Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование хитинолитического комплекса бактериального штамма VIBMO SP. X

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование хитинолитического комплекса бактериального штамма VIBMO SP. X"

На правах рукописи

^ fJO /Ze+tT

Бабенко Алексей Юрьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИТИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА БАКТЕРИАЛЬНОГО ШТАММА VIBRIO SP. X

Специальность: 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000 г.

Работа выполнена на Кафедре биофизики СПбГТУ совместно с Отделом молекуляр} генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент В.Н.Щелегедин Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Н. Кокряков доктор физико-математических наук, в.н.с. А.Л.Тимковский

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургский Государственный университет

Защита диссертации состоится 2000 г. в часов на заседай

диссертационного совета К 001.23.01 при Научно-исследовательском инстит экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акадс.ч» Павлова, д. 12

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН по адресу: 1973' Санкт-Петербург, ул. академика Павлова, д. 12

Автореферат разосланД^ 1. 2000 г. Ученый секретарь

диссертационного совета К 001.23.01

доктор биологических наук Куликова О.Г.

£ О?£ ¿V/ л, о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Химические реакции, протекающие в живой клетке или впе её, при участии различных ферментов, как правило, не являются независимыми. Они связаны между собой в сложные последовательности. Когда эти реакции в высокой степени ¡¡координированы, то участвующие в процессе ферменты называют ферментативным комплексом.

Так, ферментативный гидролиз высокомолекулярного полисахарида хитина эсушествляют организмы, синтезирующие «ферменты хитиназного комплекса». Эти эрганизмы играют важную роль в глобальном круговороте веществ. По этой причине их ;войства, а также особенности строения п функционирования их хитинолитических сомплексов активно изучаются.

Хитин - высокомолекулярный неразветвленный полисахарид, построенный из кггагков К- ацетил-р-С-глгокозамина, соединенных 1-4 связями. По распространенности I природе он занимает второе место, уступая тольхо целлюлозе. Пристальное внимание фивлекает как сам хитин, так и продукты его гидролиза и модификации, в частности его кацетилировапное производное хитозан. Хитиназы (Е.С.3.2.1.14.) - общее название ласса ферментов, способных гидролизовать хитин и его производные.

Гидролиз кристаллического хитияа в живой клетке осуществляет игинолитический комплекс из нескольких ферментов, включающий в себя, кроме ндо - и экзо - хитиназ и хитобиаз, также ферменты, обладающие тралсгликозилазной и сацетилазной активностями. По сравнению со сравнительно хорошо изученными итиназами, о деацеталазах известно очень мало. В отличие от грибных деацетилаз, оторые участвуют в образовании хитозана входящего в состав клеточной стенки екоторых видов грибов (Мисог гоихи), функции бактериальных деацетилаз на егодняшний день не совсем ясны. Имеются данные, что для индукции итинолитического комплекса бактерии Бегг/Иа 1щие/ас1ет, молекулы индуктора растворимых хитоолигосахаридов, со степенью полимеризации два и выше) должны ройти предварительную модификацию (деацетилирование?) во внеклеточном ространстве 8., Ко^сп^М М., е1 а!., 19X8].

На практике хитинолитические ферменты и секретарующие их микроорганизмы аходяг широкое применение в области борьбы с возбудителями грибковых заболеваний

растений. Важным преимуществом фунгицидных и инсектицидных препаратов на основе хитинолитических ферментов, является высокая избирательность их действия.

В связи с вышесказанным, поиск новых и исследование известных бактериальных штаммов- продуцентов хитина! является актуальной задачей. Во многих лабораториях ведутся работы по выяснению механизмов регуляции активности, секреции и индукции ферментативных комплексов хитинолитических организмов.

Цели исследования.

На кафедре Биофизики СПбГТУ выделен из почвы бактериальный штамм, принадлежащий к роду Vibrio, который привлек к себе внимание способностью накапливать повышенную хитиназную активность в ростовой среде. Цель данной работы заключалась в изучении некоторых свойств этой бактерии, а также особенностей строения и функционирования хитинолитического комплекса.

Задачи исследования.

1. Выяснение биологических и биохимических особенностей штамма Vibrio sp. X.

2. Оптимизация условий культивирования бактерии с целью достижения максимального накопления ферментативной активности в культуральной жидкости.

3. Изучение деталыюго строения хитинолитического комплекса Vibrio sp. X и особенностей его функционирования.

4. Выделение индивидуальных ферментов хитшгаз Vibrio sp. Хн изучение их свойств.

5. Изучение механизма индукции хитиназного комплекса Vibrio sp. X.

6. Оценка перспектив исследуемого штамма как продуцента хитинолитических ферментов, а также, как фунтицидного агента.

7. Создание математической модели функционирования ферментативного комплекса Vibrio sp. X в процессе роста клеточной массы и индукции ферментативного комплекса.

Научно-практическая значимость результатов.

Показано, что Vibrio sp. X является перспективным продуцентом хитинолитических ферментов. При использовании широко используемых в биотехнологии методов, получен ферментативный препарат высокой активности. Продемонстрирована значительная фунгицидная активность штамма в отношении фитопатогенных грибов, принадлежащих к родам Fusarium, Sclerotinia, Rhizoctonia и другим. Показана важная роль ферментативного деацетилирования в регуляции активности хитинолитического комплекса, что существенно расширяет наше понимание происходящих при этом процессов. Построена

математическая модель роста клеточной биомассы и накопления ферментативной активности в кулыуралыгой жидкости, адекватно описывающая особенности исследуемого штамма и предлагающая новые подходы к увеличению продукции хитшюлитических ферментов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Выделен бактериальный штамм, являющийся перспективным продуцентом хитшюлитических ферментов.

2. Хитинолитический комплекс Vibrio sp. X включает четыре хитиназы различной специфичности действия. При этом сравнение с литературными данными показало, что выделенные эндохитипазы не имеют аналогов среди изученных хитиназ бактерий рода Vibrio.

3. Впервые выдвинуто предположение о возможной роли деацетилирования хитоолигосахаридов бактериальными внеклеточными деацетилазами. А именно об их участии в регуляции активности хитинолипгчеекого комплекса.

Структура диссертации. Диссертация изложена на^^^страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение и выводы. Работа иллюстрирована 50 рисунками, 19 таблицами и 6 схемами. Список литературы содержнт/Й^назваиий работ на русском и английском языках.

Материалы и методы. В работе использованы бактериальные штаммы: L Штамм Serratia marsescens 218, полученный из коллекции ВИЗР. 2. Штамм Vibrio sp. X, полученный из коллекции кафедры Биофизики СПбГТУ. Среды и реактивы:

В работе использовали питательные среды, приготовленные на основе стандартных реактивов отечественного производства и аминопептнда производстве Санкт-Петербургского мясокомбината.

Хитин классификации «ч» фирмы «Реахим», завода им. Войейкова; акриламид, метилен-бис-акпшамид, ТЕМЕД, персульфат аммония фирмы «Реанал» (Венгрия); хитиназа Serratia marcescens фирмы «SERVA».

Все остальные использованные в работе реактивы стандартные, отечественного производства.

Коллоидный хитин готовили по методу, приведенному в [Balasubramanian R., Manocha M.S., 1992].

Для измерения хитиназной активности в работе применяли метод Сомоджи [Somogyi М., 1952]. Концентрацию белка измеряли по методу Лоури в модификации Петерсона [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., et al,195) j. Деацетилазнах активность измерялась согласно [DischeZ., Borenfreund Е., 1950].

За одну единицу хитиназной активности принято такое количество фермента, которое продуцирует ] мг N-ацетилпнокозамина за 48 часов при 25"С, рН 7,5. Одна единица деацетилазной активности деацеталирует 1 мг N-ацетилглюкозамина за 48 часов при 25°С, рН 7,5.

Изучаемая бактерия была выделена из проб почвы. Факт наличия хитиназной активности в среде устанавливали по появлению зоны просветления вокруг бактериальной колонии, при выращивании на агаризованной среде с коллоидным хитином. Размер образующейся зоны просветления коллоидного хитина вокруг бактериальной колонии в процессе инкубации может служить качественной, а при определенных условиях и количественной характеристикой величины хитиназной активности изучаемой бактерии.

Исследуемый бактериальный штамм обратил на себя внимание тем, что зона просветления мутного слоя хитина шириной 1-1,5 мм наблюдалась вокруг колоний уже после выращивания в течение 14 часов. Такая же по величине зона просветления наблюдалась вокруг колоний бактерий Serratia Marcescens 218 после 35-40 часов инкубирования (рис. 1).

3. Результаты и обсуждение.

Рис. 1 Зона просветления

вокруг бактериальных

колоний, при выращивании

на среде с коллоидным

хитином.

Х- Vibrio sp.X.

S.m.- Serratia marcescens 218.

Данные изучения морфологических и биохимических характеристик, показывают, что изучаемая бактерия относится к бактериальному роду Vibrio.

В литературе бактерии этого рода часто называют морскими, так как они нуждаются в повышенной концентрации хлористого натрия. Действительно, хлористый натрий значительно стимулирует рост биомассы исследуемого штамма и накопление хитиназной активности. Максимальный урожай клеток и активность наблюдали при концентрации NaCl от 0.1М до 0.2М. В синтетической среде с порошковым хитином, в условиях интенсивной аэрации выход хитиказы в культуральной жидкости достигает 3040 ед/мл, что превышает значения описанные в литературе. Например [Joshi S., Kozlovski M.,etal., 1988].

Накопление активности при росте в синтетической среде существенно зависит от значения рН. При переходе от рН-б к рН-7 картина качественно изменяется (рис. 2).

Рис.2 Влияние начального рН среды на рост Vibrio sp. X и выход хитиназной

активности в синтетической среде М9 с порошковым хитином.

О- рН б. □ - рН 7. Д - рН 8.

Рост-;

активность-----.

(сутки)

Для эффективного накопления активности в ростовой среде рН должен быть слабощелочным. При этом рост биомассы мало зависит от значения рН.

В составе культуральной жидкости Vibrio sp. X идентифицированы четыре хитиназы йазванные хитиназами А, В, С и D. Молекулярные массы хитиназ составляют соответственцо около 72, 60, 140 и 120 кДа (рис. 3). Оптимальные условия функционирования: рН 6-8, температура +45°С, 0,2 М NaC!.

Стадии выделения и очистки хитиназ приведены в таблицах 1,2 и 3.

Lg КОЕ/ мл.

9 8 7 6 5 4 3

1-

0-I

А ¿в

-о-ь

"т____

Актие ед/мл

0 1 2 3 4 5 8

время

Таблица 1.

Выделение хитиназы А.

Стадия выделения. Объем пробы мл. Активность пробы ед/мл. Содержание белка мг/мл. Удельная активность ед/мг.

Исходная культуральная жидкость. 2700 11 0.21 52

Обессоливание и концентрирование. 120 75 0.64 117

О-веркш^с 1 26 46 0,14 323

(З-БерЬахоэе 2 10 4,2 0,32 13

верИасгу! 820081' - 0,5 0,04 12

Таблица 2.

Выделение хитиназы В.

Стадия выделения. Объем пробы мл. Активность пробы ед/мл. Содер жанис белка мг/мл. Удельная активность ед/мг.

Исходная культуральная жидкость. 2700 11 0.21 52

Обессоливание и концентрирование. 120 75 0.64 117

О-ЗерЬагоэе 34 56 0.38 147

РЬепуЬБерЬагове СЬ-4В 40 45 0.23 196

8срЬасгу1 8200ББ - 12 0.07 171

Таблица 3.

Выделение хитиназ С и И.

Стадия выделения. Объем пробы мл. Активность пробы ед/мл. Содержание белка мг/мл. Удельная активность ед/мг.

Исходная культуральная жидкость. 800 19 0,4 48

Обессоливание и концентрирование. 140 71 0,59 120

С Б С Б С ю С Б

0-8ерЬагозе 1 30 40 10 89 0,23 0,49 43 182

О-Берквгозе 2 24 35 1,5 99 0,07 0,5 21 198

БерЬасгу! 82008Г - - - 8 - 0,06 - 133

i I > А в К i" О

■■ J J "< ИЯ0 VMF'

Рис.3 Анализ молекулярных масс различных хнтиназ УЛпо ¡р. X при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, 2- культуральная жидкость; 1- -//- разведенная в 5 раз; А- хитипаза А; В- хитиназа В; С- хитиназа С; В- хитиназа Ю;

К- реперы 67,57,45,29,14.7 кДа

Спектр синтезируемых бактерией хитиназ значительно изменяется в течение культивирования, а также сально зависит от состава ростовой среды (рис. 4). При выращивании Vibrio sp. X в среде на основе аминопептида с молотым хитином происходит преимущественное накопление в кулыуралыгой жидкости хитиназы Д. Дри использовании синтетической среды хитиназа D первой обнаруживается в культуральной жидкости, но уже на вторые сутки сменяется хитиназами А и В.

,, Рис 4. Анализ белкового состава

_ '............itiijnl-jm культуральной жидкости Vibrio

I Z 345 0 г 0710 Hit 15 It sp.X при помощи электрофореза

в полиакриламидном геле в , , ' 4 * денатурирующих условиях.

. . 'S'»** ч Пробы отбирались через сутки.

2-7 синтетическая среда с хитином; 9-14 аминопептид: физраствор 1:1с хитином;

2.9- 0 сутки;

х^- fea» **

3.10-1 сутки; 4,11-2 сутки; 5,12- 3 сутки; 6,13- 4 сутки, 7-14 5 сутки;

1,8,15- Реперы 67,25 кДа.

Продукты гидролиза хитина различными хитиназами Vibrio sp. X анализировали при помощи тонкослойной хроматографии. При действии хитиназы В на коллоидный, хитин обнаруживается преимущественно димер N-адегилглкжозамина (хитобиоза).

Основным продуктом действия хитин аз А и С являются олигосахариды со степенью полимеризации больше 4-х. Среди продуктов гидролиза хитина хитивазой D преимущественно наблюдается N- ацетилгшокозамин.

При гидролизе хитина смесью хитиназ С к D количество N- ацетилглюкозамина заметно возрастает, а также появляется небольшое количество хигобиозы. При совместном действии хитиназ В и D основным продуктом также является N-ацетилглюкозамин, а хитобиоза, продуцируемая хитиназой В при действии её на хитин в чистом виде среда продуктов гидролиза практически не обнаруживается.

Полученные результаты хорошо объясняются в рамках предположений о эвдо -механизме действия хитиназ А и С, экзо - механизме действия хиттшазы В и хитобиазной активности хитиназы D. Однако следует отметить, что помимо хитобиазной, хитиназа D проявляет и заметную экзохитиназную активность. То есть хитиназа D способна гидролизовать хитобиозу до N- ацетилглюкозамина и отщеплять моносахара с концевых участков молекулы полисахарида.

Свойства известных на сегодняшний день (по литературным данным) хитиназ различных бактерий рода Vibrio представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Сравнение свойств изученных хитиназ микроорганизмов рода Vibrio.

Микроорганизм. Мол.вес (кДа) PI рНопт. Топт. °с Механизм. Ингибиторы

Vibrio sp. [J. Ferm. Technol., 1979] 63 3,7 6,0-8,0 - Экзо- Hg,Ag,Sn,Cu

Vibrio fisheri. [Fukasawa S., Arai M., et al., 19921 2x31,5 - 6,0 45 Экзо- -

Vibrio alginolyticns[Murao S., Rawada Т., et al., 1992] SI 4,3 4,0-9,0 45 Экзо- -

Vibrio parahaemolyticus [Betty С., Zhu R., et al., 19921 80 5 6-8 45 Хитобиаза

Vibrio vulnificus. [Somerville C.S., Colwell R.R., 19931 94 Хитобиаза

Vibrio harveyi. [Jannatipour M., Sotogil R.W., et al., 19871 92,1 Хитобиаза

Vibriofurnissii [Keyhani N.O., Roseman S., 1996] 112,69 - 6-8 40-50 Эндо- Hg

Vibrio furnissii [ Keyhani N.O., Roseman S., 1996] 69,377 - 8 42 Экзо- Hg

Vibrio furnissii [Keyhani N.O., Roseman S„ 19961 36 - 7 45 Хитобиаза -

Vibrio sp.X хитиназа В 60 3,4 5,0-8,0 45 Экзо- Hg, Sn, Mn, Al, Cr, Hg, Fe, Cu, SDS

Vibrio sp. X -//- A 72 3,5 6-8 45 Эндо- -«-

Vibrio sp.X -//-D 120 3,5 6-8 45 Экзо-Хитобиаза

Vibrio sp. X -II- С 140 3,5 6-8 45 Эндо-

Vibrio fumissii является единственным представителем рода Vibrio , чей хитиновый метаболизм и отдельные ферменты хитиназы охарактеризованы достаточно полно.

Из приведенных данных следует, что свойства хитиназы В близки к свойствам других экзохитипаз Vibrio. Единственным аналогом хитиназы D является хитодекстриназа 112 кДа Vibriojurníssii. Однако исследователями она идентифицирована как хитиназа эндо - действия. Отметим отсутствие среди изученных хитиназ Vibrio аналогов эндохитиназ А и С. Возможно, это объясняется тем, что эти ферменты присутствуют в культуральной жидкости в значительно меньшем количестве, чем хитиназы В и D, а их активность заметно проявляется только при совместном действии с экзохитиназами.

Эффективность действия хитиназ Vibrio sp. X на субстрат значительно повышается при совместном действии нескольких ферментов. Особенно заметно этот эффект проявляется при действии на нативный порошковый хитин см. таблицы 5,6. Усилите активности при совместном действии ферментов вычислялось по формуле:

Усилением/а) = ( --Лктивность{\ + 2)- )х Ш0%

N Активностъ{\) + Активность^2)

Таблица 5

Активность различных хитиназ Vibrio sp. Хна 0,35% коллоидном хитине при совместном действии. Активность ед/мл (усиление %).

Хитиназа А Хитиназа В Хитиназа С Хитиназа D

Хитиназа A 1,2(0%)

Хитиназа В 15,8(16%) 12,4(0%)

Хитиназа С 2,7(0%) 16,8(20%) 1,5(0%)

Хитиназа D 28(34%) 34,7(8%) 29,6(21%) 19,7(0%)

Таблица 6.

Активность различных хитиназ Vibrio sp. Хна 1% молотом хитине при совместном действии. Активность ед/мл (усиление %).

Хитиназа А Хитиназа В Хитиназа С Хитиназа D

Хитиназа А 0,13(0%)

Хитиназа В 1(121%) 0,32(0%)

Хитиназа С 0,28(0%) 0,62(27%) 0,16(0%)

Хитиназа D 1,45(33%) 1,56(21%) 1,71(52%) 0,96(0%)

Кроме хитиназной, в культуральной жидкости Vibrio sp. X была также идентифицирована и значительная деацетилазная активность. Кривые накопления хитиназной и деацетилазной активностей в культуральной жидкости приведены на рисунке 5.

10 1 _п п nwií Г 25 S

8 • -20 1

w О 6- - 15 Л

а 4 • • jL - 10 § S

2- - 5 се 5

П - л S

U л rf 1 ИТ .......Г 1 ■■ "1 —г11 1 Г и <

0 1 2 3 4 5 6

Время cjt.

Рис. 5 Рост Vibrio sp. X и накопление хитиназной и деацетилазной активностей при 25 "С. □- Рост; Д-хитиназная активность; О- деацетилазная активность.

Видно, что деацетилазная активность появляется в культуральной жидкости уже на первые сутки культивирования, то есть раньше, чем хитиназная. Деацетилазная активность достигает максимума на вторые сутки, в период наиболее интенсивного роста культуры. Из соотношения величин хитиназной и деацетилазной активностей можно сделать вывод, что в максимуме деацетилазная активность достаточна, чтобы полностью деацетилировать продукты гидролиза хитина.

При выращивании У1Ьпо зр. X на средах без хитина, хитиназная активность, в заметных количествах, не обнаруживается. Это согласуется с литературными данными, так как подавляющее число известных хитиназ являются ипдуцибельными ферментами.

Был поставлен эксперимент, по индукции хитиназного комплекса Vibrio sp. X. В качестве источника питательных веществ для роста клеток использовали аминопептид, так как он содержит мало редуцирующих Сахаров препятствующих измерению малых величин хитиназной активности. В качестве индуктора использовали N-ацетилглюкозамин и смесь хитоолигосахаридов со степенью полимеризации от 2-х до 4. В ростовой среде поддерживалась концентрация индуктора 0, 1, 10, 100 мкМ (по N-ацетилглюкозамину) (рис. 6,7).

10 у

8-

IU 6 - -§

Я 4-2 -0 - -

5Г-

Jfz*

-г 1

--0,8 ■ - 0,6 I

s

Л t °-41 0,2

0

1 2

Время сут.

Рис.6 Рост Vibrio sp. X и накопление активности при выращивании в среде на основе аминопептида при добавлении N-ацетилглюкозамина. Незаполненные значки-рост, заполненные- активность. Концентрация Glc-N-Ac: О-О мкМ, □-1 мкМ, Д-10 мкМ, X-100 мкМ.

-г Ю

Рис. 7 Рост Vibrio sp. X и накопление активности при выращивании в среде на основе аминопептида при добавлении смеси хитооодигосахаридов. Незаполненные значки-рост, заполненные- активность. Концентрация олигосахаров (по Glc-N-Ac): О-О мкМ, □-1 мкМ, Д-10 мкМ, Х- 100 мкМ.

Видно, что присутствие в среде N-ацетилглюкозамина в концентрации 1-100 мкМ не приводит к увеличению хитиназной активности. Накопление в среде 0,2-0,4 единиц активности на мл, в течение 3-х суток можно считать базалышм уровнем экспрессии хитиназ Vibrio sp. X. Для эффективной индукции ферментативного комплекса Vibrio sp. X необходимо присутствие олигосахаров со степенью полимеризации два и выше в концентрации порядка 0,4 мкг/мл.

Vibrio sp. X протестирован на антигрибную активность против распространенных возбудителей заболеваний сельскохозяйственных растений Fusarium oxysporum, Fusarium culmorum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia bataticola, Colletotrihum lagenarium и Verticilium dahliae. Бактерия эффективно подавляет рост всех рассмотренных фитопатогенов.

Полученные результаты говорят о том, что Vibrio sp. Хпо своему антигрибному действию не уступает бактериальному штамму Serratia marcescens 218, применяемому для защиты сельскохозяйственных растений.

Так как исследуемый микроорганизм привлек к себе внимание как перспективный продуцент хитинолитических ферментов, для оптимизации биотехнологических процессов представлялось полезным построение математической модели роста клеток и накопления ферментативной активности Vibrio sp. X. Эта модель должна отражать особенности исследуемого штамма Vibrio sp. X.

За основу была взята кинетическая модель роста клеточной популяции, описываемая уравнением Ферхюяьста:

где через N выражена концентрация бактериальных клеток, а через ц удельная скорость роста биомассы. Значение известно из экспериментов и составляет около 5-109 мл"1.

Для описания зависимости удельной скорости роста биомассы от концентрации ростового субстрата мы использовали уравнение Моно, то есть предполагали, что кинетика потребления ростового субстрата соответствует кинетике ферментативной реакции:

где Я-концентрация ростового субстрата. Предельная максимальная скорость роста ц„ и константа сродства Кб выбраны исходя из наблюдаемых параметров роста клеточной культуры на Ы-ацетилглкжозам и не равными 0,6 час'1 и 50 мкг/мл.

Рассматривали рост на нативном хитине, не доступном для непосредственного использования клеткой. Ростовым субстратом 8 считали продукт действия фермента на кристаллический хитин (считали гидролиз хитина одностадийным процессом). Изменение Б описывается следующим уравнением:

или

тах

Е - хитиназная активность. Константа к равна 25 мкг/ед-час из определения единицы активности. Экономический коэффициент У, равен 109 мкг1 на основании потребления клетками М-ацетилглюкозамипа.

Синтез хитиназы является индуцибельным процессом. Мы считали, что в условиях отсутствия индуктора синтез фермента находится на весьма низком базалыюм уровне Уьн-При превышении пороговой концентрации индуктора синтез фермента скачкообразно увеличивается до Кроме того, при превышении некоторой предельной концентрации ростового субстрата включается механизм катаболитной репрессии синтеза

ферментов. Мы считали, что индуктор хитиназного комплекса и ростовой субстрат являются одним и тем же веществом, продуктами действия хитиназы на нативный хитин. Синтез фермента в таких условиях описывали следующим уравнением:

МО л

Значения базалыюй и штудированной скоростей синтеза фермента Уьм и экспериментально измерены и приблизительно равны 0,02 и 2 ед/час при концентрации клеток близкой к Ыщ,. Время «полураспада» фермента принято за 50 часов.

Таким образом, рост клеточной биомассы на нерастворимом субстрате и накопление активности, описывается системой из трех обыкновенных дифференциальных уравнепий первого порядка:

К

Iгк1

гер

+ К

Ьш

N Т

Г

¿N(1)

Л К + £(/)

ш

А

Л

к

1гиЗ

7,

Ш-8М\ 5(г)-

тгр

гер

ЬаI

N /'

Начальные условия выглядят следующим образом: N0=10 , Ео=0, БоН).

V

Значение концентрации олигосахаров, при которой происходит индукция ферментативного комплекса Бы равно 0,4 мкг/мл. Необходимо отметить, что картина роста клеток и накопления ферментативной активности заметно не изменяется при изменении значений ЕЗю) в пределах 0-0,4 мкг/мл. Гораздо большее влияние на вид зависимостей оказывает значение Бкр. При значениях 200 и 2000 мкг/мл, картина накопления ферментативной активности выглядит следующим образом (время в часах) (рис. 8).

1?

Акт. ед/мл

У1

Акт. г< ед/мл

1$

о io io зо lo 50 60 Время, час.

О "to 20 5о io 50 to ÍT Время, час.

Рис 8. Кривые накопления активности при SKp 200(1) и 2000(2) мкг/мл.

Различия в кривых накопления ферментативной активности при изменении значения S^ от 200 до 2000 мкг/мл, хорошо соответствуют изменениям накопления хитиназной активности при изменении рН ростовой среды от 6 к 7 (рис. 3). Наблюдаемая аналогия позволяет выдвинуть предположение о возможном механизме влияния рН ростовой среды на индукцию хитиназного комплекса.

Как было показано ранее, в ростовой среде Vibrio sp. X обнаруживается значительная деацетилазная активность. Величина активности достаточна для того, чтобы все продукты гидролиза хитина подверглись деацетилированию. Растворимость даже частично деацетшщрованшлх хитоолиглсахаров резко снижается при изменении рН от б к 7. Предельная растворимость деацетилированных хитоолигосахаров может оказаться ниже S„p.

Можно с высокой долей уверенности предполагать, что как индуктором, так и репрессором может служить только растворимая форма молекулы. То есть, если говорить о нашей модели, происходит рост Srep, так как при регуляции активности ферментативного комплекса «принимается во внимание» только концентрация растворимой формы индуктора. В результате этого при рН>6 в ростовой среде накапливается количество фермента значительно большее, чем необходимо для обеспечения клеток питательными веществами.

Заключение.

Предложен механизм, объясняющий гиперпродукцию хитинолитических ферментов при слабощелочных рН среды, характерный для бактериального штамма Vibrio sp. X. Это значительно расширяет наше понимание процессов происходящих при индукции хитинолитических комплексов (передача информации по цепочке: субстрат-индуктор- клетка), а также открывает новый подход к увеличению продуктивности промышленных продуцентов хитиназных ферментов.

Процесс гидролиза молотого хитина бактериальным штаммом Vibrio sp. X можно, по нашему мнению, представить следующей схемой (рис. 9).

Рис.9 Предполагаемая схема гидролиза хитина бактериальным штаммом Vibrio sp. X.

А, В, С, D- хитипазы А, В, С, D. Х- деацетилаза. Gn- хитоолигосахариды со степенью полимеризации п. G„'- деацетияированные хитоолигосахариды

4. Выводы.

1. В состав хитинолитического комплекса Vibrio sp. X входят экзохитиназы «В» и «D» молекулярной массой 60 и 120 кДа, а также эндохитиназы «А» и «С» молекулярной массой 72 и 140 кДа. Хитиназа «D», наряду с экзохитиназной, проявляет также и хитобиазную активность.

2. Индукторами хитиназного комплекса Vibrio sp. X являются хитоолигосахариды со степенью полимеризации от 2-х до 4-х.

3. Исследуемый штамм Vibrio sp. X секретирует в КЖ деацетилазную активность. Процесс деацетилирования промежуточных продуктов гидролиза хитина возможно участвует в регуляции активности хитинолитического комплекса.

4. Максимальные величины хитиназной активности в ростовой среде

Vibrio sp. X наблюдаются при слабощелочных начальных значениях pH ростовой среды.

5. Vibrio sp. X способен эффективно подавлять рост фитопатогенных грибов рода Fusarium.

6. Полученные результаты позволяют рассматривать Vibrio sp. X, как перспективный продуцент хитиназы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Получение экзогенного препарата хитиназы высокой активности, продуцируемого Vibrio sp. X. Бабенко А.Ю., Дмитриева Е.Ю., Шелегедин В.Н. // Биотехнология, 1998, N-3, р.13-18.

2. Исследование экзогенного препарата хитиназы высокой активности, продуцируемого Vibrio sp. X. Бабенко А.Ю., Дмитриева Е.Ю., Шелегедин В.Н. // Биотехнология, 1999, N-3, р.31-38.

3. Выделение экзохитиназы штамма Vibrio sp. X и некоторые её свойства Бабенко А.Ю., Шелегедин В.Н. // Биотехнология, 1999, N-5, р.11-18.

4. Выделение эндохитиназы Vibrio sp. X и некоторые её свойства. Бабенко А.Ю., Шелегедин В.Н. // Биотехнология, 2000, N-1, р.39-45.