Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование микробного синтеза индивидуальных гиббереллинов и абсцизовой кислоты

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование микробного синтеза индивидуальных гиббереллинов и абсцизовой кислоты"

На правах рукописи

р г Б ОД 1 3 МАЯ 13СВ

МАКЕЕВА АННА ПАВЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОБНОГО СИНТЕЗА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ГИББЕРЕЛЛИНОВ И АБСЩ30В0Й КИСЛОТЫ

(ОЗ.ОС.23 - биотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Научные руководители:

Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

академик РАСХН Г.С.Муромцев

доктор биологических наук Л.М.Красшпольская

доктор биологических наук, профессор Л.И.ВОРОБЬЕВА

доктор биологических наук М.А.ПРОЦЕНКО

НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН лаборатория биосинтеза

Защита состоится "_

1996г. в

час

на заседании специализированного совета Д.020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии (127550, Москва, ул.Тимирязевская, 42) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии

Автореферат разослан

1996г.

Ученый секретарь специализированного совета, (Э^ууиы кандидат биологических наук С.А.ЫЕЛИКОВА '

. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теми. Эндогенные регуляторы роста растений, в том числе, фитогормоны терпеноидной природа - гиббереллины и абсцизовая кислота - характеризуются широким спектром физиологической активности, низкими действующими концентрациями и экологической безопасностью применения. Постоянное расширение области применения фитогормонов в новых интенсивных технологиях возделывания сельскохозяйственных культур делает все более актуальной зэдачу разработки эффективных способов их получения. Наиболее перспективным представляется направленный микробный синтез фитогормонов с помощью грибов-продуцентов.

Гиббереллины представляют собой наиболее обширную (более 70) и важную группу фитогормонов, относящихся к классу дитерпенов. Основная их функция состоит в стимуляции роста растений; гиббереллины воздействуют на цветение и плодоношение высших растений, выводят семена и почки из состояния покоя. Наиболее изученный из гиббереллинов - гиббереллин АЗ. более 30-ти лет производится путем микробного синтеза; существующая технология, однако, нуждается в модернизации. Не менее перспективными благодаря их высокой и своеобразной физиологической активности могут оказаться гиббереллины А4 и, особенно, А7; но их изучению и применению препятствует отсутствие индивидуальных препаратов, так как известные продуценты А4 не обладают достаточной активностью, а продуцент А7 в литературе не описан. Кроме того, получение препаратов индивидуальных А4 и А7 осложнено трудностью разделения их смеси из-за очень близкой полярности. В связи с этим актуальной задачей является поиск активных штаммов-продуцентов индивидуальных гиббереллинов А4 и А7, а также разработка условий культивирования продуцентов, обеспечивающих эффективность ' процесса направленного биосинтезе целевых метаболитов.

Абсцизовая кислота(АБК) представляет собой оптически- активный сесквитерпеноид. Она играет важную роль в жизнедеятельности цветковых растений. Исключительное значение имеет способность АБК вызывать обрьгимое торможение процессов, а также выступать в качестве антистрессового фактора. Тонкий химический синтез АБК приводит к образованию трудно разделимой смеси стереоизомеров. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется разработке микробиологического способа получения АБК с помощью фитопотогегашх

грибов родов Сегсозрога и Botrytis, синтезирующих в основном физиологически активный изомер.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в создании биотехнологических способов получения индивидуальных гиббереллинов A4 и А7 и абсцизовой кислоты с помощью грибов-продуцентов, а также в проведении иследований, направленных на повышение эффективности процесса синтеза гиббереллина A3 грибом F.monllliorme.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) провести скрининг штаммов F.monllliorme, способных к преимущественному образованию индивидуальных гиббереллинов A4 или

а-тзкже-исследовать-способность-к—синтезу—абсцизовой—кислота-различных видов грибов рода Сегсозрога.

2) провести селекционную работу по повышению биосинтетической активности штаммов F.monllliorrae - продуцентов A3, A4 и А7.

3) изучить зависимость биосинтеза индивидуальных гиббереллинов и АБК от условий глубинного культивирования грибов-продуцентов и разработать способы направленного синтеза целевых метаболитов.

4) разработать экстракционно-сорбционный способ выделения гиббероллинов A4 и А7 и АБК из культуральной жидкости и получить высокоочщенные препараты индивидуальных гиббереллинов и АБК.

Научная новизна. Впервые выявлены штаммы гриба F.monllliorme, способные к преимущественному синтезу индивидуальных гиббереллинов A4 и А7, и практически не синтезирующие A3. Отобран активный продуцент АБК - гриб C.roalcola.

При использовании разработанной методики получения и регенерации протопластов штаммов F.monlllforme получены продуценты индивидуальных гиббереллинов A4 и А7 с повышенной биосинтетической активностью.

Разработана селекционная программа повышения биосинтетической активности штамма F.monllliorme - продуцента гиббереллина A3, включающая радиационный мутагенез и полуколичественный 'экспресс-метод определения содержания A3 в культуральной жидкости. Получена культура с активностью, на 4536 превышающей активность исходного штамма. Для полученной линии штамма оптимизирован состав ферментационной среды.

Изучена зависимость микробного синтеза гиббереллинов и АБК от основных условий культивирования продуцентов и впервые разработаны

биотехнологические способы направленного синтеза индивидуальных гиббереллинов A4, А7 и АБК.

Впервые предложен сорбционный способ выделения А7 и АБК и модифицирован экстракционный способ выделения A4 из культурэльной жидкости грибов-продуцентов. Получены высокоочиценные препараты индивидуальных A4 и А7 и АБК с содержанием действущего вещества 85-95Ж.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 14-й международной конференции "Plant Growth Substances" (Amsterdam, 1991), на 4-й Всесоюзной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на 11-й конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы, имеются положительные решения на 3 авторских свидетельства, 2 статьи сданы в печать.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, 3-х глав с изложением экспериментальных данных и обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы.

Работа изложена на 136 страницах, включает 16 рисунков и 24 таблицы. Список литературы содержит 229 наименований, в том числе 164 наименования иностранной литературы.

Автор выражает благодарность акад.РАСХН Муромцеву Г.С. и д.б.н. Краснопольской Л.М. за руководство, внимание и помощь в процессе выполнения работы, к.х.н.Садовской В.Л., Вобликовой В.Д., к.б.н. Львовой H.A., к.х.н.Артеменко E.H., Дубовой Л.П., Соколовой Л.М., доктору Хорноку Л. и Молнар А.(Венгрия) за помощь в исследованиях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследования. В работе использовали штаммы F.monillïorme коллекции ВНИИ СБ и штамм F.monlllforme- продуцент A3 лаборатории НПО "Синтез" (г.Курган), а также получетные из ВКПМ штаммы рода Сегсозрога: C.armoraclae, C.carotae, C.roslcola, C.pantaginla u C.vlolae. Хранение и вегетативное размножение культур осуществляли на агаризованных {2%) средах: среде Чапека и ее модификации, сусло-агаре (CA), картофельно-глюкознсм агаре (КГА), а также на сыпучих средах: рисе и пшене (см. спрэвочгок "Методы •экспериментальной микологии",1982). В качестве жидкой

посевной среда для культивирования С.гоз1со1а использовали модифицированную среду Нормана (Norman et al., 1981а), для культивирования штаммов F.monllilorme -продуцентов A4 и А7 - среду Ролен-Гома; для культивирования штамма F.monlllforme - продуцента A3 среду следующего состава (в масс.Ж): сахароза - 3.0; сульфат аммония - 0.2; кврбонат кальция - 0.7; кукурузный экстракт -1.5. В качестве базовой ферментационной среда для синтеза АБК использовали среду Нормана. При разработке новых ферментационных сред применяли солевую основу (в масс.%): КН2Р04 - 0.20; MgS04 - 0.02; K2S04 -0.02. Для синтеза А7 использовали среду следующего состава (в масс.%): растительное масло -7.0; кукурузный экстракт -3.5; ацетат аммония - 0.05; КН2Р04- 0.1; M¿fi04-0.02. Глубинное^культивирование проводили в колбах емкостью 500 мл и пробирках (100 и 10 мл среды). Инокуляцию сред осуществляли из расчета 5-1055 посевного материала от объема ферментационной среда. Массу мицелия (г/л) определяли весовым методом. Содержание масла определяли весовым методом после экстракции культуральной жидкости петролейным эфиром (Муромцев, 1965). Оптимизацию состава ферментационных сред проводили по ортагональной матрице математического планирования полнофакторного эксперимента (Максимов, Федоров, 1969; Максимов,1988). Концентрацию АБК (мг/л) в культуральной жидкости определяли спектрофото метрическим акспресс-методом при длине волны 268 нм (Norman et al., 19816). Содержание A3 (мг/л) в культуральной жидкости определяли спектрофотометрическим методом (см.Методы определения некоторых регуляторов роста растений,1984). Для определения содержание A4 и А7 (мг/л) в культуральной жидкости проводили сравнение площадей соответствующих пиков на хроматограммах образцов проб и аутентичных веществ после первичного разделения экстракта культуральной жидкости методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силуфоловых пластинках при использовании системы хлороформ-изопропанол (9:1). Идентификацию АБК и гиббереллинов проводили комбинированным методом газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) триметил-силилышх производных. Колонку с полисорбом при выделении АБК и А7 непосредственно из культуральной жидкости готовили согласно рекомендациям руководства "Мэтода биохимии"(1981). , Методика получения и регенерации протопластов штаммов гриба F.monlliíorme разрабатывалась на основе литературных данных (Peberdy, 1979; Harris, 1982; Sallen, 1988; Brukner, 1990 и др.). 'Физиологическую

активность полученных препаратов определяли в следующих биотестах: АБК - по ингибированию прорастания семян горчицы сорта "Юбилейная" (Коф и др., 1973), А4 и А7 - по удлинении первого междоузлия проростков огурца сорта "Муромский" (Муромцев, Агаистикова, 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Разработка способа получения индивидуальных гиббереллинов А4 и А7 путем микробного синтеза.

1.1.Поиск продуцентов гиббереллинов А4 и А7. Гриб Р.шоп111£огте является промышленным макропродуцентом гиббереллинов. Основной метаболит большинства описанных штаммов - АЗ (Муромцев, Агнистикова, 1974; Кишат ег а1., 1989). Штаммов ?.шоп111Гопг,е - макропродуцентов А4 и А7 к настоящему времени в литературе не описано. Известно, что гриб БрИаоеЛ-ота продуцирует А4 (ЕайетаоЬег, Zeigleг, 1979; Иас1етао11ег, 1994), а локулОаскомицет РЬаеоэр1гаег1а - А4 и А9 (Базэа ег а1., 1989), но ни один из них не обладает достаточной активностью.

Табл.1.

Содержание гиббереллинов в культуральной жидкости штаммов Р.шопШГогте.

Штамм Ферментационная среда

среда Ролен-Тома П0ДС0ЛН.М.+ кукур. экстр.

А4 мг/л к.ж А7 мг/л к.ж другие Аз мг/л к.ж. А4 мг/лк.ж А7 мг/л к.ж другие Аз мг/л к.ж.

Р127(4) - - следа АЗ, А1Э 3.0 3.5 следы АЗ, А13

0.1.1 3.2 .2.1 следа АЗ, А13 - 7.8 ' АЗ-5.9

гэ.ю ?5.0 27.1 следа АЗ, АЭ А13, А14 4.5 88.0 АЗ-8.0 А13-0.7

73.106 60.5 8.0 A3.A9.A13 24.3 15.5 АЗ-9.3

С целью поиска продуцентов А4 или А7 было проверено 25 штаммов гриба F.monlllforme коллекции ВНИИСБ. Штаммы культивировали на двух средах: среде Ролен-Тома и на среде с подсолнечным маслом и кукурузным экстрактом. Вследствие того, что идентификацию гиббереллинов осложняло отсутствие эталонов индивидуальных гиббереллинов, было проверено несколько хроматографических систем и отобрана система, обеспечивающая наилучшее разделение смеси хлороформ-изо-пропанол (9:1). По результатам ТСХ этилацетатных экстрактов культуральной жидкости было отобрано 4 штамма, преимущественно синтезирующие А4 и А7. Детальное изучение спектров гиббереллинов, синтезируемых этими штаммами, проведено методом

ГУ-МП триметилг.и.тгшт1,шлг производных (тябл.1 ). На_среде_РОЛбНгТОМа_

наблюдался значительный сдвиг в сторону образования А4 и его концентрация у штамма 73.106 достигала 60 мг/л. Была выявлена также высокая селективность среда на основе растительного масла для А7, особенно для штамма F8.10.

1.2.Получение и регенерация протопластов штаммов F8.10 и 73.106.

Для повышения биосинтетической активности штаммов F8.10 и 73.106 был применен часто используемый в селекционной работе с коллекционными культурами метод проведения штамма через стадию протопластирования. Применительно к отобранным штаммам была разработана методика получения и регенерации протопластов, включающая условия культивирования, возраст культуры,- состав литической' системы, химические реагенты, длительность обработки культуры литической системой, рН и температуру инкубационной среда, осмотические стабилизаторы.

При получении протопластов штамма F8.10 был использованы колонии моноконидиальных культур. Для этого гриб культивировали в жидкой среде, содержащей карбоксиметилцеллюлозу для стимуляции спорообразования. Конидии проращивали на целлофановых дисках, помещенных в питательную среду на чашках Петри. Полученные колонии обрабатывали лиофшшзированным пищеварительный соком Helix pomatla (235) в осмотическом стабилизаторе. Для регенерации суспензию образовавшихся протопластов вносили в агаризованную (1Ж агара) стабшшзирундую среду (40-45° С) и разливали по t чашкам Петри с плотной стабилизирующей средой (256 агара). В качестве стабилизатора был предложен сорбитол (10Ж). Проращивание проводили в течение 3-х

дней при 25° С. Изучение эффективности различных осмотических стабилизаторов и времени обработки литической системой показало, что увеличение периода инкубации приводит к повышению числа протопластов, но значительно уменьшает частоту регенерации, так что инкубационный период не должен превышать двух часов (табл.2).

¿збл.2.

Сравнительный анализ эффективности влияния осмотических стабилизаторов и времени обработки ферментами при получении и регенерации протопластов Р.шопШГоппе Г8.Ю.

Осмотический pH Время обработ- Число Регенерация

стабилизатор p-pa ки ферментами час. протопластов/мл щютопл-в Д

0.8М NaCl 6.04 2 3 5 5.1x10 6 1.0x10 0.40 0.04

0.8М KCl 5.79 2 5 1.0x10 5 6.3x10 0.30

3 0.06

0.7М KCl +0.2М СаС1 2 4.63 2 3 5 1.1x10 5 2.5x10 1.08 0.65

0.8М NH C1 4 4.25 2 3 5 2.0x10 5 3.5x10 3.10 0.47

Был выбран наиболее эффективный стабилизатор - 0.8М раствор Ш4С1. Установлено, что оптимальное значение рН для получения протопластов

- 4.3, для их регенерации - 5.2. Анализ влияния ряда химических реагентов (меркаптоэтаяола, Na-ЭДТА, L-цистеина и бентонита) при предварительной обработке ими пророщенных на целлофане колоний, показал, что 0.1Ж-'шй раствор Na-ЭДТА значительно повышает частоту регенерации, которая для протопластов штамма F8.10 составила 1.1%. Среди полученных протопластннх регенерантов была отобрана культура, названная Со-7, синтезировавшая до 200 мг/л А7 (рис.1).

При дслучении протопластов аспорогенного .штамма 73.106

использовали мицелиальные фрагменты размером 40-140 мкм (Мо1паг ег а1.,1985), которые получали путем фракционирования мицелия, выращенного глубинным способом. Дальнейшая обработка мицелиальных фрагментов проводилась по методике, разработанной для штамма Р8.10. Частота регенерации полученных протопластов штамма 73.106 составила 7.5%, что выше литературных данных для Р.топШГоггае (2.9-5.555) (Вгикпег, 1990). Среди полученных регенерантов была отобрана культура с наиболее сдвинутым в сторону А4 соотношением гиббереллинов А4 и А7 в культуральной жидкости при выращивании на среде Ролен-Тома (100 мг/л и 28 мг/л к.ж. соответственно), которую обозначили С5-4. --Н-С—оГ—ОАТ-йгбОЫ-10СгО-

2.5Е.6 2.0Е6 1.5Е6 1.0Е6

5.0Е5: б

Л

А3 щтон

9

Й7

к-то

ууЪисенапя

(XX/

Д

/Я|5

1 Л

.Ы,_

■—Р"

ге

5 10 |5

Т|те (ш1п.)

Рис.1 .Масс-хроматограмма экстракта к.ж. штамма С5-7.

Среда на основе подсолнечного масла и кукурузного экстракта.

Сравнительное изучение морфолого-культуральных свойств исходных и иротопластных штаммов, показало, что для протопластных штаммов характерен более быстрый рост на плотных агаризованных средах, а также большая развитость воздушного мицелия и отсутствие зон лизиса. Полученные штаммы депонированы в ВКПМ.

1.3.Реализация биосинтеза гиббереллина А4. Так как протошшстный штамм 05-4 синтезировал наряду с А4 некоторое количество А7, при разработке условий культивирования, обеспечивающих более высокое содержание А4, были выявлены факторы, регулирующие соотношение А4/А7 в культуральной жидкости продуцента.

Изучение влияния источников питания на синтез А4 показало, что его направленный синтез обеспечивает использование сахарозы и нитрата аммония.

Зависимость состава гиббереллинов, образуемых

Табл.3.

начальный индивидуальные гиббереллины и ГПВ,

рн % от суммы S пиков

А1 А3 А4 Ч А9 А13 DK

2,5 - следа следа _ следа

3,5 5,1 20,5 51,3 - 15,4 7,7

4,5 4,6 - 89,3 следа 6,1

5,5 3.1 - 55,4 20,9 9,1 11,5

6,5 - - • 12,5 - 87,5

Культуру гриба выращивали при начальных значениях рН ферментационной среда в интервале от 2.5 до 7.5. Как видно из табл.З., при значении рН 4.5 накопление М в культуральной жидкости штамма G5-4 в 9 раз превышало суммарное содержание всех остальных гиббереллинов и гиббереллинподобных веществ(ГПВ).

Известно, что при культивировании продуцента A3 на свету содержание A3 в культуральной жидкости увеличивается (Kumar, Ionsane, 1989). Нами было проведено изучение влияния света на биосинтез А4.

Конц. ГА4 мг/л

140 120 100 80 60 40 20 О L

4 5 (Г 7 91 l5 П~ сутки

Рис.2. Влияние света на накопление А4 в к.ж. штамма 05-4 1- при освещении (2000 лыке) 2- без освещения.

I

Как видно из рис.2, освещение лампами дневного света (2000 люкс)

значительно увеличивает содержание A4 в культуральной жидкости. При этом как в оште, так и в контроле максимальная концентрация достигается на 7-е сутки.

Таким образом, предложен способ направленного биосинтеза гиббереллина A4 при культивировании штамма-продуцента G5-4, который включает: рецептуру ферментационной среда (в масс.%): сахароза -6.0, нитрат аммония -0.3, КН2Р04 - 0.2, MgS04 - 0.02, K2S04- 0.02, и смесь микроэлементов - 1 мл/л;. начальный pH ферментационной среда -4.5, освещенность в течение всего процесса ферментации -2000 лике, продолжительность ферментации - 7 суток. Предложенный способ обеспечивает накопление A4 до 145 мг/л к.ж., что составляет 97% от -суммарного содержания гибберехлиыов.

1.4.Получение высокосчищенного препарата A4. Выделение A4 из культуральной жидкости штамма G5-4 осуществляли методом экстракции. В качестве экстрагента использовали этилацетат.

TIC of DRTfi: RM-FM-2 . D

! . ЙЕ15

1С

8.0E4' G.0E4' 4 . UL4 2.0E4 0

Ai^lwv.

Ич

DOM

4

10

—r-12

14

Б й

Т|те (т1п.)

Рис.З.Масс-хроматограмма экстракта к.ж. штамма С5-4.

Изучение зависимости полноты извлечения А4 от рН экстракции в интервале значений рН от 2.0 до 6.5, позволило установить, что в отличие от АЗ и А7, экстракция которых ведется при рН 2.0-2.5, оптимальное значение рН для экстракции А4 - 3.5. Полученный таким образом экстракт согласно ГХ-МС анализу содержал только гиобереллин А4 (рис.3.). Для выделения высокочшцешюго препарата А4 на завершавшем этапе испольговали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В результате получили^ препарат А4 с содержанием действующего вещества 97Х.

1.5.Реализация биосинтеза гиббереллина А7. Как было показано в табл.1, среда на основе растительного масла и кукурузного экстракта обеспечивает преимущественный биосинтез А7.

Исследование влияния температуры на синтез А7 показало эффективность использования профильного температурного режима, обеспечивающего 25°С в первые 5 суток и 28° С в последующие 4-5 сутик. Содержание А7 при этом режиме повышалось на 20-25%.

При культивировании в предложенных условиях протопластного штамма С5-7 были определены основные характеристики процесса ферментации, представление на рис.4.

Конц. рН масла г/л к.ж.

60

/

Вес сух. А7, мицелия, мг/л к.ж.

г/л 60

50

40

30

300 250 200

150 100

50

| ■->

1 То Г! и Б

сутки ё' 7 6

Рис.4.Основные характеристики процесса ферментации штамма С5-7.

1.-вес сухого мицелия 2.-концентрация А7 в к.ж.

3.-концентрация масла 4.-значение рН ферментационной среды.

Как видно на рис.4, максимальнее накопление мицелиальной массы достигается на 7-8 сутки, максимум содержания в культуральной жидкости А7 - на 9-10 сутки ферментации. Концентрация А7 в условиях колб составила 260 мг/л, а в условиях ферментера до 300 мг/л к.ж.

1.6.Выделение■А7 из культуральной жидкости штамма С5-7. Для разработки эффективного способа выделения А7 была исследована возможность сорбции А7 непосредственно из культурального фильтрата на неионогенную смолу марки "Полисорб 60/100", представляющую собой сополимер стирола с дихлорвинилбензолом. Культуральную жидкость порционно наносили на заполненную смолой колонку. Предварительно проведенные эксперименты позволили определить сорбционпую емкость смолы, которая составила около 3.2 мг/г. Элюировавие А7 водными растворами ацетона показало (рис.5), что наиболее полное

извлечение А.7 обеспечивает трехкратное алшрование 50%-ным раствором ацетона.

1.2Е5 1.0Е5 О 8.0Е4. |'6.0Е« 5 4.0Е4-£ 2.GE4-о-5

TIC of DATA:JO.D

/ц • . исходная к^льш.лс-П

rtupH I

1.5E6 1.0E6

I 5.0E5 »

3.0E4") „2.0Е4

о с 10

=10000

8 10 12 14 IE 18 20 22 Tine (nin.)

TIC of DRTR: JG5B'.c-2 ,D

Lfil

invpn.K-TU

p.p

ацетона 501,

IB

Time (mln.)

IS

20

TIC of DfiTR: JG80Z.D

p-p ацетона 807,

Ш

10 15

Типе ((лIп. )

20

Рис.5.Препаративное выделение А7 из культуральной жидкости штамма 05-7 на смоле "Полисорб 60/100".

Регенерацию сорбента проводили ацетоном. Проведенные исследования позволили предложить способ выделения А7 из культуральной жидкости сорбцией на смоле "Полисорб 60/100" с последующей десорбцией 5СЙ6-ннм раствором ацетона, отличающийся высокой селективностью и технологичностью стадий.

2.Повышение эффективности микробного синтеза гиббереллино А?.

2.1 .Повышение активности штамма Р.топШЮтае - продуцента АЗ.

Проведенный скрининг штаммов Р.топШГогше коллекции ВНИИ СБ

показал, что активность штаммоз по АЗ не превышает 500 мг/л к.ж.,

активность промышленного штамма, полученного из Курганского НПО

"Синтез" в условиях колб - около 700 мг/л. Из литературных данных

известно, что активность Р.топШХогте по АЗ может составлять

несколько грамм на литр к.ж. (йайетаеЬег, 1994). При исследовании

естественной изменчивости нами было получено 63 моноспоровых

изолята и проведена проверка их гиббереллинсинтезиругщей

активности, которая выявила значительную вариабельность культуры по

этому количественному признаку.

% от общего кол-ва вар-тов

40 30 20 10

40 30 20 10

А

200 400 600 800

1000 lioo

Конц.АЭ мг/л к.ж.

В

Т^С

200 400 600 800 1000 1200 Рис.6.Распределение гиббереллинсинтетической активности

А - моноспоровых изолятов промышленного штамма и

В - вариантов облученной популяции штамма.

На базовой среде на основе подсолнечного масла, рекомендованной

Г.С.Муромцевым (1968), концентрация АЗ в культуральной жидкости

различных изолятов колебалась от 90 до 800 мг/л (рис.6.).

С цельв повышения биосинтетической активности штамма было проведено изучение мутагенного эффекта 7-лучей на биосинтетическую активность промышленного штамма P.moniliforme. Исследование включало получение облученной популяции конидий наиболее активного из моноспоровых изолятов и разработку экспресс-метода.

обеспечивающего одновременную оценку активности большого количества вариантов облученной популяции, суспензию конидий облучали 7-лучамч ®Со, время экспозиции - 50 юл при интенсивности облучения 1000 рентген/мин. Такая экспозиция обеспечивала выживание 10% облученных конидий (11)90). Облученные конидии проращивали на КГА при 26°С.

Для оценки гиббереллинсинтетической активности полученных многочисленных вариантов мутагенизированной популяции выбор был остановлен на ТСХ. Сущность разработанного полуколичественного экспресс-метода заключалась в непосредственном нанесении 5 мкл фильтрата культуральной жидкости на силуфоловую пластинку и его разделении в системе хлороформ - этилацетат - уксусная кислота (7и:зи:ъ), кг АЗ - 0.12. эталсзном-служил-раствор-АЗ-известной— концентрации. Детектирование проводили в УФ-свете при длине волны 254 нм. При скрининге более 270 вариантов мутагенизированной популяции была отобрана линия (обозначенная далее С5-3) с активностью, на 46% превышающей активность исходного штамма. Как видно из рис.6.В, 7-излучение увеличило размах изменчивости штамма по изучаемому признаку. Таким образом, была подтверждена эффективность использования 7-лучей для повышения гиббереллинсинтетической активности продуцента АЗ, а применение разработанного полуколичественного экспресс-метода определения содержания АЗ в культурельной жидкости представляется весьма перспективным для проведения дальнейших исследований по селекции высокоактивных продуцентов АЗ.

2.2.Оптимизация состава ферментационной среды для биосинтеза АЗ.

Для выяснения возможных изменений в пищевых потребностях продуцента АЗ после мутагенеза для отобранной линии был проведен сравнительной анализ эффективности ряда ферментационных сред; при этом изучалась динамика накопления АЗ в культуральной жидкости. Как показали исследования (рис.7), наиболее эффективной оказалась среда на основе сахарозы и кукурузной муки, состав которой был оптимизирован с помощью методов математического планирования эксперимента. В полнофакторных экспериментах ПФЭ 2 2 и ПФЭ 2? рассматривали влияние на синтез АЗ следующих факторов: сахарозы, кукурузной муки и нитрата аммония. По результатам факторных экспериментов была разработана рецептура ферментационной среды (в масс.%Ж): сахароза - 6.0, кукурузная мука - 4.0,' Ш4ШЗ - 0.13,

КН2Р04 - 0.2, К2504- 0.02, 1^04- 0.02, кукурузный экстракт - 1мл/д. р-р смеси микроэлементов - 1 мл/л, применение которой позволило увеличить содержание АЗ до 1900 мг/л. Конц.АЭ,мг/л

Рис.7.Накопление A3 в культуральной жидкости штамма G5-3 при культивировании на различных ферментационных средах: 8)-сахароза+соевая мука, б)-среда Ролен-Тома, в)-подсолнечное масло+ИаЛОЗ. г)-сахароза+кукур.мука+ИаШЗ, д)-подсолнечное масло+кукурузный экстракт

З.Разработка микробиологического способа получения АБК.

3.1.Поиск штамма-продуцента АБК. С целью поиска продуцента АБК были испытаны культуры микроскопических грибов рода Сегсозрога видов C.armoraciae, C.carotae, C.roslcola, C.pantaglnls u C.vlolae. Проведенные эксперименты по глубинному культивированию этих грибов на синтетической среде, разработанной Норманом (Norman et al., 1981а), показали, что способностью к синтезу АБК обладает только культура гриба C.roslcola, при этом содержание фитогормона в •культуральной жидкости составляло около 20 мг/л на 14-е сутки культивирования. Это позволило использовать культуру C.roslcola в дальнейших исследованиях в качестве продуцента АБК. Идентификацию АБК в втилацетатных экстрактах культуральной жидкости проводили методом ГХ-МС. Изучение морфолого-культуральных свойств продуцента показало, что он характеризуется низкой скоростью росте и отсутствием спорообразования. Была выявлена корреляция между морфолого-культуральными признаками и активностью C.roslcola: в процессе рассевов гомогенизированной мицелиальной суспензии была выделена линия с темно-зеленой пигментацией колоний на плотных средэх и черным пигментом, выделяемым в ферментационную среду, которая отличалась повышенной активностью по АБК.

3.2.Разработка способа длительного хранения и вегетативного размножения продуцента. Для разработки способа длительного хранения продуцента без потери биосштетической активности были изучены следующие условия: состав питательных сред, температурный режим хранения и способ ограничения доступа воздуха. Было изучено 48 вариантов хранения и предложена методика хранения продуцента, позволяющая без пересевов хранить культуру в течение года: среды -разбавленный КГА и рис (сыпучая среда) под парафинированными пробками при 5°С.

Для вегетативного размножения культуры C.roslcola использовали среды с различными источниками С и N Наиболее эффективными для после дунцего—биосинтеза АБК оказались среда сусло-агар и синтетическая среда Нормана в качестве жидкой посевной среда. Для сокращения длительности стадий вегетативного размножения засев как плотных, так и жидких питательных сред производили гомогенизированной мицелиальной суспензией в стерильной воде.

3.3.Реализация биосинтеза АБК. При разработке способа микробного синтеза АБК основное внимание уделялось сокращению длительности процесса ферментации, так как по литературным данным время культивирования C.roslcola составляло от 14 до 20 суток (Norman et al., 19816, Tokayama et al., 1983). Это сокращение могло быть достигнуто прежде всего за счет разработки эффективной ферментационной среда. Для качественного отбора источников С и N была проведена сравнительная оценка 28 сред. Наиболее высокий выход АБК был получен на средах, содержащих пептон в сочетании с глицерином и, особенно, с подсолнечным маслом. Оптимизацию состава ферментационной среда также проводили методами математического планирования эксперимента. В полнофакторном эксперименте ПФЭ 25 учитывали влияние на выход АБК трех факторов: подсолнечного масла, пептона и дагидрофосфата калия. Сравнение абсолютных значений коэффициентов регрессии с величиной доверительного. интервала показало, что концентрация пептона находилась в лимитирующей области. Полученные данные послужили основой для постановки опыта по крутому восхождению, где варьируемым компонентом являлся пептон. Максимальный выход процесса был достигнут при концентрации пептона 1.2%. Предложена следующая рецептура ферментационной среда (в

масс.%): подсолнечное масло - 2.0, пептон - 1.2, КН2Р04 - 0.1, K2S04 - 0.02, Mg>04 - 0.02 и 1 мл смеси микроэлементов.

Изучение динамики накопления АБК в процессе культивирования продуцента в интервале от 3 до 14 суток (рис.8) показало, что на предложенных ферментационных средах содержание АБК достигало максимального значения на 7-8-е сутки культивирования, а на среде Нормана, которую использовали в качестве контрольной, лишь на 11-14 сутки, что согласуется с данными литературы (Norman et al., 19816).

Конц. АБК

Рис.8.Динамика накопления АБК в культуральной жидкости. Ферментационная среда:1-подсолнечное масло+пептон, 2-глицерин+пептон, 3-среда Нормана.

Таким образом, предложенные среды позволили значительно сократить длительность процесса ферментации и повысить выход АБК.

Проведение ферментации на свету (люминесцентная лампа, 2000 люкс) подтвердило данные о стимулирующей роли видимого света и привело к увеличению концентрации АБК.в среднем на 20%.

Изучение зависимости синтеза АБК от исходного значения рН ферментационной среды в интервале от.4.5 до 7.5 при культивировании на двух средах показало, что оптимальным для синтеза АБК является значение рН 6.0-6.5, которое соответствует натуральному рН среда с подсолнечным маслом.

Исследование влияния температуры на синтез АБК показало, что при изотермических режимах ферментации содержание АБК растет с увеличением температуры до 28° С; при 30° С наблюдали значительное снижение выхода АБК. Наибольшее содержание АБК было достигнуто при использовании профильного температурного режима, обеспечивающего 25*

С в первые четверо суток и 28°С в последующие трое суток (диаграмма на рис.9.). Конц.Ж АБК

140 ■

120 •

100 ■

80 ■

60 •

0 25

40 22 28 30й 25 28

20 28° 25"

Рис.9.Влияние температурного режима на накопление АБК. Содержание АБК в к.ж. при 25°С принято за 100Ж.

Таким образом, предложен способ микробного синтеза АБК грибом С.гоз1со1а - разработана рецептура ферментационной среды, определены исходное значение рН среда (6.0) и длительность процесса ферментации (7 суток), рекомендованы освещение в течение всего периода ферментации и профильный температурный режим.

При культивировании в предложенных условиях С.гоз1со1а были получены основные характеристики процесса ферментации.

Разработанный способ микробиологического синтеза АБК обеспечивает накопление фитогормона в культуральной жидкости гриба-продуцента С.гоэ1со1а до 220 мг/л.

3.4.Выделение АБК из культуральной жидкости С.гоз1со1а. Сорбционный способ был успешно применен и при выделении АБК. На заполненную смолой "Полисорб 60/100" колонку порционно наносили культуральный фильтрат, предварительно определив сорбционную емкость смолы по АБК, которая составила около 1.5 кг/т. Элюирование АБК проводили водными растворами ацетона. Установлено, что наиболее полное извлечение АБК обеспечивает трехкратное элюирование 40%-ным раствором ацетона. После упаривания ацетона АБК выделяли из водной фазы кристаллизацией с гексаном при рН 2.2-3.0. На основании проведенных исследований был предложен способ выделения АБК из кульчуральной жидкости сорбцией на смоле "Полисорб 60/100" с последующей десорбцией 40%-ным раствором ацетона. Полнота

извлечения составила около 85%. Возможность разработки такого простого в аппаратурном отношении и малс-стадийного способа выделения АБК и А7 в немалой степени была достигнута за счет получения достаточно высоких концентраций метаболитов в культуральной жидкости продуцентов.

4.Подтверждение физиологической активности полученных препаратов.

Физиологическая активность полученных препаратов гиббереллипов А4 и А7 была подтвеждена в биотестах на удлинение первого междоузлия проростков огурца.

Табл.4.

Действие гиббереллинов А4 и А7 на удлинение первого междоузлия проростков огурца (в % к контролю).

Концентрация, М А4 А7

-7

3.0 х 10 111 119

-6

1.5 х 10 126 132

-6

3.0 х 10 135 208

-5

1.5 х 'Ю 161 199

-5

3.0 х 10 140 204

Результаты биотестов (табл.4) показали высокую физиологическую активность полученных А4 и А7, при этом физиологический эффект А7 был значительно выше.

Активность полученного препарата АБК была испытана при в биотесте на ингибирование прорастания семян горчицы. Использовали растворы АБК концентрацией 5x10 6 и 105. Процент проросших семян горчицы за 17 часов инкубирования составил 48% и 19% от контроля, соответственно, что подтвердило данные литературы (Коф и др.,1973).

Таким образом, были разработаны биотехнологическив способы получения индивидуальных гиббереллинов А4, А7 и АБК путем микробного синтеза, включающие получение активного штамма-продуцента, условия культивирования продуцента, обеспечивающие направленный синтез индивидуальных гиббереллинов и АБК, и эффективный способ выделения фитогормонов из культуральной жидкости продуцента.

вывода

1 .Проведен скрининг грибов-продуцентов фитогормонов терпеноидеой природы: гиббереллинов А4, к! и абсцизовой кислоты. Осуществлена идентификация индивидуальных гиббереллинов, образуемых 25-ю штаммами Р.гпопШГогше; при этом впервые выявлены штаммы, способные к преимущественному синтезу гиббереллинов А4 и А7. На основании изучения биосинтетической активности 5-ти видов рода Сегсозрога, выявлен продуцент АБК - гриб С.гоз1со1а, отобрана линия с повышенной 'активностью и показана стабильность ее свойств при длительном хранении и пересевах.

2.Разработана методика получения и регенерации протопластов отобранных штаммов Р.шопИИогше, использование которой позволило получить штаммы-продуценты А4 и А7 с повышенной биосинтетической активностью. В результате проведенных экспериментов по повышению активности штамма Р.топШГогте - продуцента АЗ был подтвержден мутагенный эффект 7-лучей и при использовании разработанного экспресс-метода полуколичественного определения активности получен вариант мутагенизированнсй популяции с гиббереллинсинтезирующей активностью, на 46% превышающей активность исходного штамма.

3.Выявлены закономерности микробного синтеза гиббереллинов А4 и А7 полученными штаммами-продуцентами. Изучена зависимость этих процессов от основных условий культивирования: состава ферментационной среда, длительности культивирования, начального рН среда, температурного режима и освещения. Выявлены факторы, регулирующие соотношение А4/А7 в культуральной жидкости продуцентов и на этой основе разработаны способы направленного синтеза индивидуальных гиббереллинов, обеспечивающие их преимущественное накопление в культуральной жидкости продуцентов. Применительно к полученной линии штамма-продуцента АЗ проведена оптимизация состава ферментационной среда с использованием методов математического планирования эксперимента, позволившая увеличить концентрацию АЗ на 30-35%.

4.Изучена зависимость биосинтеза АБК от основных условий культивирования С.гоз1со1а. Предложен способ микробного синтеза АБК, позволяющий значительно сократить длительность процесса ферментации по сравнению с описанными в литературе способами микробного синтеза без снижения концентрации целевого продукта. Разработаны условия вегетативного размножения и длительного

хранения С.гоз1со1а без потери биосинтетической активности.

5.Разработав сорбционный способ выделения гиббереллина А7 и АБК непосредственно из культуральных фильтратов грибов-продуцентов при использовании сорбционной смолы типа Полисорб и модифицирован экстракционный способ выделения А4. Получены высокоочищенные препараты индивидуальных гиббереллинов А4. А7 и АБК при помощи методов ТСХ и ВЭЖХ с содержанием действующего вещества 85-95%.

1.Myrontzev G.S. .Krasnopolskaya L.M..Sokolova L.M.,Makeeva A.P., Gorbatyuk M.S..NagubnoYa L.A. Terpenoid plant growth regulators produced by phytopathogenic fungi. In Abstracts: 14th International Conference on Plant Growth Substances.Amsterdam, July, 21-26, 1991, p.21.

2.Краснопольская Л.М.. Садовская В.Л., Нагубнова Л.А., Макеева А.П., Соколова Л.II. Муромцев Г.С. Микробный синтез гиббереллинов ГА4 и ГА7 штампами F.monlllforroe. В сб: Микроорганизму в сельском хозяйстве. Тезисы докладов 4-й Всесоюзной научной конференции, Пущино-на-Оке, 1992, стр.91.

3.Макеева Д.П..Соколова Л.М..Русинова М.И., Краснопольская Л.М., Муромцев Г.С., Приеде М.А. Характеристика поцессов микробного синтеза гиббереллинов A3, М и А7 штаммами F.monilllorme. В сб: Регуляторы роста и развития растений. Тезисы докл. 11 конференции, Москва, 1993, ч.1, стр.46.

4.Решение о выдаче патента РФ ча изобретение от 27.11.1995 по заявке N 5062366/13 МПК6 от 16.09.92. Штем гриба Сегсозрога вр. -продуцент фитогормона абсцизовой кислоты. Муромцев Г.е., Краснопольская Л.М., Макеева А.П., Нагубнова Л.А.

5.Решение о выдаче патента РФ на изобретение от 27.11.1995 по заявке N5062354/13 МПК6 от 16.09.92. Способ получения абсцизовой кислоты. Муромцев Г.С., Краснопольская Л.М., Макеева А.П.

6.Решение о выдаче патента РФ на изобретение от 13.03.1996 по заявке N5062390/13 МГПСб от 16.09.92. Способ выделения абсцизовой кислоты. Муромцев Г.С. .Краснопольская Л.М. .Кобрина Н.С. .Макеева А.П.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.