Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие лигнина и конденсированных дубильных веществ в защитной реакции хвойных на патогенные грибы

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полякова, Галина Геннадьевна, Красноярск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт леса им. В. Н. Сукачева

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Галина Геннадьевна

УДК 630*42:161.4:612.017.1

Участие лигнина и конденсированных дубильных веществ в защитной реакции хвойных на патогенные грибы

Специальность 03.00. 16 - экология

03. 00. 12 - физиология растений Диссертация на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук В. И. Осипов

кандидат биологических наук В. П. Ветрова

Красноярск 1999

Оглавление

Введение ................................................................................................4

Глава 1. Участие лигнина и проантоцианидинов в защитной

реакции растений на патогенные грибы .................................. 9

1.1. Защитная реакция растений на патогены .......................... 9

1.2. Метаболизм фенольных соединений при взаимодействия растения-хозяина и паразита ....................... 13

1.3. Характеристика лигнина и проантоцианидинов .............. 18

1.3.1. Проантоцианидины, - строение и функции .................... 18

1.3.2. Лигнин, - строение и функции.......................................... 22

1.4. Защитная реакция хвойных на грибы, ассоциированные

с насекомыми-ксилофагами ................................................. 26

Г л а в а 2. Объект и методы исследования .......................................... 31

2.1. Характеристика объекта исследования в опытах

in vivo (на деревьях) и in vitro (на культуре ткани) .................31

2.2. Инокуляция деревьев и воздействие на каллусные культуры ...................................................................................... 32

2.3. Отбор образцов для анализа .............................................. 35

2.4. Приготовление мицелиальных препаратов .....................35

2.5. Анализ растительного материала .....................................36

Г л а в а 3. Участие лигнина и проантоцианидинов в защитной

реакции флоэмы ствола пихты на грибы, различающиеся

по скорости распространения в тканях растения .................39

Г л а в а 4. Участие лигнина и проантоцианидинов в защитной реакции флоэмы ствола пихты на инокуляцию гриба Verticillium sp. в разные фенофазы летнего периода............. 50

Г л а в а 5, Участие лигнина и проантоцианидинов в защитной реакции флоэмы ствола пихты на патогенные грибы у деревьев, устойчивых и неустойчивых к черному

пихтовому усачу ......................................................................... 62

Г л а в а 6. Снижение активности физиологических механизмов

противоинфекционной защиты ели при подтоплении .........71

Г л а в а 7. Индуцирование защитной реакции хвойных

элиситорами патогенных грибов в опытах in vitro и

in vivo ..........................................................................................85

Заключение .....................................................................................103

Выводы ............................................................................................... 108

Литература .................................................................................... 110

Введение

Оценка устойчивости и чувствительности хвойных к болезням и вредителям важна для прогнозирования вспышек численности насекомых и эпифитотий грибных болезней. Диагностика возможного развития очагов ксилофагов в хвойных лесах разработана слабо и основана, как правило, на определении активности смоловыделения (Положенцев, 1965). Этот показатель, названный П.А. Положенцевым, "живичным индикатором", хорошо работает только на сосне и ели, имеющих регулярное расположение смоляных ходов. Для пихты и лиственницы характерно другое строение смолоносной системы, поэтому использование живичного индикатора невозможно. Это вызвало необходимость разработки иных методов биодиагностики, в частности, исследование реакции деревьев на патогенные грибы, ассоциированные с насекомыми-ксилофагами.

В течение последних десятилетий проводятся активные исследования индуцированных защитных реакций хвойных в ответ на инокулирование патогенов с целью изучения механизмов их устойчивости (Reid et aL, 1967, Wong, Berryman, 1977, Hain 1983, Cook, Hain, 1987, DeMars et aL, 1988, Paine et al., 1997). В качестве грибов, индуцирующих защитную реакцию флоэмы хвойных, используют фитопатогенные ассоцианты стволовых вредителей, причем значительная часть работ в данной области выполнена с применением возбудителей синевы древесины из семейства Ophiostomataceae Nannf. Признаком патогеиности этих грибов является возникновение обширных некрозов флоэмы после инокуляции гриба в проводящие ткани хвойных. Исследования показали, что грибы Verticillium sp. и Leptographium sp., переносимые черным пихтовым усачом Monochamus urussovi Fisch., будучи занесены во флоэму ствола

здорового дерева, вызывают обширные некрозы флоэмы хвойных, в том числе пихты сибирской (Abies sibirica Ledeb.), ели сибирской (Picea obovata Ledeb.) и лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) (Ветрова и др., 1995). Связь со стволовым вредителем, установленная патогенность и широкий спектр хозяев данных грибов позволяет использовать их в качестве индукторов защитных реакций проводящих тканей при изучении устойчивости хвойных к болезням и вредителям.

Инокуляция грибов, переносимых насекомыми-ксилофагами, в проводящие ткани хвойных вызывает защитную сверхчувствительную реакцию, направленную на остановку и инактивацию патогена (Reid et ah, 1967, Wong, Berryman, 1977, Cook, Hain, 1987, DeMars et ah, 1988, Paine et ah, 1997). Эта реакция включает такие процессы, как некротизация инфицированных тканей, накопление в инфицированных и смежных с ними клетках терпеноидных и фенольных соединений (Reid et ah, 1967, Shrimpton, Whitney, 1969, Brignolas et ah, 1995). Предполагается, что активность защитных механизмов при этом зависит от запаса углеводов в тканях флоэмы и транспорта их к месту инфекции (Christiancen, Ericsson, 1986).

Образование сверхчувствительных некрозов свидетельствует о несовместимости растения-хозяина и патогена (Kosuge, 1969). Размеры некроза характеризуют устойчивость растения к патогенным грибам, так как в случае несовместимости число некротизированных клеток соответствует числу пораженных клеток (Озерецковская и др., 1995). Параметры защитной реакции флоэмы ствола хвойных на офиостомовые грибы, в частности, величина некроза, содержание смолы, могут характеризовать степень устойчивости хвойных к патогенам (Raffа, Berryman, 1982, Cook, Hain, 1987). Однако, в литературе не имеется примеров, демонстрирующих возможность

оценки снижения устойчивости хвойных при действии неблагоприятных экологических факторов.

Большинство ранних исследований реакций растений на заражение патогенными грибами было направлено на поиск веществ, токсичных для насекомых-переносчиков, и, в основном, ограничивалось анализом вторичного смолообразования (Hain et ai., 1983, Cook, Hain, 1987, 1988, Beriyman, 1988). Роль фенольных соединении в индуцированнои защите хвойных менее изучена, хотя эта группа веществ известна у древесных своей антимикробной активностью против многих паразитических грибов (Gottstain, Gross, 1992).

Лигнин и конденсированные дубильные вещества, называемые также проантоцианидинами, относятся к полимерным фенольным соединениям. У хвойных содержание лигнина и проантоцианидинов составляет около четверти сухой массы (Stafford, 1988, Запрометов, 1996). Лигнин локализован главным образом во вторичных клеточных стенках и срединных пластинках трахеид, сосудов, волокон (Davin, Levis, 1996) и выполняет функцию укрепления клеточных стенок. Лигнин обнаружен также в стенках паренхимных клеток и в межклеточном пространстве (Batcher, 1977). Каллусные и суспензионные культуры хвойных содержат лигнифицированные клетки (Venverloo, 1969, Davin, Levis, 1992, Запрометов, 1996). На травянистых растениях установлено, что лигнин выполняет защитную функцию (Moerschbacher, 1990). Исследование участия в защитной реакции флоэмы ствола хвойных лигнина, образующегося в тканях растения в ответ на инфицирование, не проводили.

Свободные дубильные вещества находятся в клеточной вакуоли растения. Предполагают, что дубильные вещества, как и лигнин, выполняют защитную функцию (Stafford, 1988). Имеющиеся данные об

изменении содержания проантоцианидинов в зоне реакции хвойных на инфекцию достаточно противоречивы (Jewell, 1976, Hemingway et ah, 1977 Brignolas et ah, 1995).

Таким образом, представленные литературные данные показывают недостаточную изученность защитной функции лигнина и проантоцианидинов у хвойных и требуют дополнительных исследований.

Цель исследований - оценка роли лигнина и конденсированных дубильных веществ в защитной реакции хвойных к патогенным грибам, переносимым насекомыми-ксилофагами. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) исследование динамики содержания лигнина и проантоцианидинов в некротизированных участках флоэмы ствола хвойных, возникающих в ответ на действие фитопатогенных ассоциантов черного пихтового усача;

2) изучение содержания лигнина и проантоцианидинов во флоэме ствола пихты после инокуляции патогенных грибов в разные фенофазы летнего периода;

3) сравнительный анализ содержания лигнина и проантоцианидинов в инфицированной флоэме ствола хвойных у деревьев с разным уровнем устойчивости;

4) изучение влияния экстрактов из мицелия патогенных грибов на содержание лигнина и проантоцианидинов при действии их на флоэму ствола и культуры ткани хвойных.

В результате проведенных исследований получены новые данные по содержанию полифенолов у хвойных, отражающие механизм защитной реакции деревьев на патогенные грибы, переносимые

насекомыми-ксилофагами. Впервые показано накопление лигнина во флоэме хвойных в зоне воздействия офиостомовых грибов, либо их метаболитов. При этом отмечена связь скорости накопления лигнина с устойчивостью хвойных к грибам. Доказана индуцирующая активность метаболитов офиостомовых грибов in vivo и in vitro. Получено подтверждение концепции о связи процессов роста, и защиты и снижении активности процессов защиты в период активного роста (Lorio, 1988).

Полученные результаты демонстрируют возможность биоиндикации устойчивости хвойных к насекомым-ксилофагам и патогенным грибам по биохимическим параметрам защитной реакции на офиостомовые грибы, либо их метаболиты.

Работа является составной частью исследований Инситута леса по теме "Физиологические основы инфекционного иммунитета хвойных" и проводилась в комплексе с сотрудником лаборатории лесной микробиологии Н. В. Пашеновой. Эксперименты на культурах ткани осуществлялись в комплексе с сотрудником лаборатории физиологии и биохимии древесных растений Г. К. Зражевской.

Глава 1. Участие лигнина и проантоцианидинов в защитной реакции растений на патогенные грибы

1.1. Защитная реакция растений на патогены

Различают два вида устойчивости растений к патогенам: конститутивную и индуцированную, что соответствует понятиям пассивного и активного иммунитета. Иммунитет - высшая форма проявления устойчивости, полностью исключающая возможность развития паразита. В отличие от иммунитета устойчивость растений может колебаться в широких пределах и характеризовать весь диапазон потенциального ущерба от развития паразита (Исаев, Гире, 1975). Конститутивная устойчивость определяется комплексом качеств, присущих растению вне зависимости от контакта с патогеном. Индуцированная устойчивость растений характеризуется свойствами, которые до встречи растения с патогеном не обнаруживаются и выявляются лишь как следствие непосредственного взаимодействия хозяина с патогенным агентом. При этом происходит реализация потенциальных возможностей, которые заложены в организме растения-хозяина (Рубин и др., 1975). Решающая роль в защите от инфекции принадлежит активному иммунитету. В связи с этим первостепенное значение приобретает изучение биохимической природы активной ответной реакции растения на поражение, определяющей исход взаимоотношений между растением-хозяином и паразитом (Метлицкий, Озерецковская, 1966).

Сверхчувствительная реакция (СВЧ-реакция) - универсальный защитный механизм в растительном царстве, который действует независимо от того, является ли патоген грибом, вирусом или бактерией (Klement, Goodman, 1969). Характерным признаком реакции

является быстрое отмирание зараженных клеток, сопровождающееся остановкой и инактивацией инфекционного агента в них. Во время СВЧ-реакции вместе с проникшим паразитом погибает часть окружающих его клеток растения-хозяина; за счет гибели части сохраняется организм в целом. В случае действия на растение несовместимой расы гриба число некротизированных клеток соответствует числу пораженных клеток и может поэтому служить показателем резистентности растения (Озерецковская и др., 1995); чем шире зона некроза, тем меньше устойчивость ткани растения. Наоборот в случае поражения растения совместимой расой инфицированные клетки долгое время остаются живыми.

Основным свойством патогенности является способность штамма начать размножаться и продолжать пролиферацию в клетках хозяина. В естественных условиях патогены могут проникать через устьица растения-хозяина, поступать в межклеточное пространство и размножаться. Клетки хозяина, расположенные рядом с зараженными клетками, погибают и таким образом локализуют инфекцию. Быстрота, с которой происходит образование некрозов, лишает микроорганизмы доступного источника питания и неизбежно предотвращает их дальнейшую пролиферацию.

Клементом и Гудманом (Klement, Goodman, 1969) была предложена гипотеза биохимической природы реакции сверхчувствительности. Данная гипотеза постулирует, что СВЧ-реакция вызывается разрывом S-S-связи мембранных белков, что приводит к разрушению третичной структуры белков с сопутствующим этому нарушением мембранной проницаемости. Нарушение проницаемости может, в свою очередь, приводить к утечке фенолов и фенолоксидаз из клетки, следовательно ферменты и субстраты могут реагировать за пределами клетки с внедрившимся патогеном.

СВЧ-реакция характеризуется накоплением в инфицированных и смежных с ними клетках продуктов вторичного метаболизма, терпеноидных и фенольных соединений, в том числе, полимеров, модифицирующих клеточную стенку (Vance et al., 1980, Darvill, Albeersheim, 1984, Ильинская и др., 1991). В ответ на заражение грибами в клетках устойчивых растений синтезируются полисахариды, в частности целлюлоза и каллоза, присоединяющиеся к внутренней поверхности клеточной стенки, а также полимерные фенольные соединения. Фенолы, связываясь со структурными белками клеточных стенок, образуют барьер в местах инфекции (Горбачева и др., 1991). Большое значение в модификации клеточных стенок при инфицировании имеет лигнификация и суберинизация. Лигнифицированные оболочки клеток служат преградой на пути распространения инфекции так как лишь немногие паразиты могут разрушать лигнин. Вокруг внедряющегося паразита образуется кольцо лигнифицированных клеток (Vance et al., 1980).

Суберин образуется при формировании эфирных связей между лигнином и полиэфирами жирных кислот. Суберин откладывается изнутри клеточных оболочек и также служит физическим барьером для патогена.

Изучение СВЧ-реакции позволило выявить наличие у травянистых растений защитной системы, которая проявляется в синтезе фитоалексинов в ответ на действие микробных элиситоров (Метлицкий и др., 1976, Ильинская и др., 1991, Озерецковская, 1994, Darvill, Albershen, 1984).

Фитоалексины - это особый класс фитонцидов высших растений, практически отсутствующих в интактных тканях, но появляющихся в ответ на контакт с патогенами. Для патогена они токсичны. Эти

соединения принимают активное участие в защитных реакциях растений. Основным механизмом, регулирующим содержание фитоалексинов в клетках является, по-видимому, контроль их биогенеза путем индукции или подавления активности ферментов, участвующих в биосинтезе этих соединений. На бобовых, у которых фитоалексины представлены изофлавоноидами, показано, что при несовместимом взаимодействии в инфицированных клетках быстро накапливаются мРНК, кодирующие ферменты, участвующие в синтезе изофлавоноидов из фенилаланина. Поранение также вызывало аналогичные изменения но в меньшей степени (Горбачева и др., 1991).

Микробные элиситоры - определенные метаболиты фитопатогенов, воздействие которых на растения приводит к ответному включению защитных реакций в растительных тканях. Термин элиситор происходит от английского слова ю еНске - вызывать. Вещества, образующиеся в поврежденных растительных клетках, обладающие элиситорной активностью называют эндогенными элиситорами. Элиситорными свойствами обладают два типа полисахаридов клеточных стенок грибов: р-глюканы и хитозан (Чалова и др., 1976, Васюкова и др., 1989). Некоторые из известных к настоящему времени элиситоров содержат в своем составе белковые и полипептидные компоненты. Особую группу элиситоров представляют метаболиты фитопатогенов, содержащие в своем составе липидные компоненты. Так, установлено, что активными элиситорами защитных реакций картофеля являются полиненасыщенные жирные кислоты С-20 ряда -арахидоновая и эйкозопентаеновая, присутствующие в составе индуктора, выделенного из гриба - возбудителя фитофтороза (Озерецковская и др., 1987, Озерецковская и др., 1994, Ильинская и др., 1996).

1.2. Метаболизм фенольных соединений