Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обоснование режимов хранения продуцентов различных биологически активных веществ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Обоснование режимов хранения продуцентов различных биологически активных веществ"

Всесоюзный научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

На правах рукописи

ТУРКИН ВЛАДИМИР ВАСИЛЬЕВИЧ

ОБОСНОВАНИЕ РЕЖИМОВ ХРАНЕНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ РАЗЛИЧНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальность 03. 00. 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии.

Научный руководитель - кандидат медицинских наук А. Л. Украинцев.

Официальные оппоненты: доктор технических наук С.Е.Строгов; кандидат биологических наук И. С. Павлова Ведущее учреждение: Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, г. Москва.

Л 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструкторском институте прикладной биохимии по адресу:. 125299, Москва, ул. Клары Цеткин, 4/6.

Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструкторского института прикладной биохимии.

Зашита диссертации состоится в Н^асов на заседании Специализированного Совета

С диссертацией можно'ознакомиться в библиотеке

Автореферат разослан

1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

И. И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время во многих отраслях народного хозяйства широко используются биологически активные вещества, получаемые в результате жизнедеятельности широкого круга организмов-продуцентов: микроорганизмов различных таксономических групп, перевиваемых культур клеток животных и растений.

Процессы производства биологически активных' веществ многостадийны, однако несмотря на разнообразие технологических схем производств, начальными этапами являются: проверка исходных свойств продуцента, подготовка посевного материала к культивированию.

Конечный результат производства в значительной степени 'зависит от исходных свойств продуцента, качества посевного материала. Таким образом одна из самых важных проблем при создании произ-зодств различных биопродуктов - создание запасов посевного материала, сохранившего основные биологические свойства продуцента. Эта проблема может быть решена за счет разработки способов хране-*ия посевного материала в течение длительного времени.

Единственным надежным способом сохранения клеточных культур в речение длительного времени является криоконсервирование - хране-ме при низких температурах. Наиболее распространенным способом фиоконсервирования является хранение клеток в жидком азоте при гемпературе -196° С.

Вопросам криоповреждений и криозащиты клеток посвящена обшир-¡ая литература. Теоретический аспект проблемы подробно рассмотрен ю многих публикациях. В то же время экспериментальные работы, гасвященные разработке методов криоконсервирования, часто имеют шиостративный характер. Авторы ограничиваются тем, что приводят

конкретный режим процесса для определенного биологического объек та, а вопросы о том, почему были выбраны именно такие услови криоконсервирования, оптимальны ли они, остаются в стороне. Де монстрируется факт сам по себе, а систематическое исследование н проводится. Такие результаты, как правило, имеют незначительну практическую ценность и в теоретическом плане интереса № представляют.

На наш взгляд при проведении исследований, направленных а разработку методики криоконсервирвоания клеточной культуры, сна чала .необходимо выявить основные факторы, определяющие конечны результат процесса, определить параметры самого процесса криокон сервирования, влияющие на эти основные факторы, а затем провеет: систематическое исследование зависимости результатов криоконсервирования от выбранных параметров.

Существенным условием бесперебойной работы биотехнологическоп производства является постоянное обеспечение посевными культурам со стандартными свойствами в больших объемах. Для этих целей н; производстве применяются специальные посевные аппараты. Перио, разгонки и восстановления процесса при проростах и других аварийных состояниях занимает длительный период времени.

В литературе данный вопрос не нашел должного отражения. Поэтому важно было разработать такие методы криоконсервирования, которые позволили бы устранить данный недостаток.

Цели исследования:

Цели диссертационной работы - разработка методики криоконсервирования клеточных культур ВНК-21 и Vero при температуре -196" ( в контейнерах объемом до 500 мл; разработка методик криоконсервирования клеточных культур ВНК-21, Vero и продуцента тилозин;

- 5 -

Streptomyces fradiae при температуре -70° С.

Задачи работы:

- изучить зависимость сохранности клеток от параметров процесса криоконсервирования: режима замораживания, вида и концентрации криопротектора, плотности клеточной суспензии, формы и объема контейнера для замораживания, продолжительности хранения клеток при низких температурах;

- изучить влияние криоконсервирования на ростовые свойства и морфофункциональные показатели клеток;

- изучить влияние криоконсервирования на чувствительность культуры клеток ВНК-21 к действию вирусов;

■- изучить влияние криоконсервирования на способность Streptomyces fradiae к антибиотикообразованию при культивировании в лабораторных и промышленных аппаратах.

Научная новизна.

Проведено систематическое исследованеие зависимости сохранности биоматериала от параметров процесса криоконсервирования. В результате была разработана методика криоконсервирования клеточных культур ВНК -21 и Vero в контейнерах объемом от 10 до 500 мл. Это позволяет проводить засев ферментационных аппаратов непосредственно из контейнера без предварительной наработки биомассы в культивационных сосудах малых объемов.

Впервые показана возможность криоконсервирования клеток ВНК-21 и Vero при температуре -196°С без изменения жизнеспособности и ростовых свойств, а для культуры ВНК-21 - без снижения чувствительности к действию вирусов.

Показана возможность криоконсервирования и хранения в течение длительного времени клеток ВНК-21 и Vero при температуре -70° С.

Впервые показана возможность криоконсервирования штамма Streptomyces fradiae 25А при температуре -70°С, позволяющая сохранять штамм в течение длительного времени без снижения способности к антибиотикообразованию.

Практическое значение работы.

Разработанные методики криоконсервирования позволяют создавать запас посевного материала культур ВНК-21, Vero и Streptomyces fradiae в условиях лаборатории и производства.

Весьма важной в практическом плане является разработанная методика криоконсервирования концентрированных клеточных суспензий в контейнерах объемом 500 мл: технологическая схема наработки биомассы клеток путем последовательных пересевов в культивационные сосуды и аппараты возрастающих объемов, позволяющая из ампулы с посевным материалом получить биомассу клеток для засева аппарата объемом 630 л, требует для реализации около 2 месяцев. В то же время при засеве аппарата непосредственно из контейнера срок разворачивания производства сокращается до 3 суток.

Разработанная методика криоконсервирования клеток при температуре -70°С отличается простотой реализации и может быть применена в условиях лаборатории и производства без использования в качестве хладоагента жидкого азота.

Предложенная методика криоконсервирования штамма Streptomyces fradiae 25А позволяет получить посевной материал, в полной мере сохранивший способность к антибиотикообразованию и пригодный для засева лабораторных и промышленных аппаратов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на общеотраслевой конференции молодых ученых

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 печатные

работы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на <53 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 23 таблицами. Список цитируемой литературы включает 237 наименований, из них 112 на русском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

. В качестве объектов исследования были выбраны культуры клеток млекопитающих ВНК-21 и Vero, а также представитель группы актино-мицетов (лучистых грибков) Streptomyces fradiae штамм 25А.

Клеточные культуры ВНК-21 и Vero были получены нами из НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР, йгамм Streptomyces fradiae 25А был получен с завода„Прогресс (г. Степногорск).

Для культивирования клеток ВНК-21 использовалась полусинтетическая среда (ПС), являющаяся модификацией МСИ. Для выращивания клеток ВНК-21 б суспензии среда была дополнена 10£ сыворотки крови крупного рогатого скота (СКРС), для выращивания клеток ВНК-21 в монослое - 5% сыворотки.

Для выращивания клеток Vero в монослое была использована среда 199. Среду с солевым раствором Эрла готовили из сухого концентрата фирмы "Serva"(ФРГ) согласно прилагаемой инструкции с добавлением 5% СКРС Киевского мясокомбината.

Среды ПС и 199 готовили на высокоочищенной воде, полученной на установке "Супер Ку" фирмы "Миллипор". Среды стерилизовали

фильтрованием через фильтры фирмы "Миллипор" с размером пор 0,22 мкм. Антибиотики (пенициллин - 100 мг/л и стрептомицин - 100 мг/л) и глутамин вносили в среду перед ее использованием.

Для выращивания культуры Streptomyces fradiae использовалась питательная среда, предложенная К П. Рогатых с соавторами.

Клеточную культуру ВНК-21 выращивали в монослое и в суспензии, а клетки Vero - в монослое.

В монослое клетки выращивали в стеклянных матрасах емкостью 100 мл, 250 мл, 500 мл и 1 л. Объем заполнения составлял 0,1 от общег-о объема матраса. Культивирование осуществляли при температуре (36±1 )с С в термостате ТС-80.

Посевная доза составляла для клеток ВНК-21 - (0,8г1,2)- 10

5

кл/мл, для Vero - (0,7т0,9) • 10 кл/мл. Кратность рассева для ВНК-21 - 1:10-1:15, ДЛЯ Vero - 1:10-1:20; частота пассирования для ВНК-21 - через 3-4 суток, для Vero - через 4-5 суток. Метод снятия - 0,02% версен (4/5), 0,25% трипсин (1/5).

В суспензии клеточную культуру ВНК-21 выращивали в колбах на качалке и в стеклянном ферментаторе.

Культивирование осуществляли в конических колбах емкостью 250 мл на термостатируемой качалке марки G-24 фирмы "Нью Брунсвик" (США) при температуре (36tlf С; скорость вращения ротора качалки составляла (180±10) оборотов в минуту. Пересевы проводили отъем-но-доливным способом через 3 суток.

Клеточную культуру ВНК-21 выращивали также в ферментаторе фирмы "Марубиши" (Япония) модель МД-300. ■ Культивационный сосуд имел общую вместимость 5 л, объем заполнения составлял 3 л.

Вегетативный мицеллий Streptomyces fradiae выращивали в конических колбах объемом 350 мл с 50 мл ферментационной среды.

Культуру Streptomyces fradiae 25A выращивали в лабораторных аппаратах. Ферментацию проводили при температуре +28° С, расходе воздуха (1,2-1,5) л/л мин, числе оборотов мешалки - 600 об/мин в течение 6-9 суток.

Скорость дыхания клеток определяли по уменьшению концентрации кислорода в пробах культуральной жидкости, помещенных в закрытую термостатируемую ячейку с перемешиванием. Измерения проводили с помощью анализатора дыхательной активности клеток с закрытым полярографическим датчиком рОй и на анализаторе кислорода модели 53 фирмы "Иеллоу Спрингс Инструменте" (США).

Изучение потребления кислорода клетками также проводили полярографическим методом, используя закрытый электрод типа Кларка на полярографе марки 0Н-102 (Венгрия). В качестве показателя интенсивности дыхания измеряли отношение скорости потребления

-2.

кислорода клетками в присутствии 10 М сукцината к "нормальному" дыханию.

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар. В качестве тест-культуры использовали Bacillus subtilis штамм 720. Расчет значений антибиотической активности проводили по специальным таблицам.

В работе была изучена чувствительность к действию вирусов везикулярного стоматита (ВВС) и парагриппа серотипа 3 (ПГ-3) культуры клеток ВНК-21 после криоконсервирования, а также культуры ВНК-21, не подвергавшейся криоконсервированию. О действии вирусов судили по цитопатическому действию (ЦПД), реакциям гемадсорбции (ГА) и гемагглютинации (ГТ), динамика развития которых в общем адекватно отражает динамику развития вирусов в культуре клеток.

Криоконсервирование клеток проводили в низкотемпературном хо-

лодильнике фирмы "Reveo" (США) и на программном замораживателе, изготовленном Опытным производством Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР.

В качестве криопротекторов были использованы: фетальная сыворотка крови теленка (ФСКРС) фирмы "Serva" (ФРГ), полиэтиленгли-коль (ПЭГ) фирмы "Sigma" (ФРГ), полиэтиленоксиды с молекулярными массами 400, 1500 и 4000 (ПЭО-400, ПЭ0-1500 и ПЭОО-4000) фирмы "Signa" (ФРГ), глицерин и диметилсульфоксид (ДМСО) фирмы "Merck" (ФРГ).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЕНИЕ

Криоконсервирование клеток ВНК-21 и Vero при температуре -196° С.

С целью выбора наилучшего режима охлаждения клетки ВНК-21 и Vero замораживали по нескольким программам.

I. Скорость охлаждения составляла (300f400)° /мин до конечной температуры -196° С.

II. Скорость охлаждения составляла (1-2) /мин до температуры - 80° С (когда происходит полное замерзание жидкой фазы) е последующим погружением в жидкий азот.

III. Скорость охлаждения составляла (30í40)° /мин до температуры -28° С (нижняя граница эвтектической зоны), затем -

15-минутная остановка при температуре -28еС с последующим погружением в жидкий азот, фи охлаждении клеточных суспензий перевиваемых культур ВНК-21 и Vero по I программе гибель клеток составляла практически

100% (как у клеток ВНК-21, так и у Vero). При замораживании клеточных культур по II программе доля жизнеспособных клеток составляла 15,56% у ВНК-21 и 10,56% у Vero. Клетки ВНК-21 и Vero сохраняли способность к адгезии. После замораживания по III программе жизнеспособность клеток составляла 24,15% у ВНК-21 и 21,24% у Vero. Количество участков роста, сформированных клетками после криоконсервирования, было больше, чем в случае замораживания по II программе. Этот режим охлаждения был принят за основной и применен в дальнейших исследованиях.

Для изучения зависимости жизнеспособности клеток после криоконсервирования от объема контейнера клеточные культуры ВНК-21 и Vero замораживали по III программе в плоских контейнерах объемом 10 мл, 100 мл, 250 мл и 500 мл. Оказалось, что при увеличении объема контейнера от 10 мл до 500 мл доля жизнеспособных клеток не снижается.

В то же время при замораживании клеток в цилиндрическом контейнере происходит значительное ( в 3 раза) снижение доли жиз-неспособоных клеток по сравнению с замораживанием в плоском контейнере. По-видимому, это связано с единственным существенным отличием в условиях замораживания - увеличением толщины слоя замораживаемой клеточной суспензии в цилиндрическом контейнере в 10 раз по сравнению с плоским контейнером.

С целью выбора оптимальных криопротекторов для криоконсервирования клеток на предварительном этапе работы было проведено исследование токсического действия различных криопротекторов: глицерина, ДМСО, ПЭО-400, ШО-15СЮ, ЛЭО-4000, ПЭГ. Оказалось, что инкубирование клеток ВНК -21 и Vero с криопротекторами в течение 30 минут приводит к снижению доли жизнеспособных клеток в культу-

ре (примерно на 107.). В случае, когда время инкубирования, составляло 5 минут, снижение жизнеспособности клеточной культуры наблюдалось не во всех случаях, и сам эффект был значительно менее выражен. В целом же можно сказать, что выбранные криопротекторы не обладают значительной токсичностью по отношению к клеткам ВНК-21 и Vero.

. Далее было исследовано защитное действие криопротекторов при замораживании клеточных культур ВНК-21 и Vero. Оказалось, что наилучшими криопротективными свойствами обладают глицерин, ДМСО и ГШ-4Ü0 в концентрации 10% (после криоконсервирования с этими криопротекторами доля жизнеспособных клеток в культуре уменьшается на (1т7)Х). Однако проведенное далее исследование функциональной активности клеток после криоконсервирования в средах, содержащих 10% глицерина, либо 10% ДМСО, либо 10% ЕЭО-400 показало, что криопротективные свойства в наибольшей степени выражены у ДМСО.

Так, после криоконсервирования у клеток ВНК-21 и Vero при мик-роскопировании были отмечены морфологические изменения, представляющее собой везикулы на клеточной поверхности. Количество клеток с морфологическими измененениями зависело от примененного криоп-ротектора и было наименьшим в случае использования в качестве криопротектора ДМСО.

Кроме того наблюдались изменения адгезивных свойств культур клеток ВНК-21 и Vero после криоконсервироания: уменьшалось количество прикрепившихся к стеклу клеток по сравнению с контролем. При этом степень нарушения адгезивных свойств клеток зависит от вида криопротектора: защитное действие глицерина выражено в меньшей степени, чем ДМСО, а наибольшие нарушения

адгезивных свойств клеток наблюдались при использовании в качестве криопротектора ПЭ0-4СЮ.

Аналогичная закономерность наблюдалась и в экспериментах по изучению процессов эндогенного дыхания в клетках после кри-оконсервирования. Оказалось, что после криоконсервирования с использованием в качестве криопротектора ДМСО у клеток уровень эндогенного дыхания снижался в 1,6 и 1,5 раза соответственно по сравнению с контролем. При использовании в качестве криопротектора глицерина уровни эндогенного дыхания клеток ВНК-21 и Vero снижались в 2,5 и 2,3 раза. Значительно - в 3,4 раза снижался уровень поглощения кислорода клетками после криоконсервирования с ПЭО-400 (см. табл. 1).

Таблица 1.

Зависимость скорости поглощения кислорода клетками после криоконсервирования от вида криопротектора

Криопротектор! Скорость поглощения кислорода (нМоль/мин)

ВНК-21 ! Vero

Sx ! х + Sx

Перед криокон-

сервированием 23, ,46 0, 61 18, 56 0, 84

Глицерин 9, 94 0, 22 8, 07 0, 43

ДМСО 15, 16 0, 68 12, 37 0. 58

ЕЭО-400 6, 71 0, 66 5, 23 0, 71

Кроме того, в случаях, когда в качестве криопротекторов

«г

использовались глицерин и ПЭО-400, у клеток при добавлении 10 V сукцината увеличивалась скорость потребления кислорода, что свидетельствует о нарушении целостности плазматической мембраны, е результате чего сукцинат проникает внутрь клеток, и нарушении тонкой организации митохондриальных электронопереносящих систем. В случае, когда в качестве криопротектора использовали ДОСО, стимуляция эндогенного дыхания при добавлении 10 М сукцината не наблюдалась. Следовательно, в наименьшей степени структурно-функциональные нарушения клеток после криоконсервирования выражены при использовании в качестве криопротектора ДМСО.

По своим ростовым свойствам культуры клеток ВНК-21 и Уегс после криоконсервирования не отличались от контроля в случае, когда продолжительность хранения при температуре -195*С составляла как 1 месяц, так и 12 месяцев. Следует отметить, что доля жизнеспособных клеток в культурах после криоконсервирования в течение первых 2-3 пассажей была незначительно меньше по сравнению с контролем, а начиная с 1У пассажа, отличия по данному показатели не наблюдались.

Была изучена динамика развития вирусов везикулярного стоматита (ВВС) и парагриппа серотипа 3 (ПГ -3) в клеточной культуре ВНК-21 до и после криоконсервирования. О действии вирусов на клетки судили по цитопатическому действию, реакциям гемадсорбцик и гемагглютинации.

Оказалось, что после криоконеервирвоания чувствительность клеточкой культуры ВНК-21 к действию вирусов ВВС и ПГ-3 увеличивается, однако этот эффект сохраняется на протяжении только первых двух пассажей после криоконеервирвоания.

Криоконсервирование клеточных культур ВНК-21 и Vero при температуре - 70° С.

С целью выбора наилучшего режима охлаждения клетки ВНК-21 и Yero замораживали в двух режимах.

I. Скорость охлаждения составляла С2) град/мин до температуры -70°С.

II. Скорость охлаждения клеточной суспензии составляла (35f40) град/мин до температуры -70°С.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Зависимость жизнеспособности клеточных культур ВНК-21 и Vero от режима замораживания

Режим замораживания ! Доля жизнеспособных клеток (%)

t----------------------------------------

• ВНК-21 ! Vero

у----------------------1-----------------

! 1 ± Sx ! х ± Sx

Перед замораживанием 98,22 1,07 95,14 1,24

I 16,71 0,73 9,18 0,25

II 32,44 0,97 28,91 0,88

Следует отметить, что после размораживания клетки ВНК-21 и Vero сохраняли способность к адгезии. Однако к тому времени, когда в контроле клетки ВНК-21 и Vero формировали монсслой, эти же

клеточные культуры после криоконсервирования с использованием I режима замораживания формировали немногочисленные небольшие участки роста, в то время как клетки после криоконсервирования с использованием II режима замораживания формировали участки роста в значительно большем количестве. На основании полученных результатов II режим замораживания клеток был принят за основной и использован в дальнейших исследованиях.

Исследование защитного действия глицерина и ДМСО при крио-консервировании показало (см. табл. 3), что для клеточной культуры ВНК-21 наилучшими криопротективными свойствами обладает ДМСО в концентрации 10%. После размораживания клеток ВНК-21 во всех ва-риантах(как с глицерином, так и с ДМСО) клетки ВНК-21 сохраняли способность к адгезии и формировали монослой в те же сроки, что и контроль. В то же время использование этих же криопротекторов при замораживании клеточной культуры Vero не привело к значительному увеличению доли жизнеспособных клеток по сравнению с замораживанием без криопротекторов.

Оказалось, что наилучший результат при криоконсервировании культуры клеток Vero достигается в случае, когда среда для замораживания содержит 90% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота и 10% ДМСО. В этом случае после размораживания клетки сохраняли способность к адгезии и формировали монослой в те же сроки, что и в контроле.

Изучение предельно допустимых сроков хранения клеток при температуре -7(f С показало, что значительное снижение (примерно на 30%) жизнеспособности и адгезивных свойств клеточной культуры ВНК-21 наблюдалось в случае, когда продолжительность хранения при

Таблица 3

Зависимость жизнеспособности клеток ВНК-21 и Vero от выбранного криопротектора

Криопротектор!Концентрация !Доля жизнеспособных клеток (%)

!криопротектора!--------------------------------

t '(%) ! ВНК-21 ! Vero

I j-----------------f--------------

! ! х ± Sx f х ± Sx

Перед криокон-

сервированием - 98, 22 1,07 95,14 1,24

Глицерин 5 87, 35 1,28 40,21 1,10

10 92, 15 1,73 41,82 1,25

20 90, 44 1,37 35,14 1,03

ДМСО 5 90, 28 1,25 41,07, 1,41

10 98, 04 0,87 42,15 1,73

20 95, 12 1,44 39,80 1,12

температуре -70°С составляла 12 месяцев.

В случае клеточной культуры Vero незначительное (примерно на ZZ) уменьшение доли жизнеспособных клеток отмечалось через 8 месяцев хранения, через 10 месяцев хранения жизнеспособность культуры еще более снижалась (примерно на 15%), а через 12 месяцев жизнеспособность клеток уменьшалась почти в 2 раза. В случае, когда срок хранения клеточной культуры Vero составлял 10 месяцев (и тем более 12 месяцев) адгезивные свойства клеток были в значительной степени нарушены - на площади 1 мма прикреплялись лишь

единичные клетки.

Клетки ВНК-21 и Vero, хранившиеся при температуре -70вС в течение 1-8 месяцев по своей способности к формированию монослоя практически не отличались от контроля. Клетки ВНК-21 и Vero, хранившиеся 10 и 12 месяцев, монослоя не формировали.

Последующие опыты показали, что клеточные культуры ВНК-21 и Vero, хранившиеся при температуре - 7СГС*в течение 1-8 месяцев по своим ростовым свойствам не отличаются от контроля.

Клеточная культура ВНК-21, хранившаяся при температуре -70е С в течение 10 месяцев, теряла способность к росту вне зависимости от того, сохранялись ли адгезивные свойства клеток или нет.

Клеточная культура ВНК-21, хранившаяся при температуре - 70°С в течение 8 месяцев, после размораживания была использована в качестве посевного материала для засева ферментера. В процессе выращивания клеток в ферментере оценивались также такие показатели как скорость дыхания клеток, концентрация бикарбоната, коэффициенты метаболизма по кислороду и бикарбонату. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии значительных отличий клеточной культуры ВНК-21 после криоконсервирования от контроля.

В целом же результаты настоящего раздела работы показывают, что клеточные культуры ВНК-21 и Vero можно хранить при температуре -70°С в течение 8 месяцев. При этом ростовые свойства культур клеток и такие показатели, как доля жизнеспособных клеток в культуре, способность клеток к адгезии и формированию монослоя, а также некоторые физиологические показатели при культивировании клеток ВНК-21 в ферментере практически не отличались от контроля.

Следовательно, разработанный способ криоконсервирования клеточных культур ВНК-21 и Vero может быть применен в тех случаях,

- 19 -

когда не требуется сохранять клетки более 8 месяцев.

Криоконсервирование продуцента тилозина Streptomyces fradiae

при температуре - 70® С

При разработке способа криоконсервирования вегетативного ми-целлия Streptomyces fradiae первоначально был изучен вопрос о необходимости использования криопротекторов, а также исследовано влияние глицерина и ДМСО на жизнеспособность и антибиотическую активность продуцента при замораживании-размораживании.

Материал для криоконсервирования отбирали на третьи сутки культивирования. Замораживание осуществляли в стеклянных флаконах емкостью 50 мл и стеклянных матрасах емкостью 100 мл, 500 мл и 1 л (объем заполнения во всех случаях составлял 0,1 от общего объема сосуда, толщина слоя культуральной жидкости при этом составляла 1-1,5 см). Вегетативный мицеллий замораживали как с криопро-текторами, так и без них.

Криопротекторы - глицерин и ДМСО - добавляли в культуральную жидкость перед криоконсервированием. Концентрации каждого из кри-опропротекторов составляли 5% и 10%. После добавления криопротекторов в культуральную жидкость флаконы с биоматериалом помещали в низкотемпературный холодильник при температуре -70°С. Через 7 суток хранения при температуре -70°С биоматериал размораживали на водяной бане при температуре +40°С, засевали в колбы объемом 350 мл с 50 мл ферментационной среды и выращивали на качалке.

На третьи сутки культивирования наблюдалось образование густой сети гиф во всех экспериментальных вариантах - как при криокон-сервировании с криопротекторами (как в случаях, когда концентра-

Таблица 4

Зависимость антибиотической активности ЗЬгерЬошусев ГгасИае после криоконсервирования от применных криопротекторов

Криопротектор ! Концентрация крио- ! Антибиотическая активность

! протектора в куль- ! (ед/мл)

! туральной жидкости !

! (%) !

Перед криокон-

сервированием

Криоконсерви-

рование без

криопротектора

Глицерин

ДМСО

5 10 5 10

8000+300

7330±247 8700±200 8125+211 76341189 7833±197

ции их составляли 5%, так и в случае, когда концентрации криопротекторов составляли 10%), так и без них. Однако наблюдались различия по уровням антибиотической активности (см. табл. 4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что наилучшие результаты криоконсервирования вегетативного мицеллия ЗЬгерЬотусеэ ГгасИае достигаются при использовании в качестве криопротектора глицерина в концентрации 5%. Именно этот способ был выбран за основной и использован в дальнейших экспериментах.

На следующем этапе работы была изучена зависимость антибиотической активности штамма после криоконсервирования от продолжительности хранения вегетативного мицеллия при температуре -70вС. Для сравнения в параллельном опыте вегетативный мицеллий БЬгерЬотусез ГгасИае хранили при температуре +5°С.

После размораживания вегетативный материал, а также материал, хранившийся при температуре +5°С, засевали в колбы и выращивали на качалке.

Образование густой сети гиф наблюдали на третьи сутки культивирования, независимо от температуры и продолжительности

Таблица 5

Зависимость антибиотической активности ЗЬгерЬошусез РгасИае

от продолжительности хранения при температурах +5° С и -70° С.

Продолжи-! Температура тельность! хранения хранения !(°С) (мес) !

t

Антибиотическая активность (ед/мл)

I пассаж !

II пассаж

IX сутки ! УП сутки ! IX сутки

Перед криоконсервированием 6895±299

3 +5 4508±83 605б±107 7508+325

3 -70 5875±1б5 6986±10б 7990+325

б +5 1770±110 2363±180 4438+276

6 -70 4435±196 5570+203 6117±б08

9 +5 1167±289 170б±255 2963±144

9 -70 4645+339 3975±300 6844±472

хранения. Антибиотическую активность определяли на I пассаже - на IX сутки культивирования, на II пассаже - на УП и IX сутки (см. табл. 5).

Таким образом, антибиотическая активность Б^ер^тусеБ ГгасНае сохраняется примерно на исходном (таком, как перед крио-консервированием) уровне после трех месяцев хранения в охлажденном (при температуре +5*С) и замороженном (при температуре -70ЬС) состояниях. После шести (й тем более после девяти) месяцев хранения в охлажденном состоянии антибиотическая активность штамма снижается. В то же время после шести и девяти месяцев хранения продуцента в замороженном состоянии снижения антибиотической активности практически не происходит.

При проведении ферментаций в лабораторных аппаратах объемом 1,7 л с использованием посевного материала штамма 51гер1ошусеБ ГгасНае, хранившегося в охлажденном и замороженном состояниях в течение 3 месяцев, максимальные уровни антибиотической активности в опыте и в контроле (т.е. при использовании в качестве посевного материала вегетативного- мицеллия, не подвергавшегося криоконсер-вированию) совпадали (см. табл. 6).

Из результатов, представленных на таблице 6, видно, что в опыте время ферментации увеличивалось примерно на 1,5 суток по сравнению с контролем. Возможно, это связано с тем, что при длительном хранении при низких температурах часть клеток лизируется, и, следовательно, доза засева уменьшается. Поэтому перед засевом в ферментер можно рекомендовать проводить насколько пересевов посевного материала на жидкой ферментационной среде. В этом случае жизнеспособность культуры успевает восстановиться.

Таблица 6

Динамика накопления тилозина в ферментациях в аппаратах объемом 1,7 л с использованием посевного материала, хранившегося при температурах +5° С и -70° С в течение 3 месяцев

Продолжительность! Антибиотическая активность (ед/мл) ферментации (час)!---------------------------------------

! Контроль ! Температура хранения (° С) » »----------------------------

! ! +5° С ! -70° С

0 320 200 138

24 600 162 110

48 1950 1100 400

72 3700 2£50 900

96 5200 4500 2500

120 6345 6000 3780

144 6755 6425 5500

168 7000 6600 -

172 7000 6820 6540

196 - 7000 7000

240 - - 7000 7000

264 - 7000 7000

288 - - 7000

Таблица 7

Динамика накопления тилозина в ферментациях в. аппарате объемом 630 л с использованием посевного материала БЬгерЬо-тусез ГгасПае, хранившегося при температурах +5° С и -70° С

ь течение 3 месяцев

Продолжительность ! Антибиотическая активность (ед/мл)

ферментации (час) !--------------------------------.----

! Температура хранения (° С) !------------------------------------

! +5 Г -70

35 - 200

42 300

59 - 600

. , нос

УЗ - 922

91 - 2600

114 2649

138 3382

140 - 3178

156 - 3705

162 4461

172 - 4517

182 4455

При проведении ферментаций в опытно-промышленных условиях материал, хранившийся при температурах +50С и -70°С в течение 3 месяцев, после дополнительной прокачки использовали для засева в посевные аппараты. Культуру, выращенную в течение 2 суток в посевных аппаратах, использовали для засева в ферментер объемом 630 л. При этом в процессе ферментации наблюдалось сглаживание различий между охлажденным и замороженным материалом. Это проявлялось в близких значениях величин метаболических активностей и в почти одновременном окончании процесса ферментации (см. табл. 7).

Таким образом метод криоконсервирования Streptomyces fradiae 25 А при температуре - 70°С может быть использован в лабораторных и производственных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика криоконсервирования клеточных культур ВНК-21 и Vero при температуре -19б°С. Оптимальной является программа замораживания, предусматривающая охлаждение клеток со скоростью (30f40) градусов в минуту до температуры -28?С, выдерживание клеток при этой температуре в течение 15 минут, а затем -погружение в жидкий азот.

2. Показано, что для криоконсервирования клеточных культур ВНК -21 и Vero при температуре -196°С в качестве криопротектора оптимальным является использование ДМСО в концентрации 10%.

3. Установлено, что для криоконсервирования клеток ВНК-21 и Vero при температуре -196*0 необходимо использовать контейнеры плоской формы объемом до 500 мл.

4. Показано, что при заражении клеточной культуры ВНК-21 после криоконсервирования вирусами ВВС и ПГ-3 инкубационный период реакций вирусов уменьшается, однако этот эффект сохраняется только на протяжении первых двух пассажей культивирования после размораживания.

5. Обоснован состав среды для криоконсервирования клеток ВНК-21 и Vero при температуре -70°С, которая в случае клеток ВНК-21 должна содержать 10% ДМСО, а в случае клеток Vero - 90% фе-тальной сыворотки и 10% ДМСО.

6. Установлено, что предельно допустимый срок хранения культур клеток ВНК-21 и Vero при температуре -70° С составляет 8 месяцев.

7. Производственный штамм Streptomyces fradiae 25А можно хранить при температуре -70°С в течение 9 месяцев без изменения антибиотической активности. При этом среда для криоконсервирования должна содержать 5% глицерина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Украинцев А. Д. , Туркин В. В. , Тихомирова JL А. , Федорова М. П. ,

Бабьев А.Н. Криоконсервирование клеток ВНК-21 при температу.

- 70° С./Дел. ВИНИТИ. Per. & 538 мб - Дел. 90 от II.09.90 г

Указатель депонированных работ ВИНИТИ. - 1991. - té I. - С. I

2. Тихомирова JL А. , Туркин В. В. , Федорова М. П. , Савочкина И. В. , Зубарев Т. Е , Украинцев А. Д. Способ хранения посевного материала продуцента тилозина Streptomyces fradiae. //Передовой опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения. - 1991. - N 6. - С. 10-15.