Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства хитиназы Bacillus sp. 739 - антагониста фитопатогенных грибов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Актуганов, Глеб Эдуардович

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Реакции, катализируемые хитиназами.

1.2. Распространение и роль хитиназ в природе

1.3. Бактериальные продуценты хитиназ.

1.3.1. Природные источники продуцентов хитиназ.

1.3.2. Питательные среды и особенности биосинтеза хитиназы у видов Bacillus.

1.4. Выделение и свойства бактериальных хитиназ.

1.4.1. Способы выделения и очистки бактериальных хитиназ.

1.4.2. Специфичность и механизм действия хитиназ бактерий рода Bacillus.

1.4.3. Молекулярные характеристики хитиназ.

1.5. Проблема применения бактерий, образующих хитинолитические ферменты, для защиты сельскохозяйственных растений от болезней, вызываемых фитопатогенными грибами.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Микробиологические методы.

2.2.1. Условия поддержания и культивирования штамма Bacillus sp. 739.

2.2.2. Условия поддержания и культивирования фитопатогенных грибов.

2.2.3. Изучение влияния условий культивирования на биосинтез хитиназы Bacillus sp. 739.

2.3. Физико-химические и биохимические методы.

2.3.1. Получение коллоидного хитина.

2.3.2. Получение коллоидного хитозана.

2.3.3. Получение других источников углерода.

2.3.4. Измерение хитиназной активности.

2.3.5. Определение N-ацетилглюкозаминидазной активности.

2.3.6. Измерение хитозаназной активности.

2.3.7. Измерение р-1,3-глюканазной активности.

2.3.8. Определение концентрации белка.

2.3.9. Основные этапы выделения и очистки хитиназы

Bacillus sp. 739.

2.3.10.Изучение рН-профиля и pH-стабильности очищенной хитиназы.

2.3.11. Определение температурного оптимума и термостабильности препарата очищенной хитиназы.

2.3.12. Изучение влияния pH на термостабильность хитиназы Bacillus sp. 739.

2.3.13. Гель-электрофорез в денатурирующих условиях.

2.4. Методы изучения антигрибной и миколитической активности хитиназы Bacillus sp. 739.

2.5. Статистическая обработка результатов.

3. ОБРАЗОВАНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ХИТИНАЗЫ КУЛЬТУРОЙ

BACILLUS SP. 739.

3.1. Динамика процессов роста и секреции хитиназы Bacillus sp. 739.

3.2. Влияние источников углерода на биосинтез хитиназы Bacillus sp. 739.

3.2.1. Природа источника углерода.

3.2.2. Влияние концентрации хитина в среде.

3.2.3. Дополнительные источники углерода.

3.3. Источники азота и их влияние на выход хитиназы

Bacillus sp. 739.

3.4. Влияние начального pH среды и температуры культивирования на образование хитиназы Bacillus sp. 739.

4. ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ХИТИНАЗЫ BACILLUS SP. 739.

4.1. Очистка хитиназы Bacillus sp. 739.

4.2. Свойства хитиназы Bacillus sp. 739.

4.2.1 Характеристика физико-химических свойств препарата очищенной хитиназы Bacillus sp. 739.

4.2.2. Субстратная специфичность и механизм действия хитиназы Bacillus sp. 739.

4.2.3. Характер действия очищенной хитиназы 5ас/7/ш sp. на основной субстрат.

5. АНТИГРИБНАЯ АКТИВНОСТЬ ХИТИНАЗЫ BACILLUS SP. 739.

5.1. Антигрибное действие препаратов хитиназы Bacillus sp. в агаризованной питательной среде.

5.2. Влияние хитиназы на прорастание спор фитопатогенных грибов.

5.3. Влияние хитиназы Bacillus sp. 739 на радиальный рост колоний микромицетов.

5.4. Лизирующее действие хитиназы на грибной мицелий.

5.4.1. Визуальное наблюдение лизиса грибного мицелия.

5.4.2. Образование редуцирующих Сахаров в процессе литического действия хитиназы на мицелий грибов.

5.4.3. Изменение массы сухого вещества грибов в результате инкубации с хитиназой Bacillus sp. 739.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Свойства хитиназы Bacillus sp. 739 - антагониста фитопатогенных грибов"

К настоящему времени накоплен достаточно обширный материал о ферментах, гидролизующих хитин. При этом основная масса научных публикаций приходится на последние десятилетия. Интенсивные исследования хитиназ обусловлены, как минимум, двумя причинами. В первую очередь интерес вызывает проблема ферментативного гидролиза хитина и хитозана, поскольку в последнее время все более широкое практическое применение находят растворимые олигосахариды данных полимеров [8, 9, 67]. К тому же, механизм естественной ферментативной конверсии этого нерастворимого полисахарида в легкодоступные продукты является интересной теоретической проблемой [27]. Во-вторых, в хитинолитических ферментах и продуцирующих их микроорганизмах многие исследователи видят естественное и эффективное средство борьбы с разнообразными паразитическими грибами и беспозвоночными, у которых хитин является важным структурным компонентом клеточной стенки и экзоскелета [48, 50].

Актуальность темы. Бактериальные продуценты хитиназ, в том числе и аэробные спорообразующие бактерии, находят все более широкое применение как биологическая основа препаратов для защиты сельскохозяйственных растений от болезней [7, 50, 133]. Считается, что антагонизм бактерий рода Bacillus ко многим микроскопическим грибам обусловлен в первую очередь синтезом соединений антибиотической природы [23, 77]. Вместе с тем, доказано и участие комплекса литических ферментов, продуцируемых антагонистами, в разрушении клеточной стенки мицелиальных грибов [66, 106]. Важнейшими в этом комплексе ферментов являются хитиназы. Однако, в отличие от других микроорганизмов, бациллы и роль хитиназы в их антагонизме к грибам изучены недостаточно.

Цель работы. На примере исследуемого штамма, - типичного представителя аэробных спорообразующих бактерий и биологического начала препарата 6

Бациспецин БМ [17], выяснить роль образуемой им хитиназы в антагонизме Bacillus sp. 739 к мицелиальным грибам. В связи с этим, было необходимо более детально изучить свойства хитиназы Bacillus sp. 739, включая стандартные физико-химические характеристики фермента и его биологическую активность по отношению к отдельным видам фитопатогенных грибов. Другим направлением работы являлось изучение условий максимальной продукции хитиназы штаммом Bacillus sp. 739. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние условий культивирования на секрецию хитиназного комплекса музейным штаммом Bacillus sp. 739.

2. Провести очистку хитиназы, преобладающей в культуральной жидкости исследуемого штамма.

3. Исследовать физико-химические и биохимические свойства очищенного фермента.

4.Изучить воздействие препаратов сырой и очищенной хитиназы Bacillus sp. 739 на некоторые фитопатогенные грибы.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование, включающее изучение особенностей продукции хитиназы штаммом Bacillus sp. 739 и свойств самого фермента. Впервые для бацилл проведено подробное исследование влияния препаратов очищенной хитиназы на развитие некоторых фитопатогенных грибов. Показана неспособность высокоочищенного фермента ин-гибировать рост и развитие грибов in vitro при сохранении миколитической активности.

Установлена множественность форм хитиназ, образуемых Bacillus sp.

739.

Впервые обнаружена способность Bacillus sp. 739 секретировать одновременно с хитиназой родственный ей фермент - хитозаназу [103]. Установлена конститутивная способность исследуемого штамма к образованию внеклеточной ß-1,3 -глюканазы (ламинариназы).

Практическая ценность работы. Изучены условия максимальной продукции хитиназы штаммом Bacillus sp. 739, что может быть использовано при про7 изводстве как ферментных препаратов, так и биопрепарата Бациспецин, предназначенного для защиты злаковых культур от болезней, вызываемых фитопа-тогенными грибами (Пат. 1743019, Россия).

Апробация работы. Результаты работы докладывались на международной научной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996), на международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология» (Минск, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе 2 материала статей и 1 статья.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы (1 глава), описание объектов и методов исследования (1 глава), экспериментальную часть и обсуждение результатов (3 главы), заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 135 ссылок, из них 32 на русском языке. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста и содержит 32 рисунка и 19 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Актуганов, Глеб Эдуардович

ВЫВОДЫ

1. У штамма Bacillus sp. 739, - антагониста фитопатогенных грибов, обнаружена способность к продукции комплекса миколитических ферментов, включающих хитиназу (КФ 3.2.1.14), ламинариназу (КФ 3.2.1.6) и хитозаназу (КФ 3.2.1.132).

2. Определены условия максимальной продукции хитиназы штаммом Bacillus sp. 739 в жидкой культуре. В качестве хитин-содержащего субстрата наибольший выход фермента обеспечивают мицелий Botrytis cinerea и хитин-глюкановый комплекс из плодовых тел Armillariella mellea и Macrolepiota procera в концентрациях 0,5 - 0,75 % мае.

3. Методами осаждения, гель-фильтрации, аффинной сорбции и гель-хроматографии осуществлена 56-кратная очистка хитиназы Bacillus sp. 739. С помощью электрофореза выявлены белки с хитиназной активностью, молекулярная масса которых соответствует примерно 70,000 и 34,000 дальтон.

4. Очищенная хитиназа Bacillus sp. 739 имеет оптимум pH, равный 6,0, фермент стабилен в диапазоне pH от 4,0 до 9,0. Температурный профиль активности препарата характеризуется двумя пиками, соответствующими 50°С и 65°С. Фермент стабилен в интервале температур 50-60°С.

5. По механизму действия фермент является экзо-хитиназой (хитобиози-дазой).

6. Установлено, что высокоочищенный препарат хитиназы Bacillus sp. 739, в отличие от сырого препарата, не угнетает развития фитопатогенных грибов in vitro и не проявляет ингибирующего действия на процессы прорастания спор, удлинения ростовых трубок и радиальный рост колоний грибов.

7. Обнаружена способность высокоочищенного препарата хитиназы Bacillus sp. 739 разрушать нативный мицелий грибов, гидролизуя хитин клеточных стенок с освобождением редуцирующих Сахаров. Установлено, что ан

95

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У штамма Bacillus sp. 739, являющегося антагонистом группы фитопато-генных грибов, была обнаружена способность к синтезу внеклеточной хитина-зы на средах с хитином и хитин-содержащими субстратами. В связи с этим было сделано предположение о взаимосвязи между образованием хитиназы и антигрибной активностью штамма Bacillus sp. 739. В ходе исследований было установлено, что при росте на среде с коллоидным хитином Bacillus sp. 739 имел также ß-1,3-глюканазную и слабую хитозаназную активность. Образование хитиназы начиналось через 12 ч от начала роста и достигало максимума к 36 ч культивирования. Наиболее высокая продукция фермента наблюдалась при использовании в качестве субстрата мицелия гриба Botrytis cinerea или очищенного хитин-глюканового комплекса из клеточных стенок базидиомицетов Armillariella mellea и Macrolepiota procera. Использование вместо очищенного хитина грибной биомассы приводило к значительному повышению секреции хитозаназы и ß-l,3-nnoKaHa3bi. Линейная зависимость синтеза хитиназы от концентрации субстрата имела место в интервале до 0,1%, а максимальное значение хитиназной активности достигалось при 0,4% субстрата в питательной среде. При использовании в качестве дополнительных источников углерода легкодоступных соединений синтез хитиназы угнетался, тогда как некоторые полимеры, такие как пектин, хитозан и др., увеличивали выход этого фермента у Bacillus sp. 739. Синтез хитиназы индуцировался только специфическими индукторами, такими как хитин и хитин-содержащие субстраты. Мономер хитина, N-ацетилглюкозамин, индуцировал следовые количества фермента. Оптимальными источниками органического азота являлись кукурузный и дрожжевой экстракты. Наибольший выход фермента наблюдался при концентрации кукурузного экстракта 0,1% и пептона 0,1-0,2%. Исследуемая культура имела широкий температурный оптимум для продукции хитиназы - от 28 до 38°С. Наи

92 больший выход фермента отмечался при начальном значении pH питательной среды от 6,0 до 7,0.

В результате поэтапной очистки хитиназы ее удельная активность возросла в 56 раз. Наиболее активная фракция представляла собой гетерогенный препарат. В результате электрофореза различных фракций хитиназного пика в 7,5%-ном ПААГ с 1% ДДС-Na были выявлены гомогенные белки с хитиназной активностью, молекулярная масса которых соответствовала -70,000, и 34,000 дальтон.

Анализ свойств очищенной хитиназы показал, что фермент имеет оптимум pH, равный 6,0 и стабилен в диапазоне pH от 4,0 до 9,0. Температурный профиль активности препарата характеризовался двумя пиками, при 50°С и 65°С. Фермент был стабилен в интервале температур 50-60°С.

Исследуемый фермент гидролизует п-нитрофенил-НДЧ'-диацетил-р-О-хитобиозу и коллоидный хитин, способен воздействовать на нативную (кристаллическую) форму хитина. По механизму действия фермент близок к экзо-хитиназам, а точнее - хитобиозидазам, поскольку основным продуктом его реакции является диацетилхитобиоза. На данный механизм действия указывает и линейный характер гидролиза коллоидного хитина ферментом, проявлявшийся в первые часы реакции.

Изучение антигрибной активности препаратов сырой и очищенной хитиназы показало, что высокоочищенный фермент не угнетает развития фитопато-генных грибов in vitro. Также не наблюдалось ингибирующего действия очищенной хитиназы Bacillus sp. 739 на процессы прорастания спор, удлинения ростовых трубок и радиальный рост колоний грибов в чашках. Вместе с тем препарат проявлял способность лизировать нативный мицелий грибов в статичных условиях, воздействуя на компоненты клеточной стенки. Таким образом, антигрибная активность Bacillus sp. 739 и миколитическая активность хитиназы не связаны напрямую. По всей видимости, антагонизм исследуемого штамма является результатом совместного действия низкомолекулярных антибиотических веществ и комплекса литических ферментов.

93

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Актуганов, Глеб Эдуардович, Уфа

1. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во МГУ, 1989. - 336 с.

2. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-544 с.

3. Егоров И.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. М.: Высшая школа, 1965. - 211 с.

4. Жизнь растений: В 6 т. / Под ред. А.А.Федорова. 1-е изд. - М.: Просвещение, 1976. Т. 2: Грибы. - 479 с.

5. Козачко И.А., Вьюницкая В.А., Бережницкая Т.Г., Резник С.Р., Смирнов В.В. Эндофитные бактерии рода Bacillus перспективные культуры для создания биологических средств защиты растений от болезней. // Микробиол. журн. -1995.-Т. 57,№5.-С. 69-78.

6. Кривцов Г.Г., Лоскутова H.A., Конюхова Н.С., Хорьков Е.И., Кононенко Н.В., Ванюшин Б.Ф. Действие хитозановых элиситоров на растения пшеницы. // Известия РАН. Сер. Биол.-1996. № 1. - С. 23-29.

7. Максимов В.И., Родоман В.Е., Лунцевич В.Г. Фитоактивные хитиновые соединения. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т. 33, № 4. -С. 355-362.

8. Максимов В.И., Смирнова Ю.В. Сернокислотно-ферментативная переработка хитина. // Биотехнология. 1994. - Т. 10. - С. 26-30.96

9. Мелентьев А.И., Еркееев A.M. Изучение антагонизма между почвенными бациллами и микромицетами рода Fusarium Lk: Fr. // Микробиол. журн. 1990. -Т. 52, № 1,-С. 53-56.

10. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Хитиназа Bacillus sp. 739: выделение, очистка и характеристика. // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35, №6.-С. 624-628.

11. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. М.: Изд-во МГУ, 1988. - 220 с.

12. Морозов В.В., Шелегедин В.Н., Болотников И.А. Исследование хитиназного препарата, полученного из бактерии Bacillus thuringiensis. // Биотехнология. -1994.-Т. 31, №7.-С. 20-23.

13. Никонорова А.К. Особенности взаимодействия Bacillus subtilis с Helminthosporium sativum Pam., King et Bakke. // Микология и фитопатология. -1996.-Т. 30.-С. 69-73.

14. Новогрудский Д. Использование микробов в борьбе с грибковыми заболеваниями культурных растений. // Известия АН СССР. 1936. - С. 277293.

15. Пат. 1743019 Российская федерация, А 01 N 63/00, С 12 N 1/20, 1989. Штамм бактерий Bacillus sp. для получения препарата против грибных возбудителей болезней злаковых культур/ А.И.Мелентьев, Н.Г.Усанов, О.Н.Логинов. Заявл. 3.10.89; Опубл. 23.03.93.

16. Порфирьева О.В., Юсупова Д.В., Зоткина Н.Л., Соколова Р.Б., Габдрахманова Л.А. Хитинолитический комплекс Serratia marcescens и особенности его биосинтеза. // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 3. - С. 347353.

17. Сержанина Г.И., Яншин И.Я. Грибы. Минск: Наука и техника, 1986. - 232 с.

18. Синицин А.П., Черноглазов В.М., Гусаков A.B. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. М., 1993. - 152 с. - (Итоги науки и техники.) Сер. Биотехнология; Т. 25.97

19. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. М.: Изд-во МГУ, 1984. - 26 с.

20. Слабоспицкая А.Т., Крымовская С.С. Хитиназы аэробных спорообразующих бактерий, выделенных из различных экологических источников. // Микробиол. журн. 1992. - Т. 54, № 6. - С. 16-22.

21. Смирнов В.В., Резник С.Р., Василевская И.А. Спорообразующие аэробные бактерии продуценты биологически активных веществ. - К.: Наукова думка, 1982. - 280 с.

22. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрэм Д. Мир микробов: В 3 т. М.: Мир, 1979. -Т. 1.

23. Теппер Е.З., Шилыникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. М.: Колос, 1972. - 200 с.

24. Тесленко А.Я., Попов В.Г. Хитин и его производные в биотехнологии. М.: Получение и применение ферментов, витаминов и аминокислот. Вып. 3, 1982. -40 с.

25. Тиунова H.A. Хитинолитические ферменты микрорганизмов. // Успехи биологической химии. 1989. - Т. 30. - С. 199-219.

26. Тиунова H.A., Жлоба Н.М., Сидорова И.И. Биосинтез ß-глюканаз и хитиназ в культуре микофильного штамма Т. viride. // Микробиология. 1983. - Т. 25, № 5.-С. 723-728.

27. Трачук Л.А., Шемякина Т.М., Честухина Г.Г., Степанов В.М. Хитиназы Bacillus cereus: выделение и характеристика. // Биохимия. 1996. - Т. 61, Вып. 2.-С. 357-368.98

28. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Меморская А.С. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификации и физико-химические свойства. // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 1. - С. 27-31.

29. Чигалейчик А.Г. Хитиназа Bacillus thuringiensis. // Микробиология. 1976. -Т. 45, №6.-С. 966-972.

30. Appel M., Riesde W., Hofmeyr J.-H., Bellstedt D. A method for the quatitative assessment of wound-induced chitinase activity in potato tubers. // J. Phytopathol. -1995. V. 143, № 9. - P. 525-529.

31. Araki Т., Torikata T. Structural classification of plant chitinases: two subclasses in class I and class II chitinases. // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - V. 59, № 2. -P. 336-338.

32. Aribisala O., Gooday G. Properties of chitinase from Vibrio alginolyticus, as assayed with the chromogenic substrate 3,4-dinitrophenyl tetra-N-acetylchititetraoside. //Biochem. Soc. Transactions. 1978. - V. 6. - P. 568-569.

33. Barret-Bee K., Lees J., Henderson W. Variation in the activities of enzymes associated with cell wall metabolism during a growth cycle of Candida albicans. // FEMS Microbiol. Letters. 1982. - V. 15. - P. 275-278.

34. Beintema J. Structural features of plant chitinases and chitin-binding proteins. /V FEBS Lett. 1994, - V. 350&(!&), № 2-3. - P. 159-163.

35. Bertagnolli B.L., Dal Soglio F.K., Sinclair J.B., Eastburn D.M. Extracellular j enzymes involved in the potential biocontrol of Rhizoctonia solani by Bacillus megaterium and Trichoderma harzianum. // Phytopathology. 1994. - V. 84, № 10. -P. 1136.

36. Bielka H., Dixon H., Karlson P., Liebecq C., Sharon N. et al. Enzyme Nomenclature. N.Y.: Acad. Press, 1984. - 647 P.99

37. Boiler T. Induction of hydrolases as a defense reaction against pathogens. In: Cell, and Mol. Biology of Plant Stress (Key J.L., Kosuge T., eds.). N.Y.: Liss, 1985.

38. Boiler T. Chitinase: a defence of higher plants against pathogens. In: Chitin nature and technology (Muzzarelli R., Jeuniaux C., Gooday G.W., eds.). N.Y.: Plenum Press, 1986.

39. Boot R., Renkema G., Strijland A., Van Zonneveld A., Aerts J. Cloning of a cDNA encoding chitotriosidase, a human chitinase produced by macrophages. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270, № 44. - P. 26252-26256.

40. Boyapati R., Moyne A., Cleveland T., Tuzun S, Cloning of putative chitinase genes from Bacillus to control toxin producing fungi. // Phytopathology. 1994. - V 84, № 10.-P. 1081.

41. Bronnenmeier K.s Riicknagel K., Staundenbauer W. Purification and properties of a novel type of exo-l,4-J3-glucanase (Avicelase II) from the cellulolytic Clostridium stercorarium. // Eur. J. Biochem. 1991. - V. 200. - P. 379-385.

42. Bruce A., Srinivasan U., Staines H., HighleyT. Chitinase and laminarinase production in liquid culture by Trichoderma spp. and their role in biocontrol of wood decay fungi. // Intern. Biodeterioration & Biodégradation. 1995. - P. 337-353.

43. Brurberg M., Nes I., Eijsink V. Comparative studies of chitinases A and B from Serratia marcescens. //Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 1581-1589.

44. Chet I., Inbar J. Biological control of fungal pathogens. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V. 48, № 1. - P. 37-43.

45. Clark P., Tracey M. The occurence of chitinase in some bacteria. // J. Gen. Microbiol. 1956. - V. 14. - P. 188-196.

46. Cook R.J., Baker K.F. The nature and practice of biological control of plant pathogens. // American Phytopathol. Soc.: St. Paul, Minn., 1983.

47. Cosio I., Fisher R., Carroad P. Bioconversion of shellfish chitin waste: waste pretreatment, enzyme production, process design and economic analysis. // J. Food Sci. 1982. - V. 47. - P. 901-905.100

48. Debono M., Gordee R.S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. // /\nnu. Rev. Microbiol. 1994. - V. 48. - P. 471-497.

49. Donderski W. Chitinolytic bacteria in water and bottom sediments of two lakes of different trophy. // Acta Microbiol. Pol. 1984. - V. 33, № 2. - P. 163-170.

50. El-Aassar S., Ghanem K., Sabrys A., Ghanem N. Purification and characterization of chitinases produced by Bacillus amyloliquefaciens. // Bioseparation. 1992. - V. 3, № 1. - P. 37-46.

51. Frandberg E., Schnurer J. Chitinolytic properties of Bacillus pabuli Kl. // J. Appl. Bacteriol. 1994. - V. 76., № 4. - P. 361-367.

52. Frandberg E., Schnurer J. Evaluation of a chromogenic chitooligosaccharide analogue, p-nitrophenyl-beta-D-N, N'-diacetylchitobiose, for the measurement of the chitinolytic activity of bacteria. // J. Appl. Bacteriol. 1994. - V. 76, № 3. - P. 259263.

53. Fukamizo T., Honda Y., Toyoda H., Ouchi S., Goto S. Chitinous component of the cell wall of Fusarium oxysporum, its structure deduced from chitosanase digestion. // Biosci. Biotech. Biochem. -1996. V. 60, № 10. - P. 1705-1708.

54. Fukamizo T., Kramer K. Mechanism of chitin hydrolysis by binary chitinase system in insect moulting fluid. // Insect Bichem. 1985. - V. 15. - P. 141-145.

55. Fukamizo T., Ohkawa T., Ikeda Y., Gooto S. Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V. 1205, № 2. - P. 183-188.

56. Gooday G. Chitinase activities in animals, fungi and bacteria. // Chitin in Nature and Technology. N.Y.: Plenum Press, 1986. P. 241-261.

57. Gupta R., Saxena R., Chaturvedi P., Virdi J. Chitinase production by Streptomyces viridificans: its potential in fungal cell wall lysis. // J. Appl. Bacteriol. -1995,-V. 78.-P. 378-383.

58. Hadar Y., Harman G., Taylor A., Norton J. Effect of pregermination of pea and cucumber seeds and of seed treatment with Enterobacter cloaceae on rots caused by Pythium spp. // Phytopathol. 1983. - V. 73. - P. 1322-1325.101

59. C2. Harish S., Manjula K., Podile A.R. Fusarium udum is resistant to the mycolytic activity of a biocontrol strain of Bacillus subtilis AF1. // FEMS Microbiol. Ecology. -4998. V. 25. - P. 385-390.

60. Hodge A., Alexander I., Gooday W. Chitinolytic enzymes of pathogenic and ectomycorrhizal fungi. // Mycol. Res. 1995. - V. 99, № 8. - P. 935-941.

61. Horikoshi K., Iida S. Lysis of fungal mycelia by bacterial enzymes. // Nature. -1958. V. 181, № 4613. - P. 917-918.

62. Horwitz M., Reid J., Ogridziak D. // Chitin, chitosan and related enzymes. -N.Y.: Acad. Press, 1984. P. 191-208.

63. Hsu S.C., Lockwood J.L. Mechanisms of inhibition of fungi in agar by streptomycetes. // J. Gen. Microbiol. 1969. - V. 57. - P. 149-158.

64. Imoto T., Yagishita K. A simple activity measurement of lyzozyme. // Agric. Biol. Chem. 1971. - V. 35. - P. 1154-1156.

65. Inbar J., Chet I. Evidence that chitinase produced by Aeromonas caviae is involved in the biological control of soil-borne plant pathogens by this bacterium. // Soil. Biol. Biochem. 1991. - V. 23, № 10. - P. 973-978.

66. Jackson A.O., Taylor B. Plant-microbe interactions: Life and death at the interface. // Plant cell.- 1996,- V.8, № io.- P.1651-1668.

67. Jeuniaux C. Chitinase: an addition to the list of hydrolases in the digestive tract of vertebrates. //Nature. 1961. - V. 192. -P. 135-136.

68. Jeuniaux C. Digestion of chitin in birds and mammals. // Ann. Soc. Roy. Zool. Belg. 1962. - V. 92. - P. 27-45.102

69. Joosten M., Verbakel H., Nettekoven M. et al. The phytopathogenic fungus Cladosporium fulvum is not sensitive to the chitinase and (3-1,3-glucanase defence proteins of its host, tomato. // Physiol, and Mol. Plant Pathol. 1995. - V. 46, № 1. -P. 45-59.

70. Kafetzopoulos D., Kamst E., Lugtenberg B., Spaink H. Lipo-chitin-oligosaccharides (LSOs) as endogenous organogenesis signals of the plants. // J. Cell. Biochem. 1995. - Suppl. 21a. - P. 480.

71. Katz E., Demain A. The peptide anibiotics of Bacillus: chemistry, biogenesis and possible functions. // Bacteriol. Reviews. 1977. - V. 41, № 2. - P. 449-474.

72. Kawazu K., Ohnishi S., Kanzaki H., Kobayashi A. A stable crude chitinase solution from Spodoptera litura pupae and search for its inhibitors. // J. of Bioscience. 1996. - V. 51, № 9-10. - P. 738-742.

73. Koga D., Jilka J., Kramer K. Insect endochitinases: glycoproteins from moulting fluid, integument and pupal haemolymph of Manduca sexta. // Insect. Biochem. -1983.-V. 13.-P. 295-305.

74. Kuroshima K., Sakane T., Takata R., Yokota A. Bacillus ehimensis sp. nov. and Bacillus chitinolyticus sp. nov., new chitinolytic members of the genus Bacillus. // Intern. J. Systemat. Bacteriol. 1996. - V. 46, № 1. - P. 76-80.

75. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. -1970. V. 227, № 5259,- - P. 680-685.

76. Lawrence C., Joosten M., Tuzun S. Differential induction of pathogenesis-related protein in tomato by Alternaria solani and association of a basic chitinase isozyme with resistance. // Physiol, and Mol. Plant Pathol. 1996. - V. 48, № 6. - P. 361-377.

77. Lim H.-S., Kim Y.-S., Kim S.-D. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent of plant root rot. // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57, № 2. - P. 510-516.

78. Lorito M., Peterbauer C., Hayes C., Harman G. Synergistic interaction between fungal cell wall degrading enzymes and different antifungal compounds enhances inhibition of spore germination. // Microbiology. 1994. - V. 140. - P. 623-629.

79. Mahadevan B., Crawford D. Properties of the chitinase of the antifungal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108. // Enzyme and Microbial Technol. -1997,-V. 20.-P. 489-493.

80. Matsumiya M., Mochizuki A. Distribution of chitinase and beta-N-acetylhexosaminidase in organs of several fishes. // Fisheries Science. 1996. - V. 62, № 1. - P. 150-151.

81. McCreath K., Gooday W. A rapid and sensitive microassay for determination of chitinolytic activity. // J. of Microbiol. Meth. 1992. - V. 14. - P. 229-237.

82. Miller G. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. // Anal. Chem. 1959. - V. 31. - P. 426-428.

83. Misato T., Yamaguchi I. Pesticides of microbial origin. // Outlook on Agriculture. -1984. -V. 13, №3,-P. 136-139.yi. Mitchell R., Alexander M. Mycolytic phenomenon and biological control of Fusarium in soil. // Nature. 1961. - P. 109-110.

84. Mitchell R., Alexander M. Lysis of soil fungi by bacteria. // Can. J. Microbiol. -1962.-V. 9.-P. 169-177.

85. Mitsutomi M., Kidon H., Tomita H., Watanabe T. The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan. // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - V. 59, № 3. - P. 529-531.

86. Molano J., Duran A., Cabib E. A rapid and sensitive assay for chitinase using tritiated chitin. // Anal. Biochem. 1977. - V. 83. - P. 648-656.

87. Monreal J., Reese E. The chitinase of Serratia marcescens. // Can. J. Microbiol. -1969. V. 15, №. 7. - P. 689-696.

88. Nielsen P., Sorensen J. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizoshere. // FEMS Microbiol. Ecology. 1997. - V. 22. - P. 183-192.104

89. Okazaki K., Kato F., Watanabe N., Yasuda S., Masui Y., Hayakawa S. Purification and properties of two chitinases from Streptomyces sp. J-13-3. // Biosci. Biotech. Biochem. 1995. - V. 59, № 8. - P. 1586-1587.

90. Oranusi N., Trinci A. Growth of bacteria on chitin, fungal cell walls and fungal biomass, and the effect of extracellular enzymes produced by these cultures on the antifungal activity of amphotericin B. // Microbios. 1985. - V. 43., № 172. - P. 1730.

91. Ordentlich A., Elad Y., Chet I. Rhizosphere colonization by Serratia marcescens for the control of Sclerotium rolfsii. // Soil Biol. & Biochem. 1987. - V. 19. - P. 747-751.

92. Ordentlich A., Elad Y., Chet I. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii. // Phytopathology. 1988. - V. 78. - P. 84-88.

93. Ortiz J., Berkeley R., Brewer S. Production of exo-beta-N-acetylglucosaminidase by Bacillus subtilis. // J. Gen. Microbiol. 1973. - V. 77, № 2.-P. 331-337.

94. Overdijk B., Van Steijn G., Odds F. Chitinase levels in guinea pig blood are increased after systemic infection with Aspergillus fumigatus. // Glycobiology. -1996. V. 6, № 6. - P. 627-634.

95. Pelletier A., Sygusch J. Purification and characterization of three chitosanase activities from Bacillus megaterium PI. // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. -P. 844-848.

96. Pleban S., Cherain L., Chet I. Chitinolytic activity of an endophytic strain of Bacillus cereus. // Letters in Appl. Microbiol. 1997. - V. 25. - P. 284-288.

97. Pleban S., Ingel F., Chet I. Control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in the greenhouse using endophytic Bacillus spp. // Europ. J. Plant Pathol. 1995. -V. 101, №6. P. 665-672.

98. Podile A.R., Prakash A.P. Lysis and biological control of Aspergillus niger by Bacillus subtilis AFI. // Can. J. Microbiol. 1996. - V. 42. - P. 533-538.

99. Powning R., Irzykiewicz H. Studies on the chitinase system in bean and other seeds. // Comp. Biochem. Physiol. 1965. - V. 14. - P. 127-133.105

100. Priest F.G. Extracellular enzyme synthesis in the genus Bacillus. // Bacteriol. Reviews. 1977. - V. 41.-P. 711-753.

101. Rast D., Horsch M., Furter R., Gooday G. A complex chitinolytic system in exponentially growing mycelium of Mucor rouxii: properties and function. // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 2797-2810.

102. Reissig J.L., Strominger J., Leloir L.F. A modified colorimetric method for the V estimation of N-acetylamino sugars. // J. Biol. Chem. 1955. - V. 217. - P. 959-966.

103. Renkema G., Boot R., Muijsers A., Donker-Koopman W., Aerts J. Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of the chitinase family of proteins. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 402-412.

104. Rodriguez-Kabana R., Godoy G., Morgan-Jones G., Shelby R. The determination of soil chitinase activity: conditions for assay and ecological studies. // Plant and Soil. 1983. - V. 75. - P. 95-106.

105. Sahai A., Manocha M. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host parasite interaction. // FEMS Micribiol. Rev. 1993. - V.11.-P. 317-338.

106. Sakai K., Narihara M., Kasama Y., Wakayama M., Moriguchi M. Purification and characterization of thermostable beta-N-acetylhexosaminidase of Bacillus stearothermophilus CH-4 isolated from chitin-containing compost. // Appl. Environ.

107. Microbiol. 1994. - V. 60, № 8. - P. 2911-2915.

108. Schrempf H. Degradation of crystalline cellulose and chitin by Streptomycetes. // Proseedings of 9th Symposium on the Actinomycetes. 1995. - P. 165-168.106

109. Takayanagi T., Ajisaka K., Takiguchi Y., Shimahara K. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - V. 1078, № 3. - P. 404-410.

110. Tanaka H., Watanabe T. Glucanases and chitinases of Bacillus circulans WL-12. // J. Industrial Microbiol. 1995. - V. 14, № 6. - P. 478-483.

111. Trachuk L., Revina L., Shemyakina T., Chestukhina G., Stepanov V. Chitinases of Bacillus licheniformis B-6839: Isolation and properties. // Can. J. Microbiol. -1996. V. 42, № 4. - P. 307-315.

112. Tronsmo A., Harman G. Detection and quantitation of N-acetyl-ß-D-glucosaminidase, chitobiosidase and endochitinase in solution and on gels. // Anal. Biochem. 1993. - V. 208. - P. 74-79.

113. Tweddell R.J., Jabaji-Hare S.H., Charest P.M. Production of chitinases and ß-1,3-glucanases by Stachybotrys elegans, a mycoparasite of Rhizoctonia solani. // Appl. Environ. Microbiol. V. 60, № 2. - P. 489-495.

114. Ueda M., Fujiwara A., Kawaguchi T., Arai M. Purification and some properties of six chitinases from Aeromonas sp. No. 10S-24. // Biosci. Biotech. Biochem. -1995.-V. 59,№ 11.-P. 2162-2164.

115. Ulhoa C., Peberdy J. Regulation of chitinase synthesis in Trichoderma harzianum. // J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137. - P. 2163-2169.

116. Villagomez-Castro J., Lopez-Romero E. Identification and partial characterization of three chitinase forms in Entamoeba invadens with emphasis on their inhibition by allosamidin. // Antonie van Leeuwenhoek. 1996. - V. 70. - № 1.1. P. 41-48.

117. Watanabe T., Oyanagi W., Suzuki K., Tanaka H. Chitinase system of Bacillus circulans WL-12 and importance of chitinase Al in chitin degradation. // J. Bacteriol. 1990. - V. 172, № 7. - P. 4017-4022.

118. Watanabe T., Suzuki K., Oyanagi W., Ohnishi K., Tanaka H. Gene cloning of chitinase Al from Bacillus circulans WL-12 revealed its evolutionary relationship to

119. Serratia marcescens and to the type III homology units of fibronectin. // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265, № 26. - P. 15659-15665.

120. Watanabe T., Yamada T., Oyanagi W., Suzuki K., Tanaka H. Purification and ?<->me properties of chitinase B1 from Bacillus circulans WL-12. // Biosci. Biotech. Biochem. 1992. - V. 56, № 4. - P. 682-683.

121. Weller D.M. Biological control of soil-borne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria. // Annu. Rev. Phytopathol. 1988. - V. 26. - P. 379-407.

122. Wiwat C., Siwayaprahm P., Bhumiratana A. Purification and characterization of chitinase from Bacillus circulans No.4.1. // Curr. Microbiol. 1999. - V. 39, № 3. - P. 134-140.