Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробный синтез регуляторов роста растений терпеноидной природы грибами класса DEUTEROMYCETES

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Микробный синтез регуляторов роста растений терпеноидной природы грибами класса DEUTEROMYCETES"

11 ** **

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи КРАШОПОЛЬСКАЯ ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА

УДК 582.288:[577.127.4+577.175.1]

МИКРОБНЫЙ СИНТЕЗ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ ТЕРПЕНОЙДНОЙ ПРИРОДЫ ГРИБАМИ КЛАССА БеШеготусйев.

03.00.24 - микология 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ -диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук"

МОСКВА 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РДСХН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е.П.ФЕОФШЮВА

доктор биологических наук, профессор О.Л.ОЗЕЕЕЦКОВСКАЯ

доктор биологических наук, профессор, академик МИА В.М.КАНГЕРЕ

Ведущее учреждение: "Московская сельскохозяйственная академия им. К.А.Тимирязева, кафедра сельскохозяйственной биотехнологии.

Защита диссертации состоится "О 1995 г. '

в час .на заседание специализированного совета Д.053.05.65 при'Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова.по адресу: 119899 Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический фактультет. " ' '

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " I ^ ** М С'-^ру-м к-1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук С.Н.Лекомцева

Общая- характеристика работа

Актуальность проблемы. Интенсивные- исследовании,' ведущиеся последние десятилетия в области- химической - регулнцаи роста и продуктивности растений, • • отражают ванное • значение' рострегулирущих соединений - как неотъемлемых - -• элементов интенсивных технологий возделывания " сельскохозяйственных .культур * -и ' существенных^" факторов дальнейшей - интенсификации- сельского ' хозяйства^ На-"- применении- "регуляторов- - роста- -растений,.■-. прецдэ- -всего фггогорионоз, ' базируется- \ новейшие-"---" биатехккгагнческнг-; -отрасли, связанные- с использованием- кулкгур растительных-" клеток и-тканей;.-Требования- экологии; предъявляемые - как к- качеству-сельскохозяЗствешой-продукция,-. так и— к-- сохранений" окружйищей---среда,.-выводят- -на- передний^- план- применение г биосинтетических;:. регуляторов—- роста V растений," -огличапцшсея—.'.- ензкеш---" -илнг-сверхшгакики-дозами расхода;- малой--стабильностью ж токсичностью, генетической-безопасностью,' антистрессовым- характере?*"действия«. ' Принцип • химической " -- классификации биосинтетических. регуляторов роста растений - позволяет- наделить"-- грушу ■ -веществ' -терценоидной- природы, включащую, во-первых, ^Ёитогормоны: гиббереллины, абсцизовув кислоту- (АЕК), брассиностерсшда- и, во-вторых,- регуляторы- роста растений- микробного- происхоэдения: -характеризупциеся - высокой.-" и -- многосторонней- - фаяшлопической -активность& фузинокцинй- (ЕС); обнаруженные--" среди-ч метаболитов -фитопагогенного гриба Pualcoccum amygdali Del. (БаШо'. et al.., 1964 ); а такаге внеших - растений " (Муромцев," 1987), - котиленивы,. офпоболины" и др. Широкое- практическое -. применение; в- сельском-хозяйстве^- - - - нашел . " гиббереллин—. , (вшюградорство,. . картофелеводство,- семеноводство; производство солода и- др.).. Среда- " других- - представителей*- - регуляторов.' ■ роста- .- растений , терпеноидной природы - несомненный .интерес • для- - практика могут .. представлять тиббереллины.' А^-и , спектр" действия- которых" шире, а логическая активность. в раде- случаеа ш сравнению - ■ с таковой"-ig,- Ж: А,, способный* - стимулировать--.прорастание--, семян,. -вызывать-1, рпзогенеэ черенков,.. выступать-i. как -:, антистрессовый- -фактор;-ДЕК, игращая- - исключительно? важную роль^-при.- водном-"-- .стрессе- Однако, к началу наших" работ коммерческих / препаратов" перечислении; -\вып» регуляторов, доступных-- для .

сельскохозяйственного производства, .ев было.

Пер сдектннными лоточниками. получения, биосинтетичесхих • регуляторов- могут- слувить . микроорганизмы, . превде • всего фитопатогеннае. грибы класса Беигегошусегеа. Так, . получение, гиббереллина Дд базируется : на - его микробном -- синтезе-- грибам-Ризаг1иш пш111Гоппе . БЬеЫоа. (совершенная- стадия С1ЬЬеге11а 1иЗИшго1 (Бая.) Вт.). Способность К-образовании-АБК.- обнаружена, у грибов-, родов - Сегсоврога. и... Вогг11:1в -" у 'Л ¿ёпшг1я- ахгегпага ; (Филимонова¿1287; Аваап!^ е1-а!. 1977; М.ош±. е1г а1., 1093)-

| • Гиббереллиы- А^ обнаружен: среда продуктов . жизнедеятельности

! грибов рода Бр£асе1оша (НайегеасЬег, ге1§1ег,. 1979; ЕабвггасЬег,

1992).

Организация'новис-и, модернизация _ сущвствувднх: производств ; гфедусмгтрззяег :гзучгниег--занашигерн0стей',- ишгго&зого- аанэеза- • и,

разрабатку совреманниг биотехнологий:, получения регуляторов роста, растений, способов, контроля и: - управления: бкотехнологкяескигж. процессами— Однако, в .. .таком: асшкте ' - осущетвязнн. только исследования*г.микробного синтеза - гиббераддиня.. Л^- (Муромцев, ; Агиистшгава, 1973; ^£Еегув, .1970;. Кишат,. Ьопвапе, 1989).

Разработка:уиювиг:гшуаения-..АБК.была ограничена,- а. основном,, сравнительны«- изрюшен-. вффектившста г нштредиэ-нтов-- питательных сред-.Шохша.еЬ 1931а, Ь;; Гакауаиа-.ег- а1.; 1983а,. Ь);

! способы направленного- синтеза .гиббереллина^.. и фузикокцишв". ш ■

■ разработаны, исследования,, .проведенные . с их - .продуцентами

базировались" на црименениигоОщеуштребвшх .в. ыикологии: сред -и. | условий.культивирования:-- грибов (ВаШо . ё1г а1», 1964-, 1968;

| Ватто«еЬ а1... 1971; БайетасЬег,. ге1е1ег,; 1979; СгаеЪе -еЪ а1.,.

1980). Рабош по.полуяешт•индивидуального., гиббереллина- Ау на \ основе, его- ыжробного-синтеза-ш известны.

| Изучение: ^научной-. и. _ патентной г. литературы ., обосновывает

| необходимость - проведении комплексного изучении:.-- микробного

I синтеза- регуляторов-, роста растений, терпеноидной.. природа.

| . поскольку проводимые • до* сиг лор- исследования посвящены отдельным

| ив таболитаи-тии» г реже,- крупная тиббврелгишв-*~ С; другой: стороны,

: особую : научную^ адхабдаод-^ Цредставашет:- получение; одного- ■ из

! метаболитов • ыногоксашонентого комплекса близкородственных

соединений, образуешхвродуцентш,-например. гибберелзшнов или

фузикокцинов: " Поскольку химическое- разделение , их смесей - — технологиче скп сложный- и • дорогостоящий лроцэсс, получение 'препаратов индивидуальных гиббереллинов ш фузисокцинов- мохет быть реализовано только на основе их ■ направленного" микробного синтеза.

•. Шли, н. задачи исследования^ . Цель работы — комплексное-исследование. закономерностей-.микробного синтеза : фзтопатогеншшг грибами класса Ве^егошусегев регуляторов- роста - -растений терпеноддной: . природы". . ж-:., создание", .научно-.. обоснованных бис технологий: ж. получения,.

Досишение . па ставленной. . цели вреду сматривало, решение следувдих задач: . .

1- Отбор перспективны!:'.тятачмоа.грибов-продуцентов гиббереллинов,. фузико1щинов и_ ассцизовой:._кислоты. ■ наг основе - - идентификации. и биотестирования. .регуляторов" роста .растений.

2. Разработка; •Еаучночобосновашой" программы! реализации- ироце ссов микробного синтеза гиббереллинов,-£БК и Ш, выявление наиболее значимых факторов культивирования продуцентов, обесточивающих направленный-- характер;, микробного .синтеза, регуляторов ". роста растений - терпэноидаой:: природа..

3. Изучение, спектров фузикокцинов, .синтезируемых - продуцентами,.. выявление:' закономерностей" регуляции'' образования -индивидуальных ^узикокцкнов-.-условияга-: культивирования Продуцента. Проведение" сравнительного изучения- . физиологического - действия ■рнгглттлщттдацмм »- пррттарр'ргги хтггтъпуът.шггу^ггтпттуъпт! - с целью

• выявления-перспективных-для. сельского хозяйства-соединений.

