Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез фенольных соединений в процессе формирования побега сосны обыкновенной

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез фенольных соединений в процессе формирования побега сосны обыкновенной"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

А Г!

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Людмила Павловна

.УДК 581.19:577.152,1

Биосинтез фенольных соединений в процессе формирования побега сосны обыкновенной

03.00.12 — Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ дпссертацип па сопскаппе ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск 1994

Работа выполнена в Институте леса имени В. Н. Сукачева СО РАН.

доктор биологических наук В. И. Осипов

доктор биологических наук Е. Н. Музафаров

кандидат биологических наук Т. И. Голованова

Красноярский Аграрный университет

Защита диссертации состоится « ¿¿sMrt/Л- 1994 г.

часов на заседании Специализированного совета К 064.61.02 но присуждению степени кандидата наук в Красноярском Государсгзепном университете по адресу-' 660062. Красноярск, пр. Сзободный, 79, ауд. 43-18.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке Красноярского Государственного университета.

¿¿л г

Автореферат разослан ,. ^ " __J994 года

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук Е. Я. МУЧКИНА

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организации:

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из характерных особенностей растительных организмов является способность синтезировать и накапливать значительные количества соединений фенольной структуры. Эта важная . по биологическим функциям и богатая по разнообразию группа яторичных веществ широко представлена в высших растениях. Хвойные являются уникальными представителями древесной растительности, в тканях и органах которых обнаружены практически Еое группы фенольных соединений. Наряду с моно- и олигомерами в них присутствуют полимерные формы: конденсированные дубильные вещества (проантоцианидины) и лигнин. По своей функциональной значимости важное место принадлежит лигнину. Обычно его присутствие связывают с наличием опорных и проводящих тканей, например, ксилемы. Лнгнин активно образуется в процессе дифференциации этой ткани, его содержание в древесине достигает 25-35% (Грушников, Елкин, 1973).

В клетках других тканей, например, мезофилла, паренхимы, флоэмы лигнин присутствует в малых количествах или вообще не обнаруживается. Однако у них синтезируются и. накапливаются фенольные соединения другого типа. У хвойных наиболее широко представлены оксибензойлые и оксикоричные кислоты, стильбены, катехины, но в количественном отношении преобладают проантоцианидины.

По современным представлениям процесс биосинтеза фенольных соединений состоит е диссимиляции фенилаланика - одного из конечных продуктов шикиматного пути. У древесных растений, судя по количественному содержанию фенольных соединений в клетках практически всех тканей, отот процесс отличается особенно высокой' активностью. Однако, именно эта сторона метаболизма исследована у них, в том числе и у хвойных, очень слабо.

В связи с этим, главная цель проведенных исследований состояла в установлении общих закономерностей биосинтеза фенольных соединений в различных органах и тканях сосны обыкновенной, а также взаимосвязи этого процесса с функционированием шикиматного пути.

В соответствии с целью исследований Ьътл поставлены следующие задачи:

- исследовать особенности состава фенольных соединений в различных органах и тканях формирующегося побега сосны обыкновенной;

- изучить биосинтез фенольных соединений в хсое в связи с процессами ее роста;

- изучить пути превращения 14С-шикимовой кислоты в различные фенольные соединения;

выяснить взаимосвязь обмена преэроматических предшественников (хинной и шикимовой кислот) и биосинтеза фенольных соединений в процессе роста и формирования побега сосны обыкновенной.

Научная новизна. В предлагаемой работе впервые про ведено изучение биосинтеза фенольных соединений в процессе роста и формирования побега сосны обыкновенной. Исследованы количественные аспекты и характер биосинтеза фенольных соединений в различных органах и тканях. Особенность данной работы заключается и в том, что в качестве объекта выбрана сосна обыкновенная - наиболее яркий представитель древесных растений, накапливающий в тканях большие количества лигнина и растворимых полифенолов. В экспериментах использовали различные органы и ткани, поскольку они имеют специфические особенности не только в интенсивности и направленности процесса синтеза фенольных соединений, но и в функционировании шикиматного пути. Благодаря этому подходу в результате исследований получен ряд новых данных. Установлено, что основным предшественником фенольных соединений у хвойных, как и у большинства высших растений, является фенилаланин и что скорость его образования - главный фактор, определяющий интенсивность синтеза фенилпроланоидов. Впервые показало, что биосинтез лигнина у хвойных непосредственно связан с углеводным метаболизмом растительной клетки, а не язляется только вторичным процессом диссимиляции фенилаланина.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты расширяют наше представление о биосинтезе фенольных соединений у хвойных и дают

возможность понимания тех особенностей метаболизма, которые обеспечивают высокую эффективность синтеза лигнина у древесных растений. Кроме того, это позволяет проводить целенаправленные исследования взаимосвязи основного и вторичного метаболизма.

Результаты работы представляют определенный интерес как научная основа для прикладных разработок, связанных с регулированием интенсивности фенольного обмена у высших растений. Из результатов более частного характера существенную практическую ценность может представить препаративный метод получения 14С-хинной и 14С-шикимовой кислот из хвои сосны и ели, разработанный нами.

Апробация работы и публикации. Результаты работы и ее отдельные разделы докладывались и демонстрировались на II и III Всесоюзной конференции по физиологии и биохимии древесных растений (Красноярск, 1982', Петрозаводск, 1989), на Всесоюзном семинаре по биосинтезу фенольных соединений у высших растений (Красноярск, 1980), на IV и V Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Ташкент, 1982, Таллин, 1987), На Всесоюзной конференции "Экстрактивные вещества древесных растений" (Красноярск, 1986), на Международной конференции "Экологическая физиология хвойных" (Абакан, 1991). По теме диссертации опубликовано 17 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы. Общий объем 168 страниц. Список литературы включает 376 названий, в Том числе 301 на иностранных языках. Текст иллюстрирован 20 рисунками и включает 13 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ХВОЙНЫХ

Глава имеет обзорный характер. Рассматриваются литературные данные о распространении фенольных соединений у хвойных растений и их функциях Дается характеристика состава отдельных групп фенольных соединений у различных растений, а также представлений о

принципах биосинтеза различных групп фенолов путем постепенного усложнения структуры.

Анализ литературных данных по фзнольным соединениям хвойных показал, что большинство исследователей ставили себе целью определить количественное и качественное содержание фенольных соединений, установить их роль в устойчивости растительного организма, либо в связи с сезонными изменениями или возрастом дерева. Обширны исследования по изучению состава компонентов древесины хвойных, расшифрованы основные, этапы их синтеза, выявлены многие ферменты, участвующие в этом процессе, установлена их внутриклеточная локализация и свойства.

Исследований, касающихся биосинтеза фенольных соединений на ранних этапах формирования органов и тканей сосны обыкновенной, относительно мало и в них функционирование шикиматного пути но связывалось с интенсивностью синтеза фенольных соединений. Между тем, имеющиеся сообщения дали нам основания предполагать возможность существования непосредственной связи биосинтеза полифенольных структур и интенсивности функционирования шикиматиоги пути.

Глава 2. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектам исследования служили 5 - 19-летние деревья сосны обыкновенной. Деревья росли в питомнике Погорельского стационара Института леса им. В.К. Сукачева СО РАН или в естественных условиях с городской зоне г. Красноярска. В зависимости от целей эксперимента анализировали хвою, луб и древесину побегов текущего года, хвою различного возраста, а таюхе проростки хвойных.

Методы. При анализе основных и вторичных метаболитов растительный материал гомогенизировали и экстрагировали 80%-ным этанолом. Экстракт упаривали досуха и остаток растворяли в горячей вода. Сухой неэкстрагируемый спиртом остаток использовали для выделения белковых аминокислот, лигнина и проантоцианидинов. Метаболиты основного обг/зна. Разделение суммарного экстракта на фракции аминокислот, органических к-юпот и углэводов осуществляли колоночной

ионообменной хроматографией на ионообменных смолах (Осипоз, Александрова, 1982).

Аминокислоты выделяли, используя катиониты КУ - 2x8, КРС - 4 и дауэкс 50x8 (з Н+-форме), методом ТСХ на пластинках "Фиксион 50x8" /Венгрия) -Щевени, Гергей, 1976). Количество фенилаланина и тирозина определяли методом ЕЭЖХ на Милихромэ. Сорбент нуклеосил 5 С-18 (ßagge, Larson, 1986). Аминокислоты белков выделяли из растительного остатка, нерастворимого в 80%-ном этаноле, после 24-часового гидролиза с 6 н. HCl (Lunderstadt, 1976).

Органические кислоты выделяли, используя дауэкс 1x8 или 2x8 (в СНзСОО~ -форме), разделяли двумерной хроматографией на бумаге FN-15 или на пластинках "Силуфол UV-254" в системах I) н-бутанол - уксусная кислота - вода (4:1:1), 2) этанол-25%-ный - NH,OH - вода (85:5:10).

{'идроароматическив кислоты. Для разделения использовали хроматографию на бумаге FN-15 в системе: бензиловый спирт - н-бутанол - пропанол - вода (3:1:1:1), содержащей 2% муравьиной кислоты. Для обнаружения и идентификации гидроароматических аминокислот использовали специфические проявители (Hasiam et al., 1SS3; Curtvvright, Roberts, 1S55). Количество кислот определяли по методу Будэ (Boudet, 1972). Для построения калибровочных графиков использовали фирменные препараты хинной (GEE LAWSAN Chemicals, Англия) и шикимовой (GMBH&Cj München, ФРГ) кислот.

