Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование хитинолитического комплекса бактериального штамма Vibrio sp. X

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабенко, Алексей Юрьевич

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Хитин.

1.1.1. Распространение хитина в природе.

1.1.2. Химическая природа и физико - химические свойства хитина.

1.1.3. Получение хитина из природных источников.

1.1.4. Биосинтез хитина.

1.1.5. Биологическая активность хитина и его соединений.

1.2. Хитиназы.

1.2.1. Первые этапы изучения бактериальных хитиназ.

1.2.2. Общие свойства хитиназ.

1.2.3. Распространение хитиназ в природе.

1.2.4. Выделение хитиназ.

1.2.5. Измерение активности хитиназ.

1.2.6. Строение и классификация хитиназ.

1.2.7. Происхождение, классификация и строение растительных хитиназ.

1.2.8. Происхождение, классификация и строение бактериальных хитиназ.

1.2.9. Строение и каталитическая активность хитиназ.

1.2.10. Регуляция активности генов хитиназ.

1.2.11. Хитиназы микроорганизмов рода Vibrio.

1.2.12. Ингибиторы хитиназ.

1.2.13. P-N-ацетилглюкозаминидазы (хитобиазы) и их свойства.

1.2.14. Деацетилазы и их свойства. ^

1.3. Применение хитина и хитиназ. ^

1.4. Краткая характеристика бактериального рода Vibrio. ^

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Среды и реактивы.

2.2. Бактериальные штаммы.

2.3. Определение концентрации Сахаров.

2.4. Приготовление субстратов для ферментативных исследований. ^

2.5. Определение концентрации белка. ^

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях. ^

2.7. Измерение деацетшгазной активности. ^

2.8. Определение оптической плотности (ОП). ^

2.9. Приготовление сред для культивирования.

2.10. Приготовление буферов.

2.11. Тонкослойная хроматография (ТСХ). . ^

2.12. Ионообменная хроматография.

2.13. Гидрофобная хроматография.

2.14. Гель-фильтрация.

2.15. Культивирование микроорганизмов.

2.16. Определение ферментативной активности.

2.17. Определение фунгициднои активности.

Глава 3. Экспериментальные результаты.

3.1. Сравнение результатов, полученных при калибровке различных колориметрических методов определения концентрации Сахаров.

3.2. Выбор способа измерения хитиназной активности.

3.3. Vibrio sp. X его выделение и идентификация хитиназной активности.

3.4. Таксономия и морфологические характеристики исследуемого штамма.

3.5. Рост Vibrio sp. X на синтетической среде.

3.6. Особенности культивирования Vibrio sp. X.

3.7. Рост на крахмале и накопление амилазной активности.

3.8. Деацетилазная активность.

3.9. Рост на других субстратах.

3.Í0. Устойчивость к антибиотикам.

3.11. Получение ферментативного препарата.

3.12. Анализ белков культуральной жидкости Vibrio sp. X.

3.13. Выделение хитиназы В.

3.14. Выделение хитиназы А.

3.15. Состав белков культуральной жидкости при выращивании Vibrio sp. X на различных средах.

3.16. Выделение хитиназ С и D.

3.17. Свойства хитиназ Vibrio sp. X.

3.17.1. Зависимости активности от температуры, рН и ионной силы среды.

3.17.2. Влияние различных ионов на активность ферментов. Ю

3.17.3. Действие ферментов на различные субстраты.

3.18. Анализ продуктов гидролиза хитина хитиназами Vibrio sp. X.

3.19. Совместное действие хитиназ.

3.20. Индукция хитиназного регулона.

3.21. Фунгицидная активность Vibrio sp. X.

3.22. Сравнение Vibrio sp. X с Serratia marcescens 218 и оценка его перспектив как продуцента хитиназы.

Глава 4. Обсуждение результатов.

4.1. Сравнение выделенных хитиназ с другими хитиназами

Vibrio.

4.2. Изменение рН ростовой среды в процессе культивирования.

4.3. Изменение спектра синтезируемых хитиназ с течением времени.

4.4. Влияние начального рН ростовой среды на индукцию хитиназного комплекса Vibrio sp. X.

4.5. Построение математической модели роста Vibrio sp. X и накопления ферментативной активности.

4.6. Перспективы использования Vibrio sp. X как продуцента хитиназы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование хитинолитического комплекса бактериального штамма Vibrio sp. X"

•

Актуальность проблемы.

Химические реакции, протекающие в живой клетке или вне её, при участии различных ферментов, как правило, не являются независимыми. Они связаны между собой в сложные последовательности. Когда эти реакции в высокой степени скоординированы, то участвующие в процессе ферменты называют ферментативным комплексом.

Так, ферментативный гидролиз высокомолекулярного полисахарида хитина осуществляют организмы, синтезирующие «ферменты хитиназного комплекса». Эти организмы играют важную роль в глобальном круговороте веществ. По этой причине их свойства, а также особенности строения и функционирования их хитинолитических комплексов активно изучаются.

Хитин - высокомолекулярный неразветвленный полисахарид, построенный из остатков ацетил-{3-0-глюкозамина, соединенных 1 -4 связями. По распространенности в природе он занимает второе место, уступая только целлюлозе. Хитин является основным структурным компонентом клеточной стенки грибов и внешней кутикулы членистоногих. Накапливаясь в больших количествах, как побочный продукт морского промысла хитин является легкодоступным, возобновляемым ресурсом. Благодаря своим уникальным физическим и химическим свойствам он может найти широкое применение в различных областях человеческой деятельности. Пристальное внимание привлекает как сам хитин, так и продукты его гидролиза и модификации, в частности его деацетилированное производное хитозан.

Эффективную переработку хитинового сырья можно наладить как с использованием кислотного гидролиза, так и при помощи хитинолитических ферментов.

Хитиназы (Е.С.3.2.1.14.) - общее название класса ферментов, способных гидролизовать хитин и его производные.

Гидролиз кристаллического хитина в живой клетке осуществляет хитинолитический комплекс из нескольких ферментов, включающий в себя эндо - и экзо - хитиназы и хитобиазы. Помимо хитиназ, многие организмы синтезируют хитин-деацетилазы. По сравнению со сравнительно хорошо изученными хитиназами, о деацетилазах известно очень мало. Грибные деацетилазы участвуют в образовании хитозана, входящего в состав клеточной стенки некоторых видов грибов (Mucor rouxii). Функции бактериальных деацетилаз на сегодняшний день не совсем ясны. Имеются данные о том, что для индукции хитинолитического комплекса бактерии Serrftia liquefaciens, молекулы индуктора (растворимых хитоолигосахаридов, со степенью полимеризации два и выше) должны пройти предварительную модификацию (деацетилирование?) во внеклеточном пространстве [Joshi, et al., 1988].

Хитинолитические ферменты и секретирующие их микроорганизмы находят широкое применение в области борьбы с возбудителями грибковых заболеваний растений, а также другими вредителями сельскохозяйственных культур (насекомые, нематоды и др.). Важным преимуществом инсектицидных и фунгицидных препаратов на основе хитинолитических ферментов, является высокая избирательность их действия.

В связи с вышесказанным, поиск новых и исследование известных бактериальных штаммов- продуцентов хитиназ является актуальной задачей. Во многих лабораториях ведутся работы по выяснению механизмов регуляции активности, секреции и индукции ферментативных комплексов хитинолитических организмов.

Предлагаемая работа посвящена детальному исследованию бактериального штамма Vibrio sp. X, способного накапливать значительную хитиназную активность в ростовой среде. Штамм был выделен в лаборатории микробиологии кафедры Биофизики

СПбГТУ, из проб почвы. Штамм сразу же привлек к себе внимание способностью накапливать повышенную хитиназную активность в ростовой среде.

При выращивании на твердой агаризованной среде с коллоидным хитином, зона просветления вокруг клеточной колонии образовывалась уже на первые сутки культивирования, и имела большие размеры, чем у Serratia marcescens, выращенной в аналогичных условиях. Впоследствии Vibrio sp. X был идентифицирован как представитель бактериального рода Vibrio. Работа по его изучению представляет заметный интерес, так как изученность хитиназных комплексов представителей рода Vibrio по сравнению с хитиназными комплексами бактерий родов Serratia, Bacillus, Slreptomyces и др. сравнительно мала.

Цели исследования.

Цель данной работы заключалась в изучении некоторых свойств бактерии Vibrio sp. X, важных для дальнейшего её практического использования а также детальных особенностей строения и функционирования её хитинолитического комплекса.

Задачи исследования.

1. Выяснение биологических и биохимических особенностей штамма Vibrio sp. X.

2. Оптимизация условий культивирования бактерии с целью достижения максимального накопления ферментативной активности в культуральной жидкости.

3. Изучение детального строения хитинолитического комплекса Vibrio sp. X и особенностей его функционирования.

4. Выделение индивидуальных ферментов хитиназ Vibrio sp. X и изучение их свойств.

5. Изучение механизма индукции хитиназного комплекса Vibrio sp. X.

6. Оценка перспектив использования исследуемого штамма как продуцента хитинолитических ферментов, а также, как фунгицидного агента.

7. Разработка математической модели функционирования ферментативного комплекса Vibrio sp. X в процессе роста клеточной массы и индукции ферментативного комплекса.

Научно-практическая значимость результатов.

Показано, что Vibrio sp. Jf является перспективным продуцентом хитинолитических ферментов. При использовании методов, широко используемых в биотехнологии, получен ферментативный препарат высокой активности. Продемонстрирована значительная фунгицидная активность штамма в отношении фитопатогенных грибов, принадлежащих к родам Fusarium, Sclerotinia, Rhizoctonia и другим. Выделены четыре хитиназы различной специфичности действия. При этом эндохитиназы А и С не имеют аналогов среди исследованных хитиназ представителей рода Vibrio. Получены результаты, свидетельствующие о возможной важной роли ферментативного деацетилирования промежуточных продуктов гидролиза хитина в регуляции активности хитинолитического комплекса, что существенно расширяет наше понимание происходящих при этом процессов. Построена математическая модель роста клеточной биомассы и накопления ферментативной активности в культуральной жидкости, адекватно описывающая особенности исследуемого штамма и предлагающая новые подходы к увеличению продукции хитинолитических ферментов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выделен бактериальный штамм, являющийся перспективным продуцентом хитинолитических ферментов.

2. Хитинолитический комплекс Vibrio sp. X включает четыре хитиназы различной специфичности действия. При этом сравнение с литературными данными показало, что выделенные эндохитиназы не имеют аналогов среди изученных хитиназ бактерий рода Vibrio.