4. - Изучение.-. действия..: ретардантов.. —.ингибиторов образования. -гиббереллина..чка5с-ивозмокннх.".-регуляторов.-, микробного синтеза рострегутруп^их соеданений терпешидвай: природа .га такси: ряда-физаолагически..- актгоннх-.". терпввоидов,.. относящихся к . разшм-классам" терпенов..

5 Разработка лабораторных, способов направленного микробного _ синтеза'.АБЕ» гиббереллинов-А^: и- Ау. Создание, научно обосновании* биотегвшопй'. 'паят^еяшт"..-фузикокцинов - А . , л С на основе управляемого- цериодическогсгпроцесса их микробного" синтеза..

Научная" новизна. -Впервые осуществлена комплексное изучение-микробного • синтеза регуляторов •. роста растений ..тертвноидной -

природа- фитспатогенными . грабами класса Ее^агояусзъео. Разработана научно- обоснованная-ирограша -■ реализации-", процессов биосинтеза деббереллинов, АБК и ®С, учитывающая-наиболее- -важные -с • биотехнологическсй точек зрения характеристики грибов-лродуцентов и процессов их культивирования, биогенез . и химические свойства изучаемых метаболитов.

Создана-- коллекция - - фитопатогенных' - грибов класса Беи1;егощусе1:е8- - — продуцентов - регуляторов • роста растений-терпеноидной- природы:: - гибберелдинов и. ^, ЛЕК - я ФК. Штамм-макропродуцент ■ гиббереллина ¿7 выявлен впервые (параллельно с работами В.Вгискпег, Германия). Впервые описан-штамм Р.топЛИогша- . - .: макропродуцент . . гиббереллина-.- • - А^. Охарактеризован кошюнентшй- состав ивдивЕдуалБвкх' гиббереллинов и фузикокцинов; образуемых отобранными- шташамя Р.гпопИИоппэ - и Р-.ату^'йа!, . соответственю;. Впервые-- Ж индентифадированн ; в" тдзлш продуцентов.

Показана-Еасокая физиологическая активность -Ж С, В, Ни «Г, превышалцзя-в "ряде-биотестов'-таковую Ж Д. Впервые- показано антистрессовое действие ФК С, Б,. Н и -Г, способных снижать неблагощгошое действие-засолешн- (ИаС1) на прорасхание-семян- и развитие проростков.сельскохозяйственных культур. -

- Диссертационная- >. работа^ вклшает . первое. — комплексное исследование;- ретардантов' - как регуляторов , образования рострегулирузсщих веществ -и других, физиологически активных, терпеноидов грибного происхождения, относящихся к сескви-» да-, три- и тетратергенам. Предложена-гипотетическая' схемагпрерывания биосинтеза терданоидавретардазтамк. Показано изменение - спектра индивидуальных гиббереллннов-. к? ■ фузикокцинов под воздействием ретардантов. Впервые установлен стимуляторный-эффект ¿110-1618 и пикса на образование.®.

, Приоритетный • характер:-.носит- исследование- и- ' разработка способов направленного-микробного синтеза гиббереллшов А^ п Л^, «ВЕС А, О, Б, Ни АБК". Впервые- изучены- закономерности накопления индивидуальных ФК в мицелии и культуральной." зшдаостн. продуцента зг установлена зависимость этого процесса., от условий" культивирования F.aп!ygdali•. Впервые показана' возможность двухкратного сокращения . длительности. - погруженного -

культивирования продуцента .АБК- при значительном" увеличении' выхода целевого продукта.

Впервые проведено всестороннее изучение периодического процесса' погруженного культивирования Т.ащу0сЗа11. Выявленная зависимость основных . кинетических . характеристик процесса образования-- 4К от условий культивирования " продуцента использована при- разработке уцразляемшс процессов направленного синтеза ® А и С. Впервые- показана стимуляция-образования ФК под ■ воздействием видимого света...

Практическая значимость работы заключается^ во-первых,, в . разработке способов-направленного синтеза гибберэллинов к^, АуГ АБК, фузикокцинов-Аг. С, В, Н и Л" и, во-вторах, в расширении-. -спектра высокоактивных,.,; экологически - "безопасных-" регуляторов роста .растений,- в том числе-обладающих антистрессовым-характером действия; для научных' исследований и --применения- в сельском хозяйстве.

Разработаны научно обоснованные - биотехнологии- получения исследуемых веществ на основе их; направленного микробного , синтеза,, включающие ¡перспективные штаммы: грибов-продуцентов г а также оригинальные и модифицированные" высокоэффективные ферментационные -• среды", применение химических соединений (из .числа, ретардантов),. .способных менять спектр . индивидуальных гиббереллинов и ФК. или стимулировать образование - - последних, рациональные для образования целевых метаболитов значения или-профили режимных параметров ферментации, способы выделения метаболитов-из'культуральной жидкости, что в целом составляет-необходимую •-' основу для" организации производств- препаратов-.-индивидуальных' физиологически активных фузикокцинов, -гиббереляипов, АЕК. Предложенная стратегия, реализации процессов биосинтеза рострегулирущих соединений терпеноидаой природы- и - полученный обширный- экспериментальный материал могут- быть использованы при разработке ; способов направленного микробного синтеза других' биологически активных соединений-

Полученш опытных - образцов гиббереллинов А^, А^, фузикокцинов А,- С, Б, Н, <Т и АБК составило необходимую базу для -физико-химических, ■ фазиолого-биохимических--' - иссхэдований . и.' проведения - лабораторных .. и вегетационные опытов . на

- €--

сельскохозяйственных' культурах.

Условия направленного биосинтеза ФК А, схема - управления

процессом- его микробного синтеза,' предложенные критерии контроля

за ходом ферментации были. - обобщены -■ в , опытно-щюмышленном

регламенте на производство ФК А, что позволило организовать

получение-дааного регулятора роста - растений зг провести его

агрономичесзяе и медико-токсикологическпе испытания... Результатом

\

этой-работы явилось вклшение-ФК А в перечень-регуляторов ■ роста растений, разрешенных"к .применению-Госхнмкомиссией России. Положения,, выносимые- ва защиту: ^

1. Научно обоснованная ■ комплексная - программа реализации..-процессов ■ образования- индивидуальных-' гиббереллинов, фузикокцинов, АБК; приоритетные-- свойства исследуемых систем. Способы, направленного- микробного синтеза гиббереллинсв. А^.,

АБК, Ж А, С, Б, Н н .Г.

2. Критерии отбора продуцентов ." ■ физиологически - актшшкх гиббереллинсв А^, Ау, АБК;-. -Ж. Спектры- гиббэреллинов и -фузикокцинов, образуемых отобранными штаммами..

3. Физиологическая активность индивидуальных ®С.. на основании результатов изучения ихбяотестировашигна сельскохозяйственных культурах:;. -Ряда, сравнительной' . физиологической _ активности фузикокцинов А, С, Б, - Н и J в зависимости от характера изучаемого процесса,, вида и сорта тест-объект в.

'4. Ретарданты - - как регуляторы микробного . синтеза рострегулирущиг соединений терпеноидной природа и других физиологически активных терпеноидов.- Гипотетическая схема возможных: шст прерывания - биосинтеза" терпеноидов . под воздействием ретардантов. Стимуляторный эффект пикса и АЫО-1618 на образование ФК, условия, необходимые-для его реализации. „ 5. Биотехнологии получения ©С" А и С, включающие'- -условия выращивания посевного материала, способ ферментации (оригинальные среды,. значения шя профили режимных параметров),. схема- управлеаия^першдическим процессом микробного синтеза--• - Ж-А, критерии контроля за ходом ферментации.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы ■ были долокены на 1 г 2 Всесоюзных конференциях "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1981; Киев, 1988),. на Всесоюзной

конференции-- "Мицелиальныэ- грибы-' (фазиология, - биохимия, биотехнология)" (Пущина, 1983), на;12 Мевдународной- конференции, по регуляторам роста растений (Хейдельберг, 1985),. на Республиканской'научной конференции "Витамины и- фагогормоны- в растениеводстве" (Вильнюс, 1S8S), на 5 Всесоюзном биохимическом съезде (Москва,. 1986), на 3 и 4.Всесоюзных научных -конференциях "'¿икроорганззш-.в.- сольскогл хозяйстве", (Москва, 128S, - Цущино, 1932),.на 4 Всесоюзной, конференции-.-'"Управляемое' -культивирование; _ микроорганизмов"- (Пущино-, - 1986), на 4 Мендународотм' симпозиуме. "Регулятор -роста- растений"' (София, 1986), на- Всесоюзной: конференции .ГБаосинтез вторичных-метаболитов"' (Пущино, 1987), на 2 Мевдушродном г-симпозиуме^--"НЬвыо--■ биоактивные--;.метаболиты: микроорганизмов^-■• (Гера,. 1988)., на- Всесоюзной'- - конференции- -"Микроорганизмы--— стимуляторам и-" ингибитора, роста--- растений^- и-, животных"" (Ташкент,- 1989),- , на Международной конференции ."Проблемы-и-перспективы-биотехнологии" (Братислава; 1989),; на - 4- -Международном микологическом- конгрессе (Регенсбург, 1990), на 1 и 2. Всесоюзных конференциях "Регуляторы роста и развития растений* (Москва, 1991, 1993), на Всесоюзной конференции "Пути эффективного использования .. достижений- биотехнологии • ■ • в агропромышленном--- комплексе^ (Черновцы,- 1991), на. - 14 Международной конференции по регуляторам- роста растений. (Амстердам, 1991), на 11 йеадународном конгрессе по" химической инЕбнерш-.(Прага, 1.9ЭЗ), ..на расширенном заседании: кафедры микологии- и- альгологии МГУ. им.М.В.Лсмоносова- (1994), . на -заседании отдела регуляторов-роста растений и микробного синтеза ВШИ СБ. (1934)»

Публикации результатов исследования. Основное - содержания-диссертации-г-излогено;' в-.-63 • -научных:- работах. Из----.материалам - • исследования-" оформлены-- оштно-оромышленный" - регламент. на ; производство - фузикокцина, технические- условия на- препарат фузикокцин- кристаллический,-■ методические-, указания-, по- его - применению¿.- Получено 3" авторских-' свидетельства ■ об' изобретении. ■ и; подано 5= заявок- на; патент.

