Получение и биологические свойства бактериоциноподобных веществ, продуцируемых Bacillus circulans

Калмантаев, Тимур Ахмерович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение и биологические свойства бактериоциноподобных веществ, продуцируемых Bacillus circulans
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Получение и биологические свойства бактериоциноподобных веществ, продуцируемых Bacillus circulans"

На правах рукописи

Калмантаев Тимур Ахмеровнч

ПОЛУЧЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОЦИПОПОДОБИЫХ ВЕЩЕСТВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ BACILLUS CIRCÜLANS

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехиологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАЙ 2G12

0боленск-2012

005016595

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научные руководители:

д-р техн. наук, ст. научн. сотр. Похиленко В и шор Данилович; канд. биол. наук, ст. научн. сотр. Перелыгин Владимир Владимирович

Официальные оппоненты:

Герасимов Владимир Николаевич, д-р биол. наук, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ, Оболенск, зав. лабораторией электронной микроскопии

Самойленко Владимир Александрович, кандидат биологических наук, ФБУН «Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина» РАН, Пущино, руководитель сектора биотехнологических процессов

Ведущая организация:

ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора РФ

Защита состоится «15» мая 2012 г., в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.350.002.01Д при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора РФ по адресу: 142279, Московская обл., п. Оболенск, ФБУНГНЦПМБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнад зора РФ

Автореферат разослан " апреля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета ,

кандидат биологических наук '¿Я*"*-—- фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

За последние десятилетия в клиниках мира было выделено множество антибио-тико-резистентных микроорганизмов, которые создают проблемы в лечении ряда заболеваний инфекционной этиологии. Так, в 2011 году в Германии банальная кишечная инфекция, вызванная устойчивым к антибиотикам геморрагическим штаммом Eco/i Q104.H4, унесла жизни более 50 человек, а несколько сотен человек остались инвалидами. В этой связи поиск новых средств антибактериального действия с меньшим, чем у антибиотиков, уровнем развития к ним микробной устойчивости, имеет как научное, так и практическое значение. В качестве таких средств биологического происхождения больший интерес представляют бактериоцины грамположительных бактерий, которые по своей природе являются низкомолекулярными пептидами и, по мнению большинства исследователей, не токсичны; и микроорганизмы к ним, как правило, не привыкают. Известны примеры практического использования наиболее известных бактериоцинов лактобактерий - низина и педиоцина - в качестве биоконсервантов пищевых продуктов и кормов. Вместе с тем, к бактериоцинам лактобактерий чувствительны только филогенетически родственные виды микроорганизмов, и только в отдельных случаях - грамотрицательные бактерии. Поэтому выделение новых бактериоцинов, способных более эффективно ингибировать развитие возбудителей острых кишечных инфекций, а также микроорганизмов, вызывающих порчу пищевых продуктов, является актуальной задачей современной науки и ее прикладных направлений.

Перспективными источниками антимикробных соединений пептидной природы считаются некоторые виды аэробных спорообразующих бацилл. Представители этих видов являются продуцентами полимиксиновой группы антибиотиков - бацитрацина, бути-розина, грамицидина С, полимиксина и др. Названные антибиотики востребованы до настоящего времени благодаря своей высокой эффективности против грамотрицательных бактерий, однако их применение ограничено в связи с различными побочными эффектами на организм человека. А не так давно было обнаружено, что некоторые штаммы Paenibacillus polymyxa и Bacillus circulons способны продуцировать бактериоцины и бак-териоциноподобные соединения (БПС) пептидной природы, обладающие антимикробным действием [Puiri et al., 1998; Svetoch, Stern et al., 2005; Stern, Svetoch et al., 2006; He et al, 2007]. По своему строению и спектру антимикробного действия эти соединения, как показано [Abriouel et al., 2011], близки к бактериоцинам классов I и IIa лактобактерий по принятой классификации [Klaenhammer, 1998], но дополнительно действуют и на грамотрицательные микроорганизмы.

Наибольший интерес представляет вид В. circulons, поскольку в 2001 году у штамма NRRL В-30644 (депонирован в музее ARS USA) впервые был выявлен антимикробный пептид (бактериоцин 1580), который ингибировал сальмонеллы и кампилобактерии. Представители этого вида практически безвредны, широко используются в биоиндустрии в качестве продуцентов ферментов, сурфактантов, полисахаридов, препаратов для мацерации кормов, бактериальных удобрений. Было высказано предположение о том, что они могут оказаться источниками новых бактериоцинов. Нами были выделены из окружающей среды и депонированы в коллекции микроорганизмов «ГКПМ - Оболенск» новые

бактериоциногенные штаммы В. circulons с широким спектром антимикробного действия. Потребность медицины, ветеринарии и пищевой промышленности в новых более эффективных средствах сдерживания вредных микроорганизмов явилась основанием для более глубокого изучения антимикробных веществ, продуцируемых штаммами В. circulans и для разработки лабораторной технологии их получения.

Цель исследования

Выбрать наиболее антагонистически активные и продуктивные штаммы Bacillus circulans, разработать лабораторную технологию получения бактериоциноподобных соединений, изучить их биологические и физико-химические свойства, определить возможные сферы применения.

Основные задачи исследования

1. Найти и выбрать по результатам сравнительных исследований антагонистически активные штаммы В. circulans с практически значимыми выходами по действующему началу бактериоциноподобных соединений.

2. Определить компонентный состав питательных сред и параметры культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающих существенный выход бактериоциноподобных соединений.

3. Найти и отработать способ эффективного извлечения бактериоциноподобных соединений из культуральной жидкости продуцентов, способ сравнительной оценки антимикробной активности.

4. Получить на основе отобранного штамма В. circulans и разработанного способа выделения экспериментальные образцы баюериоциноподобного соединения для изучения его основных свойств.

5. Определить с использованием представительного набора индикаторных штаммов различных видов неположительных и грамотрицательных микроорганизмов качественные и количественные показатели антимикробной активности экспериментальных образцов бактериоциноподобного соединения штамма В. circulans СК 2ч.

6. Изучить с использованием методов электрофореза и жидкостной хроматографии физико-химические и биохимические свойства экспериментальных образцов бактериоциноподобных соединений В. circulans.

7. Исследовать in vivo антимикробное действие экспериментальных образцов бактериоциноподобных соединений в опытах на цыплятах и оценить степень безвредности для белых мышей.

8. Разработать экспериментальные образцы, содержащие бактериоциноподоб-ные соединения, и определить возможные области их практического применения.

Научная новизна работы

Выделены, идентифицированы и охарактеризованы новые антагонистически активные бактериоциногенные штаммы В. circulons, подавляющие рост различных видов грамположительных и грамотрицательных патогенных и условно патогенных бактерий, в том числе - штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

Выявлена зависимость синтеза бактериоциноподобного соединения (БПС) от природы источника азота, энергетической ценности питательной среды и параметров глубинного культивирования продуцента

Установлено, что временные параметры синтеза БПС В. circulons, спектр антимикробного действия, а также его молекулярная масса отличаются от других антимикробных соединений, продуцируемых данным микроорганизмом.

Обнаружено, что некоторые штаммы В. circulons продуцируют два бактериоцино-подобных соединения разных типов: (1) выделяющееся в культуральную жидкость и ин-гибирующее грамотрицательные микроорганизмы; и (2) накапливающееся на поверхности клеток и активное в большей степени против грамположительных бактерий.

Теоретическая ценность и практическая значимость работы

Создана коллекция антагонистически активных штаммов В. circulons, пригодных для использования в качестве источника новых бактериоцинов и бактериоциноподобных соединений.

Установлена зависимость синтеза бактерицидного вещества В. circulons от энергетической ценности и доступности компонентов питательной среды, что может быть вкладом в теорию и практику управляемого синтеза бактериоцинов на основе перспективных видов сапрофитных бактерий.

Разработан способ глубинного культивирования штаммов-продуцентов, обеспечивающий малозатратное выделение БПС из культуральной жидкости В. circulons, который может быть использован для обнаружения и получения в препаративных количествах новых биологически активных веществ антимикробного действия, в том числе и бактериоцинов, синтезируемых другими видами микроорганизмов.

