та КшЗ*фе«ютйгЛз. Вкдис-Hi иг»и агЛЯ-ргзгртантй сутте-во в1др!зяжтьса за ст1йк1ста до ft? з!д EKXisnoro агаму А617 (p:ic.î). Тобго пеаеркзнял до годного íc-нотжу juopawJc-Hi-код-резистзнткост1 не спостер!гаеться. ïcwy феао-гнп доал1д-женкг-t poEsprorrrls 3yt<? поачачвио ванн як CtalR*.. Отав, шшз лрнпустити, qo утвороакя реэерта:г?1к пов'язане з мутац!ями lKBBK reHís, а цераишю аумц1а дв!Гбри1накта хлорз»4ен1-кол-резистентност1 збзр1гасться, про до св!дча-гй таком д1те-ратурн! дач! про делец! ï Onlfî-reHiB S. coellcolor А3(2) [Fielt Г. and Cuîlur J., 10373. Вуяо визначено спектри ст1й-Kocrl до 16 ааТгЯЯсгихЮ 3 назлдогсдак &1]К*-рс?вертаяпз pis-ких шта».Ив. Показано, ¡до рвворгаати стали ст1йк1шкмя до ам1-ногл1ксзчд1з, *зритром1ц;гяу, акгн.цо;йцину, .ШнтаЛщку, ри-фамп1щшу та пал1м1кс!нь7, еднак Ix ctííkoctí до вла-

заних ачтиб1отик1в був вищим, н!ж у вих1дних итам!в А617 та S18. Ц1 факти ».юкуть сз1дчити про генетичку взаемод!» детер-м1нант1в ctiükocti до pi3HHX антиб1отик1в. Така взаемогЛя

маге бути обумовлена зчеплеШстю вказаних ген1в або начвн!с-тю сп1лъних регуляторних елемент1в.

Таким чином, для генетично! иестаб1льност1 у S.coelico-1ог A3 (2) характерна множинна зм1на овнак антиб1отикорезис-тентност!.

1.2. Виникнення мутант!в, чутливих до ристомЩину, у CmlS-

та CmlR'-noxJ^mtx S.coellcolor A3(g).

Ми вивчили здатн1сть Ст13-мутант1в штаму S.coelicolor A3(2) S18 та 1х СтШ*-ревертант1в утворювати RlmS-noxlsHl (рис.2). Штам S459, чутливий до 20 мкг/мл Cm, здатний утворювати з частотой 6,6% мутантн, чутлив1 до йп, як! aöepira-ють також чутлив1сть i до Оп (фенотип CmlS RlmS). Незалежн1 CmlS RlmS мутанти в1др1зняються за р!внем чутливост! до fön. Було досл!дхено такса эдатн1сть Ст1Ки-ревертант1в штаму S459 утворювати RimS-мутаити. Майасе половина Ст1Р*-ревертант1в (41%) е чутливими до ристом1цину. Друга частина QnlR-ревер-тант1в (59%) здатна утворювати RlmS-noxlÄHl з частотою 4,6%. Биявлен1 частоти утворення RimS-MyTaHTiB значно вищ1, н!ж у вшйдного штаму S18, який утворюе RimS-мутанти з частотою 0,2%. Визначенця спектру ctIkkoctî Р1по-пох1дшк до р1зних антиб!отик!в показало, цо б1льш1сть з них стали чутлившими до макрол!дних антиб!отик1в, до ам!ногл1козид1в, а такозк до тетрацтШну, пол!м1ксину, л!нком1ципу та хлорамФен1колу. Отже, генетичн! зм!ни, що.в1дбуваються в детерм1нант! ст!й-кост! до Qn, включають ц1лий каскад под1й, одним з прояв1в ягсго б п!двздена лестаб1льн1сть детерм1нанту ctIükccti до Rrn. 0ск1льки здатн1сть утворювати з висогао частотою RimS-клони збер!гаеться i у GnlR'-nrraMiB, зм1ни, • як! е причиною тако'* високо! мута01льност1 Я1шР-детерм1нанта, збереглися i у ревертаит1в.

Проведен! досл1дження дозволили виявити так! особлжос-т! мнсжннно! зм1яи ознак антиб1отикорезистентност1 у S. сое-licolor А3(2). як висока частота появи мутант1в, чутливих до хлорамфеШколу, ристом1цину та îhemx анткб!отик1в; здатн!сть утьорлватк резистснтн1 до цих анти51отикЛв ресертанти; сут-тсва р1эниця в р1внях ст!йкост! до антиб1отик!в ровортлл?1в та еих1дного штаму.; плейотропний характер досл1джш'.х мута-ц!й; ¡Идвищення частоти мутад!й в детерм!нант! p;:cTOMi;;i:n-резис-тентиост! п!сля пошкодження CmlR-детермЗнанта.

imnussrpeaU х.»о{»«1ен1к<иу. iwr/iu

Рис.1. Заяе.тлЮть чзстотк виживання CmlR* ревертаит1в S. coelicolor А3(2), ПОХ1ДНЙХ штаму S507, в1д концентрат 1 хдорамфен1колу. 1 - AG17, 2 - S507 . 3 - R101, 4 -R102. 6 - R103. .........

CalR.RliüR (BIS) I 0,3i

О, 04-

-6.5S.---1

Q.3S Ri.-nS (Ki7, Hl С. H25 TS ir.i

5. 3-0

41S

59% 1

CrtiR.pJmR (S20d.R31S.R33i) Са^.У.П'Л 4.62 '

CnlR Rias CnlOimS

(..■503. G5,Co7 T-l ):1) (;«3.H40.34'i Ti iH.)

i Q.QI;;

Coli? "ir";

~'УЛ 0"

ГхП

Рис.2. Схема утворення QnlS- та Шпе-мутан^в S.eoelicoior А3(2) та 1х ревер?ант1в.

1.3. 1дентиф1кац1я та вивчення генетично нестаб!льних ознак ст!йкост! до антиб1отик!в у продуцента еритром!цину SaccharopoIyspora erythraea.

1.3.1. Вивчення ознак ст1йхост1 до антиб1отик!в у S. erythraea.

Ми досл1дши на ст1йк1сть до р1аних антиб1отик1в колек-ц1ю в десяти штам1в S. erythraea, серед яких як т1, шр проду-кують еритрои1цин (Егу+), гак 1 кутанти, як1 його не синте-вують (Ery"). Bel досд1дяен1 наш втами виявляли природну ст1йк1сть до иакрох1дних антнб1отик1в, а такод до лIrkomШиву, пол1м1нсину, пен1цил1яу. новоб1оцину та тетрацюШну (10-30 ыкг/ия). Виэначення р1вня ст1йкост1 до еритром1цину та 1ввих ULS-asTtiúlOTHKlB показало, щр мутанта S. erythraea, як1 не продукують еритрешгош, е чутлив1шши до цих антиб1о-тик1в, his внх1дниД Егу+-стам, вр св1дчить про пошкоддення у цих мутанПв гену !&5-ст1йкост1.

Частина досд1дхених етш1в були чутливими, частина -резистенттаам до стрептоаЩину (Эп). Цей факт привернув нашу увагу, оск1лькй штага екишоы1цет1в, як1 не продукують ам1-ногл1коеидв1 антиб1отиш. переваяпо е чутливими до цих анти-610ТИК1В, в тому чксл1 1 до an Шуаынина Г.Г. и др. ,1977]. Наявн1сть у кодехц1! як резпетенгши, так 1 чугливих до ць-ого антибЮтика птам1в ысов бути обумовлена генетичною нес-таб1льн1сто ознаки ctIèkdctI до стрептшщину.

1.3.2. Генетична нестаб1льн1сть разистентвост1 S.erythraea до стрептом1ципу.

Було вквчено вдатн1сть итам1в S. erythraea 5, A3 та А12 утворввати чутдив1 до Sa мутанта. Штам б е реэистентним до 30 мкг/ил Sa. 0,042 ECíx перев1рених клон 1 в иали StrS-фено-тип. Ця частота е досить ввеокоо. 1 вона е характерною для втрати генетично нестаб1льних ознак у S.coellcolor А3(2) та 1нших аетинш1цет1в [Федоренко В.А. и др., 1980, Cullum J., et al, 19861. Було вивчено 8датн1стъ штаму 5 утворювати спонтанн1 мутанти в п1двищеною резистентн1стю до Sn (рис.3). Шляхом посл1довного в1дбору на середовицах is вростаючими кокцентрац1ями sin отримано калекЩю спонтанних мутант!в з р1зним р1внеи CTIHKOCTÍ (в!д 0,1 до 15 иг/ил) до цього анти-бЮткка. Визначення спектр!в ctíkkoctí мутачпв, резистент-

них до sai," до iaaiR" аятнб1огик!в, показало, що у деяких э них зб1льиилась резистентнЮть до ам1ногл1козвд1в, хлорамфе-н!кюлу та амп!цил!ну. Лише у дек1дькох з досл!джених StrR-мутанПв в iдбуяось Шдвищення резистентност! до bcíx bíaIho-гл!козид1в. Шi дссл1д1Ш{, як отртан! наш? стрептом!цин-ст!йк1 мутанти збер1гашъ сз1й фенотип. Виявилось, що штами, як! не п!дтримуватась на середовищ1 з Sa, були нестаб1льни-т 1 розщешповались, утворюючи StrS-noxlÄHi з р1зноа частогоü (в!д 0.С07 до ■ißt). Под1бна картина спостер1гаеться 1 у Егу"-ыу'гант1в 5. crythraea.

Таким чинш, у S.erythraea начи виявлено генегично нес-таб1дьпу ознаку резистентное?! до За, яка проявлялась у здатност! сцонтанно утворввати чутлив1 та високорезистентн1 иутаяти, як1 отримуються шляхом ступ1нчасто! селекц! I.

1.3.3. В1осинтеэ еритрон1цину мутантами S.erythraea, ст1йки-ца до стрептом1цину.

Ми зивчили, чи гм1кюсться аятнбЮгнчна гасгавнЮтъ StrR-

¡¿У':дя?1з S.erythrasa у пор1пнянн! а вих!дкою культурою. Вуло виэиачено м!нлив!егъ оэнакя йя?к6!откчно1 гктивност! у окре-:«« клон1а штаму 5, «езагехшк 31гк-мутгя?1в та скремж гмо-hí в csc?h StrR- 73 д;;ох Кля!?-кутзн71в. Картина розпод1лу за-табЮткчко! аггилисстг ¡сгон 1 в кожного ¡rrmjy в i ндив i дуальной, сдягк спсстерггазться тендеяцгп до зОШгеяяя антиб!о-т.тшо! активное?! серед ггззле-лгггк 5ЬгЕ-?!у?гят1а (рис. 4). При в:грощувагш1 досшдяеш« StrR-EraiJis з гдибишш умзвах аяг;с51с7этяз Sii.ßZ з гаи булз б1яыкю, н1ж актив-

нгсть и?2му 5. Стул. StrR-ir/7üHra S.erythrasa е перспективней для подальшо» сакгаЦ! здгьтури иа п!двкдену анткб!о-тичну гхтквшеть. НутгдП, як1 на зиевзую» анткб1отично1 актквност1 S.erythraea, можуть Оугп впкерпотаа! як генегнчн! мяреэтк ггромпслс"™ гзяйэ. ртефама в егазперкыентах по 1х Г1С?ЗДЕ5аЦ1Т.

2. я^тзгжк гх&гокгъ яггтзЯзет: r?r?.rf*?-

в1таг- га ржх-нктсг-^ап'г^ггг^сс'г! у S.scslicolor -'-3(2}.

Важливе значения для э'ясуванпя ыехан!зм1в генетичш} неста01льност1 t,ias визкаченЕЯ локаа1зац11 з геном! неста-б!льних ген!в.

Рис.3. Схема стуШнчасто! селекцП спонтанних мутант1в 3.егуИ\гаеа з п1двищеною ст1йк1стю до стрептом1цину (концентрац!я стрептомЩияу в мкг/мл).

Р)1с.4. Антиб1отична актива1сть незаяожних клан1в штаму 5 (1) З.егДЬгаеа та його незалежких 5ЬгН-ыутан?1в (2). III - 1ндекс продуктивное^ (Ш-1 в1дпов1да£ середн!й <'1нта5ю?ичн1й активност! итачу 5).

____ Для локал1зацП детерм!нанту ст!йкост1 до Cm було проведено схрещування Mis резистентниы до цього анткб!отика штачом S18 (SCP1~SCP2~ - рецип1ент) та чутливим до Cm мутантом втаму АБ17 SS09 ( NF SCP2* - донор). За град!ентом алельних сп!вв!дносень маркер!в, що анал1зувались, маркер cmlS509 локал1зовано на хромосом1 S.coelicolor А3(2) Mix маркерами cysD18 i argAl (рис. 5, А).

.Для локал1зац11 мутацП. яка визначае СшШ*-фенотип, було проведено схрещування м!ж Сй-резистентним ревертантом птаму S510 R202 та Сг.-чутли::!!!.! мутантом Si59 итачу S18. эа результатами цього схрещування маркер cmlK202 картуегься на хромосом! S.coelicolor А3(2) м1ж маркерами cysD18 та uraAl, тобто у район1 хромосоми, в1дм1нному в1д району локал1зац!1 ыутацП Сш-чутливост1 (рис. 5, Б). Отже, зм!ни геному, як! приводить до CBilS- та до Сш1Р*-фенотип!в, це мутацП у pla-них генах. Очевидно, що це обумовлюе фенотипов! в1ды!нност1 м1ж вих!дним штамом та Оп^'-ревертантаыи. Отриман! резуль-тати дозвмяють припустити, що попередпя мутац1я anISSIO збереглась в генсм! цього штаму.

Для локал1зац11 детерм1нанту ристш1цин-резистептност1 було проведено схрещування м1ж резистентним до Rm штамом S18 та спонтанним RimS CBilS-мутантом S509, пох1дним штаму А617. Виходячи з град!ента алельних сп1вв!дношень маркер1в, мута-ц1ю чутлквост! до Rm можна розм1стити на хромосом! S.coelicolor А3(2) м1я маркерами cysDIS та cmlSl (рис. 5, В). Кр1м того, 1снуб иореляц!я м!ж успадкувапням маркер!в cysDIS, rlmS22 та cmlSl, шр таксис вказув на 1х вчепленЮть.

Таким чином, результат;! проведених схрещувань св!дчать про хромссомну локал1зац!ю нестаб1льних детерм!нанг!в ст!й~ koctI S.coelicolor А3(2) до On та Rm. Вони е зчепленими м!ж собою. Мутац1я, яка обумовлюе CmlR'-фепотип, картуеться у в1дм1нному в1д мутацП onlS раион1 генетично! карги, що маге св1дчити про функц1снування в геном! S.coelicolor А3(2) дс-к1лькох р!зних детерм1нант1в хлорамфен!кол-резистентност1. Детеры1нанти отЛК та rimR локал1зуються на одному з к!нц1в хромосоми, в якому, як 1 припускають [Cullura J., et. al., 19941, в1дбуваються 1нтенсивн1 перебудови, щр моле обумоплю-вати 1х нестаб1льн1сть.

3. Вквчеаш) структурам* гм1в у геномах мутгнт1в S.coalicolor A3(2) та S.erytfcraaa.

3,1. 1денткФ1кац1я посШовностей ДНК, вдатних до аьздлЩка-цН. в геном! мутант!в S.coellcolor А3(2). Ц1каво було а'ясувати. чи супроводжуються ыутац1йн1 suíHK у отриыаних нами мутантiв перебудовами ДНК. Ми досадили коаекц1ю 1з 63 мутант1в S.coellcolor А3(2), пох1дних птам1в А617 та S18, ака вшючала QiilS-мутанти, 1х CmlR'-pe-верганти, QnlS RlmS- 1 ChilR* RlmS-птами, а такса CmlR* RlwR-ревертанти. Дося1д*ення цих итаы1в вмхликало особливкй 1нте-рес, оск!хькк б1лыа1сть в них виникда за рахунок б1льше, н1х одн!е1, генеткчно! сод11. Едектрофоретичкий анал1з 1х сумар-но1 ДНК, розщеплево1 ендонуклеазами рестрикцИ Bain HI, PvuII, Pstl, Snai; Sal GI, Xhol, Hindlll та BgUI, не вкявив в геномах CmlS-MyraOTlB игам!в SÍ8 1 А617 та 1х ûrtlR'-ревер-тант1в таких перебудов, як ампл!ф1кацП та деашШф!каШ1 посл1довяостей ДНК, крупн1 делецП або додатков1 фрагменти.

Однак в геномах двох мутант!в (S508 та R103) з CmlR* RíirS-фенотгаюм, выявлено фрагменти ДОК poaMlpou 15 (AUD-Scl) та 20 (AÜD-SC2) т.п.н. в1дпов!дно в аыпд!ф!кованому стан!. AUD-Scl дае один фрагмент при розщелленн! суиарно! ДНК втану. S508 Pstl та Xhol. два фрагменти - PvuII, чотири - ВатШ та б1льие восьми - Smal, a AUD-Sc2 дае один фрагмент аыпл!ф!ка-ц11 при oôpoôtU суыарво! ДНК R103 рестрюсхэзгш Hindi 11 та Xhol, два г PvuII. чотирй - ВатШ, Pstl та SalGI. Коп!йн!сть AUD-Scl склад ас 50, a AUD-Sc2 - 4.0 коп 1 к/re ко«. РесгрккШй-нкй анал1а cyuapnol ДНК а кд!тан RimR-peBepraimB итаму S5Q8 показав, ср в геномах цих птаа1в AUD-Scl зкаходитъся в деам-пл1ф1кованому стан1. ВзяШ фрагменти AUD-ScS poaulpou 2,2; 3,2; 4,5 тз 11,0 т.п.н. кяоновано на пдазаШ р1)С19 по BarnHl-сайту та лоОудовано lx рестрикц1£н1 карта (рис.б).

Отхе, мутанти s OnlR* RlcsS-фгкоткпоу р1акяться не ?!ль-кя за cboivoî вдастнБостя1Л1, а 1 за структурой raioMlr. Еле-менти AUD-Scl та AUD-Sc2 е перанмн посл!довностями, гдатккик до ампл1ф!кадП, ЦенлгЯкованто! в генш! S.coellcolor A3ÍC). Ix псява, очевидно, е результатом декШкох генет;и-1гл>: под!й, первой з я>:их е пошкодження детермИ'гигу хлорач-феШказ-резкстевтБост!.

А. Б. В.

Рис.5. Град1енти аяельиих ь!днсгеЕЬ изркор1а п^селсугт'.^лсг^ анализу генотип!в рексмб!нант!в. отрн%ших у схрсп^--ваняях шташв S.coelicolor А3(2):

A. S5C9 (NF SCP2+uraAl areAl cnlS509) та

358 (SCP1~SCP2~ adeC(YlO) cysD13 cmlSSOQ*); Б. R202 (NF SCP2+ pabAl uraAl onlR202) та

S459 (SCP1" SCP2" adeC(YlO) cys018 cmlR202+);

B. SS10 (NF SCFS* uraAl argAl cm2S510 rimS22) та

S18 (SCP1"SCF2" aîeCfVlO) cysD18 anl3510+ г1т522+).

I IIlililí

i fii Т^ z

о—« о о л о

ÛS Я ййй

4-

з.эй

3

II

% ?

г я

i

TfP-

H-r

II II

II II

2 Jl

ь

li.okb

= 1? 1? 5 S £ aS

Рис.б. Рестрикции! карти ВагпШ фрагмент!в AUD-SC2 клокова-них на pUC19.

3.2. 1дентиф!кад1я посл1довностей. здатних до ампл1ф1кацП.

в геном! S.erythraea.

Од н ira в иркчин п1двищено' резистентност1 актином!цет1в до ан!иб1отик1в е ампл1ф1кац1я посл1довностей ДНК, у склад яких входять детерьйнанти ст!йкост1 до цих антиб!отик1в ГПотехин Я.А., и др., 1985, Homemann U., et.al., 1987]. m досл1дили сумарн1 ДНК 24 мутант!в S.eryhtraea, отриманих на р1зних еташх в1дбору 1 рззистентних до р1зних концентраЩй SB, на наявн1сть таких ДНХ-переОудов. Було проведено анал1в цих ДНК 14 евдонуклеазаыи рестрикцП. Розщелленкя ферментами Pvul, SalGI, anal. Saal„ SacIJ, SphJ, Xhol Hlndlll, EcoRl та EcoRV дозволило виявкти в геномах 9-ти StrR-uyTaHTlB (що становить 37,ЬХ в!д к1лькост1 досл1доених итаы1в), резис-тентннх до 1, 7, 10 та 15 иг/мл стрептоы1цину, посл!довн1сть розм1роа близько 25 т.п.н. в аипл1ф1каБаноху стан1. Ампл1ф1-îauiB було виявлено лише у геномах ыутант1в, у яких був извинений р1вень ст1йкост1 не т1льки до sm, ai до 1ниих аы!-коШкозвдних антиб!отик!в.

Виходячи а результат^ електрофсретичного розпод1лу от- • риманих рестрик?1в суиарноI ДНК, Оуло зробдено припуаення, цо у склад геному штаму 5 входить пдазн1да, яка, очевидно, детерм!куе резистенгн1сть до ам1ногл1козэд!в, 1 яка у висо-корезиотентних мутант1в знаходиться в агш11ф1ковааому стаи i. Цю пжавиШ було названо pSE201. Для вид1лення ДНК, яка в1д-пов1даз pSE20l, сумарну ДНК штаму 3005 розщепили рестрикта-вою SalOI, Фрагиевтн ДНК розд1лкли ¡аляхом електрофорезу в агарознсыу гел1 та е лаю вали pSE201 (рис.7). Отриманим препаратом трансформуваги протопласта огаму S. llvídans 66 1 выпирали рБЕ201+-трансфориантн окреш за StrR- та KrmR- озна-ками. Разом 8 пяазШдсэ pS£201 трансфорыанти усяадкували оз-наки ст1йкост1 до гш1ногл!козид1в донорного штаму S. erythraea 3005, а такси здатн1сть до утворення StrR-мутан-т1в при ступ1кчаст!й селекц11. Bel отр1шан1 нами pSE20l+-траггефорнантк на газон1 рещш1ентно! культури S. livjoans 66 пркгн1чували р!ст pSÇ201"-культури, гобто виявляли Ltz^-фе-нотяп. 1Ыазм1дну ДНК'з ralniH грансфоршнт1Е, резистеятних до р!зних концентрац1й Sîti, вид1лити не вдалося, тому ми ви-' користали генетичний метод 1дентиф1КсЩ! I криптичних плазм!д - схрецування s безплази!дша.ш птамами S.çcellcclor А3(2).

Трачскон'юганти одного э таких штам!в М138, якиЯ s чутливим до Эп, набували, кр1м 1Ьг+-фенотипу, резистентност1 до Sin. О кл1тин рЗЕ201+-транскон'югант1в S.coelicolor А3(2) було ви-д1лено плззм!дну ДНК, побудовано II рестрикц1 йну карту (ряс. 8). Здлти1сть визначати Ltz+-$e.40TKn властива лише кон'югативним плззм1дам актином1цет1в. Для доведения кон*-югативиих функц1й pSE201 було проведено ряд схрещувань ms* PSE201+ та р5Е201~-штамами S.cœllcoior А3(2). Г1рисутн1сть плазы!ди pSESOl miiraoe уепапкувакня генетичянх мяркер1з X0G-моссми. В тага« схрешувачнях з'являеться додаткова точка початку переносу хромосомних маркор!в (рис.9). Так, у схрещу-ванн! Mix pSE201" штамаыи S18 та А617 маркер донорного итаму А617 adeC(V10)+ несуть 78,6Х рекомб1нант1в, uraAl - 46,2%, cysD18+ - 22,2Z, argAl - 0,92. У схрещуванн1 ж, в якЬму един з батьк1вських штажв несе плазм!ду pSE201, град1ент успад-кування маркер!в 1накший: adeC(Vl0)+ несуть 63,71 рексмб1-нант1в, uraAl - 1.9Z. cysD18+ - 69,4%, argAl - 4,4Х. Отрима-hJ дат вкаэують, що в кл!тинах S. lívidans 66 та S.coelicolor А3(2) pSE20l виконуе кон'югатиЕн! функцп.

3 метсю 1дентиф1кацП плазм1ди pSE201 з геномах транс-формачт1в S.lívidans та транскон'вгант!в S.coelicolor А3(2) було проведено ДНК-ДНК г1бридизац1ю сумарних ДНК цих штамги з pSE201. М1чена д1гоксиген-П-д УТФ плазм!да pSE20l пСри-дизусться з Ват.Н1-фрагментами розм!ром 8, 7, 4,5 та 4,2 т.п.н. ДНК штзму Т101, 10, 8, 7 т.п.н. - його транскон'юган-та, ~20 т.п.н. - штач1в Т201 та Т710 ~1б 1 -20 т.п.н. в!дпо-в!дно - транскон*вгапт1в цих traíala, а також - э ДНК штачу S.erythraea C-OG5. Однак 1нтенсивн!сть сигналу в ДНК доелiд-жених трансформант!в та транскон'югант1в була значно менвев, н!ж в ДНК донорного пггаму 3G05, що св!дчить про малу коп1й-к1сть pSESOl в кл1 тинах цих культур. Сл1д в!дзначити, що в ДНК итам1в 66 S. lívidans та S18 S.coelicolor А3(2), як! булк реципиентами а наших експерггментах. не виявлено поел i довнос-тей, як! б ПСридизувались з pSE201. 0триман1 результат« п!дтЕердкують присутн!сть в геномах транс^ормлипв i транс-кон "югант! в S. lívidans 66 та S.coelicolor A3(2) плаэм1ди pS£201.

Отае, в геном! S.erythraea 1дентиф1ковано плазм!ду

- 16 -

ВКХ1ДНИЯ ПТАМ Б.егуш-аеа 5

БИ1-!? МУТАНТ 3005 3 АМПЛ1Ф1К0ВАН0Ю рБЕ201

вид!лення сунарно! ДНК, розщеплення Ба1 61. електрофоретичне фракЩону-вання фрагмент!в. елхжвання рБЕ201 з агарозного гелю

ТРАНСФ0РМАЦ1Я рБЕ201 БЛШйапэ 66

| в!дб1р по озкац1 ст1йкост1 до Бт

рБЕ20Г ТРАНСФОРЫАНТИ Б. Цу1<1апз

кои'югативне перенесения рБЕ201 в Б.сое11со1ог А3(2) та в!дб!р по Иг' фенотипу

рБЕ201* ТРАНСКОН'ЮГАНТН Б.сое11со1ог А3(2)

Рис.?. Схема переносу р5Е201 з Б. егу1Ьгаеа у Ш\ вкди 31гер1стусез. '

\

Рис.8. Рестрикц1йна карта плазм!ди р5Е201.

4. Настасяк И.Н., Заяоротная С.А., Кириченко Н.В., ««Доренко 8. А., Даниленко В.Н. Получение и изучение свойств мутантов Gtreptanyces" erythraeuS-с измененной устойчивостью к антибиотикам // Трудн РЮШ, еып.XXI. Генет. икленерия продуцентов антибиотиков. Москва, 1992. С. 39-45. Ь. 'W»op»-iiKo В. А., Настасяк И.Н.. Кириченко Н.В., Заворот-над С.А., Василия Л.И. Генетический контроль биосинтеза 1!.нт;юмицинл штзмюм Streptctnyces erythraeus // 7-ыа Наино-нол. кгнф. по произв. и прилод. на антибистици. Раз г рад (Болгария). 1990. С. И.

6. F»vlnr«>nKo V., ' ZavcrotnaS., Starodubtseva L., Danllenko V. Ment!! ¡cation and characterlnatlai of amplifying

and AUD-Sc2 sequences of Streptanyces coellcclor A3(2) // Atwtr. Int. Symp. and Product. Formation, Erfurt, GDR,

1У90. P.48.

7. Fedorenko v.. Zavorotnaya S. Genetic Instability of streptanyclnr est stance In the eryt hromyc In- producing organism S.erythraeus // Abstr. 6th Int. Symp. Genet. Ind. Mlc-roorgan., Strasbtirg-, 1G90. P.94.

H. Злюротнял С.A., ¿vpc A.P.. Настасяк Й.Н., Василия Л.И., Кириченко Н.В., Коновалова Т.В. , Федоренко В.А. Создание р^-комбинантн!« атамов-продуцентов антибиотика эритромицина. Tf.-a. докл. t Веессчаз. план.-отчет, конф. по напр. "Ген. я клотсч. инженерия". Пущино-на-Оке, нояб.-дек., 1990, М. 1991. С.163-164.

9. Заворотна С. А., ¿едоренко В.О. 1дентиф1кащя посл'.дов-hoctI, здатно! до ампл1ф1кац1I, в геном1 Streptanyces erytn-raeus // Тези допов1дей на VI з'1зд1 УТГС. Полтава. 1391. С.16-17.

10. Заворотная С.А., Настасяк И.Н., Кириченко Н.В,, Федорен-ко В.А. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов антибиотика эритромицина. Tea. докл. 2 ВСесоюз. план.-отчет, конф. по направл. " Ген. и кяеточ. инженерия". Пущино-на-Оке, нояб.-дек. 1991. М. 1992.'С.111-112.

11. Федоренко В.О., Настасяк I.M., Кириченко Н.В., БасШя Л. I., Заворотна С.А. Генетичне та геино1ш&енерне конструю-вання итач1з-продуцент! в еритрсм1цину Saccharopolvspora erythraea//MiKpo61cw. журнал. 56. l. 1994. С.Ю8.

12. Заворотна С. А.. Вивчення механ1зм1в генетично! неста01ль-

boctI озн&к у Saccaropol yspora erythraea // ШкроО. журнал. N1. 1994. 56. С. 106.

13. Fedorenko V., Zavorotna S. Expression of streptofnycln-roslstance determinant from Saccharopo1yspora erythraea In Streptomyces llvldans and S.coellcolor A3(2) // Theses the 9th Int. Symp. of the Biology of Actlnocnycetes, 1994. Moscow, Russia. P. 108.

14. Nastaslak I., Zavorotna S.. ShengoferN., Klrltchenko K., Marylna 0.. Fedorenko V. Properties of Streptanice-3 snbofaclens mutants with altered resistance to antibiotics. // Theses the 9th Int. Symp. of the Biology of Actlnomyce-tes, 1994. Moscow, Russia. P.104.

15. Zavorotna S., Fedorenko V. The pSE201 plasmld of Saccha-ropolyspora erythraea.//7th Int. Symp. Gen. Ind. Microorg. Abstr., Montreal, Canada. 1994. P.252.

16. Fedorenko V'., Nastaslak 1., Zavorotna S., Shengofer N.. Kxrltchenko N. Genetic instability of chloramphenicol-resistance In Saccharopolyspora erythraea and Streptomyces ambo-faciens.// 7th Int. Symp. Gen. Ind. Microorg. Abstr., ktontreal. Canada. 1994. P.25.

17. Fedorenko V., Zavorotna S., Basllla I., Klrltchenko N. GenetJс instability in Saccharopo1yspora erythraea //10 VAAM Tagung "Biologue der Actincxnyceten" Abstr., Jena, 1994. P.7.

18. Zavorotna S., Hastaslak 1., O'.lynlk M., Basllla L., Fedorenko V. Genetic improvement of the erythromycin produced strains Saccharopolyspora erythraea //7th European congress on blothechnology. Nice. 1995. Abstract Book. 2. P.56.

Злворотиая С. A.

Изучение ыаяекулярао-гекеткчаеккх механизмов нестабильности признаков устойчивости к антибиотикам у Streptomyces coelicolor A3(2) и Saccharopolyspora erythraea.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. Украинский научный центр гигиены. Клев, 1996.

Показано, что происходит множественное изменение признаков антибиотикорезистентносги у S.coellcolor А3(2). С высокой частотой появляются мутанты, чувствительные к хлорам-фенкколу (Сш) и ристомицину (Rm), которые способны реверти-

ровать к CtiilR* и RimR-фенотипу. Наблюдается различие в уровнях устойчивости к антибиотикам ревертантов и исходного штамма. Мутация crnlS увеличивает степень генетической нестабильности детерминанта устойчивоста к Rm. Гены резистентности к Сй и fön сцеплены и локализуются на одном из концов хромосомы S.coelicolor А3(2). В геноме мутантов с кнсжественкц-ш изменениями признаков резистентности к антибиотикам идентифицированы амплификации последовательностей ДНК.

У S.erythraea обнаружен генетически нестабильный признак резистентности к стрептсетдену (sm). В геноме штаммов S. erythraea выявлена плазмида pSE201. В амптк^ицировашге« состоянии эта плазмида обеспечивает повышение устойчивости к Sm и другим аминогликозидам.

Ключов! слова: актиномЩетк, сгрептомЩш, генетична нестаб1дьн!сть, резистентн1сть, бЮсинтез антиб1отик1в, шшм1ди.

Zarcrotna S.

tbleculnr-Eenatic Instability ix-cbanisms of antibiotic-rcslstsiico stwJylns in StreptoHycws ccelicolcr A3(2) and Ssccfcarupolyspora crythrasa.

The Candidate Thesis for a Phylosophy Degree. a Speciality CX5.CO.15 - Genetics, Ucralnian Research Higienlc Center, 1996.

Multiple changes of antibiotic resistance properties were characterised in S.coelicolor A3(2). When reverting to chloraTifenicol (Cm) and ristocnycin (йп) resistance they demcnstralted different that Initial strains' levels of antibiotic resistance. On-sensitive (CmlS) mutation resulted in the increaslcn of genetic instability of Rm-resistance determinant. On- and Km-resistance genes are closely linked and localised on one of the ends of S.coelicolor A3(2) chro-¡noscne. Amplifying DNA sequencies were identlfyed In the genomes of mutants with multiple changes of antibiotic resistance.

Geneticaly unstable streptomycin-rcsistar.ee determinant was found in S.erythraea. pS£201 plasnid was detected in the gencme of S.erythraea strains. Increasing of streptonycln and aminoglycoside resistance Is determined by the amplification of this plasrald.