Количественное определение лигнина проводили в растительном остатке, нерастворимом в 80%-ном этаноле. Использовали метод Классона в модификации Сугано с соавт. (Sugano e.t at., 1975) и метод с тиогликолесой кислотой (Brookbank, Brauns, 1940), модифицированный нами.

Растворимые фенольные соединения анализировали после гидролиза суммарного экстракта с 2 М HCl при 1С0"С. Осадок проантоцианидинов в виде флобафенов отделяли центрифугированием, а из раствора с помощью абсорбционной хроматографии на полиамиде выделяли фракцию фенолкарбоновых кислот (Schmidtlein, Herrmann, 1975; Schulz, Herrmann, 1980).

Разделение фенолкарбоновых кислот осуществляли

двумерной хроматографией на бумаге FN-16 в системах: 1) бензогг.уксусная кислота:вода (125:72:3), 2) муравьинокисяый натрий (10 г) + муразьиная кислота (1 мл) и вода до 200 мл. Общее количество фенолкарбоновых кислот определяли колориметрическим методом, используя реактив Фолина-Дениса (Marigo, 1973). Количество проантоцианидиноз определяли по методу Стаффорд и Лестер (1980).

Глава 3. СОСТАВ И ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ ФсНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ У СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

Фекольньш соединения хбсйных. Комплекс фенолоных соединений, присутствующих в клетках различных тканей хвойных, можно разделить на два основных типа: лигнин и растворимые полифенолы. В древесине наиболее характерным фенольным компонентом является лигнин. Его содержание в этой ткани достигает 25-35% сухой массы, тогда как доля растворимых полифенолов не превышает 2%. Хвоя и луб однолетнего побега сосны содержат меньше лигнина, чем древесина (10-12%), но концентрация растворимых полифенолов в них выше в 4-5 раз. По данным различных исследователей (Громова и др., 1971; Медведева и др., 1S74 а,б,в; Ткжавкина и др., 1970, 1974, 1977; Niemann, 1972, 1976, 1979) состав этой группы фекальных соединений представлен широким кругом веществ. Обнаружены оксикоричные и оксибензойные кислоты, лигнаны, стильбены флавоноиды и ряд других соединений. При изучении состава фракции фенолкарбоновых кислот, выделенных из различных органов и тканей сосны, обнаружены п-оксибензойная, прогскатеховая, галловая, кофейная, феруловая и сиреневая кислоты. Наряду с ними присутствует большое число неидентифицироаанных веществ, которые, по-видимому, являются простыми производными оксикормчных и оксибензойных кислот. В количественном отношении среди растворимых полифенолов преобладают конденсированные дубильные вещества проантоцианидины.

Общее содержание фенольных соединений в растении обычно увеличивается по мере его роста и формирования.

Зто обусловлено тем, что образование 'вторичных соединений, в том числе и фенольных, непосредственно связано с процессом дифференциации растительной клетки. Наблюдение за изменением содержания фенольных соединений в процессе формирования хвои сосны показало, что максимальное количество лигнина накапливается в первый год жизни, а концентрация проантоцианидинов продолжает возрастать и дальше. При увеличении возраста хвои от 1 до 4 лет их содержание повышается на 48%. Различия в характере накопления этих фенольных соединений обусловлено тем, что их образование происходит в клетках различных тканей. Основное количество лигнина синтезируется при формировании проводящих элементов ксилемы, а проантоцианидины образуются в паренхимных клетках перидермы, эндодермы и некоторых других тканей (БЫ^огс), 1988).

Таким образом, хвойные способны накапливать в клетках и тканях большие количества проантоцианидинов и лигнина. Это свидетельствует о том, что процесс образования фенольных соединений отличается у них высокой активностью.

Биосинтез фенольных соединений. У большинства растений исходным веществом для синтеза почти всех фенольньк соединений является фенилаланин. При введении И-14С] -ОХ-фенилапанина в хвою сосны наблюдали его превращение з лигнин, проантоцианидины и фенолкарбоновые кислоты. Относительная радиоактивность этих соединений {% от радиоактивности введенного фенилаланика) через 24 часа составляла соответственно 39.9, 2.9 и 4,7%.

Определение радиоактивности индивидуальных соединений фракции феколкарбоновых кислот показало наличие метки главным образом а оксиксричных кислотах: кофейней и феруловой. В сксибензойных кислотах радиоактивность не обнаружена.

Известно, чго протскатеховая и галловая кислоты могут синтезироваться в растениях непосредственно из промежуточного продукта шикиматного пути дегидрошикимовой кислоты (Запрометов, 1964; Мийдла и

др., 1975; Ishikura, 1975; Niemann, 1986). Дегидрощихимовая кислота, используемая а данном процессе, образуется не только в прямой реакции этого пути, - из дегидрохинной кислоты, но и в реакции окисления шикимовой кислоты при участии шикимат-дегид рогеназы (ШДГ). В связи с этим, исследовали продукты превращения 14С-шикимовой кислоты под действием экстракта ферментов из 3-дневных этиолированных проростков сосны. При введении в реакционную среду кофактора ШДГ - NADPг- наблюдали образования двух радиоактивных соединений, которые были выделены с помощью хроматографии на бумаге и 8ЭЖХ з обращенной фазе и идентифицированы как протокатеховак и галловая кислоты. Следовательно, а клетках хвойных присутствуют все ферменты, необходимые для прямого превращения гидроароматичесшх кислот в оксибензойные кислоты.

Общие закономерности оносинтеза фенольных соединений а хвое сосны исследовали методом пульсовой метки: 10-минутная экспозиция фотосинтеза с атмосфере 14СОгс последующим измерением радиоактивности через определенные промежутки Бремени при выдерживании побегов в естественных условиях. Определение скорости синтеза этих двух групп фенольных соединений в различны« периоды вегетации показало, что интенсивное образование лигнина характерно для молодой активно растущей хвои, а проантоцианидинов - для хвои, закончившей реет.

В растущей хвое присутствуют клетки различного возраста, а следовательно, и степени зрелости. Поэтому с целью более детального исследований взаимосвязи метаболизма фенольных соединений с процессом дифференциации клеток хвои, определяли икгиЕность образования лигнина и проантоцианидинов в клетках нижней, средней и е-зрхней частей, средний возраст которых составляет; соответственно, 7, 16 и 32 дня.

Установлено, что максимальная скорость синтеза лигнина наблюдается в самых молодых клетках основания хвои. Активность же образования проантоцианидинов возрастает по мере их созревания. Об зтем свидетельствует увеличение радиоактивности проантоцианидинов в средней и

верхней частях хвои, по сравнению с основанием, соответственно, в 3 и 8 раз.

Таким образом, с процессом дифференциации клеток хвои непосредственно связан только биосинтез лигнина, поскольку накопление этого полифенола в клеточной стенке ксилемы является необходимым условием ее формирования. Образование же проантоцианидинов - это особенность уже зрелой автотрефной клетки. Причина активации биосинтеза этих полифенолов на разных этапах формирования клеток хпои обусловлена не только локализацией в различных тканях, но и участием в этих процессах различных клеточных структур, а также спецификой функций, выполняемых лигнином и проантоцианидинами. Изучение биосинтеза фенол ьных соединений у хвойных показало, что центральное место в этом процессе, как и у других высших растений, занимает фенилпропаноидный путь. По этому пути из фенилаланина образуются активированные формы оксикоричных кислот, которые представляют собой исходные соединения для синтеза самых разнообразных фенольных структур, з том числе и проантоцианидинов и лигнина. Исключением являются только протокатеховая и галловая кислоты, образующиеся не в результате окисления соответствующих оксикоричных кислот, а из промежуточного соединения шикиматного пути дегидрошикимовой кислоты.

Предполагается, что способность к интенсивному синтезу фенольных соединений, обнаруженная у хвойных, обусловлена существованием у них каких-то особенностей в структурной организации или регуляции шикиматного пути, благодаря которому обеспечивается его высокая биосинтетическая активность.

Глава 4. ШИКИМДТНЫЙ ПУТЬ

С целью выяснения особенностей функционирования шикиматного пути у хвойных и его роли в биосинтезе не только ароматических кислот, но и фенольных соединений, . исследовали метаболизм 14С-шикимовой кислоты у сосны обыкновенной и влияние глифозата на этот процесс.

В исследованиях, проведенных на различных растениях

установлено, что основными продуктами превращения 14С-шикимовой кислоты обычно являются ароматические аминокислоты (Garnborg, Neish, 1959; Weinstein et ol., 1967; Minamikav/a etal., 1969; Tazaki et al., 1974; Minamikawa, 1976). При изучении метаболизма 14С-шикимовой кислоты в хвое, лубе и древесине молодого побега сосны обнаружено включение метки в конечные продукты шикиматного пути -ароматические аминокислоты. В хвое радиоактивность фениг.аланина и тирозина свободного фонда была выше, чем белкового. В лубе наблюдалась обратная зависимость, а а древесине свободные аминокислоты вообще не обнаружены. Наиболее интенсивное использование ароматических аминокислот в биосинтезе белка происходит в клетках луба (табл. 1). В хвое, лубе и древесине сосны на долю фенилаланина и тирозина приходится соответственно 1,12, 4,88 и 1,06% от общей радиоактивности продуктов, синтезированных из 14С-шикимовой кислоты. Основным продуктом ее превращения были фенольные соединения и хинная кислота (табл. 2). Последняя образуется из промежуточного продукта шикиматного пути - дегидрохината -при участии хинатдегидрогеназы (Осинов, Шеин, 1986).

Таблица 1

Радиоактивность ароматических аминокислот,

синтезированных в молодом побеге сосны из 14С-шикимовой кислоты, имп-мин/r сухой массы растительной ткани

Аминокислота Хвоя Луб Ддеаесина

Фснилалаиик:

свободный 363 ± 29 (0,31)* 737 ± 55 (0,35) -

из белков 85 i 11 (0,07) 4275 ± 260(2,07) 433 ± 41 (0,64)

Тирозин:

свободный 46& ± зе 10,40) 395 ± 27 (0,19) -

из белков 398 ± 32 (0,35) 4680 ± 310(2,27) 287 ± 29 (0,42)

* В скобках указан % от общей радиоактивности веществ, синтезированных в ткани из 14С-шикимовой кислоты.

В хвое из фенольных соединений наиболее высокую . 12

радиоактивность имели лигнин и фенолкарбоновые кислоты. Значительная часть 14С-шикимовой кислоты превращается в хинную кислоту. В древесине ее радиоактивность также была очень высокой, но максимальное количество радиоуглерода включалось з лигнин, доля остальных фенолов составляла около 8%.

Таблица 2

Радиоактивность хинной кислоты и фенольных соединений, синтезированных в молодом побеге сосны из 14С-шикимоеой кислоты, имп-мин/г сухой массы ткани

Соединение, Хпсд Луб Дрепесинз

фракция

Хинная кислота 43080±780 19330-970 32190±1500

(35,5)* 0,3) (35,5)

Фенолкарбонов 23110±160 164450±2230 4000±500

ые кислоты (20,1) (79,2) (4,5)

Проантоцианид 7120^190 1270-350 3150±-340

ины (6,2) (0,6) (3,3)

Лигнин 25240±2660 6570+970 40330^1090

(22,0) (3,2) (46,5)

* В скобках указан % от общей радиоактивности веществ, синтезированных в ткани из 14С-шикимовой кислоты.

Таким образом, основными продуктами шикиматнего пути у сосны обыкновенной являются фенольные соединения и хинная кислота. Доля ароматических аминокислот, используемых в биосинтезе белка, но превышает 3%

Глифозат (!Ч[фосфонометил] -глицин) - это эффективный гербицид, первичное действие которого заключается в ингибиоовании активности одного из ферментов шикиматнего пути - 5-енолпирувилшикимат-З-фосфат-синтазы (Лтгпет, 1986; 1зЫкига а1., 1986). В результата снижается или полностью прекращается синтез ароматических аминокислот, а также их вторичных производных. Аналогичным образом действует глифозат у хвойных. В молодом побеге сссны он ингибирует превращение 14С-шикимовой кислоты -1 фенольные соединения. Особенно сильно падиг.нр-зтеп процесс образования лигнина. Его радиоактивность з присутствии глифозата снижается на 90%, а растворимых пс-

лифенолоз - на 30 - 70%.

3 ряде растений при блокировании шикиматного пути на уровне б-енолпирувилшикимат-З-фосфат-синтезы наблюдали повышение активности образования продуктов альтернативной реакции: протокатеховой и галловой кислот (АгпгИет е\. а!., 1981, 1984). В хвое сосны скорость синтеза оксибензойных кислот из 14С-шикимовой кислоты под действием глифозата наоборот уменьшается, но при этом резко возрастает активность образования хинной кислоты. Ее радиоактивность увеличивается по сравнению с контролем более чем в 2 раза. Подобные результаты получены для луба и древесины.

Следовательно, у хвойных при блокировании шикиматного пути глифозатом происходит

перераспределение потока углерода и возрастает скорость синтеза его альтернативного продукта - хинной кислоты.

Глава 5. ХИННАЯ И ШИКИМОВАЯ КИСЛОТЫ У ХВОЙНЫХ

Существование высокоактивной реакции синтеза хинной кислоты является, по-видимому, особенностью шикиматного пути хвойных, Об этом свидетельствует их способность накапливать ее в молодых формирующихся тканях в очень больших количествах (Кизель, 1928; Манская, Код и на, 1960; ВоиЬе!, 1972).

Изучение сезонной динамики гидроароматических кислот у сосны обыкновенной показало, что максимальная концентрация хинной кислоты наблюдается в хвое в период ее активного роста и достигает 8-10%. В тканях побега ее содержание ниже: в лубе 3,7%, в древесине 1,2%. Шикимовая кислота также накапливается, но в меньших количествах. К осени происходит быстрое уменьшение концентрации хинной кислоты. В количественном отношении уровень хинной значительно преобладает над уровнем шикимовой . кислоты, особенно в хвое, в лубе разница в их,Содержании проявляется в меньшей степени. Содержание кислот определялось в тканях, клетки которых находятся в разных этапах развития. Например, в июне в период : активного роста значительная часть хвои представлена молодыми слабо

дифференцированными клетками, в последующие сроки, особенно после окончания ростовых процессоз, их доля, по сравнению с количеством сформированных быстро уменьшается. Следовательно, высокая концентрация гидроароматических кислот характерна для наиболее ;.!олодых клеток тканей хвойных.

По мере созревания тканей актизность процесса утилизации гидроароматических кислот возрастает, о чем косвенно свидетельствует уменьшение их концентрации. С.М.Манская и Л.А.Кодина (1958, 1960) считали, что еснсзнь."-1рсду:стем превращения хинной и шикимоеой кислот у .зойных является лигнин. Поэтому накопление хинной •.ислоты а молодых формирующихся тканях они объясняли ;изкой скоростью образования именно этого псппоонолз, и /меньшение в дальнейшем ее содержания - началом активней лигнификации клеточных стенок. Однако, максимальная ■концентрация хинной кислоты почти всегда накапливается я :<гое, тогда как основное количество лигнина образуется 2 древесине, хотя для этой ткани не характерно присутствие больших количеств хинной кислоты. Некоторые исследователи пытались объяснить это противоречие транспортом хинной кислоты '.13 хвои в ткани побега и стволовую часть дерева.

При изучении передвижения радиоактивных продукте?, фотосинтеза из хвои в луб, древесину и почки :.;ояоцсго побега сосны установлено, что активный отток зещоста из хвои отмечен з августе после окончания ее роста. 8 этот период за 28 часса эксперимента в побег поступает 33,4% радиоуглерода, ассимилированного хвоей после Юмннутной экспозиции фотосинтеза с атмосфере с 1-ССЪ. лтом

основное количество продуктов фотосинтеза используется ?. гюсцессэ образования компонентов древесины. Но максимальная концентрация гидроароматических кислот а лубе и древесине накапливается еще в конце июня, то есть, до начала активного транспорта из хвои. Сравнение дикзмики радиоактивности суммарных фракций угле поде в и органических кислот а лубе и древесине молодого побе! а сосны обыкновенной показало, что 14С-кислоты появляются в этих тканях только через 8 часов, когда содержание 14С-углеводоа достигает уже достаточно больших значений.

Из этого следует, что хинная кислота не является транспортным соединением, а образуется в тканях побега из углеводов, поступающих из хвои.

При формировании листьев древесных растений наблюдается два ярко выраженных периода: 1) накопление хинной кислоты и 2) уменьшение ее концентрации. Это послужило основанием для предположения, что хинная кислота является запасным соединением, используемым при необходимости для синтеза веществ по шикиматному пути (Boudet, 1972; Tazaki eta!., 1974; Boudet et a!., 1985). Считали, что ее участие в обмене происходит в результате изменения направления реакции, катализируемой хинат-дегидрогеназой.

Представления о запасной функции хинной кислоты предполагает разделение во времени процессов ее синтеза и превращения. С целью выяснения этого процесса определяли активность включения фотоассимилированного 14С в хинную кислоту в период ее накопления в хвое и когда концентрация быстро уменьшается.

В июне в клетках молодой формирующейся хвои накапливается не только хинная, но и шикимовая кислота. О поступлении синтезируемых гидроароматических кислот в запасной малоактивный фонд свидетельствует тот факт, что после 10-минутной экспозиции фотосинтеза их радиоактивность увеличивается на протяжении почти всего эксперимента (28 часов). Особенно активно идет процесс резервирования 14С-хинной кислоты.

В июне, начале июля концентрация хинной кислоты достигает своего максимума и начинает уменьшаться. середине августа она снижается в 2-3 раза. Если исходить из представления о резервной функции хинной кислоты, то в этот период ее синтез полностью прекращается и идет обратный процесс - превращение в продукты шикиматного пути. Однако, и в августе, и в сентябре активность образования 14С-хинной кислоты из фотсгссимилирозанкогс 14CQ,остается достаточно высокой. Кроме того, определение скорости изменения радиоактивности гидроароматических кислот в первые 3 часа эксперимента показано, что активность обмена хинной кислоты в 2,6 раза выше, чем шикимовой кислоты (Осипов, Александрова, 1982). Следовательно, у

хвойных наряду с запасным фондом хинной кислоты существует и метаболически активный фонд. Поэтому изменение концентрации хинной кислоты, наблюдаемое а процессе роста и формирования хвси, обусловлено не сменой направления реакции, катализируемой хинат-дегидрогенаэой, а изменением соотношения скорости ее синтеза и превращения.

Этот факт имеет принципиальное значение, поскольку он свидетельствует о том, что хинная кислота, образуясь как продукт шикиматного пути, превращается затем в фенольные соединения по какомуто иному пути.

В исследованиях на чайном растении и в листьях дуба показано существование альтернативного пути превращения хинной кислоты в оксибензойные кислоты: протокатеховую и галловую (Запрометов, 1964; Воийе^ 1972). Аналогичный путь Функционирует и у хзойных (Осипов, Александрова, 1986), но в таких тканях, как ксилема, наиболее вероятна связь обмена хинной кислоты с образованием фенилпропаноидных предшественников лигнина.

В хвое, где активность образования этого полимера намного ниже, хинная кислота, синтезируемая на ранних этапах формирования клетки, полностью не используется и накапливается в резервном вакуолярном фонде. В процессе дифференциации количество хинной кислоты постепенно уменьшается и в. зрелой клетке присутствуют только ее следы. Вполне вероятно, что она превращается а проантоцианидины. При изучении биосинтеза фенольных соединений в различных частях хвои сосны установлено, что максимальная скорость синтеза проантоцианидинов наблюдается в зрелых клетках ее верхней части. Можно было бы предположить, что они являются продуктами превращения хинной кислоты резервного фонда. Однако результаты определения количества хинной кислоты а различных частях хвои и •эффективности ее образования из фотоассимилироеанного 14С свидетельствует о том, что существование такой связи маловероятно. Действительно, активность образования проантоцианидинов возрастает в процессе дифференциации клеток хвои а 8,5 раз. В то же время количество хинной кислоты уменьшается всего на 27% и то несмотря на то, что

1Т

скорость ее синтеза снижается в 3-4 раза.

Следовательно, путь превращения хинной кислоты в хвоо сосны, по-видимому, не связан с синтезом проан гоционидинов.

Наиболее вероятно, чю проантоцианидинм, как и хинная кислота, являются продуктами шикиматного пути, но хинная кислота образуется из его промежуточного соединения -дегидрокинага, а проантоцианидины - их конечного • фенилиланина. Поэтому последовалсяыактивация синтеза сначала хинной кислоты, а затем проантоцианидино&, наблюдается в процессе дифференциации клеток хвои, обусловлена не резервированием предшественника, а перераспределением потока углерода по шикиматмому пути с синтеза хинной кислоты на более эффективное образование его конечных продуктов и далее проантоцианидинов (Осипов, Александрова, 1333).

Однако, в хвое этот путь утилизации хинной кислоты, по-видимому, не является единственным. Изучение метаболизма 14С-хинной кислоты в хвоо сосны показало, что основными продуктами ее превращения являются шикимовая кислота и углеводы (Осипов, Шеин, 1930). Относительная радиоактивность последних составляет 36%. Этс свидетельствует о том, что значительное количество хинной кислоты е автотрофньк клетках хвои подворгае юя катаболическим превращениям.

Следовательно, хинную кислоту, которая в больше; количествах накапливается на ранних этапах развития хвои можно рассматривать как универсальный источник углерода используемый в биосинтезе широкого круга вещоот: различной структуры, а не только полифенолов.

ВЫВОДЫ

1. Изучение общих закономерностей процесса синтез; фенольных соединений у хвойных свидетельствует ос отсутствии у них каких-либо специфических особенностей I механизме образования ароматических структур. Показано что основным предшественником фенольных соединений 1 хвойных, как и у большинства высших растений, являете!

18

лерьпчио синтезированный фемилаланин •• продукт шикиматнего пути. При этом, доля ароматических аминокислот, используемых в биосинтезе белка, значительно маньше того количества, которое превращается и о>енольные соединения. Оксибензойные кислоты: протокатеховая и галловая, образуются у хвойных непосредственно из промежуточного продукта шикиматного пути дег идроши ки мозой кислоты.

•2. Метаболизм хвойных характеризуется высокой активностью образования фенольных соединений. Показано, что для формирующихся клеток ксилемы характерно образование ли гимна и гго фенилпропаноидных предшественников, тогда как для азютрофных клеток хаои - проантоцианидиноз.

3. При изучении биосинтеза фенольных соединений а процесса роста и формирования хвои установлено, что по времени сначала активируется биосинтез лигнина в процессе дифференциации клзток ксилемы, а на более поздних этапах - образование проантоцианидинов в автотрофных клетках хвои.

4. Особенностью шикиматного пути у хвойных является образование оксибензойных кислот и хинной кислоты. При блокировании шикиматного пути глифозатом происходит перераспределение, потока углерода и возрастает скорость альтернативной реакции синтеза хинной кислоты.

5-. Изучение взаимосвязи обмена преароматических предшественников и биосинтеза фенольных соединений показало, что процесс образования лигнина у хвойных - это специфический путь превращения углеводоз, основная регуляция которого осуществляется на уровне шикиматного пути.

гЛатериалы диссертации опубликованы а следующих

работах:

1. Осипов В.И., Александрова Л.П. Использование изотопа углерод-14 а физпопоги-биохимических исследованиях хвойных // Тсз.дскл. ¡X симп. по биол. проблемам севера. -

Сыктывкар, 1931. -С. 26-23.

2. Осипов В.И., Александрова Jl.il. Пространственная организация биосинтеза хинной и шикимозой кислот г*

автотрофной клетке хвои сосны обыкновенной // Физиол. растений.-1982.-Т 29, вып. 2.-С.286-292.

3. Осипов В.И., Александрова Л.П. Шикиматный путь в хЬЬе сосны обыкновенной / Тез.докл. IV Всес. симп. по фенольным соединениям.Ташкент.-1982.-С.52-54.

4. Осипов В.И., Александрова Л.П. Биосинтез лигнина в ХБ<зе сосны обыкновенной / Проблемы физиологии и биохимии древесных растений: тез. докл. 2-й Всес. конф.-Краснбярск,-1982.-С. 21-23.

5. Осипов В.П., Александрова Л.П. Функционирование шикиматного пути у хвойных // Там же. -С. 24-25.

6. Осипов В.И., Александрова Л.П. Изучение метаболизма хвойных методом пульсовой метки / Исследования обмена веществ древесных растений.-Новосибирск: Наука, 1985.-С.5-14.

7. Александрова Л.П., Осипов В.И. Методика фракционирования фенольных соединений тканей хвойных / Там же. -С.95-102.

8. Осипов В.И., Александрова Л.П. Шикиматный путь у высших растений //Ж. общей биологии.-1986.-ТXIV!!, вып.1. -С.79-92.

9. Осипов В.И., Александрова Л.П. Биосинтез оксибензойных кислот в проростках сосны обыкновенной // Изв. СО АН СССР -1986. Вып.1, серия биологическая. -С.83-86.

10. Осипов В.И., Александрова Л.П. Влияние глифозата на обмен хинной и шикимовой кислот в хвое сосны обыкновенной // Физиология растений.-1986.-Т. 33, вып.4. -С.762-768.

11. Шеин И.В., Александрова Л.П., Осипов В.И. Фенолкарбоновые кислоты тканей однолетнего побега сосны обыкновенной // Экстрактивные вещества древесных растений: Тез. докл. Всес. конф. -Новосибирск, 1936.-C.13-14.

12. Александрова Л.П., Шеин И.В., Осипов В.И. . Бимоейнтез протокатеховой и галловой кислот у хвойных // Тез. докл. V Всесоюзного симп. по фенольным соединениям. А. Секция биохимии и физиологии. -Таллинн, 1987.-С.5-6.

13. Шеин И.В., Александровыа Л.П., Осипов В.И. Превращение хинной кислоты в лигнин у хвойных // Там же,-С.161-162.

4. Осипов В.И., Александрова Л.П. Метаболизм хинной ислоты и фенольных соединений в клетках хвои сосны быкновенной // Физиол. растений.- 1988.-Т.35,М 4.-С.734-41.

5. Александрова Л.П., Осипов В.И. Фенольныа соединения в роцессе роста и формирования побега сосны обыкновенной ' Проблемы физиол. и биохимии древесных растений.-етрозаводск, 198Э.-С. 3-5. 16. Судачкова Н.Е., Гире Г.И., лександрсга Л.П. и др. // Физиология сосны обыкновенной, ■овосибирск: Наука.-1990.-396 с.

7. Шеин И.В., Александрова Л.П., Зражевская Г.К., Осипов .И. Влияние глифозата на метаболизм хвойных // коло^ическая; физиология хвойных: тез. докл. Междун. симп. ЮФРО. Красноярск: ИЛиД.-1991.С.136-137.