Структура-и объем-работы. Диссертация состоит из- введения,: ■ обзора -литературы; пксперимепталыюй -части;- вкшнаггзей-- описание-. объектов д- методов -исследования,, пяти глав- собственных.

исследований, заключения", выводов и списка цитируемой литературы. -

Работа изложена-на страницах " машинописного текста,

иллюстрирована 59 таблицами:и"47 рисунками.. Список литературы-содернит 301 наименование.

Автор выражает глубокую" благодарность инициатору - настоящей работы и"научному"руководителю проектов, в рейках.. которых. она выполнена — академику РАСШ Г.С.Муромцеву, а - -такзе--' сотрудника^, отдела, регуляторов роста растений.- и микробного - синтеза • и. лаборатории физико-химических методов исследования - ВНЖ - СБ". и лаборатории, технического обслуживания промышленной биотехнологии Института микробиологии Латвийской--.Академии: наук за" содействие в-выполнении"- настоящего- исследования».--

Содержание"работы.

Группа регуляторов роста растений терпеноидной природа - в . наших иследованиях была ограничена гибберёдлинами А^ и А^,. абсцнзовой кислотой и фузикокцинаш. Скрининг продуцентов, вели среда видов-фатопатогенных грибов класса Беи1;еготусе1ге8.— одной из наиболее перспективных групп- источников- регуляторов- роста, растений^ Отбор продуцентов-' был - осеовзн" ■ на выполнении ". двух условий: 1) осуществлении- идентификации .рострегулкру;гд>гг.вещоств и 2) подтверждении физиологического действия изучаемых веществ.

1.1. Отбор продуцентов гиббереллинов..

Задача- состояла в поиске продуцентов;, наиболее -физиологически активных гиббереллинов - А^ и Ау, а такие в отборе продуцента Ад .с высокой биосинтетической' активностью.. Поскольку препаративное--- химическое - разделение - к^. ■ ж А^ представляет собой весьма сложный процесс, необходимо было найти продуценты, способные к преимущественному-образованию одного из гиббереллинов. Пойся: был проведен среда штаммов , Р. иопИИогте-(порядок. НурЬотусе1а1еа), что связано - с недостаточной изученностью способности-, штаммов этого 'вида к синтезу индивидуальных гиббереллинов.. К началу наших работ был известен макропродуцент А. - гриб £!рЬасе1оша шаиШ)1;1со1а (ЕайешасЬег,

- э -

2е1^1ег, 1979), макропродуценты. А^ известны не были.

Основу для поиска составила полученная' академиком Г.С.Муромцевым коллекция штаммов Р.шопИиГогше, =способных' к образовании гиббереллиношдобных-. веществ'. Скрининг ■ "продуцентов был осуществлен в два этапа с использованием ТСХ. в качестве метода' предварительного анализа . и метода

хрокатомасс-спектромэтрии пер-триметилсшпыгьных производных, для идентификации'. гиббереллинов. Хроматомасс-сгоктромэтрия гиббереллинов, АБК и ® и масс-спектромвтрия вторичных ионов. ФК была осуществлена к.х.н. В. Л..Садовской-1 '..Г'

I г>

;сс

10 12 Т( me ( mlп . )

2.5Е5" « 2.-0Е5-| 1.5Е5 . = .1. 0Е5

■ 3

с 5.0Е4

АТ

ЬА7.

J.,

Dk.. А»

■J*-

0J

4

В 10 Tl me (ml n. )

12

14

IG

Еис.1. СС-ЬБ - анализ, экстрактов культуральннхг гладкостей штаммов С 5/4 (а) и. С 5/7 (в). Р^шопШЮгиа.

В результате^были отобраны штаммы- г.топИИсвиэ (уоловно обозначите G 5/4 и G 5/7), основным метаболитом., которых <йшг гиббер9ллшаЛ4 ш-iV (рис.1),, соответственно^ В качестве-минорных метаболитов отобранных'штаммов., были;

штамаС 5/4 ^з- "з- w.^4'- he-- ¿3?:

штамм G 5/7 - Ag, lAg, A^, i^, Ag, A13- -В культуральЕых: яидкостях шешйов присутствовали диоксикауренолид е кислота фудженаля.

Кроме того, был - выбран ттамм-матфспродуцонт Ад, биосинтетическая"-' способность. • которого: не уступала производственного.штамму: Р.monlllíогша. (1Ш0-"Синтез^^ r.Kypraii), условное обозначение штаюга G 5/3. Наряду-, с'Ад штамм- образовывал в незначительных количествах гиббереллиш- А^,. 1Ад, k¿, Ar,, 1А-,, Ад, А^д, дагштауренолид иг кислоту..фудазналя,..

1.2. Поиек продуцента'ДЕК..

С целью выявления- продуцента. АБК-. Еналииирсвали- три" вида рода Сегсоярога (порядок-. Hyphoziyeetales): G.carotae- (Pass.) Eolb. (F-2164). С-roaicola. Базв- (P-21 G5), C.viola. Sacc. (F-21§7) Всероссийской, коллекции: .- : микроорганизмов. -' Ra: основании результатов хроиатомасс-спектрометрии" " тримвтшкилильвых.-, производных згял ацетатных. экстрактов культуральннх, видаостей- п их фракций, излученных, после препаративного разделения в тонком слое, АЕК .была идентифицирована,только, в. культуральной- кидкостп' гриба С. .roslcola. В условият;: соответствулциг даннек литература (Norman et.al., 1981), гриб, образовывал около .10-20 мг АБК на '..л культурального фильтрата, за 14. даей^ ферментации.

1.3.. Исследование способности к синтезу ФК штатов P.amygdali...(порядок Spbaeropsldales).

Выло изучено четыре штамма-. Р.amygcall: Л - - штаым Центральной микологической коллекции" (Нидерланды), II 428.S4; Р2 - выделен, из шрагелного .побега .миндаля."(Amygdalus comnunls I.) 1'3 и Р4 - получены, из"культур коллекции:" йаыского университета. Результаты хроматамасс-спектроштрического анализа

триыетилсилильнык производных.. доказали/надичие в культуральной" жидкости всех четьфехжтаымов:фузжокципов А, В, С, D, . Н, J, 16-0-деметил J, Е, Р, а такав. 3? неидвши!«iдаровянтшху ЕС. • с величиной.. m/z 595, 613 и 643.. Уровень..- - 52С-синтезирулией • активности у 4х- штаммов существенна различался,' при- этом качественный состав и количественное' соотношение

®С, как было показано с помощью масс-спектрометрзн вторичнчт ионов, у всех культур были одинаковы" (табл. 1). Таким образом, задача направленного синтеза.индивидуальных ®С, как единственный путь получении их, высокоочшценных . препаратов, должна. была решаться на • основе • изучения закономерностей регуляции образования ©К условиями .культивирования продуцента.. ■

Таблица 1.

Содержание. ■ индивидуальных фузикокцинов в " нультуральных жидкостях'штаммов. Р. ашу£йа11

штамм концентрация, ■ ФЕС, % . содержание индивидуальных СЕК, % к суммарному, количеству

А С Б Н J *

Р1 58 53 20 ' 3 6 14 4

Р2 100 50 23 5 8 10 8

РЗ 208. 48 16 3 4 20 . 9

Р4 383 48 1? 2 11 . 15 7

'* — здесь и далее сумма минорных ФК: ®ГЕ, Ш 16-О-деметил. <ЕС .1 и др.

Вещества Ж-природы были' обнаружены не . тЬлько в культуральной яидкости, впервые было доказано наличие ■ ® в квделки штаммов Р.ашу^^ЗаИ. По сравнении с культуральной. еидкостби, в.мицелии.набор идентифицированншх ® был- несколько уте - А, С, Б, Е, и .1, процесс их образования протекал быстрее, максимальные концентрации ®£ А и его ■ предшественников были примерно одинаковы, в то - время как в культуральной жидкости содержание Ж А во"много-раз превосходило, содержание 5Е Н и <Х. В. целом,.содержание-Ж в мицелии- .было в 20-30 раз., ниже, по срашенню с культуральной кидкостьа.

