Сравнительное изучение процесса лигнификации древесины сосны обыкновенной in vivo и in vitro

Железниченко, Татьяна Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительное изучение процесса лигнификации древесины сосны обыкновенной in vivo и in vitro
ВАК РФ 03.02.01, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное изучение процесса лигнификации древесины сосны обыкновенной in vivo и in vitro"

4854771

На правах рукописи

ЖЕЛЕЗНИЧЕНКО Татьяна Витальевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ЛИГНИФИКАЦИИ ДРЕВЕСИНЫ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ IN VIVO И IN VITRO

Специальность 03.02.01 - ботаника; 03.01.05 - физиология и биохимия

растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 СЕН 2011

4854771

Работа выполнена в отделе физико-химической биологии и биотехнологии древесных растений Учреждении Российской академии наук Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, г. Красноярск

Научный руководитель:

доктор биологических наук Антонова Галина Феодосиевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Загоскина Наталья Викторовна

доктор биологических наук Бенькова Вера Ефимовна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН

Защита диссертации состоится «18» октября 2011 в 10.00 часов в конференц-зале Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН на заседании диссертационного совета Д 003.056.01 при Институте леса им. В.Н. Сукачева СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, ИЛ СО РАН

Тел./факс (391) 249-46-31; e-mail: institute_forest@ksc.krasn.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Автореферат разослан « » сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного сове—

Д.6.Н., проф.

Е.Н. Муратова

На правах рукописи

ЖЕЛЕЗНИЧЕНКО Татьяна Витальевна

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ЛИГНИФИКАЦИИ ДРЕВЕСИНЫ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ IN VIVO К IN VITRO

Специальность 03.02.01 - ботаника; 03.01.05 - физиология и биохимия

растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук

Антонова Галина Феодосиевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Загоскина Наталья Викторовна

доктор биологических наук Бенькова Вера Ефимовна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Ботанический институт им. B.JI. Комарова РАН

Тел./факс (391) 249-46-31; e-mail: mstitute_forest@ksc.krasn.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН

Автореферат разослан « » сентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

дб.н., проф. Е.Н. Муратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Лигнификация является одним из главных процессов, сопровождающих развитие клеток ксилемы древесных растений. Проблема процесса лигнификации привлекала и привлекает исследователей по разным причинам. С одной стороны важно понять сам процесс лигнификации, приводящий к укреплению ткани и появлению ее механической прочности, чтобы управлять этим процессом. С другой, важно найти пути оптимальной делигнификации древесины, поскольку лигнин является одним из наиболее значимых факторов, ограничивающих превращение биомассы растений в целлюлозу или биотопливо. Интерес части исследователей направлен на получение растений с либо низким содержанием лигаина, либо его легкой доступностью химической деградации [Sticklen, 2008; Weng et al., 2008a; Mansfield, 2009].

Изучение механизма биосинтеза лигнина и условий сочетания структурных фенилпропановых единиц в его макромолекулах связано в основном с синтезом дегидрополимеров in situ, предложенном еще Фрайденбергом [Freudenberg, 1959]. Другим направлением, активно используемым в последнее время, является исследование лигнификации в культуре ткани. Ее применяют как модельную систему для изучения путей биосинтеза предшественников лигаина -оксикоричных кислот и ферментов, участвующих в процессе [Запрометов, 1993; Li et al., 2000; Dixon et al., 2001; Kürkónm et al., 2002; Móller et al., 2003; 2005; 2006].

Значительно меньше работ, в которых биогенез лигнина рассматривается непосредственно в развивающейся ткани растений [Donaldson, 1991, 1992; Grunwald at all., 2002; Terashima et al., 1986; Terashima, Fokushima, 1988; Terashima et al., 1988]. При этом в основном используются разные варианты методов спектроскопии.

Ранняя и поздняя ксилема образуются при разных условиях обеспеченности развивающихся тканей водой [Zahner et al., 1964]. Различия в условиях формирования клеток ксилемы раннего и позднего слоя годичного прироста сосны обыкновенной [Антонова, Стасова, 1993; Антонова, 1999] должны влиять на процесс лигнификации, интенсивность его отложения в ксилеме и структуру полимера. Такие различия были обнаружены ранее при изучении отложения лигнина на этапах созревания клеток ранней и поздней ксилемы в стволах лиственницы сибирской [Antonova et al, 2007]. Связано ли это с биогенетической особенностью вида или характерно и для других хвойных следует проверить. Изучение лигнификации на последовательных стадиях развития клеток ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной до сих пор не проводилось.

Кроме того, важно установить, насколько будут адекватными процессы лигнификации in vivo и in vitro, т.е. в культуре тканей.

Данная работа является продолжением исследований ксилогенеза сосны обыкновенной, проводимой в Институте леса.

Цели и задачи исследования - изучить процесс отложения лигнина, его структуру и состав предшественников - оксикоричных кислот - на последовательных стадиях развития клеток ранней и поздней ксилемы при формировании годичных приростов в стволах сосны обыкновенной (in vivó) и сравнить процессы лигнификации in vivo и in vitro (в культуре ткани).

В задачи работы входило изучение:

• содержания и состава фракций фенолхарбоновых кислот в ходе поэтапного развития клеток ранней и поздней ксилемы,

• содержания лигнина на последовательных этапах созревания трахеид,

• состава и соотношения феншшропановых единиц в структуре препаратов лигнина, а также его макромолекулярной характеристики,

• условий культивирования каллуса сосны обыкновенной,

• содержание и структуру лигнина в биомассе каллуса при разных условиях его культивирования,

• содержание низкомолекулярных метаболитов в каллусной массе при разных условиях культивирования.

Научная новизна исследования. Показаны различия в динамике накопления лигнина в ходе созревания ранних и поздних трахеид сосны обыкновенной. Проведено поэтапное сравнение макромолекулярных характеристик и структуры препаратов лигнина, выделенных из разных по степени развития клеток ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной. Получены данные по содержанию и составу фенолкарбоновых кислот, и в частности оксшсоричных кислот, как соединений, играющих важную роль в росте и развитии клеток, а также являющихся предшественниками лишила в ходе развития первичных и вторичных стенок ранних и поздних трахеид Впервые проведено сравнение структуры лигнина, продуцированного в ранней и поздней ксилеме сосны обыкновенной in vivo и in vitro.

Защищаемые положения:

• Отложение лигнина в ходе образования раннего и позднего слоя годичного прироста идет с разной интенсивностью и динамикой,

• Лигаины последовательных этапов созревания ранних и поздних трахеид различаются по составу феншшропановых структурных единиц, что коррелирует с изменением состава оксикоричных кислот - предшественников лигнина.

• Лигнин сосны обыкновенной, полученный в условиях т vitro по составу структурных единиц ближе к лигнину ранней ксилемы.

Теоретическое и практическое значение.

Полученные данные по составу и соотношению структурных единиц, скорости отложения, структуре макромолекул лигаина, а также динамике и фракционному составу его предшественников на разных этапах дифференциации ранних и поздних трахеид послужат фундаментальным вкладом в понимание процесса лигнифшсации и ксилогенеза хвойных.

Сравнительное изучение процесса лигнификации сосны обыкновенной in vivo и in vitro позволит также внести вклад в понимание механизма лигнификации, определить факторы, влияющие на процесс, и наметить биотехнолошческие пути регулирования этого процесса, в частности, применяя генную инженерию.

2010), на научных чтениях памяти профессора А. А. Яценко-Хмелевского «Структурно-функциональные исследования растений в приложении к актуальным проблемам экологии и эволюции биосферы» (Санкт-Петербург, 2009), на конференции молодых ученых Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН «Исследование компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск 2009, 2010), на VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений -фундаментальная основа экологии и инновационный биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах текста, содержит 31 рисунков, 7 таблиц и 3 приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего ссылки на 187 источников, из которых 139 на иностранных языках.

Личный вклад автора.

Автор являлась непосредственным участником экспериментов, обработки и анализа экспериментального материала.

Благодарности.

Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. Г. Ф. Антоноеой, а также к.б.н. В.В. Стасовой, Т.Н. Вараксиной и д.б.н. КН. Третьяковой за неоценимую и всестороннюю помощь в работе над диссертацией. Диссертация выполнялась в рамках грантов РФФИ № 06-04-49501 и № 09-04-00155

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ЛИГНИФИКАЦИЯ КСИЛЕМЫ В ПРОЦЕССЕ ЕЁ РАЗВИТИЯ

В главе анализируются работы отечественных и зарубежных авторов, посвященные изучению строения древесины хвойных, образованию и развитию ксилемных производных камбия, лигнификации и распределению лигнина в клеточных стенках трахеид. Детально рассматривается биосинтез липнина, его химия и структура, а также фенолкарбоновые кислоты, как предшественников лигнина.

Обсуждается культура каллусных тканей как возможная модельная система для изучения лигнификации ксилемы. Приводятся данные по современному состоянию вопроса и влиянию различных факторов на процессы лигаификации.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования

Объектами исследования itt vivo служили 25-летние деревья сосны обыкновенной. Материал отбирали в начале и конце июля и начале августа, когда клетки развивающегося годичного слоя принадлежали либо к ранней, либо поздней ксилеме. Клетки разных этапов дифференциации были получены в группе по исследованию ксилогенеза Отдела физико-химической биологии и биотехнологии древесных растений Института леса им. В.Н. Сукачева и использовались для

изучения метаболитов развивающейся ксилемы сосны обыкновенной [Антонова и др., 2009].

В начале июня были собраны слои клеток камбиальной зоны (Кам) и двух частей зоны роста растяжением (первая - Pocrl и вторая Рост2). Первая примыкала к камбиальной зоне, вторая к зоне созревания. Кроме того, в этот период зона созревания содержала слой клеток в начале утолщения стенок без лигнификации (D1). В конце июня, когда формировался слой равней древесины, получены слои клеток зон камбия (Кам), роста растяжением (Рост) и созревания: D1 - начало вторичного утолщения стенок трахеид без лигаификации и два последовательных слоя лигаифицирующихся клеток - D2a и D26. В начале августа были получены слои клеток камбиальной зоны (Кам) и зоны созревания трахеид поздней ксилемы. Фаза роста растяжением в момент отбора образцов отсутствовала. Зона созревания была разделена на четыре слоя: клетки D1 и три последовательных слоя лш инфицирующихся клеток - D2a, D26 и D2b. Кроме того, были выделены клетки зрелой ранней и поздней ксилемы (М).

Выделение и анализ фенолкарбоновых кислот

Материал после фиксации этанолом, подвергали исчерпывающей экстракции 80 % этанолом (до отрицательной реакции на углеводы). Экстракт высушивали, обрабатывали водой и хлороформом. Подкисленный водный слой экстрагировали эфиром. В эфирных вытяжках определяли свободные фенолкарбоновые кислоты (ФК) [Jennings, 1981]. В водном слое определяли содержание связанных ФК. Далее водный слой использовали для определения ФК, входящих в состав сложных и простых эфиров с использованием щелочного и кислотного гидролиза соответственно.

Выделение и анализ литвина

Материалом для анализа служили твердые остатки, полученные после спиртовой экстракции (см. выше). Содержание лигнина определяли с тиоглеколевой кислотой [Venverloo 1969]. В ходе анализа спиртом извлекали низкомолекулярную фракцию лигнина (ТГЛ-1), а щелочью с последующей нейтрализацией соляной кислотой - высокомолекулярную фракцию (ТГЛ-П), которую использовали для дальнейшего анализа.

Молекулярно-массовое распределение лигнина оценивали методом гель-фильтрации (Sephadex G-75, элюевгг ДМСО+LiCl). Количество и соотношение фенилпропановых структур препаратах лигнина определяли щелочным окислением [Hartley 1971] и ТСХ.

Для оценки сложных эфирных связей в препаратах лигнина использовали щелочной гидролиз, а простых эфирных связей - кислотный [Scalbert et al. 1985]. Гидролизаты экстрагировали эфиром, в эфирных вьггяжках определяли ФК (ТСХ), а в водных слоях углеводы [Dubois et al., 1956] и ТСХ.