Получен экспериментальный образец БПС, изучены его свойства, определен спектр областей возможного использования.

Разработаны «Методические рекомендации по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulons, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов» - учрежденческий уровень внедрения.

Разработан лабораторный регламент получения бактериоцина с обеззараживающими свойствами [JIP 78095326-100-2011] - федеральный уровень внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Новые штаммы В. circulons, которые являются продуцентами бактериоциноподобных веществ, подавляют рост и развитие широкого спектра бактериальных патогенов.

2. Выход и активность бактериоциноподобного соединения В. circulons зависят от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также параметров глубинного культивирования.

3. Бактериоциноподобное соединение штамма В. circulons Ск2ч представляет собой термостабильное, рН устойчивое, протеин-содержащее соединение с молекулярной массой около 6 кДа, ингибирующее рост ряда грамотрицательных и грамположительных патогенов бактериальной природы.

4. Бакгерициноподобное соединение штамма В. circulans Ск2ч может быть использовано в качестве добавки в корм цыплят - для контроля числа бактериальных патогенов в кишечнике, а также в составе полимерных пленок - для хранения продуктов, обеспечивающего снижение микробной контаминации.

Работа выполнена в отделе биологических технологий ФБУН ГНЦ ПМБ Роспот-ребнадзора в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации 2009 - 2013 годы» (Государственные контракты № 122-Д от 11.06.2009 г. и № 55-Д от 22.07.2011 г.).

Личный вклад соискателя

Автором лично выполнена вся экспериментальная работа по выбору штамма-продуцента, выделению и очистке БПС, изучению свойств экспериментального образца, а также интерпретация полученных данных. Автор внес значительный вклад в составление «Методических рекомендаций по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов», а также в разработку Лабораторного регламента на получение бактериоцина с обеззараживающими свойствами.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на: 1-ой Оболенской школе-конференции «Биологическая безопасность в современном мире» [Оболенск, 2009], И научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Биобезопасность в современном мире» [Оболенск, 2010], III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» [Оболенск, 2011].

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 публикациях, в том числе в 3 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 124 цитируемых работы, из которых 24 - отечественных и 100 - иностранных авторов. Материалы диссертации изложены на 112 страницах машинописного текста, иллюстрированы 11 рисунками и 16 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Для выполнения работы использовали идентифицированные антагонистически активные штаммы Bacillus circulans (С2/2, Ск2ч, 1580, КСП18, ППС2а), Paenibacillus polymyxa Р602 и Bacillus subtilis ПС50, выделенные из образцов почвы, корневой системы растений, растительных остатков и водного настоя стеблей злаков. Данные штаммы депонировали в качестве авторских штаммов в «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ. В качестве контрольных штаммов использовали штаммы Bacillus circulans Jordan 1890 (В-222, В-1969) и Bacillus subtilis (Ehrenberg 1835) В-436, полученные из Всероссийской коллек-

ции микроорганизмов (ИБФМ РАН, г. Пущино-на-Оке). В качестве индикаторных культур для оценки антагонистической активности исследуемых микроорганизмов использовали грамотрицательные (Escherichia coli Ml5, Salmonella enteritidis 237, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Pseudomonas aeruginosa 468, Acinetobacter Iwqffii 125, Shigella sonne /2, Klebsiella pneumoniae 114, Enterobacter cloacae 190, Haemophilus influence XAU1) и грамположительные (Listeria monocytogenes 766, Bacillus spp., Lactococcus spp., Staphylococcus aureus 46) бактерии, полученные из коллекции микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ.

Штаммы бацилл культивировали на чашках с питательным (Nutrient Agar М001, HiMedia, Индия; ГРМ-агар ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Россия), либо крахмальным агаром (Starch agar, Ref. 1-283, Scharlau, EC) при температуре 30 °C в течение двух суток. Для получения посевных материалов одиночные типовые колонии микроорганизмов суспендировали в изотоническом растворе хлористого натрия (рН 7,0-7,2). Клеточными суспензиями в количестве 1 % засевали качалочные (750 мл) колбы со 100 мл питательной среды. Инкубацию посевов осуществляли на качалке (28-30 °С, 130 об/мин). В качестве питательных сред использовали коммерческие (ГРМ-бульон, питательный бульон для листерий из ГНЦ ПМБ, Россия) и экспериментальные варианты на основе различных гид-ролизатов белка с добавлением различных углеводов, экстракта дрожжей и минеральных солей.

Микробиологические методы

Идентификация изолятов. После первичной оценки морфо-культуральных признаков, давших основание отнести выделенные изоляты к роду Bacillus, дальнейшую их видовую принадлежность определяли с помощью стандартизованной системы биохимических тестов API® 50 СН (BioMerieux, Франция) и программного обеспечения API 4.0. В случае спорной идентификации для уточнения вида бацилл привлекали дополнительные тесты, описанные в литературе [Logan, 1984].

Проверка на антагонистическую активность. Первичный скрининг антагонистически активных изолятов бацилл проводили методом нанесения образцов клеточной массы в виде агаровых блоков или пятен (spot-test) на поверхность свежих газонов индикаторных штаммов. Уровень активности выделенных образцов бактерицидных веществ выражали в арбитражных единицах (АЕ/мл) путем нанесения спотов из серии двукратных разведений (по 10 мкл) на свежие газоны тест-культур. За одну АЕ принимали величину, обратную степени разведения образца, при которой отчетливо определялась минимальная зона ингибирования.

Определение молекулярной массы бактерицидного вещества проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). После окраски и отмывки гель помещали в стерильные чашки Петри и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма (2 мл взвеси клеток смешивали с 10-15 мл расплавленного и охлажденного до 45 °С питательного агара М001 HiMedia). После инкубации чашек в термостате (37 °С) в течение 1820 ч отмечали наличие и расположение зоны подавления роста тест-культуры на агаре над

полосой электрофореграммы, содержащей активный пептид. Сравнение с маркерами позволяло определить молекулярную массу активного пептида.

Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) в отношении тест-культур проводили методом двукратных серийных разведений препарата (от 128 до 0,06 мг/л) в 1 мл жидкой питательной среды, соответствующей по составу их потребностям. Результаты учитывали после инкубации при 37 °С, отмечая изменение оптической плотности сред по сравнению с контролем.

Выбор среды культивирования осуществляли, используя в качестве основы питательную среду следующего состава (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0; калия фосфат 2-х замещенный, 3-х водный - 3,0; натрия хлорид - 1,0; калия хлорид - 1,0 и магния сульфат -0,005. На первом этапе исследований к основе питательной среды добавляли по отдельности (0,3 - 0,5 %) различные источники аминного азота - виннокислый аммоний, сульфат аммония, хлористый и щавелевокислый аммоний, а также гидролизаты казеина (солянокислый - СГК), рыбной муки (панкреатический - ПГРМ) и глутамат натрия (pH сред составляла 7,3 - 7,5 ед.). Во все варианты сред добавляли 0,5 % глюкозы. В качестве контроля использовали коммерческий ГРМ-бульон (Оболенск, Россия).

На втором этапе исследований к питательной основе с выбранным по результатам первого этапа источником азота дополнительно вводили кроме глюкозы и другие источники углерода - различные moho-, ди-, три-, олиго- и полисахариды.

Биотехнологические методы

Посевной материал готовили в колбах на термостатированных качалках, культивирование микроорганизмов проводили в ферментерах, разделение культуральной жидкости (КЖ) на клеточную массу и супернатант осуществляли на центрифугах или фильтрационных аппаратах. В работе использовали термостаты ТС-80М (Россия), качалки NBS (New Brunswick Scientific, США), ферментеры АКА-210, ЗУ (Россия) или Bioflo 110 NBS (США). Для стерилизации питательных сред, растворов использовали установку стерилизующей фильтрации АСФ-011 и автоклав ВК-75 (Россия).