С целью -выявления мекштаммовых различий: и маркировки* исследуемых. шта'.агоз P.aщygcIalI было проведено сравнительное изучение элгктрофоретических спектров - общего пула

г

водорастворимых. белков мицелия: и множестветтых молекулярных форы ряда ферментов, осуществленное к.б.н. И.А.Мошной.

Как следовало из расчитанных .на основании- полученных электрофореграш величин коэффициентов., попарного сходства, наибольшие-ыэЕштамыоваге различия были , характерны , дат штаммов . Р1 и Р4, отличаадихся наименьшей-и наибольшей- 3>К-синтезирукщей активностью,-соответственно (табл.-. 2). Особенность'' штамма•- Р1 выражалась главным .образом в отсутствии" многих фракций, фенолоксвдаз и ряда дэищрогеназ. В электрофорэграммаз и гамма. 5? 4 наиболее высока была доля уникальных полос.- Полученные данные свидетельствовали о возможности - биохимического маркирования штамма-макропродуцента. -

Таблица..2. :

Коэффициенты попарного сходства (Кс) штаммов- 3?.ашз@3а11 по спектрам полшюрфвых ферментных.систем (а) и об'лего .белка' (в).

а в

штаммы РЗ ?2 Р1 штаммы РЗ Р2 Р1

-Р4 0,767' 0,809- 0,629 Р4 0,595 0,553 0,552

РЗ 0,831 0,714 РЗ 0,773 0,786

, Р2 0,793 Р2 0,780

Вновь полученные- продуценты- были- депонированы- - во' Всероссийской, коллекции промышленных микроорганизмов..

1.4. Физиологическое - действие :АБК-, индивидуальных гиббереллинсе и фузикокцинов, образуемых- ■ отобраншми-грибамя-продуцентами.

Для* .биотестирования- использовали.- фильтрат \. культуралшой жидкости , (в соответствующих .. разведениях) и. высокоочищенные-препараты гкббереллииов, фузикокцинов.. и • АЕК, для> получения которых, были.разработаны или- модифицированы, методы .' выделения и' химической: очистки; в -том числе с применением в качестве

сорбента ненолярноЗ - ношшгой. смолы-Палисорб - сополимера стирола и дихлорвннилбанзола. Полученные' препараты. содержали от 80% до: 50Х . действующего вещества. Результаты биотестирования •' подтвердили соответствундее . данным литературы действие гибберэллиЕэв-А^ и Ау, 1ЕК, ФК VA, образуемых отобранными,. штаммами-. (Муромцев,- Агнистикова, 1973, 19S4; Основы химической регуляции роста и продуктивности.- растений* 1987;. Кефэли и др., 1989). Из. Еперэдэ показанных эффектов:"®. А следует отметить.

Таблица 3.

Физиологическое-действие .индивзадуалБНых фузикогсцинов

тест ряд сравнительной активности Ж

1. Потеря веса черенками.

томат сорт Црогресс. А > С > D > J > H >

2. Удлинение ■ сегментов корней.

кукуруза сорт Днепровская 705 C=J>A>D>H>

3. Прорастание семян

3.1. на HgO

салат сорт Крупнокачанный-' J >A>C>D>H> V

сорт Берлинский- A=C>J>D>H>

томат сорт ЕрибозСкнй. " " С > A > J > D > H >

сорт Свитенок A > B-> С > H > J. > K* -

кукуруза сорт. Днепровская 705 A = C = J>H>D> к*

3.2. на фоне-NaOl

томат, ccpt Грибовский:, J>C>A>H>D> V>KB

кукуруза: сорт: Днепровская.-705 С =.J.= E > A X-D >

4. Развитие"; первичных. корней:-проростков

4.1. на HgO

томат, сорт Грибовский ■ H > A = С >- J > D >

" кукуруза сорт Днепровская 705 C>A>J>D>H>

4.2. на.фане HaCl

toiíet." сорт Грибовский:-. ■ J. > С > A > H > D >

кукуруза сорт Днепровская 705. ■A = H.>C>D = Hff. > j >kb

- контроль HgO; Kg - контроль EaCl (0,5 - 0,75£).

способность этого вещества увеличивать в лабораторных условиях . урожай шампиньона-культивируемого (Agaricua" Мьрогиз (J.Ige.j Imbach) на- 40 - 502.

В связи с тем, что физиологическое действие - индивидуальных-©С, за исключением ФК А, изучено явно недостаточно, был-проведен -детальный сравнительный анализ" физиологической активности.:® с использованием.- '. в качестве---'. тест-объектов различных -сельскохозяйственных культур: салата (bactica sativa L.), томата-(Lycoperslccon esculentum И11-1.)кукурузы (Zea . шаув. L.).. В результате баю показано; что наряду "с ФК А- физиологической активностью-обладалиЖ С, J; соотнесение- -активностей,

зависело от изучаемого физиологического процесса, ;в2да---"раст8ния-и его- сорта- В проведенных- экспериментах- четко проявилось . антистрессовое-действие--индивидуальных®С- (табл.3.). В- ряде опытов эффект фузикокщшов С, D, Н, и J был Еыше по сравнения с воздействием Ш к. Оптимальные ■ действующие концентрации "индивидуальных.® лекали в диапазоне - 10~6- "5 х 1СГ5 U- На основании полученных результатов была установлена- зависимость физиологической активности фузикокцинов от строения." молекулы». Проведенное, биотестарованш позволило предположить, что - -представляют собой перспективную -. для • практики: сельского хозяйства группу регуляторов роста растений, -не ограничивающуюся основным метаболитом F.amygdall - Фк А.

- 2.: Реализация . процессов - образования-: .гиббереллинов, абсцизовой кислоты и фузикокцинов.

Разработка биотехнологических- способов получения - продуктов микробного синтеза включает в себя установление оптимальных- (или рациональных) значений" , и профилей"- многочисленных- факторов: и параметров- культивирования7-' Для. того, . чтобы . окэртить-. - .круг наиболее значишх факторов, необходим»'выявить,, в. -определенноы-прибликении, ' ваянейшие черты - исследуемых- систем; • В качестве . приоритетных характеристик.изучаемых биотехнологических - систем," основу которых составляли • целевые. - ' метаболиты, отобранные грибы-продуцентыгиббереллинов, ДЕК. и "®С и способы их

культивирования, были выбраны.- следующие: 1) структурная организация продуцентов, , их . морфэлого-культуральныг характеристики, 2) физиология питания продуцентов, ■ 3) принадлежность изучаемых веществ к вторичным метаболитам, 4) химические свойства' конкретных" метаболитов,, их взаимные-превращения, 5) путь~биосинтеза терпеноидов, возможность наличия общих регуляторов биосинтеза (ряс.2).

поиск и применение -регуляторов биосинтеза

методы анализа, выделения и очистки

СПОСОБ' КУЛИ0ШРОЕДНШГ

- методы .хранения- физиология

питания, составы сред

- аппаратурное •

- оформление -процесса культивирования

- тип. ферментации -

• • , - искомая фаза-процесса ферментации.

- профили'регимных параметров

Рис.2. Общая схема разработки" биотехнологических способов микробного синтеза регуляторов, роста растений терпеноидной природа.

Основу процесса микробного' синтеза рострегуларухщих веществ терпеноидной природы составило периодическое погруженное культивирование их продуцентов-

При исследовании"-- микробного синтеза- гибберэялпнов необходимо- было установить оптимальные условия образования А^ и А7 применительно к кацдому из штаммов-продуцентов;, изучение -У.сгЗ'дДа!! было направлено на. установление зависимости

накопления'индивидуальных- ®С . от условий культивирования;- в работе с АБК целесообразно было сократить процесс ферментации, составлявший» согласна данным литературы, 14~20 дней '(Яогтап е1;.а1., 1981, Такауаш, 1983а, Ъ).

2.1. Ыорфологр-культуральные: свойства грибов-продуцентов определили выбор методов их - культивирования п соответствующего аппаратурного оформления работы.

Тот4 факт, что изучаемые- продуценты, регуляторов роста растений представляют .собой •мщелиальнне.-органЕЕзгйЫ, аспорогенные или слабо спороносящке, имел решавдее- значение при разработке методов ' длительного ,6 - - хранения культур продуцентов • и подаерживаыцей селекции. Применительно к каждому-продуценту были, разработаны конкретные- условия ■ хранения", позволившие - -в' течение; ряда лет поддерживать высокий уровень активности .при минимальном-числе'пассажей (1 пассах в 1 - 3 года).

Для погруженной. культуры-Р.ащудйаН и С.гоз1со1а было характерно образование- агломератов или пеллет, что затрудняло изучение кинетических характеристик процессов микробного синтеза и в ряде случаев отрицательно влияло на - накопление • целевых метаболитов. Неоднородность погруженной культуры,- .присутствие агломератов на стадии посевной культуры- было- преодолено, путем использованного М- Цриеде измельчения инокулнма, что приводило к увеличению-числа точек роста.. Применение- гомогенизации,, как одного из приемов подготовки инокулша, способствовало повышению эффективности, изучаемых процессов микробного синтеза, увеличивало концентрацию метаболитов- и сокращало - длительность ферментации.

2.2; Физиология питания грибов-продуцентов и разработка ферментационных- сред.

Изучение - физиологии • питания" грибов-продуцентов является основой разработки ферментационных сред, одного - из • наиболее ответственных-этапов создания-биотехнологии получения-, продуктов микробного.синтеза, во многом-определявдего эффективность всего процесса. Стратегия разработки, ферментационной.- среды была направлена,: во-первых, на реализацию генетического потенциала

биосинтетической активности продуцента и, во-вторых, на создание селективных условий для образованшгизучаемого метаболита.

Превде всего был-осуществлен качественный отбор источников питания яа основе изучения сочетаний источников углерода и азота, ' относящихся к разным классам органических и неорганических соединений. .Эффективными- для образования' Ау штаммом й Б/7 были среды, . которые обеспечивали высокие концентрации Ад при культивировании штамма й 5/3, в том числе содержащие в качестве источника углерода- подсолнечное масло. Преимущественное образование,- А4 штаммом Э 5/4 обеспечивали, среды, содержащие, глюкозу- или. сахарозу. Наибольшие-, концентрации ®С были достигнуты на средах, содержащих необезжиреннув соевую муку в сочетании-*-с различными.--источниками углерода. Методом масс-спектрометрии вторичных ионов было показано, что рецептура ферментационных , сред практически не оказывает - влияния на качественный состав индивидуальных-Ж, .но.способна существенно изменять их соотношение. Варьируя состав среды, можно было добиться преимущественного накопления фузикокцинс® А, С, Б, достичь значительной концентрации - Н или .Г. Требованиям достижения'.высоких концентраций АБК при' значительней - сокращении длительности процесса культивирования С.гоБ1со1а з -наибольшей, степени отвечали среды, с подсолнечным маслом, что..ныявило общие-черты в подходе в разработке ферментационных сред гиббереллинов Ад и А? и АБК.

Изучение- возможности модификации . состава- сред, путем использования . более дешевых, и - доступных источников . питания, доказало целесообразность замены гликозы пли. сахарозы на сахар-сырец. Также, была разработана среда для получения ©С А и С на основе молочной сыворотки - (регуляцию - преимущественного-, накопления Л или С осуществляли- такими факторами ферментации, как длительность- процесса культивирования, темпертурный" режим, рН среды и др; см. раздел 2.4.).

. После осуществления подбора источников- питания- проводили оптимизацию состава фэрментационых сред методами математического планирования эксперимента, включавшими постановку полнофакторных экспериментов опытов по методу крутого восхождения. Осуществление этого.раздела работы позволило значительно (до

40-50 %) увеличить концентрации изучаемых метаболитов и в ряде случаев снизить расход питательных веществ.

В результате проведенных исследований были разработаны оригинальные среды, обеспечивающие-:значительный"уровень АБК щит сокращении длительности ' ферментации в два . раза; высокую концентрации и преимущественное накопление фузикокцияов А, с, Б или Н; гиббереллинов А^ или. А^.

2.3. Регуляция" образования-регуляторов роста растений. как вторичных метаболитов грибов-продуцентов.

Принадлежность' регуляторов роста растений . к вторичным метаболитам диктовала необходимость" установления оптимальных соотношений трофофазн и-шщофазш. и осуществления регуляции-перехода, к образовании исследуемых:продуктов.

Результаты оптимизации состава- ферментационных" сред, для . культивирования продуцентов, гиббереллинов и ФК показали, что высокая эффективность'¡процесса.образования изучаемых продуктов достигается при определенной лимитации: развития . биомассы. При этом верхний-предел развития-биомассы был значительно выше- у штаммов Р.шопИНогше по сравнении с продуцентом ФК. Можно предположить, что подобная закономерность должна иметь место и при микробном синтезе АБКГ' однако в экспериментах- не были созданы условия достижения верхнего предела развития биомассы, начиная с которого можно было бы наблвдать снижение продуктивности мицелия медленнорастущего штамма С.гоз1со1а.

Принимая во внимание, что требования к параметрам ферментации; - обеспечивающим-- оптимальные условия роста' продуцентов и образования исследуемых' метаболитов, могут различаться, серьезное внимание было уделено • разработке профильных режимов культивирования; ^предусматривающих изменение-того или иного параметра в ходе ферментации. Было показано, что . изменение температуры в процессе ферментации. - способствует интенсификации образования исследуемых .метаболитов. и приводит • к-повытению их концентраций . (рис. 3). Повышение , эффектинности-процессов микробного синтеза-за счет использования профильного температурного режима- связано, 'вероятно, либо с созданием оптимальных условий работы' ключевых ферментов биосинтеза

изучаемых метаболитов, либо с лимитацией дальнейшего роста продуцента.

Содержание метаболита в юг, %

150 140 130 120 110

100

0

ГАу

АБК

■ ■ 1

2 •■ 3 -• 4 •-

...1 .. 2 -■ 3 4 ■•

Рис. 3 Содержание гиббераллкна"- Ау и абсцизовой кислоты в хультуралъных жидкостях продуцентов в зависимости . от температурного режима ферментации: 1 - 26° С; 2 - 28° С;. 3 -

26° 28° С; 4 - 28°

26° С.

Преимущества, профильных, режимов ферментации, вторичных метаболитов проявились' при ' 'разработке условий аэрации погруженной культуры продуцента Ш, выращиваемой в ферментационных аппаратах. Из изученных решмов наиболее, эффективный, для образования заключался в снижении уровня р02 в идиофазе по сравнению с трофофазой, что приводило к уменьшению" скорости роста продуцента, и, как- ёледствие; лимитировало накопление биомассы.

Согласно полученным- результатам, в качестве критериев, по которым, можно было, судазгь о ходе процесса ферментации" ~и определять момент, в. который: необходимо измененить значения параметров, целесообразно было использовать, кроме временных характеристик, динашку значений рН культуральноЯ среды л характер потребления культурой кислорода, что и.было реализовано составлением соответствующего алгоритма.

2.4. Химические свойства изучаемы* метаболитов.

Химические свойства метаболитов, возможность их взаимных превращений, ферментативных « нефэрментативных, их стабильность или лабильность во многом определяют ход реализации процесса биосинтеза того или иного соединения.

В зтой связи целесообразно было . рассмотреть' проблему контроля . рН культуральной среды, учитывая/, разумеется,. что влияние рН .на ■ процесс микробного синтеза значительно шире. Контроль рй среда можно свести к двум основным, моментам. Во-первых, определение оптимального для.. образования изучаемых метаболитов .начального рН ферментационной среды и, . во-вторых, коррекция рН в течение ферментации.

Оптимальный исходный рН был определен--для-всех оригинальных сред, разработанных для получения гиббереллинов. А4 и А^, АБК и Ш. Наибольшая концентрация АЕК. была .достигнута при .начальном рН 6,0-6,5, гиббереллинов А^.и Ау - при рН 4,5-5,0. Указанные значения рН создавали селективные условия для'образования А4 и krj штаммами G 5/4 и G 5/7. Доля А4 при культивировании штамма G 5/4 на среде с начальным рН 4,5 составила около ■ 90S от суммы ГПВ. На примере штамма P.moniliiorme G 5/3, отличавшегося от других штаммов выраженной тенденцией к повышению. рН среда в течение ферментации,' был показан положительный эффект коррекции вН в процессе культивирования, который выражался в ¿^-кратном возрастании концентрации Ад и снижении . суммарного содержания минорных. метаболитов.

Изучение влияния параметров процесса ферментации на образование индивидуальных. ФЕС. проводили,- исследуя каждый фактор поочередно; продуцент * при этом культивировали на 5-ти Ферментационных средах. Сопоставление' экспериментального материала и данных литературы позволило построить следукщую цепочку наблюдаемых превращений фузикокцинов: K-*J—►А—*С—*D (рис. 4.). Этапы от Н до А представляют собой заключительные реакции биогенеза А, его дальнейшее деацетшшрование в С и превращение С в D за счет потери еще одной ацетильной группы, по-видимому, могут протекать нефэрментативно, согласно данным Barrow (1968). Впервые показано, что осуществлению этой последовавтльнооти превращений способствуют высокие значения рН

среда и температуры процесса, интенсивная' аэрация и увеличение длительности периода ферментации.

Н -ь J ->- А -- С -► Л

5,0-5,5 6,0 7,5-8,0 8,5 . рН

24° 26° —► 24° 26° С

5-8 15 - 20 40 - 50 р02, % '

30 72 - 84 12Г) длительность

ферментации, час.

Рис. 4. Зависимость образования индивидуальных Ж от параметров .процесса ферментации.

2.5. Изучение, ретардантов как регуляторов микробного , синтеза физиологически активных терпеноидов.

Терпеноиднач природа изученных, рострегулирухвдих. соединений позволила предположить, наличие общих (химических) регуляторов реакций их биосинтеза, действующих либо' на единых для всэх изучаемых метаболитов этапах биогенеза, - либо на специфических для каадого вещества.

С целью обнаружения . таких .. регуляторов был . проведен сравнительный анализ . ■ действия . ретардантов, способных ингибировать биосинтез - гиббереллина.

Коллекция объектов. исследования, была дополнена культурами мицелиальных грибов-продуцентов таким образом, чтобы целевые метаболиты представляли разные классы терпеноидовБыли, выбраны и исследованы следующие грибные модели:. С.гов1со1а - продуцент сесквитерпена. АБК;. .1*ив1с1±ит соссШеш Рис. - продуцент тритерпена, стероидного антибиотика фузидина, Т.агпу£с1а11 -продуцент дитерпена фузикокцина, Р.топШГоппе - продуцент ■

дитерпена гиббереллина, В1акез1еа 1;г1зро:га ТказгЬег - продуцент тетратерпэна ^-каротина.

В результате было показано, что ретарданты хлорхолинхлорид (ССС), пике, морфол и паклобутразол (РР 333) способны подавлять образование всех исследуемых метаболитов. Ингибиторное действие ретардантов на микробный синтез Ж, фузидана и р-каротина • было, выявлено . впервые. АЫО-1618 обладал избирательным

- характером действия, подавляя микробный синтез АБК, фузидана, гиббереллина и ^-каротина, но не оказывая ингибиторяого воздействия на образование ФК, что могло, быть -связано с неспособностью ретарданта либо .прерывать. кошфетные ферментативные реакции, либо проникать к. месту действия.

Интерпретируя полученные- данные, - можно предположить,, что

- прерывание биосинтеза терпеноидов происходит на какой-то общей достаточно ранней стадии их биогенеза - до фарнезил хшрофосфата. Однако, относительно гиббереллинов место прерывания их ферментативного синтеза экспериментально ■ установлено: под воздействием ССС и АЫО-1618 - на стадии • циклизации

'; геранилгеранил пирофосфата в энт-каурен И; под воздействием РР

| 333 - на более • поздних стадиях превращения энт-каурена в

! эЕт-кауреновую кислоту (Ылвег, 1961; Нвгайа, Xащ, -1965).

Поскольку эти стадии характерны • для синтеза гиббереллиновых структур* и не имеют отношения • к образовании других изученных ; веществ, следует допустить, что ретарданты имеют разные места

действия на ферментативный синтез терпеноидов, скорее всего, специфические для каждого, из соединений (рис. 5). Остается,

- конечно, маловероятная возможность одновременного частичного' шзгкбирозания ретардантами какой-то - общей' стадии' ферментативного синтеза терпеноидов и стадий, специфических для синтеза

\ гиббереллинов.

I Воздействие ретардантов на микробный синтез ФК ■ и

| . гиббереллинов сопровождалось значительными изменениями

| качественного и 'количественного состава индивидуальных

| метаболитов, что может быть использовано при - разработке

биотехнолоий их получения.

Изучение воздействия ретардантов на образование 5К. в —- условиях, обеспечивающих его сверхсинтез (прежде всего вз счет

МЕВАЛОНОВАЯ КИСЛОТА.

ФАРНЕЗШ1 Ш

ССС, РР 333

«УЗВДЩ

s

ССС, РР 333, / АМО-1618 АБК

ГЕРАШСПГЕРАНИЛ ЕЕВ

ССС, РР 333, АМО-1618 ч4

(З-ХАРСТИП

^ ССС, РР 333

ФШПСОВЩЗ ■ - ССС, АМО-1618

ЭЕТ-КАУЕЕН.

-■ РР 333

ЭБТ-КАУРЕЯОВАЯ КИСЛОТА

". " Г ' "........

Г5БЕКРЕЛЛШ

"V - предполагаемые места действия, ч

■f - - известные места действия

Рис. 5. Схема прерывания биосинтеза терпеноидов под воздействием ретардантов.

оригинальной ферментационной среды), позволило выявить, стимуляцию этого процесса под воздействием пикса (концентрации -шше М) к AU0-1618. Методами*- математического планирования были установлены оптимальные - концентрации последного, обеспечивашие увеличение содеркания ФК -на 65-85Ж. Стимуляторный

эффект АШ-1618 был достигнут за счет резкого увеличения продуктивности мицелия и сохранялся даже при снижении содержания источника углерода в среде в 2 раза. По-видимому, в основе наблюдаемой, стимуляции биосинтеза фузикокцина лежит "способность ретарданта блокировать одну из ветвей- терпеноидаого синтеза, осуществляемую грибом на среде -с сахаром-сырцом и соевой мукой, в результате.чего общие для- 4К и предполагаемого терпеноида-предшественники идут на образование ФК.

3. Биотехнология получения фузикокцинов А л С.

)

Разработанные в предыдущих разделах подходы к реализации процесса образования фузикокцинов при культивировании гриба-продуцента, установленные- закономерности регуляции качественного состава и количественного соотношения, индивидуальных метаболитов были использованы при создании биотехнологии получения физиологически активных ФК А и С.

3.1. Условия выращивания посевного материала;

Получение посевного материала, как составная часть способа получения метаболитов микроорганизмов, оказывает , принципиальное влияние на -последухщий ход ферментации. Разработка условий, выращивания жидкой посевной культуры, включала исследование следунцих факторов: состава посевной среда, возраста посевного мицелия, количества вносимого инокулюма, способа его предварительной подготовки. Были разработаны две оптимизированные посевные среда, качественный состав одной - из . них совпадал с таковым ферментационной среда. Оптимальный для. образования- ®£ возраст посевного материала при выращивании, в колбах составил 72 часа, в ферментационном-аппарате - 24 часа. Достижении наибольших концентраций Ж способствовало количество инокулша, обеспечвващее 0,8 г биомассы на литр ферментационной N среда. Составной частью подготовки инокулята служило измельчение посевного материала. Были выявлены следующие критерии достижения посевной культурой • "стадии физиологической зрелости: снижение-интенсивности дыхания, начало резкого повышения pH культуральной среда, исчерпание источника углерода.

Способ получения посевного материала во многом определял -Еффективность стадйа. ферментации, однако влияния качества инокулша из состав индивидуальных ■ фузикокшнов отмечено не было.

,3.2. Условия направленного микробного синтеза фузикокцинов А и С.

Полученные ранее результаты позволили• выбрать две ферментационные среды: для получения ФК А - сахар-сырец + соевая. -мука, и Ж С - на оснозе молочной сыворотки с внесением соевой, муки,., установить - длительность процессов культивирования ■ продуцента, обеспечивавшую преимущественное накопление ФК А или С - 72 и 120 часов, соответственно, при выращивании P.amygdall в-' колбах на ротациониой качалке. ■ При . использовании - для культивирования ферментационных аппаратов длительность процесса "ферментации уменьшалась в среднем на 12 часов. ■

На каждом этапе разработки биотехнологий получения ФК А и С осуществляли контроль качественного состава и количественного соотношения индивидуальных ФК методом масс-спектрометрш вторичных ионов.

Составы сред были оптимизированы с помощью полнофакторных экспериментов и опытов на -основе метода "Бокса-Уилсонау •' что; позволило существенна поднять концентрации исследуемых ФК при сохранении исходной направленности их образования.. Следует отметить различие в оптпмальшх концентрациях--источников питания ■ в посевной среде и одной, из ферментационных, вклычахщих одни и те же ингредиенты, что свидетельствует о качественно различных задачах, решаемых при 'выращивании шоку лила и осуществлении собственно процесса микробного синтеза. .

Эффективность процесса образования ФК А была увеличена . за счет дополнительного внесения .в- среду источника .- углерода. Наибольшее увеличение концентрации Ж (на 10-15%) было получено . при поддержании - редуцирующих веществ в течение идиофагы; на-уровне 0,2-0,3%.

В соответствии с выводами раздела 2 . были установлены оптимальные- значения исходного рН ферментационных сред для ■ образования ФК-А и С, составившие 5,5-8,0 и 7,5, соответственно.

Достижению направленного синтеза способствовали разработанные температурные режимы: постоянный 26°С для образования ФК С и профильный 2о 24° С для получения ФК А, время снижения температуры, процесса - 18® час ферментации. Изменение температуры более, чем на два градуса ели ее снижение в более ранние или поздние сроки приводило к уменьшению эффективности процесса образования 4НС. Впервые отмечено 25-30%-ное -увеличение концентрации ©С под воздействием видимого света. В описанных условиях культивирования Р .8шу@1а11 содержание ФК С в культуральной жидкости достигало 400-500 мг/л культуральной жидкости, что составляло 70-75Ж от суммарной концентрации ФК (рис. 6).

концентрация ФК, мг/л кж

430 410

210 190 170 150 130

80 60 40 20 О

Н

1

3 5 7

длительность ферментации, сутки

Рис. 6. Способ получения ФК С. Содержанке индвидуальЕЫХ Ж в -культуральной жидкости в процессе ферментации.

Режим аэрации и перемешивания- был. наиболее - подробно разработан для способа получения ФК А, базирующегося на культивировании продуцента в ферментационных . аппаратах, оснащенных перемешивающим устройством турбинного типа. Изучение различных режимов перемешивания впялило наиболее благоприятный

D

для образования ФК вариант - ступенчатого увеличения ' скорости перемешивания с 200 до 300 мин-1. Такой резни таремепивания-позволял преодолеть отрицательное влияние Еозрзсгашщей вязкости жидкой культура на условия массобмена, способствовал повшешш содержания ФК А в среде и сникал расход подаваемого в аппарат воздуха- Оптимальные для образования ФК А условия., насыщения среды кислородом обеспечивал профилированный •. резни подачи-воздуха, при котором в трофофазе значение pOg составляло-15-20 % и в идаофазе -. 5-8Ж. Критерием определения момента изменения уровня р09 служило снижение расхода воздуха, что соответствовало 21 - 33 часу ферментации. Условия высокого содержания кислорода в среде приводили к увеличении скорости роста продуцента к, следовательно, к интенсивному накоплению биомассы, в то же время скорость образования-ФК была невелика. При низком уровне . рО^-были лимитированы- и рост P.amygdali, и. синтез Ж.

Основными критериями достижения максимальной, концентрации ФК и, следовательно, завершения процесса, ферментации слунили результаты■спектрофотометряческого определения содержания ФК, а такке~ход изменения значений pH культуральной среды (а тленно

конценчрация 5Н, мг/л ка

800

.о,

-о- ФК А -.-ФК С -х- ФК Н -Д- ФК J-

600

400

200

0

т-!-1-г^-г

12 24 36 48 60 72

длительность ферментации, час.

Рис. 7. Способ получения. ФК А. Накопление индивидуальных ФК в . культуральной гздкости в процессе ферлентации: ■.

начало их повышений) и показатели расхода воздуха, необходимого для обеспечения, разработанного режима насыщения среды кислородом. -

Разработанный управляемый процесс биосинтеза <ЙС А отвечал поставленной цели, т.е. обеспечивал эффективное образование ЕС до 1,0- 1,2 г/л и создавал селективные условия накопления ФК А, его доля достигала 75-85% от суммы ФК (рис.75.' Максимальная скорость образования ®С (18-30 час. ферментации)-" была равна

0.025.- 0,040 г/л/час. Значения экономических коэффициентов в высокоэффективных процессах составили: 1^=0,35-0,40 г/г; 1р/8=0,04-С,05 г/г, Ур/а= 0,10-0,14 г/г. Полученные результаты были оформлены в виде опытно-промышленного регламента на производство Ш А. -

ВЫВОДЫ

1. Предложена научно обоснованная комплексная программа-реализации процессов микробного синтеза регуляторов роста растений терпеноидной природа , основанная- на следующих -приоритетных характеристиках исследуемых систем: 1/ морфолого-культуральные свойства грибов-продуцентов, . 2/ физиология питания продуцентов, 3/ _ принадлежность изучаекргх веществ к вторичным метаболитам, 4/ химические свойства конкретных веществ, их биогенез, взаимные превращения, 5/ путь биосинтеза терпеновдов, наличие возможных общих регуляторов их образования.

2. На основании результатов идентификации рострегулируыдих соединений методом хроматомасс-спектрометрии . и биотестирования их высокоочищенных препаратов отобраны штаммы фитопатогенных грибов класса Оеигегошусагев, перспективные для разработки биотехнологий получения . гиббереллинов, фузикокцинов и. АБК. Впервые показано, что штаммы Р.топИИогае могут различаться по основному метаболиту гиббереллинозой природы. Получены штаммы Р.тоиНИогте, способные к преимущественному образованию физиологически активных гиббереллинов

Ад или Ду - Показана. возможность биохимического маркирования штамма 7 .адщфаИ -макроцродуцента фузикокцинов.

3. На основании результатов изучения ретардантов - ингибиторов биосинтеза гиббереллинов как регуляторов микробного синтеза физиологически активных: терпеноидов грибного происхождения предложена гипотетическая схема возможных ■ мест, прерывания ретардантами биосинтеза терпеноидов. Воздействие ретардантов на образование гиббереллинов и Ж сопровождается изменениями в наборе и соотношении индивидуальных метаболитов. " Впервые установлена стимуляция образования-ФК под воздействием АШ-1618 и низких концентраций пинса.

4. Установлена зависимость образования индивидуальных гиббереллинов и АБК от основных • параметров культивирования отобранных штаммов-продуцентов. Применительно к каждому штамму разработаны способы направленого микробного синтеза АБК и гиббереллинов А^ и А^, включающие_ эффективные, ферментационные среды, оптимальные для образования целевых метаболитов значения рН сред, температурные реете.«, длительность - процессов ферментация. Предложенный способ микробного синтеза АБК позволяет получать высокие концентрации фитогормона при значительном сокращении длительности процесса ферментации по сравнению с иззестныка в литературе аналогами. Получены опытные образцы препаратов АБК и индивидуальных гиббереллинов А^ и А^.

5. В культуральной жидкости птаммов Р.-атуг^йаИ. идентифицированы фузякокцивн А, В, С!, В, Е, Н, J, 16-0-деметил J. Впервые обнаружены з мицелии продуцента, количественные соотношения ФК А. и его предшественников в мицелии и культуральной- кидкости различны. По данным биотестирования на сельскохозяйственных культурах ФК А, С, В, Н, J обладают физиологической, в том числе.-антистрессовой, активностью, сравнительное соотношение значений которой зависит от исследуемого физиологического процесса, вида растения • и его сорта. Показана- зависимость физиологической активности - фузккокцинов от строения молекулы. ■. В ряде экспериментов эффект ФК О, О, Н иш J превышает воздействие- Ж А, что позволяет рассматривать фузикокцины как перспективную -для использования в-сельском хозяйстве группу регуляторов роста, растений.

6. Процесс погруженного культивирования Р.агпудйаН сопровождается следупцей последовательностью накопления ФК: Н —♦

J —* А —<• С —► D. Осуществлению данной последовательности превращений способствуют высокие значения pH среды и температуры процесса, интенсивная аэрация и увеличение длительности ферментации. С учетом выявленных закономерностей образования индивидуальных ФК и, ее зависимости от условий выращивания продуцента разработаны способы направленного микробного синтеза физиологически активных фузикокцинов А, С, Б, Н и J. 7. Разработаны научно обоснованные биотехнологии получения физиологически активных Ж А и С, включаящие способ выращивания посевного материала и условия ферментации, обеспэчзващие как высокую суммарную концентрацию ФК, так и создание селективных условий для получения ШК А или С. Показана стимуляторная роль видимого света в образовании ФК. Разработан способ выделения ФК, впервые в качестве сорбента использована смола Полисорб. Предложены критерии контроля процессов ферментации и подготовки посевного материала, а также - схема управления процессом микробного синтеза ФК А. На основе разработанной биотехнологии составлен опытно-промышленный регламент на производство ®С А и "" налажено его опытное производство.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

' -1. Муромцев P.C., Коренева В.М., Краснопояьская Л.М. О некоторых физиологических эффектах нового регулятора роста растений фузикокцина.// Сельхоз.биология, 19S0.-t.15.- И 5. -с.699-703.

2. Муромцев Г.С., Коренева В.М., Краснопольская Л.М., Евлампьева М.А. Питательная среда для культивирования . продуцента фузикокцина - Pusicoccm anygdali. // Авторское свидетельство СССР Н 1172515, 1980.

3. Муромцев Г.С., Кобрина Н.С., Вобликова В.Д., Коренева В.М., Краснопольская Л.М. Обнаружение фузикокциноподобнсго вещества в початках кукурузы.// В сб: Регулятор! роста и развития растений. Тезисы докл. I Всесоюзной конференции. М., 1981. - С.78.

4. Краснопольская Л.М., КореЕева В.М., Муромцев Г.С. Изучение условий микробного синтеза фузикокцина. // Микол." и фитопатол., 1984. - N 1. - С.48-52.

5. Максимова P.A., Пальмова Н.П., Аббасова К.А., Семенов М.Н.,

Полин Д.Н., Ыуромцев Г.С., Краснопольская Л.М., Чудар В-С. Питательная срэда для культивирования Fusicoccum amygdaii-продуцента фузикокцина. // Авторское свидетельство СССР N 1378364, 1984.

6. Коренева В.М., Краснопольская Л.М«, Кобрина Н.С., Воблшсова

B.Д. Метода определения регулятора роста растений фузикокцина. //В сб: Метода определения некоторых регуляторов роста растений (методические рекомендации). М., 1984. - С.16-22.

7. Muromtsev G.S., Kracnopolskaya L.M., Nagubnova L.A. Effects oi - growth retardants on the microbial synthesis oi physiologycally active.terpenoids. // In: 12th 'Intern.conference on Plant Growth Substances. Heidelberg,11985. - P.19.

8. Muromtsev G.S., Pavlova Z.N., Rrasnopolskaya I.if. Physiologically active" terpenoids and their interaction with growth retardants. // In: Plant Growth Regulators. Proc. 4th Intern. Symp. Pamporovo, 1986. - Part 1. - P.209-218.

9. Muromtsev G.S., Xrasnopolskaya L.M., Gorbatyuk M.S., Stolpakova V.V., Grishina I.I., Sadovskaya V.L. Pusicoccins: microbial synthesis, Isolation, identification and physiological activity. // In: New Bioactive Metabolites Irom Microorganisms. 2nd Intern.Syrap. Proceedings."" Gera, 1988. - P.110. .

10. Муромцев Г.С., Краснопольская Л.М., Приеде М.А., Горбатик Н.С., Столпакова В.В., Гршгина И.И., Садовская В.Л.,. Султонов ГО.С. Микробный синтез фузикокцинов и практическое применение фузикокцина А. // В сб: Проблемы и перспективы биотехнологии. Братислава, 1989. - С.62-63.

11. Ыуромцев Г.С., Павлова З.Н., Краснопольская Л.11., Нагубнова Л.А. Взаимодействие ретардантов с физиологически активными терпеноидами. // Изв. АН СССР, серия Биол., 1989. - N 1. -

C.116-123.

12. Приеде М.А., Чудар B.C., Аре Р.Ю.* Логина A.S., Краснопольская Л.Ы., Муромцев Г.С. Основные характеристики микробного синтеза фузикокцина в ферментационных установках. // Докл.ВАСХНШГ, 1989. - Н 8. - С.2-5.

13. Палева Н.С., Краснопольская Л.Ц., Ыуромцев Г.С. Статистический анализ информационных потоков по регуляторам роста растений микробного происхождения. // В сб: Микроорганизмы

- стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных. Тезисы докл. Всесоюзной конференции. Ташкент, 1989. - С. 148.

14. Muromtsev G.S., Gorbatyuk M.S., Grishina I.I., Krasnopolskaya L.M., Priede M.A., Sadovskaya V.L., Stolpakova V.Y., Syltonov Yu.S. Fusicoccins: microbial synthesis, Identification, physiological activity and practical application. // Progress in Industrial Microbiology,

1989. - V.27. - P. 193-203.

15. Муромцев Г.С., Краснопольская Л.Ы., НагуСнова Л.A. Взаимодействие . ретардантов и цитокининов с физиологически активными терпеновдаш. // В сб: Регуляторы роста 'растений (сборник научных трудов). ВШИСБ, ВИР. Л., 1989. - С.82-86.

-16. Muromtsev G.S., Krasnopolskaya L.M., Nagubnova Ь.А., Sokolova L.M. Physiologically active terpenoid metabolites ol lungl. // In: 4th Intern. Mycological Coungress. Abstracts. Regensburg, 1990. - P.246.

17. Krasnopolskaya L.M., Gorbatyuk M.S., Muromtsev G.S. Biosynthesis oi fusicoccins by iungus Fusicoccum amygdali Del. // In:-4th. Intern. Mycological-Coungress. Abstracts. Regensburg,

.1990. - P.240.

18. Чудар B.C., Приеде M.A., Ape Р.Ю., Дзенис С.В., фунта Б.P., Логина А.Ж., Муромцев Г.С., Краснопольская Л.Ы. Способ получения фузйкокцина А. Заявка № 4332155/30-13, 23.11.88 (приоритет). Авторское свидетельство СССР J61565020 С 12 J61/14, АО /й 63/04,

1990.

19. Садовская В.Л., Ракитин Л.Ю., Гришина И.И., Краснопольская Л.М., Муромцев Г.С., Шевченко В.П. .Количественное определение фузикокциновых терпеноидов . методом вторично-ионной масс-спектрометрии. // Виоорганическая химия, 1990. - Т.16. - N 10. - С.1407-1412.

20. Адеиптвили Т.Ы., Симонян Г.Г., Каландадзе Д.Д., Каличава Г.С., Краснопольская Л.М. Влияние фузикокцина на фитохимическую активность хлоропластов пшеницы. // Известия АН Грузии, сер. биол., 1991. - Т.17. - С.402-406.

21. Muromtzev G.S., .Krasnopolskaya I.M., Sokolova L.M., liakeeva A.P., Gorbatjuk M.S., Nagubnova I.A. Terpenoidd plant growth regulators produced by pbytopathogenic iungi. // In: Abstracts

14th International,.- Conference on -Plant Growth ' Substances, Amsterdam, July 21-26, 1991. - P.56. .

22. Муромцев Г.С., Краснопольская JIЛ., Соколова Л.М., Макеева А.П., Нагубнова Л.А. Изучение направленного синтеза индивидуальных габбереллшов грибом Glbbsrella fujlknrol. // В сб: Пути эффективного использования достижений биотехнологии в агропромышленном комплексе, Тезисы Всесовз. конференции, Черновцы, 1991. - Г.1. - С. 103.

23. Горбатюк М.С., Краснопольская Л.М., Муромцев Г.С. Действие индивидуальных фузикокцинов на прорастание се?лян сельскохозяйственных культур. //В сб: Микроорганизмы в сельском . хозяйстве. Тезисы докл. 1У Всесоюз. научной конференции, Пушино, 1992. - с:42.

24. Макеева А.П., Соколова Л.М., Русинова М.И., Краснопольская Л.М., Муромцев Г.С., Приеде IS.A. Характеристика процессов гликробного синтеза гиббереллинов Ад, А^ и А^ штаммами Pusarlum moniliforme. //В сб: Регуляторы роста и развития растений. Тезисы докл. 11 конференции, М-, 1993. - 4.1. - С.46.

25. Краснопольская Л.Ы., Сафрай А.П., Нагубнова Л.А., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А. Возможность применения регуляторов роста и развития в биотехнологиях культивирования съедобных грибов. // В сб: Регуляторы роста и развития растений. Тезисы докл. 11 конференции, М., 1S93. - 4.2. - С.99.

2S. Priede М. „ Karklins R., Krasnopolskaya L., Sadovskaya V.' Microbial synthesis of gibberelllns using varios strains of fungus Pusarium moniliforme. // Proceedings of Latvian Academy of Science, 1993. - S3. - P.49-55.

27. Priede "M., Karklins H., Viesturs" U., Krasnopolsfcaya L. Pusicoccins production by fungus Pusicoccua amygdali Del. at different agitation/aeration regimes. // Proceedings of Latvian Academy of Science, 1993. - II 3. - P.56-60.

28. Краснопольская Л.М., Горбатюк M.C., Можина И.А-., Муромцев Г.С. Сравнительное изучение штаммов Pusicoccum amygdali Del. . -продуцентов регуляторов роста растений фузикокцинов. // Микология и фитопатология, 1993. - II 1. - С.46-50.

29. Priede И., Viesturs П., Krasnopolskaya L. Effect оГ

' different bloreactor mixing systems on gibberellic acid"

production. // CHISA,93. 11th Int. Congress ol Chemical Engineering, Chemical Equipment design and Automation. Chech. : republic, 1993. - Paper N 432. - 8 p.

30. Красиополъская Л.М., Горбатюк M.C., Приеде U.A., Садовская ; ' В.Л. Влияние условий культивирования гриба Pusicoccum ainygdali i ва образование индивидуальных фузикокцинов. // Биотехнология,

' 1994, - N 10. - С.18-21.

31. Kuromtsav G.S., Voblikova V.D,, Kobrina N.S., Koreneva V.M., ! Krasnopolakaya L.M., Sadovskaya V.l. Occurence of Pusicoccanes | in plant and iungi. //• J.Plarit Growth Regulation, 1994.- V. 13.-I N 1. - P.39-49.

I 32. Муромцев Г.С., Краснопольская Л.М., Нагубнова Л.А.

• Сравнительный анализ действия ретардантов на микробный синтез

j физиологически активных терпеноидов. // Доклада АН, 1994. -

\ Т.335. - КЗ. - C.38S-387.

33. Муромцев Г.С., Горбатюк М.С., Краснопольская Л.М. Получение и физиологическое действие индивидуальных фузикокцинов на сельскохозяйственные культуры. // Доклады РАСХН., 1994. - N Б. -С.10-13.

34. Краснопольская Л.Ы., Нагубнова Л.А., Сафрай А.И., Завьялова Л.А., Гарибова Л.В. Влияние" регуляторов роста на рост и развитие некоторых шляпочных грибов. // Микология и фитопатология , 1994.

" •-■ Т..28. --Вшг.2. - С.15-20. ' '

35. Краснопольская Л.М., Нагубнова Л.А., Муромцев Г.С. Действие ретардантов на микробный синтез фузикокцинов. // Прикладная биохимия и микробиология (в печати).