Тонкослойная хроматография

Качественный и количественный состав ФК анализировали методом ТСХ на насыщенных водяным паром пластинках Silufol - UV254, восходящим способом в системе бензол: уксусная кислота (9:1). ФК идентифицировали по метчикам в УФ-

свете и после проявления диазотированным п-гаггроашшшом. Для определения состава и количества альдегидов использовали 2,4-динитрофинилгидрозин.

Качественный состав углеводов оценивали методом ТСХ на импрешированных пластинках "Silufol-UV254", в системе н-бутанол: ацетон: вода (2:7:1). Сахара идентифицировали по метчикам после проявления анилин-фгалатом.

Получение в анализ калпуспых культур

Для получения эксплантов использовали стерилизованные отрезки побегов, собранных в конце июня и середине июля. С отрезков снимали кору и собирали эксплантат со стороны либо ксилемы, либо флоэмы, контролируя под микроскопом локализацию камбиальной зоны. Были получены слои клеток развивающейся ксилемы и флоэмы, содержащие камбиальную зону, а также смесь клеток ксилемы и флоэмы с камбием между ними. Последний эксплант позволил получить устойчивую культуру каллуса, которая использовалась для дальнейших исследований.

Экспланты помещали на питательную среду Уг МС (среда МС с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов) [Murashige, Skoog 1962], дополненную активированным углем (0,3 %) и не содержащую гормонов и выдерживали в темноте при 2°С в течение 3 дней. Затем их переносили на среду 1А МС с добавлением аскорбиновой кислоты (0-200 мг/л), 2,4 - Д (4,42 мг/л), НУК (2 мг/л), и БАЛ (4,7 мг/л) и концентрацией сахарозы 3 % и инкубировали в темноте при 25°С в течение месяца до появления первичного каллуса. Эту же среду использовали для поддержания каллусных культур.

Для инициации дифференциации каллуса и лигвификации изменяли состав питательной среды, длительность выращивания каллуса и условия освещенности (каллус выращивали в темноте или на свету). Использовалась питательная среда Уг МС с концентрацией сахарозы 3 % (обр. 14) и 5 % (обр. 11; 15-25). Указано, что сахароза является источником углерода в процессе лигаификации [Rogers et al., 2005]. Другим изменением в культивировании являлось добавление в среду поливишшшроллидона (3.5 i/л) (обр. 16; 19; 20). Его предлагали использовать, чтобы снизить отрицательное влияние фенолов, накапливающихся в среде, на прирост каллусной массы [Mailer et al., 2003]. В одну из сред добавляли феруловую (0,5 ммоль/л) (обр. 24), а также феруловую в сочетании с аскорбиновой (200 мг/л) кислотой (обр. 25). Первая - является предшественником гааяцилпропановых единиц лигаина, а вторая - является антиоксидангом, положительно влияющим на прирост каллусной биомассы. Все среды доводили до рН 5.8 и автоклавировали.

Поскольку увеличение продолжительности культивирования каллуса сопровождается снижением образования как растворимых форм фенольных соединений, так и лигаина [Стрекова и др., 1980] для анализа использовали биомассу каллуса одинакового пассажа и времени выращивания на питательной среде. В первой серии экспериментов каллус выращивали в течение 21 сут. (обр. 1116). В связи с тем, что после этого срока дифференциация клеток была неравномерной, и растущий каллус имел гетерогенную структуру, ew биомассу разделяли на «светлую» (активно делящиеся клетки) (обр. 14с; 15с; 16с) и «темную» (с лигаифицированными клеточными стенками) (обр. 11т 14т; 15т; 16т) части,

которые анализировали раздельно. Чтобы достичь равномерной коричневой окраски всей биомассы, т.е. одинаковой степени развития клеток увеличили продолжительность выращивания каллуса в тех же условиях до 2 месяцев (обр, 19т-25т).

Поскольку существуют данные об усиленном образовании лигнина в культуре тканей на свету [Möller et al,, 2006], были изменены условия освещенности. Каллусы культивировали в темноте (гетеротрофные) (обр. 11т; 19т) и на свету (фотомиксотрофные) (при 16 часовом фотопериоде) (обр. 14-16 и 20-25).

Цитологические исследования проводили методом давленых препаратов [Паушева, 1987] и мацерации [Wheeler et al., 1966]. Присутствие лигнина определяли с флороглюцином. Химический анализ каллусной биомассы проводили, как описано выше. В водных растворах определяли содержание углеводов [Dubois et al., 1956], ФК [Jennings, 1981], аскорбиновой (AK) и дегидроаскорбиновой СЦАК) кислот [Чаплыгина, Антонова, 2002]. Лигнин в каллусных тканях анализировали, как описано выше.

ГЛАВА 3. ФЕНОЛКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ В ФОРМИРУЮЩЕМСЯ СЛОЕ В СТВОЛАХ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

Общее содержание фенольных соединений (ФС), содержание свободных и связанных фенолкарбоновых кислот (ФК), а в составе последних - количество ФК, связанных с метаболитами клеток простой и сложной эфирной связью, изучалось по стадиям и этапам дифференциации трахеид формирующихся слоев ранней и поздней ксилемы. В составе ФК исследовали также состав и количество свободных и связанных оксикоричных кислот (OK). Наибольший интерес представляли п-кумаровая, синаповая и феруловая кислоты, как непосредственные предшественники монолигаолов, участвующих в синтезе лигнина.

Изменение ФК при развитии первичных стенок трахеид

В связи с тем, что в начале июня в зоне формирующейся ксилемы помимо зон Кам и Рост (PoctI и Рост2) присутствовали нелишифицированные клетки в начале вторичного утолщения D1, был проведен анализ ФК всех зон, чтобы оценить их содержание и состав перед началом отложения лигнина.

Общее содержание ФС и свободных ФК в зоне роста растяжением приведены на рис. 1, а связанных ФК на рис. 2.

0.15 г 6

Стадии развития клеток Стадии развития клеток

Рис. 1. Содержание общих фенолов (а) и свободных ФК (б) в клетках камбиальной зоны (Кам), двух этапов зоны роста растяжением (Рост1 и Рост2) и начального этапа развития вторичной стенки (Р1) при формировании годичного прироста в стволе сосны обыкновенной в начале июня: 1- г/г сух. веса; 2 - мг х 10"6 на клетку.

Данные приводятся в расчете на сухой вес ткани и на клетку. При разных методах расчета наблюдается разная характеристика динамики ФК. Такое различие связано с накоплением веществ в клеточных стенках и уменьшением количества клеток на навеску ткани. Поскольку расчет на клетку адекватно описывает метаболизм соединений, данные будут рассматриваться в основном в расчете на клетку.

По мере развития структуры первичных стенок общее содержание ФС и свободных ФК увеличивается в первой фазе роста и снижается во второй (рис. 1) также как и содержание связанных ФК (рис. 2). Это соответствует снижению скорости роста клеток сосны обыкновенной [Антонова и Шебеко, 1985].

Содержание свободных ФК в составе общих ФС составляло 12,5 - 22,5%, простых эфиров 75,5 - 47 %, а сложных - 56 - 26 % в зависимости от стадии развития клеток. Это означает, что при создании структуры первичных стенок в основном используются ФК, входящие в состав простых эфиров.

Изменения всех форм ФК могут быть связаны с их расходом в процессе образования диферуловых мостиков между полисахаридами клеточной стенки на втором этапе роста растяжением, что согласуется с уменьшением способности клеток к растяжению и снижению скорости роста.

В начале вторичного утолщения, перед лигнификацией содержание общих фенолов и всех фракций ФК увеличивается, что может бьггь оценено, как подготовка к этапу лишификации ксилемы. Разные методы расчета дают разную информацию о динамике ФК. Это начинает проявляться уже на стадии формирования вторичных клеточных стенок.

Изменение ФК в ходе дифференциации ранних и поздних трахеид

Далее сравнивается динамика ФС и ФК для полного цикла дифференциации ранних (конец июня) и поздних (начало августа) трахеид начиная с камбиальной зоны и заканчивая зрелыми клетками.

Общее содержание ФС. Данные на рис. 3 представлены в расчете на клетку.

Общее содержание фенолов изменяется в зависимости от стадии дифференциации клеток и типа формирующейся древесины. Если не учитывать камбиальную зону, то в клетках ранней и поздней ксилемы количество фенольных соединений увеличивается, достигая максимума к началу лигаификации трахеид, а далее снижается по мере их созревания. В клетках поздней ксилемы общее содержание фенолов выше, чем в клетках ранней, особенно большое различие наблюдается в Кам. Возможно, это связано с присутствием в камбиальной зоне большего числа

Кам Рост! РосТ2 01 Стадии развития клеток

Рис. 2. Содержание

щелочелабильных (1) и кислотолабильных (2) ФК при формировании годичного

прироста в стволе сосны обыкновенной в начале июня в расчете на клетку. (Обозначения см. на рис. 1).

флоэмных производных камбия, которые, могут содержать ФС флавановой природы, как предшественников танниноносной паренхимы флоэмы, образующейся в период развития поздней ксилемы.

Свободные и связанные ФК. На

всех стадиях дифференциации клеток количество связанных ФК в два-пять раз больше, чем свободных. При этом в клетках ранней ксилемы количество свободных ФК в два-три раза больше, чем в поздней (рис. 4а). Как при развитии ранних, так и поздних трахеид свободные ФК увеличиваются к концу созревания трахеид (рис. 4). Динамика связанных ФК как в ранних, так и в поздних трахеидах имеет сходный характер (рис. 46). Их количество увеличивается от камбия до начала отложения лигнина, а затем снижается. В ранних трахеидах содержание этой фракции меньше, чем в поздних. Противоположное изменение содержания свободных и связанных ФК может указывать на катаболизм связанных ФК для обеспечения субстратами синтеза лигнина.

0,3

0,2

? 0,1

х 1.5

4 ?

р! 1

| £ 0,5

1 о

Кам Рост 01 02а 026 02в М Стадии дифференциации трахеид

Рис. 3. Содержание ФС в клетках зон камбия (Кам), роста растяжением (Рост), развития вторичной стенки до (01) и в ходе лигнификации (Л2а, 026, Шв), а также в зрелых трахеидах (М) при формировании ранней (1) и поздней (2) ксилемы годичного прироста в стволе сосны обыкновенной в расчете на клетку.

Кам Рост 01 Q2a D26 D2b М Стадии дифференциации трахеид

Кам Рост Э1 02а 026 02в М Стадии дифференциации тра)® ид

Рис. 4. Содержание свободных (а) и суммы связанных (б) ФК при формировании ранней (Г) и поздней (2) ксилемы годичного прироста в стволе сосны обыкновенной в расчете на клетку. (Обозначения см. на рис. 3).

Различие в количестве свободных ФК в конце созревания ранних и поздних трахеид может иметь влияние на толщину стенок трахеид так как свободные ФК являются ядами для клетки. Можно предположить, что повышенное их содержание в ранней, по сравнению с поздней ксилемой, является причиной более быстрого созревания ранних клеток и перехода их в зону зрелой ксилемы. Уменьшение времени пребывания клеток в зоне будет влиять на толщину клеточных стенок [Антонова, 1999].

Содержание отдельных форм связанных ФК - простых (кислотолабильные формы) и сложных (щелочелабильные формы) эфиров, тоже изменяется в

зависимости от стадии дифференциации трахеид и типа формирующейся ксилемы (рис. 5).

1,2

х 1

а & о,8

8 1 о,б

| 5 0,4

1 0,2 2 0

0,3 0,25 ? 0,2 > 0,15

I 0,1

" 0,05

Кам Рост 01 02а 026 02в М Стадии дифференциации трахэид

Кам Рост 02а 026 02в М Стадии дифференциации трахеид

Рис. 5. Содержание щелочелабильных (1) и кислотолабильных (2) ФК при формировании ранней (а) и поздней (б) ксилемы в расчете на клетку. (Обозначения см. на рис. 3).

Содержание простых и сложных ФК специфично для каждого из этапов дифференциации клеток и слоя формирующейся ксилемы. На стадиях дифференциации ранних трахеид кислотолабильных ФК в два-три раза больше, чем щелочелабильных. Исключение составляет зона роста растяжением ранних трахеид, в которой количество обоих форм кислот одинаково.

В клетках поздней ксилемы, если не учитывать камбиальную зону, простых форм ФК уже на порядок больше, чем сложных. Это указывает на избирательность использования простых и сложных ФК в биосинтезе лигнина, что должно повлиять на гетерогенность и динамику его отложения в ткани.

Изменение индивидуального состава ОК при развития трахеид

Состав свободных и связанных ОК, а в том числе их простых и сложных эфиров, тоже отличается специфичностью, как в отношении этапов дифференциации, так и слоя формирующейся ксилемы. В составе свободных ОК в ранней ксилеме доминировали п-кумаровая, феруловая кислоты, и по мере лигаификации их содержание снижалось. В поздней количество синаповой кислоты увеличивалось, а феруловой, напротив, снижалось. В ранней древесине в простых эфирах преобладали п-кумаровая и кофейная кислоты, и их количество падало, а в сложных - п-кумаровая и феруловая, содержание которых росло в процессе отложения лигнина. В поздних клетках в составе связанных ФК основным агликоном была феруловая кислота, и её количество в простых эфирах снижалось, тогда, как в сложных возрастало по ходу процесса.

Вариабельность содержания и состава свободных и связанных ФК, простых и сложных эфиров, а также всех форм ОК по мере дифференциации клеток ранней и поздней ксилемы должны влиять как на процесс лигнификации, так и состав феншшропановых единиц лигаина.

ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ ЛИГНИФИКАЦИИ РАННЕЙ И ПОЗДНЕЙ КСИЛЕМЫ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ

В главе приводятся данные по содержанию лигнина, составу и соотношению в нем структурных единиц, молекулярно-массовому распределению его препаратов, выделенных их клеток разных этапов созревания ранней и поздней ксилемы.

Особенности отложения лигнина в ранней и поздней ксилеме

Накопление лигнина в ксилеме рассматривали как интегральный (рис. 6а) и дифференциальный процессы (рис. 66).

Стадии созревания трахеид Стадии созревания трахеид

Рис. 6. Содержание (а) (% от сух. веса) и прирост (б) (% от веса лигнина в М) количества высокомолекулярных (ТГЛ-П) фракций лигнина на стадиях созревания ранних (1) и поздних (2) трахеид сосны обыкновенной. (Обозначения стадий развитая клеток см. на рис. 3).

Общий процесс лигнификации идет по нарастающей, т.е. по мере формирования вторичных стенок трахеид ранней и поздней ксилемы количество лигнина постепенно увеличивается (рис. 6а).

В то же время дифференциальные кривые (рис. 66), полученные как прирост количества лигнина, показывают, что интенсивность отложения лигнина различна на этих этапах, и динамика ее для ранней и поздней ксилемы противоположна. В ранней ксилеме интенсивность лигнификации постепенно возрастает к концу созревания трахеид, а в поздней, напротив, она максимальна на начальных этапах отложения литина и падает к завершению процесса.

Такое различие в динамике согласуется с изменением отношения АК/ДАК, т.е. условий окислительных процессов в тканях развивающейся ксилемы сосны обыкновенной, определенном на тех же объектах исследования ранее [Антонова и др., 2009]. Количество АК в ткани, как антиоксиданта, существенно влияет на скорость лигнификации [ТакаЬата, 1993].

Состав и структура лигнина

Метод щелочного окисления показал, что лигаины, как разных стадий созревания, так и ранней и поздней ксилемы тех же стадий различаются по содержанию и составу фенилпропановых единиц (рис. 7). Увеличение отношения сирингальных единиц к гваяцильным в ходе лигаификации ранней ксилемы показывает, что в структуре лигнина ранней ксилемы по мере лигнификации начинают преобладать сирингильные структуры. В поздней, напротив, начинают превалировать гваяцильные структурные единицы. Если эти данные сопоставить с изменением индивидуальных ОК, то можно предположить, что основным превращениям на пути образования монолигнолов в ранней ксилеме подвергаются сложные, а в поздней - простые эфиры ОК. Содержание п-оксифенилпропановых единиц в ранней древесине в лигнине по мере его биосинтеза увеличивается, тогда как в поздней, наоборот, снижается.

02а 026 02в М Стадии литификации

02а 026 02в М Стадии лигнификации

Рис. 7. Изменение отношения сирингилальдегида к ванилину (а) и содержания п-оксибензальдегида по стадиям лигнификации ранней (1) и поздней (2) ксилемы. (Обозначения стадий развития клеток см. на рис. 3).

Данные указывают на избирательное использование п-кумаровой, синаповой и феруловой кислот в синтезе полимера и соответствуют изменениям в содержании индивидуальных ОК на этапах лигнификации.

Молекулярно-маесовое распределение

Молекулярная масса лигнина изменяется по стадиям созревания трахеид (рис. 8). Препараты лигаина, синтезированные на первых стадиях процесса, имеют повышенную молекулярную массу за счет повышенного содержания в них углеводов.

Н фЖЦИВ

Рис. 8. Гель - фильтрационные кривые препаратов лигнина (ТГЛ-П), выделенных из ксилемы сосны с разной степенью созревания трахеид: а, в - первый этап лигнификации ранней и поздней ксилемы (соответственно), б, г - зрелая ранняя и поздняя ксилема (соответственно). Гель - 8ер1тс}ех 0-75, элюирование - ВШО+ЫС!. Стрелки показывают объемы выхода голубого декстрана и п-кумаровой кислоты.

По мере созревания клеток дисперсность лигнина увеличивается. Лигнин в ранней зрелой древесине более однороден, чем лигнин в зрелой поздней. В лигнине поздней ксилемы последних стадий увеличивается количество высокомолекулярных фракций.

Эфирные связи в макромолекулах лигнина

В состав литина помимо альдегидов входят также оксикоричные кислоты, соединяющие сложными и простыми эфирными связями макромолекулы лигнина между собой и с углеводами клеточной стенки.

В составе ОК, соединенных с лигаином простыми эфирными связями, в ранней древесине определили в основном феруловую кислоту, а в поздней - синаповую и феруловую. Через эти кислоты лигнин соединялся с углеводными олигомерами, которые содержали остатки арабинозы, ксилозы и глюкозы

В сложных эфирных связях лигнина в ранней ксилеме участвовали синаповая, п-кумаровая, п-оксибензойнная и феруловая кислоты, а в поздней - п-кумаровая, синаповая кислоты и следовые количества феруловой. В составе углеводной части сложноэфирных фрагментов присутствовали остатки арабинозы и ксилозы.

Таким образом, изучение особенностей лигнификации при формировании слоев ранней и поздней ксилемы годичного прироста древесины в стволах сосны обыкновенной, т.е. in vivo, показало, что между ранней и поздней ксилемой существуют специфичные отличия по динамике аккумуляции лигнина, его макромолекулярной характеристике, содержанию и составу фенилпропановых единиц в структуре полимера. Это свидетельствует о кардинальном различии в механизмах биосинтеза лигнина, синтезе его предшественников и условиях их конденсации в процессе лигнификации двух слоев ксилемы, образование которых в годичном приросте обусловлено разными условиями оводненности тканей в период роста дерева.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ЛИГНИФИКАЦИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (Pinus sylvesrtis)

Исследование лигнификации ксилемы сосны обыкновенной in vitro, было проведено в каллусной культуре ткани сосны обыкновенной. Условия культивирования (состав питательной среды, длительность культивирования и освещенность) указаны в методической части.

Изучение условий культивирования каллуса

На первой стадии исследования подбирались условия культивирования каллуса, которые обеспечивали не только его рост, но и дифференциацию с последующей лишификацией. Подбор условий проводили на образцах 1-8, данные приведены в диссертации. Предварительно была проведена работа по подбору эксплангов и формированию из них первичного каллуса (см. выше).

Лигнификации и анализ каллуса

В автореферате приводятся данные химического и гистохимического анализа каллусов сосны обыкновенной, полученных в условиях культивирования, при которых наблюдалась реакция на лигнин (обр. 11-25).

Гистохимический анализ. Состояние развития каллуса оценивали микроскопическим методом (см. га. 2).

В «светлых» (т.е. растущих) частях каллуса преобладали округлые клетки с тонкими стенками и крупным ядром. Очень редко наблюдалось слабое окрашивание на лигнин (обр. 14с; 15с; 16с).

В «темных» (т.е. дифференцированных) частях каллуса форма клеток была более разнообразной. Встречались округлые, овальные, и др. по форме клетки, многие с вторичным утолщением (трахеидоподобные клетки). Утолщение клеточных стенок было различным, но реакцию на лигнин давали преимущественно стенки со сплошным утолщением (обр. 11т-25т).

Химический анализ. В работе приводятся данные общего содержания углеводов, фенольных соединений, АК и ДАК (обр. 14-16), содержания низкомолекулярного (ТГЛ-1) и высокомолекулярного (ТГЛ-П) лигнина (обр. 11т, 14-16, 20, 21, 24, 25), а также состава структурных единиц препаратов лигнина (обр. 14-16).

Спирторастворимые вещества. Состав спирторастворимых метаболитов меняется в зависимости от условий культивирования каллуса и степени дифференциации клеток (рис. 9).

& 20

& 15

I10

X в

1 5

о 0

14с 14т 15с 15т 16с 16Г Образцы каллуса

14с 14т 15с 15т

Образцы каллуса

Рис. 9. Содержание углеводов (а) и фенольных соединений (б) в зависимости от условий культивирования каллуса и степени развития клеток (% от сухого веса биомассы), («с» - активно развивающиеся и делящиеся клетки, «т» - клетки с лигнифицированными клеточными стенками).

Количество низкомолекулярных углеводов при содержании сахарозы в питательной среде 3% ниже (обр. 14с;14т), чем при 5% (обр. 15с;15т), тогда как спирторастворимых ФС, наоборот, выше. Применение поливинилпирролидона (обр. 16) усиливает накопление углеводов в растущих клетках каллуса.

Отношение АК/ДАК в активно делящейся части каллуса (обр. 14с), культивированного при 3 %-ной сахарозе, было низким, т.е. преобладали процессы окисления. В лигнифицированной части (обр. 14т) АК не было обнаружено, что, вероятно, связано с её окислением до ДАК и, возможно, с подавлением синтеза АК.

В образцах 15с и 15т, культивировавшихся на средах с 5%-ной сахарозой, содержание АК на порядок выше, чем в образце 14с. Отношение АК/ДАК в 15с (0,264) выше, чем в 15т (0,164), что указывает на преобладание окислительных процессов и, вероятно, на потенциальную возможность лигнификации [ТакаЬата, ОшИ, 1997]. В образцах 16с и 16т уровень АК и ДАК не измерялся, поскольку применение поливинилпирролидона затрудняет их определение.

Содержание и состав лигнина также зависят от условий культивирования и степени развития каллуса (рис. 10). В зависимости от этих факторов менялось количество синтезированного лигнина. Максимальное содержание лигнина отмечалось в дифференцированной части каллуса («темной»), культивируемого на

среде с 5%-ной сахарозой (обр. 15т), а минимальное - в растущей части каллуса («светлой»), как низком, так и высоком содержании сахарозы (обр. 14с; 15с).

25 20 15 10 5 0

14т 15с 15т 16с Образцы каллуса

Рис. 10. Содержание (а) спирторастворимых фракций лигнина (ТГЛ-1) и (б) щелочерастворимых фракций лигнина (ТГЛ-П) в зависимости от условий культивирования каллуса и степени развития клеток (% от сухого веса клеточной стенки). (Обозначения как на рис. 9).

Применение ноливинилпирролидона (обр. 16с; 16т) при 5 %-ном содержании сахарозы в среде способствует приросту каллусной биомассы, но отрицательно влияет на накопление лигнина в тканях.

Изменение условий лигнификации за счет увеличения длительности выращивания позволило достичь однородной структуры биомассы каллуса (обр. 19т-25т) с равномерной дифференциацией клеток (рис. 11).

5 зо I 25

6 20

5 15 $

I 10

а 5 а

§ о

11т 15т 16т 19т 20т 21т 24т 25т Образцы каллуса

Рис. 11. Содержание (а) низкомолекулярных (ТГЛ-1) и (б) высокомолекулярных (ТГЛ-П) фракций лигнина в зависимости от условий культивирования каллуса (% от сухого веса клеточной стенки).

Увеличение длительности выращивания каллуса приводит к накоплению лигнина в его тканях, особенно относительного увеличения низкомолекулярной фракции. Культуры каллусных тканей, полученные в темноте (гетеротрофные) содержат больше низкомолекулярного лигнина и меньше высокомолекулярного (обр. 11т; 19т), чем культуры, выращенные на свету. Добавление феруловой кислоты (обр. 24т) в питательную среду не влияет на количество лигнина в тканях, однако может влиять на его структуру, а добавление АК к питательной среде отрицательно влияет на накопление этого полимера (обр. 25т). Очевидно, что существует возможность регуляции процесса лигнификации.

Структура лигнинов. Лигнины, выделенные из клеток разного онтогенетического развития, а также при разных условиях культивирования каллуса, отличаются содержанием и составом фенилпропановых единиц (рис. 12). Во всех образцах, за исключением 16т, преобладают гваяцильные структуры, характерные дня лигнина хвойных (рис. 12а). Также в лишине каллуса наблюдалось высокое содержание п-оксифенилпропановых структур, являющихся производными п-кумаровой кислоты, тогда как в лигнине зрелой ксилемы хвойных, и в частности сосны [Никитин, 1960; Грушников, Елкин 1973], они обнаруживались в следовых количествах, что также подтверждается нашими данными in vivo, особенно для поздней ксилемы.

14с 14т 15с 16т 16с 16т 14с 14т 15с 15т 16с 16т

Образцы каллуса Образцы каллуса

Рис. 12. Содержание продуктов щелочного окисления лигнина, продуцируемого каллусом в разных условиях культивирования и с разной степенью развития его клеток. (Обозначения как на рис. 9).

Характеристику лигнина хвойных часто дают по соотношению сириншльных и гваяцильных структур как S/V (или наоборот V/S). По данным анализа в лишине in vivo отношение S/V в ранней ксилеме составляет 0,31, поздней - 0,12. В лигнинах in vitro отношение S/V было равно для 15т - 0,42, а для 16т - 0,95. Сравнение отношений показывает, что литвин каллуса отличается по структуре от лигнина ранней и поздней ксилемы, однако ближе к лигнину зрелой ранней древесины. При использовании поливинилпирролидона в лигнине в основном преобладают сирингильные структуры.

В лигнине каллуса, кроме того, наблюдалось высокое содержание оксикоричных кислот - феруловой и п-кумаровой (рис. 12 б). При этом «светлая» часть каллуса содержала кислот больше, чем «темная». Это может свидетельствовать о разной степени конденсированности лигнина из-за разной степени связи с гемицеллюлозами стенок клеток каллуса. Если рассматривать сформированный лигнин с этой точки зрения, то лигнин из образца 15т, по-видимому, имеет более конденсированную структуру (более «плотный»).

Повышенное содержание феруловой и п-кумаровой кислот в лигнине из 16с (культивирование с поливинилпирролидоном), вероятно, означает, что макромолекулы лигнина в начале их формирования в этих условиях имеют малый молекулярный вес и множественные связи с компонентами клеточной стенки. В 16т этих связей меньше. По степени конденсированности лигнин этой части каллуса, по-видимому, аналогичен лигнину из 15т.

Результаты показывают, что состав и соотношение фенилпропановых единиц лигнина, продуцируемого каллусными кулыурами, а значит и биогенез предшественников лигнина, зависит от условий культивирования и состояния развития каллуса.

Следует ожидать, что структурная организация препаратов лигнина из каллусов серии 19-25, состоящих из клеток одинакового онтогенетического развития также будет различна.

ВЫВОДЫ

1. В ходе развития первичных стенок трахеид, как стадии предшествующей лигнификации, содержание фепольных соединений, свободных и связанных фенолкарбоновых кислот увеличивается в первой фазе роста, снижается во второй и снова повышается перед лигаификацией. Это свидетельствует о притоке субстратов, необходимых для этого процесса.

2. На всех стадиях развития клеток двух типов ксилемы доминируют связанные фенолкарбоновые кислоты, а в их составе простые эфиры, особенно в поздней ксилеме. Отношение сложных и простых эфиров зависит от степени развития и от типа клеток. В поздней ксилеме отношение простых эфиров к сложным на порядок больше, чем в ранней. Уровень свободных ФК в клетках ранней ксилемы больше, чем поздней. Данные указывают на разную субстратную основу процесса лигнификации ранней и поздней ксилемы.

3. Состав свободных оксшсоричпых кислот, их простых и сложных эфиров изменяется индивидуально в ходе дифференциации клеток и специфичен по отношению к слою развивающейся ксилемы.

4. Впервые показано, что при формировании ранней ксилемы интенсивность биосинтеза лигнина повышается к концу созревания трахеид, тогда как лишификация поздней ксилемы наиболее активно идет в начале процесса и падает в ходе созревания трахеид. Это указывает на разные условия лигнификации при развитии двух слоев ксилемы годичного слоя.

5. Лигаины ранней и поздней ксилемы на каждой из стадий формирования различаются содержанием и соотношением фенилпропановых единиц -гваяцильных, сириншльных и п-оксифенильных - и, следовательно, организацией их структуры.

6. Лигнин, синтезированный на первых стадиях процесса, имеет повышенную молекулярную массу из-за связей с полисахаридами клеточной стенки и более однороден, чем на последующих стадиях формирования трахеид Лигнин ранней зрелой ксилемы менее дисперсен, чем поздней.

7. Содержание и структурные характеристики лигнина, полученного в культуре ткани сосны обыкновенной, зависят от условий культивирования и степени развития каллуса. В зависимости от этих факторов меняется количество образованного лигнина, состав и соотношение фенилпропановых единиц в структуре лигнина. Данные указывают на возможность регуляции процесса лигнификации.

8. Лигнин каллуса сосны обыкновенной по соотношению сирингильных и гваяцильных единиц имеет сходство с лигнином ранней древесины.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Издания, рекомендованные ВАК:

1. Железннченко Т.В., Стасова В.В., Антонова Г.Ф. Фенолкарбоновые кислоты развивающихся клеток вторичной ксилемы Pinus sylvestris (Pinaceae) // Растительные ресурсы. 2011. Т. 47. Вып. 2. С. 76-85.

2. Антонова Г.Ф., Железннченко Т.В., Стасова В.В. Изменение содержания и состава фенолкарбоновых кислот в ходе роста клеток ксилемы сосны обыкновенной И Онтогенез, 2011, Т. 42, № 4, с. 276-284.

Прочие издания:

3. Железннченко Т.В. Участие фенолокислот в росте и развитии клеток при формировании древесины сосны обыкновенной. Материалы конференции молодых ученых «Исследования лесных экосистем Сибири», 3-4 марта 2009., Красноярск. Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, С. 20-22.

4. Железннченко Т.В., Стасова В.В., Антонова Г.Ф. Фенолокислоты развивающихся клеток сосны обыкновенной. Научные чтения памяти профессора А.А. Яценко-Хмелевского (к 100-летию со дня рождения). «Структурно-функциональные исследования растений в приложении к актуальным проблемам экологии и эволюции биосферы», 24-26 ноября 2009 г., Санкт-Петербург. Тезисы докладов. С. 19-20.

5. Железннченко Т.В. Особенности лигнификации при формировании ксилемы сосны обыкновенной. Материалы конференции молодых ученых «Исследования лесных экосистем Сибири», 6-7 апреля 2010., Красноярск. Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, С.29-31.

6. Антонова Г.Ф., Вараксина Т.В., Стасова В.В., Железннченко Т.В. Особенности лигнификации ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной. Материалы VII Международного симпозиума по фенолъным соединениям. 19-23 октября, Россия, Москва, 2009. С.292.

7. Антонова Г.Ф., Баженов А.В., Вараксина Т.В., Железннченко Т.В. Отложение лигнина на стадиях развития ранней и поздней ксилемы в стволах сосны обыкновенной. Материалы IV всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья», 21-23 апреля 2009. Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2009, кн.1. С.78-79.

8. Antonova G., Jeleznichcnko T., Vaiaksina T. Déposition of lignin during early and late xylem formation in Scots pine. ABSTRACTS. ХХШ IUFRO WORLD CONGRESS "Forest for the future: Sustaining Society and the Environment", 23-28 August 2010, Séoul, Republic of Korea. International Forestry Review Vol. 12(5), 2010.

9. Железннченко Т.В. Участие фенолокислот в росте и развитии клеток при формировании ксилемы и флоэмы сосны обыкновенной. Материалы XLV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», 10-12 апреля. Новосибирск 2007. С.113-114.

10.Железннченко Т.В., Вараксина Т.Н, Стасова В.В., Антонова Г.Ф. Лигнификация в культуре ткани сосны обыкновенной. VII Съезд Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационный биотехнологий», 4-10 июля 2011 г., ННГУ им. Лобачевского, Нижний Новгород. Материалы докладов. С. 249-250.

Подписано в печать 01.09.2011 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная 80 г/и2 Способ печати - оперативный Заказ №353. Тираж 100 Отпечатано в типографии «ДарМа-печать» Адрес: Академгородок, 50 стр.28, оф. 156 Тел. 290-72-32

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Железниченко, Татьяна Витальевна

Список принятых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИГНИФИКАЦИЯ КСИЛЕМЫ В ПРОЦЕССЕ ЕЁ РАЗВИТИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).Г.

1.1. Строение древесины хвойных.

1.2. Ультраструктура и одревеснение клеточной стенки.

1.3. Образование и строение годичного слоя.

1.4. Развитие ксилемных производных камбия.1

1.5. Фенольные соединения.

1.5.1. Фенолкарбоновые кислоты в растительной клетке.

1.5.2. Химия и структура лигнина.

1.5.3. Биосинтез лигнина.

1.6. Каллусные культуры как модельные системы для изучения процесса лигнификации клеточной стенки.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материал исследования.

2.2. Выделение и анализ фенолкарбоновых кислот.

2.3. Выделение и анализ лигнина.

2.4. Получение и анализ каллусных культур.

ГЛАВА 3. ФЕНОЛКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ГОДИЧНОГО СЛОЯ В СТВОЛАХ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ.

3.1. Изменение ФК при развитии первичных стенок трахеид.

3.2. Изменение ФК в ранних и поздних трахеидах.

3.3. Изменение индивидуального состава ФК по ходу развития трахеид .61 Заключение к главе.

ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ ЛИГНИФИКАЦИИ РАННЕЙ И ПОЗДНЕЙ КСИЛЕМЫ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ.

4.1. Отложение лигнина в ранней и поздней ксилеме.

4.2. Состав и структура лигнина.

4.3. Эфирные связи в макромолекулах лигнина.

4.4. Молекулярно-массовое распределение макромолекул.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительное изучение процесса лигнификации древесины сосны обыкновенной in vivo и in vitro"

Обоснование и актуальность. Лигнификация является одним из главных процессов, сопровождающих развитие клеток ксилемы древесных растений. Действуя как межклеточное связующее вещество, лигнин обеспечивает высокую устойчивость древесины к ударам, сжатию, изгибу. Он как бы цементирует эластичные микрофибриллы целлюлозы, что значительно повышает механическую прочность клеточной стенки. Кроме того, пропитывая клеточную стенку проводящих элементов ксилемы, он снижает ее проницаемость, что играет важную роль в транспорте воды, минеральных веществ и продуктов метаболизма, и делает клеточную стенку более устойчивой к воздействию патогенных микроорганизмов.

Проблема процесса лигнификации привлекала и привлекает исследователей по разным причинам. С одной стороны важно понять сам процесс лигнификации, приводящий к стабилизации ткани и появлению ее механической прочности, чтобы управлять этим процессом. С другой, важно найти пути оптимальной делигнификации древесины, поскольку лигнин является одним из наиболее значимых ограничивающих факторов, превращающих биомассу растений в целлюлозу или биотопливо. Интерес части исследователей направлен на получение растений с либо низким содержанием лигнина, либо его легкой доступностью химической деградации [Sticken, 2008; Weng et al., 2008a; Mansfield, 2009].

Изучение механизма биосинтеза лигнина и условий сочетания структурных фенилпропановых единиц в его макромолекулах в основном с связано синтезом дегидрополимеров in situ, предложенным еще Фрайденбергом [Freudenberg, 1959]. Другим направлением, активно используемым в последнее время, является исследование лигнификации в культуре ткани, которую применяют как модельную систему для изучения путей биосинтеза предшественников лигнина — оксикоричных кислот и ферментов, участвующих в процессе [Запрометов, 1993; Li et al., 2000; Dixon et al., 2001; Kärkönen et al., 2002; Möller et al., 2005; 2006].

Ранняя и поздняя ксилема, входящие в состав годичного прироста древесины хвойных отличаются по содержанию и распределению лигнина в структуре ксилемной ткани, морфологическим параметрам трахеид и физико-механическим характеристикам. Различия в условиях формирования ксилемных клеток раннего и позднего типа сосны обыкновенной [Антонова, Стасова, 1992; Антонова, 1999] должны влиять на процесс лигнификации, интенсивность его отложения в тканевых структурах и гетерогенность. Такие различия были обнаружены ранее при изучении отложения лигнина на этапах созревания клеток ранней и поздней ксилемы в стволах лиственницы сибирской [Antonova et al, 2007]. Связано ли это с биогенетической особенностью вида или характерно и для других хвойных нужно установить. Изучение лигнификации на последовательных стадиях развития клеток ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной до сих пор не проводилось.

Кроме того, важно установить, насколько будут адекватными процессы лигнификации in vivo и in vitro, т.е. в культуре тканей, которую используют как модельную систему для изучения лигнификации [Möller et al.,2003; 2005; 2006] и системы ферментов, связанных с этим процессом [Kärkönen et al., 2002; Möller et al., 2005].

Цель исследования - изучить процесс отложения лигнина, его структуру и состав предшественников - оксикоричных кислот - на последовательных стадиях развития клеток ранней и поздней ксилемы при формировании годичных приростов в стволах сосны обыкновенной {in vivo) и сравнить процессы лигнификации in vivo и in vitro (в культуре ткани).

Научная новизна. Впервые показаны различия в содержании, структуре и динамике накопления лигнина по мере созревания стенок ранних и поздних трахеид сосны обыкновенной. Впервые проведено поэтапное сравнение структуры препаратов лигнина, выделенных из разных по степени развития клеток ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной. Впервые получены данные по содержанию и составу фенолкарбоновых кислот, и в частности оксикоричных кислот, как соединений, играющих важную роль в росте и развитии клеток, а также являющихся предшественниками лигнина в ходе развития первичных и вторичных стенок ранних и поздних трахеид сосны обыкновенной. Впервые проведено сравнение структуры лигнина, продуцированного в ранней и поздней ксилеме сосны обыкновенной in vivo и in vitro. Установлено, что лигнин, полученный в культуре ткани, отличается по структуре от обоих типов древесины, однако имеет большее сходство с лигнинами ранней древесины. Защищаемые положения:

• Лигнины последовательных этапов созревания ранних и поздних трахеид различаются по составу фенилпропановых структурных единиц, что коррелирует с изменением состава оксикоричных кислот — предшественников лигнина.

• Лигнин сосны обыкновенной, полученный в условиях in vitro по составу структурных единиц ближе к лигнину ранней ксилемы.

Теоретическое и практическое значение.

Полученные данные по составу и соотношению структурных единиц, скорости отложения, структуре макромолекул лигнина, а также динамике и фракционному составу его предшественников на разных этапах дифференциации ранних и поздних трахеид послужат фундаментальным вкладом в понимание процесса лигнификации и ксилогенеза хвойных.

Сравнительное изучение процесса лигнификации сосны обыкновенной in vivo и in vitro позволит также внести вклад в понимание механизма лигнификации, определить факторы, влияющие на процесс, и наметить биотехнологические пути регулирования этого процесса, в частности, применяя генную инженерию.

Апробация работы. Материалы исследований были представлены на VII Международном симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2009), на IV всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009), на XXIII IUFRO WORLD CONGRESS (Seoul, 2010), на научных чтениях памяти профессора А. А. Яценко-Хмелевского «Структурно-функциональные исследования растений в приложении к актуальным проблемам экологии и эволюции биосферы» (Санкт-Петербург, 2009), на конференции молодых ученых Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН «Исследование компонентов лесных экосистем Сибири» (Красноярск 2009, 2010), на VII Съезде Общества физиологов растений России (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликованоЛО работ, в том числе 2 в рецензируемых журналах.

Заключение Диссертация по теме "Ботаника", Железниченко, Татьяна Витальевна

выводы

1. В ходе развития первичных стенок трахеид, как стадии предшествующей лигнификации, содержание фенольных соединений, свободных и связанных фенолкарбоновых кислот увеличивается в первой фазе роста, снижается во второй и снова повышается перед лигнификацией. Это свидетельствует о притоке субстратов, необходимых для этого процесса.

3. Состав свободных оксикоричных кислот, их простых и сложных эфиров изменяется индивидуально в ходе дифференциации клеток и специфичен по отношению к слою развивающейся ксилемы.

4. Впервые показано, что при формировании ранней ксилемы интенсивность биосинтеза лигнина повышается к концу созревания трахеид, тогда как лигнификация поздней ксилемы наиболее активно идет в начале процесса и падает в ходе созревания трахеид. Это указывает на разные условия лигнификации при развитии двух слоев ксилемы годичного слоя.

5. Лигнины ранней и поздней ксилемы на каждой из стадий формирования различаются содержанием и соотношением фенилпропановых единиц -гваяцильных, сирингильных и п-оксифенильных - и, следовательно, организацией их структуры.

6. Лигнин, синтезированный на первых стадиях процесса, имеет повышенную молекулярную массу из-за связей с полисахаридами клеточной стенки и более однороден, чем на последующих стадиях формирования трахеид. Лигнин ранней зрелой ксилемы менее дисперсен, чем поздней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований получены данные о составе и динамике предшественников лигнина (ФК), интенсивности его накопления и структуре макромолекул при развитии ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной. Кроме того, изучено накопление и структура лигнина в культуре клеток сосны обыкновенной и её зависимость от условий культивирования. Это позволило провести сравнение состава лигнина in vivo и in vitro.

В зависимости от стадии развития клеток и типа образующейся древесины содержание и состав фракций низкомолекулярных фенольных соединений (спирторастворимых) значительно изменяются. Их количество максимально на первой стадии лигнификации трахеид, затем снижается по мере их развития. В состав спирторастворимых ФС входят фенолкарбоновые кислоты, являющиеся предшественниками лигнина. В составе ФК присутствуют свободные и связанные формы, а в составе последних простые и сложные эфиры кислот. Их количество тоже меняется в зависимости от стадии дифференциации и типа дифференцирующихся клеток.

Содержание связанных форм кислот как в ранней так и поздней ксилеме в два-пять раз больше, чем свободных. Свободных кислот в ранней ксилеме в два-три раза больше, чем в поздней. Это указывает на специфику фенольного метаболизма в биогенезе ранних и поздних трахеид.

В составе связанных ФК обоих типов ксилемы превалировали простые эфиры. В клетках поздней древесины их было больше, чем в клетках ранней, особенно на стадии созревания. В ходе дифференциации клеток соотношение простых и сложных эфиров ФК тоже меняется специфично по отношению к типу формирующейся древесины. Простых эфиров ФК на стадиях дифференциации ранних трахеид содержалось в два, а в зрелой ксилеме почти в три раза больше, чем сложных. В поздних клетках содержание простых эфиров ФК на этапах лигнификации в десять раз больше, чем сложных.

Индивидуальный состав свободных и связанных ФК, в том числе их простых и сложных эфиров тоже отличается специфичностью как по отношению к типу древесины, так и стадиям дифференциации клеток. При развитии клеток ранней ксилемы преобладала синаповая кислота, а при развитии поздней - феруловая, различающиеся своей реакционной активностью.

Вариабельность свободных и связанных форм, а также содержания и состава простых и сложных эфиров по мере дифференциации клеток ранней и поздней ксилемы должны влиять как на процесс лигнификации, так и состав фенилпропановых единиц лигнина.

Биосинтез лигнина в ходе формирования ранней и поздней ксилемы сосны обыкновенной идет с противоположной динамикой: в ранней ксилеме интенсивность отложения лигнина увеличивается к концу созревания, а в поздней, напротив, снижается. Эти изменения коррелируют с количеством оксикоричных фенолкабоновых кислот, как предшественников лигнина, и уровнем аскорбиновой кислоты [Антонова и др., 2009], определяющей их доступность последующей дегидрогенной полимеризации.

Лигнины ранней и поздней ксилемы на каждой из стадий формирования различаются содержанием и соотношением фенилпропановых единиц и, следовательно, организацией их структуры. Соотношение сирингил- и гваяцилпропановых единиц в препаратах лигнина в трахеидах ранней ксилемы в ходе созревания постепенно растет, а в поздней, наоборот, снижается. Количество п-оксифенилпропановых единиц в ранней древесине увеличивается, в поздней - снижается в ходе лигнификации.

Согласно данным гель-хроматографии средняя молекулярная масса препаратов лигнина в ходе биосинтеза изменяется. На ранних стадиях отложения лигнина она меньше, чем к концу созревания. При этом дисперсность полимера увеличивается по мере созревания трахеид и в зрелой поздней древесине она выше, чем в ранней.

Таким образом, лигнин ранней и поздней ксилемы сосны различается по динамике накопления, составу, структуре и размеру макромолекул, что является следствием разных условий его биосинтеза.

Для сравнения процесса лигнификации in vivo и in vitro была получена культура ткани сосны обыкновенной.

Инициация каллусогенеза на разных эксплантах возможна при наличии в материале меристематических клеток. Они присутствуют либо во вторичных тканях (камбиальные клетки), которые при разделении флоэмы и ксилемы могут располагаться как на одной, так и на другой стороне, либо в зародышах семян.

В процессе работы подобраны условия культивирования каллуса сосны обыкновенной, при которых идет не только рост, но и лигнификация каллуса. Важными факторами, влияющими на морфологию клеток и накопление лигнина в клеточных стенках, являются условия освещенности (свет или темнота), концентрация сахарозы и аскорбиновой кислоты в питательной среде, добавление в нее поливинилпирролидона или феруловой кислоты, а также увеличение длительности выращивания.

Содержание низкомолекулярных спирторастворимых метаболитов каллуса (фенольных соединений (в основном ФК), углеводов, аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот) зависит от степени дифференциации клеток и от условий культивирования. При увеличении концентрации сахарозы в питательной среде до 5 % в клетках каллуса повышается количество низкомолекулярных углеводов, тогда как спирторастворимых фенольных соединений, наоборот, снижается. Отношение АК/ДАК также увеличивается.

Содержание и структурные характеристики лигнина также зависят от степени развития каллуса и условий культивирования. В зависимости от этих факторов меняется количество образованного лигнина, состав и соотношение фенилпропановых единиц в структуре лигнина. В растущих клетках каллуса количество обоих фракций лигнина всегда ниже, чем дифференцированных. При использовании питательной среды с повышенной концентрацией сахарозы степень лигнификации клеток значительно усиливается и количество высокомолекулярной фракции лигнина значительно усиливается.

Применение поливинилпирролидона при той же концентрации сахарозы в среде положительно влияет на прирост каллусной биомассы, однако подавляет биосинтез лигнина и способствует увеличению его низкомолекулярной фракции.

Увеличение длительности выращивания каллуса приводит к накоплению лигнина в его тканях. Культуры каллусных тканей, полученные в темноте содержат больше низкомолекулярного лигнина и меньше высокомолекулярного, чем культуры, выращенные при 16 часовом фотопериоде. Добавление феруловой кислоты в питательную среду не влияет на количество лигнина в тканях, однако может влиять на его структуру, а добавление аскорбиновой кислоты к среде подавляет биосинтез этого полимера.

Таким образом, сделана оценка процесса лигнификации в культуре клеток сосны обыкновенной. Показано, что при различных условиях культивирования образуется разное количество лигнина в каллусных тканях, который также различается по своей структуре. Принимая во внимание полученные данные, вероятно, можно регулировать образование и свойства этого полимера.

Сопоставление данных по содержанию и структуре лигнина, полученного в условиях in vitro, позволило сделать вывод, что он отличается по структуре от обоих типов древесины, однако имеет большее сходство с лигнинами ранней древесины. Анализ полученных данных показывает, что сравнение процесса лигнификации in vivo и in vitro может быть не вполне объективным, поскольку в древесине сосны присутствуют два разных типа ксилемы - ранняя и поздняя, различающиеся по динамике аккумуляции лигнина, его макромолекулярной структуре, содержании и составе фенилпропановых единиц.

Ill

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Железниченко, Татьяна Витальевна, Красноярск

1. Антонова Г.Ф. Аскорбиновая кислота и развитие клеток ксилемы и флоэмы в стволе сосны обыкновенной / Г.Ф. Антонова, В.В. Стасова, Т.Н. Вараксина // Физиология растений. 2009. - Т. 56, № 2. - С. 210-219.

2. Антонова Г.Ф. Динамика развития клеточных стенок трахеид в процессе образования годичного слоя древесины сосны обыкновенной / Г.Ф. Антонова, В.В. Шебеко // Химия древесины. 1986. - № 1. - С. 82 - 87.

3. Антонова Г.Ф. Использование крезилового прочного фиолетового при изучении образования древесины / Г.Ф. Антонова, В.В. Шебеко // Химия древесины. 1981. - № 4. - С. 102 - 105.

4. Антонова Г.Ф. Рост клеток хвойных / Г.Ф. Антонова. Новосибирск: Наука, 1999. 231 с.

5. Антонова Г.Ф. Формирование годичного слоя стволов сосны обыкновенной и лиственницы сибирской / Г.Ф. Антонова, В.В. Стасова // Лесоведение. 1992. - № 5. - С. 19 - 27.

6. Антонова Г.Ф. Формирование ксилемы в двулетних побегах свободно растущей сосны обыкновенной / Г.Ф. Антонова, В.В. Шебеко // Роль экологических факторов в метаболизме хвойных. Красноярск: ИЛиД СО АН СССР, 1979. - С. 118-128.

7. Антонова Г.Ф. Формирование ксилемы хвойных. 3. Динамика развития трахеид в зонах дифференциации / Г.Ф. Антонова, В.В. Шебеко // Лесоведение. 1985. - № 5. - С. 71-74.

8. Антонова, Г.Ф. Сезонная динамика камбиальной активности и дифференциации трахеид в стволе сосны обыкновенной. / Г.Ф Антонова, В.В. Шебеко, Е.С. Милютина // Химия древесины. 1983. — № 1. — С. 16 -22.

9. Бардинская М.С. Растительные клеточные стенки и их образование / М.С. Бардинская. М: Наука, 1964. - 160 с.

10. Браунинг Б.Л. Состав и химические реакции древесины / Б.Л. Браунинг // Химия древесины. М.: Лесная промышленность, 1967. - С. 5-35.

11. Гребинский С.О. Биохимия растений / С.О. Гребинский. Львов: Вища школа, 1975. - 280 с.

12. Грушников О.П. Достижения и проблемы химии лигнина / О.П. Грушников, В.В. Елкин. М.: Наука, 1973. - 296 с.

13. Дженсен У. Ботаническая гистохимия / У. Дженсен. М.: Мир, 1965. -377 с.

14. Загоскина Н.В. Культура ткани чайного растения: дифференциация, уровень плоидности, образование фенольных соединеий / Н.В. Загоскина, В.Г. Федосеева, Л.В. Фролова, Н.Д. Азаренкова, М.Н.

15. Запрометов // Физиология растений. 1994. - Т. 41, № 5. - С.762-767.

16. Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений и их биогенез / М.Н. Запрометов // Итоги науки и техники. Биологическая серия. М: ВИНИТИ, 1988. - Т. 27. - 188 с.

17. Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений: Биосинтез, превращения и функции / М.Н. Запрометов // Новые направления в физиологии растений. М: Наука, 1985. - С.143-162.

18. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях / М.Н. Запрометов. М.: Наука, 1993. - 272 с.

19. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений / М.Н. Запрометов. М.:Высш. шк., 1974. - 213с.

20. Карманов А.П. Лигнин. Структурная организация и самоорганизация / А.П. Карманов // Химия растительного сырья. 1999. - №1. - С. 65-74.

21. Костина В. М. Особенности фенольного метаболизма растений рода Rhododendron L. in vivo и in vitro: автореф. дис. канд. биол наук / В. М. Костина. М., 2009. - 22 с.

22. Крамер П.Д. Физиология древесных растений / П. Д. Крамер, Т.Т. Козловский. М.: Лесн. пром-ть, 1983. - 462 с.

23. Леплинский Ю.И. Длина волокон древесины у древесных растений. I. Длина волокон древесины в стволе древесного растения / Ю.И. Леплинский // Ботан. журн. 1982. - Т. 67, № 1. - С. 3 - 16.

24. Москалева В.Е. О формировании трахеиды сосны / В.Е. Москалева // Тр. Ин-та леса АН СССР. 1958. - Т. 37. - С. 254 - 265.

25. Никитин В.М. Химия древесины и целлюлозы / В.М. Никитин. М: Гослесбумиздат, 1960. - 468 с.

26. Одинцов П.П. Уроновые кислоты в молодых побегах ели / П.П. Одинцов, Р.Г. Каткевич, М.К. Пендере, Ю.Ю. Каткевич // Изв. АН ЛатвССР. Сер. Хим. 1967. - Вып. 3. - С. 632 - 639.

27. Осипов В.И. Гидроароматические кислоты в жизнедеятельности хвойных / В.И. Осипов. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1979. -111с.

28. Осипов В.И. Биосинтез оксибензойных кислот в проростках Pinus sylvestris L. / В.И. Осипов, Л.П. Александрова // Изв. СО АН СССР, Сер. Биол. наук. 1986. - Вып. 1. - С. 83-86.

29. Перелыгин Л.М. Строение древесины / Л.М. Перелыгин. М.: Изд-во АН СССР, 1954. - 194 с.

30. Полубояринов О.И. Плотность древесины / О.И. Полубояринов. М: Лесн. пром-ть, 1976. - 200 с.

31. Сарканен К.В. Лигнин / К.В. Сарканен // Химия древесины: под ред. Браунинга-М.: Лесн. пром, 1967. С. 180-243.

32. Сарканен К.В. Понятие о лигнине, его номенклатура и классификация / К.В. Сарканен // Лигнины: (структура, свойства и реакции): под ред. Сарканена К.В., Людвига К.Х., Хергерта Г.В. М.: Лесн. пром-сть, 1975. -С. 9- 18

33. Сарканен К.В. Предшественники лигнина и их полимеризация / К.В. Сарканен // Лигнины (структура, свойства и реакции): под ред. Сарканена К.В., Людвига К.Х. М.: Лесн. Пром-ть, 1975. - С. 18-79.

34. Стасова В.В. Динамика пластических веществ годичного слоя ксилемы побегов сосны / В.В. Стасова, Г.Ф. Антонова // Лесоведение. 1989. - № 5. - С. 36-45.

35. Стасова В.В. Особенности развития стенок трахеид при образовании древесины сосны обыкновенной: дис. канд. биол. наук / В.В. Стасова. -Красноярск, 1991. 174 с.

36. Стрекова В.Ю. О возможных причинах нарушения процесса лигнификации в культуре ткани чайного растения / В.Ю. Стрекова, Г.А. Субботина, Н.В. Загоскина, М.Н. Запрометов // Физиология растений. -1980. Т. 27, №. 6. - С. 1192-1198.

37. Судачкова Н.Е. Влияние стрессовых воздействий на ксилогенез сосны обыкновенной в условиях Сибири / Н.Е. Судачкова, И.Л. Милютина, Л.И. Романова// Лесоведение. 2007. - №6. - С. 101-106.

38. Третьякова И.Н. Индукция соматического эмбриогенеза у кедра сибирского / И.Н. Третьякова, М.В. Ижболдина // Лесоведение. 2009. -№ 5. - С. 43-49.

39. Третьякова И.Н. Особенности роста эмбриогенного каллуса и получение соматических зародышей у кедра сибирского / И.Н. Третьякова, М.В. Ижболдина//Хвойные бореальной зоны. 2008. - №1-2. - С. 71-76.

40. Фенгел Д. Древесина (химия, ультраструктура, реакции) / Д. Фенгел, Г. Вегенер -М.:Лесн. пром-ть. 1988. - 512 с.

41. Чаплыгина И.А. Особенности формирования ранних и поздних трахеид при образовании лиственницы сибирской: автореф. дис. канд. биол. наук / И.А. Чаплыгина. Красноярск, 2007. — 16 с.

42. Эриныш П.П. Строение и свойства древесины как многокомпонентной полимерной системы / П.П. Эриныш // Химия древесины. 1977. - Т. 1. -С. 8 - 25.

43. Эсау К. Анатомия семенных растений / К. Эсау. М.: Мир, 1980. - 558 с.

44. Яценко-Хмелевский А.А. Основы и методы анатомического исследования древесины / А.А. Яценко-Хмелевский. М. — Л.: Изд-во АН СССР, 1954.-337 с.

45. Agarwal Umesh P. Raman imaging to investigate ultrastructure and composition of plant cell walls: distribution of lignin and cellulose in black spruce wood (Picea mariana) / P. Agarwal Umesh // Planta. 2006. V. 224. -P.l 141-1153.

46. Antonova G.F. Daily dynamics in xylem cell radial growth of Scots pine (Pinus sylvesnris L.) / G.F. Antonova, V.P. Cherkashin, V.V. Stasova, T.N. Varaksina // Trees. 1995. - V. 10. N 1. - P. 24-30.

47. Antonova G.F. Effects of environmental factors on wood formation in Scots pine stems / G.F. Antonova, V.Y. Stasova // Trees. 1993. V. 7, N 5. - P. 214219.

48. Antonova G.F. The Differences in the Lignification of Earlywood and Latewood in Larch (Larix sibirica Ldb.) / G.F. Antonova, T.N. Varaksina, V.V. Stasova//Eur. J. For. Res. 2007. - V. 10, N 2. - P. 149-161.

49. Asunmaa S. Morphology of middle lamella, of swedish spruce (Picea excelsa) / S. Asunmaa// Svenskpapperstidn. 1955. V. 58. - P. 308-310.

50. Bailey I.W. Cell wall structure of higher plants / I.W. Bailey // Industrial and Engineering Chemistry. 1938. V. 30. - P 40-47.

51. Baucher M. Biosynthesis and genetic engineering of lignin / M. Baucher, B. Monties, M: Van Montagu, W. Boerjan // Plant Sci. 1998. V. 17. - P. 125197.

52. Boerjian.W. Lignin biosynthesis / W. Boerjian, J. Ralph, M. Baucher // Annu Rev Plant Biol. 2003. - V. 54. - P. 519-546.

53. Boija E. Interaction between model membranes and lignin-related compounds studied by immobilized liposome chromatography / E. Boija, G. Johansson // Biochim Biophys Acta. 2006. - V.1758. - P. 620-626.

54. Boudet A.M. Biochemistry and molecular biology of lignification / A.M. Boudet, C. Lapierre, J. Grima-Pettenati // New Phytol. 1995. - V. 129. -P. 203-236.

55. Brandstom F. Morphology of Norway-spruce tracheids with emphasis on wall organization: Doctoral thesis. / F. Brandstom Uppsala, Swedish University of Agricultural Science, 2002. - 237 p.

56. Brunow G. Lignins released from Picea abies suspension cultures — true native spruce lignins / G. Brunow, R.M. Ede, L.K. Simola, J. Lemmeitunen // Phytochemistry. 1990. - V. 29. - P. 2535-2538.

57. Brunow G. The chemical structure of exrtacellular lignin released by cultures the Picea abies / G. Brunow, I. Kipelainan, C. Lapiere, K. Lundguist, L.K. Simola, J. Lemmeitunen // Phytochemistry. 1993. - V. 32. - P. 845-850.

58. Cano-Delgado A. Reduced cellulose synthesis invokes lignification and defense responses in Arabidopsis thaliana / A. Cano-Delgado, S. Penfield, C. Smith, M. Catley, M. Bevan // Plant J. 2003. - V. 34. - P. 351-362.

59. Chaffey N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia Trends / N. Chaffey // Plant Science. 1999. - V. 4. - P. 203-204.

60. Denne M.P. Temperature and tracheid development in Pinus sylvestris seedlings / M.P. Denne // J. Exp. Bot. 1971. - V. 22, N 71. - P. 362 - 370.

61. Dixon R.A. The biosythesis of monolignols: a "metabolic grig", or independent pathway to guaicil and syringil units? / R.A. Dixon, F. Chef, D. Guo, K. Parvathi // Phytochemistry. 2001. V. 57. - P. 1069-1084.

62. Donaldson L.A. Lignification and lignin topochemistry — an ultrastructural view / L.A. Donaldson // Phytochem. 2001. - V. 57. - P. 859-873.

63. Donaldson L.A. Lignin distribution during latewood formation in Pinus radiata D.Don. / L.A. Donaldson // IAWA Bui. 1992. - V. 13, N 4. - P. 381387.

64. Donaldson L.A. Seasonal changes in lignin distribution during tracheid development in Pinus radiata D.Don. / L.A. Donaldson // Wood Sci. Technol. 1991.-V. 2, N.l. - P. 15-25.

65. Doubois M. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances / M. Doubois, R.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers, F. Smith // Anal. Chem. 1956. - V. 28. - P. 350 - 356.

66. Ehlting J. Global transcript profiling of primary stems from Arabidopsis thaliana identifies candidate genes regulators of fiber differentiation / J. Ehlting, N. Mattheus, DS. L. Aeschliman, Samuels, et al. // Plant J. 2005. -V. 42.-P. 618-640.

67. Fengel D. Wood chemistry, ultrastructure, reactions / D. Fengel, G. Wegener.- Cermany, Berlin: Walter de Gruyter, 1989. - 124 p.

68. Fox C. Chemical and thermal characterization of three industrial lignins and their corresponding lignin esters: MS thesis / C. Fox/ Moscow, University of Idaho College of Natural Resources, 2006. - 67 p.

69. Freudenberg K. Biosynthesis and constitution of lignin / K. Freudenberg // Nature. 1959.-V. 183.-P. 1152-1155.

70. Frey H.P. Uber die Einlagerung des Lignins in die Zellwand / H.P. Frey // Holz Roh- u. Werkstoff. 1959. - V. 17, N 8. - P. 313-318.

71. Frey-Wyssling A. Ultra-violet and fluorescence optics of lignified cell walls / A. Frey-Wyssling // The Formation of Wood in Forest Trees. N.Y.: Academic Press, 1964. - P. 153-167.

72. Fry S.C. Cross-linking of matrix polymers in the growing cell walls of angiosperms / S.C. Fry // Annu. Rev. Plant Physiol. 1986. - V. 37. - P. 165186.

73. Fry S.C. Feruloylated Pectins from the Primary Cell Wall: Their Structure and Possible Functions / S.C. Fry // Planta. 1983. - V. 157. - P. 111-123.

74. Fry S.C. Feruloylated pectins from the primary cell wall: their structure and possible functions / S.C. Fry // Planta. 1983. - V. 157. - P. 111-123.

75. Fry S.C. Intracellular feruloylation of pectic polysaccharides / S.C. Fry // Planta. 1987. - V. 171.-P. 205-211.

76. Fry S.C. Intraprotoplasmic and wall-localised formation of arabinoxylan-bound diferulates and larger ferulate coupling-producrs in maize cellsuspension cultures / S.C. Fry, S.C. Willis, A.EJ. Paterson // Planta. 2000. -V.211.-P. 679-692.

77. Fry S.C. Oxidative scission of plant cell wall polysaccharides by ascorbate-induced hydroxyl radicals / S.C. Fry // Biochemical Journal. 1998. - V. 50. -P. 931-937.

78. Fukuda H. Lignin synthesis and its relates enzymes as markers of tracheary-element differentiation in single cells isolated from the mesophyll of Zinnia elegants / H. Fukuda, A. Komamine // Planta. 1982. - V. 155. - P 423-430.

79. Fukuda H. Tracheary element formation as a model system of cell differentiation / H. Fukuda // International Review Cytology. 1992. - V. 136/ - P. 289-332.

80. Gindl W. Relationship between lignin content and tracheid morphology in spruce / W. Gindl, R. Wimmer // In: Proceedings of 3rd Plant Biomechanics Conference., Aug. Sept. 2000. - Freiburg, Germany, 2000. - P. 163-168.

81. Glass A.D.M. Influence of phenolic acids on ion uptake. 4. Depolarization of membrane potential / A.D.M. Glass, J. Dunlop // Plant Physiol. 1974. - V. 54. - P. 855-858.

82. Grabber J.H. Ferulate cross-linking in cell walls isolated from maize cell suspensions / J.H. Grabber, R.D. Hatfield, J. Ralph et al. // Phytochemistry. -1995. -V. 40. P. 1077-1082.

83. Grabber J.H. Genetic and molecular basis of grass cell wall biosynthesis and degradability. I. Lignin-cell wall matrix interactions / J.H. Grabber, J. Ralph, C. Lapierre, Y. Barriere // C.r. boil. 2004. - V. 327. - P. 455-465.

84. Gross G.G. Biosynthesis and metabolism of phenolic acids and monolignols / G.G. Gross // Biosynthesis and degradation of wood components. N.Y.: Acad. Press, 1985. - P. 229 - 271.

85. Harris PJ. Phenolic constituens of the cell walls of monocotyledons / P.J. Harris, R.D. Hartley // Biochem. Syst. Ecol. 1980. - V. 8. - P. 153-160.

86. Hartley R.D. Improved methods for the estimation by gas-liquid chromatography of lignin degradation products from plants / R.D. Hartley // J. Chromatog. -1971. V. 54. - P.335- 344.

87. Hartley R.D. Phenolic constituents of the cell walls of dicotyledons / R.D. Hartley, P.J. Harris // Ibid. 1981. V. 9. - P. 189-203.

88. Hartley R.D. Phenolic components and degradability of the cell walls , of the brown midrib mutant, bmz, of Zea mays / R.D. Hartley, E.C. Jones // J. Sci. Food and Agr. 1978. - V. 29. - P. 777-789.

89. Hartley R.D. Substitiied truxillic and truxillic acid on cell walls of Cynodon dactulon / R.D. Hartley, W.H. Morrison, F. Balza, G.H.N. Towers // Phytochemistry. 1990. - V. 29. - P, 3699-3703.

90. Hatfield R. Lignin formation in plants: the dilemma of linkage specificity / R. Hatfield, W. Vermerris // Ibid. 2001. - V. 126. - P. 1351-1357.

91. Havel L. Xylogenesis in Cupressus callus involves apoptosis / L. Havel, M.T. Scarano, D.J. Durzan // Advanced Horticultural Science. 1997. - V. 11. -P. 37-40.

92. Higuchi T. Chemical properties of milled wood lignin of grasses / T. Higuchi, Y. Ito, M. Shimada, I. Kawamura // Phytochemistry. 1967. - V. 6. - P. 15511556.

93. Ishii T. Isolation and characterization of feruloylated arabinoxylan oligosaccarides from bamboo shoot cell walls / T. Ishii, T. Hiroi // Carbohydr. Res. 1990. - V. 196. - P. 175-183.

94. Ishii T. Use of non-radioactive digoxigenin-labelled DNA probe for RFLP analysis in rice / T. Ishii, O. Paraud, D.S. Blar, G.S. Khush // Plant Mol. Biol. Rep. 1990. - V. 8. - P. 167-179.

95. Jannings A.C. The determination of dihydroxy phenolic compounds in extracts of plant tissues / A.C. Jannings // Analyt. Biochem. 1981. - V. 118, N2.-P. 396-398.

96. Kamisaka S. Diferulic and ferulic acid in the cell wall of Avena coleopties -their relationships to mechanical properties of the cell wall / S. Kamisaka, S. Takeda, K. Takashi, K. Shibata // Plant Physiol. 1990. - V. 78. - P. 1-7.

97. Kärkönen A. Lignification related enzymes in Picea abies suspension cultures / A. Kärkönen, S. Koutaniemi, M. Mustonen, K. Syrjänen, G. Brunow, I. Kilpeläinen, T.H. Teeri, L.K. Simola // Physiol Plant. 2002. - V. 114. - P. 343-353.

98. Kato A. A new feruloylated trisaccaride from bagasse / A. Kato, J. Azuma, A. Koshijima // Chem. Lett. 1983. - P. 137-140.

99. Keneda M. Tracking monolignols during wood development in lodgepole pine / M. Keneda, KH. Rensing, JCT. Wong, B. Banno, SD. Mansfield, AL. Samuels // Plant Physiol. 2008. - V. 147. - P. 1750-1760.

100. Kerr T. The cambium and its derivative tissues. No X Structure. Optical properties and chemical composition of the so-called middle lamella / T. Kerr, J.W. Bailey // J. Arnold Arboretum. 1934. - V. 15. - P. 327-349.

101. Lange B.M. Elicitor-enduced spuce stress lignin. Structural similarity to early developmental lignin / B.M. Lange, C. Lapierre, H. Sanderman // Plant Physiol. 1995. - V. 108. - P. 1277-1287.

102. Lewis A. 20th centrum roller coaster ride: A short account of lignification / A. Lewis // Curr. Opin. Plant Biol. 1999. - V. 2. - P. 153-162.

103. Li L. 5-Hydroxyconiferul aldehyde modulates enzymatic methylation for syringyl monolignol formation, a new view of monolignol biosynthesis in Angiosperms / L. Li, J.L. Popko, T. Umezawa, V.L. Chiang // J. Biol. Chem. -2000. V. 275. - P. 6537-6545.

104. Locher R. Cell wall-bound trans- and cis-benzoic acids in growing maize roots / R. Locher, H.V. Martin, R. Grison, P-E. Pilet // Physiologia Plantarum. 1994.-V. 90.-P. 734-738.

105. Mansfield S.D. Solutions for dissolution engineering cell walls for deconstruction / S.D. Mansfield // Curr Opin Biotechnol. - 2009. - V. 20. - P. 286-294.

106. Marjamaa K. Monolignol oxidation by xylem peroxidase isoforms of Norway spruce (Picea abies) and silver birch (Betula pendula) / K. Marjamaa, E. Kukkola, T. Lundell, P. Karhunen, P. Saranpaa, KV. Farstedt // Tree Physiol. -2006.-V. 26.-P. 605-611.

107. Maurer A. Electron microscope representation of structural details I softwood cell walls with ultra-microtome sections / A. Maurer, D. Fengel // Horz Roh Werkst. 1991. - V. 13. - P. 323-338.

108. Meier H. The distribution of polysaccharides in the cell-wall of trecheids of pine {Pinus silvestris L.) / H. Meier, K.C.B. Wilkie // Holzforschung. 1959. -V. 13. - P. 177-182.

109. Möller R. Lignification in cell cultures of Pinus radiata: activities of enzymes and lignin topochemistry / R. Möller, G. Koch, B. Nanayakkara, U. Schmitt // Tree Physiology. 2005. - V. 26. - P. 201-210.

110. Möller R. Effect of light and activated charcoal on tracheary element differentiation in callus cultures Pinus radiata D. Don. / R. Möller, R.D. Ball, A.R. Henderson, G. Modzel, J. Find // Plant Cell Tissue and Organ Culture. -2006.-V. 85.-P. 161-171.

111. Möller R. Cell differentiation, secondary sell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. / R. Möller, A.G. McDonald, C. Walter, F J. Harris // Planta. 2003. - V. 217. - P. 736-747.

112. Möller R. Cell differentiation and secondary cell wall formation in callus culture of Pinus radaita: PhD thesis / R. Möller. New Zealand, The University of Auckland, 2002. - 236 p.

113. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. - P. 473-497.

114. Murmanis L. Seasonal develoment of secondary xylem in Pinus strobus L / L. Murmanis, J.B. Sach // Wood Sei. Technol. 1969. - V. 3, N 3. - P. 177 - 193.

115. Nimz H.H. Carbon 13 nuclear magnetic resonance spectra of lignins. 6. Lignin and DHP acetates / H.H. Nimz, H.D. Ludemann // Holzforschung. -1976. V. 30. - P. 33-40.

116. Nose M. Towards the Specification of Consecutive Steps in Macromolecular Lignin Assembly / M. Nose, M.A. Bernards, M. Furlan, J. Zajicek, T.L. Eberhardt, N.G. Lewis // Phytochemistry. 1995. - V. 39. - P. 71-79.

117. Picket-Heaps J.D. Xylem wall deposition: Radioautographic investigations using lignin precursors / J.D. Picket-Heaps // Protoplasma. 1968. - V. 65. -P. 181-205.

118. Ralph J. Lignin-ferulate cross-links in grasses: active incorporation of ferulate polysac-charide esters into ryegrass lignins / J. Ralph, J.H. Grabber, R.D. Hatfield // Ibid. 1995. - V. 275. - P. 167-178.

119. Ralph J. Lignins: naturals polimer from oxidative coupling of 4-hydroxiphenilpropanoids / J. Ralph, K. Lundquist, G. Brunow, H. Kim, PF. Schatz, JM. Marita, RD. Hatfield, SA. Ralph, JH. Christensen et al. // Phytochem. Rev. 2004. - V. 3. - P. 29-60.

120. Ralph J. Identification and synthesis of new ferulic acid dehydrodimers present in grass cell walls / J. Ralph, S. Quideau, J.H. Grabber, R.D. Hatfield //J. Chem. Soc. 1994. - V.l. - P. 13485-13498.

121. Ramsden L. Tracheid formation in cultures of pine (Pinns sylvestris) / L. Ramsden, D.H. Nortcote // J. Cell Sei. 1987. - V. 88. - P. 467-474.

122. Ravinda B. Somatic embryogenesis from vegetative shoot apices of mature trees of Pinus patula / B. Ravinda, J. Malabadi, Staden. Van // Tree Physiology. 2005. - V. 25. - P. 11-16.

123. Rogers L.A. Light, the circadian clock, and sugar perception in the control of lignin biosynthesis / L.A. Rogers, S. Dubos, C. Surman, G. Willment, S.D. Mansfielt, M.M. Campbell // J Exp Bot. 2005. - V. 56. - P. 1651-1663.

124. Rouau X. A dehydrotrimer of ferulic acid from maize bran / X. Rouau, V. Cheynier, A. Surget et al. // Phytochemisry. 2003. - V. 63. - P. 899-903.

125. Sachs I.B. Investigation of lignin distribution in the cell wall of certain woods / I.B. Sachs, I.T. Clark, J.C. Pew // J. Polymer Sci. Part C. 1963. - V. 2. -P 203-212.

126. Santanen A. Polyamine metabolism during development of somatic and zygotic embryos of Picea abies (Norway spruce): acad. dissert / A. Santanen. Helsinky, 2000. - 60c.

127. Sarkanen K.V. Lignin precursors and their polymerization / K.V. Sarkanen, G.H. Ludwid // Lignins: occurrence, formation, structure and reactions: New York: Wiley-Interscience, 1971. - P: 95-163.

128. Scalbert A. Ether linkage between phenolic acids and lignin fractions from wheat straw / A. Scalbert, R. Monties, J.-Y. Lallemand, E. Guittet, C. Rolando //Phytochemistry. 1985. - V.24. - P. 1359-1362.

129. Sederoff R.R. Unexpected variation in lignin / R.R. Sederoff, J J. MacKay, J. Ralph, R.D. Hatfield // Curr. Opin. Plant Biology. 1999. - V. 2. - P. 145-152.

130. Sell J. Confirmation of sandwich-like model of the cell wall of softwoods by the light microscope / J. Sell // Holz als Roh-Werkstoff. 1994. - V.52. - P. 234.

131. Sell J. The structure of cell wall layer S2. Field emission SEM studies on the transverse-fracture surfaces of the wood of spruce and fir / J. Sell, T. Zimmermann // Forschungs-u Arbeitsber. Abt Holz. 1993. - V. 115. - P. 126.

132. Simola L.K. Lignin release and photomixotropism in suspension cultures in Picea abies / L.K. Simola, J. Lemmetyinen, A. Santanen // Physiol Plant. 1992.-V. 84. P. 374-379.

133. Stafford H. Proanthocyanidins and the lignin connection / H. Stafford // Phytochem. 1988. - V. 27, N 1. - P. 1-6.

134. Sterjliades R., Dean J.F.D., Eriksson K.-E.L. Laccase from sycamore maple (Acer pseudoplatanus) polymerizes monolignols / R. Sterjliades, J.F.D. Dean, K.-E.L. Eriksson // Plant Physiol. 1992. - V. 99. - P. 1162-1168.

135. Sticken M.B. Plant genetic engineering for biofuel production: towards affordable cellulosic ethanol / M.B. Sticken // Nat Rev Genet. 2008. - V. 9. -P. 433-443.

136. Takahama U. Peroxidase-Phenolics-Ascorbate System Can Scavenge Hydrogen Peroxide in Plant Cells / U. Takahama, T.A. Oniki // Physiol. Plant. 1997.-V. 101.-P. 845-852:

137. Tan K.S. Effect of ferulic and p-coumaric acid on Oryza coleotile growth and mechanical properties of cell wall /K.S. Tan, T. Horoson, Y. Masuda // Ibid. -1992b.-V. 140.-P. 460-465.

138. Tan K.S. Involvement of cell wall-bound diferulic acid in light-induced decrease in growth rate and cell wall extensibility of Oriza coleoptiles / K.S. Tan, T. Horoson, Y. Masuda // Plant Cell Physiol. 1992a. - V. 33. - P. 103108.

139. Terashima N. Factors affecting the formation of condensed structure in lignin / N. Terashima, Y. Seguchi // Proceedings of the 4 the International Symposium on Wood and Pulping Chemistry. Paris, 1987. - V. 2. - P. 1-4.

140. Terashima N. Heterogeneity in formation of lignin. VIII. An autoradiographic study on the formation of guaicyl and syringyl lignin in Magnolia Kobus DC / N. Terashima, K. Fukushima, K. Takabe // Holzforschung. 1986. V. 40. -Suppl. 101-105.

141. Terashima N. Heterogeneity in formation of lignin. X. Visualization of lignification process in differentiation xylem of pine by microradiography / N. Terashima, K. Fukushima, Y. Sano // Holzforschung. 1988. V. 42. - P. 347350.

142. Terashima N. Heterogeneity in formation of lignin. XI: An autoradiographic study of the heterogeneous formation and structure of pine lignin. / N. Terashima, K. Fukushima // Wood Sci. Technol. 1988 - V. 22. - P. 259-270.

143. Teutonico R.A. Activity and accumulation of cell division-promoting phenolics in tobacco tissue cultures / R.A. Teutonico, M.W. Dudley, J.D. Orr, D.G. Lynn, A.N. Binns // Plant Physiol. 1991. - V. 97. - P. 288-297.

144. Tronchet M. Cinnamyl alcohol dehydrogenases C and D, key enzymes in lignin biosynthesis, play an essential role in disease resistance in Arabidopsis / M. Tronchet, C. Balague, T. Kroj, L. Jouanin, D. Roby // Mol Plant Pathol. -2010.-V.ll.-P. 83-92.

145. Tsutsumi Y. Lignin biosynthesis in woody angiosperms tissues I. Lignification and peroxidase activity stimulated in water-stressed Populus callus cultures / Y. Tsutsumi, K. Sakai // Mokuzai Gakkaishi. 1993. - V. 39. -P. 214-220.

146. Vanholme R. Lignin Biosynthesis and Structure / R. Vanholme, B. Demedts, K. Morrel, J. Ralph, W. Boerjan // Plant Physiology. 2010. - V. 153. - P. 895-905.

147. Venverloo C.J. The lignin of Populus nigra L. A comparative study of the lignified structures in tissue cultures and the tissue of the trees / CJ. Venverloo // Acta Bot. Neerl. 1969. - V. 18. - P: 241-314.

148. Waldron K.W. Ferulic acid Dehydrodimers in the Cell Walls of Beta vulgaris and their Possible Role in Texture / K.W. Waldron, A. Ng, M.L. Parker, A.J. Parr // J. Sci. Food Agric. 1997. - V. 74. - P. 221-228.

149. Wallace G. Phenolic compounds of the plant cell wall / G. Wallace, S.C. Fry // Int. Rev. Cytol. 1994. - V. 151. - P. 229-267.

150. Wardrop A.B. Morphological factors relating to the penetration of liquids into wood / A.B. Wardrop, G.W. Davies // Holzforscung. 1961. - V. 15. - P. 129141.

151. Wardrop A.B. The structure and formation of the cell wall in xylem / A.B. Wardrop // The Formation of Wood in Forest Trees. N.Y:. Academic Press, 1964.-P. 87-134.

152. Wardrop A.B. Process of lignification in woody plants / A.B. Wardrop, D.E. Bland // In: Proc. Intern. Congr. Biochem. IV-th. Vienna, 1958. - P. 2-25.

153. Wardrop A.B. Process of lignification in woody plants / Wardrop A.B., Bland D.E. // In 'Proceedings of the Fourth International Congress of Biochemistry. -Pergamon, London, 1959. P. 92-116.

154. Washer J. Differetioation of Pinus radiata callus culture: the effect of nutrients / J. Washer, K.J. Rielly, J.R. Barnett // New Zealand Journal Forest Science. -1977.-V. 7.-P. 321-328.

155. Weng J.K. Independent origins of syringyl lignin in vascular plants / J.K. Weng, X. Li, J. Stout, C. Chappie // Proc Natl Acad Sci USA. 2008a. - V. 105.-P. 7887-7892.

156. Wetmore R.H. Experimental induction of vascular tissues in callus of angiosperms / R.H. Wetmore, J.P. Rier // American Journal of Botany. 1963. -V. 50.-P. 418-430.

157. Wetmore R.H. On differentiation xylem / R.H. Wetmore, S. Sorokin // Journal of Arnord Arboretum. 1955. - V. 36. - P. 305-317.

158. Wheeler E.J. Tracheid length and; diameter variation in the bole of loblolly pine / E.J. Wheeler, B.J. Zobel, D.L. Weeks // TAPPI. 1966. - V. 49, N. 11. -PI 484-490.

159. Whetten R. Lignin biosynthesis / R. Whetten, R. Sederoff// The Plant Cell. -1995.-V. 7.-P. 1001-1013.

160. Wilson B.F. Differentiation of cambial derivatives. Proposed terminology / B.F. Wilson, T.J. Wodzicki, P.R. Zahner // Ibid. 1966. - V. 12, N 14. - P. 438- 440.

161. Wodzicki T.J. Mechanism of xylem differentiation in Pinus silvestris L. / T.J. Wodzicki // J. Exp. Bot. 1971. - V. 22, N 72. - P 671 - 640.

162. Wodzicki T.J. Organization and breakdown of the protoplast during maturation of pine tracheid / T.J. Wodzicki, C.L. Brawn // Amer. J. Bot. 1973. -V. 60,N7.-P. 631 -640.

163. Zahner R. Earlywood-latewood features of red pine grown under simulated drought and irrigation / R. Zahner, J.E. Lotan, W.D. Baughman // Forest Sci. 1964.-V. 10, N3.-P. 361 -370.

164. Zahner R. Internal Moisture Stress and Wood Formation in Conifers / R. Zahner // For. Prod. J. 1963. - V. 13. - P. 240-247.

165. Zarra I. The cell wall stiffening mechanism in Pinus pinaster Aiton: regulation by apoplastic levels of ascorbate and hydrogen peroxide / I. Zarra, M. Sagchez, E. Quejieiro, M.J. Pena, G. Revilla // J. Sci. Food Agrie. 1999. -V. 79.-P. 416-420.

Информация о работе

Железниченко, Татьяна Витальевна
кандидата биологических наук
Красноярск, 2011
ВАК 03.02.01

Диссертация

Сравнительное изучение процесса лигнификации древесины сосны обыкновенной in vivo и in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы