Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика хитинах бактерий Bacillus Ucheniformis и Bacillus cereus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика хитинах бактерий Bacillus Ucheniformis и Bacillus cereus"

i i a

i С- '.''.Г' V-v'/; М0СК0НСКИй4>РД]|Й0В ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.3

ТРАЧУ К ЛЕСЯ А НАСТАСЬЕЙ НА

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ХИТИНАЗ БАКТЕРИЙ Bacillus licheniformis и Bacillus cereus

Oí.00.04. - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации та соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Диссертационная работа выполнена и лаборатории химии белка ГосНИИ Генетика, г.Москва

Научные руководители: доктор химических наук, профессор В.М.Степанов, доктор биологических наук Г.Г.Честухина

Официальные оппоненты: члеи-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор И.С.Кулаев,

доктор химических наук Л.М.Гинодман

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится "/¿7 " инХС^ 1996 года в '/¿Пчасов на заседании Специализированного совета Д.053.05.32. при Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан "_" „уу ¿г1,1996 г.

Ученый секретарь Специализированного сонета

М.В. Иванов

ОБЩАЯ ХЛ1 'Л KT Г. 11И CT И К Л. 1'ЛКОГЫ

Актуальность проблемы. Участвуя п утилизации хнтипсодержащих ■ in larcjit.nbix субсграгоп, хитиназы играют существенную роль и метаболизме многих водных н почвенных сапрофитов. Изучение згих ферментов необходимо для биохимической характеристики бактернй-иродуцентоп. Среди продуцентов хнгнпаз видное моего занимают бактерии рода Bacillus, однако, в настоящее время бациллярные хитиназы изучены недостаточно, практически не исследован к ((¡еномен их множественности. Множественность бактериальных хитиназ вносит определенные затруднения в их фракционирование и получение индивидуальных белков, поэтому особую значимость приобретает разработка новых подходов к выделению к очистке этих (ферментов.

Подробное исследование свойств малоизученных бациллярных хитиназ необходимо для оценки перспективности использования их структурных генов в создании траисгенных растений, устойчивых к патогенным грибам и насекомым-вредителям. Поиск бактериальных штаммов., интенсивно продуцирующих хитиназы, весьма перспективен для получения фунгшшдных и 'жтомоцидных препаратов.

Цслыо данной работы являлась разработка методов очистки внеклеточных хитиназ бактерий рода Bacillus, а также подробное изучение молекулярных и функциональных свойств полученных индивидуальных ферментов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Для выделения внеклеточных хитиназ Bacillus разработан эффективный подход, основанный на использовании гидрофобной хроматографии на Butyl-Toyopearl, ионообменной хроматографии на Mono Q и гельфильтрации. Впервые выделены и охарактеризованы пять ферментов хитинолитического комплекса R и S вариантов Bacillus lichevi/orniis, а также три хитиназы Bacillus cereus. Определены молекулярные массы, аминоконцевые последовательности, иммунологические свойства и субстратная специфичность индивидуальных хитиназ, а также зависимость их функциональных свойств от pH н температуры.

Разработанная схема выделения хитиназ может быть применена для очистки подобных ферментов других микроорганизмов, в том числе и для фракционирования 5лпзкородственных хитиназ. Данные, полученные при изучении молекулярных и иппматических свойств очищеккых ферментов, могут быть использованы для клонирования структурных генов хитиназ.

Показано, что Bacillus licheniformis шт. В-6839 является активным продуцентом чипшаз и может быть использован для получения фунпшидных и чнтомоцидных препаратов, а также для промышленной переработки хитина и хитозана.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на III :импозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), на всероссийской конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), на международном симпозиуме "Молекулярные ответы растений на биотические и абиотические стрессы" (Хельсинки, 1996), на семинаре лаборатории химии белка ГосНИИГенетнка 19 марта 1996 г. и на заседании кафедры биохимии МГУ I апреля 19% г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных рабо т.

Сфунтура и объем рабо-гм. Диссертация состоит из введения, обзора ипературы, посвященного характеристике хитиназ, изложения полученных

рсмулыатон и их обсуждения, выводов, женернмен гальиоп части и списка нитруемой литера туры. Работа изложена па стр., включая рис. и схем. Пиблшн рафия пклмчяст наимсиошиши.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Oifiiip Лактсрий - продуцентов хитиняз. Культуральнме особенности штаммов Bacillus licheniformis и Bacillus cereus.

Способность осветлять агаризованную сроду с коллоидным хитином, указывающая на секрецию хитнназ, была выявлена у 70 in 100 геетированных нами бациллярных штаммов. При подборе оптимальных условии глубинного культивирования наибольшую хитинолитическуш активность обнаружили клетки Bacillus licheniformis: на среде, содержащей измельченный хитин панцирей крабов и белково-вигамшшый концентрат, продуктивность данного штамма составляла примерно 2 единицы активности на один милшштр культуральной жидкости, что сопоставимо с продуктивностью коммерческих штаммов Serrada [Joshi, S. et al., 19X9, Monreal, J. et al., 1968] и Streptomyces [Robbins, P. el al., 1992]. Значительный, в сравнении с остальными штаммами, уровень хитнназной активности проявил также штамм В-6838 Bacillus cereus. Эта штаммы Bacillus licheniform и Bacillus cereus были использованы для выделения, очистки и характеристики хи гияач.

Олнгоспорогсннын штамм Bacillus licheniformis В-6839 обнаружил выраженную склонность к диссоциации на морфологические варианты. При рассеве исходной культуры на чашки с агаризованной средой, содержащей коллоидный хитин, но <|)енотипическнм признакам были отобраны колонии R, S и М типа. При глубинном культивировании мевду ними обнаружились различия в уровне секреции хитнназ и протеинам (Табл. 1).

Таблица 1. Ферментативная активность в культуральной жидкости R, S и М вариантов

Bacillus licheniformis

Варианты Активность в культуральной жидкости, ед. акт7мг/мл:

Х1ГПЦШЫ протепназы (по Z-AIa-Ala-Leu-NHGÄNO,)

R 0,8 0,01

S 1,3 15.0

М 1,7 25.0

М форма оказалась неустойчивой - в процессе культивирования она диссоциировала на S и R варианты, поэтому были изучены только хитинами, секретируемыс двумя последними вариантами.

IOK I ЮЕС П к-Дя кДя

36 29

24_ 20

_29 24

Piic.l .Ds-N;K)jicKrpo(|H)pc-i 11 12%-ном ГТЛЛГ белком, сскретирокаиных Bacillus cercus «час культивировании в течение 45 часов ма среде с MnS()4 (КЖ I) и на с роде без MnS()4 (КЖ II).

При культивировании клеток Bacillus eereus било выявлено, что добавление питательную среду сульфата марганца стимулирует увеличение хитиназной ктншюсти примерно в два раза. При этом изменялся спектр секретируемых елков, в частности, появлялись дополнительно в значительных количествах елки с молекулярной массой 68 и 62 кДа (рис. I).

. Выделение хитиназ Bacillus.

Для выделения хитиназ из культуральной жидкости бацилл была разработана кема, основным этапом которой является гидрофобная хроматография на колонке с utyl-Toyopearl. Применение этого метода позволило удалить гидрофильные римеси и разделить хитиназы с близкими молекулярными свойствами. .1. Хитииазы Bacillus licheniformis

.1.1. Хитинат, образуемые S вариантом. Белки культуральной жидкости S варианта ыделяли высаливанием (рис. 2). Примесные протеиназы, содержащиеся в осадке в иачителъиом количестве, отделяли сорбцией на аффинном сорбенте бациграцин-илохроме. Не связавшуюся с колонкой фракцию хитиназ хроматографировали на !uty!-Toyopearl в 0,1 М На-фосфатном буфере, pH 7,3, содержащем 0,6 М (NH»)z SO4 ,43 М (NSOi был эшоировал пик S1, а фосфатным буфером, не содержащим ульфа ¡а аммония, - пик S2 (рис. 3). При анионообменной хроматографии пика S1 на lorm Q, 0,16 М NaCI элюировался пик S1-!, который, по данным Ds-Na-лектрофореча, содержал только белок с молекулярной массой 53 кДа - хитиназу-53 рис. 5). При хроматографии в аналогичных условиях пика S2, в котором преобладал елок с молекулярной массой 42 кДа, 0,18 М NaCI элюироаались три пика - S2-1, S2-2 : S2-3 (рис. 4), - все они содержали хитиназную активность. Рехромнго! рафия S2-I на dono Q дала чисгую хитиназу-49 (рис. 5). Гель-фильтрация S2-3 11а Superdex 75 юзволнла выделить чистую хитиназу-42 (рис. 5). Фракция S2-2 содержала рудпоразделимую смеси обоих ферментов. Общий выход хитиназ S-варианта но ктшшоегн составил 44%.

Кулмурллыш! ЖИДКОС!!.

Сунерпатаит

Осадок

(¡¡щитрации-силихрим

Сорбировавшиеся Несвязашииеся нротеиначы хнтииазы

и к S1

Butyl-Toyopearl

пик S2

Mono Q

пик S1-!

(Chi-53)

пики S2-1

Mono Q

пше S2-1-1 (chi-49)

S2-2

S2-3

Superdex 75

пик S2-3-1 (chi-42)

Рис.2. Схема выделения и очистки хитиназ S вариант» Bacillus Ucheniformis.

2.1.2. Хипшшпы, образуемые R вариантом. Культуральную жидкость R варианта непосредственно наносили на колонку с Butyl-Toyopearl, уравновешенную 0,1 М Na-([юсфагным буфером, рН 7,3, содержащим 0,6 М сульфат аммония. Связавшиеся с колонкой белки элюировались в виде двух пиков: 0,25 М (NRih SO4 был элюирован пик R1, затем, >)а-фосфатным бугром, рН 7,3, - пик R2; оба пика обнаружили хитилазную активность (рис. 6а). По данным Ds-Na-электрофореза, лик R2 содержал только одни белок с молекулярной массой 66 кДа - чистую хитиназу-66 (рис. 5). При разделении белков пика RI анионообменной хроматографией на Mono Q, 0,1 М NaCl элюировался пик R1-1, который содержал преимущественно хитишпу с молекулярной массой 62 кДа (рис. 66).

0,3

КД-.1 45

0.2 0,1

(а)

10 30 50 Фракции

(Г.)

1'ис.З. (я) Хроматография на ВШуЬТоуореаг! хитиназ 8 варианта. Колонка (5.5x15 см) уравновешена 0,1 М ^-фосфатным буфером, рН 7,3, содержащим 0,6 М (МНО^О*. Стрелка I (имчначист начало члюшш (2 мл/мин.) 0,1 М №-фосфатным буфером, рН 7,3, содержащим 0,43 М (N114)2.404 ; стрелка 2 укатывает на начало элюшш тем же буфером бе! (N114)2804. — Азго;!-—I, фракции, содержащие мгпншкук» активность. (б) Электрофора в 12%-ном 0*-№|-ПААГ пиков и полученных в результате хроматографии на ВШу1-Тоуореаг1. Молекулярные массы белков-сгандартов укачаны слева.

S2-1 Sl-2 SÍ-3

0,4

.0,3 *

0,2 ОД

30 50 70 Объем, мл

С«)

кДа

45_,

ЗА—

(С)

l'nc.4. (а) Ашюиообменная хроматография на Mono Q пика S2. Колонка KR5/5 уравновешена 0,05 М Tris-HCl, рН Н,5, содержащим 2 М мочевину. Скоросп, тоцпн 0,5 мл/мни. — . As». —-. NaCI. (П) Электрофор« к 12%-нпм Ds-Na-ПАЛГ пиков S2-1, S2-2 и S2-3. Молекулярные массы белкон-сг.шдартов укачаны слева.

24

Частая хип:паза-(>2 была получена после рехроматографин пика R1-I в тех же условиях. Общий вмход хнтнназион активности R варианта составил 58%.

ь-Д"

Рис.5. Электрофоре! » |»%-[Ц)м D.s-Nii-ПЛЛГ очищенных хм гш un НшШш lirlu-mfarmix с молекулярной Maccoii (1(1. 02. 53. 49 11 42 кДд. Молекулярные м;\ссы белкои-ст'.шдартов укачаны слева.

24_

1,1 о,i

0J

»

< 0,2 ОД

г—л 1 ■ 1 ►— 4

-- — Е2

\ j

\м I

v/V X

0,3

0,6 ¿

d 0,4 м-f

од i

(а)

т ш Фращш

150 170

30 SO Объем, мл

(б)

Рис.6, (а) Хроматография на Butyl-Toyopearl культуралыюй жидкости R варианта Bacillus [icheniformis. Условия фракционирования см. подпись к рис.3. —, члюция градиентом (NH4)2.SO<;

—,А»о: i—i,фракции, содержащие хнтмнашую активность, (б) Алионообменная хроматография пика Rlna Mono Q. Условия фракционирован™: см. подпись к рис.4. — , Агм; i—1, ппк, содержащий хитшитчук) активность.

2.2. Хитнназы Bacillus cereus

Для выделения хитицаз использовали культуральные жидкости, полученные при культипировании клеток Bacillus cereus на средах с сульфатом марганца - КЖ I, и без сульфата марганца - КЖ II. Культуральные жидкости I и II наносили на колонку с Butyl-Toyopearl.

i* 1,0

«Да

63_

45_

36_ «Й

29_

24_

20

60 80 Фракции

(б)

Рис.7. (а) Хроматография на Butyl-Toyopearl белков Bacillus cereus, содержащихся в КЖ I. Колонка (5,5x15 см) уравновешена 0.1 М №1-фоа|>атным буфером, pH 7,3, с0,Х М (N114)2804. —утопия градиентом (NH^jSO^ (2 mji/miih.);-A2!o;i—1 фракции, содержащие хнтшмзную активность, (б) Ds-Na-шектрофоре-,) в12%-ном ПААГ пиков 1-1 и 1-2,

кДа «6

п-ъ n-i

43_

3<>_ -tmhi

2Э—

24_ '

10

(а)

40 60 80 100 Фракции

(б)

Рнс.8. (а) Хроматография на Вшу1-Тоуореаг1 белков ВасШия сегеиз, содержащихся в "КЖ II. Условия хроматографии ц обозначения: см. подпись к рис. 7. (б) Вй-1Ча-'»лектрофоре1 в 12%-ном ПААГ пиков II-1 н И-2.

Связавшиеся с сорбентом белки культуральной жидкости I элюировались двумя пиками: пик 1-1 элюировался 0,4-0,35 М ГЫН^гЯО« при рН 7,3, а пик 1-2 - 0,1 М №1-<1хкфатным буфером, рН 7,3 (рис. 7а). По данным Оя-Ыа-электрофореза, первый пик содержал белки с молекулярной массой 62 и 52 кДа, а второй - 68- и 38-кДа белки (рис. 76). В обоих пиках имелась хитииазпая активность.

68- н ЗН-кДа белки были разделены гель-фильтрацией на 8ирсгс1сх 75 - оба они Iидролнзоиали коллоид/пли хитин.

Разделить 62- и 52-кДа белки ие удалось, потгому для выделения 52-кДа белка была использована кулыуральиая жидкость, в которой белок с молекулярной

массой (>2 кДа отсулспювал, - КЖ 11. Хромаю» рафия >той культуральион жидкости на Bnlyl-Toyopeail позволила получить ник И-1 (рис. Sa), содержащий только белок с молекулярной массой 52 кДа - хппшачу-52 (рис. Кб).

Таким образом Сипни выделены внеклеточные хитнназы Bacillus ccrcus с молекулярной массой 6К, 52 и 38 кДа. 62-кДа белок выделить по удалось, но его N-кониснуи) iioaicjumiiiVJibiwcri, определили после переноса белка in пластинки полнакридаиидного геля на нолнвишшфгоридную мембрану.

3. Характеристика хитииаз Bacillus

3.1. Молекулярные и функциональные свойства хитина:« Bacillus licheniformis.

Лмшшконцевыс последовательности и /химер молекул хиппшач (рис. 9). Хотя нее амшшкоицеиые последовательности выделенных нами хитииаз Bacillus licheniformis в той или иной степени различаются, в них имеются и сходные мотивы. Наибольшее сходсгво обнаружили хитнназы -42 и -53. Не исключено, что замена A.sp/Gly п девятой позиции N-кокцевого участка хнпшазы-42 обусловлена неполным отщеплением остатка Gly8. Таким образом, имеющееся различие может быть артефактом, и происхождение 42- и 53-кДа белков связано с процессингом С-копневой части молекулы.

Аминоконцевая последовательность хнтиназы-66 обнаруживает шесть совпадений споследователыюстями 42- и 53-кДа хитнназ (из семи остатков, поддающихся сопоставлению). Наличие тирозина в четвертой позиции N-концевой последовательности двух последних хитиназ - остатка, идентификация которого методом Эдмаиа обычно не представляет затруднений, - указывает на то, что представленные аминокислотные последовательности хитииаз -42, -53 и -66 не идентичны. N-концевой остаток аспарагиновой кислоты, отличающий хитиназу-66, возможно, является результатом

chi62 chi49

Bacillus ccreus шт. B-6838 chi38 chi52 chi62

Bacillus circuUms chiA1 Ala Asp Ser Tyr Lys lle Val Gly Tyr Tyr Pro

Bacillus licheniformis шт. B-6839

chi66 Asp Gly Gly Asn Asn Tyr Ile Ile

chi53 Gly Gly Asn Туг Tyr lle Ile Gly Aspl Tyr Pro

chi42 Gly Gly Asn Туг Tyr Ile Ile Gly Gly

GlyThr ArgGluVal Gly Ue Plie Thr Phe Pro

Ala Asn Asn Leu Gly Ser x [Asp Ser" Gin"'x""GiäGly'GittÄsp" Ile'väij .GlnCily Gin Asp Ile V_aj;

Рис.9. Аминоконцевая последовательность хитиназ Bacillus licheniformis шт. B-6839 и Д ( ireuhms [Watarabe, Т. et al, 1ТО0]. Совпадающие аминокислотные остатки обведены.

неодинаково протекающего процессинга предполагаемого нредшесгпенпика хитиназ. Вполне вероятно, что имеется по крайней мере два структурных гена -один кодирует хитиназу-66, а другой - 53- и 42-кДа ферменты. Различие длины

нолннепт ндных цепей может 6i.ni. обусловлено либо существенной разницей в длине сI рукгурнмх генов, либо питспсшшмм ограниченным нрогеолнзом С-концсиых участком <|к.'рмептов.

Последовательности хнтиназ-62 и -49 на щученном, впрочем, небольшом отрезке иолппентндиоп цепи, практически не совпадают друг с другом и с последов» 1елыюст'ЯМ11 остальных хитиназ Bacillus liclieniformis.

Таким образом, в геноме данного штамма, вероятно, имеется но меньшей мере четыре различных гена xmiinai, два in которых (геи, кодирующий хитиназу-66 и ген, кодирующий 53- н 42-кДа множественные (|юрмы) близкородственны.

Это предположение подтверждается иммунологическими данными, которые ясно указывают на сходство 66-, 53- и 42-кДа хитиназ между собой и на их отличие от хнтнназ -62 и -49 (рис. 10а).

(¡0

1,4-Chi42

2 - Chi 66

3 - chi 53

5 - chi 62

6 - chi 49

(6)

1,2-Chi 68

3.4 - chi 52 5,6 - chi 38

Рис. IO. Анализ хнтнназ Bacillus licheniformis (а) и Bacillus cereus (б) методом двойной дш|х[)узш1 в геле по Оухтерлоии. (а) Лунка, расположенная в центре, содержит антпсыворотку к хитина ie-53: лунки 1 (н 4), 2, 3 п 5 содержат хитпиязу-42, -66, -53, -42, -62 н -49 соответственно, (б) Центральная лунка содержит антисыворотку к хнтпназе-68, лунки 1 11 2 - хптнначу-68, лунки 3 и 4 -хитина iv-52. лунки 5 п 6 - хнтшту-38. Концентрация белка s растворах 1 мг/мл, внесены аликвоты по 10 и 5 мкл.

Таблица 2. Физико-химические свойства хитиназ Bacillus.

Свойства Bacillus licheniformis Bacillus cereus

молекулярная масса, кДа 66 53 42 62 49 68 52 38

pl 4,6 4,5 4,5 4,4 — — —

рН-огтпшум 3.5-5.5 3.5-5,5 3.5-5.5 3,5-5,5 4.5-6,0 4 4 4

8.5-9.5 9-10 9-10 X,5-9.5 8.5-9.5

pH стабильности (12 ч.) 4-1(1 4-HI 4-10 4-10 4-10 4-10 4-10 4-11

T°-oimiMVM 71)° 70° 70° 90° 70° 60° 50° 60е

Т° стабильности (3(1 мин.) 65° 65° 65" 75° 60° 60° 60° 60°

— не определял!!

Несмотря на отмеченные различия в строении молекул, физико-химические характеристики изученных хитиназ Bacillus licheniformis в значительной степени сходны. В частности, их изошектрические точки почти идентичны и cooiBeicntvioi pH 4.5-4,7.

Р 4() г

•х

<

20 О

3 4 5

(а)

6 7

рн

9 10 11

i<«>

Ö80

я

£

Р60 «

«

140

I

£20

о

О

J^J chi 53 chi 66 chi 62

chi 49

3 4 5 6 7 8 9 10 11 (6) pH

Рис.! I. рН-Зависимосгь активности (а) и стабильности (б) хитиназ -66, -62, -53 и -49 Bacillus licheni/ormis. (а) Для определения активности нспольювалп 0,05 М буферные растворы:: Na-фоофат-щпраткын, pH 3,0-6,0, Ыа-фосфатный, pH 7,0-8,5, и №-карбонатный, pH 9,0-10,5. Конечная концентрация фермента в буферном растворе - 0,03 o.e. Агио/мл. Максимальную активность принимали за 100%. (G) Раствор фермента в соответствующем буфере (0,03 o.e. Агио/мл) инкубировали 12 ч. при 30°. За 100% принимали исходную активность фермента пр; [соответствующем pH.

J()0 Г

с h i 42,

V°chi62 chi 66 \ chi 53

20 30 4t) 50 60 70 80 90 100 Температура,°С

100

o4

Ö60 о x а

¡40 С

20 0

chi 49,

/ //

20 30 40 50 60 70 80 90 100 Темпе ратура,°С

(а) (б)

Рис. 12. Влияние температуры на стабильность (а) и активность (б) хитиназ -66, -62, -53 и -49 ВасШих ИсИет/отт. (а) 0,3 мл раствора ферменнта в 0,1 М Тп5-НС1, рН 9,0, (0,03 о.е.Амо/ мл) инкубировали 0,5 ч. при соответствующей температуре, татем охлаждали до 4", добавляли 0.5 мл 1%-пого водного раствора коллоидного хитина и отмеряли остаточную ¡наивность хитина ! при 37". (б) К 0,3 мл раствора фермента н 0,1 М Тп5-НС1. рН 9,0, добавляли 0,5 мл 1%-иого водного раствора коллоидного хитина и нпкубнровалн р.гише время, в зависимости о г температуры. Реакцию останавливали добавлением 0,75 мл реагента с днинтросалппшшвои

КПС10Т0Н.

Ii iiixtuie pH па активность и стабильность ферментов (Табл. 2). Хитииазы -М>, -53, а также -62 и -49 обнаружили два pH-оптимума активности по коллоидному хитину - в области pH 3,5-5,5 и 8,5-10 (рис. 11а). Согласно литературным данным, двойной pH-оптимум активности имеется и у некоторых других бактериальных хитина ! [Takayanagi, Т. et а!., 1991]. Это необычное свойство может быть следствием влияния pH на активность (|>ермеитов и/нлн па структуру полимерного субстрата.

Псе исследованные нами хитиназы Bacillus liclieniformis стабильны в интервале pH от 4 до 10 (рис.116).

Зависимость стабильности и активности хитинсп от температуры (Табл.2). Хнтиназы Bacillus licheniformis сохраняют стабильность до 60-75° С (рис. 12а). Температурный оптимум активности 66-, 53- и 49-кДа хитиназ - 70° С, тогда как хитнназа-62 проявляет наибольшую активность при 90° С (рис.126).

Субстратная специфичность хитиназ (Табл. 3). Для определения субстратной специфичности хитиназ использовали полимерные субстраты - коллоидный хитин, "кристаллический" хитин и коллоидный хитозан (степень анетилирования 18%), а также низкомолекулярные хитосахариды - ди- и три-М-ацетилглюкозамин.

Хитиназы Bacillus licheniformis обнаружили сравнимую активность по коллоидному хитину и по трисахариду. Исключением является хитиназа-66, слабо активная по всем испытанным субстратам. Субстратная специфичность хитииазы-49 не изучалась, поскольку этот фермент оказался очень нестабильным. 53- и 42-кДа множественные формы имеют близкие ло величине активности, кроме активности по "кристаллическому" хитину. Хитиназа-62, которая по молекулярным характеристикам отличается от выше

Таблица 3. Субстратная специфичность хитиназ Bacillus, (удельная активность, ед. акт./мг).

Bacillus licheniformis Bacillus cereus

Субетрат pH 66 кДа 53 кДа 42 кДа 62 кДа 49 кДа 68 кДа 52 кДа 38 кДа

коллоидный XIITIIH 5,0 0,9 14,5 17,3 14,4 13,5 0,8 1,7 6,7

«кристаллический» хитин 5,0 0,1 И 0,1 0 ... 0 0 0,1

коллоидный хитозан 6.4 0,3 0,2 0,4 0 ... 0 0 1,2

5,0 0,6 2,2 4,7 14,4 0 0 6,0

хнтотрмоча 5.5 0,03 0,3 0.3 3,2 ... 0.2 0,2 0,4

хитобпош 5.5 0 0 0 0 ... 0 0 0

— не определяли

упомянутых «(¡ерментов, показала существенно более высокую активность по коллоидному хитозану и трисахариду, чем остальные хитиназы Bacillus licheniformis. что подтверждает ее индивидуальность и отлнчие от группы близкородственных хитиназ.

3.2. Молекулярные и функциональные свойства хитиназ Bacillus cercus

Лмишжонцевые последовательности хитина'!. Установленные амнноконцевые последовательности 52- и 38-кДа хитиназ Bacillus cereus не совпадают друг с другом

Chi 3S

(6)

Рис. 13. pH-Зависимость активности (а) и стабильности (б) хитаназ -68, -52 и -38 Bacillus ceretis. (а) Для определения активности использовали 0,1 М буферные растворы: фосфат-цнтратнын. pH 3,0-7,0; Na-фосфатныи, pH 8,0; Трнс-НС!, pH 9,0; CAPS (3-(Ш1КЛогекснлампно)-1-пропансульфоновая кислота), pH 10,0-11,0. Конечная концентрация фермента в буферном растворе - 0,03 o.e. Ан<Лш. Максимальную активность данного фермента принимали за ¡00%. (б) К 0,1 мл 0,1 М буферного раствора с pH от 3 до 11 (см. подпись к pnc.Sa) добавляли 5 мкя водного раствора фермента (конечная концентрация - 0,03 o.e. Ано/мл) и инкубировали 16 часов при 30". Затем каждый раствор титровали 0,1 М фосфат-цитратным буфером, pH 4,0-6,0, до конечного значения pH 5,0; общий обьем раствора доводили дисптпрованнон водой до 0,3 мл, добавляли 0,5 мл 1%-ной водной суспензии коллоидного хитина и инкубировали при 37°. Количество растворимых продуктов реакции оценивали по реакции восстанавливающих групп с дшигросалпциловой кислотой. За 100% принимали исходную активность фермента при pH 5,0.

Рис. 14. Влияние температуры на активность (а) и стабильность (б) хитиназ -68, -52 И -38 Bacillus ceretis. (6) 0,3 мл раствора фермента (0,03 o.e. Ато/мл) в 0,1 M фосфат-цитратиом буфере, pH 5,(1, ппкубнровалн и течение 30 мнн. при соответствующей температуре. Чатем раствор охлаждали до 20" и добавляли 0,5 мл 1%-Hoii водной суспензии коллоидного хитина. Ximinaaiiyio активность оценивали по реакции растворимых ииарон с днннтросалншшовон кислотой. Ча 10(1% принимали активность <|>ермепта нрн 20". (Щ К 0,3 мл раствора ферме! гги и 0,1 M фосфат-цшратном буфере, pli 5,0, (0,03 o.e. Лгко/мл) добавляли 0,5 мл 1%-нон подпой cyciieiriini коллоидного xi ni uni il пнкубнроналп or 2 до 60 mihi., в зависимости or температуры. 1'еакншо iKT.in.ili'lllu.uili добавлением реагента с лшшгросалпцнлоион кислотой. 'ta 100% нршшмалп максимальную акшиность фермента в единицу времени.

и с известим» послсдователыюстямн бактериальных хитиназ (рис. У). Возможно, > ш белкн уникальны. H го же время, нельзя исключить вероятность родстнл данных (|)ермс1и<41. гак как сравниваются лишь небольшие участки их нервнчпон структуры. - различие молекулярных масс может быть обусловлено процсссннгом в N-концспых участках молекул.

N-KoiicH бХ-кДа хитиназы оказался недоступным для секвенироваиия, нероя гио, из-за модификации аминокоицевого остатка. Имеете с тем, отсутствие HMMvno.Toi пческой реакции между антисывороткой к 68-кДа белку и хитииазамн с молекулярной массой 52 и 38 кДа (рис. 106) указывает на то, что 68-кДа хитнпаза структурно не родственна двум другим выделенным ([юристам Bacillus cereus. Возможно, в ICHOMC данного штамма имеется по меньшей мере три разных структурных гена хитиназ.

Лмнноконцевая последовательность белка с молекулярной массой 62 кДа идентична N-кониевому участку 52-кДа хитнназы. Различие молекулярных масс них белков может быть обусловлено неодинаково протекающим

ностграпеляционным процесспигом С-концевой части

молекулы-предшественника, или разной протяженностью кодирующих стуктурных генов. Нельзя также исключить возможность лротеолитнческон деградации 62-кДа белка в процессе выделения.

'¡акисимость активности и стабильности хитинач от pH (Табл. 2). Функциональные характеристики выделенных хитиназ Bacillus cereus довольно близки, хотя и не идентичны. У всех трех ферментов имеется отчетливый оптимум активности по коллоидному хитину при кислом значении pH (рис. 1 За), что характерно для большинства изученных бактериальных хитиназ. В щелочной среде активность хитиназ Bacillus cereus снижается, причем если 68- и 52-кДа хитиназы при pH 10 сохраняют 70-85% активности, то 38-кДа хитииаза в зтих условиях проявляет только 5% активности. Отсутствие выраженного оптимума активности в щелочной среде отличает хитиназы Bacillus cereus от хитиназ Bacillus licheniformis.

Все хнтииазы Bacillus cereus при 30° С стабильны в диапазоне pH от 4 до 10, а 38-кДа хитпназа - даже при pH 11 (рис. 136).

Влияние температуры ¡ta активность и стабильность хитиназ (Табл. 2). При pH 5 температура 60° С является критической для всех трех хитиназ Bacillus cereus - после получасовой инкубации ферментов при этой температуре сохранялось 50% их активности (рис.146). При 60° С лучше всего проявляется и каталитическая активность 68- и 38-кДа хитиназ, тогда как хитиназа-52 наиболее активна при 50° С (рис.140,). Таким образом, по температурным характеристикам хитиназы Bacillus cereus также отличаются от изученных нами хитиназ Bacillus licheniformis.

Субстратная специфичность хитинач (Табл. 3). 68- и 52-кДа хитнназы гидролизумт только коллоидный хитин, в то время как 38-кДа хитиназа отличается широкой субстратной специфичностью, расщепляя не только коллоидный, но и "кристаллический" хитин, а также хитозан.

Удельная активность 38-кДа хитиназы по отношению по коллоидному хитину в четыре раза больше, чем удельная активность хитиназы-52 и в восемь раз больше удельной активности 68-кДа хитиназы.

Удельная активность 38-кДа хитиназы Bacillus cereus по растворенному хптозану. pH 5, Ii два раза больше, чем но коллоидному, pH 6,4. По-виднмому,

наблюдаемый >ф||к:к[ обусловлен тем, что расширенный субстраi более доступен денешию хи niiia i.

Хитиназы Bacillus cercus гак же, как исследованные нами хнтнпазы Bacillus lichcmformis, по активны по отношению к ди-М-ацетилглюкочамину и очень медленно шдролтукн гри-М-ацеишгдюкозамиц, поэтому, согласно номенклатуре IUB 19X4 г., эти (|х;рме11гы следовало бы отнести к эндоглюканотидролазам. Тем пс менее, известен целый ряд хитиназ, способ действия которых не учтен к современной номенклатуре. Так, например, 47-кДа хппшача Sirepiomyces oliraccoviriilis не ruApuninyev дн-М-ацетплтлюкозамнн, однако но способу действия это типичный экчо<|х:рмс|гг, поскольку от хитина и хитосахаридов он последовательно отщепляет только хитобнозу [Blank, Н. et «/., 1993]. С учетом литературных данных, ни один ич выделенных нами с|)срмснтов нельзя однозначно отнести к группе эндо- или жчоглюканогидролаз.

4. Множественные формы хнткиаз Bacillus licheniformis и Bacillus cereus и их срапнснис с другими бактериальными хитипазами

По первичной структуре изученные в настоящее время бактериальные хппшазы делятся на три группы - А, В и С [Watanabe, Т. et al., 1993]. В пределах каждой группы каталитические домены обнаруживают более 30% совпадений но аминокислотным остаткам, тогда как между последовательностями хитиназ разных групп совпадений не найдено, за исключением нескольких остатков, непосредственно вовлеченных в катализ, а также 8-12 остатков, участвующих в стабилизации структуры активного центра.

Аминокоицевая последовательность 53-кДа хитиназы Bacillus licheniformis обнаружила сходство (5 из 11 идентифицированных остатков) с N-концевым участком 74-кДа хитиназы AI Bacillus circulans, принадлежащей к группе А бактериальных хнтнпаз (рис. 9). Судя по N-концевым последовательностям, хнтнназе-53 явно родственны хитиназы-66 и -42. По-видимому, 53-, 42- и 66-кДа хитиназы Bacillus licheniformis относятся к одной и той же группе ферментов. Характерно, что аминокислотные последовательности хитиназ этой группы начинаются с каталитического домена, тогда как у других хитиназ каталитическому домену предшествуют домены с другими функциями.

N-концевые последовательности хитиназ -49 и -62 Bacillus lichenformis, а также хитиназ Bacillus cereus не проявляют сколько-нибудь значимых соответствий с первичной структурой известных бактериальпых хитиназ. На основании этого можно допустить, что найдены новые типы бактериальных хитиназ. Все же следует иметь ввиду, что проанализированы короткие отрезки полипептидиых цепей, поэтому нельзя полностью исключить возможность того, что совпадения существуют, а представленные N-копцы образовались вследствие ограниченного про теолнза более протяженных участков молекул.

Таким образом, данные но разделению хитиназ Bacillus, их молекулярным, иммунологическим свойствам и субстратной специфичности подтверждают, что каждый из изученных нами штаммов продуцирует комплекс хнтинолитичееких фсрмситок. Очевидно, для бацилл явление множественности хитиназ не менее характерно, чем для других бактерий. Секреция комплекса хнтииолитичееких ферментов покачана для Serratia marcesccns [Jones, .1. et til., 19X6] и целого ряда

прентомнцеюи [.loslii, S. cl al., 19X9; Miyashita, K. et al., 1991, 1993]. Разнообразие ;итииа< отражает множественность кодирующих структурных генов и/нлн юзташюсть иосггрансляцношюй модификации, в которой ведущую роль играет н рашшеиный протеолнз.

Комплекс внеклеточных хититп может иметь существенное значение для ¡рнснособления бактерий к использованию различных источников хитина.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения индпвидуалиых хитиназ из культуралыюй кидкостн Bacillus cercas шт. ВКПМ-6838 и Bacillus lichenformis шг. ВКПМ-6839, (снованный на использовании гидрофобной хроматографии на Butyl-Toyopcarl, юнообменной хроматографии на Mono Q и гельфильтрации.

2. Показано, что R форма Bacillus licheniformis продуцирует 66- н 59-кДа итиназы, a S форма - хитиназы -53, -49 и -42. Впервые охарактеризованы голекулярпые и знзиматические свойства этих ферментов. Сходство N-концевых юследователыюстей и иммунологических свойств 66-, 53- и 42-кДа хитиназ казывает на то, что данные белки близкородственны, а хитиназы -53 и -42 скорее ;сего кодируются общим структурным геном. Выявлено сходство аминоконцевых юследователыюстей хнтнназ Bacillus licheniformis с молекулярной массой 53, 42 и >6 кДа и N-концевого участка хитиназы Al Bacillus circulons, принадлежащей к руппе А бактериальных хитиназ.

3. Впервые выделены внеклеточные хитиназы Bacillus cereus с молекулярной laccofi 68, 52 и 38 кДа. Изучена зависимость свойств этих ферментов от pH и емпературы, а также их субстратная специфичность. Хитиназы -38 и -52 1азличаются по молекулярным свойствам. 68- кДа хнтиназа нчмунолигическн не юдствешм двум другим хитиназам штамма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Трачук Л.А., Шемякина Т.М., Честухина Г.Г\, Степанов В.М. (1996) (итиназы Bacillus cereus: выделение и характеристика, Биохимия, 6J (2), стр.35768.

2) L.A.Trachuk, L.P.Revina, T.M.Shemyakina, G.G.Chestukhina, V.M.Stepaaov 1996) Chitinases of Bacillus licheniformis B-6839:, isolation and properties. Cañad. J. dicrobiol., 42(2), pp. 171-183.

3) Честухина Г.Г., Трачук Л.А. (1993) Glu-специфичная протеиназа из Bacillus р. III Симпозиум "Химия цротеолитических ферментов", Москва, стр.23.

4) Трачук Л.А., Ревина Л.П., Шемякина Т.М., Честухина Г.Г. (1993) Изучение .итиназкой активности Bacillus licheniformis шт. В-6839. Конференция "Биосинтез ¡x-'рментов микроорганизмами", Москва, сгр.106.

5) G.G.Chestukhina & L.A.Trachuk (1996) Bacterial chitinases as potential plant >rotection agents. Symposium '"Molecular responses of plants to biotic and abiotic tresses", Helsinki, pp. 32-33.