Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах

Власенко, Анна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах"

На правах рукописи

Власенко Анна Николаевна

МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ В ПОЧВАХ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 ИЮН 2011

Москва-2011

4848434

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Д.Г. Звягинцев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Л.П. Терехова

кандидат биологических наук И.К. Кравченко

Ведущая организация: Российский государственный аграрный

университет — МСХА имени К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится 31 мая 2011 г в 14 ч 00 мин в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, строение 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 28 апреля 2011г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, строение 12, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь

диссертационного совета Я^М/^/л

доктор биологических наук, профессор -сс^ М. Зенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Такие биополимеры как хитин и пектин являются распространенными полисахаридами в природе и постоянно присутствуют в почве (De Boer W., 2004). Хитин представляет собой азотсодержащий полимер Н-ацетил-Б-глюкозамина, выступает неотъемлемым компонентом клеточных стенок микромицетов, экзоскелета беспозвоночных животных. Пектин -безазотистый полисахарид, состоящий из остатков D-галактуроновой кислоты, является структурным компонентом клеточных стенок высших растений, придающий прочность растительным тканям. Оба биополимера представляют собой существенный источник углерода и азота для почвенных микроорганизмов, а их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Gooday, 1990; Kang et al., 2005).

Жизнедеятельность гидролитических микробных сообществ в существенной степени определяет уровень плодородия почв, включая снабжение растений доступными питательными ресурсами, формирование почвенной структуры и способность к подавлению нежелательных фитопатогенных популяций (Downing & Thomson, 2000; Kobayashi et al., 2002). Масштабы микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) отличаются в биогеоценозах разных биоклиматических зон, однако в научной литературе информация о структуре и особенностях формирования микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов (в частности, температуры) практически отсутствует. С одной стороны, важна роль психрофильных и психротрофных микроорганизмов в процессах деструкции биополимеров, особенно в зонах холодного и умеренного климата. С другой стороны, известная приуроченность максимальной активности большинства хитинолитических и пектинолитических ферментов микроорганизмов к температуре 40-55°С (Kashyap, 2001; Dahia, 2006) делает интересным вопрос о деструкции полисахаридов почвенным микробным комплексом при повышенных температурах, с целью оценки потенциальной

гидролитической активности микробного сообщества почв и поиска продуцентов гидролитических ферментов.

Целью диссертационной работы явилось исследование особенностей комплекса микроорганизмов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в почвах при различных температурах (5,27,50°С). В задачи исследования входило:

1. Сравнительное исследование динамики эмиссии диоксида углерода из образцов почв с добавлением субстрата (хитина и пектина) и без него, инкубируемых при разных температурах.

2. Изучение динамики численности и биомассы эукариотных и прокариотных микроорганизмов, развивающихся в исследуемых микрокосмах при различных температурах в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением полисахаридов.

3. Оценка разнообразия и численности отдельных филогенетических групп прокариотных микроорганизмов гидролитиков в почвах при различных температурах.

4. Детекция хитиназного гена при различных температурах в исследуемых почвах и чистых культурах хитиколиткков.

5. Выявление наиболее активной группы микроорганизмов, участвующих в разложении хитина и пектина в почве при разных температурах. Выделение доминшггов гидролитичеких сообществ почв, определение их видового разнообразия и активности разложения ими полисахаридов.

Научная новизна Впервые в экспериментах с микрокосмами проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур.

Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) при гидролизе полисахаридов микробным сообществом вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов - мицелиальных и одноклеточных прокариот. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.

Впервые с использованием метода FISH (флюоресцентная гибридизация ш situ) оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активного бактериального гидролитического (хитинолитического и пектинолитического) комплекса в гумусовых горизонтах серой лесной, глее-слабоподзолистой, бурой цусшнно-степной почв и чернозема в зависимости от температуры. Установлено, что при всех исследуемых температурах среди возможных агентов деструкции полисахаридов их разложение осуществляется представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria, При понижении температуры в почвенном гидролитическом бактериальном комплексе особенно возрастает численность метаболически активных форм Firmicutes и Betaproteobacteria. С ростом температуры на порядок увеличивается биомасса мицелиальных представителей группы Actinobacteria, а также возрастает роль Gammaproteobacteria.

С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического сообщества (дыхания).

Практическая значимость. Выделены штаммы микроорганизмов, обладающие высокой хитинолигаческой активностью при различных температурах, последовательности гена 16S рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа. Полученные штаммы могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопагогенами.

Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение при разработке биотехнологического процесса получения хитинолитических и пекгинолитических ферментов.

Проведенная оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур,

и анализ их компонентного состава могут быть полезны в разработке и применении хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пекгинсодержащих отходов.

Знание закономерностей микробного разложения биополимеров даст возможность управлять микробными популяциями и раскрыть экологическую роль микроорганизмов в углеродных и азотных циклах. Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ХШ и XIV Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007 и Ломоносов-2006, на XIV Докучаевских молодежных чтениях - 2011 в Санкт-Петебургском государственном университете, на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ и в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм (Штутгарт, Германия).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи, трое тезисов докладов.

Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы и заключение. Материалы диссертации изложены на "г^ страницах машинописного текста, содержат рисунков, /^.таблиц. Список литературы включает/^источников, из них ^зарубежные.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность своим научным руководителям д.б.н., проф. Д.Г. Звягинцеву и к.б.н. НА. Манучаровой за постоянную помощь и поддержку, повседневное внимание к работе, ценные советы и консультации. Автор особенно благодарен д.б.н. П.А. Кожевину за помощь в проведении многомерной математической статистики и математического планирования эксперимента, ИХ Кравченко и А.К. Кизиловой за помощь в постановке ДГГЭ и ценные практические советы. Автор искренне благодарит А.Л. Степанова, Г.М. Зенову, Т.Г. Добровольскую, Т.П. Турову за ценные рекомендации и помощь в работе, а также весь

коллектив кафедры биологии почв МГУ.

СОДЕРЖА1ШЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования явились образцы верхних гумусовых горизонтов почв разных биоклиматических зон: глее-слабоподзолистой, серой лесной почв и чернозема типичного, отобранные в Тюменской (Надым), Тульской (Щекинский район) и Воронежской (Таповский район) областях, соответственно, и текстурного уплотненного горизонта бурой пустынностепной почвы из Монголии (Южный Гоби, Булган сомон). Основные характеристики исследуемых почв представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные характеристики исследуемых почв.

Почва Глубина отбора проб, см Сорг, % Сгк/Сфк рН вода.

Глее-слабоподзолистая 2-10 0,8 0,5 4,1

Серая лесная типичная бескарбонатная глубокая на покровном суглинке 8-20 1,8 0,9 5,5

Чернозем типичный глубококарбонатный тяжелосуглинистый 5-30 3,1 2,14 6,8

Бурая пусгынностепная песчаная 2-10 0,64 0,5 8,1

При определении структуры гидролитического микробного комплекса в исследуемых почвах при различных температурах использовали метод почвенных микрокосмов с инициацией микробной сукцессии увлажнением и внесением очищенного хитина («ICN Biomedicals», Германия) и пектина («Sigma», Германия) в количестве 0,6% от массы почвы. Инкубацию почвенных микрокосмов осуществляли при 5,27 и 50°С.

Изучение активности эмиссии диоксида углерода из почв при внесении полисахаридов и без них оценивали газохроматографическим методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Определение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов

и грибов проводили с помощью люминесцентно-микроскопического метода.

Препараты для подсчета бактерий и мицелия актиномицетов окрашивали акридиновым оранжевым, для учета мицелия грибов - калькофлюором белым. Биомассу определяли расчетным методом (Кожевин, 1989; Полянская и др., 1995).

Выделение из почв микроорганизмов, разрушающих полисахариды, проводили методом посева на плотные питательные среды. Детекцию микроорганизмов осуществляли по филогенетическим и культурально-морфологическим признакам.

Оценку интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов проводили, измеряя эмиссию диоксида углерода этими культурами и одновременно их биомассу по накоплению белка методом Бредфорда (Bradford, 1976).

Интенсивность образования хитиназы разными группами микроорганизмов осуществляли спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата хитиназура - коммерческого препарата окрашенного хитина (Gomes Ramizes et al., 2004), также с применением 4-метилумбеллиферон-меченого ^ацетил-О-глюкозоаминида дигидрата (Pritsch et al., 2004).

С использованием метода флюоресцентной гибридизации in situ (метод FISH) (Amane, 2000) выявляли специфику бактериального, метаболически активного сообщества, разрушающего полисахариды. В настоящей работе был применен спектр зондов, специфичных дал представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп Bacteria. Использование метода FISH позволило учесть живые, метаболически активные клетки в почвенных образцах с полисахаридами и без них. Окраска препаратов красителем акридиновым оранжевым дала возможность оценить общую численность клеток микроорганизмов в образцах., включая покоящиеся формы.

Для выделения ДНК из чистых культур микроорганизмов применяли Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). Суммарную ДНК из почв экстрагировали с помощью PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя.

ПЦР. Фрагмент гена 16S rRNA амплифицировали с использованием универсальных праймеров 341F+GC и 907R (Muyzer et al., 1993). Фрагмент хитиназного гена chiA обнаруживали с помощью «вложенного» ПЦР („nested" PCR) согласно протоколу (Williamson et al., 2000).

Полученные ПЦР-фрагменты разделяли с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГТЭ) на оборудовании DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, США) в Институте микробиологии РАН согласно протоколу (Кравченко и др., 2010) с использованием денатурирующего градиента (формамид, мочевина) 50-65% под напряжением 40 В в течение 16 ч для 16S rRNA (и 35-60% при 200V в течение 6 ч для chiA) при постоянной температуре 60° С. Результаты электрофореза регистрировали с помощью системы гель-документирования BioDoc Analyzer П (Biometra, Германия) после окрашивания этидий бромидом. Характерные видимые полосы были элюированы, полученные растворы очищены и использованы для определения нуклеотидных последовательностей.

Секвенированне генов 16S гРНК и с hi А проводили в Центре «Биоиженерия» РАН с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США).