При выборе способа выделения из КЖ и частичной очистки бактериоциноподоб-ных соединений использовали методы солевой преципитации, вакуумного выпаривания, сорбции на твердых носителях, фазовой сепарации органическими растворителями, а также методы ультрафильтрации. Для разделения КЖ на клеточную массу и бесклеточный супернатант использовали центрифугу J2-21 Beckmann (Германия), фильтрационную установку на полых волокнах (Россия) с отсечением по молекулярному весу в 100; 15; и 5 кДа. Концентрирование целевых продуктов проводили на вакуум-выпарной установке Laboretta 4000 Heindolh (Германия). Для обезвоживания биоматериалов применяли лио-филизатор Virtis BT-4k (США) и анализатор влажности MF-50 (Moisture Analyzer, Япония).

Биохимические методы

Постановка трицин-ДСН-ПААГ-электрофореза. Пробы для исследования подвергали предварительной очистке, используя патроны Bond Elut® С18 (Analytichem Intern.,

Habor City, CA, США), руководствуясь инструкцией производителя. Концентрацию протеинов в образцах определяли по методу Бредфорд [Bradford, 1976] на спектрофотометре Spekol 11 (Analytik Jena AG, Германия) при длине волны 595 нм.

Концентрация разделяющего полиакриламидного геля составляла 16,5 %, а концентрирующего - 10 %. В лунки предварительно залитого геля наносили по 4 мкл исследуемых образцов и маркеры. В качестве молекулярных меток использовали маркеры фирм Spectra™ Multicolor Low Range Protein Ladder (1,7 - 40 кДа, Fermentas, EC), PageRuler™ Unstained Low Range Protein Ladder (3,4-100 кДа, Fermentas, EC), а также очищенные пептиды - инсулин (5,7 кДа) и лизоцим (14,5 кДа). Электрофорез проводили в катодном (100 мМ Трис-НСЦЮО мМ, 0,1 % SDS, pH 8,25) и анодном (200 мМ Трис-HCL, pH 8,9) буферах в камере для вертикального электрофореза Hoefer (США) по методу [Shagger, 1987] для низкомолекулярных белков и пептидов. Разделение проводили при U = 125 В и I = 25 мА в течение 4 ч.

Фиксацию низкомолекулярных пептидов проводили в 5 % растворе глутарового альдегида в течение 30 мин с последующей промывкой в дистиллированной воде. Окраску пептида проводили в растворе, содержащем 25 % этанола, 10 % уксусной кислоты, 0,001 % Кумасси G250 и 500 мл воды. Для определения молекулярной массы пептидной полосы, ответственной за антимикробную активность, гель отмывали в 10 % растворе уксусной кислоты при температуре 80 °С в течение 2 ч, затем еще 30 мин в дистиллированной воде и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма, как было описано выше.

Компонентный состав образцов БПС изучали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на микроколоночном жидкостном хроматографе Мили-хром-6 (ЗАО «Научприбор», Россия) с использованием обращенно-фазовой аналитической колонки (КАХ-6-80-4), заполненной сорбентом Сепарон-С18. Образцы БПС предварительно готовили, используя патроны Bond Elut® С18. Элюцию проб с аналитической колонки проводили в градиенте концентрации водного раствора ацетонитрила от 0 до 30 % с добавлением 0,1 % трифторуксусной кислоты с регистрацией оптической плотности при двух длинах волн: 220 и 280 нм. Полученные данные обрабатывали в программе UniChrom® указанного хроматографа. Выявление «биоактивных» пиков проводили нанесением элюатов на свежие газоны тестовых культур. Для этого пробы элюатов высушивали при 105 °С и отдельно разводили в 50 мкл дистиллированной воды.

В отдельных случаях для идентификации биоактивных фракций в образцах БПС использовали метод тонкослойной хроматографии на алюминиевых силикагельных пластинах Silufol UV254 (Чехия) в системе: бутанол/ледяная уксусная кислота/вода.

Методы in vivo. Полученные образцы антимикробных веществ исследовали в опытах на цыплятах и белых мышах. Цыплятам в течение 3 дней давали стандартный коммерческий корм (контроль) и такой же сухой корм, но предварительно насыщенный бесклеточным супернатантом В. circulons Ск2ч с активностью 100 АЕ/мл в отношении Е. coli (опытная группа). В опытах на мышах кроме варианта кормления стандартным сухим кормом, содержащим концентрат БПС, изучили вариант его введения внутрибрюшинно

(до 100 мг на особь), используя стерильные растворы. В ходе 7 суточного эксперимента, наблюдали за активностью животных, отбирали фекальную массу для анализа микрофлоры, а в конце опыта проводили их вскрытие и визуальную оценку состояния внутренних органов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 2 посвящена сравнительной характеристике новых штаммов антагонистически активных бацилл, вопросам идентификации, а также обоснованию выбора некоторых из них в качестве продуцентов бактерицидных веществ. При отборе изолятов из окружающей среды обращали внимание на их активность в отношении грамположительных (Гр+) и грамотрицательных (Гр—) бактерий, в большей части на примере Listeria monocytogenes и Escherichia coli, соответственно. В таблице 1 приведены краткие данные о штаммах бацилл, использованных в работе на первоначальном этапе исследований. Пять из них с наиболее выраженной антагонистической активностью и по совокупности морфо-культуральных, биохимических свойств идентифицированые как В. circulons, были депонированы в «ГКПМ - Оболенск».

Таблица 1 - Основные сведения о штаммах бацилл, используемых в работе

Рабочее обозначение Источник выделения или получения Музейные параметры штамма Антагонистическая активное™ в отношении:

Название № в коллекции

С2/2 Настой соломы В. circulons С2/2 5223 ГНЦПМБ Гр (+) и Гр(-) бактерий

Ск22 Настой соломы B.circulans С22-4 6516 ГНЦПМБ То же

1К Корневая система овощной культуры В. circulons КСП-18 6853 ГНЦПМБ То же

2а Растительные остатки B.circulans ППС2а 6854 ГНЦПМБ То же

В-50 Воздушная среда B.subtilis ПС-50° 6855 ГНЦПМБ Гр (+) бактерий

Ск2ч Настой соломы B.circulans Ск2ч 6861 ГНЦПМБ Гр (+) и Гр(-) бактерий

1580 Музей ГНЦПМБ B.circulans 1580 1580 ГНЦПМБ В основном Гр(-) бактерий

Рр602 Музей ГНЦПМБ P.poJymyxa 602 602 ГНЦПМБ Гр (-) бактерий

1969 ВКМ, ИБФМ РАН B.circulans Jordan 1890 var.halophilus В-1969 ВКМ В основном Гр(-) бактерий

222 ВКМ, ИБФМ РАН B.circulans Jordan 1890 В-222 ВКМ Гр (+) бактерий

436 ВКМ, ИБФМ РАН B.subtilis Cohn 1872 В-436 ВКМ Гр (+) бактерий

На рис. 1 представлены фотоизображения колоний, клеток и спор, типичных для отобранных штаммов В. с1гси1апя. Характерным признаком молодых колоний являются выросты, часто направленные циркулярно, а также подвижные палочковидные клетки. Споры обычно образуются на 3-4 сутки, имеют терминальное расположение и шире материнской клетки.

Суточные

на ГРМ-агаре

Колонии

На ГРМ-(а) н соевом агаре (б)

Клетки - ! \ ^

Суточные m КЖ

Споры V •

3 суточные из КЖ

Рисунок 1 - Типичная морфология колоний, вегетативных клеток и спор штаммов В. circulons

В опытах по отработке условий получения бактериоциноподобных веществ были использованы в основном два штамма - В. circulons С2/2 и В.circulons Ск2ч, которые давали наибольшие по диаметру зоны ингибирования (до 20 мм) Гр(-) бактерий. Другие, указанные в таблице 1 штаммы, использовали для проведения сравнительных исследований. Так, В. circulons 1580 является продуцентом бактериоцина, P. polymyxa 602 не только бактериоцина, но и, возможно, антибиотика полимиксина, тогда как штаммы В. circulons Jordan 1890 и B.subtilis Cohn 1872 не описаны как бактериоциногенные.

В главе 3 представлены результаты по экспериментальному обоснованию выбора компонентного состава питательных сред, условий глубинного культивирования В. circulons, способов выделения бактериоциноподобной субстанции и оценки антагонистической активности образцов. В табл. 2 представлены данные о зависимости антагонистической активности супернатантов В. circulons Ск2ч от состава среды культивирования.

Таблица 2 - Зависимость антимикробной активности супернатантов В. circulons Ск2ч от источника азота и концентрации глюкозы в жидкой питательной среде

Антагонистическая активность (АЕ/мл) проб* при одном источнике энергии (глюкоза -_0,5 %) и различных источниках азота (0,5%)__

Сульфат аммония

Тартрат аммония

Глутамат натрия

Гидроли-зат казеина

Щавелевокислый аммоний

Хлористый Гидролизат аммоний рыбный

60± 20

40±6

60± 20

0**

20±6

Антагонистическая активность (АЕ/мл) проб при одном источнике азота (сульфат аммо-_ния - 0,5%) и различных источниках энергии

Галактоза, 0,5%

Мальтоза, 0,5%

Манноза, 0,5%

Лактоза, 0,5%

Сахароза. 0,5%

Глицерин, 0,1%

Глюкоза, 0,5%

Глюкоза, 1,0%

30±10

15±5

60± 20

40±10

30±10

60± 20

30±10

*активность рассчитана для супернатантов, сконцентрированных в 10 раз, 0** ■ вие зоны ингибирования в данных условиях._

отсутст-

Синтез бактериоциноподобных соединений четко фиксировали в случае использования в питательной среде азота минерального происхождения и практически отсутствовал при культивировании в среде на основе азота органического происхождения. Определенное влияние на продукцию БПС оказывали также тип и концентрация источника энергии в составе питательной среды - концентрация глюкозы не должна превышать 1,0 %.

Удовлетворительную воспроизводимость результатов по уровню продукции БПС достигали при температуре 28-30 °С, вращении качалки 120-130 об/мин и культивировании в течение не более 50 ч. Полноценность состава питательных сред и выбранный режим культивирования позволяли поддерживать вегетативный рост клетки В. с1гси1ап$ без перехода к стадии споруляции.

Таким образом, уже на стадии предварительных исследований установили существенную зависимость выхода БПС от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также условий глубинного культивирования.

При получении бактериоцинов их выход зависит не только от штамма продуцента, условий его культивирования, но и способа выделения. Молекулы бактериоцинов и подобные им пептиды, как известно, обладают амфифильными свойствами и склонностью к агрегации, как между собой, так и с бактериальными клетками, их дебрисом, что приводит к снижению удельной активности [Рпщйоге е1: а!., 2007]. В этой связи провели эксперименты с целью определения оптимальных путей извлечения БПС из супернатантов. В табл. 3 представлены результаты сравнительных исследований по эффективности выделения бактериоциноподобных соединений при использовании различных способов обработки супернатанта штамма В. с1гси1 аш Ск2ч.

Таблица 3 - Сравнение выхода бактериоциноподобных соединений в зависимости от способа обработки супернатанта КЖ штамма В. с1гси1ат Ск2ч

Способ выделения и действующее начало Арбитражные единицы активности в 100 мл супернатанта*

ЕАЕ** Выход, %

Солевая преципитация Сульфат аммония, 60% 48000±17000 48

Сорбция на твердых носителях Уголь активированный 54000 ± 8000 54

Силикагель 100/250 72000 ± 12000 72

Окись алюминия 16000 ±4000 16

Аэросил А-300 43000 ± 9000 43

Разделение в двухфазной системе Хлороформ 93000±15000 93

Дихлорметан 95000± 11000 95

Толуол 75000 ±6000 75

* исходный супернатант имел активность 100 АЕ/мл, общее количество АЕ в 100 мл принято за 100%, **представлены средние показатели суммарных значений активности из 3 опытов.

Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что при использовании двухфазной системы выделения с хлороформом или дихлорметаном выход бактериоциноподобных соединений из супернатанта КЖ штамма В. Ыгси1ат Ск2ч составляет 93-95%.

Таким образом, подобранные условия культивирования штамма-продуцента и режимы получения антимикробных соединений из супернатантов КЖ дали основание для разработки лабораторной технологии получения БПС, продуцируемых В. сггсгйат.

В главе 4 представлены результаты разработки лабораторной технологии получения препарата БПС на основе штамма В. с1гси1ат Ск2ч на ферментационных аппаратах

объемом Юл, с использованием аппаратов мембранного и гравитационного разделения КЖ, методов выделения и грубой очистки бактериоциноподобных соединений с помощью органического растворителя, а также приготовления готовой формы препарата методом лиофильного высушивания.

Принципиальная схема получения экспериментальных образцов БПС представлена на рис. 2.

Питательные среды (ПС)

Жщкпя Шогивя

Размножение штамма на плотной и в жидкой средах

колбы. 28 - 30° С. 24-36 ч

[| Жидкая ПС |] [|; П<№ИЮ»М»тер1№< ¿¡гфер^еперТТ] )

Ирепаративиые образцы

Определение и нормализация

Рисунок 2 - Технологическая схема получения препаративных образцов бактерицидного вещества на основе B.circulans Ск2ч Ключевой стадией технологии является получение КЖ вегетативных клеток B.circulans в условиях, которые обеспечивают продукцию БПС на уровне как минимум 100 АЕ/мл. Типовую динамику роста клеток в ферментере и продукции бактерицидных веществ иллюстрируют данные представленные на рисунке 3. Как показали опыты с выращиванием штамма - продуцента БПС в среде выбранного состава при наблюдении в течение 5 суток, рост клеток был наиболее интенсивен в срок до 48 - 50 часов, после чего намечается тенденция падения оптической плотности и, соответственно, снижения числа клеток, что свидетельствует о переходе клеток в состояние спор. Известно, что у некоторых бацилл максимальный уровень синтеза антибиотиков, например, бутирозина, совпадает с активной стадией процесса спорообразования [Schaeffer, 1969, Nam and Ryu,1985].

Обычно процесс спорообразования начинается на 3-5 сутки культивирования штаммов-продуцентов. Как следует из результатов наших опытов, приведенных на рисунке 3, синтез БПС штаммом B.circulans Ск2ч начинается уже на стадии логарифмического

роста (16-20 ч) и достигает максимума к 40 - 50 ч, когда еще в КЖ отсутствуют признаки спорообразования. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что время культивирования штамма В. circulons Ск2ч, достаточное для накопления БПС, составляет 48-50 часов.

12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 Время культивирования, ч

-рН культуралызой жидки сти

-k>g КОЕ/мл

- Антагонистическая Активность,х100 АЕЛсл

"Оптическая Плопаостъ

Рисунок 3 - Динамика роста клеток, изменения рН, ОП и накопления БПС при культивировании В. circulans Ск2ч в ферментере объемом до ] 0 л.

Обозначения: рН - показатель кислотности среды, ед. рН; ОП — оптическая плотность при 600 нм; КОЕ - колониеобразующие единицы, log/ml; АА - антагонистическая активность, измеренная по отношению к тест-штамму E.coli, x lOO АЕ/мл.

Стадия концентрирования БПС, находящегося в КЖ в достаточно разбавленном состоянии (мкг/л), имеет решающее значение для получения его в практически значимых количествах. В процессе концентрирования супернатанта необходимо уменьшить количество примесных соединений, солей и воды, при этом повысить концентрацию низкомолекулярного бактериоциноподобного соединения. Для решения этой задачи использовали принципы мембранного разделения КЖ с применением ультрафильтрационных полово-локонных мембран с отсечением, обеспечивающим отделение клеток и низкомолекулярного пептида (100 и 5 кДа, соответственно). Такой подход существенно повышает производительность процесса переработки бактериоцинсодержащего супернатанта и, по сравнению с другими методами, уменьшает временные и материальные затраты, связанные с последующей обработкой концентратов БПС дорогостоящими реагентами (растворителями, сорбентами и др.).

Выделение БПС из водных растворов (супернатантов/фильтратов) проводится различными приемами - от часто используемой солевой преципитации (сульфат аммония) до одно- или двухэтапных методов хроматографического разделения на колонках со смолами ионного и гидрофобного взаимодействия [Pingitore et al., 2007]. Однако эти методы в одних случаях не избирательны, а в других - являются высокозатратными. Наши исследо-

вания показали, что более предпочтительным является метод фазовой сепарации БПС с использованием безводного гидрофобного растворителя. Теоретической предпосылкой для выбора указанного метода явилось свойство аффинности бактериоцинов к гидрофобным растворителям, что предполагает возможность их сбора на границе раздела фаз (вода/растворитель). Практическое доказательство возможности использования такого способа для выделения бактериоцинов получили сотрудники Университета штата Огайо [Burianek and Yousef, 2000], которые использовали в качестве растворителя хлороформ. Поскольку это соединение обладает относительно высокой токсичностью и сильным наркотическим действием мы модифицировали этот метод, заменив хлороформ менее токсичным растворителем - дихлорметаном (ДХМ). Кроме того, ДХМ отличался от хлороформа меньшей плотностью (1,32 против 1,48 г/см3) и температурой кипения (40 °С против 61 °С), что существенным образом облегчает его возгонку из водных растворов и дает возможность повторного использования.

Суть метода заключается в том, что бактериоцинсодержащая жидкость смешивали с эквивалентным объемом ДХМ и подвергали скоростному гомогенизированию для получения эмульсии. После центрифугирования в результате сепарации формируется верхняя фаза (водная), промежуточная фаза (интерфаза) и нижняя фаза - ДХМ. Данные типичного эксперимента по приготовлению БПС методом фазовой сепарации приведены в табл. 4. Из представленных данных следует, что обработка супернатанта ДХМ позволяет выделить из него до 94,6 % от активности целевой субстанции с одновременным снижением на 86,2 % массы сухих веществ.

Таблица 4 - Количественные показатели фракционирования супернатанта В.

circulons Ск2ч с использованием дихлорметана

Образцы Содержание сухих веществ, Активность против E.coli, АЕ*

мг % АЕ /мг Суммарная % АЕ

Супернатант 850 100,0 3,94 3349 100,0

Верхняя фаза 740 86,2 0,20 148 4,4

Промежуточная фаза 108 12,7 29,60 3200 94,6

Нижняя фаза 10 1,0 1,00 10 1,0

(*) АЕ, арбитражная единица - минимальное количество вещества, дающего эффект

Таким образом, результаты исследований по отработке элементов технологической схемы показали возможность получения препаративных образцов бактериоциноподобного соединения В. circulons в количестве, достаточном для всесторонней оценки их биологических и физико-химических свойств.

В главе 5 описаны результаты исследований основных биологических и физико-химических свойств образцов БПС штаммов В. circulons С2/2 и В. circulons Ск2ч.

Активность образцов БПС наблюдали в отношении штаммов эшерихий, сальмонелл, листерий, некоторых бацилл и вакцинного штамма сибиреязвенного микроба. В то же время при тестировании штаммов В. circulons С2/2 и В. circulons Ск2ч друг против

друга зон ингибирования не наблюдали, что свидетельствует об иммунности этих штаммов к собственным метаболитам.

Выполненные эксперименты показали, что при действии органических растворителей - ацетона, бутанола, метанола, хлороформа, дихлорметана, ацетонитрила, а также после высушивания при 105° С антимикробная активность образцов БПС полностью сохранялась, но частично терялась после автоклавирования при 121 °С (15 мин) в щелочной зоне (рН 10 - 11). Полная потеря активности происходила при нагревании сухих проб до 150° С. Лиофшгазированные препараты БПС сохраняют активность при хранении в течение 1 года (срок наблюдения) в условиях комнатной температуры (24 ± 3 °С) и полностью восстанавливаются при регидратации. Отметили также, что высушивание при 105 °С приводит к частичному снижению растворимости препарата БПС, которая, однако, восстанавливается при суспендировании порошка в щелочной среде (рН 10) с последующим доведением рН суспензии до физиологических значений (рН 6 - 7).

В отличие от бактериоцинов лактобактерий класса 1 и 2а образцы БПС оказались устойчивы к некоторым протеазным и гидролазным ферментам - химотрипсину (10 мг/мл), папаину (30 мг/мл), протеиназе К (10 мг/мл), лизоциму (10 мг/мл). Частичная инактивация БПС происходила лишь под воздействием панкреатического комплекса ферментов (30 мг/мл). Из данных литературы известно [Takeuchi Y, et al., 1979], что устойчивость такого рода соединений микробного происхождения может быть связана с наличием в их структуре у- диаминобутириковых кислот, которые способствуют формированию циклических молекул, устойчивых к внешним воздействиям.

Исследование компонентного состава БПС

На рис. 5 приведены данные по хроматографическому анализу грубо очищенного препаративного образца БПС В. circulons Ск2ч с использованием обращено-фазовой колонки.

е.о.п. -

vj\ й I \ \ л

: V ~ 1 F i 'Л 1 \ i \

-0,05- .....280..ПГП ^.....:.......j

п f i ll Q мин

Рисунок 5 - Типовой профиль элюирования БПС В. circulons Ск2ч на колонке КАХ-6-80-4, заполненной сорбентом Сепарон-С18

Как показали результаты тестирования на культуре Е. coli «биоактивным» было только вещество пика, выходящего на 5-6 мин после начала элюирования. При этом данный пик регистрировали и при длине волны 280 нм (ароматические аминокислоты), и при длине волны 220 нм (пептидная связь). Пики, регистрируемые при этих двух длинах волн, полностью совпадали по времени выхода.

Таким образом, установили, что экспериментальный препарат БПС состоит из нескольких компонентов с различным временем удержания, но только один из них, выделяющийся на 5-6 мин, обладает антагонистической активностью по отношению к культуре Е. coli.

Для оценки молекулярной массы компонентов БПС провели трицин-ДСН-ПААГ-электрофорез проб с использованием пептидных маркеров: лизоцима (14,3 кДа) и инсулина (5,7 кДа). Данные электрофоретического разделения образцов БПС, полученных из бесклеточных ферментатов В. circulons Ск2ч и В. circulons С2/2, приведены на рис. 6.

Образцы БПС штаммов В. circulons

Метки* Ск2ч С2/2

14,3 кДа pPW

5,7 кДа

1 2 1 2

(*) использовали лизоцпм и инсулин.

- линии меток. - линии БПС

Рисунок 6 - Оценка молекулярного веса антимикробных фракций штаммов В. circulons с помощью трицин-ДСН-ПААГ - электрофореза и заливки геля агаром с Е. coli М17

Как следует из представленных данных на рис. 6, БПС штамма В. circulons Ск2ч имеет молекулярную массу около 6 кДа, а БПС штамма С2/2 около 7 кДа. Эти образцы БПС показали одинаковую устойчивость к действию протеолитических ферментов, выдерживали нагревание при 105 °С, но теряли активность после автоклавирования при рН 10-11. Описанные свойства отличают БПС штаммов В. circulons Ск2ч и В. circulons С2/2 от бактериоцина, продуцируемого штаммом В. circulons 1580, который имел молекулярную массу 3,5 кДа и был чувствителен к протеазам [Svetoch, et al., 2005].

Таким образом, образцы БПС штаммов Ск2ч и С2/2 В. circulons по основным биологическим и физико-химическим свойствам практически не отличаются друг от друга. При этом, по молекулярному весу они значительно отличаются от антибиотиков, проду-

цируемых представителями этого же вида бацилл - полимиксина M (1157 Да), бутирозина (1050 Да) и циркудина (854 Да).

Исследование спектра и величины антимикробной активности. Образцы БПС штаммов Ск2ч и С2/2 В. circulons имели выраженную ингибирующую активность в отношении ряда грамотрицательных бактерий, в том числе обладающих резистентностью к антибиотикам. Так, если для Escherichia coli (штаммы М17, 3R, 0157:Н7, 4/10R) по методу «spot-test» размер зоны ингибирования составил - 15-17 мм, для Salmonella Enteritidis (штаммы 237, 92 riflOO, 204) - 11-12 мм, для Yersinia pseudotuberculosis 699 - 15 мм и Klebsiela pneumonia 964R - 13 мм, то для Listeria monocytogenes 776 и Staphylococcus aureus MR 218, всего 2-3 мм. Данные по оценке величины минимальных ингибирующих концентраций препаративного образца БПС В. circulons Ск2ч в отношении антибиотико-резистентных клинических изолятов микроорганизмов представлены в табл. 5.

Таблица 5 - Минимальные подавляющие концентрации (МПК) образца БПС штамма В. circulons Ск2ч в отношении антибиотикорезистентных клинических изолятов микроорганизмов

Тестируемый штамм Величина МПК

по протеину, *мкг/мл по растворимой субстанции, мг

Acinetobacter Iwoffii 125 0,425 0,390

Pseudomonas aeruginosa 468 6,800 6,250

Staphylococcus aureus 46 0,425 0,390

Klebsiella pneumoniae 114 0,200 0,195

Enterobacter cloacae 190 0,200 0,195

Candida albicans 1710 0,850 0,780

Salmonella enteritidis 237 0,200 0,195

Shigella sonne 1/2 0,200 0,195

Campylobacter jejuni 1,700 0,100

Haemophilus influence XAU1 1,700 0,100

(*) определяли по методу [Bradford, 1976]. Исходная концентрация протеина - 27,2 мкг/мл; растворимой части - 25 мг/мл.

Как следует из представленных данных, образцы препаратов БПС штаммов Ск2ч и С2/2 В. circulons, полученные по разработанной технологии, ингибируют рост ряда бактериальных патогенов, в том числе представителей родов Salmonella, Campylobacter и Escherichia, включая штаммы, резистентные к антибиотикам.

Глава 6 посвящена изучению возможностей практического применения антимикробных продуктов В. circulons в опытах на мелких животных и цыплятах с оценкой переносимости ими БПС, а также по защите пищевой продукции в составе полимерных покрытий. В опытах на мышах после 7 дней кормления сухим кормом, пропитанным БПС, не отмечали изменений в поведенческой активности животных и не наблюдали заметных изменений в составе аэробной микрофлоры кишечника. Сделали вывод о том, что препарат БПС, инкорпорированный в состав стандартного корма в количестве 100 мг на

1 гранулу (700 мг) из расчета на одну мышь, хорошо и без последствий переносится животными. В опытах по оценке токсичности на мышах при внутрибрюшинной инъекции стерильной суспензии, приготовленной на основе сухой субстанции БПС в концентрациях до 100 мг/мл, величина LD50 составила 5000 мг/кг, что соответствует категории мапоток-сичных препаратов.

В табл. 6 приведены результаты опыта по оценке лечебной эффективности сухого корма, приготовленного с добавлением бесклеточного супернатанта В. circulons Ск2ч, для экспериментальной группы бройлеров, которые естественным образом были инфицированы патогенным для человека возбудителем кампилобакгериоза - Campylobacter jejuni.

Таблица 6 - Лечебное действие корма, содержащего супернатант культуры В. circulons Ск2ч при трехдневном кормлении 35- суточной бройлерной птицы

Группа цыплят №№ кур Концентрация Campylobacter jejuni (log КОЕ/г) в слепом отростке кишечника

По особям Среднее

Контрольная: стандартный грану-лированныйо корм «ПК-6» 1 8,04 7,34±0,64

2 7,20

3 7,89

4 7,45

5 6,25

6 7,20

Опытная: корм «ПК-6», содержащий супернатант В. circulons * 31 3,78 3,85±0,28

32 3,73

33 4,34

34 3,64

35 3,79

Разница с контролем: 3,49

(*) получали смешиванием стандартного сухого корма ПК-6 с бесклеточным супернатантом 48 ч бульонной культуры В.агси1ап5 Ск2ч и последующим высушиванием корма конвективным методом

Из представленных в табл. 6 данных следует, что кормление цыплят кормом, содержащим продукты ферментации В. circulons Ск2ч, приводит к достоверно значимому уровню падения (на 3,5 log) концентрации кампилобактерий в кишечнике птицы.

Известны попытки использования бактериоцинов, в частности низина, в составе полимерных пленок для защиты мясных продуктов от микробной порчи и ослизнения, однако этот бактериоцин активен только против узкого спектра грамположительных бактерий. На основе поливинилового спирта и БПС штаммов В. circulons и P.polymyxa 602 изготовили защитные пленки и провели опыты для оценки возможности их нанесения на пищевые продукты в качестве биологического средства бактериальной деконтаминации. На примере покрытия мясных изделий (нарезок сосисок) полимерами, содержащие бес-

клеточные стерильные супернатанты бакгериоцинпродуцирующих бацилл, показана реальная возможность существенного снижения уровня их естественной контаминации.

Таким образом, результаты опытов с использованием бройлерных цыплят-кампилоносителей и скоропортящихся мясных изделий дают основание для практического применения БПС штаммов В. circulons при создании новых средств с обеззараживающими и деконтаминирующими свойствами.

ВЫВОДЫ

1. Из природных источников выделили, изучили и депонировали в Государственной коллекции микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск» пять новых штаммов В. circulons, которые являются источниками антимикробных соединений пептидной природы.

2. Изучили питательные потребности новых штаммов В. circulons, разработали условия и режимы приготовления КЖ, обеспечивающие уровень выхода антимикробных соединений, приемлемый для создания лабораторных технологий.

3. Разработали лабораторную технологию приготовления препаратов БПС штамма В. circulons, включающую стадии культивирования, концентрирования КЖ и получения препаратов БПС в количестве, достаточном для всесторонней оценки их биологических и физико-химических свойств.

4. БПС штамма В. circulons Ск2ч имеет, по данным трицин-ДСН-ПААГ-электрофореза, молекулярную массу около 6 кДа. Соединение устойчиво к действию про-теолитических ферментов, выдерживает нагревание при 121 °С в течение 15 мин, разрушается при автоклавировании в щелочных зонах рН (10 - 11), и по этим свойствам отличается как от ранее описанного бакгериоцина штамма В. circulons 1580, так и от антибиотиков группы полимиксинов.

5. Экспериментальные образцы препаратов БПС штамма В. circulons Ск2ч ингиби-руют рост ряда бактериальных грамотрицательных и грамположительных патогенов, в том числе представителей родов Salmonella, Campylobacter и Escherichia, включая их варианты, резистентные к антибиотикам.

6. Экспериментальные образцы БПС штамма Ск2ч безвредны для мышей и цыплят при пероральном способе введении в составе сухих кормов, а, по данным внутрибрюшин-ного введения белым мышам, относятся к группе слаботоксичных веществ (LD50 = 5000 мг/кг).

7. Результаты опытов с использованием бройлерных цыплят и вареных мясных продуктов показывают возможность использования БПС в составе лечебных кормов, защитных полимерных покрытий, а также при разработке обеззараживающих и деконтамини-рующих биологических средств нового поколения.

Список публикаций по теме диссертации

A) Статьи в рецензируемых журналах:

1. Похиленко В. Д., Перелыгин В.В., Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Храмов В.М. Культуральные особенности бацилл группы circulans-sublilis-polymyxa как продуцентов бактерицидных веществ широкого спектра действия. // В мире научных открытий. - 2010. - № 5 (11). - Часть 1. - С. 64-72.

2. Храмов В.М., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Поиск антагонистически активных энтерококков, получение и свойства синтезируемых ими бактерицидных веществ II В мире научных открытий. - 2010. - №5 (11). - Часть 4. - С. 41—46.

3. Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Перелыгин В.В., Похиленко В.Д. Получение и оценка эффективности антимикробных полимерных покрытий на основе бактерицидных веществ Bacillus circulans и Paenibacilluspolymyxa II Биомедицинский журнал «Medline.ru». - 2011. - Том 12(121).- Микробиология. - С. 1478-1486.

Б) Статьи в иных изданиях:

4. Калмантаев Т.А., Храмов В.М., Перелыгин В.В., Похиленко В.Д. Новые сферы применения некоторых антагонистически активных штаммов бацилл // Наука Красноярья. -2012. -№1. - С. 29-38.

B) Тезисы докладов:

5. Калмантаев Т.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Разработка способа получения антимикробных веществ Bacillus circulans'. влияние состава питательной среды и условий культивирования продуцента. //. Тезисы из материалов I школы - конференции молодых ученых и специалистов. - 2009. - С. 183-184.

6. Храмов В.М., Калмантаев Т.А.,Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Новый штамм Streptococcus faecium 3322 и бактериоцин Е-3322, обладающий анти-листериозной активностью. // Тезисы из материалов II школы - конференции молодых ученых и специалистов. - 2010. - С. 338-340.

7. Калмантаев Т.А., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Новые бакте-риоциноподобные вещества антагонистически активной группы бацилл. // Тезисы из материалов II школы-конференции молодых ученых и специалистов. - 2010. -С. 324-325.

8. Калмантаев Т.А., Храмов В.М., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Получение и исследование бактериоциноподобных субстанций из культуральной жидкости штамма продуцента Bacillus circulans Ск2ч. // Тезисы из материалов научно-практической школы - конференции молодых ученых и специалистов. - 2011. -С. 263-265.

9. Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Садикова Г.Т., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Антимикробные полимерные покрытия: пример использования бактерицидных веществ, продуцируемых группой Bacillus circulans. II Тезисы из материалов научно-практической школы- конференции молодых ученых и специалистов. - 2011. -С. 265-266.

Ю.Храмов В.М., Калмантаев Т.А., Чукина И.А., Похиленко В.Д., Перелыгин В.В. Оценка возможности использования концентратов бактериоцинов в качестве кормовой добавки // Журнал Гастроэнтерология Санкт-Петербурга, 2011. - № 4. Материалы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии (Санкт-Петербург, 24-25 ноября 2011 г.). - М40 - М41.

Выражаю искреннюю благодарность:

моим руководителям - д.т.н. Похиленко В.Д и к.б.н. Перелыгину В.В. за ценные консультации и оказанную помощь при выполнении диссертации;

профессору Светочу Э.А. за помощь в организации проведения экспериментов и ценные консультации;

сотрудникам отдела биологических технологий Садиковой Г.Т., Чукиной И.А., сотрудникам отдела молекулярной биологии к.м.н. Мицевичу Е.В., Мицевич И.П. за помощь и содействие в работе;

ФБУН ГНЦ ПМБ, в лице директора чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. Дятлова И.А., за предоставленную возможность провести необходимые эксперименты и выполнить данную работу.

Подписано в печать:

12.04.2012

Заказ № 7123 Тираж - 75 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калмантаев, Тимур Ахмерович, Оболенск

61 12-3/783

Министерство здравоохранения и социальна и развития Российской Федерации

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

КАЛМАНТАЕВ ТИМУР АХМЕРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИОЦИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ, ПРОДУЦИРУЕМЫХ

BACILLUS CIRCULANS

Специальность: 03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

На правах рукописи

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор технических наук В. Д. Похиленко, кандидат биологических наук В. В. Перелыгин

Оболенск - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ Стр

ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ................. 5

ВВЕДЕНИЕ............................................................................ 7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................ 14

1.1. Антимикробные пептиды бактерий, основные свойства и классификация............................................................................................................................14

1.2. Бактерии рода Bacillus - продуценты пептидов широкого спектра антимикробного действия..............................................................................20

1.3. Методология получения бактериоцинов и бактериоцино-подобных соединений (БПС)........................................................................................24

1.4. Примеры использования бактериоцинов и БПС.....................27

1.5. Заключение по обзору литературы...................................35

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..............................37

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ....................................................................................37

2.1. Используемые штаммы бактерий..................................................................37

2.2. Питательные среды и условия культивирования. 38

2.3. Накопление биомассы и концентрирование продукта..............39

2.4. Микробиологические методы............................................................................40

2.5. Биохимические методы..........................................................................................41

2.6. Экспериментальные животные........................................................................43

2.7. Методика приготовления и нанесения антимикробных полимерных покрытий................................................................................................................44

2.8. Методы статистической обработки результатов..............................45

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.................................................46

ГЛАВА 3. ШТАММЫ B.CIRCULANS И ПРОДУКЦИЯ

АНТИМИКРОБНОЙ СУБСТАНЦИИ..........................................................46

3.1. Описание штаммов-продуцентов антимикробных субстан-

ций....................................................................................................................................................46

3.2. Определение факторов, влияющих на синтез бактерицидных веществ, режимы культивирования............................................................49

3.2.1. Продукция бактериоциноподобных веществ в зависимости от источника азота........................................................49

3.2.2. Продукция бактериоциноподобных веществ в зависимости от источника углерода..................................................................................51

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЦИНА

В. СЖСШАЖ....................................................................................................................55

4.1. Питательная среда........................................................................................................56

4.2. Глубинное культивирование штамма-продуцента........................57

4.3. Разделение культуральной жидкости........................................................59

4.4. Сравнение и выбор способа выделения БПС....................................63

4.4.1. Метод высаливания неорганическими солями..........................63

4.4.2. Адсорбция-десорбция на твердом носителе................................64

4.4.3. Фазовая сепарация органическим растворителем..................65

4.5. Приготовление экспериментальных образцов БПС......................69

4.6. Очистка и идентификация компонентов препарата..................72

ГЛАВА 5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ

СВОЙСТВА БАКТЕРИОЦИНА В. СЖСШАЖ................................74

5.1. Спектр антимикробного (деконтаминирующего) действия. 74

5.2. Физико-химические свойства: термоустойчивость, рН зависимость, устойчивость к протеолизу, молекулярный вес............78

5.3. Оценка безвредности бактериоцина............................................................82

ГЛАВА 6. ПРИМЕРЫ И РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ

ПРИМЕНЕНИЮ БПС..................................................83

6.1. Лечебная эффективность на бройлерной птице.................84

6.2. Обеззараживание лабильных биоматериалов...................................85

6.3. Снижение контаминации вареных мясных колбас..................87

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................91

ВЫВОДЫ........................................................................................................................................93

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.......................95

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ..............................................................110

БЛАГОДАРНОСТИ..............................................................................................................112

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

АА - антимикробная (антагонистическая) активность АЕ - арбитражная единица активности БМ - биомасса микроорганизмов

БПС (BLIS) - бактериоциноподобное соединение (Bacteriocin-Like Ingibitory Substance)

GRAS - Generally recognized as safe (В целом признанные как безопасные)

ГРМ-бульон - бульон из гидролизата рыбно-костной муки

Гр(+/-) - грамположительные/грамотрицательные бактерии

ДАБ - диаминобутириковая кислота

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИБФМ РАН - Институт биохимии и физиологии микроорганизмов Российской Академии Наук.

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующая единица

МПК - минимальная подавляющая концентрация

МРС-агар - агар «Манн-Рогоза-Шарп»

мМ - миллимоль

ОП - оптическая плотность

ПААГ-электрофорез - полиакриламидный гель-электрофорез. ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПВС - поливиниловый спирт

ПК-6 - комбикорм экспандированный для цыплят-бройлеров

ПС - питательная среда

кДа - кило Дальтон

ТФУ - трифторуксусная кислота

ФБУН ГНЦ ПМБ - Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

SRCAM - State Research Center for Applied Microbiology (ГНЦПМ)

Dha - дегидроаланин (dehydroalanine).

Dhb - дегидробутирин (dehydrobutyrine).

HPLC (ВЭЖХ) - High-Performance Liquid Chromatography (высокоэффективная жидкостная хроматография)

LD50 - летальная доза для 50% популяции животных

in vivo - эксперимент проводимый в живом организме

in vitro - эксперимент проводимый в «пробирке», без участия животных

per os - пероральный путь введения

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulphate).

ВВЕДЕНИЕ

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2013 годы)», предусматривающей разработку обеззараживающих и деконтаминирующих препаратов нового поколения, в том числе на основе бактериоцинов микробного происхождения.

Актуальность проблемы За последние 30 лет в клиниках было выделено множество разнообразных микроорганизмов, на которых не действуют большинство традиционных антибиотиков. Уже в наши дни в Германии жертвами кишечной инфекции, вызванной устойчивым к антибиотикам геморрагическим штаммом Е.соИ ОЮ4:Н4, стали более 50 человек. В этой связи поиск новых антибактериальных средств с широким спектром действия и меньшим уровнем развития к ним микробной устойчивости имеет как научное, так и практическое значение.

Внимание исследователей уже несколько десятилетий привлечено к антимикробным пептидам - бактериоцинам, которые продуцируются преимущественно грамположительными бактериями. Особенностью бактериоцинов, как отмечает большинство исследователей, является то, что они не токсичны и к ним у бактерий, как правило, резистентность не развивается. Известны примеры практического использования некоторых бактериоцинов в качестве биоконсервантов пищевых продуктов, кормов. Так, бактериоцин низин (Е 234), продуцируемый молочнокислыми бактериями - ЬаМососст \actis, многие годы успешно применяется в составе различных продуктов питания, продлевая сроки их хранения, а педиоцин используют для стабилизации стартовых культур. Вместе с тем к бактериоцинам лактобактерий чувствительны лишь грамположительные представители филогенетически родственных микроорганизмов и только в отдельных случаях - грамотрицательные

бактерии.

Таким образом, выявление новых продуцентов бактериоцинов среди других представителей микроорганизмов, способных более эффективно ин-гибировать рост и развитие бактерий, вызывающих пищевые отравления и дисфункции кишечника, является актуальной задачей.

Перспективными источниками антимикробных соединений пептидной природы считаются некоторые виды аэробных спорообразующих бацилл [25]. Представители этих видов являются продуцентами известных соединений полипептидной природы - бацитрацина, бутирозина, грамицидина С, по-лимиксина и др., входящих в так называемую группу полимиксиновых антибиотиков. Эти антибиотики востребованы благодаря своей высокой эффективности против грамотрицательных бактерий, однако системное применение их ограничено в связи с побочными эффектами на уровне макроорганизмов.

В последнее десятилетие было обнаружено, что в числе представителей семейства бацилл - Paenibacillus polymyxa и Bacillus circulans, встречаются штаммы, способные производить бактериоцины и бактериоциноподобные соединения (БПС) пептидной природы, которые обладают антимикробным действием [61; 87; 96; 112]. По своему строению, механизму и спектру антимикробного действия эти соединения близки к бактериоцинам классов I, Па по классификации Кляенхамера [67], но отличаются более широким спектром действия. Наибольший интерес вызывает вид В. circulans , так как у одного из его представителей - В. circulans NRRL В-30644, депонированного в коллекции культур ARS (Agricultural Research Service) при Министерстве сельского хозяйства США, в 2001 году впервые был выявлен антимикробный пептид (бактериоцин 1580) с активностью против сальмонелл и кампилобак-терий [24].

Представители вида В. circulans практически безвредны и благодаря этому широко используются в биоиндустрии в качестве продуцентов биоло-

гически-активных соединений, и они могут оказаться ценными источниками новых антимикробных пептидов - бактериоцинов.

Нами были выделены из окружающей среды и депонированы в Государственной коллекции микроорганизмов «ГКПМ - Оболенск» ГНЦ ПМБ ряд новых штаммов из группы В. circulans, которые оказались продуцентами антимикробных пептидов с широким спектром действия. Потребность медицины, ветеринарии и пищевой промышленности в новых, более эффективных, средствах сдерживания вредных микроорганизмов явились основанием для более глубокого изучения антимикробных продуктов на основе В. circulans и разработки технологий их получения в препаративных количествах.

Цель исследования

Выбрать наиболее антагонистически активные и продуктивные штаммы Bacillus circulans , разработать лабораторную технологию получения бак-териоциноподобных соединений, изучить физико-химические свойства БПС и определить возможные сферы их применения.

Основные задачи исследования

4. Получить на основе отобранного штамма В. circulans и разработанного способа выделения экспериментальные образцы бактериоцинопо-добного соединения для изучения его основных свойств.

5. Определить с использованием представительного набора индикаторных штаммов различных видов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов качественные и количественные показатели антимикробной активности экспериментальных образцов бактериоциноподобного соединения штамма В. circulans СК 2ч.

8. Разработать экспериментальные образцы, содержащие бактерио-циноподобные соединения, и определить возможные области их практического применения.

Научная новизна работы

Выделены, идентифицированы и охарактеризованы новые антагонистически активные бактериоциногенные штаммы В. circulans, подавляющие рост различных видов грамположительных и грамотрицательных патогенных и условно патогенных бактерий, в том числе и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

Выявлена зависимость синтеза бактериоцино-подобного вещества от природы источника азота, энергетической ценности питательной среды и параметров глубинного культивирования продуцента.

Установлено, что как временные параметры синтеза БПС штаммом В. circulans, так и спектр антимикробного действия, включая молекулярную

массу, отличаются от других антимикробных соединений, продуцируемых штаммами этого вида.

Обнаружено, что некоторые из исследованных штаммов продуцируют два типа БПС: одно выделяется в культуральную жидкость и подавляет гра-мотрицательные бактерии, другое накапливается на поверхности клеток и активно против грамположительных бактерий.

Теоретическая ценность и практическая значимость работы

Создана коллекция антагонистически активных штаммов В. circulons, пригодных для использования в качестве источников новых бактериоцинов и бактериоциноподобных соединений.

Установлена зависимость синтеза бактерицидного вещества В. circulons от энергетической ценности и доступности компонентов питательной среды, что может стать вкладом в теорию и практику управляемого синтеза бактериоцинов на основе перспективных видов сапрофитных бактерий.

Разработаны способы глубинного культивирования продуцентов для получения БПС, обосновано использование малозатратных методов выделения их из культуральной жидкости, определены основные свойства экспериментальных препаратов. На основе выполненной работы разработан лабораторный регламент и составлены методические рекомендации.

Проведенные исследования и технологические разработки могут быть использованы для обнаружения и получения в препаративных количествах новых биологически активных веществ антимикробного действия, в том числе и бактериоцинов, синтезируемых другими видами микроорганизмов.

Внедрение

1. В Государственной коллекции микроорганизмов «ГКПМ - Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ в 2011 году депонированы следующие штаммы - продуценты бактериоциноподобных субстанций: В. circulons КПС-18 (№ 6853);

В. circulans ППС-2а (№ 6854); В. subtilis ПС-50° (№ 6855). Уровень внедрения учрежденческий.

2. «Методические рекомендации по применению бактерицидных веществ, синтезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов». Уровень внедрения учрежденческий.

3. Лабораторный регламент на получение бактериоцина с обеззараживающими свойствами [ЛР 78095326-100-2011]. Уровень внедрения федеральный.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Новые штаммы В. circulans, которые являются продуцентами бактериоциноподобных веществ, подавляют рост и развитие широкого спектра бактериальных патогенов.

2. Выход и активность бактериоциноподобного соединения В. circulans зависят от природы источника азота, вида и концентрации углерода в питательной среде, а также параметров глубинного культивирования.

3. Бактериоциноподобное соединение штамма В. circulans Ск2ч представляет собой термостабильное, pH устойчивое, протеин-содержащее соединение с молекулярной массой около 6 кДа, ингибирующее рост ряда грамотрицательных и грамположительных патогенов бактериальной природы.

4. Бактерициноподобное соединение штамма В. circulans Ск2ч может быть использовано в качестве добавки в корм цыплят - для контроля числа бактериальных патогенов в кишечнике, а также в составе полимерных пленок - для хранения продуктов, обеспечивающего снижение микробной контаминации.

Личный вклад соискателя

Автором лично выполнена вся экспериментальная работа и интерпретация полученных данных. По материалам диссертации были составлены «Методические рекомендации по применению бактерицидных веществ, син-

тезируемых Bacillus circulans, в составе полимерных пленок для продления сроков хранения пищевых продуктов».

Экспериментальные данные, полученные при выполнении диссертационной работы, легли в основу лабораторного регламента на получение бакте-риоцина с обеззараживающими свойствами [JIP 78095326-100-2011], в написании которого автор принял непосредственное участие.

Апробация работы

Основные результаты диссертацио

Информация о работе

Калмантаев, Тимур Ахмерович
кандидата биологических наук
Оболенск, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Получение и биологические свойства бактериоциноподобных веществ, продуцируемых Bacillus circulans - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы