Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn продуценты поверхностно-активных веществ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn продуценты поверхностно-активных веществ"

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА ОЛЬГА ВАЛЕРЬЕВНА

АЭРОБНЫЕ СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ РОДА BACILLUS COHN ПРОДУЦЕНТЫ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2004

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской Академии Наук

Научный руководитель - кандидат биологических наук Кузьмина Людмила Юрьевна

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Мелентьев Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

доктор биологических наук, профессор Ибрагимов Ренат Исмагилович

Ведущая организация: Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится "10" февраля 2005 г в f У час на заседании Регионального диссертационного Совета КМ 002.124. 01 при Президиуме Академии наук республики Башкортостан, по адресу: 450014, г. Уфа, ул. Новороссийская, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке филиала ФГУП "НПО "Микроген" МЗ РФ в г. Уфа, Имунопрепарат, по адресу: 450014, г. Уфа ул. Новороссийская, 105.

Автореферат разослан " декабря 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

у К. А. Лукманова

"7

ШЪЦМ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание эффективных микробных поверхностно-активных веществ (биоПАВ, биосурфактантов), обладающих рядом преимуществ по сравнению с химическими детергентами (биодеградабильность, промышленное получение на дешевых субстратах, эффективное действие при экстремальных температурах, концентрациях минеральных солей, рН), является актуальной задачей современной микробиологии и открывает перспективу их применения для решения различных промышленных задач.

Эти вещества могут синтезироваться некоторыми бактериями, дрожжами, микроводорослями, мицелиальными грибами [Desai J.D., 1987] и представлены гликолипидами, липопептидами и липопротеинами, липополисахаридами, жирными кислотами и полисахарид-белковыми комплексами. На сегодняшний день описано не более 100 микробных продуцентов ПАВ. Из большого количества известных биосурфактантов микробного происхождения в промышленном масштабе производится лишь эмульсан, продуцируемый Acinetobacter calcoaceticus RAG-1.

Бактерии, принадлежащие к роду Bacillus Cohn, могут быть перспективными продуцентами биоПАВ, поскольку уже известны некоторые штаммы, например, В subiihs и В lichemformis, В pumilus, продуцирующие поверхностно-активные липопептиды. Однако в целом способность к образованию биоПАВ представителями данного рода изучена недостаточно.

Применение биоПАВ представляется перспективным в медицине и фармакологии, в частности, для приготовления лекарственных форм, таких как жировые эмульсии для парэнтеральнго введения, фторуглеродистых заменителей крови, лечебных аэрозолей и др. Возможно использование биоПАВ для нормализации процессов пищеварения и всасывания при синдроме малабсорбции и других нарушениях, обусловленных дефицитом в кишечнике поверхностно-активных желчных кислот Липопротеиновые и липопептидные биоПАВ рассматриваются как перспективное средство компенсации дефицита легочных сурфактантов у больных [Ганиткевич Я.В., 1988].

В добывающей промышленности, возможно применение микробных ПАВ для увеличения степени извлечения нефти на истощенных месторождениях [Караскевич Е.Н., 1977; Donaldson Е.С. et al., 1984; Gutnic D.L., 1984; Sarkar A.K.et al., 1989; Гринберг T.A. и др., 1990; Беляев; C.C. и др., 1998; Нази-на Т.Н. и др., 1998], для уменьшения вязкости нефти и облегчения ее транспортировки по нефтепроводам, для очистки танкеров и других емкостей от остатков нефти, для стабилизации и дестабилизации эмульсий, для улучшения горючих свойств высокоасфальтовых нефтей [Елисеев С.А. и др., 1991; Кислухи-на О.В. и др., 1993].

Цель исследований. Цель настоящей работы - поиск эффективных продуцентов биоПАВ среди бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, выделение, очистка и характеристика синтезируемых поверхностно-активных веществ.

Для этого предстояло решить следующие задачи:

1. Оценить способность бактерий рода Bacillus продуцировать вещества, обладающие поверхностно-активными свойствами, и подобрать активные штаммы для получения биоПАВ.

2. Исследовать закономерности образования биоПАВ в процессе периодического культивирования продуцентов. Изучить влияние некоторых источников углеродного питания на динамику процессов роста и секреции биосурфактантов.

3. Определить физико-химические свойства биоПАВ, продуцируемых бациллами.

4 Установить химическую природу биоПАВ, выделяемого наиболее активным штаммом продуцентом, и оценить его биологическую активность.

Научная новизна. Оценена способность представителей рода Bacillus к образованию поверхностно-активных соединений. Установлено, что наибольшим потенциалом обладают представители вида В subtilis Выявлено, что интенсивное образование поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и завершается к моменту перехода в стационарную фазу Выявлен и запатентован новый штамм В subtilis ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ Установлена химическая идентичность биоПАВ, продуцируемого штаммом В subtilis ИБ-17, ли-попептиду сурфактин. Обнаруженный новый природный штамм почвенных бактерий В subtilis ИБ-17, превосходит по уровню накопления сурфактина известные, даже генетически модифицированные штаммы-продуценты

Практическая значимость работы. Исследования могут быть использованы для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Способность биоПАВ липопетидной природы ингибировать рост и развитие мицелиальных грибов, в том числе и дерматофитов, может быть использована при разработке новых фарм- и ветпрепаратов. Штамм В subtilis ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ, может найти практическое применение в нефтедобывающей промышленности для увеличения извлечения нефти из нефтеносных пластов, очистки загрязненной углеводородами почвы, для стабилизации и дестабилизации эмульсий.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- среди представителей рода Bacillus Coh п наибольшим потенциалом образования биоПАВ обладают изоляты вида В subtilis;

- новый природный штамм В subtilis ИБ-18, продуцирующий поверхностно-активные вещества, отличающиеся высокой термической стабильностью и биостойкостью;

- новый природный штамм В subtilis ИБ-17 - продуцент поверхностно-активных веществ сурфактинов.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Международная конференция "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий [Саранск, 2001]; 6 и 7 Пущинская школа-конференция "Биология наука XXI века" [Пущино, 2002, 2003]; Межрегиональ-

ная конференция молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" [Пермь, 2002]; 1 Всероссийская Интернет - конференции "Интеграция науки и образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем" [Уфа, 2003]; World Conference on Magic Bullets Celebrating Paul Ehrlich's 150th Birthday [Nürnberg, 2004].

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 Патент РФ и 1 заявка на выдачу Патента РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 168 наименований.

Благодарности. Автор выражает огромную признательность; к.х.н., с.н.с. B.C. Никитиной и н с. Г.В. Шендель за методическую помощь в проведении аминокислотного анализа, зав. лаб. Белорусского государственного университета к.б н. В.П. Курченко за содействие в проведении масс-спектроскопического исследования липопептидов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Основными объектами исследования являлись местные изоляты аэробных спорообразующих бактерий, принадлежащих к роду Bacillus Cohn 1872, из Коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН.

В качестве тест-объектов действия метаболитов бацилл использовали ми-целиальные грибы Drechslern sorokimana Sacc. Subram (Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke, Bipolaris sorokimana (Sacc ) Shoem), Fusarium gibbosum Appl. et Wr. emend Bilai, F sambucinum Fuck, Pénicillium variabile Sopp. Raper a. Thom и аскомицет Sacharomyces cerevisia из Коллекции грибов Института биологии УНЦ РАН.

Питательные среды и условия культивирования. Для хранения и поддержания в рабочем состоянии культур микроорганизмов использованы агари-зованные среды: для бактерий - картофельный агар и синтетическая среда К1 [Мелентьев А.И и др., 2000]; для грибов - среда Чапека-Докса и картофельно-глюкозный агар, дрожжей - неохмеленное пивное сусло

Глубинное культивирование исследуемых микроорганизмов осуществляли в качалочных колбах емкостью 250 мл при 160 об/мин"', 37 °С в течение 120 ч. Состав минеральных сред: кукурузный экстракт - 0,15; (NH4)2HP04 - 0,2; К2НР04 - 0,2; (NH4)2 SO4 - 0,2; СаС03 - 0,5; вода дистиллированная до 100%. В качестве источника углерода в зависимости от задачи использовали картофельный крахмал, глицерин или глюкозу (1%). Для культивирования штаммов В pumilus использовали среду, содержащую дополнительно дрожжевой автолизат - 0,2; кукурузный экстракт - 0,05; пептон - 0,05%).

Численность аэробной микрофлоры в пластовых водах при оценке биостабильности микробных ПАВ определяли на среде МПА, а сульфат - восстанавливающих бактерий на среде "Постгейт В".

Определение поверхностной активности. Поверхностное натяжение культуральной жидкости измеряли методом отрыва кольца [W D. Garkins, 1930; Н.К. Адам, 1947; А. Вайсбергер, 1950; Р.М Панин, 1974; А. Адамсон, 1979] после отделения биомассы центрифугированием при п=4000 об/мин"1.

Определение динамики процессов роста и секреции биоПАВ производили при культивировании исследуемых штаммов в колбах на аппарате УВМТ-12-250. Отбор проб осуществляли через 6, 10, 24, 30 ч и далее через каждые 24 ч культивирования. Регистрировали показания рН (иономер универсальный ЭВ-74), содержания биомассы (весовым методом (Егоров Н.С , 1983], оптическую плотность (спектрофотометр СФ-46) и поверхностное натяжения в культуральной жидкости.

Физико-химическая характеристика биоПАВ. Критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) и величину предельной адсорбции определяли путем построения изотерм поверхностного натяжения Ошоси-тельную концентрацию биоПАВ оценивали по величине предельного разведения до значения ККМ [Sheppard J.D., Mulligan C.N , 1987, Guerra-Santos L. et al, 1984].

Термическую стабильность биоПАВ определяли путем прогрева культуральной жидкости при 100 °С в течении 30 минут с последующим измерением поверхностного натяжения.

Оценку стабильности биоПАВ при хранении производили по изменению величины поверхностного натяжения культуральной жидкости при ее хранении на протяжении от 2 до 8 месяцев в нестерильных условиях в прозрачной посуде при комнатной температуре. Стабильность биоПАВ в смеси с пластовой водой оценивали при смешении 1:1. Полученные растворы хранили на протяжении 150 сут.

Выделение биоПАВ. Супернатант закисляли 2N НС1 до рН 2,0 и выдерживали при +4 °С в течении 12 ч для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием (п=4000 мин"'), трижды экстрагировали метанолом по 10 мл в течение 1,5 ч. Экстракты объединяли, добавляли 1 г активированного древесного угля, встряхивали 15 мин, затем отделяли от угля центрифугированием и выпаривали в тигле при 55 °С досуха.

Определение химического состава биоПАВ. Элементный состав определяли на анализаторе фирмы HEKAtech GmbH (Germane).

Спектры поглощения в инфракрасном диапазоне волн биоПАВ снимали на ИК-спектрофотометре Specord (Cari Zeiss Jena, DDR) M-80 в таблетках KBr.

Аминокислотный состав гидролизатов липопептидов определяли с помощью Автоматического анализатора аминокислот ААА 339 М (Mikrotechna, Czechoslovakia).

При масс-спектроскопии исследуемых липопептидов использовали детектор Waters Micromass ZQ 2000 с электроспрей ионизацией (ESIj.

Тонкослойную хроматографию осуществляли на стеклянных пластинках с силикагелем L5/40 размером 5/10 (Merck) в системе растворителей хлороформ : метанол : аммиак - 65 : 25 : 4. Пластинки проявляли опрыскиванием H2S04 и нагреванием при 120 °С. В качестве стандарта использовали сурфактин (Sigma).

Разделение вещества на отдельные фракции осуществляли методом ВЖХ на аналитической колонке Zorbax ODS (4,6 мм*25 см) С18 с размером частиц 7 мкм, с детекцией на абсорбционном спектрофотометре Waters Model 441 с рабочей длиной волны 220 нм при чувствительности 0,32.

Определение биологической активности биоПАВ. Антагонистическую активность определяли методом укола и лунок [Сеги И., 1983; Мелентьев А.И., Еркеев А.М., 1990].

Гемолитическую активность определяли методом лунок на агаровых пластинках с донорской кровью человека, а также в растворах отмытых эритроцитов мышиной крови по изменению экстинции на спектрофотометре Spekol 11 (Carlzeiss Jena, DDR).

Статистическую обработку результатов проводили, используя критерий Стьюдента на 5 % уровне значимости. Данные были обработаны с помощью программ для персональных ЭВМ Origin 5,0 и Microsoft Excel 7.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Скрининг возможных продуцентов биоПАВ и условия их образования

Скрининг возможных продуцентов биоПАВ был осуществлен среди культур аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus, ранее выделенных и описанных в качестве антагонистов мицелиальных грибов. Среди 74 штаммов бактерий рода Bacillus 48 штаммов принадлежали к виду В subtilis, 14 - В polymyxa, 4-5 pumilus и 6 не идентифицированных до вида изолятов - Bacillus sp Исследуемые культуры бактерий по величине поверхностного натяжения создаваемого в культуральной жидкости мы условно разделили на три группы: 1 - потенциальные продуценты биоПАВ, создающие поверхностное натяжение до 30 мН/м; 2 - слабые продуценты биоПАВ 30-50 мН/м; 3 - неактивные от 50 и более мН/м. Бактерии, объединенные в первую группу, снижали поверхностное натяжение на 62,16 - 57,10%, вторую - на 56,88 - 29,58% и в третью на 26,16 - 0%. Видовой состав бацилл по группам был представлен следующим образом: в первой группе В subtilis - 17 и 1 штамм Bacillus sp. ИБ-26 б; во второй В subtilis -21, В polymyxa - 9, Bacillus sp. - 3 и В pumilus - 1 штамм; третьей В subtilis - 12, В polymyxa - 5, Bacillus sp. - 2 и В pumilus -3 штамма.

Всего в ходе скрининга было отобрано 18 культур, при культивировании которых в жидкой питательной среде достигалось снижение поверхностного натяжения до 30 мН/м и ниже. Среди этих культур штаммы В subtilis ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19, обеспечивали снижение поверхностного натяжения КЖ до 2627 мН/м. Штаммы характеризовались стабильностью по продукции биоПАВ, и были отобраны нами для дальнейших исследований.

Существует точка зрения, согласно которой, микроорганизмы секрети-руют в среду поверхностно-активные вещества при росте на липофильных субстратах, например углеводородах. Учитывая, что способность использовать углеводороды в качестве источника углерода и энергии у представителей рода Bacillus встречается крайне редко, мы изучали влияние источников углерода и энергии на способность бацилл продуцировать биоПАВ на примере некоторых

наиболее распространенных субстратов, а именно крахмала, глицерина и глюкозы. При культивировании бацилл на глюкозе из четырнадцати штаммов только три культуры можно было отнести к 1 группе, восемь ко 2 и три к 3 группе (3:8:3) (табл. 1). Тогда как на глицерине это соотношение было 4:8.1, а на крахмале 5:5:4. Таким образом, изученные углеводы, можно расположить в ряд крахмап>глицерин>глюкоза по мере убывания способности к образованию биоПАВ бациллами.

Таблица 1

Поверхностное натяжение культуральной жидкости при выращивании бацилл в __средах с различными источниками углерода___

Штамм Глюкоза, 1% Глицерин, 1% Крахмал, 1%

ожг, мН/м группа ожг, мН/м группа а*г, мН/м группа

В зиЪиШ ИБ-17 27,93±0,42 1 28,19±2,23 1 26,44±0,25 1

В ¿иЬМи ИБ-47 28,92±2,22 1 29,35±0,33 1 29,98±0,14 1

В зиЬШк ИБ-28 29,91±2,14 1 29,93±2,25 1 33,24±5,24 2

В эиЬЫк ИБ-19 33,19±2,48 2 28,25±4,60 1 27,04±0,24 1

В .чиЬНШ ИБ-18 30,34±2,87 2 33.84±0,32 2 27,50±0,39 1

В .чиЫШя - 39-3 43,61 ±23,91 2 35,68±13,85 2 28,43±0,78 1

В яиЬШи ИБ-25 33,41±3,76 2 36,66±6,78 2 _, 31,76±0,36 2

В ро1утуха-У1 48,41 ±7,24 2 Нет роста 48,47±4,07 2

В ро1утуха-50 34,75±5,00 2 49,38±3,50 2 42,30±4,65 2

В ИБ-54 30,59±0,98 2 30,05±0,60 2 31,24±6,48 2

В ро1утуха-45 37,71±2,31 2 47,68+7,61 2 71,27±2,76 3

В .чиЬШк ИБ-55 51,63±1,83 3 44,01 ±3,44 2 55,75±1,31 3

В ро1утуха-46 62,02±13,52 3 49,68±21,69 2 77,44±1,78 3

В 5ИШ/5-39-1 52,63±2,853 3 56,33±4,52 3 64,48±4,69 3

Среда 64,69±3,08 - 67,82±2,45 - 69,88±2,9 -

Динамику роста и секреции биоПАВ в жидкой культуре изучали у трех штаммов В яиЬиШ ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19 в питательной среде с крахмалом. Выращивание осуществляли в колбах на аппарате УВМТ в стандартных условиях. В процессе культивирования В зиМтН? ИБ-17 кривая изменения биомассы, определенной как гравиметрическим методом, так и спектрофотометриче-ским, имела вид, характерный для периодического культивирования спорообра-зующих бактерий (рис.1). Характер изменения рН среды в процессе культивирования также соответствовал общим закономерностям, характерным для глубинных культур бацилл. Интенсивное снижение величины поверхностного натяжения среды отмечалось с началом логарифмической фазы роста культуры бактерий и завершалось к переходу в стационарную фазу роста. Следовательно, синтез поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и связан с интенсивностью катаболических процессов. При прекращении вегетативного роста клеток и переходу их к формированию спор дальнейших изменений в величине поверхностного натяжения не происходит,

В 5 и Ь11115 И Б-17

мН/ч .

О 20 40 60 ВО 100 120 140

Рис. 1 Динамика роста биомассы и снижения поверхностного натяжения в процессе культивирования штамма В зиЫШв ИБ-17.

а, следовательно, образуемые биоПАВ не являются продуктами лизиса клеток. Динамика роста и секреции биоПАВ при культивировании штаммов В зиЫНк ИБ-18 и ИБ-19 имела сходный характер, и отличалась лишь уровнем накопления биомассы и уровнем снижения поверхностного натяжения. Таким образом, отмеченная особенность образования биоПАВ позволяет, при разработке соответствующих технологий, использовать процессы непрерывного культивирования продуцентов.

Физико-химическая характеристика исследуемых биоПАВ

Критическая концентрация мицеллообразования и предельная адсорбция биоПАВ являются одними из важнейших физико-химических характеристик эффективности поверхностно-активных веществ

Для определения критической концентрации мицеллообразования (ККМ) и предельной адсорбции были построены графики изотерм поверхностного натяжения в зависимости от степени разбавления культуральной жидкости, поскольку работа проводилась с биоПАВ не установленной химической природы и неопределенным его содержанием. В качестве стандарта использовали Tween 80, для которого точка ККМ соответствует концентрации 13 мг/л при поверхностном натяжении 47,5 мН/м.

Интересные сведения о гетерогенности ПАВ можно получить из графиков изотерм в полулогарифмических координатах. На рис.2, в качестве примера, представлены изотермы поверхностного натяжения в двух системах координат для биоПАВ В зиЫШх ИБ-18.

SS ж

X

41

К в н я х

м а.

V

ш о

а

ДО

V

О 2D «

Разбавление КЖ %

s

S

*1 *

к н а

s

*

а.

о о С

О

51 1

Разбавление K>Klg%

Рис. 2 Изотермы поверхностного натяжения (А - а (мН/м)-С (КЖ%); Б -С) культуральной жидкости, полученной при культивировании штамма В яиЬМи ИБ-18 на крахмале, 1%.

Согласно A.A. Абрамзон и др. (1979), отсутствие четкого угла перегиба кривой изотермы в точке ККМ свидетельствует о наличии в смеси нескольких ПАВ одновременно. Возможно, что исследуемые штаммы, образуют несколько гомологичных соединений, таких, как, например, липопептидные ПАВ сурфак-тины [Arima К. et al., 1968].

В таблице 2 представлены экспериментальные данные о значениях ККМ и величинах предельной адсорбции биоПАВ, синтезируемых исследуемыми штаммами.

Таблица 2

ККМ и предельная адсорбция (Гго) биоПАВ на среде с крахмалом (1%)_

Штамм Критическая концентрация мицел-лообразования (ККМ) Предельная адсорбция (Г,„)

ККМ"' ажгккм(мН/м) кж%/Р ожгг„(мН/м)

53 33,27±2,24 0,2/512 38,62±2,17

19 35,00±1,06 0,8/128 42,73±12,31

18 38,64±0,61 0,8/128 44,14±0,49

ьо X 25 16,0 35,18±1,32 3,1/32 38,14±1,24

17 14,2 41,05±1,75 3,1/32 47,72±4,96

52-1 35,57±0,И 0,8/128 41,67±0,95

а 47 16,1 35,69±0,34 0,8/128 44,51±0,78

оа 39-3 12,7 38,46±17,84 0,8/128 42,42±1,82

32-1 16,0 36,41±1,46 0,4/256 47,16±2,71

32-2 11,9 35,38±0,62 3,1/32 39,74±1,88

34-d 9,4 39,65±2,00 12,5/8 38,31±1,44

Как следует из представленных данных, значение ККМ биоПАВ культур В зиЫШх ИБ-18, ИБ-19 и ИБ-52-1 достигается при большей кратности разбавления, а, следовательно, они отличаются и большим уровнем продукции. Представляло интерес определить уровень продукции биоПАВ исследуемыми культурами при использовании различных источников углерода. В табл.3 представлены результаты, из которых следует, что продукция биоПАВ культурами В

зиЬиИз ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19 выше на средах содержащих глицерин, нежели глюкозу или крахмал.

Таблица 3

Критическая концентрация мицеллообразования биоПАВ при культивировании бацилл на

Штамм Глицерин, 1% Глюкоза, 1% Крахмал, 1%

смс' о*г(мН/м) СМС' а*г(мН/м) СМС' а"(мН/м)

19 32,4 , Шгё/ 38,3 35,0

из 17 ; п,5 32,5 16,0 32,2 14,2 41,0

К ^ 18 32,0 38,5 32,0 35,5 23Д 38,6

о «Э 47 т 37,7 13,2 48,9 16,1 35,6

иэ 28 13,2 38,3 Щщж. 40,0 нет данных

54 6,5 42,5 8,0 46,4 нет данных

Из литературных данных известна величина ККМ сурфактина - поверхностно-активного вещества, образуемого некоторыми штаммами В эиЫШв, составляющая по разным источникам от 70 до 220 цМ. В этом случае, уровень продукции биоПАВ исследуемыми нами штаммами составляет 0,7-1,7 мг/л, что соответствует уровню западных аналогов.

Термическая стабильность ПАВ - одно из важнейших условий при их использовании в нефтедобывающей промышленности. Было установлено (табл. 4), что 30 минутный прогрев при 100 °С не вызывает изменений величин поверхностного натяжения, что свидетельствует о высокой термической стабильности молекул биоПАВ, продуцируемых исследуемыми бациллами в водных растворах.

Для практического применения биоПАВ большое значение имеет их устойчивость к биоразложению. Биологическую стабильность ПАВ оценивали по изменению величины поверхностного натяжения при хранении на протяжении 61 суток и более до полной потери свойств в нестерильных условиях, с учетом источника углерода, использованного в процессе биосинтеза (крахмал, глицерин и глюкоза).

Таблица 4

Поверхностное натяжение (?** , мН/м) в кульгуральной жидкости штаммов бацилл до и после прогрева

Штамм Крахмал, 1% Глицерин, 1% Глюкоза, 1%

до прогрева 30 мин 100 "С до прогрева 30 мин 100 С до прогрева 30 мин 100 "С

В. тЫй1$У&-\1 26,44±0,25 26,32±0,27 28,19*2,23 29,84±0,48 27,93±0,42 28,28±3,87

В. эиЬпЬз ИБ-18 27,50±0,39 27,45±1,36 33,38±0,32 33,04±0,39 30,34^2,87 29,78*0,56

В. тЬЫя ИБ-19 27,04±0,24 25,67±0,86 28,25±4,60 26,09±3,67 33,19^2,48 30,01*0,68

В яЖШк ИБ-25 31,76±0,36 31,20±0,43 36,66±6,78 34,45±0,71 33,41±3,76 30,84±2,79

В зиЬп1мШ-28 33,24±5,24 37,57^2,5 1 29,93±2,25 32,07±0,44 29,91^2,14 31,56*0,72

В яиЫИп ИБ-39-3 28,43±0,78 29,15±0,24 35,6&= 13,85 30,00±0,24 43,61±23,91 31,46*0,37

В шЫНи ИБ-47 29,98=ь0,14 29,80±0,18 29,35±0,33 29,66±0,95 28,92*2.22 30,47*4,36

В. хиЬШм ИБ-52-1 30,13±0,20 нет д анных 31,31±1,76 31,97±4,12 30,68±1,56 31,29*0,69

В ¡мЬПЫй ИБ-53 36,70±0,35 37,01±037 33,53±0,95 | 34,33±0,67 29,53±2,38 30,56*0,45

В. зиЫПк ИБ-54 31,24±6,48 35,31±0,37 30,05±0,60 | 30,11 ±0,32 30.59±0,98 31,61±0Д5

тивности (табл. 5), все исследуемые культуры можно было условно разделить на 3 группы: I -стабильны до 61 и более сут, II - до 16-34 сут и III не более 8-10 сут. БиоПАВ только двух штаммов, В subtilis ИБ-17 и ИБ-53, имели биосохранность до 60 сут, вне зависимости от природы источника углерода в питательной среде. БиоПАВ, продуцируемые В subtilis ИБ-18, ИБ-19 и ИБ-39-3 на средах с крахмалом, также сохраняли свою активность в течение 60 сут наблюдения, однако, при пользовании глюкозы и глицерина активность биоПАВ сохранялась не более 16-34 сут. На средах с крахмалом биоПАВ, продуцируемые В subtilis ИБ-39-3, сохраняли свои свойства на протяжении 209 сут (около 7 месяцев), В subtilis ИБ-17 - 150 сут (5 месяцев), а полная потеря свойств, происходила на месяц позже.

Таблица 5

Поверхностное натяжение и продолжительность сохранности поверхностной __активности культуральной жидкости бацилл_

Штамм продуцент Глюкоза, 1% Глицерин, 1% Крахмал, 1%

ожг, мН/м сут г , мН/м сут г п", мН/м сут r

В subtilis 25 33,03±3,75 32 II не сохр 8 III 32,19tl,76 32 II

В subtilis 28 32,62±3,57 32 II не сохр 10 III 33,94±8,01 33 II

В subtilis 47 не сохр 8 III 30,43±1,87 32 II 29,67±1,12 32 II

В subtilis 54 34,35±3,22 32 II 35,03±4,49 21 II 32,04±1,64 31 II

В subtilis 39-3 30,33±5,55 16 II 28,61±7,13 17 II 30,82±0,66 61-209 I

В subtilis 52-1 30,62±1,56 31 II 32,18±2,98 31 II 30,I5±2,60 61 I

В subtilis 18 31,18±7,82 24 II 34,58±б,58 32 II 30,71±1,73 61 I

В subtilis 19 31,86±2,02 31 II 29,09±2,31 34 II 31,01±2,35 61 I

В subtilis 17 29,26±2,65 61 I 29,66±1,33 61 I 30,09±1,48 61-150 I

В subtilis 53 29,75±1,85 61 I 34,49±2,73 61 I 29,30±1,97 61 I

не сохр - не сохраняет активность в период наблюдения, г - группа

Таким образом, наибольшей биостабильностью отличаются ПАВ, полученные при культивировании бацилл на средах с крахмалом. Вероятно, на среде с крахмалом образуется большее количество антибиотических веществ, что препятствует биодеградации синтезируемых бациллами ПАВ. Возможно, что стабильность исследуемых биоПАВ, обусловлена их химической природой.

При использовании биоПАВ с целью повышения отдачи нефтеносных пластов, путем заводнения нагнетательных скважин, важное значение имеет их стабильность при смешении с пластовыми водами. Была произведена оценка стабильности биоПАВ при смешении с пластовой водой в соотношении 1:1 Характеристика использованной пластовой воды: содержание мине-

ральных солей 13% мае, титр аэробной микрофлоры 28 КОЕ/мл и сульфат-восстанавливающих бактерий 30 КОЕ/мл. Как следует из представленных данных (рис. 2), наилучшими показателями отличается ПАВ, продуцируемый штаммом В хиЬШз ИБ-18, он сохранял активность в течение 100 сут, тогда как у культур В яиЬИНз ИБ-19 и ИБ-17 не более 30-37 сут. Поскольку штамм В ¿иМНя ИБ-18 представляет практический интерес для получения биоПАВ для нефтедобывающей промышленности, нами был получен на него

Время сутки

Рис. 2 Изменение поверхностного натяжения растворов биоПАВ, продуцируемых культурами бацилл, в смеси с пластовой водой

Определение химической природы и структуры биоПАВ

Для практического использования новых биоПАВ требуется определение их химической природы и структуры. Поскольку это сложная и трудоемкая работа, для дальнейших исследований нами был выбран штамм В зиЫШ$ ИБ-17, как стабильный продуцент с наибольшим выходом биоПАВ на различных средах, с высокой термо- и биостабильностью.

Результаты элементного анализа образца биоПАВ штамма В зиЫШз ИБ-17 представлены в таблице 6.

Таблица 6

Элементный состав биоПАВ В ыЬпЬя ИБ-17 и сурфактина

Элементы Соде ржание элементов, %массы

Образец биоПАВ В лмШи ИБ-17 Сурфактин [Апша К. е1а1, 1968] Сурфактин (расчетные значения)

С 55,6 59,6 55,97-56,73

О 27,9 - 26,18-26,87

н 7,6 9,0 8,02-8,18

N 7,3 9,1 8,91-9,14

зольность 1,6 -

Исходя из полученных данных, расчетная брутто-формула исследуемого вещества может быть представлена как СзаНадОг^в. На основе данных

элементного анализа и расчетной брутто-формулы нами было предположено, что выделенное вещество, может соответствовать сурфактинам.

Методом тонкослойной хроматографии было проведено сравнение соответствия исследуемого образца стандартному сурфактину (Sigma). В исследуемом образце было выявлено два пятна, из которых доминантное имело ту же величину подвижности (Rf = 0,184), что и стандартный образец сур-фактина (рис. 3), и минорное с Rf = 0,65. Вероятно это следствие недостаточной очистки исследуемого образца или наличия компонента, отличного по строению от су^фактинов.

1 Рис. 3 Тонкослойная ч- хроматограмма очищенного образца биоПАВ. 1 - обра, зец биоПАВ В зиЫФх ИБ-т 17; 2 - сурфактин. Пластина , - силикагель Ь5/40; система * растворителей - хлороформ : метанол: аммиак (65:25:4).

Спектр поглощения инфракрасного излучения образцом биоПАВ В зыЬиИя выявил наличие пептидных связей, характеризовавшихся поглощением в области 1648 см4, аминогрупп - 1568 см"1. Присутствие карбоксильных групп (1420 см"1), вероятно, обусловлено дикарбоновыми аминокислотами - аспарагиновой и/или глютаминовой. Полосы поглощения при 2956, 2926,и 2854 см"1 указывают на СН3-группы. Данные также указывают на присутствие большого числа СН2-групп. Колебания О - Н и N - Н связей отражены поглощениями при 3052 и 3412 см"1, что соответствует -СО - ЫН-- и -N - Н- группам.

Таким образом, данные ИК-спектроскопии подтвердили предположение о возможной липопептидной структуре поверхностно-активных веществ, продуцируемых исследуемым штаммом.

Для разделения препарата на отельные компоненты использовали метод распределительной высокоэффективной жидкостной хроматографии, в ее обратнофазовом варианте. В результате аналитического разделения препарата нам удалось получить шесть основных фракций, различающихся по времени удерживания.

Поскольку данные элементного состава, ТСХ и ИК-спектроскопии свидетельствовали о принадлежности исследуемого биоПАВ к классу липо-пептидов, нам предстояло выяснить состав аминокислот, составляющих пептидную часть молекулы. На рис. 4 представлены данные аминокислотного анализа кислотного гидролизата исходного препарата, свидетельствующие о присутствии четырех доминирующих аминокислот - лейцина, валина, аспа-рагиновой кислоты и глутаминовой кислоты в молярном соотношении 4,24 1,01.1,00 1,08. Эти данные очень близки к установленному соотношению аминокислот в молекуле сурфактина: 4:1:1:1.

Рис. 4 Хроматограмма разделения аминокислот гидролизата из препарата биоПАВ продуцируемого В тЬИНь ИБ-17.

Аминокислотный анализ отдельных фракций дал следующие результаты (табл. 7)' в наиболее подвижной фракции (1-ой) сумма аминокислот не превышает 12 мг/r образца, в наибольшем количестве содержатся те же лейцин, валин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, а также глицин и аланин. Т е , данная фракция по аминокислотному составу отличается от сурфактина. Аминокислотный состав со 2-й и по 6-ю фракции абсолютно идентичен, в них обнаружены те же аминокислоты лейцин, валин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты в соотношении 4:1:1:1. Вероятно, при обратнофазовой ВЭЖХ разделяются компоненты сурфактина, различающиеся по гидрофобному фрагменту, а именно по строению и длине углеродной цепи ß-гидроксикарбоновой кислоты.

При масс-спектрометрическом анализе исходного образца биоПАВ детектировался спектр заряженных частиц с выраженным кластером интенсивных пиков в интервале 1032-1150 m/z. Сопоставление полученных спектров с масс-спектрами поверхностно-активных липопептидов Bacillus spp., полученных другими авторами [Baumgart F.et al., 1991], позволило сделать заключение об их близком соответствии. Сочетание масс-спектрометрии с ВЭЖХ позволило обнаружить три изоформы веществ с массой 1045 Da и четыре изоформы с массой 1059 Da. Первое вещество соответствует натриевой соли сурфактина (M+Na)+ с липофильным остатком См-Р-гидроксикарбоновой кислоты, второй - С,5- p-гидроксикарбоновой кислоты.

Наличие трех изоформ С|4-сурфактина, вероятнее всего, обусловлено строением углеродной цепи ß-гидроксикарбоновой кислоты, для которых известно - нормальное, изо- и антиизо- строение Четыре изоформы С)5-сурфактина, могут также быть связаны со строением углеродного скелета липофильного остатка, или же, с встречающейся заменой 7-го остатка лейцина в пептидном кольце на изолейцин.

Биологическая активность.

Известно, что сурфактины обладают множественной биологической активностью. Так, они обладают избирательной антигрибной активностью, в частности, они не угнетают рост аскомицетов S cerevisiae в противоположность другому липопептиду бацилл - итурину, но вызывают лизис эритроцитов. Поэтому, в дополнение к физико-химическим данным, характеризующим биоПАВ В subtihs ИБ-17 как сурфактин, нами были проведены некоторые тесты на гемолиз эритроцитов и на антигрибную активность.

Образцы Концентра- Поверхност- Аминокислоты, Гемоли- Ангифунгальная акгив-

ция препара- ное натяже- Молярное соотношение тическая носгь

та, мкг/мя ние, мН/м актив- D р S

ность, sorohrn variabile cerevi

мм ana sia

Общий образец, Су 1000 26,4 Asp, Glu, Val, Leu 494±26 +++ - -

400 1 1:1:4 323±11 +-Н- - -

Фракция 1 1000 27,4 Asp, Glu. Val, Gly Ala Leu 0,0 - - -

400 2:3:2:2:1.6 0,0 - - -

Фракция 2 1000 37,8 Asp, Glu, Val, Leu нд нд - -

400 1.11:4 0,0 - - -

Фракция 3 1000 30,2 Asp, Glu, Val, Leu нд нд - -

400 1.1:1:4 158±59 - - -

Фракция 4 1000 28,4 Asp, Glu, Val, Leu 374±93 + - -

400 1 1:1-4 243±59 - - -

Фракция 5 1000 30,1 Asp, Glu, Val, Leu 378±35 + - -

400 111:4 227±19 + - -

Фракция 6 1000 28,4 Asp, Glu, Val, Leu 437±62 -н- - -

400 11:1:4 319±87 ++ - -

Фракция, оседаю- 1000 нд Asp, Glu, Val, Leu нд нд - -

щая на колонке, ЫЕ 400 1 1:1:4 267=40 - - -

нд - нет данных; "—" - активность отсутствует;

антигрибная активность. "+++" - 800-900 мм2, "++" - 150-240 мм2, "+" - 75-150 мм2.

Типичная картина гемолиза эритроцитов человека при определении методом лунок в агаре с донорской кровью, свидетельствовала о так называемом а'-гемолизе, когда непосредственно вокруг лунок образуется небольшой ореол из целых или частично лизированных эритроцитов, а к нему примыкает зона полного гемолиза, распространяющаяся далее в среду [Лабин-ская A.C., 1978].

Наибольшая гемолитическая активность обнаруживалась в исходном препарате при концентрации 1000 мкг/мл (табл 7), отсутствовала в первой и второй фракциях, однако проявилась в третьей, возрастая в последующих При концентрациях исходного препарата и отдельных его фракций 40 мкг/мл гемолитическая активность не проявилась.

Из литературных данных известно, что минимальная гемолитическая активность сурфактина соответствует 200 мкМ [Peypoux F. et al., 1999], что составляет 207 мкг/мл Таким образом, полученные данные о гемолитической активности исследуемого биоПАВ также свидетельствуют о его схожести с сурфактином.

Антагонистическая активность штамма В subtilis ИБ-17 была определена к почвенным микромицетам D sorokimana, F gibbosum, F sambucinum, P Emvarmbile и аскомицетам S cerevisiae. Было показано, что культура подавляет только два тестируемых организма - D sorokiniana и Р variabile Эти культуры были использованы для определения антигрибной активности препаратов сурфактина В subtilis ИБ-17 (табл. 7). Как и ожидалось ингибирова-ния роста дрожжей S cerevisia обнаружено не было, но в то же время не наблюдалось и подавления мицеллиального гриба Р variabile во всех исследованных концентрациях.

В дополнение к этим биотестам в лаборатории прикладной микробиологии Института биологии УНЦ РАН и Уфимском городском кожно-венерологическом диспансере было установлено, что культуры В subtilis ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19 способны подавлять рост и развитие грибов Trichophyton rubrum, Т Mentagrophytes var Gipseum и Microsporium canis, вызывающих дерматомикозы, что является новым, ранее не известным свойством бацилл, образующих липопептиды.

Таким образом, совокупность полученных результатов, позволяет сделать заключение, что отобранные штаммы В subtilis ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19 являются продуцентами липопетидных биоПАВ, отличающихся высокой термостабильностью и продолжительной сохранностью в нестерильных растворах.. Аналитическими физико-химическими методами, дополненными изучением биологических свойств установлено, что штамм В subtilis ИБ-17 синтезирует поверхностно-активные вещества соответствующие липопепти-ду сурфактин.

Выводы

1. Установлено, что среди представителей рода Bacillus Cohn наибольшим потенциалом образования биоПАВ обладают изоляты вида В subtilis. Отобрано 18 культур, снижающих поверхностное натяжение культураль-ной среды с 70 до 30 мН/м.

2. При культивировании бацилл - продуцентов, интенсивное образование поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и завершается к моменту перехода в стационарную фазу.

3 Уровень продукции биоПАВ отобранных штаммов, рассчитанный по критической концентрации мицеллообразования составляет 0,7-1,7 мг/л

4. Поверхностно активные вещества найденных штаммов бацилл обладают высокой термо- и биостойкостью Выявлен и запатентован новый штамм В subtilis ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ В смеси с пластовой водой нефтепромыслов биоПАВ данного штамма не теряют активности до 100 суток.

5. Методами экстракции и препаративной хроматографии выделены и очищены поверхностно-активные вещества, синтезируемые штаммом В subtilis ИБ-17. На основании данных физико-химических анализов и совокупности биологических свойств доказано, что данные биоПАВ являются циклическими липопептидами, идентичными сурфактину. Штамм запатентован как продуцент сурфактинов, не уступающий по уровню продукции генноинженерным аналогам.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кузьмина Л Ю., Мелентьев А.И , Яковлева О.В. Скрининг продуцентов поверхностно активных веществ среди бактерий рода Bacillus Cohn // Биотехнология на рубеже двух тысячелетий: Мат. международ науч конф., Саранск, 12-15 сентября, 2001 г. - Саранск, 2001. - С. 33-34.

2. Яковлева О.В., Кузьмина Л.Ю. Биосурфактанты бацилл и их свойства // Биология наука XXI века. Мат. 6-ой Путинской школы-конф., Пущино, 20-24 мая, 2002 г. - Пущино, 2002. - С. 78-79.

3. Яковлева О.В., Кузьмина Л. Ю. Поверхностно активные соединения культуры Bacillus subtilis ИБ-17 II Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Мат. межрегиональной конф. молодых ученых, Пермь, 20-22 ноября, 2002 г. - Пермь, 2002. - С. 75-76.

4. Кузьмина Л.Ю., Яковлева О.В. Физико-химические свойства сурфактан-тов бацилл // Интеграция науки и образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем. Мат. 1-й Всерос Интернет - конф.. - Уфа, УГНТУ, 25-27 декабря 2002 г. С. 6.

5. Яковлева О В., Шендель Г.В., Кузьмина Л.Ю., Мелентьев А И Определение химической природы поверхностно-активных соединений, продуцируемых Bacillus subtilis ИБ-17 // Биология наука XXI века. Мат. 7-ой Пу-

щинской школы-конф., Пущино, 14-18 апреля, 2003 г. - Пущино, 2003. - С. 298.

6. Melentiev A. I., Mucamadeeva О. R., Galimzyanova N. F., Kuzmina L. Yu., Yakovleva О. V. In vitro growth inhibition of dermatophytes by some of Bacillus subtilis //World Conference on Magic Bullets celebration Paul Ehrlich's 150 Birthday. - Nürnberg, Germany, September 9-11, 2004 -Abstracts. - P. A-83.

7. Кузьмина Л Ю, Мелентьев А.И , Актуганов Г.Э., Фердман В.М., Яковлева OB Штамм бактерий В subtilis ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно активных веществ Патент РФ № 2211861 МПК C12N1/20 Заявл. 18 03.2002. Опубл. 10.09.2003 Бюл. № 25.

8. Мелет ьев А И., Кузьмина Л. Ю , Яковлева О. В , Курченко В П. Штамм бактерий В subtilis ИБ-17 - продуцент сурфактина. // Заявка № 2004110414 на Патент РФ.Опубл. 20.11.2004 Бюл. № 32.

Соискатель

Яковлева О.В.

Лицензия № 223 от 03.08.2000 г. Формат 60x84 1/16. Бумага типографская. Компьютерный набор. Печать на ризографе. Тираж 100 экз. Заказ № 234

Отпечатано в типографии ООО «Штайм» 450005, Уфа, ул 8е марта, 12/1

РНБ Русский фонд

2006-4 1758

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Яковлева, Ольга Валерьевна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация микробных ПАВ и их основные продуценты.

1.2. Выделение биоПАВ из культуральной жидкости и его очистка.

1.3. Физико-химические свойства биоПАВ.

1.4. Продуценты и условия образования липопептидных ПАВ.

1.5. Биологическая активность липопептидных биоПАВ.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Условия культивирования.

2.3. Измерение поверхностного натяжения.

2.4. Изучение динамики процессов роста и секреции биоПАВ.

2.5. Критерии оценки эффективности биоПАВ.

2.6. Выделение биоПАВ.

2.7. Определение химического состава биоПАВ.

2.7.1. Элементный анализ.

2.7.2. Тонкослойная хроматография.

2.7.3. Инфракрасный спектр.

2.7.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

2.7.5. Аминокислотный анализ.

2.7.6. Масс-спектрометрия.

2.8. Определение биологической активности биоПАВ.

2.8.1. Антагонистическая активность к фитопатогенным грибам.

2.8.2. Гемолитическая активность биоПАВ.

2.9. Статистический анализ результатов эксперимента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3. СКРИНИНГ ПРОДУЦЕНТОВ БИОПАВ СРЕДИ КУЛЬТУР БАЦИЛЛ

4. ОБРАЗОВАНИЕ БИОПАВ В ПРОЦЕССЕ ПЕРИОДИЧЕСКОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ.

4.1. Влияние некоторых источников углерода на образование биоПАВ

4.2. Динамика роста и секреции биоПАВ в жидкой культуре.

5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОПАВ,

ПРОДУЦИРУЕМЫХ БАЦИЛЛАМИ.

5.1. Критическая концентрация мицеллообразования и предельная адсорбция биоПАВ.

5.2. Термическая стабильность биоПАВ.

5.3. Влияние времени на сохранение поверхностно активных свойств биоПАВ.

5.3.1. Влияние продолжительности хранения культуральной жидкости на поверхностную активность биоПАВ.

5.3.1. Стабильность биоПАВ в смеси с пластовой водой.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ И СТРУКТУРЫ БИОПАВ ШТАММА В. вЦВТПЛЗ ИБ-17.

6.1. Элементный состав биоПАВ.

6.2. Тонкослойная хроматография.

6.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

6.5. Аминокислотный состав биоПАВ.

6.6. Масс-спектрометрический анализ биоПАВ.

7. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В. вЦВТПЛв ИБ-17.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus Cohn продуценты поверхностно-активных веществ"

Актуальность темы. Использование в различных технологиях соединений, легко поддающихся биологическому разложению, становится актуальной задачей, в связи с возрастающим антропогенным воздействием на окружающую среду и угрожающими размерами ее загрязнения [Павленко Н.И. и др., 1994]. Одними из наиболее распространенных полютантов являются синтетические поверхностно-активные соединения, широко используемые как в быту, так и в промышленности. В связи с этим, особый интерес представляет поиск и исследование биоПАВ микробного происхождения, которые, как правило, способны быстро разлагаться под действием естественных природных физических и биотических факторов.

Эти вещества могут синтезироваться некоторыми бактериями, дрожжами, микроводорослями, мицелиальными грибами [Desai J.D., 1987] и представлены гликолипидами, липопротеинами, липополисахаридами, жирными кислотами и полисахарид-белковыми комплексами. На сегодняшний день описано не более 100 микробных продуцентов ПАВ. Из большого количества известных био-сурфактантов микробного происхождения, в промышленном масштабе производится лишь эмульсан, продуцируемый Acinetobacter calcoaceticus RAG-1.

Бактерии, принадлежащие к роду Bacillus Cohn, могут быть перспективными продуцентами биоПАВ, поскольку уже известны некоторые штаммы, например, В. subtilis и В. licheniformis, продуцирующие липопептидные ПАВ сур-фактин и лихенизин. Однако, в целом способность к образованию биоПАВ представителями данного рода изучена слабо.

Микробные ПАВ способны снижать поверхностное натяжение на границе раздела нефти и воды при экстремальных температурах, pH и концентрациях минеральных солей, что открывает перспективу их применения для решения различных промышленных задач.

В настоящее время предлагается применение микробных ПАВ для увеличения добычи нефти путем снижения поверхностного натяжения на границе раздела нефти и воды [Караскевич E.H., 1977; Donaldson Е.С. et al., 1984; Gutnic D.L., 1984; Sarkar A.K. et al., 1989; Гринберг T.A. и др., 1990; Беляев C.C. и др., 1998; Назина Т.Н. и др., 1998]. Кроме того, в нефтяной и нефтеперерабатывающей промышленности биоПАВ могут найти применение для уменьшения вязкости нефти и облегчения ее транспортировки по нефтепроводам, для очистки танкеров и других емкостей от остатков нефти, для стабилизации и дестабилизации эмульсий, улучшения горючих свойств высокоасфальтовых нефтей [Елисеев СЛ. и др., 1991; Кислухина О.В. и др., 1993].

Предлагается множество методов микробиологической очистки почв, загрязненных углеводородами нефти и газового конденсата. Интенсификацию таких способов очистки можно осуществлять путем орошения загрязненной почвы суспензией микроорганизмов - деструкторов углеводородов в виде биопены, что обеспечит равномерное поступление микробной суспензии в почву независимо от рельефа на глубину 30-40 см. По мнению Стабниковой М.В. с соавторами (1993), основу биопены должны составлять биогенные ПАВ, которые обладают достаточно высокими пенообразующими свойствами и эмульгирующей активностью.

Перспективным представляется применение биоПАВ в медицине и фармакологии, в том числе, для приготовления различных лекарственных форм, таких как жировые эмульсии для парэнтерального введения, фторуглероди-стых заменителей крови, лечебных аэрозолей и др. В связи с ожидаемый высокой физиологической активностью биоПАВ, заслуживает внимания возможность их использования для нормализации процессов пищеварения и всасывания при синдроме малабсорбции и других нарушениях, обусловленных дефицитом в кишечнике поверхностно-активных желчных кислот. Липопротеино-вые и липопептидные биоПАВ рассматриваются как перспективное средство компенсации дефицита легочных сурфактантов у больных [Ганиткевич Я.В., 1988].

Цели и задачи исследований.

Цель настоящей работы - поиск эффективных продуцентов биоПАВ среди бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, выделение, очистка и характеристика синтезируемых поверхностно-активных веществ.

Для этого предстояло решить следующие задачи:

1. Оценить способность бактерий рода Bacillus продуцировать вещества, обладающие поверхностно-активными свойствами и подобрать активные штаммы для получения биоПАВ;

2. Исследовать закономерности образования биоПАВ в процессе периодического культивирования продуцентов. Изучить влияние некоторых источников углеродного питания на динамику процессов роста и секреции биосурфактантов;

3. Определить физико-химические свойства биоПАВ, продуцируемых бациллами;

4. Установить химическую природу биоПАВ, выделяемого наиболее активным штаммом продуцентом, и оценить его биологическую активность.

Научная новизна работы. Оценена способность представителей рода Bacillus к образованию поверхностно-активных соединений. Установлено, что наибольшим потенциалом обладают представители вида В. subtilis. Выявлено что, интенсивное образование поверхностно-активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и завершается к моменту перехода в стационарную фазу. Выявлен и запатентован новый штамм В. subtilis ИБ-18 -продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ. Установлена химическая идентичность биоПАВ, продуцируемого штаммом В. subtilis ИБ-17, липопептиду сурфактин. Обнаруженный новый природный штамм почвенных бактерий В. subtilis ИБ-17, превосходит по уровню накопления сурфактина многие известные, даже генетически модифицированные штаммы-продуценты.

Практическая значимость работы. Исследования могут быть использованы для получения биогенного поверхностно-активного вещества сурфактина, обладающего множественной биологической активностью. Его практическое применение возможно в нефтедобывающей промышленности для увеличения извлечения нефти из нефтеносных пластов, очистки загрязненной углеводородами почвы, для стабилизации и дестабилизации эмульсий. Способность биоПАВ липопептидной природы ингибировать рост и развитие мицелиальных грибов, в том числе и дерматофитов, может быть использована при разработке новых фарм- и ветпрепаратов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- новые штаммы бактерий вида В. subtilis - продуценты поверхностно активных веществ;

- физико-химические свойства биоПАВ, продуцируемых бациллами (термо- и биостойкость, критическая концентрация мицеллообразова-ния);

- структура и биологическая активность нового метаболита, обладающего поверхностно-активными свойствами.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Международная конференция "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий [Саранск, 2001]; 6 и 7 Пущинская школа-конференция "Биология наука XXI века" [Пущино, 2002, 2003]; Межрегиональная конференция молодых ученых "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" [Пермь, 2002]; 1 Всероссийская Интернет - конференции "Интеграция науки и образования в области био- и органической химии и механики многофазовых систем" [Уфа, 2003]; World Conference on Magic Bullets Celebrating Paul Ehrlich's 150th Birthday [Nürnberg, 2004].

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 1 патент и 1 опубликованная заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, главы результаты и обсуждение, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего ссылки. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста и содержит 20 рисунков и 10 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Яковлева, Ольга Валерьевна

9. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что среди представителей рода Bacillus Cohn наибольшим потенциалом образования биоПАВ обладают изоляты вида В. subtilis. Отобрано 18 культур, снижающих поверхностное натяжение культуральной среды с 70 до 30 мН/м.

2. При культивировании бацилл - продуцентов, интенсивное образование поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий и завершается к моменту перехода в стационарную фазу.

3. Уровень продукции биоПАВ отобранных штаммов, рассчитанный по критической концентрации мицеллообразования составляет 0,7-4,7 г/л.

4. Поверхностно активные вещества найденных штаммов бацилл обладают высокой термо- и биостойкостью. Выявлен и запатентован новый штамм В. subtilis ИБ-18 - продуцент термо- и биостойких поверхностно-активных веществ. В смеси с пластовой водой нефтепромыслов биоПАВ данного штамма не теряют активности в течение 100 суток.

5. Методами экстракции и препаративной хроматографии выделены и очищены поверхностно-активные вещества, синтезируемые штаммом В. subtilis ИБ-17. На основании данных физико-химических анализов и совокупности биологических свойств доказано, что данные биоПАВ являются циклическими липопептидами, идентичными сурфактину. Штамм запатентован как продуцент сурфактинов, не уступающий по уровню продукции зарубежным аналогам, в том числе генноинженер-ным.

8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из задач данной работы был поиск продуцентов поверхностно активных веществ, среди бактерий рода Bacillus из Коллекции микроорганизмов Института биологии УНЦ РАН. Всего в ходе скрининга, из 74 коллекционных штаммов бацилл было отобрано 18 культур создающих поверхностное натяжение в среде менее 30 мН/м. Как следует их наших исследований, бактерии вида В. polymyxa и В. pumilus можно не рассматривать в качестве потенциальных продуцентов биоПАВ, а возможный скрининг перспективнее проводить среди бактерий вида В. subtilis.

Среди культур продуцентов биоПАВ можно выделить штаммы В. subtilis ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19, создающих поверхностное натяжение в питательной среде 26-27 мН/м. У способных к биосинтезу биоПАВ бактерий и дрожжей при культивировании на разнообразных источниках образуются биосурфактанты, создающие поверхностное натяжение в среде порядка 27,6 - 41,0 мН/м [Jle-сыкО.Ю. и др., 1989; Елисеев С.А. и др., 1990; Шульга А.Н. и др., 1990; Карпенко Е.В. и др., 1996]. Таким образом, выбранные нами культуры проявляют высокую поверхностную активность, которая свойственна биосурфактантам микробного происхождения. Кроме того, эти штаммы характеризовались стабильностью по продукции биоПАВ.

При изучении способности трех продуцентов биоПАВ - В. subtilis ИБ-17, В . subtilis ИБ-18 и В. subtilis ИБ-19 к синтезу целевого продукта на среде содержащей крахмал было показано, что интенсивное образование поверхностно активных веществ осуществляется в логарифмической фазе роста бактерий, примерно через 10 ч от начала их выращивания, и завершается к переходу в стационарную фазу. С переходом в стационарную фазу (через 24 ч) концентрация биоПАВ достигает своего максимума. При прекращении вегетативного роста клеток и переходе их к формированию спор дальнейших изменений в величине поверхностного натяжения не происходит. Синтез поверхностно-активных веществ культурами бацилл связан с интенсивностью катаболических процессов, а это позволяет, при разработке соответствующих технологий, использовать процессы непрерывного культивирования продуцентов.

С целью выбора экономически доступного источника углерода, увеличения выхода биоПАВ и определения некоторых физико-химических показателей конечного продукта при культивировании изучаемых штаммов, мы использовали несколько источников углерода, а именно полисахарид крахмал, многоатомный спирт глицерин и моносахарид глюкозу.

Проведенные исследования показали, что все три источника углерода подходят для культивирования продуцентов биоПАВ среди бактерий рода Bacillus. Однако, скрининг продуцентов биосурфактантов следует проводить на крахмале, поскольку большее число штаммов способно к синтезу биоПАВ на этом субстрате, нежели на глицерине, и еще меньше культур на глюкозе. Кроме того, использование крахмала экономически целесообразнее, чем глюкозы.

Вместе с тем необходимо отметить, что по показателю поверхностного натяжения в среде нельзя сделать однозначный вывод о том, что концентрация биоПАВ на среде с крахмалом выше, чем на двух других источниках углерода. Для решения этой задачи необходимо использовать методы позволяющие оценить концентрацию поверхностно активных веществ в среде.

Одним из таких способов является непрямой метод, основанный на определении последовательных разведений культуральной жидкости до достижения критической концентрации мицеллообразования.

Критическая концентрация мицеллообразования (ККМ) и предельная адсорбция (Гт), являются одними из важнейших физико-химических характеристик эффективности поверхностно-активных веществ.

На основании изотерм поверхностного натяжения нами были определены ККМ и предельная адсорбция биоПАВ продуцируемых бациллами на трех источниках углерода. Точка ККМ у исследованных штаммов достигалась при двух и восьми кратном разведении, что составляло от 50 до 12,5% от исходной КЖ, а предельная адсорбция при 8-512 кратном разведении или 12,5-0,2% КЖ.

Анализ полученных значений ККМ и предельной адсорбции показал, что на среде с глицерином концентрация ПАВ такова, что образование мицелл и сгущение максимального количества растворенного поверхностно-активного вещества на границе раздела двух фаз, происходит при большем разбавлении культуральной жидкости, чем на среде с крахмалом и глюкозой. В свою очередь на среде с крахмалом точки ККМ и предельной адсорбции, в культуральной жидкости соответствуют такому же или большему разбавлению, чем на глюкозе.

Таким образом, можно сделать вывод, что, продукция биоПАВ в среде с крахмалом по абсолютным показателям хотя и выше, чем на двух других источниках углерода , однако полученные результаты по концентрации сурфак-тантов, на основе анализа данных точки ККМ , не столь однозначны. По-видимому, при культивировании на глицерине у исследованных штаммов бацилл концентрация биоПАВ в среде выше, и поэтому поверхностное натяжение в точке ККМ имеет меньшее значение, чем на двух других источниках углерода.

По литературным данным эффективными источниками углерода для получения биоПАВ, и в частности сурфактина, являются сахара, такие как глюкоза, сахароза и фруктоза, тогда как глицерин существенно снижает их образование [Cooper D.G. et al. 1981, Sandrin С. et al.1990].

Однако наши исследования показали обратное, что при культивировании на глицерине концентрация биоПАВ в среде выше, чем на глюкозе, а при использовании крахмала большее число штаммов бацилл способно к продуцированию биоПАВ, чем на двух других источниках углерода.

На основании полученной точки ККМ и учитывая литературные данные, где величина ККМ сурфактина - поверхностно-активного вещества, образуемого некоторыми штаммами В. subtilis, составляет по разным источникам от 70 до 220 jiM, мы смогли рассчитать уровень продукции биоПАВ исследуемыми нами штаммами, что составляет 0,7-М ,7 г/л и соответствует уровню западных аналогов.

Исследуя физико-химическую характеристики биоПАВ, было показано, что штаммы бациллы при культивировании на питательных средах выделяют продукты метаболизма, проявляющие поверхностно-активные свойства, которые не теряют своей активности после тепловой обработки при температуре 100С°С и 30 мин экспозиции. При этом источник углерода при культивировании не оказывает никакого влияния не термостабильные свойства биоПАВ.

Ранее термостабильность была обнаружена у биоэмульгаторов, продуцируемых дрожжами Candida lypolytica (липозан ,сохраняет активность в течение 1 ч при 70°С и теряет 60% активности за 1 ч при 100°С) [Cirigliano М.С., Carman G.M., 1984])) и бактериями Acinetobacter sp. АТСС 31012 (безбелковые апо-эмульсаны ,сохраняют активность в течение 2 ч при 100°С) [Gutnick D.L. et al., 1983])). Для продуцентов биоПАВ есть только одно сообщение, что липопеп-тид, выделяемый культурой В. amyloliquefaciens, сохраняет свои поверхностные свойства при инкубировании в течение 30 минут при 100°С [Yu G.Y. et al, 2002].

Таким образом, исследованные нами биоПАВ, продуцируемые бациллами, по термостабильным свойствам не уступают другим биосурфактантам микробного происхождения.

Полученные нами биоПАВ могут сохранять свою активность длительное время. Поверхностно активные свойства культуральной жидкости у исследуемых штаммов на крахмале сохраняются до 1-2 месяцев, а у некоторых культур в течении 5-7 месяцев, тогда как на глицерине и глюкозе от 2 недель и не более месяца. На всех трех источниках углерода сохраняют поверхностную активность в культуральной жидкости до 2 месяцев только штаммы В. subtilis ИБ-17, ИБ-18 и ИБ-19.

Биостабильность биоПАВ в культуральной жидкости в смеси с пластовой водой (1:1) сохраняет штамм В. subtilis ИБ-18 в течении 100 суток, тогда как штаммы В. subtilis ИБ-17 и В. subtilis ИБ-19 не более 30-37 суток. Для сравнения, по имеющимся у нас данным, только липопептидный биоПАВ итурин, выделенный из культуры В. amyloliguefacies, сохранял свои поверхностные свойства при хранении в течение 2 месяцев [Yu G.Y. et al, 2002].

Для изучения химической природы поверхностно — активных веществ, продуцируемых штаммом В. subtilis ИБ-17, провели выделение и очистку биоПАВ из культуральной жидкости.

Результаты элементного состава выделенного продукта показали, что это вещество оказалось близким к известному в литературе биоПАВ - сурфактину, представляющему собой гомологичную смесь циклических пептидов.

ИК - спектр выделенного нами биоПАВ показал наличие пептидных связей - поглощение в области 1648 см"1, аминогрупп (1568 см"1), карбоксильных групп (1420 см"1), колебания О - Н и N - Н связей отражены поглощениями при 3052 и 3412 см'1 , что соответствует -СО - NH- и -N - Н- группам. Полученные результаты позволяют предположить липопротеидную природу исследуемого биоПАВ.

Тонкослойная хроматография выделенного продукта и сертифицированного образца сурфактина фирмы Sigma в качестве стандарта установила совпадение Rf сурфактина и одного из компонентов исследуемого биоПАВ.

Высокоэффективная жидкостная обратнофазовая хроматография очищенного образца биоПАВ показала, что он представляет собой сложную смесь веществ. Было выделено шесть фракций. Изучение аминокислотного состава фракций позволило установить, что в пяти из них соотношение Лейцина, Вали-на, Аспарагиновой и Глутаминовой кислот соответствует описанному в сур-фактине и составляет 4:1:1:1.

Очередным подтверждением содержания сурфактина в полученном образце биоПАВ оказались данные масспектрометрического анализа. Были обнаружены вещества с массой 1045 и 1059 Да, которые соответствуют трем изо-формам Сн-сурфактина и четырем изоформам С^-сурфактина.

Таким образом, проведенные исследования с высокой долей вероятности свидетельствуют о том, что биоПАВ выделенные из культуры В. subtilis ИБ-17, содержат сурфактины.

Известно, что сурфактины обладают множественной биологической активностью, так они обладают избирательной антигрибной активностью, в частности, они не угнетают рост аскомицетов Sacharomyces cerevisia в противоположность другому липопептиду бацилл - итурину [Feignier С. et al., 1995], а так же являются сильными ингибиторами сгущения фибрина и вызывают лизиро-вание эритроцитов, сферополастов и протопластов некоторых видов бактерий [Volpon L. et al., 2000]. Поэтому, в дополнение к физико-химическим свойствам, характеризующим биоПАВ В. subtilis ИБ-17 как сурфактин, нами были проведены некоторые тесты в отношении их биологической активности на гемолиз эритроцитов и на антигрибную активность.

Мы изучали антигрибную активность, проявляемую исходным очищенным препаратом биоПАВ В. subtilis ИБ-17 и отдельных его фракций, разделенных методом препаративной ВЭЖХ, на аскомицет и некоторые мицелиальные грибы: Drechslern sorokiniana, Fusarium gibbosum, F. sambucinum и Pénicillium variabile.

Было показано, что культура В. subtilis ИБ-17 подавляет только два тестируемых организма - D. sorokiniana и Р. variabile.

Для дальнейших исследований были взяты грибы D. sorokiniana и Р. variabile, которые подавляются метаболитами В. subtilis ИБ-17 и культура S. cerevisia - устойчивая к действию метаболитов. Методом лунок, мы анализировали очищенный препарат сурфактина В. subtilis ИБ-17 и отдельные его фракции, разделенных с помощью ВЖХ к этим культурам.

В проведенных исследованиях (табл. 7), как и ожидалось ингибирования роста дрожжей 5. сегегшд обнаружено не было, но в то же время мы не наблюдали подавления мицеллиального гриба Р. уапаЬПе во всех исследованных концентрациях вещества.

Проведенные тесты на антигрибную и гемолитическую активность показали наибольшую активность исходного препарата. Активность отсутствует в первой, второй и третьей фракциях, разделенных методом препаративной ВЭЖХ, и начинает проявляться в четвертой и последующих (табл. 7), возрастая с увеличением длины гидрофобной части молекулы сурфактина. При этом кинетика гемолиза эритроцитов в растворе зависит от концентрации сурфактина (рис. 7.2). Это позволяет говорить о схожести механизмов антигрибного и гемолитического действия сурфактина, обусловленного взаимодействием с мембранами эритроцитов и/или грибных клеток.

Таким образом, исследования физико-химических свойств, структуры и биологической активности биоПАВ, выделенных из культуры В. зиЫШя ИБ-17, свидетельствуют о том, что они, в основном, содержат сурфактины.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Яковлева, Ольга Валерьевна, Уфа

1. Абрамзон А. А. Поверхностно-активные вещества. Справочник./ А. А. Абрамзон, В. В.Бочаров, Г. М. Гаевский и др. - Л.: Химия, 1979. - 376 с.

2. Абрамзон А. А. Поверхностно-активные вещества / А. А. Абрамзон, Л. П. Зайченко, И. Файнгольд. - Л.: Химия, 1988. - 200 с.

3. Адам Н. К. Физика и химия поверхностей / Н.К. Адам. - М.-Л.: ГИИЗ Технико - теоретический литературы, 1947. - 552 с.

4. Безбородов А. М. Биология продуктов микробного синтеза / А. М. Безбородов. - М. - Агропромиздат, 1991. - 238 с.

5. Блоховская В. А, Физико-химические свойства препаратов полимик- сана, полученных из различных штаммов Bacillus polymyxa / В. А, Блоховская, Р. И. Гвоздяк, К. Воцелко и др. // Микробиологический журнал. - 1993. - № 2. - 27-34.

6. Вайсбергер А. Физические методы органической химии. Справочник. / ^ А. Вайсбергер - М.: Иностранная литература, 1950. - Т 1. - 170-203.

7. Ганиткевич Я. В. Поверхностно-активные вещества микробного происхождения / Я. В. Ганиткевич // Биотехнология. - 1988. - № 5. - 575-583.

8. Гвоздяк П. И. Использование бактерий для отделения нефти от твердых частиц / П. И. Гвоздяк, Н. И. Подорван Н. П. Гвоздяк // Микробиологический журнал. - 1990. - № 5. - 38-42.

9. Герхард Ф. Методы общей бактериологии. / Под. ред. Герхард Ф и др. - М..: Мир, 1984. - Т 2. - 472 с.

10. Гринберг Т. А. Некоторые свойства полисахарида, синтезируемого щ культурой Acinetohacter sp. / Т. А. Гринберг, В. В. Дерябин, Н. В. Краснопевцева и др.// Микробиологический журнал. - 1987. — № 4. -С. 24-30.

11. Гринберг Т. А. Биополимеры, используемые для увеличения нефтеот- ^ дачи пластов / Т. А. Гринберг, Т. П.Пирог, А. М. Полищук и др. // Микробиологический журнал. - 1990. - № 2. - 100-112.

12. Егоров Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. Пособие. / Под. ред. Н. Егоров - 2 е. Изд. - М.: МГУ, 1983.-215 с.

13. Елисеев А. Особенности биосинтеза поверхностно-активных липи- • дов культурой Bacillus sp / А. Елисеев, А. П. Шульга, Е. В. Карпенко // Микробиологический журнал. - 1990. - № 3. - 41-44.

14. Елисеев А. Поверхностно-активные вещества и биотехнология / А. Елисеев, Р. В. Кучер. - Киев: Наукова думка, 1991. - 116 с.

15. Елисеев А. Нефтеотмывающий биоэмульгатор, образуемый Bacillus species / А. Елисеев, Р. И. Вильданов-Марцишин, А. Н. Шульга и др. // Микробиологический журнал. - 1992. - № 6. - 61-66.

16. Карпенко Е. В. Поверхностно-активные соединения культуры Pseu- domonas sp. S-27 / E. В. Карпенко, A. Н. Шульга, Н. Щеглова и др. // Микробиологический журнал. - 1996. - № 5. - 18-24.

17. Кислухина О. В. Определение способности микроорганизмов диспергировать нефтепродукты / О. В., Кислухина О. Ж. Хамроев, Г. Н. Морщакова и др. // Экология. - 1993. - № 3. - 81-84.

18. Козаренко Т. Д. Ионообменная хроматография аминокислот. / Т. Д. Козаренко, Н. Зуев, Н. Ф. Муляр. - Новосибирск.: Наука, 1981. -160 с.

19. Коронелли Т. В. Роль эмульгирования в процессе поглощения углеводородов клетками Pseudomonas aeruginosa / Т. В. Коронелли, Т. И. Комарова, А. В. Игнатченко // Микробиология. - 1983. - № 1. - 94-97.

20. Кучер Р. В. Поверхностно-активные пептидолипиды культуры Bacillus species С-14 / P. В. Кучер, А. Н. Шульга, А. Елисеев и др. // Доклады АН УССР Серия Биологические, геологические и химические науки. -1990.-№9.-С. 40-42.

21. Лабинская А. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А. Лабинская. - 4-е изд. - М.: Медицина, 1978. - 392 с.

22. Лесык О. Ю. Поверхностно-активные и эмульгирующие свойства культуры Candida lipolytica Y-917 при росте на н-гексадекане / О. Ю Лесык., Е. В. Карпенко, А. Елисеев и др. // Микробиологический журнал. - 1989. - № 6. - 56-59.

23. Матышевская М. Биополимер, продуцируемый бактериями рода Xanthomonas, и его использование в нефтяной промышленности / М. Матышевская, Р. И. Гвоздяк, И. И. Майко и др. // Микробиологический журнал. - 1979. - № 1 88-92. *

24. Мелентьев А. И., Еркеев А. М. Изучение антагонизма между почвен- Ф ными грибами и микромицетами род Fusarium Lk:Fr/ А. И. Мелентьев, А. М. Еркеев // Микробиол. журн. - 1990. - № 1. - 53-56.

25. Павленко Н. И. Эмульгирующая активность углеводородусваивающих микроорганизмов / Н. И. Павленко, Л. М. Хенкина, 3. Т. Бега // Микробиологический журнал. - 1994. - № 1. - 90-91.

26. Панич Р. М. Практикум по коллоидной химии и электронной микроскопии / Р. М. Панич, Воюцкий, Н. Н. Иванова и др. - М.: Химия, 1974. - 224 с.

27. Пирог Т. П. Эмульсан - представитель нового типа промышленно важных внеклеточных биополимеров / Т. П. Пирог, Т. А. Гринберг, В. В, Дерябин и др. // Биотехнология. - 1990. - №4. - 3-6.

28. Поиск и идентификация бактерий-антагонистов возбудителей корневых гнилей сельскохозяйственных растений: Отчет о НИР (Закл.) / Институт Биологии БНЦ УрО АН СССР; Руководитель А.И. Мелентьев. -№ ГР 0189. 0916126. - Уфа, 1991. - 63 с.

29. Сеги И. Методы почвенной микробиологии / Пер. И. Ф. Куренного; • под ред. Г.С. Муромцева. - М.: Колос, 1983.- 296 с.

30. Стабникова Е. В.Использование биогенных поверхностно-активных веществ в микробиологической очистке почвы от углеводородов нефти / Е. В. Стабникова, М. В. Московченко, К. Т. Иванов и др. // Микробиологический журнал. - 1993. - № 1. - 75-78.

31. Теппер Е. 3. Практикум по микробиологии / Е. 3. Теппер, В. К. Шиль- шикова, Г. И. Переверзева. - М.: Колос, 1987. - 238 с.

32. Турковская О. В. Штамм Р Pseudomonas aeruginosa - продуцент био- ПАВ / О. В. Турковская, Т. В. Дмитриева, А. Ю. Муратова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. - №1. - 80-85.

33. Шульга А. Н. Биоэмульгатор, образуемый культурой Bacillus species и его свойства / А. Н. Шульга, А. Елисеев, Е. В. Карпенко и др. // Микробиологический журнал. - 1991. - № 5. - 78-82.

34. Шульга А. Н. Метод определения содержания аниогенных поверхностно-активных пептидолипидов бактериального происхождения / А. Н. Шульга, Е. В. Карпенко, А. Елисеев и др. // Микробиологический журнал.-1993-№ 1.-С. 85-88.

35. Ahimou F. Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hy- drophobicity / F. Ahimou, P. Jacgues, M. Deleu // Enzyme and Microbial * Technology. - 2000. - № 6. - P. 749-754.

36. Akihiro O. Production of lipopeptide antibiotic surfactin with recombinant Bacillus subtilis I O. Akihiro, A. Takashi, S. Makoto // Biotechnology Letters. - 1992. - № 12. - P. 1165-1168.

37. Akihiro O. Production of lipopeptide antibiotic surfactin, by recombinant Bacillus subtilis in solid state fermentation / O. Akihiro, A. Takashi, S. Makoto // Biotechnology and Bioengineering. - 1995. - № 3. - P. 209-2014.

38. Baumgart F. Identification of amino Acid substitutions in the lipopeptide surfactin using 2D NMR spectroscopy / F. Baumgart, B. Kluge, C. Ullrich et. al. // Biochem. Biophis. Res. Commun. - 1991. - №. 7. - P. 998-1005.

39. Besson F. Action of antifungal peptidolipids from Bacillus subtilis on the cell membrane Saccharomyces cereuisiae / F. Besson, F. Peypoyx, M. J. Quentin et. al. // J. Antibiot. - 1984. - № 7. - P. 172-177.

40. Bortolano M. Inhibition of alcane phosphatase by surfactin, a natural chelating lipopeptide from Bacillus subtilis IM. Bortolano, F. Besson, B. Roux // Biotechnology Letters. - 1997. - № 5. - P. 433-435.

41. Busscher H. J. Biosufactants production by thermophilic dairy streptococci / H. J. Busscher, T. R. Neu, H. С van der Mei // Appl. Microbiol.and Bio-technol. - 1994. - № 1 - P. 4-7.

42. Calvo C. Surfactant activity of a naphtalene degrading Bacillus pumilus strain isolated from oil sluge / С Calvo, F.L.Toledo, J. Gonzales-Lopes // J. Biotechnol. - 2004. - № 9. - P. 269-276.

43. Carrera P. Unated States Patent, № 5277294Method of producing surfactin with the use of mutant of Bacillus subtilis I P. Carrera, P. Cosmina, G. Grandietal.//,Jul, 13,1993.

44. Cirigliano M. C. Isolation of a bioemulsifier from Candida lipolytica I M. C. Cirigliano, G ,M. Carman //.Appl Environ Microbiol. - 1984. - № 10. -P. 747-750.

45. Clark G. В. Impact of oil shortage on plastic medical supplies / G. B. Clark, B. Kline // Public Health Rep. - 1981. - № 2. - P. 111 -115.

46. Cooper D, G. Torulopsis petrophillum and surface activity / D. Cooper, D. Paddock // Appl. Environ. Microbiol.- 1983. - № 6. - P. 1426-1429.

47. Cooper D. G. Surface-Active Agents from two Bacillus species / D. G. Cooper, B. G. Goldenberg // Applied and Environmental Microbiology. -1987. -№2.-P . 224-229.

48. Davis D. A. The application of foaming rof the recovery of Surfactin from B. subtilis ATCC 21332 cultures / D. A. Davis, H. С Lynch, J. Valery // Enzyme Microb Technol. - 2002. - № 4. - P. 346-354.

49. Desai J. D. Microbial surfactants: evalution, types, production and fiiture applications / J, D. Desai // Journal of Scientific & Industrial Research. -1987.-№10.-P. 440-449.

50. Desai A. I. Emulsifier production by Pseudomonas Jluorescens during the growing on hydrocarbons / A. I. Desai, K. M. Patel, I. D. Desai // Curr. Sci. - 1988.-№ 7 . -P . 500-501.

51. Desai A. I. Advances in the production of biosurfactants and their commercial applications / A. I. Desai, K. M. Patel, I. D. Desai // J. Sci. and Ind. Res . -1994.-№8.-P. 619-621.

52. Desai J. D. Microbial Production of surfactants and Tier Commercial Potential / Jitendra D. Desai, Ibrahim M. Banat // Microbiology and Molecular Biology Reveiws. - 1997. - J^ s 3. - P. 47-64.

54. Donaldson E. C. Microbiology for enhanced oil recovery / E. C. Donaldson // Erdol. And Kohle-Erdgas Petrochem. - 1984. - № 4. - P.245-248.

55. Feigner Studies on Upopeptide biosynthesis by Bacillus subtilis: Isolation and characterization of iturin", surfactin^ mutants / С Feigner, F. Besson, G.Michel // FEMS Microbiology Letters. - 1995. - № 1. - P. 11-15.

56. Feignier C. Characterization of iturin synthetase in the wild-tupe Bacillus subtilis strain producting iturin and in an iturin deficient mutant / C. Feignier, F. Besson, G. Michel // FEMS Microbiology Letters. - 1996. - № 1. -P.l 17-122.

57. Guerra-Santos L. Pseudomonas aeroginosa Biosurfactant production in Continuous Culture with Glucose as Carbon Source / Luis Guerra-Santos, Othmar КафреИ, Armin Fiechter // Applied and Environmental Microbiol-Ф ogy.-1984.-№ 4 P. 301-305.

58. Gutnic D. L. Biosurfactants and the oil industry/ D. Gutnic // Biotech 84: Word Biotech Rept. 1984 Prog. Conf. may 1984. - London, 1984. - P. 645-653.

59. Gutnick D. L. Perspectives of microbial surfactants / D. L Gutnick, W. Mi- nas // Biochemical Society Transactions. - 1987. - № 8. - P. 22-35

60. Не Н. Circulocins, new antibacterial lipopeptides from Bacillus circulans, J2154 / H. He, B. Chen, J. Korshalla et. al. // Tetrahedron. - 2001. - №.11. - P . 1189-1195.

61. Heerklotz H. Detergent-like action of the antibiotic peptide surfactin on lipid membranes / H. Heerklotz, J. Seelig // Biophysical Journal. - 2001. -№ 9 . - P . 1547-1554.

62. Henriksen A. Cyclic lipoundecapeptide tensin from Pseudomonas fluores- cens strain 96.578 / A. Henriksen, U. Anthoni, T. H.Nielsen // Acta Crys-ta l logrC. -1999. -№l . -P . 113-115.

63. Hiraoka H. Characterization oiBacillus subtilis RBI4, coproducer of peptide antibiotics iturin A and surfactin / H. Hiraoka, O. Aska, T. Ano et al. // J Gen. Appl. Microbiol. - 1992. - >Го 6. - P. 635-640.

64. Horowitz S. Isolation and characterization of surfactant produced by Bacillus licheniformis 86 / S. Horowitz, J. N. Gilbert, W. M. Grifin // J Ind. Microbiol. - 1990. - № 6. - P. 243-248.

65. Horowitz S. Structural analysis of Bacillus licheniformis 86 surfactant / S. Horowitz, W.M. Griffin // J. Ind. Microbiol. - 1991. - №2-3. - P. 45-52.

66. Hsieh F. C. Rapid detection and characterization of surfactin-producing Bacillus subtilis and closely related species based on PCR / F. C. Hsieh, M. C. 1.i, T. С Lin // Curr Microbiol. - 2004. - № 9. - P. 186-191.

67. Imai Y. Hypocholesterolemic effect of surfactin, a novel bacterial peptide- lipid/ Y. Imai, H. Sugino, Takeshi F. //, Journal of the Takeda Research 1.aboratories. - 1971. - № 4. - P.728-734.

68. Javaheri M. Anaerobic production of a biosurfactant by Bacillus licheniformis JF-2 / M. Javaheri, G. E. Jenneman, M. J. Mclnemey et al. // Applied and Environmental Microbiology. - 1985. - № 9. - P. 5320-5323.

69. Jenny K. Biosurfactants from Bacillus licheniformis'. structural analysis and characterization / K. Jenny, O. Kappeli, A. Fiechter // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1991.-№ 1.-P. 5-13.

70. Kalinovskaya N. I Characterization of surfactin-like cyclic depsipeptides synthesized by Bacillus pumilus from ascidian Halocynthia aurantium / N. I. Kalinovskaya, T. A. Kuznetsova, E. P. Ivanova et al. // Biotechnol. -2002.-J^o5.-P. 179-88.

71. Kim H. S. Production and properties of a lipopeptide biosurfactant from Bacillus subtilis C9 / H. S. Kim, B. D. Yoon, C. H. Lee et al. // J. Fennent Bioeng. - 1997. - № 8. - P. 41-46.

72. Kikuchi T. Enhancement of plasminogen activation by surfactin C: augmentation of fibrinoiusis in vitro and in vivo / T. Kikuchi, K. Hasumi // BBA - Proteins and Proteomics. - 2002. - № 2. - P. 234-245.

73. Kowall M. Separation and characterisation of surfactin isoforms produced by Bacillus subtilis OKB 105. / M. Kowall, J. Vater, B. Kluge et all. // Jor-nal of colloid and interface science. - 1998. - № 4. - P. 1-8.

74. Kluge B. Studies on the biosynthesis of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis ATCC 21332 / B. Kluge, J. Vater, J. Salnikov et al // Febs Letters. - 1988. - № 1. - P. 107-110.

75. Kracht M. Antiviral and hemolytic activities of surfactin isoforms and their methyl ester derivatives / M. Kracht, M. Rokos H., M. Ozel et al. // Appl Biochem Biotechnol. - 2001. - № 3. P. 199-210.

76. Latoud С Interactions of antibiotics of the iturin group with human erythrocytes / С Latoud, F. Peypoyx, G. Michel et. al. // Biochim. Biophys. Acta. - 1986. - № 6. - P. 526-535.

77. Latoud C. Action of iturin A on membrane vesicles from Saccharomyces cereuisiae: activation of phospholipases A and В activities by picomolar amounts of iturin A / С Latoud, F. Peypoyx, G. Michel // J. Antibiot. -1988.-№11.-P. 1699-1700.

78. Latoud Interaction of iturin A, a lipopeptide antibiotic, with Streptococcus cereuisiae cells: influence of the sterol membrane composition / C, Latoud, F. Peypoyx, G. Michel // Can. J. Microbiol. - 1990. - № 6. - P. 384-389.

79. Lin S. C. Production and Deactivation of Biosurfactant by Bacillus licheni- formis JF-2. / S. С Lin., M. M. Sharma, G. Georiou. // Biotechnology Program. - 1993.-№ 9 . -P . 138-145.

80. Macdonald C. R. Surface-Active Lipids From Nocardia Erythropolis Grown on Hydrocarbons / C. R. Macdonald, D. G. Cooper, J. E. Zajic // Applied and Environmental Microbiology. - 1981. - № 1. - P. 117-123.

81. Maget-Dana R. Pore-forming properties of iturin A, a lipopeptide antibiotic / R. Maget-Dana, M. Ptak, F. Peypoux et. al. // Biochimica et Biopysica Acta. - 1985. - № 10. - P. 405-409.

82. Maget-Dana R. Surfactin / iturin A interactions may explain the synergistic effect of surfactin on the biological properties of iturin A / R. Maget-Dana, 1.. Thimon, F. Peypoux et al. // Biochimie. - 1992. - № 10. - P. 1047-1051.

83. Maget-Dana R. Iturins, a special class of poreforming lipopeptides: biological and physicochemical properties / R. Maget-Dana, F. Peypoyx // Toxicology. - 1994.-№ 7. -P . 151-174.

84. Mant C. T. Hydrophilic interaction /cation-exchange chromatography for separation of cyclic peptides // Journal of Chromatography. - 1998. - № 6. - P . 79-88.

85. Mclnemey M. J. Properties of the biosurfactant produced by Bacillus li- cheniformis strain JF-2 / M. J. Mclnemey, M. Javaheri, D. P. Nagle Jr // J. Ind. Micribiol. - 1990. - № 5. - P. 95-102.

86. Mikkola R. Bacillus amyloliquefaciens strains isolated from moisture- damaged buildings produced surfactin and a substance toxic to mammalian cells / R. Mikkola, M. A. Andersson, P. Grigoriev et al. // Arch Microbiol. -2004 . -№4. -P . 314-323.

87. Morikawa M. Isolation of a new surfactin producer Bacillus pumilus A-1, and cloning and nucleotide sequence of the regulator gene, psf-lJ / M. Morikawa, M. Ito, T. Imanaka // Ferment. Bioeng. - 1992. - № 4. - P. 255-261. Il l

88. Moyne A.-L. Bacillomycin D: an iturin with antifungal activity against Aspergillus flavus / A.-L. Moyne, R. Shelby, T. E. Cleveland et. al. // Journal of Applied Microbiology. - 2001. - № 1. - P. 622-629.

89. Mulligan С N. Enhanced biosurfactant production by a mutant Bacillus subtilis strain / С N. Mulligan, T. Y-K. Chow., B. F. Gibbs // Appl Microbiol. Biotechnol. - 1989. - № 5. - P. 486-489.

90. Mulligan С N. Recovery of biosurfactants by ultrafiltration / C. N. Mulligan, B. F. Gibbs // J Chem Technol Biotecnol. - 1990. - № 1. - P. 23-29.

91. Nakano M. M. Identification of genetic locus required for biosynthesis of the lipopeptide antibiotic surfactin in Bacillus subtilis I M. M. Nakano, M. A. Makahel, P. Zuber // Journal of Bacteriology. - 1988. - № 12. - P. 5662-5668.

92. Nakayama S. Isolation of new variants of surfactin by recombinant Bacillus subtilis I S. Nakayama, S. Takahashi, M. Hirai et al // Appl Microbiol Biotechnol/ - 1997. - № 8. - P. 80-82.

93. Naruse N. Pumilacidin, a complex of new antiviral antibiotics. Production, isolation, chemical properties, structure and biological activity / N. Naruse, O.Tenmyo, S. Kobaru et al. // J Antibiot. - 1990. - № 3 P. 267-280.

94. Navon-Venezia S. Alasan, a new bioemulsifer from et al. Acinetobacter ra- dioresistens II S. Navon-Venezia, Z. Zosim, A. Gottlieb et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - № 1. - P. 3240-3244.

95. Navon-Venezia S. The bioemulsifer alasan: role of protein in maintaining structure and activity/ S. Navon-Venezia, E. Banin, E. Z. Ron et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1998. - № 9. - P. 382-384.

96. Nitschke М. Biosurfactant production by Bacillus subtilis using cassava- processing effluent / M. Nitschke, G. M. Pastore // Appl Biochem Biotech-nol. -2004. - № 3. - P . 163-172.

97. Ochno A. Production of a lipopeptideantibiotic, surfactin, by recombinant Bacillus subtilis in solid stste fermentation / A. Ochno, T. Ano, M. Shoda // Biotechnology and Bioengeniring. - 1995. - № 4. - P. 209-214.

98. Orwa J. A. Isolation and structural characterization of polymyxin В components / J. A. Orwa, C. Govaerts, R. Busson et al. // Journal of Chromatography. -2001. - № 12. - P . 369-373.

99. Peypoux F. Structure de la mycosubtiline, antibiotique isole de Bacillus subtilis I F. Peypoux, G. Michel, L. Delcambe // Eur.J.Biochem. - 1976. -№ 3 . - P . 391-398.

100. Peypoux F. Structure of iturin A, a peptidolipid antibiotic from Bacillus subtilis IF. Peypoux, G. Guinand, G. Michel et. al. // Biochemistry. - 1978. - № 7 . -P . 3992-3996.

101. Peypoux F. Structures of bacillomycin D and bacillomycin L peptidolopid antibiotics from Bacillus subtilis IF. Peypoux, M.-T. Pommier, B.C. Das et. al. //LAntibiot. - 1984. - № 7. - P . 1600-1604.

102. Peypoyx F. Controlled biosynthesis of Val-17.-and [Leu-7] surfactins / F. Peypoyx, G. Michel // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1992. - № 6. - P. 515-517.

103. Peypoux F. Ala4. surfactin, a nowel isoform from Bacillus subtilis studied by mass and NMR spectroscopies / F. Peypoux, J.-M. Bonmatin, H. Labbe et al. //Eur. J. Biochem. - 1994. - № 1. - P. 89-96.

104. Peypoyx F. Resent tends in the biochemistry of surfactin / F. Peypoyx, J. M. Bonmatin, J. Wallach // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - № 1. - P. 533-563.

105. Quentin M. J. Action of peptidolipidic antibiotics of the iturin group on erythrocytes. Effect of some lipids on hemolyses / M. J. Quentin, F. Besson, F. Peypoyx et. al. // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. - № 4. - P. 207-2011.

106. Razafindralambo H. Contribution to the study of surface-active properties of Bacillus subtilis lipopeptides / H. Razafindralambo // Biotechnology Agronomy Society and Environment, - 1996. - № 2. - P. 201-205.

107. Ron E. Z. Natural roles of biosurfactants / E. Z. Ron, E. Rosenberg // Environmental Microbiology. - 2001. - № 3. - P. 229-236.

108. Roubin M. R. Gibbs B. F. Correlation of enhanced surfactin production with decreased isocitrate dehydrogenase / M. R. de Roubin, C. N. Mulligan, B. F. Gibbs // Can J Microbiol. - 1989. - № 5. - P.853-859.

109. Sandrin C. Coproduction of surfactin and iturin A, lipopeptides with surfactant and antifungal properties, by Bacillus subtilis I C. Sandrin, F. Peypoyx, G.Michel // Biotechnol. Appl. Biochem. - 1990. - № 12. - P. 370-375.

110. Sarkar A. K. A critical evaluation of major processes / A. K. Sarkar, J. C. Goursaud, M. M. Sharma et al. // In situ. - 1989. - № 4. - P. 207-238.

111. Schaller K. D. Characterization of surfactin from Bacillus subtilis for application as an agent for enhanced oil recovery / K. D. Schaller, S. L. Fox, D. F. Bruhn // Appl Biochem Biotechnol. - 2004. - № 6. - P. 827-836.

112. Sheppard J. D. The production of surfactin by Bacillus subtilis grown on peat hydrolisate / J. D. Sheppard, C. N. Mulligan // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1987. - № 10. - P. 110-116.

113. Sheppard J. D. Development of computerized feedback control for the continuous phasing of Bacillus subtilis I J. D. Sheppard, D.G. Cooper // Biotechnology and Bioengineering. - 1990. - № 6. - P. 539-545.

114. Sheppard J. D. The response oi Bacillus subtilis ATCC 21332 to manganese during continuous-phased growth / J. D. Sheppard, D. G. Cooper // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1991. - № 5, _ p. 72-76.

115. Sorensen D. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73 / D. Sorensen, Т.Н. Nielsen, C. Christophersen et. al. // Acta Cryst, Section С - 2001. - № 10. - P. 1123-1124.

116. Thimon L. Effect of the lipopeptide antibiotic, iturin A, on moфhology and membrane ultrastructure of yeast cells / L. Thimon, F. Peypoux, J. Wallach et al. //FEMS Microbiology Letters. - 1985. - № 3. - P. 101-106.

117. Thimon L. Effect of iturin A, a lipopeptide from Bacillus subtilis on morphology and ultrastructure of human erythrocytes / L.Thimon, F. Peypoyx, J. M. Exbrayat et. al. // Cytobios. - 1994. - № 9. - P. 69-83.

118. Toraya T. Purification and structural determination of inhibitor of starfish oocyte maturation from a Bacillus subtilis I T. Toraya, T. Maoka, H. Tsuji et. al. // Applied and Environmental Microbiology. - 1995. - № 5. - P. 1799-1804.

119. Toren A. Emulsifying activity of purified alasan proteins fi-om Acinetobac- ter radioresistens I A. Toren, S. Navon-Venezia, E. Z. Ron et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - № 7. - P. 1102-1106/

120. Toure Y. Role of lipopeptides produced by Bacillus subtilis GAl in the reduction of grey mould disease caused by Botrytis cinerea on apple / Y. Toure, M. Ongena, P. Jacques //J Appl Microbiol. - 2004. - № 5. - P. 1151-1160.

121. Tsuge K. Characterization of Bacillus subtilis YB8, coproducer of lipopeptides surfactin and plipastatin Bl / K. Tsuge, T. Ano, M. Shoda // J Gen. Appl. Microbiol. - 1995. - № 5. - P. 541-545.

122. Tsukagoshi N. A novel protoplast-bursting factor (surfactin) abtainel fi-om Bacillus subtilis JAM '1213 // Biochimica et Biophysica Acta. - 1970. - № 6 . -P . 204-210.

123. Ullrich С Cell-fi-ee biosynthesis of surfactin, a cyclic lipopeptide produced by Bacillus subtilis I С Ullrich, Biochemistry. - 1991. - № 3. - P. 6503-6508.

124. Vanittanakom N. Fengycin - a novel antifungal lipopeptide antibiotic produced by Bacillus subtilis F-29-3 / N. Vanittanakom, W. Loeffler, U. Koch et al. // J.Antibiot. - 1986. - №. 9. - P. 888-901.

125. Vater J. Lipopeptides, an attractive class of microbial surfactants / J. Vater // Prog. Colloid Polymer Sci. - 1986. - № 7. - P. 12-18.

126. Vollenbroich D. Mechanism of inactivation of enveloped viruses by the biosurfactant surfactin fi:om Bacillus subtilis I D. Vollenbroich, M. Ozel, J. Vater et al. // Biologicals. - 1997. - № 3. - P. 289-297.

127. Vollenbroich D. Antimycoplasma properties and application in cell culture of surfactin, a lipopeptide antibiotic from Bacillus subtilis I D. Vollenbroich, G. Pauli, M. Ozel et al. // Appl Environ Microbiol. - 1998. - № 1. -P. 44-49.

128. Volpon L. NMR structure of active and inactive and inactive forms of the sterol-dependent antifungal antibiotic bacillomycin L / L. Volpon, F. Besson, J-M. Lancelin // Eur. J. Biochem. - 1999. - № 6. - P. 200-210.

129. Volpon L. NMR structure of antibiotics plipastatins A and В from Bacillus subtilis inhibitors of pospholipase A2 / L. Volpon, F. Besson, J-M. Lancelin // FEBS Letters. - 2000. - № 10. - P. 76-80.

130. Wagner F. Strategies for biosurfactant production / F. Wagner // Amer. oil Chem. Soc.-1987.-№9.-P. 12-55.

131. Weil Y. H. Identification of Induced acidification in iron- enriched cultures of Bacillus subtilis during biosurfactant fermentation / Y. H. Weil, L. F. Wang, J. S. Chang et al. // Journal of Bioscience and Bioengineering. -2003.-№ 2 . -P . 174-178.

132. Yakimov М. М. Structural characterization of lichenisin A components by fast atom bombardment tandem mass spectrometry / M. M. Yakimov, W. R. Abraham, H. Meyer et al. // Biochim Biophys Acta. - 1999. - № 5. - P. 273-280.

133. Yakimov M. M. Recombinant acylheptapeptide lichenisin: high level of production by Bacillus subtilis cells / M. M. Yakimov, L. Giuliano, K. N. Timmis et al. // J Mol. Microbiol Biotechnol. 200. - № 2. - P. 217-224.

134. Yu G. Y. Production of iturin A by Bacillus amyloliguefacies suppressing Rhizoctonia solani I G. Y. Yu, J. B. Sinclair, B. L. Hartman et. al. // Soil Biology & Biotechnology. - 2002. - № 2. - P. 955-963.

135. Zajic J, E. Biosurfactant and surface phenomena associated with Corine- bacterium lepus I J. E. Zajic, D. G. Cooper, W. L. Cairns et all. // Adv. Biotechnol. Pore. 6 th.. Fermet. Symp. 20-25 Julu. 1980. - London (Canada), 1980.-P. 467-474.

136. Zajic J. E. Biosurfactants / J. E. Zajic, W. Seffems, // CRC Crit. Rev. Biotechnol. - 1984. - № 1. - P. 87-107.