Филогенетический анализ. Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последоватеотностей генов 16S гРНК и chiA использовали программу BLAST (http://vsww.ncbi .nlm.nih. gov/blast). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://iwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdifa/bioedit.html). а их множественное выравнивание - с использованием программы CLUSTAL W 1.75. Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма "neighbor-joining" (NJ) в программе MEGA 4 (Tamura, 2007). Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICAL и Statgraphics Plus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I, Динамика эмиссии диоксида углерода из почв с внесением полисахаридов при различных температурах

Исследование активности дыхания в почвенных микрокосмах с внесением хитина и пектина показало, что эмиссия СОг в этих вариантах превышала контроль в среднем в 2-6 раз во всех исследуемых почвах. Скорость продукции С02 в вариантах с субстратом различалась с изменением температуры инкубации. При минимальной температуре (5°С) пик активности наблюдался к концу 3-й недели эксперимента, при 27°С - к концу первой недели, а при 50°С - уже на первые сутки опыта. При этом, контрольные варианты на изменение температуры не реагировали (рис. 1). Такие результаты указывают на зысокую активность микробных сообществ, деградирующих полисахариды,

Wiks !ambda=,04019, F(M, 674,21)^24,232, р=0,0000 Vertical bars denote 0,95 confidence intervals

А, Б В

Рис. 1. Динамика эмиссии диоксида углерода (мкг С-ССЬ/ г почвы сут) из микрокосмов буро-пустынноетепной почвы, инкубируемых при различных температурах: А - 5°С, Б - 27°С, В -- 50°С.

2. Оптимизация условий разложения хитина с помощью математического планирования эксперимента

Эмиссия диоксида углерода также была использована в качестве

функционального показателя микробного хитинолитического сообщества для

эксперимента на основе математического планирования определения условий, обеспечивающих оптимальные значения факторов для микробного разложение хитина в почвах. Эксперимент был спланирован по схеме центрального композиционного плана «22 звезда». В результате была получена поверхность отклика функционального показателя (эмиссии диоксида углерода) в зависимости от температуры с течением времени с четко выявляемой вершиной. Установлено, что оптимальные значения факторов различались для исследуемых типов почв. На контурных графиках (рис. 2) видно, что для чернозема максимальное дыхание обнаруживается примерно на 20-е сутки при температуре 25°С, для пустынно-степной почвы - на 10-е сутки при температуре 30"С.

Contours of Estimated Response Surface ^ Contours of Estimated Response Surface

0 10 20 30 40 SO 0 10 20 30 40 60

temperature temperature

Рис. 2. Оптимальные значения факторов на контурном графике в экспериментах с внесением хитина в А - бурую пустынностепную почву и Б - чернозем типичный.

Таким образом, с помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического сообщества (дыхания).

3. Динамика биомассы хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почв, развивающихся при различных температурах

Эксперименты по определению динамики численности и биомассы разных групп микроорганизмов в ходе микробной сукцессии в образцах почв, инкубируемых при разных температурах, в целом подтвердили полученные

\Mlks 1атЬс)а=,04873, Р(30. 311.81)=18,701, р=0,0000

Ш® 1атЬс1а=,07445, Р(30, 311,811=14,790, р=0,0000

Мкв 1атЬйа=,01800, Р(30, 311,011=30,457, р=0,0000

Рис. 3. Динамика биомассы микроорганизмов (мг / г почвы) при различных температурах в ходе хитино- и пектолитической сукцессии в черноземе типичном: А - бактерии, Б - актиномицеты, В - грибы.

нами закономерности активности дыхания для всех почв (рис. 3). Установленная зависимость коррелировала также с полученными результатами по определению активности хиткназы in situ с использованием 4-метилумбеллиферон-меченого К-ацетил-В-В-глюкозоаминид дигидрата. Так, максимальная активность хитиназы в увлажненном черноземе in situ даже без внесения хитина при 27°С приходилась на 8-е сутки эксперимента и составляла 610 нмоль / г ч, что в шесть раз превышало активность хитиназы в этой же почве, инкубируемой при 5°С.

Рассмотрение отношений биомассы отдельных групп микроорганизмов в образцах с добавлением субстрата к биомассе микроорганизмов в контрольном образце (рис. 4) показало, что вне зависимости от субстрата и типа почвы грибы имеют тенденцию разлагать полисахариды более активно при низких температурах. Чего нельзя сказать о прокариотном комплексе, который в большей степени приурочен к типу почвы. Как бактериальный, так и актиномицетный гидролитические комплексы глееподзолистой почвы особенно

Рис, 4. Максимальные значения отношений биомассы основных групп микроорганизмов в почвах с добавлением хитина (х) и пектина (п) к биомассе тех же групп в контрольных образцах (К) в ходе эксперимента при различных температурах инкубации чернозема (А), глее-слабоподзолистой (Б) и пустынно-степной (В) почв.

Т, "С:

135 £3 27 О50

грибы

активны при низких температурах. В бурой пустынно-степкой почве вклад прокариот в разложение полисахаридов максимален при 50°С. При этом активность актиномицетов при повышенных температурах особенно велика в бурой пустынно-степной почве и черноземе с хитином. Данные особенности, по всей вероятности, обуславливаются структурой природного микробного комплекса, приспособленного к климатическим условиям формирования исследованных почв.

4. Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почве

С помощью методов многомерной математической статистики был проведен анализ структурных (биомасса грибов, бактерий к актиномицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей при деструкции полисахаридов в почвах. Пошаговая множественная регрессия для выявления связи между функциональным и структурными показателями определила существенную роль вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов в функционировании почвенного микробного сообщества -мицелиальных и одноклеточных бактерий, особенно актиномицетов. Полученная регрессионная модель на основе двух переменных имеет высокую статистическую значимость (объясняет до 90% дисперсии функционального показателя). Зависимость описывается следующими уравнениями для исследуемых почв:

Resp = 52,87*В + 89,27*А - пустынно-степной почва Resp = 37,77*В + 555,49*А - серая лесная почва

где, Resp - эмиссия С02 (мкг С-СОг/г-ч), А - биомасса актиномицетов (мг/г), В - биомасса бактерий (мг/г).

Таким образом, установлена высокая активность при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов микробного сообщества - мицелиальных и одноклеточных прокариот, которые, как показано, вносят существенный вклад в контролирование дыхания микробного сообщества на широком спектре условий (температура, поступление органического вещества, сукцессионное

)Л

время). При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.

5. Молекулярно-бнслогический анализ компонентного состава гидролитического бактериального сообщества почв, развивающегося при различных температурах

5.1. Исследование прокариотного хитинолитического и пектннолитнческого сообщества почв с помощью флюоресцентной гибридизации ia situ

Оценку метаболически активных клеток прокариот в микробном гидролитическом комплексе рассматриваемых почв проводили с помощью метода in situ-гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-мечеными сшигонуклеогидными зондами (FISH) на сроки эксперимента с максимальной микробной биомассой, измеренной с помощью люминесцентной микроскопии, и наибольшей активности дыхания для определенных температур инкубации.

Проведенные исследования показали, что в целом суммарная доля идентифицируемых клеток, обнаруженных гибридизацией с универсальными зондами на представителей доменов Bacteria и Archaea, составила в образцах исследуемых почв от 26% для чернозема до 90% для глее-слабоподзолистой и бурой пустынностепной почв от общего числа клеток, определенных окрашиванием акридином оранжевым. Особенно низким процент идентификации оказался для образцов чернозема инкубируемых при 5°С, где основная масса бактерий была представлена очень мелкими размерами клеток. Эти данные позволяют предположить, что значительная доля прокариотных организмов чернозема находится в форме покоящихся или метаболически неактивных клеток.

В почвах с хшином и пектином по сравнению с кошролем отмечалось возрастание (в 1,5-3 раза) численности метаболически активных представителей доменов как Bacteria, так и Archaea при всех исследуемых температурах (рис. 5). В образцах разных типов почв с добавлением субстратов при разных температурах она составила 4-20,5* 108 (дчя Bacteria) и 9-29* 107 (для Archaea) клеток в грамме почвы. Представляет интерес высокая доля архей в гидролитическом мшфобном

О 10 20 30 40 50 60 70 80

«i i: : г

% «i i

I i

8*Й< ' ] 1 i

ЙШЙШГ ! i! !

ШйШ !

шя. . ,¡ ¡ ¡ ¡

ШрЯ, ; i

шш i i

10° КЛ./ГП.

кот-роль хитин и* пекгт

конгтроль хитин Р5 пектин контроль хитин 8 пекгт

Kflir П.

Ш Bacteria ■ Artiaea

П Неедентафицированные клоны (акрущин ораиж.)

В.

15 10 кпАп.

m*h i - контроль ^

шт&яш i хитин контроль 0

ишиш 1

|1шиет1тмм1м11ШН ХИТИН А

Т,°С

Рис. 5. Численность метаболически активных представителей доменов Bacteria и Archaea в микробном комплексе почв при различных температурах: А - чернозем, Б - глее-подзолистая почва, В - пустньшно-степная почва.

комплексе пустынно-степной и глее-слабоподзолистой почв, как при высоких, так и при низких температурах, особенно в образцах с хитином. В ряде работ говорится об их участии в минерализации азотсодержащего органического вещества в почвах (Leininger et al., 2006; Timonen & Bomberg, 2009; Stopnisek et al., 2010).

Наибольшее влияние температуры на метаболическую активность домена Bacteria обнаруживалось для гидролитических комплексов глееподзолистой и пустнынно-степной почв, где численность активных клеток возрастала с понижением или увеличением температуры, соответственно. Тогда как в хитинолитическом и пектинолитическом комплексах чернозема общая численность метаболически активных форм Bacteria не существенно колебалась с изменением температуры. Данные особенности, по всей видимости,

объясняются высокой буферной способностью гидролитических микробных систем чернозема, а также достаточно высоким содержанием органического вещества в этой почве.

Анализ компонентного состава клеток внутри домена Bacteria в образцах чернозема типичного выявил дифференциацию групп бактерий при изменении температуры инкубирования (рис 6). Было показано, что представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes реагировали значительным увеличением численности метаболически активных форм на внесение хитина и пектина во все исследованные почвы вне зависимости от

123456789

4 т---------------------------------------------------

123456789

Рис. 6. Численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria (1 -Actinobacteria, 2 - Firmicutes, 3 - Alphaproteobacteria, 4 - Betaproteobacteria, 5 -Gammaproteobacteria, 6 - Deltaproteobacteria, 7 - Cytophaga/Bacteroidetes, 8 -Chitinophaga, 9 - Vermcomicrobia) в черноземе с добавлением полисахаридов и без них при различных температурах инкубации: А - 5°С, Б - 27°С, В - 50°С.

температуры. Что позволяет говорить об их активном участии в разложении полисахаридов при широком диапазоне температур. Эти группы организмов наиболее часто упоминаются в числе основных агентов деструкции органического вещества в природных экосистемах (Pourcher et. al., 2001; Звягинцев, Зенова, 2001). При понижении температуры до 5°С в гидролитическом микробном комплексе почв наблюдалось возрастание численности группы Firmicutes и Betaproteobacteria, и сокращение грамположительных бактерий с высоким содержанием Г+Ц пар в ДНК, относящихся к филогенетической группе Actinobacteria по сравнению с их численностью в этих почвах при 50°С, где Actinobacteria заметно возрастала в опытных вариантах и составляла до 35% среди идентифицированных одноклеточных единиц внутри домена Bacteria в гидролитическом комплексе почв. При этом особого внимания заслуживает рост мицелиальных форм актинобактерий, биомасса которых в пустынностепной почве и черноземе с добавлением хитина увеличивалась почти на порядок. Кроме того, в вариантах с полисахаридами при 50°С (в некоторых почвах и при 27°С) численность метаболически активных клеток Gammaproteobacteria была выше, чем в контрольных образцах. Роль этой группы бактерий в разложении хитина отмечается в некоторых исследованиях (Cottrell et al., 2000; Das et al., 2010).

Увеличение численности Verrucomicrobia в вариантах с пектином указывает на их возможное участие в процессах деструкции. На данный момент среди описанных и узаконенных представителей Verrucomicrobia выявлены бактерии, способные к росту на целлюлозе, пектине, крахмале (Chin et al., 2001; Sangwan et al., 2004).

5.2. ДГГЭ-анализ амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК микробных сообществ из почв, обогащенных субстратом и без него

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ) суммарного

амплификата фрагментов гена 16S рРНК был применен с целью оценки

сложности микробных гидролитических сообществ почв и различий в

структурах их доминантных составляющих. Для анализа использовалась

суммарная ДНК, выделенная из микрокосмов чернозема и бурой пустынно-

степной почв, инкубируемых при различных температурах с внесением полисахаридов и без них, на сроки, аналогичные методу FISH.

На полученных профилях ДГТЭ интенсивность и количество дискретных полос в образцах с добавлением пектина и хитина была выше по сравнению с контрольными для обоих почв. Филогенетическое дерево, представленное на рисунке 7, объединяет результаты ДГГЭ-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК почвенных сообществ. Сиквенс-анализ некоторых характерных ДГТЭ полос выявил в образцах почв с хитином, инкубируемых при 5 "С, присутствие сиквенсных типов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteriacea {Jantinobacterium, Massilia) группы Betaproteobacteria (рис. 7, кластер а). Большинство проанализированных при 27°С последовательностей относилось к филлуму Bacteroidetes (кластер с). Характерные полосы, выделенные при 50СС, принадлежали представителям семейства Xantomonodaceae гаммапротеобактерий, среди которых наиболее близкими оказались бактерии рода Lysobacter (кластер Ь).

Таким образом, комбинирование двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE) дало возможность информативно оценить различия в структурах доминантных составляющих гидролитических сообществ почв, формирующихся при различных температурах. Кроме того, среди сиквенсных типов, полученных методом ДГТЭ, были представители, выделяемые нами на плотные питательные среды.

6. Детекция хитиназного гена chiÄ в почвах с хитином и без него при различных температурах

С помощью метода «вложенного» ПЦР-анализа (nested PCR) с использованием специфических праймеров и последующим разделением полученных продуктов ПЦР с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза было проведено исследование хитиназного гена группы А (chiA) 18 семейства гликозилгидролаз в почвенном микробном сообществе in situ и чистых культурах микроорганизмов, выделенных из исследуемых почв при различных температурах инкубации. Среди известных хитиназ эта группа

'331493 Qxaioeacteraceae Bacterium с... >50937 Unc.JatHnnbactalum sp.A... • chernosem 27 chit - AM412135 Massllla sp, P-105 ——♦ chernosem 5 chit [EU730936.1 MassillaSmonae ■EF575567 Beta proteobacteilum DQ39W91 Una! .beta proteobacterium FJ165491 Oxalobacteraceae bacterium с&чз —»pustscnit

FR691428 Beta prateobacterlixn R-36978

tFR774560Xantnomonaeaceae bactertin I____

- HM163343 Gamma pniecfcacteriun OR-187 —•Pust 50 chit

_ягС1

i-af

331GQ369134 Lysobacter oiyzas YC6269 EU376963 Lysotacter oryzae YC6269 j— • chernosem 50 chit sV EU8339Q8 Lysobacter sp. RCML-52 EU32B034 Unc. Cytnphagale3 bacterium ... HQ396933 Unc. Sacteroidetes bactslum... AF348716 Unc. Cyttptaga sp. MPD-32

-FJ218352 Bacterobetes bacterium S154

_,AM990£r77Bacteradetes Bacterkm MOLA...

"iool ay162091 Batteroldetes Bacterium cmdj... -*Pust 27 CM

mm GU271825 Unc. Bacterddes sp .4 225 l| 'GU271431 Unc. Cytopftaga sp. 1272

I-• chemosem 27 cht

13c Pust 27 control Pust 27 chit

100

S9 p AF55Q5B4 Bacteroidetes bacterium Ko31(2) LNR025822GilSslaipitskaictlaeKMM ... AJ244698FlaObactErium sp. V4.BS.09 Iaj244698 Flavotectertum sp. V4.BS.09(2) FR691444 Gllllsia sp.. R-36928 EU196300 <3eil5iasp. NPB

Рис. 7. Дендрограмма, основанная на результатах DGGE-анализа амтишфицировапных фрагментов гена 16S рРНК почвенных сообществ.

Опытные варианта обозначены кружочками. Дерево построено с помощью алгоритма neighbour-joing, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» - анализа 1000 альтернативных деревьев. Буквенные обозначения выделенных кластеров см. в тексте.

обладает высоко консервативными участками, позволяющими их специфическую детекцию среди широкого филогенетггческого разнообразия микроорганизмов и обнаруживается у 70-80% микробов-хитинолитиков (Williamson et al., 2000).

ДГГЭ анализ амплифицированных фрагментов хитиназного гена показал возрастающую сложность микробных сообществ в почве с добавлением хитина на всех температурах. Результаты секвенирования выдавали отношение полученных последовательностей к хитиназному гену некультивируемых организмов и таким филогенетическим группам, как Actinobacteria ( и Firmicutes. Однако среди близкородственных организмов, выявленных ДГГЭ хитиназного гена, не обнаруживались доминанты, выделенные нами на плотные среды с хитином. Здесь нельзя говорить об абсолютной корреляции между филогенией функционального хитиназного гена и филогенией 16S РНК. Что также отмечается в работах других авторов (Xiao et al., 2005; Yasir et al., 2009) и позволяет предполагать горизонтальный перенос хитиназных генов внутри микробного сообщества, как большинства генов биодеградации, сосредоточенных в плазмиднсй ДНК.

7. Выделение и идентификация доминантоп хитинолитичсскего сообщества почв, развивающегося при различных температурах, и определение их хитинолитическсй активности

Исследование комплекса хитинолитических микроорганизмов в глее-слабоподзолистой и бурой пустынностешой почвах с использованием метода посева на плотные питательные среды с добавлением хитина, как единственного источника углерода и азота, выявило разных доминантов в зависимости от температуры культивирования. Идентификация выделенных штаммов производилась по культурально-морфологическим и\или филогенетическим признакам. В целом, полученные посевы отличались явным преобладанием (от 55% да 80-90% от общего числа выделенных организмов) какого-то одного вида хитинолитика внутри групп микроорганизмов для отдельных типов почв и температур (особенно это было характерно для крайних температур - 5 и 50°С).

Так, в глее-слабоподзолистой почве доминантами при 27°С среди выделяющихся на среде с хитином микроорганизмов были представители родов Arthrobacter, Sreptomyces (St. flavogriseus), Aspergillus (A. caespitosus). При 5°C основными хитинолитиками в этой почве оказались Bacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces globosus, Penicillum frequentans. В бурой пустыпностепной почве 27°С среди мицелильных прокариот преобладали St. pluricolorescens и St. lavendulacolor, среди немицелиальных бактерий -аэробные грамположительные палочки рода Bacillus, среди грибов -Trichoderma (Т. viride). Streptomyces roseolilacinus оказался единственным представителем среди акгиномицетов пустынно-степной почвы, выделенных на среде с хитином при 50°С. Доминирующий штамм бактерии в хитинолитическом комплексе бурой пустынностепной почвы при 50°С, был идентифицирован, на основании последовательности 16S рРНК как представитель недавно открытого рода Silanimonas - S. lenta, относящийся к семейству Xanthomonadaceae гамма-протеобакгерий.

С целью определения интенсивности разрушения хитина выделенными чистыми культурами микроорганизмов была измерена удельная активность их дыхания (В), под которой понимали отношение разности между эмиссией диоксида углерода (мкг С-ССЬ/мл среды) определенным штаммом при росте его на среде с хитином и без него к разности накопленной биомассы (мкг) этим штаммом на тех же средах (рис. 7, левая панель). Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК некоторых активных штаммов хитинолитиков были депонированы в генбанк EMBL-EBI. Присвоенные им номера доступа указаны в скобках далее по тексту.

При температуре инкубирования 5°С удельная активность дыхания штаммами Streptomyces sp. strain 5GP1-1 (FR821066), Pseudomonas sp. (FR832618) и Penicillum frequentans была сравнима между собой и достигала максимума к 14-м суткам опыта (рис 7А, левая панель). Однако при 27 °С наибольшая хитинолитическая активность обнаруживалась у штамма актиномицета Streptomyces flavogriseus strain 10 (FR832623), причем на порядок превышала таковую у грибного штамма Trichoderma viride и бактериального

Рис. 7. Динамика удельной шстивности дыхания (В) (левая панель) и удельной активности образовагшя хитиназы (С) (правая панель) чистыми культурами хитинолитических микроорганизмов при А - 5, Б - 27 и В - 50°С.

° 14 сугки

□ Т. чШае

щВааНиз вр.

Ш 51. Науодл&гсз :п 10

1 ч

3 6

Ш В. \enta

О говеоШапив

сутки

0,001

14 21 сутки

-О- гр. в(га/п 5вР1-1

Рвеис/отопаз ер. * Р. КециеМапь

14 сутки

□ Рзеидотопаь гр. 0 ер. вйз/'л 53Р1-1 ® Р. /тедиеп(ап$

0,001

1 3 7 14 21 сутки Т vin.de -л- ВаеШиз $р. — ЭГ. Авуодпвеиз з1гз/л 10

0 1 3 7 14 21«утки —о— Э. /еп(а

юьеоШас'миь

штамма Bacillus sp. (FR832620). При 50°C участие мицелиальных (Streptomyces roseolilacinus (FR749827) и одноклеточных (Silanimonas lenta) бактерий в трансформации хитина становится схожим по показателю удельной активности дыхания.

Рассмотрение удельной активности образования хитиназы (С [ед. хитиназы/мл среды]) в культуралыюй жидкости исследуемых микроорганизмов, измеренной с помощью chitin-azure (рис. 7, правая панель), показывает, что при 5°С она была максимальной для грибных штаммов, при 27°С - у актиномицетов и на порядок превышала таковую у грибов и бактерий. При 50°С продукция хитиназы была одинаковой для обоих прокариотных штаммов Streptomyces roseolilacinus и Silanimonas lenta. В литературе имеются сведения, указывающие на способность образования хитиназы у многих представителей гаммапротеобактерий (Das et al., 2010), однако для рода Silanimonas, принадлежащего к этой группе, хитинолитическая активность определена впервые.

Таким образом, интенсивное накопление биомассы, высокая эмиссия диоксида углерода микроорганизмами, растущими на среде с хитином, а так же образование в среде экзофермента хитиназы показывает на потребление хитина в качестве источника углерода и азота в среде всеми исследуемыми микроорганизмами, однако наиболее активными деструкторами хитина из рассматриваемых штаммов можно считать мицелиальные прокариоты -актиномицеты.

выводы

1. Показано, что деградация полисахаридов наиболее активно протекает в пустынно-степной зоне - при высоких температурах, в почвах средних и северных климатических зон - при более низких температурах. В почвах при высоких температурах основными деструкторами полисахаридов являются прокариоты, при низких температурах возрастает роль грибов.

2. С помощью математического планирования впервые показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессиокного времени) для функционального показателя почвенного микробного гидролитического сообщества (дыхания).

3. Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов микробного сообщества - мицелиапьных и одноклеточных прокариот. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.

4. Показано, что изменение температуры существенно влияет на общую численность метаболически активных одноклеточных прокариот в гидролитическом комплексе глее-слабоподзолистой и пустынно-степной почв и практически не изменяет её в черноземе, не выявляет различия в структурах доминантных составляющих бактериальных гидролитических сообществ всех исследованных почв.

5. При всех исследуемых температурах разложение полисахаридов осуществляется филогенетическими группами АсИпоЬас(епа, р1тйси1а\ Вас1его1с!е1е.ч и РшеоЬашИа. Понижение температуры значительно увеличивает численность метаболически активных клеток /чУт/сы/е^ и Ве(аго1еоЬас(епа в гидролитическом комплексе почв и сокращает её у группы АсИпоЬасЬепа. При высоких температурах на фоне явного доминирования группы АсЧпоЬааепа, биомасса мицелиальных форм которой возрастает почта на порядок в образцах с хитином, в некоторых почвах выделяются также Оаттарго1еоЪа(Лггш.

6. Детектирован хитиказнын ген группы А (сЫА) в почве и чистых культурах микроорганизмов, отвечающий за процесс гидролиза хитина при различных температурах.

7. Выделены бактериальные штаммы, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, определенные последовательности гена 16Б рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотвдных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Власенко А.Н. Микробная трансформация хитина в почвах при различных температурах. «ХШ Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007» М. 2006. Изд-во Макс Пресс, с. 24-25.

2. Манучарова Н.А, Власенко А.Н., Степанов A.JI. Температура как аутэкологический фактор формирования хитинолитического микробного комплекса в почвах. Известия РАН. Сер. Биол. 2007. № 2. с. 205-211.

3. Власенко А.Н. Влияние температуры на формирование почвенного микробного хитинолитического комплекса. «XTV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007» М. 2007. Изд-во Макс Пресс, с. 13-14.

4. Манучарова H.A., Власенко А.Н., Белова Э.В., Зенова Г.М., Добровольская Т. Г., Степанов А. Л. Методические аспекты определения использования хитина почвенными микроорганизмами. Известия РАН. Сер. Биол. 2008. №5. с. 635-640.

5. Манучарова H.A., Власенко А.Н., Турова Т.П., Пантелеева А.Н., Степанов А.Л., Зенова Г.М. Термофильный хитинолитический микробный комплекс бурой пустынно-степной почвы. Микробиология. 2008. Т. 77. №5. с. 683-688.

6. Манучарова H.A., Власенко А.Н., Менько Е.В, Звягинцев Д.Г. Специфика хитинолитического микробного комплекса в почвах, инкубируемых при различных температурах. Микробиология. 2011. Т. 80. №2. с. 219-229.

7. Рапопорт А.М., Власенко А.Н., Манучарова H.A. Гидролитические микробные сообщества и их роль в наземных экосистемах. "Материалы всероссийской научной конференции XIV Молодежные Докучаевские чтения - 2011", СПб: СПбГУ, 2011, с. 359-360.

Подписано в печать:

26.04.2011

Заказ № 5424 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Власенко, Анна Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Полисахариды (хитин и пектин) в природных экосистемах.

1.1.1. Хитин.

1.1.2. Пектиновые вещества.

1.1.3. Сферы применения исследуемых полисахаридов.

1.2. Отношение почвенных микроорганизмов к температуре.

1.3. Гидролитические ферментные комплексы микроорганизмов и их активность в зависимости от температуры.

1.3.1. Хитинолитические ферментные комплексы.

1.3.2. Пектинолитические ферментные комплексы.

1.4. Основные группы почвенных хитинолитических и пектиполитических микроорганизмов.40'.

1.5. Молекулярно-биологических анализ хитинолитических сообществ природных экосистем.

Глава II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Постановка эксперимента по инициации микробной сукцессии

2.2.2. Изучение эмиссии диоксида углерода из образцов исследуемых почв.

2.2.3. Определение численности разных групп микроогранизмов люминесцентномикроскопическим методом.

2.2.4. Определение структуры прокариотного хитинолитического и нектинолитического сообщества почв методом FISH.

2.2.5. Выделение ДНК и амплификация фрагментов генов 16S рРНК и chiÄ

2.2.6. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

2.2.7. Филогенетический анализ

2.2.8. Получение и идентификация чистых культур хитинолитических микроорганизмов

2.2.9. Оценка интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов

2.2.10. Определение интенсивности образования хитиназы чистыми культурами микроорганизмов.

2.2.11. Определение хитиназной активности in situ

ГЛАВА HI. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Динамика эмиссии диоксида углерода из почв с внесением полисахаридов при различных температурах

3.2. Оптимизация условий разложения хитина с помощью математического планирования эксперимента

3.3. Динамика биомассы хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почв, развивающихся при различных температурах.

3.4. Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почве

3.5. Молекулярно-биологический анализ компонентного состава гидролитического бактериального сообщества почв, развивающегося при различных температурах.

3.5.1. Исследование прокариотного хитинолитического и пектинолитического сообщества почв с помощью флюоресцентной гибридизации in situ

3.5.2. ДГТЭ-анализ амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК микробных сообществ из почв, обогащенных субстратом и без него

3.5.3. Детекция хитиназного гена chiA в почвах с хитином и без него при различных температурах

3.6. Выделение и идентификация доминантов хитинолитического сообщества почв, развивающегося при различных температурах.

3.7. Оценка интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов при различных температурах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах"

Такие биополимеры как хитин и пектин являются распространенными полисахаридами в природе и постоянно присутствуют в почве (De Boer, 1999). Хитин представляет собой азотсодержащий полимер N-ацетил-О-глюкозамина, выступает неотъемлемым компонентом клеточных стенок микромицетов, экзоскелета беспозвоночных животных. Пектин -безазотистый полисахарид, состоящий из остатков D-галактуроновой кислоты, является структурным компонентом клеточных стенок высших растений, присутствует в составе клеточных соков. Оба биополимера представляют собой существенный источник углерода и азота для почвенных микроорганизмов, а их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Gooday, 1990; Kang et al., 2005).

Жизнедеятельность гидролитических микробных сообществ в существенной степени определяет уровень плодородия почв, включая снабжение растений доступными питательными ресурсами, формирование почвенной структуры и способность к подавлению нежелательных фитопатогенных популяций (Downing & Thomson, 2000; Kobayashi ct al., 2002). Масштабы микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) отличаются в биогеоценозах разных биоклиматических зон. однако в научной литературе информация о структуре и особенностях формирования микробных гидролитических комплексов под воздействием экологических факторов (в частности, температуры) практически отсутствует. С одной стороны, важна роль психрофильных и психротрофных микроорганизмов в процессах деструкции биополимеров, особенно в зонах холодного и умеренного климата. С другой стороны, известная приуроченность максимальной активности большинства хитинолитических и пектинолитических ферментов микроорганизмов к температуре 40-55°С (Kashyap, 2001; Dahia, 2006) делает интересным вопрос о деструкции полисахаридов почвенным микробным комплексом при повышенных температурах, с целью оценки потенциальной гидролитической активности микробного сообщества почв и поиска продуцентов гидролитических ферментов.

В задачи исследования входило:

4. Детекция хитиназного гена при различных температурах в исследуемых почвах и чистых культурах хитинолитиков.

5. Выявление наиболее активной группы микроорганизмов, участвующих в разложении хитина и пектина в почве при разных температурах. Выделение доминантов гидролитичеких сообществ почв, определение их видового разнообразия и активности разложения ими полисахаридов.

Научная новизна. Впервые в экспериментах с микрокосмами проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур.

Впервые с использованием метода FISH (флюоресцентная гибридизация in situ) оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активного бактериального гидролитического (хитиполитического и пектинолитического) комплекса в гумусовых горизонтах серой лесной, глее-слабоподзолистой, бурой пустынно-степной почв и чернозема в зависимости от температуры. Установлено, что при всех исследуемых температурах среди возможных агентов деструкции полисахаридов их разложение осуществляется представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. При понижении температуры в почвенном гидролитическом бактериальном комплексе особенно возрастает численность метаболически активных форм Firmicutes и Betaproteobacteria. С ростом температуры на порядок увеличивается биомасса мицелиальных представителей группы Actinobacteria, а также возрастает роль Gammaproteobacteiia.

Практическая значимость. Выделены штаммы микроорганизмов, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, последовательности гена 16S рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа. Полученные штаммы могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопатогенами.

Результаты проведенного исследования имеют важное практическое значение при разработке биотехнологического процесса получения хитинолитических и пектинолитических ферментов.

Проведенная оценка потенциальной гидролитической активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур, и анализ их компонентного состава могут быть полезны в разработке и применении хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 4 статьи, трое тезисов докладов.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Власенко, Анна Николаевна

ВЫВОДЫ

2. С помощью математического планирования впервые показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя почвенного микробного гидролитического сообщества (дыхания).

3. Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры минорных по биомассе компонентов микробного сообщества - мицелиальных и одноклеточных прокариот. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина.

4. Показано, что изменение температуры существенно влияет на общую численность метаболически активных одноклеточных прокариот в гидролитическом комплексе глее-слабоподзолистой и пустыпностепной почв и практически не изменяет её в черноземе, но выявляет различия в структурах доминантных составляющих бактериальных гидролитических сообществ всех исследованных почв.

5. При всех исследуемых температурах разложение полисахаридов осуществляется филогенетическими группами АсИпоЬаМепа, 171ггтси(е.ч, Вас1его1с1е1ех и Рго1еоЬаМеИа. Понижение температуры значительно увеличивает численность метаболически активных клеток 1чгписи1е.ч и ВетгоГеоЬас1епа в гидролитическом комплексе почв и сокращает её у группы АсипоЬаМепа. При высоких температурах на фоне явного доминирования группы АсШюЬаМепа, биомасса мицелиальных форм которой возрастает почти на порядок в образцах с хитином, в некоторых почвах выделяются также Оат т ар го 1е оЬас1е п а.

6. Детектирован хитиназный ген группы А (сЫА) в почве и чистых культурах микроорганизмов, отвечающий за процесс гидролиза хитина при различных температурах.

7. Выделены бактериальные штаммы, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, определенные последовательности гена 16Б рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в экспериментах с микрокосмами оценена потенциальная гидролитическая активности микробных сообществ почв, развивающихся в широком диапазоне температур. Комбинирование разнообразных методов исследования позволило информативно оценить различия в структурах доминантных составляющих гидролитических сообществ почв с изменением температуры.

Установлена высокая активность (оцениваемая по структурным и функциональным показателям) минорных по биомассе компонентов -мицелиальных и одноклеточных прокариот при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры. При этом роль актиномицетов особенно велика в процессах деструкции хитина

Впервые с использованием метода FISH (флюоресцентная гибридизация in situ) оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активного бактериального гидролитического (хитинолитического и пектинолитического) комплексов в гумусовых горизонтах серой лесной, глее-слабоподзолистой, бурой пустынно-степной почв и чернозема в зависимости от температуры. Установлено, что при всех исследуемых темпера!урах разложение полисахаридов осуществляется представителями филогенетических групп Actinobacteria, Finnicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. При понижении температуры в почвенном гидролитическом бактериальном комплексе особенно возрастает численность метаболически активных форм Finnicutes и Betaproteobacteria. С ростом температуры на порядок увеличивается биомасса мицелиальных представителей группы Actinobacteria, а также возрастает роль Gammaproteobacteria. С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического сообщества (дыхания).

Выделены штаммы микроорганизмов, обладающие высокой хитинолитической активностью при различных температурах, последовательности гена 168 рРНК которых депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей с присвоением им индивидуальных номеров доступа. Полученные штаммы могут быть использованы в биотехнологии для создания биопрепаратов при борьбе с фитопатогепами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Власенко, Анна Николаевна, Москва

1. Агафонов Ю.В., Быкова В.М., Кривошейка Л.И., Сидоров H.H., Белоцерковец В.М. Применение хитозана в сельскохозяйственном и декоративном растениеводстве. Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Москва Щелково, 1999.

2. Агре IT.C. Систематика термофильных актиномицетов. Пущино, 1986. -130 с.

3. Алимова Ф.К. Trichoderma/Hypocrca (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение. Казань: Казанский государственный университет имени В.И. Ульянова-Ленина. 2005. - 264с.

4. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. М.: Изд-во АН СССР, 1952. -792 с.5: Воробьева Л.И. Археи. М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. - 447 с.

5. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М.: Наука. 1983. 245 с.

6. Горовой А.Ф., Кошевский И.И., Теслкж., Трутнева H.A. / Материалы VI Между нар. Конф. «Новые достижения и исследования хитина и хитозана». М.: ВНИРО. 2001. С. 78-81.

7. Дедков В.П., Гунин П.Д. Тепловой режим почвогрунтов пустынных экосистем. //Экология. 1984. №5 с. 16-22.

8. Димо В. IT., Тепловой режим почв СССР. -М.: Колос, 1972. 359 с.

9. Добровольский Г.В. Урусевская И.С. География почв. М.: МГУ, 2004. 460 с.

10. Докучаев В.В. Русский чернозем. М.: ОГИЗ, 1948. - 480 с. (Избр. Соч.: Т. 1).

11. Донченко Л.В., Фирсов Г.Г. Пектин основные свойства, производство и применение. М.: ДеЛи принт, 2007. -276 с.

12. Доржготов Д. Почвы Монголии. Улан-Батор. Изд-во «Admon». 2003. -287 с.

13. Егорова Е.В. Влияние отходов биотехнологического производстваантибиотиков на агрохимические свойства и ферментативную активность дерново-подзолистой почвы. // Вестник Московского Университета серия Почвоведение. 2004. №3. С. 48-52.

14. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ, 2005. 445 с.

15. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М.: ГЕОС, 2001.

16. Зенова Г.М., Курапова Л.И., Лысенко A.M. и Звягинцев Д.г. структурно-функциональная организация комплексов термотолерантных актиномицетов пустынных и вулканических почв // Почвоведение. 2009. №5. с. 575-580.

17. Зенова Г.М., Дуброва М.С., Звягинцев Д.Г. Структурно-функциональные особенности комплексов почвенных психротолерантных актиномицетов. //Почвоведение. 2010. №4. с. 482487.

18. Иванушкина Н.Е. Влияние температуры и водного потенциала па рост и развитие почвенных грибов. Дис. канд. биол. наук. 1984.

19. Кожсвин П.А. Микробные популяции в природе. М.: МГУ, 1989. -175 с.

20. Кравченко И.К., Кизилова А.К., Быкова С.А., Менько Е.В., Гальченко В.Ф. Молекулярный анализ накопительных культур с высоким сродством к метану, выделенных из почв лесного биоценоза и агроцепозов. //Микробиология. 2010. Т. 79. №1. с. 114-122.

21. Кулев Д.Х., Львова Е.Б. // Материалы VI Между нар. Конф. «Новые достижения и исследования хитина и хитозана» / М.: ВНИРО. 2001. с.204-207.

22. Кухарепко О.С., Манучарова Н.А., Добровольская Т.Г. Особенности бактериальных сообществ гидроморфных почв северных регионов // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2010. №4. с. 41-43.

23. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Белова Э.В., Зенова Г.М., Добровольская Т. Г., Степанов А. Л. Методические аспектыопределения использования хитина почвенными микроорганизмами. Известия РАН. Сер. Биол. 2008. №5. с. 635-640.

24. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э., Галимзянова Н.Ф. Роль хитиназы в проявлении и антигрибной активности штаммов Bacillus sp. 739. // Микробиология. 2001. Т. 70. №5. С. 636-641.

25. Методы почвенной микробиологии и биохимии // М.: Изд-во МГУ. 1991. 303 с.

26. Мишустин E.II. Термофильные микроорганизмы в природе и практике. М.: Изд-во АН СССР. 1950.-635 с.

27. Мишустин E.H., Перцовская М.И. Микроорганизмы и самоочищение почвы. М.: Изд-во АН СССР, 1954. 650 с

28. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экология микроорганизмов; под ред. А.И. Нетрусова. М.: Изд. центр «Академия», 2004. - 272 с.

29. Новогрудский Д.М. Почвенная микробиология. Алма-Ата. 1956. -586 с.

30. Панкратов Т.А. Бактериальные сообщества сфагновых болот и их участие в деструкции природных полимеров. // Диссертация кан. биол. наук. М.: Институт микробиологии РАН, 2007. - 137с.

31. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH.// Микробиология, 2005. Т. 74, №6, С. 831-837.

32. Паринкина О.М. Микрофлора тундровых почв. Л.: Наука, 1989. 159 с.

33. Полянская Л.М., Гейдебрехт В.В., Степанов А.Л., Звягинцев Д.Г. Распределение численности и биомассы микроорганизмов по профилям зональных типов почв // Почвоведение. 1995. №3. с. 322-328.

34. Терехов A.C. Экологические пиши почвенных актиномицетов. Диссертация кан. биол. наук. -М.: МГУ, 2003. 182 с.

35. Тиунова H.A., Пиреева Д.А., Фениксова Р.В. Образование хитиназы Actinomyces kurssanovii. //Микробиология. 1976. Т. XLV. С. 625-629.

36. Тютерев С. Л., Якубчик М.С., Тарлаковский С.А. // Производство и применение хитина и хитозана. М.: Изд-воВНИРО, 1995. с. 55-57.

37. Феофилова Е.П. Биологические функции и практическое использование хитина // Прикладная биохимия и микробиология. 1984. Т. 20. Выпуск 2. с. 147-160.

38. Феофилова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физико-химические свойства и перспективы использования // Хитин и хитозан. Под ред. акад. РАСХН К.Г. Скрябина, д.х.н. Г.А. Вихоревой, д.х.н. В.П. Варламовой М.: Наука, 2002. 365 с.

39. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение // под ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. М.: Наука. 2002. - 368 с.

40. Шишов JI.JL, Тонконогов В.Д., Лебедева И.И, Герасимова М.И. Под ред. Добровольского Г.В. Классификация и диагностика почв России. Смоленск: Ойкумена. 2004. 342 с.

41. Шкадова А.К. Температурный режим почв на территории СССР. Ленинград. 1979.-203 с.

42. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1972. -476 с.

43. Aber J. D. & Mellilo J. M. Terrestrial Ecosystems. Saunders College Publishing, PA. , 1991. P. 84-88.

44. Alves M.P., Rainey F.A., Nobre M.F. & Cosata M.S. Thermomonas hydrothermalis sp. nov., a new slightly thermophilic y-proteobacterium isolated from a hot spring in central Portugal // Syst. Appl. Microbiol. 2003. 26: 70-75.

45. Amann R.I., Krunholz L., Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology II BacterioL, 1990. 172: 762-770.

46. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. 59: 143-169.

47. Anderson A. S. and Wellington E. M. H. The taxonomy of Streptomyces and related Genera//Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 2001. 51: 797-814.

48. Anjaiah V., Comalis P., Koedam N. Effect of genotype and root colonization in biological control of fusarium wilts in pigeonpea and chickpea by Pseudomonas aeruginosa PNA1 // Can. J. Microbiol. 2003. 49: 85-91.

