Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологических аспектов культивирования штаммов Streptomyces fradiae - продуцентов ветеринарного антибиотика тилозина

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата технических наук, Савочкина, Ирина Владимировна, Москва

6

АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО ОТКРЫТОГО ТИПА "БИОХИММАШ

Савочкина Ирина Владимировна

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ БТКЕРТОМУСЕЗ П1А01АЕ - ПРОДУЦЕНТОВ ВЕТЕРИНАРНОГО

АНТИБИОТИКА ТИЛОЗИНА

Специальность 03.00.23 - "Биотехнология"

Научные руководители:

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Т.Н. Зубарев;

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник Л.А. Тихомирова

На правах рукописи

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................7

1.1. Производство ветеринарных антибиотиков. Антибиотик тилозин......7

1.2. Физико-химические и биологические свойства тилозина...........9

1.3. Продуценты тилозина. Естественная изменчивость штаммов.........13

1.4. Поддержание продуцентов тилозина и других антибиотиков, подготовка посевного материала...........................15

1.5. Хранение продуцентов тилозина и других антибиотиков...........18

1.6. Морфологические признаки продуцентов тилозина и других антибиотиков

при выращивании на агаризованных и жидких средах.............20

1.7. Культивирование продуцентов тилозина и других антибиотиков.......25

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ

СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ТИЛОЗИНА............... 35

2.1. Объекты исследования - штаммы Б^ерШтусез кгкИае - продуценты тилозина . 35

2.2. Питательные среды, используемые в процессе поддержания и культивирования штаммов................................35

2.3. Условия хранения, поддержания штаммов и приготовления посевного материала................................36

2.4. Условия культивирования штаммов....................38

2.5. Методы, использованные при изучении физиологических, культуральных и морфологических характеристик штаммов.................38

2.6. Математическая обработка результатов..................40

2.7. Принципиальная технологическая схема производства тилозина (стадии подготовки посевного материала и культивирования)............40

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................44

3.1. Поддержание и хранение высокоактивных продуцентов тилозина,

подготовка и хранение посевного материала................44

3.1.1. Морфологические характеристики продуцентов тилозина на агаризованных средах, поддерживающая селекция.............44

3.1.2. Подготовка посевного материала....................51

3.1.3. Хранение штаммов и посевного материала................55

3.2. Периодическое культивирование продуцентов тилозина в колбах и

в лабораторных ферментерах.......................58

3.2.1. Динамика накопления тилозина и изменение состава культуральной жидкости...............................58

3.2.2. Изменение морфологических характеристик штаммов в условиях

глубинного культивирования......................64

3.2.3. Оптимизация количественного состава питательных веществ, вносимых

в начале и по ходу ферментации.....................66

3.2.4. Влияние интенсивности аэрации на динамику накопления тилозина.....70

3.3. Периодическое культивирование продуцентов тилозина в

заводских ферментерах.........................73

ВЫВОДЫ................................79

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ... 81 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Фотографии колоний штаммов й-аШае - продуцентов

тилозина.........................106

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Документы........................119

ВВЕДЕНИЕ

Одним из наиболее эффективных антибиотиков, используемых в ветеринарии, является тилозин, что обусловлено его высокими лечебными и лечебно-профилактическими свойствами, широким антимикробным спектром действия, а также его способностью служить стимулятором роста и низкой токсичностью.

Микробиологическое производство тилозина и различных препаратов на его основе организовано в ряде стран - США, Болгарии, Югославии, Чехии, ФРГ. В 80-е годы было начато в небольших объемах производство тилозина на некоторых биохимических заводах в СССР, однако после распада СССР производство тилозина на этих заводах было приостановлено. В настоящее время в РФ и других странах СНГ многотоннажное производство тилозина отсутствует, несмотря на большой спрос -потребность в тилозине в РФ оценивается в несколько сотен тонн в год. Большое количество тилозина закупается хозяйствами РФ у зарубежных фирм.

Продуцентами тилозина являются актиномицеты Streptomyces fradiae, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces rimosus. Первые штаммы - продуценты тилозина были зарегистрированы в США в 1955 году. В России также был селекционирован ряд штаммов, имеющих промышленное значение. Исследованию этих штаммов с целью оптимизации условий их использования в микробиологическом производстве и посвящена, в основном, настоящая работа.

