Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика хитиназ бактерий Bacillus licheniformis и Bacillus cercus

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика хитиназ бактерий Bacillus licheniformis и Bacillus cercus"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОМ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.152.3

ТРЛЧУК ЛЕСЯ АНАСТАСЬЕВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ХИТИНАЗ БАКТЕРИЙ Bacillus licheniformis и Bacillus cereus

03.00.04. - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Диссертационная работа пышшисия п лаборатории химии белка ГосНИИГенетнка, г.Москва

Научные руководители: доктор химических наук, профессор В.М.Сгеиаиов, доктор биологических наук Г.Г.Честухииа

Официальные оппоненты: член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор И.С.Кулаев,

доктор химических наук Л.М.Гинодман

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита состоится "/0 " шОкл 1996 года в часов на заседании Специализированного совета Д.053.05.32. при Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. Автореферат разослан " 6 " 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного сонета

М.В. Иванов

ОБЩАЯ ХЛРЛКТКРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Участвуя в утилизации хнтинсодержащих нательных субстратов, хитииазы играю г существенную роль и метаболизме югнх подлых к почвенных сапрофнтов. Изучение тгнх <|>ерментов необходимо для мхнмической характеристики бактерий-продуцентов. Среди продуцентов гинач видное место занимают бактерии рода Bacillus, однако, г, настоящее время щшлярные хитииазы изучены недостаточно, практически ие исследован и иомен их множественности. Множественность бактериальных хитиназ вносит ределениые затруднения в их фракционирование и получение индивидуальных чков, полому особую значимость приобретает разработка новых подходов к щелешпо и очистке этих ^крментоп.

Подробное исследование свойств малоизученных бациллярных хитиназ обходимо для оценки перспективности использования их структурных генов в 1данни трансгенных растений, устойчивых к патогенным грибам и насекомым--■дителям. Поиск бактериальных штаммов, интенсивно продуцирующих хитииазы, м.ма перспективен для получения фунгнцидных и энтомоцидных препаратов.

Целмо данной работы являлась разработка методов очистки внеклеточных шназ бактерий рода Bacillus, а также подробное изучение молекулярных и пкциональных свойств полученных индивидуальных <[>ерментов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Для выделения жлеточиых хитиназ Bacillus разработан эффективный подход, основанный на юльзовании гидрофобной хроматографии иа Butyl-Toyopearl, ионообменной »матографии ка Mono Q и гельфильтрации. Впервые выделены и фактеризованы пять ферментов хитинолитического комплекса R и S вариантов .7lins ticheniformis, а также три хитииазы Bacillus cereus. Определены чекулярные массы, аминоконпевые последовательности, иммунологические iicrisa и субстратная специфичность индивидуальных хитиназ, а также лсимость их функциональных свойств от pH и температуры.

Разработанная схема выделения хитиназ может быть применена для очиегкн юбных ферментов других микроорганизмов, в том числе и для фракционирования пк о родственных хитиназ. Данные, полученные при изучении молекулярных и иматических свойств очищенных ферментов, могут быть использованы для пировапия структурных генов хитиназ.

Показано, что Bacillus lichcniformis шт. В-6839 является активным продуцентом пназ и может быть использован для получения фунгицидных и чнтомоцидных плратоп, а глкже для промышленной переработки хитина и хитозана.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на III по шуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва, 1993), на всероссийской <1>ерсшшн "Биосинтез «[¡ерментов микроорганизмами" (Москва, 1993), на сдулародном симпозиуме "Молекулярные ответы растений на биотические и отичсские стрессы" (Хельсинки, 1996), на семинаре лаборатории химии белка НИИГенетнка 19 марта 1996 г. и на заседании кафедры биохимии МГУ 1 апреля Г) I'.

Публикации. По ма териалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора jparypi.i. посвященного характеристике хитиназ, изложения полученных

рсзулма ion Ii их обсуждения, выводов, жспернмспталыюп част п списка

нитруемой jinicpaiypi.i. Работа изложена па 132 стр., »ключам 21 рис. и Этлииц Пнблшм ра(|)н>| включает ÍS6 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ()i(ío|i Пактсрии - продуцентов хитинах Культуральнме особенности штаммоп Bacillus licfteniformis и Bacillus curcas.

Способность осветлять агаризопанную среду с коллоидным хитином, указывающая на сскрснию хитиназ, была выявлена у 70 из 100 тестированных нами бациллярных штаммов. При подборе оптимальных условий глубинного культивирования наибольшую хнтинолитическую активность обнаружили клетки Bacillus lichcniforniis: на среде, содержащей измельченный хитин панцирей крабов и белково-витамшшый концентрат, продуктивность данного штамма составляла примерно 2 единицы активности на один мшшлитр культуралыюй жидкости, что сопоставимо с продуктивностью коммерческих штаммов Serrada [Joshi, S. et ai., 1989, Monreal, J. et al., 1968] и Streptomyces [Robbins, P. et al., 1992]. Значительный, в сравнении с остальными штаммами, уровень хитиназной активности проявил также штамм В-6Н38 Bacillus cereits. Эти штаммы Bacillus licheniform и Bacillus cereus были использованы для выделения, очистки н характеристики хитиназ.

Олнгоспорогснныи штамм Bacillus lichenifurmis В-6839 обнаружил выраженную склонность к диссоциации на морфологические варианты. При рассеве исходной культуры на чашки с агаризованиой средой, содержащей коллоидный хнтин, по фсиотипичсским признакам были отобраны колонии R, S и М типа. При глубинном культивировании между ними обнаружились различия в уровне секреции хнтнназ и протенназ (Табл. 1).

Таблица 1. Ферментативная активность в культуралыюй жидкости R, S и М вариантов

Bacillus licheniformis.

Нлрнанты Активность в культуралыюй жидкости, ед. якт7мг/мл:

хнгнназы протепиазы (по Z-Ala-Ala-Leu-NHC4i,NO;)

R 0,8 0,01

S 1,3 15.0

М 1,7 25.0

М форма оказалась неустойчивой - в процессе культивирования она диссоциировала па S и R варианты, поэтому были изучены только хнтнназы, секрстируемме двумя последними вариантами.

ЮК I (OK п

2Л 20

кдя

_65

211 жя» _45

аа» _36

_29

_24

_20

ш

я* _14

1'пс. I .Ds-Na-шектрофорсз н 12%-иом ПЛАГ белков, секретнропанных Bacillus cereus после культивирования в теченис 45 часов на среде с MnSOj (КЖ I) и на среде без MnSC)4 (КЖ II).

При культивировании клеток Bacillus reretts было выявлено, что добавление i питательную среду сульфата марганца стимулирует увеличение хитиназной iKiTiBiiocTii примерно в два раза. При этом изменялся спектр секретируемых >елков, и частности, появлялись дополнительно в значительных количествах >елкн с молекулярной массой 68 и 62 кДа (рис. I).

!. Выделение хитиназ Bacillus.

Для выделения хитиназ из культуральной жидкости бацилл была разработана :хема, основным этапом которой является гидрофобная хроматография на колонке с iulyl-Toyopearl. Применение этого метода позволило удалить гидрофильные фнмеси и разделить хитиназы с близкими молекулярными свойствами. 1.1. Хитиназы Bacillus licheniformis

!.1.1. Хитишпы, образуемые S вариантом. Белки культуральной жидкости S варианта шделяли г.ысалнванием (рис. 2). Примесные протеиназы, содержащиеся в осадке в шачительном количестве, отделяли сорбцией на асЭДяшном сорбенте бацитрацин-:илохроме. Не связавшуюся с колонкой фракцию хитиназ хроматографировали на iutyl-Toyopearl в 0,1 М Na-фосфатном буфере, pH 7,3, содержащем 0,6 М (NFLtb SC)4 >,43 М (NH4)2 SO» был элюирован пик S1, а (|юсфатным бугром, не содержащим :ульфа :а аммония, - пик S2 (рис. 3). При анионообменной хроматографии пика SI на Vlono Q, 0,16 М NaCl злюиров;шся пик SI-1, который, по данным Ds-Na->лектро([>ореза, содержал только белок с молекулярной массой 53 кДа - хитиназу-53 рис. 5). При хроматографии в аналогичных условиях пика S2, в котором преобладал Зелок с молекулярной массой 42 кДа, 0,18 М NaCl элюироаались три пика - S2-1, S2-2 1 S2-3 (рис. 4), - все они содержали хитиназкую активность. Рехроматография S2-I на Vlono Q дала чистую хнтиназу-49 (рис. 5). Гель-фильтрация S2-3 11а Superdex 75 юзполила выделить чистую хитиназу-42 (рис. 5). Фракция S2-2 содержала грудноразделнмуи) смесь обоих ферментов. Общий выход хитиназ S-варнапта но iK iiiiiiiocni составил 44%.

Kyjll.rypUJlMUDI жидкость

Суисриатант

Осадок

(¡¡щитрацин-силохром

Сорбировавшиеся иротснназы

Несвмзашииссн хнтиназы

ик S1

Butyl-Toyopearl

пик S2

Mono Q

пик S1-1 (chi-53)

пики S2-1

S2-2

S2-3

Mono Q

Superdex 75

пик S2-1-1 (chi-49)

пик S2-3-1 (chi-42)

Рис.2. Схема выделения и очистки хитиназ S варианта Bacillus lichemformis.

2.1.2. Хчтшшчы, образуемые R вариантом. Культуральную жидкость R варианта непосредственно наносили на колонку с Butyl-Toyopearl, уравновешенную 0,1 М Na-<|к>ефатиым буфером, рН 7,3, содержащим 0,6 М сульфат аммония. Связавшиеся с колонкой белки элюировались в виде двух пиков: 0,25 М (NHth SO4 был ■мынроваи пик R1, затем, Ыа-фосфатным буфером, рН 7,3, - пик R2; оба пика обнаружили хитиназную активность (рие. 6а). По данным Ds-Na-weKTpo(|x)pe3a, пик R2 содержал только один белок с молекулярной массой 66 кДа - чистую хитиназу-66 (рис. 5). При разделении белков пика R1 анионообменной хроматографией на Mono Q, 0,1 М NaCl элюировался пик R1-1, который содержал преимущественно хнтиназу с молекулярной массой 62 кДа (рис. 66).

0,2 ОД

(а)

30 50 Фракции

'нс.З. (а) Хроматография на Butyl-Toyopearl хитиназ S варианта. Колонка (5.5x15 см) ■раиновешепа 0,1 M Na-фосфатньш бугром, рН 7,3, содержащим 0,6 M (NHi);SO<. Стрелка i ■Потачает начало 1люшш (2 мл/мпн.) 0,1 M Na-фосфатным буфером, рН 7,3, содержащим 0,43 M Nll4)2.S()4 ; стрелка 2 укачивает па начало злюшш тем же Gyijœpavi без (N44)2X04. —,Аз»о:|—i, ipaKUim, содержащие хнтнназную активность. (б) Электрофорез в 12%-ном Ds-Na-ПААГ пиков SI и >2, полученных в результате хроматографии на Butyl-Toyopearl. Молекулярные массы бе'жов-ганлартов указаны С1ева.

Si-l S2-2 S2-Î

0,4

.0,3 0,2 0,1

10 30 50 Объем, мл

00

(б)

'мс.4. (а) Лиионообмеиная хроматография lia Mono Q пика S2. Колонка HR5/5 ¡îaiiiioiieineiia 0,05 M Tris-HCI, рН К,5. содержащим 2 M мочевину. Скорость злищнн 0,5 мл/мни. — . .»■■: —. Na('I. (0) Электрофоре) и 12%-ном Ds-Na-ПАЛГ никои S2-I. S2-2 и S2-3. Молекулярные ассы Пелкон-сгапдартон указаны слева.

Чистя хилг.назл-(>2 была получена поело рехромаюграфии пика К 1-1 и тех же условиях. Общин выход хнттшазнон активности R варианта составил 5Х%.

S 8 Я Sf SJ ■■ё '-ё

0,4 0,3

•

т

п

< О, 0,1

(а)

110 130 150 Фракции

Рис.5. Электрофоре» » 10%-ном l)s-N.i-l 1ДДГ очищенных хнпшш Ihirilhu liclwinfiirmis с молекулярной -Miiccoii Oft. 62. 53. 4У п 42 кД.1. Молекулярные массы бснкок-сганларто» укачаны слева.

8 <

и 0,8 0,1

Ч

R1-1 / и

\

\ \

✓ V V

/

г

0,2

0,1

30 50 Объем, мл

70

(б)

Рис.6, (а) Хроматография на Butyl-Toyopearl культуралыюй жидкости R варианта Bacillus lichenifurmis. Условия фракционирования см. подпись к рнс.З. —, члюция градиентом (NH-ibSOi;

—,А2»о: фракции, содержащие хнтиназную активность, (б) Анионообменная хроматография пика Rinn Mono Q. Условия фракционирования: см. подпись к рис.4. — , Агм; i—i, пик, содержащий хнтнначную активность.

2.2. Хнтииазы Bacillus cereus

Для выделения хитииаз использовали культуральные жидкости, полученные при культивировании клеток Bacillus cereus на средах с сульфатом марганца - КЖ I, и без сульфата марганца - КЖ II. Культуральные жидкости I и II наносили на колонку с Butyl-Toyopearl.

Г-2 1-1

кДя

0,3

65_ Ii i * ifcHW)

45_ 36_ .»MM» mj>

0,4 g 29_

N 24_

*

0,1 20_

(0 so

Фракции

(б)

Рис.7. (а) Хроматография на Butyl-Toyopearl белков Bacillus cereus, содержащихся в КЖ [, Колонка (5,5x15 ш1 уравновешена ОД М Nii-фосфатным буфером, pH 7.3, и О,Я М (NH^jSO^ —-'нвши фалментом (N114)7504 (2 мл/мин.);-Аг«д;|—(фракции, содержащие хптпшиную актив!гость, (б) Ds-Na- weicrpo([iope-i в12%-ном ПАЛГпнков 1-1 и 1-2.

Рис.8, (а) Хроматография на Butyl-Toyopearl белков Bacillus ccreus, содержащихся в КЖ II. Условия хроматофафии :i обозначения: см. подпись к рис. 7. (б) Ds-Na-члектрофор« в 12%-ном ПЛАГ пиков II-1 н II-2.

Связавшиеся с сорбентом белки культуральной жидкости I элюировались двумя пиками: пик 1-1 элюировался 0,44),35 М (МН^гЗО« при рН 7,3, а пик 1-2 - 0,1 М Ыа-<|>осфатиым бу<[>ером, рН 7,3 (рис. 7а). По данным Оя^а-электрофореза, первый пик содержал белки с молекулярной массой 62 и 52 кДа, а второй - 68- и 38-кДа белки (рис. 76). В обоих пиках имелась хитиназная активность.

68- и ЗЯ-кДа белки были разделены гель-фильтрацней на Яирег(]ех 75 - оба они I ндролнзовалн коллоидный хитин.

Разделить 62- и 52-кДа белки не удалось, почтому для выделения 52-кДа белка была использована культуральная жидкость, в которой белок с молекулярной

массой 62 кДа отсутствовал, - КЖ II. Хроматография мой кулыуралыюй жидкости на Butyl-Toyopcarl шпиолила получить ник II-l (рис. 8а), содержащий только белок с молекулярной массой 52 кДа - хнтиназу*52 (рис. 86).

Таким образом были выделены внеклеточные хитнназы Bacillus ccrcus с молекулярной массой 68, 52 и 38 кДа. 62-кДа белок выделить не удалось, по его N-коицевую последовательность определили после переноса белка in пластики полнакриламидпого геля па ноливншшфгоридную мембрану.

3. Характсрисгика хигииаз Bacillus

3.1. Молекулярные и функциональные свойства хитиназ Bacillus liclteniforniis.

Л.ишшкшщевыс пнслсдокателышсти и ¡камер молекул хчтишп (рис. 9). Хотя все амшюконцевые последовательности выделенных нами хитиназ Bacillus liclicnijbrmis п той или иной степени различаются, в них имеются и сходные мотивы. Наибольшее сходсгво обнаружили хитнназы -42 и -53. Не исключено, что замена Asp/Gly в девятой позиции N-концевого участка хнтниачы-42 обусловлена неполным отщеплением остатка Gly8. Таким образом, имеющееся различие может быть артефактом, и происхождение 42- и 53-кДа белков связано с нроцессннгом С-концевой части молекулы.

Аминоконцевая последовательность хнтиназы-66 обнаруживает шесть совпадений ¡последовательностями 42- и 53-кДа хитиназ (из семи остатков, поддающихся сопоставлению). Наличие тирозина в четвертой позиции N-концевой последовательности двух последних хитиназ - остатка, идентификация которого методом Эдмана обычно не представляет затруднений, - указывает на то, что представленные аминокислотные последовательности хитиназ -42, -53 и -66 не идентичны. N-концевой остаток аспарагиновой кислоты, отличающий хитиназу-66, возможно, является результатом

Bacillus circulans chiA1 Bacillus liehen ¡form is шт. B-6839 chi66 chi53 Chi42 chi62 chi49

Bacillus ccrcus шт. B-6838 chi38 chi52 chi62

Asp

Ala Asp Ser Tyr Lys Ile Val Gly

Gly Gly Asn Asn Tyr Ile Ile

Gly Gly Asn Tyr Tyr Ile Ile Gly

Gly Gly Asn Tyr Tyr Ile Ile Gly

Tyr

Туг Pro

Asp Туг Pro Gly

Gly Thr Arg Glu Val Gly Ile Phe Thr Phe Pro

Ala Asn Asn LeuGly Ser x [Asp Ser" Gin" x" Gin Gly" Gin Asp 1 Fe" Val] ;AsP_S-eI_x _Gin Gly Gin A_sp_Ile Val j

Рис.9. Аминоконцевая последовательность хитиназ Bacillus lichenifurmis шт. B-6839 и Д circulans [Walanabe. Т. et al„ 1У90]. Совпадающие аминокислотные остатки обведены.

неодинаково протекающего процсссинга предполагаемого предшественника хиишаз. Вполне вероятно, что имеется по крайней мере два структурных гена -один кодирует хитиназу-66, а другой - 53- и 42-кДа ферменты. Различие длины

К)

полипом i и.'шых ценой может быть обусловлено либо существенной разницей в длине сфуктурпых генов, либо интенсивным ограниченным нротеолнэом С-концевых участков (]юрменгон.

Последовательности Х1гшназ-62 н -49 па изученном, впрочем, небольшом о гречке подниентндиои цени, практически не совпадают друг с другом и с носледоиа 1елы1остямн остальных хнтнназ Bacillus Hcheniformis.

Таким образом, в iviiomc данного штамма, вероятно, имеется но меньшей мере четыре различных reim хипшаз, два из которых (ген, кодирующий хитнпазу-66 и теп. кодирующий 53- и 42-кДа множественные <|х>рмы) близкородственны.

Это предположение подтверждается иммунологическими данными, которые ясно указывают на сходство 66-, 53- и 42-кДа хитиназ между собой п на их о тличие от хн тнназ-62 н -49 (рис. 10а).

(а)

1.4 -chi 42

2 - chi 66

3 - chi 53 5 - Chi 62 6-Chi49

(G)

1,2-chi 68 3,4 - chi 52 5,6 - chi 38

I'iic. К). Диализ хнтнназ Bacillus Hcheniformis (а) и Bacillus ceretis (б) методом двойной дш|х|)уэии в геле по Оухтерлони. (а) Лунка, расположенная в центре, содержит антнсыворотку к хитина ie-53: лунки 1 (м 4), 2, 3 и 5 содержат xiiTiinajy-42, -66, -53, -42, -62 и -49 соответственно. (П) Центральная лунки содержит антнсыворотку к Х1гтиназе-68, лункн 1 и 2 - хнтнна)у-68, лунки 3 и 4 -хитина iy-52. лункн 5 и 6 - ximinaiy-Зй. Копиейграипя белка в растворах 1 мг/.чл. внесены алпквоты по 10 и 5 мкл.

Таблица 2. Фнзнко-химнческнс свойства хитиназ Bacillus.

Свойства Bacillus Hcheniformis Bacillus cereus

молекулярная масса, кДа 66 53 42 62 49 68 52 38

pl 4,6 4,5 4,5 4,4 -- — — ...

рЦ-оптпмум 3.5-5.5 3,5-5,5 3.5-5.5 3,5-5,5 4.5-6.0 4 4 4

8.5-9.5 9-10 9-10 8.5-9.5 8.5-9.5

pH стабильности (12 ч.) 4-1(1 4-10 4-10 4-10 4-1(1 4-10 4-1(1 4-11

T°-nimiMVM 70° 7(1° 70 0 90° 70° 60° 51)° 60е

Т° стабильности (3(1 мни.) 65° 65° 6fl" 75° 60° 60° 60° 60°

— не определяли

Несмотря на отмеченные различия в строении молекул, физико-химические характеристики изученных хитиназ Bacillus Hcheniformis в значительной степени сходны. И частности, их изо электрические точки почти идентичны и coothcictbvioi pH 4.5-4.7.

100 so

S 60 с

= 40

•л <

20 О

3

(а)

7

рн

clii 62 J00

chi 53 ■Д

chi 6ft &80

с

n

Chi 49 P60

itf

«

«

I40

H

g 20

О

9 10 11

10 11

Рис. 11. рН-Зависнмость активности (а) и стабильности (б) хитнназ -66, -62, -53 и -49 ВасШих Ис1гсП1/огт1Х. (а) Для определения активности использовали 0,05 М буферные растворы:: №-фосфат-цнтратньш, рН 3,0-6,0, Ыа-фосфатиын, рН 7,0-8,5, и Ыа-карбонатнын, рН 9,0-10,5. Конечная концентрация фермента в буферном растворе - 0,03 о.е. Аг«о/мл. Максимальную активность принимали за 100%. (б) Раствор фермента в соответствующем буфере (0,03 о.е. Агио/мл) инкубировали 12 ч. при 30°. За 100% принимали исходную активность фермента присоответствугащем рН.

Chi 62

20 30 40 50 60 70 80 90 100 Температура/С

20 30 40 50 60 70 80 90 100 Темпе ратура,°С

(а) (б)

Рис. 12. Влияние температуры на стабильность (а) и активность (б) хитнназ -66, -62, -53 и -49 Bacillus licheniformis. (а) 0,3 мл раствора ||>ермешгга в 0,1 M Tris-HCI, pH 9,0, (0,03 о.с.Агм/ мл) инкубировали 0,5 ч. при соответствующей температуре, «тем охлаждали до 4", добавляли 0.5 мл 1%-иого водного раствора коллоидного хитина и измеряли остаточную активность ximina i при 37". (б) К 0,3 мл раствора фермента в 0,1 M Tns-HCI. pH 9,0, добавляли 0,5 мл 1%-иого полного раствора коллоидного хитина и инкубировали разное время, к зависимости ■и температуры. 1'еакшпо останавливали добавлением 0,75 мл реагеша с дппш'росалнйнлоиом кмелогон.

В.тяние pH на активность и стабильность ферментам (Табл. 2). Хитиназы -66, -53, а также -62 м -49 обнаружили два pH-оптимума активности по коллоидному хитину - и области pH 3,5-5,5 и 8,5-10 (рис. 11а). Согласно литературным данным, двойной pH-оптимум активности имеется и у некоторых других бактериальных хнтпнач [Takayanagi, Т. el а!., 1991]. Это необычное свойство может быть следствием влияния pH на активность ферментов и/или на структуру полимерного субстрата.

Нее исследованные нами хитиназы Bacillus licheniformis стабильны в интервале pH от 4 до 10 (рис. 116).

Зависимость стабильности и активности хитинаi от температуры (Табл.2). Хитиназы Bacillus Hcheniformis сохраняют стабильность до 60-75° С (рис. 12а). Температурный оптимум активности 66-, 53- и 49-кДа хнтиназ - 70° С, тогда как хитиназа-62 проявляет наибольшую активность при 90° С (рис.126).

Субстратная специфичность хитиназ (Табл. 3). Для определения субстратной специфичности хнтиназ использовали полимерные субстраты - коллоидный хитин, "кристаллический" хитин и коллоидный хитозан (степень апеллирования 18%), а также низкомолекулярные хитосахариды - ди- и три-Ы-ацетилглюкозамнн.

Хитиназы Bacillus Hcheniformis обнаружили сравнимую активность по коллоидному хитину и по трисахариду. Исключением является хитиназа-66, слабо активная по всем испытанным субстратам. Субстратная специфичность хитиназы-49 не изучалась, поскольку этот фермент оказался очень нестабильным. 53- и 42-кДа множественные формы имеют близкие по величине активности, кроме активности по "кристаллическому" хитину. Хитиназа-62, которая по молекулярным характеристикам отличается от выше

Таблица 3. Субстратная специфичность хитиназ Bacillus, (удельная активность, ед. акт./мг).

Bacillus licheniformis Bacillus cereus

Субстрат pH 66 кДа 53 кДа 42 кДа 62 кДа 49 кДа 68 кДа 52 кДа 38 кДа

коллоидный xirriiH 5,0 0,9 14,5 17,3 14,4 13,5 0,8 1,7 6.7

«кристаллический» хнтнн 5,0 0,1 11 0,1 0 ... 0 0 0,1

коллоидный хиточан 6.4 0,3 0,2 0,4 0 ... 0 0 1,2

5,0 0,6 2,2 4,7 14,4 — 0 0 6,0

хптотрпоча 5.5 0,03 0,3 0,3 3,2 ... 0.2 0,2 0,4

хнтоПноча 5.5 () 0 0 и ... 0 0 0

— ни определят

упомянутых ([х-рментов, показала существенно более ьысокую активность по коллоидному хнтозану и трисахариду, чем остальные хитиназы Bacillus licheniformis. что подтверждает ее индивидуальность и отличие от группы близко роде 1 венных хитиназ.

3.2. Молекулярные и функциональные свойства хитиназ Bacillus cereus

Лмшюкоиценые последовательности хиттип. Установленные амнноконневые Поспелова ic.ii.пост 52- и 38-кДа хитиназ Bacillus cereus не совпадают друг с друг ом

10 12

(С)

Рис.13. рН-Зависимость активности (а) и стабильности (б) хитиназ -68, -52 и -38 Bacillus cereus. (а) Для определения активности использовали 0,1 М буферные растворы: фосфат-шггратныи. рН 3,0-7,0; Ыа-фосфатнын, рН 8,0; Трнс-НС!, рН 9,0; CAPS (3-(цпклогекенламиноИ-пропансульфоновая кислота), рН 10,0-11,0. Конечная концентрация фермента в буферном растворе - 0,03 о.е. Аао/мл. Максимальную активность данного фермента принимали ча 100%. (б) К 0,1 мл 0,1 М буферного раствора с рН от 3 до 11 (см. подпись к рис.5а) добавляли 5 мкл водного раствора фермента (конечная концентрация - 0,03 о.е. Агао/мп) и инкубировали 16 часов при 30°. Затем каждый раствор титровали 0,1 М фосфат-цитратным буфером, рН 4,0-6,0, до конечного значения рН 5,0; общий обьем раствора доводили дистилнрованнои водой до 0,3 мл, добавляли 0,5 мл 1%-ной водной суспензии коллоидного хитина п инкубировали при 37°. Количество растворимых продуктов реакции оценивали по реакции восстанавливающих групп с динитросалициловой кислотой. За 100% принимали исходную активность фермента при рН 5,0.

Рис.14. Влияние температуры на активность (а) и стабильность (б) хитиназ -68, -52 И -38 Bacillus cereus. (ff) 0,3 мл раствора фермента (0,03 o.e. Аво/мл) в 0,1 M фосфат-нитратном буфере, pli 5,0, инкубировали в течение 30 мин. при соответствующей температуре. Чатем раствор охлаждали до 20" и добавляли 0,5 мл 1%-noii водной суспентии коллоидного хитина. Хптипашую активность оцсшпыли по реакции растворимых Сахаров с дишп'росалпшшовон кислотой. За 100% lipimilM.LM! активность фермента при 20". (9) К 0,3 мл раствора ||крме1гга в 0,1 M фосфат-цшратпом буфере, pli 5,0, (0,03 o.e. Агко/мл) добавляли 0,5 мл 1%-иой волной cyciieirinii коллоидного хитина и инкубировали от 2 до С>0 мин., в ывнеимости or температуры. Реакцию останавливали добавлением реагента с дшпгфосалнцшюиой кислотой. За 100% принимали максимальную акч нипоегь фермента н единицу времени.

i с известными последовательностями бактериальных хи шназ (рис. 9). Кичможно, ни белки уникальны. И г» же время, нельзя исключить вероятность родства данных |юрмешо!1. так как сравниваются лишь небольшие участки их первичной :труктуры. - различие молекулярных масс может бы ть обусловлено процесспигом в "J-Koiiueni.ix участках молекул.

N-коисц 68-кДа хитииазы оказался недоступным для секвеннрования, lepoHHio, из-за М1>дн<|шкацпи аминоконцецого остатка. Вместе с тем, отсутствие 1ммунолотической реакции между антисывороткой к бХ-кДа белку и хнтиназами с юлекулярной массой 52 и ЗХ кДа (рис. 106) указывает на то, ч то 68-кДа хитниаза фуктурпо не родстпепиа двум другим выделенным (|>ерментам Bacillus remis. )озможио. u iciiOMc данного штамма имеется по меньшей мере три разных труктурных тепа хитиназ.

Лмннокопцевая последовательность белка с молекулярной массой 62 кДа |дептнчна N-концевому участку 52-кДа хитииазы. Различие молекулярных масс тих белков может быть обусловлено неодинаково протекающим

оспрамсляшюпным нроцесснигом С-коицсвой части

юлекулы-прсдшествешшка, или разной протяженностью кодирующих стуктурных сноп. Нельзя также исключить возможность протеолитической деградации 62-кДа елка в процессе выделения.

1инисимость активности и стабильности хитина:! um pH (Табл. 2). функциональные характеристики выделенных хитиназ Bacillus cereus довольно лнзки, хотя и не идентичны. У всех трех ферментов имеется отчетливый оптимум ктилности по коллоидному хитину при кислом значении pH (рнс.13а), что арактерпо для большинства изученных бактериальных хитиНаз. В щелочной среде ктивность хитиназ Bacillus rereiis снижается, причем если 68- и 52-кДа хитииазы при Н К) сохраняют 70-85% активности, то 38-кДа хитиназа в этих условиях проявляет олько 5% активности. Отсутствие выраженного оптимума активности в щелочной реде отличает хитииазы Bacillus cereus от хитиназ Bacillus licheniformis.

Все хитииазы Bacillus cereus при 30° С стабильны в диапазоне pH от 4 до 10, а Х-кДа хитниаза - даже при pH 11 (рис. 136).

Влияние температуры на активность и стабильность хитинач (Табл. 2). При Н 5 температура 60° С является критической для всех трех хитиназ Bacillus cereus после получасовой инкубации (¡»ерментов при этой температуре сохранялось 50% х активности (рис. 146). При 60° С лучше всего проявляется и каталитическая ктншюсть 6Х- и 38-кДа хитиназ, тогда как хитиназа-52 наиболее активна при 50° С рис. 149.). Таким образом, по температурным характеристикам хитииазы Bacillus i'i'eus также отличаются от изученных нами хитиназ Bacillus licheniformis.

Субстратная специфичность хитинаi (Табл. 3). 6Х- и 52-кДа хитииазы ндролнзуют только коллоидный хитин, в то время как ЗХ-кДа хитипаза тличается широкой субстратной специфичностью, расщепляя не только оллондный, но и "кристаллический" хитин, а также хитоэан.

Удельная активность 38-кДа хитииазы по отношению по коллоидному хитину четыре раза больше, чем удельная активность хитиназы-52 и в восемь раз олыие удельной активности 68-кДа хитииазы.

Удельная активность 38-кДа хитипазы Bacillus cereus по растворенному нтозану. pH 5, в два раза больше, чем но коллоидному, pH 6,4. По-виднмому,

наблюдаемый h|«|ici:i обусловлен чем, что растворенный субстрат более доступен действию хигнназ.

Хнтпнатм Jhicilhis ccrats так же, как исследованные нами хитиназы lktcillus Hchcnijormis, не ак тивны но отношению к дн-Г^-ацотнлглюкочамину н очень медленно шдроличуюг три-М-ацепштлюкочамнн, поэтому, согласно номенклатуре IUB 19X4 т., эти (¡xjpMcn ты следовало бы отнести к эндоглюкатч ндролачам. Тем но менее, iniiceicit целый ряд хптннач, способ действия которых не учтен н современной номенклатуре. Так, например, 47-кДа ximinaia Streplumyces olivaceoviridis не тндролпчусг ди-М-ацетшнлюкозамнн, однако но способу действия это типичный •1К'чо(|)ерме1| т, поскольку от хитина и хнтосахарндов он последовательно опцепляет только хитобиочу [Blaak, H. et al., 1993]. С учетом литературных данных, нн один из выделенных нами <|>ермснтов нельзя однозначно отнести к группе эндо- или экчоглюканогндролаз.

4. Множественные формы хитина] Bacillus lichenifttrmis и Bacillus ccreus и их сравнение е другими бактериальными хнпшазами

По первичной структуре изученные в настоящее время бактериальные хнпшачм делятся на три группы - А, В и С [Watanabe, T. et al., 1993]. В пределах каждой группы каталитические домены обнаруживают более 30% совпадений по аминокислотным остаткам, тогда как между последовательностями хнтиназ разных трупп совпадений не найдено, за исключением нескольких остатков, непоередсгвенно вовлеченных в катализ, а также 8-12 остатков, участвующих в стабилизации структуры активного центра.

Дмнпоконцевая последовательность 53-кДа хитиназы Bacillus licheniformis обнаружила сходство (5 из 11 идентифицированных остатков) с N-концевым участком 74-кДа хитиназы Al Bacillus circulons, принадлежащей к группе А бактериальных хнтнпаз (рис. 9). Судя по N-концевым последовательностям, хитнпазе-53 явно родственны хнтиназы-66 и -42. По-видимому, 53-, 42- и 66-кДа хитиназы bacillus licheniformis относятся к одной и той же группе ферментов. Характерно, что аминокислотные последовательности хнтиназ этой группы начинаются с каталитического домена, тогда как у других хигнназ каталитическому домену предшествуют домены с другими функциями.

N-концевые последовательности хитиназ -49 и -62 Bacillus lichenformis, а также хнтнназ Bacillus cereus не проявляют сколько-нибудь значимых соответствий с первичной структурой известных бактериальпых хнтиназ. На основании этого можно допусти ть, что найдены новые типы бактериальных хитиназ. Все же следует иметь ввиду, что проанализированы короткие отрезки полипептидных цепей, поэтому нельзя полностью исключить возможность того, что совпадения существуют, а представленные N-концы образовались вследствие ограниченного нро гсолпза более про тяженных участков молекул.

Таким образом, данные но разделению хитиназ Bacillus, их молекулярным, иммунологическим свойствам и субстратной специфичности подтверждают, что каждый из изученных нами штаммов продуцирует комплекс хитинолитических (|>ерментор!. Очевидно, для бацилл явление множественности хнтиназ не менее характерно, чем ;шя других бактерий. Секреция комплекса хш((политических <|>ермеитов показана для Serratia marresiens [Jones, .1. et al., 1986] и целою ряда

сгрентомпцетов [Joshi, S. cl al., 19X9; Miyashita, К. el al., 1991, 1993]. Разнообразие xirriiiia'i отражает множественность кодирующих структурных генов и/или иотганпость иоопраисляционпой модификации, в которой ведущую роль играет ограниченным иротеолнз.

Комплекс внеклеточных хитнназ может иметь существенное значение для приспособления бактерий к использованию различных источников хитина.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод выделения инднвидуалных хитнназ из куль гуральной жидкости Bacillus cereus шт. ВКПМ-6838 и Bacillus lichcnformis шт. ВКПМ-6839, основанный на использовании гидрофобной хроматографии на Bulyl-Toyopearl, ионообменной хроматографии на Mono Q и гельфильтрации.

2. Показано, что R форма Bacillus licheniformis продуцирует 66- и 52,-кДа хитиназы, a S ([юрма - хитиназы -53, -49 и -42. Впервые охарактеризованы молекулярные и энзиматические свойства этих ферментов. Сходство N-конневых последовательностей н иммунологических свойств 66-, 53- и 42-кДа хитиназ указывает на то, что данные белки близкородственны, а хитиназы -53 и -42 скорее всего кодируются общим структурным геном. Выявлено сходство аминоконцевых последовательностей хнтиназ Bacillus licheniformis с молекулярной массой 53, 42 и 66 кДа и N-koпаевого участка хитиназы AI Bacillus circulons, принадлежащей к группе А бактериальных хитнназ.

3. Впервые выделены внеклеточные хитиназы Bacillus cereus с молекулярной массой 68, 52 и 38 кДа. Изучена зависимость свойств этих ферментов от pH и температуры, а также их субстратная специфичность. Хитиназы -38 и -52 различаются по молекулярным свойствам. 68- кДа хитиназа иммунолнгически не родственна двум другим хитиназам штамма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1) Трачук Л.А., Шемякина Т.М., Честухина Г.Г., Степанов В.М. (1996) Хитниазы Bacillus cereus: выделение и характеристика, Биохимия, 61 (2), стр.357368.

2) L.A.Trachuk, L.P.Revina, T.M.Shemyakma, G.G.Chestukhma, V.M.Stepanov (1996) Chitinases of Bacillus licheniformis B-6839:, isolation and properties. Cañad. J. Microbiol., 42(2), pp. 171-183.

3) Честухина Г.Г., Трачук JI.A. (1993) Glu-специфичная протеиназа из Bacillus sp. III Симпозиум "Химия прогеолитаческих ферментов", Москва, стр.23.

4) Трачук Л.А., Ревнна Л.П., Шемякина Т.М., Честухина Г.Г. (1993) Изучение хитииазнон активности Bacillus licheniformis шт. В-6839. Конференция "Биосинтез (|>ерментов микроорганизмами", Москва, стр. 106.

5) G.G.Chestukhina & L.A.Trachuk (1996) Bacterial chitinases as potential plant protection agents. Symposium "Molecular responses of plants to biolic and abiotic stresses", Helsinki, pp. 32-33.