49. Arakane Y. & Muthukrishnan S. Insect chitinase and chitinase-like proteins // Cell. Mol. Life Sci. 2010. 67: 201-216.

50. Baker G.C. and Cowan D.A. 16S rDNA primers and the unbiased assessment of thermophile diversity // Biochem. Soc. Trans. 2004. 32: 218— 221.

51. BaiTOS M. D., Bonetti S. J. and Carsella J. S. Isolation of Pénicillium chitinases: a comparison of enzymes isolated from supernatant and pelleted fractions //FASEB J. 2006. 20: A 57.

52. Beg Q.K., B. Bhushan, M. Kapoor, G.S. Hoondal. Production and characterization of thermostable xylanase and pectinase from Streptomyces sp. QG-11-3 II J. hid. Microbiol. Biotechnol. 2000. 24: 396-402.

53. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology // Eds. J.A.Holt, N.R. Krieg, Peter H.A. Smath, J.T. Stanley, S.T. Williams. Baltimore ets: Williams and Wilkins, 1994. 787 p.

54. Bertaux J., Gloger U., Schmid M., Hartmann A., Scheu S. Routine fluorescence in situ hybridization in soil // J. Microbiol. Methods. 2007. 69: 451-460.

55. Berthrong S.T., Schadt C.W., Pineiro G. and Jackson R.B. Afforestation alters the composition of functional genes in soil and biogeochemical processes in South American grasslands // Appl. Environ. Microbiol. 2009. 75 (19): 6240-6248.

56. Berensmeier S., Singh S.A., Meens J. & Buchholz K. Cloning of the pelA gen from Bacillus licheniformis 14A and biochemical characterization of recombinant, thermostable, high alkaline pectate lyase // Appl. Microbiol. Biothechnol. 2004. 64: 560-567.

57. Bhattacharya D., Nagpure A., Gupta R.K. Bacterial chitinases: properties and potential // Crit. Rev. Biotechnol. 2007. 27(1): 21-28.

58. Bhushan B. and Hoondal G.S. Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp. BG-11 // Biotechn. Lett. 1998. 20(2): 157-159.

59. Boot R.G., Blommaart E.F.C., Swart E., Ghauharali-van der Vlugt K., Bijl N., Moe C., Place A. & Aerts J.M.G. Identification of a nivel acidic mammalian chitinase distinct from chitotriosidase H J. Biol. Chem. 2001. 276: 6770-6778.

60. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitationof microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. 72: 248-254.

61. Brock T. D. & Madigan M. T., 1988. Biology of Microorganisms. 5th edn. Prentice Hall Incorporation. 835 pp.

62. Brühlmann F., Kim K.S., Zimmerman W. and Fiechter A. Pectinolytic Enzymes from actinomycetes for the degummining of raimie bast fibers // Appl. & Environ. Microbiol. 1994. 60 (6): 2107-2112.

63. Busse H.-J., Kämpfer P., Moore E.R.B. & 7 other authors. Thermomonas haemolytica gen. nov., sp. nov., a c-proteobacterium from kaolin slurry // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. 52: 473-483.

64. Campbell J.H., Clark J.S. and Zak J.Z. PCR-DGGE Comparison of Bacterial Community Structure in Fresh and Archived Soils Sampled along a Chihuahuan Desert Elevational Gradient // Microb. Ecol. 2009. 57 (2): 261-266.

65. Castle D. & Kirchman D.L. Composition of estuarine bacterial communities assessed by denaturing gradient gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization// Limnol. Oceanogr.: Methods. 2004. 2: 303-314.

66. Chandler D.P., Fredrickson J.K. and Brockman F.J. Effect of PCR template concentration on the composition and distribution of total community 16S rDNA clone libraries UMol. Ecol. 1997. 6: 475-482.

67. Chen M.Y., Tsay S.S., Chen K.Y., Shi Y.C., Lin Y.T. & Lin G.H. Pseudoxanthomonas taiwanensis sp. nov., a novel thermophilic, N20-producing species isolated from hot springs // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. 52: 2155-2161.

68. Chin K.-J., liesak W . and Janssen H. Optitus terrae gen nov., sp. Nov., to accommodate novel strain of the division "¥61x^01111^0^^ isolated from rice paddy soil HIJSEM. 2001. 51: 1965-1968.

69. Christopher C.A. and Clause! A.O. 1980. U.S. Patent 4,210,204.

70. Cottrell M.T., Wood D.N., Yu L., Kirchman D.L. Selected chitinase genes in cultured and uncultured marine bacteria in the alpha- and gamma-subclasses of the proteobacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2000. 66(3): 1195-201.

71. Culbreath AK, Rodriguez-Cabana R, Morgan-Jones G. Chitin and Paecilomyces lilacinus for control of Meloidogyne arenaria II Nematropica. 1986.16: 153-166.

72. Dahiya N., Tewari R., Tiwari R.P., Singh Hoodndal G. Chitinase from Enterobacter sp. NRG4: Its purification, characterization and reaction pattern // Electron. J. Biotechnol. 2005. V.8. №2.

73. Dahiya N., Tewari R., Hoondal G.S. Biothechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. 71: 773-782.

74. Davila-Rodriguez J.L.; Escobar-Barrios V.A., Shirai K. & Rangel-Mendez J.R. Synthesis of a chitin-based biocomposite for water treatment: Optimization for fluoride removal // Journal of Fluorine Chemistry. 2009. 130 (8): 718-726.

75. De Boyer W., Gunnewiek PJAK, Lafeber P., Janse J.D., Spit B.E., Woldendorp J.W. Antifungal properties of chitinolytic dune soil bacteria // Soil Biol. &Biochem. 1998. 30(2): 193-203.

76. De Boyer W., Gerards S., Klein G. P.J.A. and Modderman R. Response of the chitinolytic microbial community to cliitin amendments of dune soils // Biol Fei1.il. Soils. 1999. 29: 170-177.

77. De Boer W., Klein Gunnewiek P.J., Kowalchuk G.A. and Van Veen J.A. Growth of Chitinolytic Dune Soil B-Subclass Proteobacleria in Response to Invading Fungal Hyphae // Appl. Environ. Microbiol. 2001. 67(8): 33583362.

78. Dedysh S. N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S. and Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog U Appl. Envir Microbiol. 2006. 72(3): 2110-2117.

79. Deshpande M.V. Enzymatic degradation of chitin and its biological applications // J. Sci. Ind. Res. 1986. 45: 273-281.

80. Domsch K.H., Gams W., Traute-Heidi Anderson. "Compendium of soil fungi"//Eching: IHW-Verl. Reprint der Ausg. Von 1980. Vol. 1 (1993).

81. Downing K.J. & Thomson J.A. Introduction of the Serratia marcescens. chiA gene into an endophytic Pseudomonas fluorescens for the biocontrol of fitophatogenic fungi // Can. J. Microbiol. 2000. 46: 363-369.

82. Edenbom S.L. and Sexstone A.J. DGGE fingerprinting of culturable soil bacterial communities complements culture-independent analyses // Soil Biol. & Biochem. 2007. 39 (7): 1570-1579.

83. Eickhorst T. and Tippkotter R. Improved detection of soil microorganisms using fluorescence in situ hybridization (FISH) and catalyzed reporter deposition (CARD-FISH) // Soil Biol.& Biochem. 2008. 40(7): 18831891.

84. Eilenberg H., Pnini-Cohen S., Schuster S., Movtchan A. & Zilberstein A. Isolation and characterisation of chitinase genes from pitches of the carnivorous plant Nepenthes khasiana II J. Exp. Bol. 2006. 57: 2775-2784.

85. Eltarabily-K.A., Soliman-M.H, Nassar-A.H., Alhassani-H.A. Biologycal-Control of Sclerotinia Minor Using a Chitinolytic Bacterium and Actinomycetes II Plant Pathology. 2000. 49(5): 573-583.

86. Escott G.M. and Adams D.J. Chitinase Activity in Human Serum and Leukocytes // Infection and Immunity. 1995. 63(12): 4770^1773

87. Favela-Torres E., Volke-S.T. and Viniegra-Gonzalez G. Production of Hydrolytic Depolymerising Pectinases // Food Technol. Biotechnol. 2006. 44 (2) 221-227.

88. Feller G., Naiynx E., Arpigny J. L., Zekhini Z., Swings J. and Gerday C. Temperature dependence of growth, enzyme secretion and activity ofpsychrophilic Antarctic bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. 41: 477-479.

89. Fenice M., Selbmann L., R. Di Giambattista and Federici F. Chitinolytic activity at low temperature of an Antarctic strain (A3) of Verticillium lecanii II Research in Microbiol. 1998. 149(4): 289-300.

90. Frankenberger W.T.Jr. & Dick W.A. Relationships between enzyme activities and microbial growth and activity indices in soil. // Soil Sci. Society of America J. 1983.47: 945-951.

91. Gao J., Bauer M. W„ Shockley K.R., Pysz M.A. and Kelly R. M. Growth of Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus on Chitin Involves Two Family 18 Chitinases IIAppl. Environ. Microbiol. 2003. 69(6): 3119-3128.

92. Gao X.D., Katsumoto T., Onodera K. Purification and Characterization of Chitin Deacetylase from Absidia coerulea // J. Biochem. 1995. 117:257-263.

93. Georlette D., Blaise V., Collins T., D'Amico S., Gratia E., Hoyoux A., Marx J.-C., Sonan G., Feller G., Gerday C. Some like it cold: biocatalysis at low temperatures // FEMSMicrobiol. Rev. 2004. 28: 25-42.

94. Giersher K. Pectin and pectic enzymes in fruit and vegetables technology // Gordian. 1981. V.81. №№7-8. p. 171-176.

95. Gillichinsky D., Vishnivetskaya T., Petrova M., Spirina E., Mamykin V. and Rivkina E. Bacteria in Permafrost // In "Psychrophilcs: from biodiversity to biotechnology" ed. by Margesin R., Schinner F., Marx J.K., Cerdey C. Springer Verlag. 2008. 462 p.

96. Gohel V., Singh A., Vimal M., Ashwmi P. and Chhatpar H.S. Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic microorganisms. // African Journal of Biotechnol. 2006. 5 (2): 54-72.

97. Gonzalez-Franco A.C., Deobald L.A., Spivak A. and Crawford D.L. Actinobacterial chitinase-like enzymes: profiles of rhizosphere versus non-rhizosphere isolates // Can. J. Microbiol. 2003. 49: 683-698.