Создание многотоннажного производства тилозина в РФ является одной из приоритетных задач, стоящих перед отечественной микробиологической промышленностью. Важнейшей стадией в таком производстве является культивирование продуцентов тилозина. При этом остаются неизученными существенные вопросы, относящиеся к технологии производства на этой стадии.

Настоящая работа посвящена решению следующих задач, связанных с усовершенствованием технологии культивирования штаммов Str. fradiae - продуцентов тилозина:

- выявление отличительных морфологических признаков высокоактивных штаммов при рассевах их на агаризованных средах с целью использования этих признаков для проведения поддерживающей селекции;

- подбор условий, обеспечивающих сохранение в течение длительного времени высокой продуцирующей способности штаммов без их замораживания и лиофилизации;

- выявление морфологических признаков штаммов при глубинном культивировании, соответствующих их высокой антибиотической активности, для микроскопического контроля за состоянием продуцентов на стадиях подготовки посевного материала и ферментации;

- исследование динамики изменения состава культуральной жидкости с целью отработки условий ведения процесса ферментации, исключающих снижение концентрации тилозина в конце процесса и позволяющих, при необходимости, продлить период активного синтеза антибиотика;

- определение зависимости конечной концентрации и скорости синтеза тилозина от интенсивности аэрации культуральной жидкости с целью определения предельных значений этих параметров для используемых высокоактивных штаммов.

Основные результаты, представляющие практический интерес, прошли проверку на заводе "Прогресс" (г. Степногорск, Казахстан) в центральной заводской лаборатории на аппаратах объемом 630 лив цехе на ферментерах объемом 63 м3. Эти работы выполнялись на договорной основе между заводом и АООТ "Биохиммаш" (ВНИИбиохиммашпроект, НПО"Биомаш").

В приведенном ниже литературном обзоре, предпосланном основному тексту, кроме публикаций, относящихся непосредственно к микробиологическому синтезу тилозина, рассмотрены также некоторые материалы, посвященные изучению продуцентов других антибиотиков, в тех случаях, когда способы поддержания и культивирования этих штаммов аналогичны таковым для продуцента тилозина.

В Приложение 1 вынесены фотографии, иллюстрирующие морфологические осо-

бенности штаммов Str. fradiae при выращивании их на агаризованных и жидких питательных средах. В Приложении 2 приведены выдержки из некоторых отчетных документов по договорам с заводом "Прогресс" и справка о депонировании штамма Str. fradiae БС-1 - продуцента тилозина, созданного с участием автора.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Производство ветеринарных антибиотиков. Антибиотик тилозин

Антибиотики широко используются во многих странах для лечебных и лечебно-профилактических целей в животноводстве/4, 38, 84, 87, 132, 141, 160,163/. Суммарный годовой объем производства антибиотиков в мире для использования в животноводстве по данным обзора /141/ оценивался в 4 млрд. $ . При этом каждый доллар, затраченный на использование антибиотиков, обеспечивал 5-^8 $ прибыли /132, 141/. Основными производителями и потребителями кормовых антибиотиков являются США и Япония /132,163/.

По данным обзора /132/ более половины из 15900 тонн антибиотиков, ежегодно производимых в США , были использованы в животноводстве. Следует отметить, что основной товарной формой кормовых антибиотиков за рубежом являются неочищенные продукты микробиологического синтеза, более дешевые, чем очищенные (которые используются, в основном, для инъекций) и весьма эффективные. В состав таких препаратов кроме антибиотиков входит комплекс биологически активных веществ (остатки питательной среды, аминокислоты, витамины, мицелий продуцентов), различные наполнители (кукурузная мука, ржаные или пшеничные отруби, гранулы из стержней кукурузных початков и др.) /141, 168/.

За рубежом на основе тилозина производят также комбинированные препараты, например, содержащие дополнительно сульфаниламиды, которые усиливают лечебное действие антибиотика /141/.

В СССР в 1990 г. было произведено 3200 т антибиотиков /98/, в основном медицинского назначения. В последующие годы производство антибиотиков в странах СНГ резко сократилось.

Одним из основных антибиотиков ветеринарного назначения является тилозин. Как было отмечено выше, широкое использование тилозина во многих странах, в том числе и в нашей стране, связано как с его широким антибактериальным спектром

действия /6, 50, 76, 79, 118, 142/ , так и со способностью служить стимулятором роста /129, 142/ и низкой токсичностью /11, 142, 204/. Синтезируемый актиномицетом Str. fradiae, тилозин был впервые выделен в 1955 г. из образца почвы в Таиланде /212/, отсюда происходит и его название. Запатентован этот антибиотик фирмой "Eli Lilly" (США) /189/. Первое описание тилозина сделано в 1961 г. в работе /212/.

В нашей стране были предложены две товарные формы тилозина: очищенный -тилозин-тартрат (винно-кислая соль тилозина) и неочищенный препарат - фрадизин, получаемый в результате упаривания и сушки культуральной жидкости, содержащей тилозин /129,141/. В начале 90-х годов выпуск тилозина на заводах СНГ был практически прекращен. В работе /136/ указывается, что производство тилозина предполагается возобновить на Бердеком заводе биологических препаратов.

Данные о зарубежных и отечественных товарных формах препаратов, содержащих тилозин, представлены в табл.1 /141/.

Таблица 1

Формы препаратов антибиотика тилозина

Препарат Производитель (фирма,страна) Действующее начало Наполнитель Срок

Наименование Содержание хранения, год

1 2 3 4 5 6

Фрадизин-10, -20, -40 Россия Тилозин-основание 10, 20, 40 г/кг Мука кукурузная, отруби ржаные или пшеничные 0,5

Тилан-10, -40, -100, премикс (гранулированный) "Elanco Products Co.", дочерн. "Eli Lili/, США Тилозин-фосфат Юг/кг, 40, 100 г/фунт* - 2

Тилан-микс 2% То же То же 20 г/кг 2

Тилан AF-20 "Pliva", Югославия То же То же - -

Фармазин-фосфат -100, -200, -250, премикс "Pharmachim", Болгария То же 100, 200, 250 г/кг Белки и минеральные вещества —

Фармазин-220 (гранулированный) Тоже То же 220 г/кг То же -

Продолжение табл. 1

1 2 3 4 5 6

Тилозин-тартрат (порошок) Россия Очищенные формы тилозина-тартрата 600 г/кг — 1

Тилан (растворимый порошок) "Elanco Products Со.", дочерн. "Eli Lili/, США Тилозин-тартрат ПОг - -

Фармазин-тартрат (водорастворимый порошок) "Pharmachira", Болгария То же 100 г Водорастворимый наполнитель, 100 г

Тилан-50, 200 инъекционный "Elanco Products Со.", дочерн. "Eli Lili/', США Тилозин-основание Пропиленгликоль Бензиловый спирт 50,200мг/мл 0,5 мл 0,04 мл - -

Фрадизин-50, 200 инъекционный "Pharmachim", Болгария Тилозин-основание 50,200мг/мл - -

Унгутил (аэрозоль) То же То же 3% - -

Комбинированные формы

Тилан-10 сульфа G (гранулированный) "Elanco Products Co.", дочерн. "Eli Lili/, США Тилозин-фосфат Сульфаметазин 10 г/фунт То же _ 2

Тилан-40 сульфа G (гранулированный) То же То же 40 г/фунт То же - 2

Тилан-микс сульфа G (гранулированный) "Elanco Products Co.", дочерн. "Eli Lilif, США Тилозин-фосфат Сульфаметазин 100 г/кг То же - 2

Тинил "Biotica", Чехословакия Тилозин-основание Сульфадимидин Юг/кг 15 г/кг - 2

Тилозин сульфа S-D "Bioptivet Tierarzneimittel GmbH", Германия То же 100 мг/2,5 г То же - -

Нестил (внутривыменной шприц) "Pharmachim", Болгария Тилозин-основание Неомицин сульфат 250 тыс.МЕ 100 тыс.МЕ До 10 г -

* 1 фунт = 453,6 г

1.2. Физико-химические и биологические свойства тилозина

Тилозин - устойчивое монокислотное основание, которое в очищенном виде представляет собой белые пластинчатые кристаллы горького вкуса с температурой плавления 127-И 32° С. Его молекулярная масса равна 900, эмпирическая формула -С45Н77МОи. По структуре тилозин - 16-ти членный макролид, в состав которого входят тилонолидное кольцо и три сахара: микаминоза - сахар, содержащий аминогруппу;

микароза и мициноза /129, 142, 201/. Структурная формула тилозина приведена на рис.1 /193, 202, 204/. Антибиотик хорошо растворим в большинстве органических растворителей, включая спирты, кетоны, простые и сложные эфиры, галогенсодержащие углеводороды. Растворимость тилозина в воде низкая и понижается при повышении температуры. При 20 0 С она составляет 5 мг/мл. Водные и спиртовые растворы тилозина обладают характерным поглощением в УФ области спектра с максимумом 282 нм. Способность растворов тилозина к специфическому поглощению УФ лучей была использована при разработке методов определения концентрации антибиотика в рабочих жидкостях на различных стадиях его производства и в кормах /83, 111, 176, 204/. В сухом виде тилозин устойчив и может храниться в течение ряда лет без изменения антибиотических свойств /129, 142/.

Тилозин хорошо реагирует с органическими и неорганическими кислотами. В соединении с винной и фосфорной кислотами он образует соли - тартрат и фосфат. Кристаллические соли тилозина хорошо растворимы в воде, например, растворимость тилозин-тартрата при 20 0 С - 600 мг/мл. При рН меньше 4,5 тилозин гидролизуется с образованием десмикозина, обладающего антибиотическими и токсикологическими свойствами, сходными со свойствами тилозина /50, 129/. При этом от тилозина отщепляется микароза. Дальнейший гидролиз приводит к освобождению нейтральных Сахаров - мицинозы и микаминозы.

Установлено, что штаммы-продуценты тилозина в процессе ферментации в зависимости от состояния культуры и условий выращивания могут образовывать кроме тилозина ряд близких между собой в структурном отношении антибиотиков. Кроме указанного выше десмикозина, обнаружены и описаны макроцин, реломицин и лактеномицин/142, 202, 204/.

Подробно изучены генетические и биохимические аспекты механизма образования тилозина и родственных ему соединений, принимающих участие в этом процессе. Предложена схема конечного этапа биосинтеза тилозина /22,60, 142/. Проведены

сн,

оси

Мициноза

СН3

Микаминоза

Тилонолид

Рис. 1. Структурная формула тилозина

работы по установлению локализации генов, ответственных за процесс биосинтеза тилозина /194/. Авторами работы /37/ выделен соответствующий фрагмент ДНК.

Детально исследованы биологические свойства тилозина. Подробный обзор работ по изучению биологических свойств тилозина приведен в Материалах симпозиума по фармацевтической продукции для животных, выпускаемой фирмой "Elanco" (США). Из данных по антибактериальному спектру действия видно, что тилозин активен против грамположительных микроорганизмов. Была установлена его эффективность против Erysipelothrix, Sphaerophorus necrophorus, Vibrio coli, Laptospira pasteurella. Однако он не эффективен против Escherichia coli и Salmonella. В хозяйственном отношении важна активность тилозина против микоплазм, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных. Установлено, что тилозин обладает наибольшей активностью в сравнении с другими антибиотиками против Mycoplasma gallisepticum. Ряд работ свидетельствует об активности его против других видов микоплазм, в частности-Mycoplasma agalactiae /142/.

Исследования механизма действия тилозина показали, что он, как и другие макролидные антибиотики, тормозит синтез белка на участке аминоацил-тРНК и пептидил- тРНК, связываясь с рибосомами /142, 204/.

Разработана методика определения концентрации тилозина, основанная на его способности подавлять рост Bacillus subtilis /48/. В работах /52, 53/ предложен новый математический подход при определении концентрации тилозина методом диффузии в агар, позволяющий резко сократить объем работ и увеличить точность используемых ранее табличной и графической методик биологического титрования.

Ведутся работы по созданию гибридного антибиотика на основе тилозина для борьбы с патогенными микроорганизмами, устойчивыми к тилозину /81/. Методами генной инженерии в Японии получен штамм, образующий производное тилозина, активное в отношении бактерий, устойчивых к этому антибиотику /49/. Изучена структура нового макролидного антибиотика, родственного тилозину /201/.

С помощью метода слияния и регенерации протопластов исследуется возможность получения новых антибиотиков штаммами Str. fradiae /71,159/.

1.3. Продуценты тилозина. Естественная изменчивость штаммов

Продуцентами тилозина являются Str. fradiae, Str. hygroscopicus, Str. rimosus /193, 204/. Серия Fradiae принадлежит к секции Roseus, роду Streptomyces, семейству Streptomycetaceae, классу Streptomycetes /88, 127/. Род Streptomyces является наиболее крупным из многих родов эуактиномицетов /164/, он образует 75% антибиотиков, синтезируемых актиномицетами /129, 193/. За рубежом �