Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Олигоспоровые актиномицеты в почвах разных типов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Михайлова, Наталия Викторовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

МИХАЙЛОВА Наталия Викторовна

ОЛИГОСПОРОВЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ В ПОЧВАХ РАЗНЫХ ТИПОВ

Специальность 03.00.07. - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук Г. М. Зенова

Москва 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................ 4

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................... 7

1.1. Экология олигоспоровых актиномицетов................................. 7

1.2. Прикладное значение олигоспоровых актиномицетов........... 15

1.3. Место представителей олигоспоровых актиномицетов

в системах классификаций........................................................ 23

1.4. Методы выделения актиномицетов из природных субстратов................................................................................. 30

1.4.1. Этапы выделения микроорганизмов......................................... 31

1.4.2. Методы, основанные на подавлении роста сопутствующих организмов.................................................... 32

1.4.3. Методы, основанные на особенностях спор............................ 33

1.4.4. Методы, основанные на особенностях

вегетативных клеток.............................................................. 37

1.4.5. Применение метода PCR для выявления

и идентификации актиномицетов в почвах и других субстратах............................................................... 38

1.4.6. Другие методы выявления, изоляции

и идентификации актиномицетов в почвах............................. 44

1.4.7. Селективное выделение олигоспоровых

актиномицетов из природных источников.............................. 48

1.4.8. Методы выявления комплекса актиномицетов

в ходе инициированных сукцессий............................................ 52

Глава II. ОБЪКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................ 53

2.1. Объекты исследования.............................................................. 53

2.2. Методы исследования............................................................... 55

2.2.1. Метод фаготипирования для выявления

актиномицетов в почве........................................................... 55

Стр.

2.2.2. Метод посева из разведений почвенных

суспензий для учета и выделения олигоспоровых актиномицетов....................................................................... 57

2.2.3. Методы идентификации актиномицетов.............................. 59

2.2.4. Сукцессионный анализ............................................................. 65

Глава III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................... 67

3.1. Численность и доля олигоспоровых актиномицетов

в комплексе почвенных мицелиальных прокариот................. 67

3.2. Частота встречаемости олигоспоровых

актиномицетов в почвах........................................................... 73

3.3. Вертикально-ярусное распределение

олигоспоровых актиномицетов в биогеоценозах.................... 78

3.4. Динамика численности популяций

олигоспоровых актиномицетов в ходе сукцессии.................... 83

3.5. Выявление олигоспоровых актиномицетов

в различных типах почв методом фаготипирования................90

3.6. Сравнительная характеристика методов, использованных для выявления олигоспоровых актиномицетов

в различных типах почв............................................................ 93

3.7. Выявление некоторых родов олигоспоровых актиномицетов с применением предобработки

почвенных образцов растворами хлорамина Б...................... 100

Глава IV ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР

АКТИНОМИЦЕТОВ.............................................................. 107

Глава V ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................ 115

ВЫВОДЫ................................................................................................. 121

ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................... 123

Описание исследованных почв................................................. 123

ЛИТЕРАТУРА........................................................................................ 134

ВВЕДЕНИЕ

• Актуальность темы. В настоящее время группа актиномицетов и родственных им организмов насчитывает более 100 родов. Однако, до последнего десятилетия считалось, что наиболее распространенными в почве являются актиномицеты родов Streptomyces и Micromonospora. Использование селективных методов выявления позволяет обнаружить и другие, считавшиеся редкими роды актиномицетов.

Олигоспоровые актиномицеты — понятие не таксономическое. Под олигоспоровыми актиномицетами подразумевают группу родов, представители которых характеризуются наличием коротких цепочек спор (не более десяти) на воздушном (реже на воздушном и субстратном) мицелии, причем диаметр спор превышает диаметр гиф.

Имеются сведения об обнаружении олигоспоровых актиномицетов родов Thermomonospora, Saccharopolyspora, Saccharomonospora в саморазогревающихся субстратах и в почвах южных зон (чернозем, каштановая почва). Однако закономерности распределения этих мицелиальных прокариот в наземных экосистемах не исследованы и неизвестна их доля в актиномицетном комплексе различных почв. Среди олигоспоровых актиномицетов много продуцентов ценных биологически активных веществ: антибиотиков, витаминов, ферментов и др. Они образуют внеклеточные ферменты гидролазы и участвуют в разложении целлюлозы, хитина, гумусовых веществ в почве (The Prokaryotes, 1991).

• Целью работы было выявление закономерностей распределения олигоспоровых актиномицетов в различных типах почв и по вертикальной структуре основных типов биогеоценозов для установления экологического статуса этих мицелиальных прокариот.

• Задачи исследования:

1. Разработка и подбор методических приемов селективного выделения олигоспоровых актиномицетов из почв и растительных субстратов.

2. Определение численности, пространственной и временной локализации олигоспоровых актиномицетов в почвах основных природных зон России и стран СНГ, а также в некоторых почвах Мексики, Монголии и Аргентины.

3. Выявление закономерностей вертикально-ярусного распределения олигоспоровых актиномицетов в биогеоценозах разных типов.

4. Определение наиболее благоприятных временных промежутков и условий в микробной сукцессии для выделения олигоспоровых актиномицетов из почв основных биоклиматических зон.

5. Составление коллекции культур — представителей олигоспоровой группы актиномицетов.

• Научная новизна.

Предложен комплексный метод для селективного выделения из почвы и растительных субстратов олигоспоровых актиномицетов (тепловая предобработка воздушно-сухих образцов почвы (120°С, 1 час); посев почвенных и растительных суспензий на селективные среды с пропионатом натрия и с гороховой мукой; добавление комплекса антибиотиков в питательные среды; длительные сроки инкубирования посевов (3—4 недели)).

Впервые показано, что олигоспоровые формы являются минорным, но постоянно присутствующим компонентом почвенных актиномицетных комплексов. Количество олигоспоровых актиномицетов увеличивается от почв северных районов к южным. В лесной зоне наиболее благоприятным местообитанием для олигоспоровых актиномицетов являются нижние слои подстилки и верхние горизонты почвы. В степном биогеоценозе олигоспоровые актиномицеты сосредоточены в почвенном ярусе. В полупустынном биогеоценозе олигоспоровые актиномицеты преобладают в карбонатно-иллювиальном горизонте серозема, где их доля в комплексе превышает долю стрептомицетов.

Использование сукцессионного подхода к исследованию актиномицетов позволило выявить временные промежутки и условия, определяющие максимальный показатель их популяционной плотности в почве. Исследование динамики численности актиномицетов показало, что максимумы популяционной плотности родов, объединяемых в группу олигоспоровых, отмечены на разных этапах сукцессии, что свидетельствует об их экологическом разнообразии и последовательном участии в разложении органического вещества.

• Практическая значимость.

Установление экологической ниши олигоспоровых актиномицетов важно для пополнения наших знаний о биоразнообразии микробного мира и способах его сохранения.

Сведения, полученные при изучении динамики численности и таксономического состава актиномицетного комплекса в ходе сукцессии, инициированной увлажнением почвы, дает возможность оптимизировать процедуру выделения нужного объекта из природных субстратов, а также управлять объектом непосредственно в почве, что имеет важное значение с точки зрения поиска природных штаммов микроорганизмов для нужд биотехнологии.

• Апробация работы. Основные положения работы доложены на Международной конференции «Ломоносов-96» (Москва, 1996), Международной конференции «Ломоносов-97» (Москва, 1997), Н-ой Открытой городской научной конференции молодых ученых города Пущино (Пущино, 1997), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт-Петербург, 1998), 16th Word Congress of Soil Science (Montpellier, France, 1998), Международной конференции «Ломоносов-98» (Москва, 1998), Международной конференции «Ломоносов-99» (Москва, 1999), IX International Congress of Bacteriology @ Applied Microbiology (IX ICBAM) (Sydney, Australia, 1999) и на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

• Публикации. Материалы диссертации изложены в 12 печатных работах.

Автор выражает глубокую признательность заведующему кафедрой биологии почв академику РАЕН Звягинцеву Д. Г. за постоянное внимание к работе.

Автор благодарит профессора Владыченского А. С. за помощь в идентификации почв и профессора Судницына И. И. за консультации и ценные советы.

Автор выражает признательность к. б. н. Лихачевой А. А. и всему коллективу кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. М. В. Ломоносова за сотрудничество и поддержку.

ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Экология олигоспоровых актиномицетов

Представители рода Saccharomonospora были выделены из естественных источников, таких как лиственная подстилка, навоз, компост и верховой торф (The Prokaryotes, 1991), а также из озерных илов (Агре, 1986; Bergey's Manual, 1989). Большое число спор S. viridis было обнаружено в зернохранилищах с повышенной влажностью и начавших саморазогреваться (Lakey, 1988), а также в грибных компостах (Fergus, 1964). Было высказано предположение, что споры культур S. viridis, S. rectivirgula и других термофильных актиномицетов вызывают загрязнение субстратов, попадая в них из почвы и воздуха. Условия для их пролиферации в хранящемся сене с содержанием воды 35-46 % обсуждались Lacey (Lacey, 1988). Показано, что благоприятные условия для роста S. viridis складываются в ареалах с повышенными температурами и высокими значениями pH (Lacey, 1988). Также было высказано предположение (Bergey's Manual, 1989), что штаммы сахаромоноспор, участвуют в разложении исключительно гемицеллзолозы (McCarthy et al., 1985), но не целлюлозы, лигнина или пектина (McCarthy and Broda, 1984; McCarthy and Cross, 1984). С понижением содержания в субстрате воды, понижается и его температура. Однако, поскольку число обнаруживаемых актиномицетных спор в субстрате остается высоким, то это может представлять значительную угрозу для здоровья работников сельского хозяйства, так как споры S. viridis могут вызвать появление аллфшческих альвеолигов (пневмония у гиперчувствительных индивидов) или так называемые «фермерское легкое» (Barrowcliff and Arblaster, 1968; Greene et al., 1981), «легкое работников грибных хозяйств», и вентиляционную пневмонию (Kurup, 1984). Эти заболевания связаны с Т-лимфоцит-зависимыми гранулематозными воспалительными реакциями (Newman Taylor, 1985; Lacey, 1988).

Жизнеспособные споры S. viridis были также обнаружены в озерных илах (Johnston and Cross, 1976), а вид S. glauca выделялся из почвы (GreinerMai et al., 1988). Мезофильные виды S. azurea и S. суапеа были изолированы из почвенных образцов (Runmao, 1987; Runmao et al., 1988).

По данным Широких И. Г. специфическим признаком таксономического состава актиномицетного комплекса торфяников является доминирование сахаромоноспор, редко встречающихся в почвах зональных типов (Звягинцев и др., 1995). В выработанном торфянике при широком родовом спектре представители рода Saccharomonospora характеризуются незначительной численностью (до нескольких сотен КОЕ/г) и невысокой частотой встречаемости (в основном на талломах лишайников). При освоении целинной торфяной почвы структура комплексов актиномицетов изменяется незначительно. Так, представители рода Saccharomonospora из разряда типичных доминирующих в целинной почве переходят в ряд случайных при пастбищном использовании и не встречаются совсем в почве севооборота. Проведение лесной рекультивации торфяников ведет к выпадению из актиномицетного комплекса представителей рода Saccharomonospora. При исследовании вертикально-ярусной структуры лесного биогеоценоза на выработанном торфянике представители рода Saccharomonospora были обнаружены в травяном ярусе.

Представители рода Saccharopolyspora выделялись из различных разлагающихся растительных материалов (Lacey, 1988). Saccharopolyspora hirsuta была впервые выделена из выжимок сахарного тростника (Lacey, 1971, 1974; Lacey and Goodfellow, 1975). Штаммы S. gregorii иногда выделялись из сена, соломы и, временами, из ячменя (Goodfellow et al., 1989). S. hordei является частым загрязнителем хранящегося ячменя и сена, и несколько реже, сахарного тростника (Lacey, 1988). rectivirgula особенно часто встречается во многих хранящихся растительных субстратах содержащих достаточно воды для начала спонтанного разогрева. Условия для ее пролиферации являются сходными с описанными для сахаромоноспор (Lacey, 1988). Однако существуют факты, свидетельствующие о том, что S. rectivirgula способна разрушать протеины и увеличивать высвобождение газообразного азота из

субстратов (Festenstein, 1966). Очевидно с этим связана способность S. rectivirgula заселять свежескошенное сено, которое имеет низкие значения pH (5,5-6,5) без предобработки парами аммония для повышения pH (Lacey, 1988).

Присутствие большого количества спор Saccharopolyspora в парниках и на производствах, связанных с переработкой растительных материалов, может стать причиной серьезных заболеваний сходных с заболеваниями, вызываемыми представителями рода Saccharomonospora (Lacey, 1988; Lacey and Crook, 1988). S. rectivirgula (синоним Faenia rectivirgula, Micropolyspora faeni, M. rectivirgula, Thermopolyspora polyspora или Т. rectivirgula) является частой проблемой и главной причиной пневмонии у гиперчувствительных индивидов известной как фермерское легкое (Campbell, 1932; Pepys et al., 1963). Споры Saccharopolyspora hordei также в большом количестве присутствуют в хранящемся зерне, и этот организм может вызывать заболевания у гиперчувствительных субъектов (Lacey and Crook, 1988). Заболевание фермерским легким протекает обычно в хронической форме, однако, были зарегистрированы фатальные случаи (Lacey, 1988). Респираторные заболевания, сходные с фермерским легким, были зарегистрированы у лошадей, поедавших влажное сено (Pirie et al., 1971; Lacey, 1988). Острые вспышки этого заболевания, приведшие к нескольким смертельным случаям, были зарегистрированы в Канаде у крупного рогатого скота (Wilkie, 1978). Критерии, используемые для диагностики нетипичных аллергических альвеолитов, включая фермерское легкое, были предложены Lacey (1988). Антигены, недавно выделенные в чистом виде, из S. rectivirgula, могут быть использованы для определения циркулирующих антител в крови пациентов (Brummond et al., 1988; Mantujarvi and Kump, 1988). Также для диагностики перечисленных выше заболеваний Ramasamy с соавторами (Ramasamy et al., 1987) была разработана фермент-связывающая иммуноадсорбционная система (ELISA).

Некоторые штаммы сахарополиспор {S. erythraea (Labeda, 1987), «S. hirsuta subsp. kobensis» (Iwasaki et al., 1979), S. hirsuta subsp. taberi (Gerber et al., 1983; Labeda, 1987), «S. aurantiaca», «S. aurantiaca subsp. kunmingensis»

(Jiang et al., 1986), «Faenia interjecta» (Okazaki et al., 1987)) были выделены из почвы.

Согласно результатам исследований, проведенным Широких И. Г., представители рода Saccharopolyspora являются доминантами в торфяных почвах (Широких, 1993). В выработанном торфянике при широком родовом спектре актиномицеты рода Saccharopolyspora характеризуются незначительной численностью и невысокой частотой встречаемости. Сахарополиспоры, часто встречающиеся в целинной торфяной почве, лишь случайно выделяются из почвы, длительно используемой в севообороте. При исследовании вертикально-ярусной структуры лесного биогеоценоза на выработанном торфянике представители рода Saccharopolyspora были обнаружены в моховом и почвенном ярусах (Широких, 1993). В пастбищном биогеоценозе сахарополиспоры обнаруживались в войлоке и торфяном ярусе в качестве минорного компонента.

В целях получения информации о взимоотношениях популяций актиномицетов внутри комплекса, в диссертационной работе Широких И. Г. (1993) были проведены модельные опыты по наблюдению за динамикой численности актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением воздушно-сухих образцов торфяной почвы и выработанных торфяников различной степени окультуренности. В результате эксперимента установлен динамический характер численности различных родов актинмицетов, в том числе и представителей родов Saccharomonospora и Saccharopolyspora, что может свидетельствовать об активно протекающих в почве процессах размножения, гибели и перестройки популяционной структуры актиномицетов. Также было обнаружено, что наиболее благоприятные условия для выделения представителей родов Saccharomonospora и Saccharopolyspora складываются на промежуточных стадиях сукцессии. Сукцессионные исследования были использованы для определения степени разобщенности постоянно выделяемых из торфяных почв родов актиномицетов. Микромоноспоровые актиномицеты, принадлежащие родам Saccharomonospora, Micromonosp