Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ действия ретардантов на микробный синтез физиологически активных терпеноидов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ действия ретардантов на микробный синтез физиологически активных терпеноидов"

I ^ 3 '

Всесоюзный научно-исследовательский инст!гтут сельскохозяйственной биотехнологии

На правах рукописи

НАГУБНОВА Лилия Алексеевна

Сравнительный анализ действия ретардантов на микробный синтез физиологически активных терпеноидов. ( 03.0023 - биотехнология )

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1592

■ Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии.

Научный руководитель

академик ВАСХНИЛ Г.С.Муромцев

Официальные оппоненты

доктор биологических ваук, гпххЬессор Л Л Воробьева

кандидат билогнческих наук В.ГДжавахия

Ведущее учреждение

Институт биохимии им. А.Н.Баха

Защита состоится

1992 г. в

час. на

заседании специализированного совета Д 020.40.01 при ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии ( 127253, Москва, улЛсковская, д.12, корп. 4 )

. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

■ Автореферат разослан _1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук СА.Меликова.

| ОП1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

" " | Актуальность темы. Общеизвестная жизненноважная функция ^еЬпеноидов, играющих значительную роль во многих процессах ""ЧЯВгаболизма, обуславливает принципиальное значение, соединений, способных регулировать их биосинтез. При этом важен как поиск новых регуляторов, так и всестороннее изучение уже известных.Общензвестно, что универсальных регуляторов биохимических процессов нет, и одни и те же вещества могут выступать одновременно и как ингибиторы н как стимуляторы. Работы, связанные с изучением универсальных регуляторов терпеноидного биосинтеза, могут объединять различные направления биотехнологии и выполняться на стыке наук.

Учитывая общность пути биосинтеза у растений п грибов, можно предположить, что вещества, регулирующие этот путь вторичного метаболизма у растений, будут оказывать аналогичное действие на микроорганизмы и наоборот. Имеющиеся ' экспериментальные подтверждения такого факта позволяют значительно расширить методическую оснсру проводимых исследований.

В связи с этим грибы—макро продуценты .физиолопгческп активных веществ можно рассматривать не только как обЪект биотехнологии их получения, но и как модель для изучения регуляции биосинтеза этих соединений.

Анализ литературы позволил предположить,что веществами, способными регулировать биосинтез терпеноидов, могут быть ретарданты — синтетические регуляторы роста растений, проявляющие антагиббереллнновый эффект как о растениях, так и в грибах. ■

Предпринятая в настоящем исследовании разработка микробных моделей позволила впервые комплексно п широко изучить воздействие ретардантов на биосинтез терпеноидов. Важность этой работы связана с большим практическим значением ретардантов, что требует разработки эффективных приемов их применения на основе всестороннего изучения воздействия ретардантов на растительный организм.

Проеденное исследование имеет большое значение для биотехнологии получения физиологически активных терпеноидов.

Представленная к защите работа является частью плановой темы лаборатории прикладной микологии ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

I.

Цель и задачи исследований. Целью работы явилось исследование действия ретардантов на биосинтез физиологически активных терпеноидов в культурах микроскопических грибов-продуцентов.

В задачу работы входило:

•И'азработать микробиологические модели биосинтеза дитерпенов, тритерпенов, сесквитерпенов и тетратерпенов применительно к задачам исследования.

2.Установпть основные закономерности действия ретардантов на микробный синтез физиологически активных терпеноидов и изучить его зависимость при различных условиях культивирования для ряда продуцентов (состав сред, длительность ферментации, время внесения ретардантов и их концентра -ция, условия освещенности).

3. Сопоставить полученные результаты с данными литературы и составить на этой основе гипотетическую схему прерывания микробного синтеза терпеноидов под воздействием ретардантов.

4. На основе полученных данных разработать рекоменда-. дци по оптимизации биотехнологии получения индивидуальных

веществ, на примере фузикокцина.

Научная новизна и практическая значимость работы. ■ Впервые поставлена и осуществлена задача комплексного ' изучения действия ретардантов на биосинтез • терпеноидов, Позволившего выявить ингибиторную способность ряда ретардантов воздействовать на образование фузикокцина, трихо— тецина, фузидина и й-каротина. Впервые показано изменение качественного состава фузикокцинов под влиянием ретардантов.

Экспериментальный результат и данные литературы обобщены в гипотетической схеме.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности Использования в микробиологических исследованиях ретардантов как инструмента регуляции биосинтеза терпеноидов, что может быть использовано при усовершенствовании биотехнологии .получения физиологически активных терпеноидов, например, индивидуальных фузикокшноа

Результаты проведенных исследований вносят определенный вклад в понимание процессов воздействия ретардантов на терпеноидяый шунт л представляют практический интерес как для разработки методических рекомендаций по применению ретардантов в растениеводстве, так и для создания новых

ретардантов с избирательным спектром действия.

Апробация работыДиссертацнонная работа обсуждалась на расширенном заседании отдела регуляторов роста растений ВНИИ СБ. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции по регуляторам роста растений (ФРГ, 1985), на 1У Всесоюзной конференции по управляемому культивированию микроорганизмов ( Пущино-на-Оке, 1986), на Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Москва, 1986), на конференции молодых ученых ВНИИСБ (Москва, 1986), на совещании "Научные и практические основы применения регуляторов роста растений в интенсивных технологиях" (Ялта, 1986), на П Всесоюзной конференции по регуляции роста и развития растений (Киев, 1988), на ГУ Международном микологическом конгрессе (ФРГ, 1990).

Публикации. По результатам выполненных исследований опубликовано 11 печатных работ.

Структура и обЪем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов п методоз исследования, изложения результатов исследования, заключения, выводов И списка цитированной литературы. Работа изложена на 89 страницах машинописного текста, содержит 8 рисунков и 17 таблиц. Список литературы включает 96 наименований, из них 83 работы зарубежник авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Использованные в работе культуры грибов-продуцентов физиологически активных терпеноидов представлены в таблице 1 Культуры грибов поддерживали на агариэованных средах, жидкий посевной материал выращивали погруженно в 700-мл колбах со 100 мл среды, для ферментации использовали пробирки диаметром 20 мм с 10 мл среды, 1и каждый вариант опыта брали по 3 пробирки (повторности). Культивирование проводили на ротационных качахках (240 об/мин). Используемые среды отвечали двум условиям: синтезировалось достаточное для определения количество терпеноидов и жидкие среды являлись истинным раствором. Условия погруженного культивирования: рН сред, хлительность ферментации, температура обеспечивали максимальное накопление физиологически активных терпеноидов.

Действие света изучали на стационарной культуре. Освещенность была постоянной - 2000 люкс.

В экспериментах использовали ретарданты —

Табл.1. Микроскопические грибы - продуценты физиологически активных терпекоидов.

класс кол. вещество продуцент

изопр.

едиши

сескви- 3 абсцизовая Cercospora rosicola

терпены кислота(АБК)

3 трихотецин Tricholhecium roseum

дитерпены 4 фузикокцин(ФК) Fusicoccum amygdali

4 габбереллш1(ГК)С!ЬЬе1е11а fujilcuroi

тритериепы 6 фузидин Fusidium coccineum

тетратер -

пены 8 ß-каротин Blakeslea trispora

ингибиторы биосинтеза гиббереллина: ССС (хлорхолинхлорид), АМО-1618(2-шопропнл-4~димет11ламино-5-метилфенил-1-пипери-даний харбоксилат метил хлорид), пике (1,1-диметилпипе-ридавий хлорид), морфол (1,1-ишетилморфолиний хлорид), РР 333 - паклобугразол (2 RS3 К5-1-(4-хлорофенил)-414-ди-метил-2-(1,2,4-триазол-1-ил)пентан-3-ОЛ). Навеску ретар -даятов стерилизовали этанолом, растворяли в стерильной воде и полученный раствор добавляли в ферментационную среду одновременно с инакулюмоы таким образом, чтобы итоговая концентрация ретарданта составила Ю ^нли 10"' M, РР 333 изучали так же в диапазоне концентраций от 10 5до 10"6М. Контролем служил водный раствор этанола соответствующей концентрации.

Концентрации фуэикокцина, гиббереллина, абсциэовой кислоты, трихотецина, ß-каротина в культуральной жидкости определяли спектрофоггометрически, а фузидина - методом биологического титрования (Evidente ел.,1979, Краснопольс-кая и др,1984; Муромцев, Агнистикова, 1973; Norman £¿,1981, Патгорак, 1963; Thomas, Goodwin, 1967, Регламент по производству фузидина, 1988).

Проведенные нами эксперименты показали, что добавление ретардантов или этанола не влияло на точность методов определения терпенондов.

Показатель регуляггорного воздействия ретардантов

определяли следующим образом. Рассчитывали количество каждого вещества, приходящееся на единицу воздушно-сухой биомассы продуцента. Приведенный расчет позволял избежать ошибки, связанной с естественношг флуктуацией накопления биомассы. Отношение этих величин в опытных вариантах к контрольным служило показателем действия ретардантов (% к контролю). Учитывал!! результаты только тех опытов, в которых рост грибов в присутствии ретардантов соответствовал контролю и исключали вариа!ггы опытов, где рост гриба-продуцента был угнетен.

Статистическая обработка результатов. Каждый опыт проводили от 2 до 10 раз в Зх-крлтной биологической пооторности. В таблицах приведены средние арифметические из нескольких опытов, обсуждаются различия между вариантами, достоверные при 5%-ном уровне значимости.

Воздушно-сухую биомассу грибов-продуцентов (на синтетических средах) и сырую биомассу (на среде с соевой мукой) определяли весовым метеодом.

Конечный рН культуральной жидкости - с помощью иокомера универсального ЭВ-74.

Качественный анализ фузикокцинов проводили методом масс-спектрометрии вторичных ионов на приборе масс-спектрометр М-80А, снабженном компьютерной системой обработки данных М-003 (Hitachi, Япония) (Садовская н др, 1986).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. Накопление физиологически активных терпеноидов (ФК и П<) в культуральной жидкости.

Исследуя влияние ретардантов на микробные модели, представляло интерес рассмотрение действия химических соединений данного типа на динамику накопления физиологически активных терпеноидов - ФК и ГК в культуральной жидкости.

Для этого мы изучали процессы биосинтеза ФК и ГК в культуральной жидкости, содержащей ССС, и в контроле (без ССС) в течение 6 сутох (для ФК) (рис.1) п 8 суток (для ГКХрис2).

В ходе экспериментов было установлено, что в контроле быстрый синтез ФК приходится на 2 сутки ферментации гриба-продуцента (между 2-J и 48 часами). Максимальное количество ФК накапливается а культуральной жидкости к 3

Накопление в ферментационной среде 1)ФК и 2)ГК в контроле и в присутствии ретарданта ССС.

суткам, остается неизменным в течение 4-х суток и, начиная с 5 суток его содержанке уменьшается.

Быстрый синтез ГК начинается на 2-3 сутки, затем с 3 до 7 суток процесс образования терпенопда замедляется, на 8 сутки достигает максимума.

При добавлении ретарданта вЛферментационную среду одновременно с иноку люмом наблюдали выход кривой накопления ФК на стационарный уровень на 2 сутки. В последующие сутки содержание ФК не изменялось. Аналогичная картина наблюдалась . при накоплении ГК в присутствии ССС.

Полученные результаты имеют важное значение с точки зрения отработки методов методических приемов использования микробных моделей для изучения влияния ретардантов на биосинтез терпеноидов. Стабильные воспроизводимые результаты могут быть получены только в том случае, если длительность процесса ферментации обеспечивает максимально возможное накопление продуктов в культуральной жидкости. При несоблюдении этого условия показатель "процент к контролю" сильно искажается.

Влияние ретардантов на биосинтез физиологически активных тер пеноидов.

В настоящей работе было изучено воздействие 5 ретардантов на микробный синтез'физиологически активных терпеноидов: АБК, ГК, ФК, трихотецнна, фузндина и ^-каротина. Проведенные эксперименты показали, что из пяти изученных ретардантов паклобутразол и АМО-161Х оказывали в некоторых стуча« токсическое действие на грибы-продуценты.

Так как РР 333 в концентрациях 10 и 10 М проявлял фунгистатическую активность по отношению к грибам Grosicola, G. fujikuroi, F. amigdali и Т. roseum, то он был испытан в более низких концентрациях 10 и 10 М, которые, не давали фунгистатического эффекта.

О действии AMO-1618 на образование АБК судилии по концентрации Ю-^ М, tjc. при концентрации Ю-"' М угнетался рост гриба С. rosicola.

Во всех остальных случаях биомасса в опытных и контрольных вариантах была практически одинакова.

Конечный рН культуральной жидкости при выращивании грибов в присутствии ретарданта варьировал' следующим образом. Значение рН культурального фильтрата при биосинтезе АБК, ФК и Р-каропша в опытных вариантах было чуть ниже контрольного значения. При биосинтезе трихотецина, фузиднна и в ряде случаев ФК значение рН было близко к контролю, а при синтезе ГК значение рН увеличивалось в сравнении с контрольным вариантом.

Данные по воздействию ретардантов на биосинтез физиологически активных терпеноидов приведены в табл. 2. Нами впервые была показана способность ряда ретардантов ингибировать микробный синтез ФК, трихотецина, ^-каротина п фузидяна. Протестированые ретарданты влияли также на биосинтеза АБК и ГК.

Все ретарданты по-разному влияли на образование изученных терпеноидов.

.Наиболее сильный ретардантный эффект был выявлен у РР 333. Как было сказано выше, паклобутразол в концентрациях 10"'' и Ю-4 М подавлял рост отдельных грибов-продуцентов. При концентрации 10-"* М фунгицякный эффект РР 333 исчезал и четко проявлялось резкое снижение концентраций всех физиологически активных терпеноидов.

ССС - второй из изученных ретардантов по силе ингибиторного эффекта. В наибольшей степени он подавлял биосинтез ГК, в наименьшей - ФК.

Пике также сильнее всего ингибировал ферментативный синтез ГК, что очень хорошо видно при его концентрации 10~*М.

Морфол в этой же концентрации влиял на образование ГК, но не подавлял синтез ФК, АБК, трихотецина и фузндина, хотя в концентрации М проявлял ингнбирующий эффект для

7

Влияние ретардантов на микробный синтез терпеноидов.

Таблица 2.

Ретардант Кснц. м Класс литер-пени - Класс сескви-тергтены Класс тетра-терпенк Класс тритег)-' ■ пеки

Ж ГК Abrí трихс-тештк {¡-каротин фу 3 шин

ч к контролю

ССС 10"° 47 15 27 32 34 42

ТО"4 63 21 31 35 72 51

Aíi'O *' 6t S ю-3 102 18 * 101 76 84

ю-4 102 35 26 116 107 93

пжс 10"3 30 28 32 76 53 28

10~! 80 33 74 98 77 95

МОРФХТ to- 34 31 57 57 54 89

lo-4 103 41 102 96 82 104

Р? 333 ю-3 * * * - * 54 63

Ю-4 А * * * 59 1 «V

10-5 31 38 ' 30 ' 67 64 79

10"6 51 47 81 88 ' 78 83

к;HT?OJS 100 100 • 100 100 100 1С0

* - лигиоироЕаняе роста грива-продуцента.

большинства изученных терпеноияоп.

АМО-1618 сильно подавлял синтез ГК и ЛБ!ч, слабо влиял на образование Р-каротина и фузидина и практически не оказывал воздействия на биосинтез ФК и трнхотецина.

Таким образом, все изученные ретарданты можно условно разделить на две группы:

1) пнгибирующие биосинтез физиологически активных терпеноидов,

2) ретарданты с избирательным спектром дейстБяя.

Полученные нами результаты показали, что ретарданты

способны влиять на микробный синтез физиологически активных терпеноидов. Однако, характер этого воздействия различен п зависит от концентрации ретарданта и состава ферментационной среды (таблЗ).

В литературе имеются данные о влиянии ретардантов на биоинтез АБК и ГК. Однако, подобные воздействия на бпосинтез ФК не описаны, поэтому этот процесс нами изучен подробнее.

Воздействие ретардантов на микробный синтез фузикокшшз.

Нами были выбраны для исследования ингибиторного эффекта ретардантов на биосинтез ФК две ферментационных среды: синтетическая среда Балляо (Ballio e.3-, 1968 ) и среда, содержащая соевую муку (среда 2-11ХКрасиопальская п íp, 1984).. На среде с соевой мукой обеспечивается максимальный биосинтез данного терпеноида.

Проведенное исследование выявило четкую зависимость результатов применения таких ретардантов, как морфол, пике, АМО-1618 от состава среды.

Так, морфол обнаруживал ингибнрующяй эффект лишь на среде Баллио и не оказывал никакого влияния на образование ФК на среде 2-11.

На синтетической среде Баллно было сильнее выражено пнгибрукяцее действие пикса. На среде, содержащей соевую муку, пике в концентрации 10 М ингибировзл енптез ФК, а в 10 М оказывал небольшое стимуляторное действие.

Воздействие АМО-1618 на синтез терпеноида на среде Баллло отмечено пе было. При внесении AMO- 1618 в среду с соевой мукой наблюдалась резкая стимуляция синтеза ФК. Этот эффект проявлялся только на указанной среде.

С целью изучения стимуляции синтеза ФК под воздействием АМО-1618 нами была проведена серия опытов, в том числе по

9.

Табл.3 Воздействие ряда ретардантов на биосинтез ФК на среде Баллйо и на среде 2-11.

Ре тард. Конц. М среда Баллио среда 2-11

% к контролю

ССС Ю-3 47 51

Ю-4 63 64

АМО-1618 ю-3 102 184

ю-4 102 102

Пике ю-3 30 63

Ю-4 80 121

Морфол 10"3 34 103

10"4 108 97

РР 333 ю-5 31 37

■ ю"6 51 62

Контроль 100 100

методу факторного эксперимента 2 , в котором учитывалось влияние трех факторов: глюкозы, соевой муки и АМО-1618.

Полученные данные показали, что выход ФК под влиянием оптимальных доз этого ретарданта увеличивается за счет резкого повышения продуктивности мицелия. Причем в некоторых вариантах увеличение содержания ФК в культуральной жидкости наблюдалось даже при уменьшении концентрации глюкозы на 50%. Максимальный стнмуляторный эффект АМО-1618, получений в наших опытах, составил 165-185% к контролю. Оптимальными для синтеза ФК оказались концентрации ретарданта от 2^ 10~^ до КГ3 М. По-видимому, в основе стимуляторного эффекта АМСЬ-1618 лежит его способность блокировать одну из ветвей терпеноядного синтеза , осуществляемую грибом на среде с соевой мукой, в результате чего большое количество предшественников идет на синтез ФК.

Кроме того, нами было изучено влияние низких хоицентрацнй пикса на синтез ФК на этой же среде. В результате проведенных исследований было обнаружено, что на среде 2-11 низкие концентрации ретарданта стимулировали образование ФК. Максимальный эффект наблюдался при концентрации пике 5 Ю-' М и составлял к контролю. При дальнейшем снижение концентрации ретарданта стимуляторное действие уменьшалось.

Влияние ССС на биосинтез ФК в зависимости от времени внесения ретарданта.

В главе "Материалы и методы" указано, что при определении воздействия ретардантов на микробный синтез терпеноидов, ингибиторы вносили в ферментационную среду одновременно с инокулюыом. При изучении биосинтеза ФК рассматривалось также влияние ССС в зависимости от времени внесения ретарданта.

Ретардант вносили: одновременно с инокулюмом, на 5, 23, 30, 47, 54, 73 часы ферментации. Контролем служило накопление ФК в культуральной жидкости без ретарданта (рисЗ ).

Полученные результаты показали, что по эффекту на биосинтез ФК изученные сроки внесения ССС можно разделить на 2 группы: от внесения ретарданта одновременно с инокулюмом

ФК % к конт.

100 75

контроль (без ССС)

50

25 п

о Ш—Щ III—и-„

5 23/30 47/54 72

время ферментации, часы РисЗ Влияние ССС на накопление ФК в культуральной жидкости в зависимости от времени внесения ретарданта.

(0 часов) до 23 часов ферментации и от 30 до 73 часов.

Согласно данным опыта, процент ингибировани* синтеза ФК пр внесении ССС на 23 час ферментации а 2 раза больше, чем при 30-часовом внесении. Это свидетельствует о том, что промежуточная реакция биосинтеза ФК, на которую воздействует ССС. в основном протекает именно в этот период.

Действие ретардантов на качественный состав фуэикокцинов.

Известно, что ретарданты способны изменять качественный состав гиббереллинов (Hedden е.а,1У78).Поскольку Аю фьнпвфдш синтезирует ряд метаболитов фузнкокциновой природы (ВаШо е. а,1971), нами было изучено воздействие ретардантов на качественный состав фузикокцинов при культивировании продуцента на средах Баллио и 2-11.

Полученные данные, приведенные в таблице 4 , свидетельствуют об изменении композиции фузикокцинов под воздействием ретардантов.

Проведенные исследования показали, что при воздействии ретардантов на синтез физикокцинов на среде Баллио из смесей исчезают минорные фузикокцины.

При этом ССС оставляет соотношение ФК А и ФК Д почти таким же, как в контроле, а содержание ФК С увеличивается.

При добавлении РР 333 в культуральную среду происходит изменение соотношения ФК А и ФК С в пользу первого. .

Морфол влияет иначе на смесь фузикокцинов, при этом количество ФК А уменьшается, а ФК С и ФК Д возрастает.

Пике вообще иигибирует образование ФК А, резко увеличивает содержание ФК С и ФК Д.

АМО-1618 не влияет на суммарный выход фузикокцинов на среде Баллио, однако, количество ФК А при этом возрастает почти в 2 раза по сравнению с контролем, тогда как концентрация ФК С и ФК Д несколько уменьшается.

На среде, содержащей соевую муку (2-Щ изменение качественого состава фузикокцинов носит иной характер.

ССС и пике практически не изменяют качественный состав фузикокцинов, оба ретарданта одинаково подавляют синтез ФК А и ФК С.

Морфол ингибирует синтез минорных фузикокцинов. При этом соответственно возрастают в смеси доли ФК А и ФК С Содержание ФК Д остается на уровне контрольного. Следует отметить, что изменение качественного состава фузикокцинов под действием морфола не сопровождается изменениями общего содержания фузикокцинов.

АМО-1618 резко увеличивает количество фуэикокцинов на среде 2-11, при это*! концентрация ФК А возрастает в 3 раза.

12. .

Качественный состав фузикокшшов при культлвирсБЕша У-опи^ааП в прксутсзии ретардантов и в контроле.

Таблица 4.

Ретгшдант Кон- Среда Баллио

цент- -

рация, Фузиокшпш, мг/мг с.б. И -

Среда 2-11-

Фупиокциш, мг/мг с.а.

А' С

Б J Н

16-0- А де метил J

С

Б

Н 16-0-деме-тил J

Контроль 17,0 16,5 п с ** « о 2.0 4.8 4,2 30,0 18,0 3 .5 3.5 7,0 5.0

ССС 10"3 10.0 11.0 1.0 - - 15,0 14.0 1, п \ ^ 1 ,3 2.4 -

РР 333 • 10"5 Э,0 5,0 - 1,0 - - 16,0 9,0 - - -

Морфол . п 10 ° 4.0 10,0 2.0 - - - 37,0 24,0 4, ,0 - - -

Пике 10 " .- 10,0 4.0 - - - 15,5 15,0 2, ,0 1 ,5 4,5 3,5

АМО-1618 ю-3 31,0 11,0 1.0 5.0 - - 92,0 14,0 8,0 4,0 -

( см. табл. 4 ).

Влияние света на содержание фитогормонов в культуральной жидкости в присутствии ретардантов и в контроле.

Известно, что свет влияет на биосинтез терпеноидов, поэтому было проведено сравнительное изучение действия ССС и морфола на образование фитогормонов на свету и в темноте (табл. 5 ).

Было выявлено, что морфол в концентрации 1(Г М оказывал фунгистатическое действие на стационарную культуру грибов-продуцентов С.го5ко1а и Р. ап^сЫк Поэтому о его влиянии судили по концентрации 10 ^М. В остальных случаях биомасса в опытных и контрольных вариантах была практически одинакова.

В наших опытах впервые было показано стимуляторное действие света на образование ФК, увеличение его концентрации составило 22%. Ретарданты подавляли биосинтез ФК на свету и в темноте. Однако эти ретарданты полностью не снимали стимуляторного действия света, концентрация ФК в культуральной жидкости в присутствии ретардантов на свету была выше, чем в темноте.

При изучении влияния ретардантов на синтез АБК и ГК было обнаружено, что испытуемые ретарданты ССС и морфол полностью снимали стимулирующее действие света и ингибировали образование этих фитогормонов в культуральной жидкости.

Таблица 5.

Воздействие ретардантов на биосинтез фитогормонов на свету и в темноте.

Ретард,

M

Конц

свет темно- свет темно- свет темно

та та та

мг/мг сухой биомассы

ХС лорфол

10' 10" 10" 10'

F31

-3

11,05 Ш 8,45 7,45 3,80 2,95

12,95 2,45 12,70 7,90 4,50 4,85

угнетение роста угнетение роста2,90 2,75

2,80 2,10 12Д) 9,80 3,75 3,85

контроль

4,10

330 17,00 14,00 10.10 7.85

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В настоящей работе проведено сравнительное изучение действия ретардантов (ССС, АМО-1618, РР 333, 1,1-диметилпиперидиний хлорид (пике), 1,1-диметилморфолиний хлорид (морфол) на микробный синтез терпеноидов: абсцизо вой кислоты,трихотецина, фузидина, гиббереллина , фузикокцнна и р-каротина.

Известно, что прерывание биосинтеза ГК под воздействием ССС и AMO—1618 определяется их способностью блокировать реакцию циклизации геранилгеранил пирофосфата н :сопалил Пирофасфат;РР 333 препятствует окислению энт-каурена •i энт-кауреновую кислоту. Таким образом, на начальные стадии терпенсидного синтеза, включая образование

фарнезил пирофосфата и геранилгеранил пирофосфата, эти ретарданты не влияют. Сопоставление полученных нами результатов с даными литературы заставляют предположить, что эти ретарданты имеют более, чем одно место действия и способны воздействовать на различные участки терпеноидного биосинтетического пути. При этом ннгибирование биосинтеза АБК, трихотецина и фузидина под воздействием ССС и РР 333 происходит после стадии фарнезил пирофосфата,а биосинтеза ФК и p-каротина - после стадии геранилгеранил пирофосфата.По сравнению с ССС и РР 333, АМО-1618 обладает более избирательным характером действия, прерывая синтез АБК после стадии фарнезил пирофосфата, ГК и ^ -каротина -после стадии геранилгеранил пирофосфата,но не препятствуя превращениям, ведущим к образованию ФК, фузидина и трихотецина.

Таким образом, в результате проведенной работы предложена схема возможных мест действия изученных ретардантов на микробный синтез физиологически активных терпеноидов( Схема 1).

Полученные результаты позволя)от использовать ретарданты как инструмент для регуляции биосинтеза терпеноидов, что может быть использовано как в теоретических исследованиях, так и при оптимизации биотехнологий их получения.

Несомненное практическое значение может иметь установленный факт стимуляции микробного синтеза фуэнкокцина под воздействием АМО-1618 и пнкса.Внесение АМО-1618 в ферментационную среду приводит к повышению продуктивности мицелия и увеличивает концентрацию фузикокшшов в

ССС, РР 333

ФУЗИДИН

МЕВАЛОНОВАЯ КИСЛОТА

I

ФАРНЕЗИЛ РР

'—> ССС, АМО-1618 АБСЦИЗОВАЯ КИСЛОТА

ССС, РР 333 ТРИХОТЕЦИН

ССС, АМО-1618, РР 333с

7

Р-КАРОТИН

ГЕРАНИЛГЕРАНИЛ РР

ССС, РР 333

<

ФУЗИКОКЦИН ССС, АМО-1618 ЭНТ-КАУРЕН

1

РР 333

ЭНТ-КАУРЕНОВАЯ КИСЛОТА

ГИББЕРЕЛЛИН

Рис. 8. Прерывание биосинтеза физиологически активных терпеноидов под действием ретардантов

-О о—~ предполагаемые места действия

-1 |--экспериментально устаноатенные места действия

культуральной жидкости в 1,6-1,8 раза.

Выявленные закономерности воздействия ретардантов на качественный состаа и количественное соотношение фузнкокцинов в культуральной жидкости позволяет получать целый спектр

,данных веществ микробиологическим путем. Установленная стимуляция биосинтеза фузикокцинов в зависимости от концентрации ретардантов, времени их внесения, а также состава ферментационных сред и условий освещенности может быть использована при оптимизации микробиологического способа получения индивидуальных фузикокцинов. Разработка таких способов очень важна, так как способы химического синтеза физиологически активных соединений, их очистки и разделения "раине затруднительны и дорогостоящи.

ВЫВОДЫ.

1.Разработаны микробиологические модели биосинтеза физиологически активных терпеноидов: подобраны культуры ¡рлбов-макропродуцентоа сескви-, ди-, три- и тетратерпенов, условия их культивирования, методы количественного и качественного определения терпеноидов. Обоснованы широкие возможности этих моделей'для изучения влияния ретардантов на биосинтез ЛЕК, трихотецина, фузвдина, ФК, ГК и ^-каротина.

2. Впервые показано влияние ретардантов на биосинтез фузикокцина ( продуцент - И. ату£()а1!), трихотецнна (продуцент — Т.го5еит ),фузидкна (продуцент — р.сосстеит), Р-каротана ( продуцент - В. 1шрога ). Подтверждено ингибиторное воздействие ретардантов на биосинтез АБК (продуцент - Сгоз1со1а ) и ГК ( продуцент - О. ГиДипм).

Установлена зависимость ингибиторного эффекта ретардантов на биосинтез изученных терпеноидов от их концентраций. Показано, что наибольшей ингибиторной способностью обладают РР 333 и ССС.

Изучено влияние ретардантов на образование ФК и ГК от длительности ферментации.

Исследовано действие ретардантов на синтез ФК в зависимости от времени их внесения и состава ферментационных сред.

3). На основании полученных результатов все изученные ретарданты можно разделить на две группы:

а)ретарданты, ингибирующие биосинтез изученных терпеноидов: ССС, РР 333 и пике,

б)ретарданты с избирательным спектром действия: АМО-1618 и морфол.

4) Предложена схема прерывания биосинтеза физиологически активных терпеноидов под воздействием

17.

ретардантов, включающая наиболее вероятные места действия ретардантов.

5). Впервые показано стимуляторное действие света на биосинтез ФК, подтверждено его положительное воздействие на образование АБК и ГК. Установлено, что ретарданты способны целиком снимать действие света на образование АБК и ГК и лишь частично на биосинтез ФК.

6). Впервые выявлена способность ретардантов влиять на качественный состав и количественное соотношение фузикокцинов в культуральной жидкости. Изменения спектра фузикокцинов зависят от свойств испытуемых ретардантов и состава ферментационных сред. Показана возможность использования ретардантов для направленного синтеза индивидуальных фузикокцинов.

7). Впервые обнаружено стимуляторное действие АМО-1618 и низких концентраций пикса на образование ФК. Установлена его зависимость от условий культивирования, выявлены оптимальные концентрации ретардантов. Максимальное увеличение содержания ФК в культуральной жидкости под воздействием АМО-1618 составляет 65-85%, а пикса - 35-40%.

Список опубликованных работ:

1. Muromtzev G.S.,Krasnopolskaya l.H.,Nagubnova I.A., Effects of growth retardants on the microbial synthesis of physiologically active terpenoids. In: 12th' International Conference on Plant Growth Substances. Heidelberg, August 26-31, 1985, p.19.

2. Краснопольская Л.М, Нагубнова ЛА„ Муромцев Г.С. Ретарданты как регуляторы микробного синтеза физиологически активных терпеноидов. В сб: 1У Всесоюзная конференция "Управляемое культивирование микроорганизмов". Тезисы докладов, Пущино-на—Оке, 1986, с. 81-82.

3. Краснопольская Л.М, Нагубнова ЛА„ Муромцев Г.С. Сравнительный анализ действия ретардантов на микробный тсинтез регуляторов роста растений терпеноидной природы. В сб: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. Тезисы докладов Ш Всесоюзной научной конференции. М, МГУ, 19S6, с. 106.

4. Муромцев Г.С, Краснопольская Л.М, Нагубнова Л А. Воздействие ретардантов и цитокининов на микробный синтез регуляторов роста растений терпеноидной природы. В сб: Витамины и фитогормоны в растениеводстве. Тезисы республиканской научной конференции. Вильнюс, 14Sf>, c.S2-84.

т.

5. Нагубнова - Л А,- Краснопольская Л.М. Ретарданты и регуляция микробного синтеза терпеноидов. В сб: Современные проблемы биотехнологии микроорганизмов. Тезисы докладов конференции молодых ученых. Рига, 1987, с.149.

6. Муромцев Г.С, Краснопольская Л.М., Нагубнова ЛА, Макеева А.П. Сравнительный анализ действия ретардантов на микробиологический синтез физиологически активных терпеноидов. Материалы П Всесоюзной конференции по регуляторам роста и развития растений. Киев, 25-27 мая 1988, с. 265.

7. Муромцев Г.С, Краснопольская Л.М, Нагубнова Л.А. Взаимодействие ретардантов и цитоышинов с физиологически активными терпеноидамп. В сб: Регуляторы роста растений (сборник научных трудов)./ ВНИИСБ, ВИР. Л., 1989, с. 82-86. 3. Муромцев Г.С, Павлова З.Н, Краснопольская Л.М, Нагубнова ЛА. Взаимодействие ретардантов с физиологически активными терпеноидами. Известия АН СССР. Сер. биол, 1939, Я; 1, с. 116-123.

9. Muromtzev S.S., Krasnopolskaya L.M., Nagubnova L.A., Sokolova l.H. Physiologically active terpenoid metabolites of fungi. In: Fourth Intternatlonal Mycologlcal Coungress (IMC4), Abstracts, Regensburg, FRG, 28th August-3rd September, 1990, p.246.

10. Муромцев Г.С, Краснопольская Л.М, Кобрина Н.С, Горбатюк М.С, Соколова Л.М, Макеева АЛ, Нагубнова ЛА. Направленный микробиологический синтез терпеноидных регуляторов роста растений. Материалы рабочего совещания по программе "Регуляторы роста и развили растений", Москва, 16-18 июля 1991 г, с50.

И. Muromtzev G.S., Krasnopolskaya L.M., Sokolova L.M., Makeeva A.P., Gorbatjuk M.S., Nagubnova L.A. Terpenoid plant growth regulators produced by phytopathogenlc fungi. In: abstracts 14th International Conference on Plant Growth Substances, Amsterdam, July 21-26 1991, p. 56.