98. Gooday G.W. Physiology of microbial degradation of ehitin and chitosan // Biodégradation. 1990. 1: 177-190.

99. Gortari M.C. and Hours R. A. Fungal chitinases and their biological role in the antagonism onto nematode eggs. A review. // Mycol. Progress. 2008. 7(4): 221-238.

100. Gould W.D., Bryant R.J., Trofimow J.A., Anderson R.V., Coleman D.C. Chitin decomposition in a model soil system. // Soil Biol. & Biochem. 1981. 13: 487-492.

101. Gounot A.M. & Russell N. J. Physiology of cold-adapted microorganisms // In "Cold-adapted Organisms", Edited by R. Margesin & F. Schinner. New York: Springer. 1999.-416 p.

102. Gray T.R.G. and Baxby P. Chitin decomposition in soil. II. The ecology of chitinoclastic micro-organisms in forest soil // Trans. Br. Mycol. Soc. 1968. 51: 293-309.

103. Gschwendtner S., Reichmann M., Millier M., Radl V., Munch J.C. and Schloter M. Abundance of bacterial genes encoding for proteases and chitinases in the rhizosphere of three different potato cultivars // Biol. Fertil. Soils. 2010. 46: 649-652.

104. Haki G. D. and Rakshit S. K. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review // Bioresourse Technology. 2003. 89(1): 17-34.

105. Hallmann J., Rodriguez-Kabana R., Kloepper J.W. Chitin-mediated changes in bakterial communities of the soil, rhizosphere and within roots of cotton in relation to nematode control // Soil biology and biochemistry. 1999. 31: 551-560.

106. Hatada Y„ Saito K., Yoshimatsu T„ Ozawa T., Kobayashi T. & Ito S. Deduced amino-acid sequence and possible catalytic residues of a novel pectate lyase from an alcalophilic strain of Bacillus H Eur. J. Biochem. 2000. 267: 2268-2275.

107. Ilenrissat B. & Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. 293: 781-788.

108. Ilenrissat B. Classification of chitinase modules // In Chitin and chitmases. Muzzarelli RAA (ed). Basel, Switzerland: Birkhauser-Verlag. 1999. pp. 137159.

109. Herron S.R., Benen J.AE., Scavetta R.D., Visser J. & Jurnak F. Structure and function of pectic enzymes: virulence factors of plant pathogens // Proc. Natl acad. Sci. USA. 2000. 97: 8762-8769.

110. Hirsbrunner P. 1888. U.S. Patent 4,743,288.

111. Howard M.B., Ekborg n.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. hid. Microbiol. Biot. 2003. 30: 627-635.

112. Ikeda S., Ytow N. Ezura H., Minamisawa K., Miyashita K., Fujimura T. Analysis of molecular diversity of bacterial chitinase genes in the maize rhizosphere using culture-independent methods // Microbes and Environm. Microbiology. 2007. 66: 3290-3296.

113. Jayani R.S., Saxena S. and Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review // Process Biochemistry. 2005. 40: 2931-2944.

114. Jiang C., Xu L. Actinomycete diversity in unusual habitats I I Bioline Enternational. Actinomycetes. 1993. 4(2): 47-57. ■

115. Jousset A., Lara E., Nikolausz M., Harms H. and Chatzinotas A. Application of the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technique as an efficient diagnostic tool for ciliate communities in soil // Sci. Total Envir. 2010. 408 (5): 1221-1225.

116. Kang H., Freeman C., Park S.S., and Chun J., N-Acetylglucosaminidase Activities in Wetlands: A Global Survey II Hydrobiologia. 2005. 535: 103110.

117. Karlsson M. and Stenlid J. Comparative Evolutionary Histories of Fungal Chitinases. // In Evolutionary Biology. Concept, Modeling and Application. Ed. by Pierre Pontarotti. Springer Verlag. 2009. Part 3. Chap. 19. pp. 323337.

118. Kashyap D.R., Vohra P.K., Chopra S. and Tevvari R. Application of pectinases in the commercial sector: a review // Bioresource Technol. 2001. 77: 215-237.

119. Kasugai H., Motojima S. and InouseK. 1975. U.S. Patent 3,891,756.

120. Kawase T., Saito A., Sato T., Kanai R., Fujii T., Nikaidou N., Miyashita K., Watanabe T. Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases m Actinobacteria II Appl. Environ. Microbiol. 2004. 70(2): 1135-1144.

121. Kertesz L.I. The pectin substances. New York: Intersciense Publishers, 1951.-628p.

122. Kim S.-K. Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and Their Derivatives: Biological Activities and Applications. CRC Press, USA. 2010. 662 p.

123. Kirchman D.L. The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments IIFEMSMicrobiol. Ecol. 2002. 39: 91-100.

124. Klappenbach J.A., P.R. Saxman P.R., Cole J.R. and Schmidt T.M. rmdb: The ribosomal RNA operon copy number database // Nucleic Acids Res. 2001. 29: 181-184.

125. Knudsen K.E.B. Carbohydrate and lignin contents of plant materials used in animal feeding // Animal Feed Technology. 1997. 67: 319-338

126. Kobayashi D.Y., Reedy R.M., Bick J. & Oudemans P.V. Characterisation of a chitinase gene from Stenotrophomonas maltophilia strain 34S1 and its involment in biologicalcontrol // Appl. Environ. Microbiol. 2002. 68(3): 1047-1054.

127. Kogan G., Machova E., Chorvatovicova D., Sandula J. // Prog. 3 rd Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symp. 1998. P. 372-379.

128. Kong Y.H., Beer M., Seviour R.J., Lindrea K.C. and Rees G.N. Structure and functional analysis of microbial community in an aerobic: anaerobicsequencing batch reactor (SBR) with nophosphorus removal // Syst. Appl. Microbiol. 2001. 24: 597-609.

129. Kramer K. J., Muthukrishnan S., Lowell J., White F. Chitinases for insect control // In Advances in insect control. Eds. N. Carozzi, M. Koziel. Taylor and Francis, Bristol, 1997, p. 185-193.

130. Krsek M. & Wellington E.M.H. Assessment of chitin decomposer diversity within an upland grassland // Antonie van Leeuwenhoek. 2001. 79: 261267.

131. Kuhad R.C., Kapoor M., Rustagi R. Enhanced production of an alkaline pectinase from Streptomyces sp. RCK-SC by whole-cell immobilization and solid-state cultivation II World J. Microbiol. Biotechnol. 2004. 20: 257-263.

132. Kuk J.H., Jung W.J., Jo G.H., Kun Y.C., Kim K.Y., Park R.D. Production of N-acetyl-beta-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp. GJ-18 crude enzyme // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. 68(3): 384-389.

133. Labrie C., Leclerc P., Cote N., Roy S., Brzezinski R., Hogue R. and Beaulieu C. Effect of chitin waste-based composts produced by two-phase composting on two oomycete plant pathogens // Plant and Soil. 2001. 235: 27-34.

134. Lang C. & Dornenburg H. Perspectives in the biological function and the technological application of polygalacturonases (Minireview) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. 53: 366-375.

135. LeCleir G.R., Buchan A., Maurer J., Moran M.A. and Hollibaugh J.T. Comparision of chitinolytic enzymes from an alkaline, hypersaline lake and an estuary // Environ. Microbiol. 2007. 9: 197-205.

136. Lee E.M., Jeon C.O., Choi I., Chang K.S., Kim C.J. Silanimonas lenia gen. nov., sp. nov., a slightly thermophilic and alkaliphilic gammaproteobacterium isolated from a hot spring // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. 55: 385-389.

137. Leininger S., T. Urich, M. Schloter, L. Schwark, J. Qi, G. W. Nicol, J. I. Prosser, S. C. Schuster & C. Schleper. Archaea predominate amongammonia-oxidizing prokaryotes in soils // Nature. 2006. 442: 806-809.

138. Leisner J. J., Larsen M. H., Jorgensen R. L., Brondsted L., Thomsen L. E. and Ingmer H. Chitin Hydrolysis by Listeria spp., Including L. monocytogenes fIAppl. Environ. Microbiol. 2008. 74(12): 3823-3830.

139. Lezica R.P., Quesada-Allue L. Chitin // Methods in Plant Biochemistry. 1990. 2: 443-474.

140. Li D.-C. Review of Fungal Chitinases // Mycopathologia. 2006. 161 (6): 345-360.

141. Makarios-Laham I. and Lee T.-C. Biodegradability of chitin- and chitosan-containing films in soil environment // J. of Polymers&Environ. 1995. 3(l):31-36.

142. Makoi J. IT. J. R. and Ndakidemi P. A. Selected soil enzymes: Examples of their potential roles in the ecosystem // African Journal of Biotechnology. 2008. 7(3): 181-191.

143. Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M., Schleifer K.-H. Phylogenetie oligonucleotide probes for the major subclasses of Proteobacleria: problems and solutions//Syst. Appl. Microbiol. 1992. 15: 593-600.

144. Markovic O. & .Tanecek S. Pectin degrading glycoside hydrolases of family 28: sequence-structural features, specificities and evolution // Protein Eng. 2001. 14: 615-631.

145. Marx M.-C., Wood M. and Jarvis S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils // Soil Biol, and Biochem. 2001. 33: 1633-1640.

146. Mavromatis K., Feller G., Kokkinidis M. and Bouriotis V. Cold adaptation of a psychrophilic chitinase: a mutagenesis study. // Protein Engineering. 2003. 16(7): 497-503.

147. Mediavilla J., Jain S., Kriakov J., Ford M.E., Duda R.L., Jacobs W.R., Hendrix R.W., Hatfull G.F. Genome organization and characterization of mycobacteriophage Bxbl HMol Microbiol. 2000. 38: 955-970.

148. Meier H., Amann R% Ludwig W% Schleifer K.-H. Specific oligonucleotide probes for in situ detection of a major group of gram-positive bacteria with low DNA G+C content II Syst. Appl. Microbiol. 1999. 22: 186-196.

149. Metcalfe A.C., Krsek M., Gooday G.W., Prosser J.I. and Wellington E.M.H. Molecular analysis of a bacterial chitinolytic community in an upland pasture II Appl. Environ. Microbiol. 2002a. 68 (10): 5042-5050.

150. Metcalfe A.C., Williamson N. Krsek M. and Wellington E.M.H. Molecular diversity within chitinolytic actinomycetes determined by in situ analysis // Actinomycetol. 2002b. 17: 18-22.

151. Meyer A. F., Lipson D.A., Martin A.P., Schadt C. W„ Schmidt S. K. Molecular and metabolic characterization of cold tolerant alpine soil Pseudomonas sensu stricto // Appl. Environ. Microbiol. 2004. 70(1): 483489.

152. Mitchell R. & Alexander M. Microbiological processes associated with the use of chitin for biological control II Soil Sci. Soc. Am. Proc. 1962. 26: 556558.

153. Mitchell R. Additionof faungal cell-wall components to soil for biological disease control // Phytopathology. 1963.53(9): 1068-1071.

154. Muzzarelli R. Native, industrial, and fossil chitins II In R. A. Muzzarelli and P. Jooaes (ed.), Chitin and chitinases. Birkhauser, Basel, Switzerland. 1999. P. 1-5.

155. Nakatsu C.H., Torsvik V. and Ovreas L. Soil community analysis using DGGE of 16S rDNA polymerase chain reaction products // Soil Sci. Soc. Am. J. 2000. 64: 1382-1388.

156. Nawani N. N., Kapadnis B. P., Das A. D„ Rao A. S. and Mahajan S. K. Purification and characterization of a thermophilic and acidophilic chitinase from Microbispora sp. v2 // J. Appl. Microbiol. 2002. 93 (6): 965-975.

157. Neef A., Amann R., Schlesner H., Schleifer K.-H. Monitoring a widespread bacterial group: in situ detection of Planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes //Microbiology. 1998. 144: 3257-3266.

158. Nishimura T., Toyota K., Mochizuki M. Predominant culturable Bacillus species in Japanese arable soils and their potential as biocontrol agents // Microb. Environ. 2005. 20: 61-68.

159. Okafor N. Ecology of microorganisms on chitin buried in soil // J. Gen. Microbiol. 1966a. 44: 311-327.

160. Okafor N. Estimation of the decomposition of chitin in soil by the method of carbon dioxide release // Soil Science. 1966b. 102:140-142.

161. Ordentlich A., Elad Y., Chet I. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol of Sclerotium rolfsii H Phytopathology. 1988. 78: 84-88.

162. Parcham J. A., Deng S. P. Detection, guantification of ß-glucosaminidase activity m soil // Soil Biol. & Biochem. 2000. 32: 1183-1190.

163. Pectinase database http://pec.biodbs.ini'o/mdcx.html

164. Pitt J.I. 1988. A laboratory guide to common Penicillium species. 2nd ed. North Ryde, N.S.W., Australia: Publ. by the author. 187 p.

165. Poulsen P.H.B., Muller J., Magid J. Determination of relationship between chitinase activity and microbial diversity in chitin amended compost // Bioresource Techonoly. 2008. 99: 4355-4359.

166. Pourcher A-M., Sutra L., Hebe I., Moguedet G., Bollet C, Simoneau Ph., Gardan L. Enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from refuse of a landfill if FEMSMicrobiology Ecology. 2001. 34: 229-241.

167. Ramaiah N. Tlill R.T., Chun J., Ravel J., Matte M.H., Straube W.L. and Col well R/r/ Use of a chiA probe for detection of chitinase genes in bacteria from the Chesapeake Bay // FEMS Microbial. Ecol. 2000. 34: 63-71.

168. Raskin L., Stromley J.M., Rittmann B.E., Stahl D.A. Group-specific 16S rRNAhybridization probes to describe natural communities of methanogens // Appl. Environ. Microbiol. 1994. 60: 1232-1240.

169. Repka V. Intra- and extracellular isoforms of PR-3 class chitinase in virusinfected cucumber plants // Acta Virol. 1997. 41(2): 71-75.

170. Revah-Moiseev S. & Carroad A. Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish chitin to single-cell protein // Biotechnol. & Bioengng. 1981. 23(8): 1067-1072.

171. Rodrigues J., Santos M. J., Copa-Patio J. L. and Peprez-Leblic M. I. Chitinolytic activity produced by Penicillium oxalicum in different culture media.// Letters Applied Microbiol. 1993. 16(2): 69-71.

172. Rodrigues-Kabana R., Godoy G., Morgan-Jones G. and Shelby R. A. Thedetermination of soil chitinase activity: Conditions for assay and ecological studies, if Plant and soil. 1983. 75 (1): 95-106.

173. Roller C., Wagner M„ Amann R., Ludwig W„ Schleifer K.-H. In situ probing of Gram-positive bacteria with high DNA G+C content using 23S l-RNA- targeted oligonucleotides //Microbiology. 1994. 140: 2849-2858.

174. Rossello-Mora R., Thamdrup B., Shafer II. Weller R. and Amann R. The response of the microbial community of marine sediments to organic carbon input under anaerobic conditions // Syst. Appl. Microbiol. 1999. 22: 237-248.

175. Sahai A. S., Manocha M. S. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction. // FEMS Microb. Reviews. 1993. 11: 317-338.

176. Sakai T., Sakamoto T., Hallaert J. & Vandamme E.J. Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties, and applications // Adv. Appl. Microbiol. 1993. 39: 213-294. '

177. Sato K., Azama Y., Nogawa M., Taguchi G. And Shimosaka M. Analysis of a change in bacterial community in different environments with addition of chitin or chitosan // J. Bioscience & Bioengineering. 2010. 109 (5):472-478.

178. Salokari, R.M., E.E. Vaughan, A.D.L. Akkermans, M. Saarela, and W.M. de Vos. Bifi dobactcrial diversity in human feces detected by genus specific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol.2001. 67: 504-513.

179. Schafer H., Muyzcr G. Denaturing gradient gel electrophoresis in marine microbial ecology // Marine Microbiology. Methods in Microbiology. Ed. J.H. Paul. London: Acad. Press. 2001. 30: 425-468.

180. Schiewer S. and Patil S.B. Pectin-rich fruit wastes as biosorbents for heavy metal removal: Equilibrium and kinetics. // Bioresource Technology. 2008. 99(6): 1896-1903.

181. Schrempf H. Recognition and degradation of chitin by streptomycetes // Antonie van Leeicwenhoek. 2001. 79: 285-289.

182. Seidl V., Huemer B., Seiboth B., Kubicek C.P. A complete survey of Trichoderma chitinases reveals three distinct subgroups of family 18 chitinases HFEBSJ. 2005. 272: 5923-5939.

183. Sembiring, L., Ward, A.C., and Goodfellow, M. Selective isolation and characterization of members of the Streptomyces violaceusniger clade associated with the roots of Paraserianthes falcataria // Antonie Van Leeuwenhoek. 2001. 78: 353-366.

184. Seymour G.B., Knox J.P. Pectin's and their manipulation. USA: Blackwell,2002. 25Op.

185. Song J. H., R. J. Murphy, R. Narayan and G. B. H. Davies. Biodegradable and compostable alternatives to conventional plastics. // Phil. Trans. R. Soc. B. 2009. 364: 2127-2139.

186. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology //Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. 44 (4): 846-849.

187. Stackebrandt E.; Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards IIMicrobiology today. 2006. P. 152-155.

188. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes //

189. E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. 1991. Wiley, New York. p. 205-248.

190. Stopnisek N., Gubry-Rangin C., Hofferle S., Nicol G.-W., Mandic-Mulec I. and Prosser J.I. Thaumarchaeal Ammonia Oxidation in an Acidic Forest Peat Soil Is Not Influenced by Ammonium Amendment // Appl. Environm. Microbiol. 2010. 76 (22): 7626-7634.

191. Stutzenberger F.J. Inducible thermoalkalophilic polygalacturonate lyase from Thermonomospora fusca // J. Bacteriol. 169: 2774-2780.

192. Sullivan L.A., Weightman A.J., Fiy J.C. New degenerate Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides-sipecific 16S ribosomal DNA-targeted oligonucleotide probes reveal high bacterial diversity in river taff epilithon // Appl Environ. Microbiol. 2001. 68: 201-210.

193. Suzuki K., Taiyji M., Sugawara N, Nikaidou N., Henrissat B. and Watanabe T. The third chitinase gene (chi C) of Serratiamarcescens 2170 and the relationship of its product to other bacterial chitinases // Biochem. J. 1999. 343: 587-596.

194. Takayanagi T., Ajisaka K., Takiguchi Y. &Shimahara K. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u // Biochim. Biophys. Acta. 1991. 1078: 404-410.

195. Thakur B.R., Singh R.K. and Handa A.K. Chemistry and Uses of Pectin — A Review // Crit. Rev. FoodSci.& Nutrition. 1997. 37(1): 47-73.

196. Tamura K., Dudley J., Nei M. & Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary genetic Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution. 2007. 24: 1596-1599.

197. Tharanathan R.N. & KitturF.S. Chitin the undisputed biomolecule of great potential // Crit. Rev. FoodSci. Nutr. 2003. 43: 61-87.

198. Timonen S. and Bomberg M. Archaea in dry soil environments // Phytochem. Rev. 2009. 8: 505-518.

199. Tsujibo H., Minoura K., Miyamoto K., Endo H., Moriwaki M. & Inamori Y. Purification and properties of a thermostable chitinase from Strep tomyces thermoviolaceus OPC-520 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. 59: 620-622.

200. Veldkamp H. A study of the aerobic decomposition of chitin by microorganisms // Meded Landbouwhogesch Wageningen. 1955. 55: 127174.

201. Leuven vanL. W. 1967. U.S. Patent 3,346, 407.

202. Wagner M., Horn M., Daims PI. Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaiyotes. // Cwr. Opin. Microbiol. 2003. 6(3): 302-309.

203. Watanabe T., Kanai R., Kawase T., Tanabe T., Mitsutomi M., Sakuda S., Miyashita K. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution IIMicrobiology. 1999. 145: 3353-3363.

204. Williamson, N., Brian, P., and Wellington, E. M.: Molecular detection of bacterial and streptomycete chitinase in the environment // Antonie Van Leeuwenhoek. 2000. 78: 315-321.

205. Woods D. 1988. U.S. Patent 4,735,737.

206. Xiao X,, Yin X., Lin J., Sun L., You Z., Wang P., and Wang F. Chitinase

207. Genes in Lake Sediments of Ardley Island, Antarctica // Appl. Environm. Microbiol. 2005. 71 (12):7904-7909.

208. Xiao Y., Bozd J., Grosse S., Beauchemin M., Coupe E., Lau P. Mining Xantomonas and Streptomyces genomes for new pectinase-encoding sequences and their heterologous expression in Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biothechnol. 2008. 78: 973-981.

209. Yang C.H. and Crowley D.E. Rhizosphere microbial community structure in relation to root location and plant iron nutritional status // Appl. Environ. Microbiol. 2000. 66: 345-351.

Информация о работе

Власенко, Анна Николаевна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Микробная деградация полисахаридов в почвах при различных температурах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы