Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Хитинолитический и пектинолитический микробные комплексы наземных экосистем

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Хитинолитический и пектинолитический микробные комплексы наземных экосистем"

На правах рукописи

^і/сги/' '

ЛУКАЧЕВА Евгения Георгиевна

ХИТИНОЛИТИЧЕСКИЙ И ПЕКТИНОЛИТИЧЕСКИЙ МИКРОБНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 В МАЙ 2013

Москва—2013

005058260

005058260

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Манучарова Наталия Александровна

Официальные оппоненты: Терехова Лариса Петровна........

доктор биологических наук, профессор,

Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе Российской академии медицинских наук, руководитель отдела микробиологии Бабич Тамара Леонидовна

кандидат биологических наук, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация: «Российский государственный аграрный университет — Московская сельскохозяйственная академия имени К. А. Тимирязева»

Защита состоится " 28 "_мая_ 2013 г. в 15:30 в аудитории .... на заседании

диссертационного совета Д.501.002.13, Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова». Автореферат разослан "26 " апреля 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета: Зенова Галина Михайловна

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Растительные сообщества благодаря вертикально-ярусной организации определяют пространственную структуру микробных комплексов в экосистемах. Вертикально-ярусный подход подразумевает одновременное исследование микробоценозов в пределах надземного, наземного (подстилка) и почвенного ярусов экосистем.

Для наземных биогеоценозов определяющим фактором, влияющим на стратификацию микроорганизмов, является характер и доступность субстрата, формирующего определенный тип питания микробиоты. Так в филлоплане это прижизненные экссудаты растений, в подстилках - биополимеры, в почве -гумусовые компоненты. При этом все ярусы связаны между собой единым потоком органического вещества и представляют собой разделенные в пространстве стадии сукцессии по разложению органических веществ (Звягинцев и др., 2005). В связи с тем, что микробные сообщества играют первостепенную роль в круговороте веществ и потоках энергии, определяя тем самым гомеостаз экосистем, актуальным представляется вопрос о закономерности распространения гидролитических микробных комплексов наземных экосистем, их видового состава и метаболической активности.

В микробиологии направление, связанное с ярусной организацией растительных сообществ до последнего времени почти не развивалось (Звягинцев, 2005). При сравнении- микробных комплексов разных природных зон анализировались лишь гумусовые горизонты (А1) почвенного профиля. При таком подходе учитывалась лишь незначительная часть микробного сообщества. Но с развитием современных молекулярно-биологических методов в рамках вертикально-ярусного подхода стратиграфический анализ микробных сообществ позволяет определить таксономическую принадлежность, активность и функциональную значимость компонентов микробных гидролитических комплексов.

Такие полисахариды, как хитин и пектин входят в состав матрикса клеточных стенок различных организмов и, постоянно присутствуя в наземных биогеоценозах, представляют собой пул органического углерода и азота (МаписЬагоуа, 2009), их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Сооёау, 1990; Каг^ й а1., 2005). Наличие в молекуле хитина ацетамидных

групп придает ему особо ценные в практическом отношении свойства (Феофилова, 1992). Известно, например, что препарат на основе бактериальной хитиназы является перспективным экологически безопасным средством биологического контроля над фитопатогенными грибами (Eltarabily et al, 2000). Кроме того, в последнее время активно ведутся работы по изучению этих полисахаридов в качестве биосорбента.

В связи с ростом применения в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине и косметологии таких полисахаридов как пектин и хитин, а также с их широкой распространенностью в наземных экосистемах, актуальным является вопрос определения активности и структуры гидролитических комплексов этих полисахаридов.

Цель работы - установить закономерности распространения гидролитических микробных комплексов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в наземных экосистемах различных биоклиматических зон, их метаболическую активность и филогенетическую принадлежность. Задачи исследования:

1. Оценить динамику функциональных и структурных показателей метаболически активных микроорганизмов-гидролитиков, населяющих надземный (филлосферу), наземный (подстилку) и почвенный (гумусовый горизонт Al) ярусы наземных экосистем различных биоклиматических зон.

2. В условиях лабораторного микрокосма определить активность микробной деструкции полисахаридов в различных ярусах степной, лесной и таежной экосистем.

3. Исследовать разнообразие и численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria метаболически активных микроорганизмов-гидролитиков исследуемых биогеоценозов.

4. Выявить наиболее активные группы прокариот, участвующих в разложении исследуемых биополимеров, и видовое разнообразие доминантов гидролитических сообществ. В условиях микрокосмов установить возможность использования выделенных культур активных хитинолитиков в борьбе с фитопатогенными грибами.

Научная новизна работы заключается в определении биоразнообразия гидролитических микробных комплексов (хитинолитического и пектинолитического) и степени их функционирования в наземных экосистемах различных биоклиматических зон......

По результатам работы установлена специфическая функциональная роль микроорганизмов при деструкции биополимеров в надземной и почвенной частях экосистем.

Впервые отмечено, что развитие хитинолитического сообщества обусловлено, главным образом, прокариотными организмами, в то время как пектинолитического - его эукариотной составляющей. Для определенных условий эксперимента установлена регрессионная зависимость структурных показателей микробного сообщества (грибов и актиномицетов) в наземных экосистемах разных биоклиматических зон в рамках вертикально-ярусного подхода. Рассчитана удельная активность дыхания микробных сообществ, и установлено, что удельная активность при использовании хитина, вне зависимости от яруса исследуемого биогеоценоза, в 2-3 раза превышает удельную активность дыхания при использовании пектина, что может быть полезно для развития современной биотехнологии.

Данные, полученные в результате обработки с помощью дискриминатного и кластерного анализов, дают возможность утверждать, что среди экологических параметров, определяющих структурные показатели гидролитического комплекса, для определенных условий эксперимента, более значимым фактором является тип биогеоценоза по сравнению с внесением органического вещества и профильным уровнем системы. Подобные данные могли бы быть полезны для понимания наиболее значимых параметров для управления микробными комплексами. По результатам дискриминатного анализа установлена возможность классификации и биодиагностики образцов наземных экосистем по структурному показателю микробного комплекса, в том числе по его гидролитической составляющей.

По результатам работы выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических комплексов исследуемых биогеоценозов. В хитинолитическом комплексе наряду с высокой численностью Ас/тоЬас1епа и Игт'юШея наблюдается увеличение таких филогенетических групп как

Proteobacteria, а в пектинолитическом комплексе следует отметить возрастание Acidobacteria и Bacteroidetes.

Сформулированные в диссертации положения позволяют расширить представление о распространенности гидролитических комплексов, их таксономической принадлежности и функциональной значимости. Полученные выводы позволяют оценить экологическую стратегию структурных компонентов гидролитических комплексов.

Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы для разработки методов борьбы с фитопатогенными грибами и биотехнологии. Разработанные математические модели могут найти применение в биодиагностике и биогеографии. Полученные в результате диссертационной работы выводы полезны для понимания наиболее значимых параметров в управлении микробными комплексами, что может открыть новые перспективы для повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Положения работы изложены в материалах к 3 международным и 1 всероссийской конференциях: Conference European Geoscience Union (Vienna, Austria - April, 2011; 2012); Eurosoil (Bari, Italy -July, 2012); VI Всероссийский съезд почвоведов им. B.B. Докучаева (Петрозаводск, Россия - август, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах текста, содержит 22 иллюстрации и 4 таблицы. Состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследований, экспериментальных результатов, заключения, выводов и списка литературы (95 источников, из них 60 источников на иностранных языках).

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. H.A. Манучаровой. Особую благодарность выражаю д.б.н. П.А. Кожевину. Искренне благодарю всех сотрудников кафедры биологии почв.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полевые исследования и сбор материалов проводились в наземных экосистемах различных биоклиматических зон с учетом вертикальной ярусности.

Таблица 1.Основные характеристики исследуемых биогеоценозов

Биогеоценоз Почва Подстилка Листья

Таежная зона Глее-слабо-подзолистая (Глееподзолистая *) Надым, глубина отбора 2-10 см, Сорг. 0,8%, рНводн. 4,1. Смешанный образец и Р,Н береза (Betula sp.)

Зона широколиственных лесов Серая лесная, Тульская обл., глубина отбора 2-10 см, Сорг. 2,1%, рНводн. 5,4 Смешанный образец и Р, Н липа сердцелистная (Tilia cordata)

Степная зона Чернозем обыкновенный, Воронежская обл., глубина отбора 2-10 см, Сорг.3,1%, рНводн.6,8 Смешанный образец и Р.Н липа сердцелистная (Tilia cordata)

* - по классификации Шишов Л.Л. и др., 2004

Образцы субстратов отбирались с повторностью, достаточной для учета пространственных и временных вариаций структуры гидролитических микробных сообществ (табл.1).

При анализе структурных и функциональных показателей гидролитических микробных комплексов (хитинолитического и пектинолитического) в исследуемых образцах наземных экосистем использовали метод микрокосмов с инициацией микробной сукцессии увлажнением и внесением очищенных полисахаридов (хитина («ICN Biomedicals», Германия), пектина («Sigma», Германия). Инициировали микробную сукцессию увлажнением и внесением 0,6%-ой суспензии хитина или пектина (30мг/5г почвы). Масса вносимых субстратов во всех вариантах не превышала десятых долей процента от массы образца.

Изучение активности эмиссии диоксида углерода из почв при внесении полисахаридов и без них оценивали газохроматографичеким методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Определение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов и грибов проводили с использованием метода люминесцентной микроскопии препаратов с применением флюорохромов. Для учета бактерий и мицелия актиномицетов использовался акридиновый оранжевый, для учета мицелия грибов - калькофлюор белый. Количество микробных клеток, содержащихся в 1г почвы, вычисляли по формуле: N=Sian/vS2c, где N - число клеток (длина мицелия, мкм) на 1 г почвы; S! -площадь препарата (мкм2); а — количество клеток (длина мицелия, мкм) в одном поле зрения (усреднение производилось по всем препаратам); п — показатель разведения почвенной суспензии (мл); v — объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 — площадь полей зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г). (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

С использованием метода молекулярной диагностики микроорганизмов in situ (метод FISH) (Amann, 2000), модифицированного для работы с почвой (Манучарова и др., 2011) выявляли специфику бактериального, метаболически активного сообщества.

Использование люминесцентно-микроскопического метода и окрашивание препаратов набором различных флюорохромов дало возможность оценить общую численность (прокариотной и эукариотной составляющей) и филогенетическую принадлежность микробного комплекса.

Определение таксономичекого состава хитинолитического и пектинолитического комплексов проводили с помощью метода посева на плотные питательные среды с последующим выделением ДНК из чистых культур, ПЦР и секвенированием.

Выделение ДНК. Для экстрагирования тотальной ДНК из образцов наземных экосистем (листьев, подстилки и почвы) применяли стандартные методики PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя; из чистых культур микроорганизмов ДНК извлекали с помощью Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США), руководствуясь инструкциями производителя.

Выбор олигонуклеотидных праймеров и амплификация ДНК. Для амплификации путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) филогенетических фрагментов генов, кодирующих 16S в большинстве экспериментов были использованы универсальные праймерные системы (1 lF-1492Re) (Muyzer et al., 1993).

Филогенетический анализ. Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S rRNA использовали программное обеспечение баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Анализ и выравнивание последовательностей осуществлялось с помощью программы BioEdit (http://iwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html'). Построение дендрограмм осуществлялось с помощью алгоритма neighbor-joining (NJ) в программе MEGA 4 (Tamura, 2007). Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев. Вновь полученные последовательности различных генов были депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей (GenBank) с присвоением им индивидуальных номеров доступа.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICA-6 и Statgraphics Plus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Оценка эмиссии СО? и общей биомассы микроорганизмов для контрольных и опытных образцов микрокосмов надземного, наземного и почвенного ярусов на примере лесной экосистемы на 10-е сутки эксперимента

Рассматривая суммарную биомассу грибов, актиномицетов и бактерий в исследуемых образцах при добавлении биополимеров во всех вариантах (надземного - листья, наземного - подстилка и почвенного ярусов) наблюдалось увеличение общей микробной биомассы по сравнению с контролем (рис.1).

Оценивая эмиссию С02, также следует отметить ее возрастание во всех исследуемых образцах с полисахаридом по сравнению с контролем (рис.2).

Рис. 1. Общая биомасса микроорганизмов для контрольных и опытных образцов микрокосмов надземного, наземного и почвенного ярусов на примере экосистемы зоны

широколиственных лесов на 10-е сутки эксперимента

□ Контроль В Хитин 1 Пектин

Почва

Подстилка

Листья

Рис. 2. Эмиссия СС>2 для контрольных и опытных образцов микрокосмов надземного, наземного и почвенного ярусов на примере лесной

экосистемы на 10-е сутки эксперимента

2. Динамика эмиссии СО? из образцов микрокосмов вертикально-ярусных рядов (листья, подстилка, почва) лесного биогеоценоза

Рассматривая динамику эмиссии С02 из исследуемых микрокосмов по слоям вертикально-ярусной структуры, можно выделить следующую закономерность: в надземном и наземном ярусах эмиссия С02 была выше в образцах при добавлении пектина.

При переходе к нижним слоям, к смешанному образцу подстилки и почве, следует отметить наибольшие значения эмиссии для образцов с хитином (рис. 3).

Надземный ярус (зеленые листья)

Наземный ярус (опавшие листья - подстилка -1. слой)

Г- -9- - Хитин -

Рис. 3. Динамика эмиссии С02 из образцов микрокосмов разных ярусов лесного биогеоценоза: а) надземного яруса (зеленые листья); б) наземного яруса (опавшие листья -подстилки Ь-слой); в) подстилки слой Р+Н; г) почвы (горизонт А)

3. Биомасса микроорганизмов в пространственно-сукиессионном ряду (листья, подстилка, почва) наземных экосистем, принадлежащих различным биоклиматическим зонам

При анализе микробной биомассы во всех рассматриваемых экосистемах в надземных слоях установлено превалирование биомассы пектинолитических организмов, а в почвенных - главным образом - хитинолитических (рис.4).

0.8

В) 0.7

0.6

. 0,5 С

¿: 0,4 = 0,3 0.2 0,1 О

Рис. 4. Биомасса микроорганизмов в пространственно-сукцессионном ряду (листья, подстилка, почва) наземных экосистем, принадлежащих разным биоклиматическим зонам: а) степной биогеоценоз; б) биогеоценоз зоны широколиственных лесов; в) таежный биогеоценоз

Таким образом, при анализе микробной биомассы при добавлении субстратов в зависимости от яруса наблюдается схожая тенденция с эмиссией диоксида углерода из исследуемых слоев. В надземных слоях превалирование биомассы пектинолитических организмов, а в почвенных - главным образом - хитинолитических.

Используя структурный (биомасса) и функциональный (дыхание) показатель работы микробного сообщества, можно говорить о субстратной специфичности микроорганизмов для каждого яруса биогеоценоза. В наземных ярусах прослеживается преимущественное развитие пектинолитической, а в почвенном ярусе - хитинолитической составляющей микробной компоненты.

[□ Контроль Е2 Хитин в Пектин]

4. Отклик разных групп микроорганизмов на внесение хитина

При внесении в систему хитина вне зависимости от биотопа (на листьях, в подстилке и в почве) суммарный отклик прокариотной биомассы был значимо выше по сравнению с грибной и составлял до 80% (рис.5).

Следует выделить надземный ярус с внесением хитина, где биомасса грибов не только не возрастает, но становится даже ниже контрольной. Мы связываем такую особенность с развитием прокариотного хитинолитического комплекса, использующего в процессе своей жизнедеятельности хитин, входящий в клеточную стенку грибов, находящихся на поверхности листьев. Это свойство может быть использовано в биотехнологии для борьбы с фитопатогенными грибами.

0% 20% 40% 60% 80% 100%

Рис. 5. Отклик разных групп микроорганизмов на внесение хитина: а) биогеоценоз зоны широколиственных лесов; б) степной биогеоценоз; в) таежный биогеоценоз

Таким образом, экспериментально показано, что во всех исследуемых ярусах наземной экосистемы развитие хитинолитических сообществ обусловлено, главным образом, прокариотными организмами, в то время как пектинолитических - его эукариотной составляющей.

При внесении в систему пектина, значительно повышается отклик грибной биомассы (рис. 6).

□ Бактерии

а Актиномицеты

□ Грибы

0% 20% 40% 60% 80% 1СО%

Рис. 6. Отклик разных групп микроорганизмов на внесение пектина: а) биогеоценоз зоны широколиственных лесов; б) степной биогеоценоз; в) таежный биогеоценоз

5. Удельная активность дыхания почвенных микробных сообществ, принадлежащих различным биоклиматическим зонам

С целью оценки активности микробных комплексов хитинолитиков и пектинолитиков была рассчитана удельная активность дыхания почвенных микробных сообществ при внесении полимеров, представляющая собой отношение разницы эмиссии диоксида углерода в опытном и контрольном вариантах к разнице биомасс микроорганизмов в аналогичных образцах, выраженная в мкг углерода С02 на мкг углерода биомассы (рис.7).

Рис. 7. Удельная активность дыхания почвенных микробных сообществ биогеоценозов: а) степного; б) широколиственных лесов; в) таежного при внесении полисахаридов (хитина или пектина) на 10-е сутки опыта Существенно, что удельная активность дыхания при внесении хитина была в 2-3 раза выше по сравнению с показателем использования пектина по всем исследуемым биогеоценозам. Вероятно, это связано с тем, что хитин, как азотсодержащий биополимер,

В)

охотнее используется микроорганизмами, кроме того это косвенно указывает на преимущественную биодеградацию хитина прокариотными организмами, а пектина -грибами, имеющими, большую биомассу. Отмеченная особенность деятельности хитинолитических организмов может быть полезна в биотехнологии при приготовлении препаратов, направленных на быструю утилизацию отходов микробиологических производств.

6. Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почвах

Анализ основной информации о динамике структурных (биомасса грибов, бактерий и актиномицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей проведен с помощью методов многомерной математической статистики.

На дендрограмме (вертикальная ось отражает относительное сходство) выделяется три кластера (рис.8). Существенно, что группируются кластеры на уровне типа биогеоценоза По координатам центроидов можно судить, какие переменные играют наиболее важную роль в каждом кластере. По результатам кластерного анализа для структурных показателей более значимым фактором оказывается тип биогеоценоза по сравнению с внесением органического вещества и профильным уровнем системы.

— о о-:= о о — аз а> сз о

~ ' ~=СО и-= и-и-¡П^^—

Рис. 8. Дендрограмма кластерного анализа по общей биомассе микроорганизмов в вертикально-ярусном ряду (листья, подстилка, почва) исследуемых биогеоценозов (Ы-таежный, Р-лесной, Б-степной)

С помощью дискриминантного анализа была проверена возможность определения типа биогеоценоза по структурным показателям микробного комплекса. Точность диагностики образцов составила 85,19%. Дискриминантные функции для натуральных значений структурно-функциональных признаков:

=268,11-2,78 (бактерии)-2,71(актиномицеты)-2,66(грибы)-0,29(суммарная биомасса)

VI = 15,73-0,14(бактерии)-0,19(а1сг11номицеты)-0,178(грибы)+1г32(суммарная биомасса)

На дендрограмме рассеивания на плоскости двух дискриминантных функций видно, что объекты разных биогеоценозов образуют обособленные группировки (рис.9).

Plot of Discriminant Functions

CNJ

с о

о с

D LL

3,3 2,3 1,3 0,3 -0,7 -1,7

о о

X о о

X

-X + : X X о

г X УХ 1 □ о о D „ П ° сР+сРа оа ,

Col_6 а 1

X 2 о 3

+■ Centroids

-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6 1,6 2,6

Function 1

Рис. 9. Расположение образцов на плоскости двух дискриминантных функций F1 и F2, где 1 - таежный, 2 - лесной, 3 -степной биогеоценозы

Оценка потенциальной гидролитической активности и анализ компонентного состава микробных сообществ наземных экосистем могут быть полезны для решения проблемы классификации и биодиагностики образцов биогеоценозов и для определения их типовой принадлежности.

Таким образом, с помощью дискриминантного анализа, установлена возможность классификации образцов наземных экосистем в определенных условиях эксперимента по структурному показателю микробного комплекса, в том числе по его гидролитической составляющей.

7. Соотношение численности зубактерий, архей и метаболически неактивных клеток прокариотных микроорганизмов в образцах почвы, подстилки и листьев на 10-е сутки сукцессии

Оценку численности метаболически активных клеток прокариот в микробных гидролитических комплексах исследуемых биогеоценозов проводили с помощью метода т вйи-гибридизации с гКЫА специфичными флуоресцентными олигонуклеотидными зондами.

Наибольшая численность бактерий регистрируется в подстилке (12х109 кл. /г). Доля физиологически активных клеток здесь составила около 25-30% (рис. 10).

При добавлении полисахаридов - в образцах возрастала как общая численность, так и численность активных клеток прокариот. Обращает на себя внимание значимое увеличение доли метаболически активных клеток в образцах филлосферы с добавлением пектина (достигает 70%).

Хитин Пеетин Контроль

Почва

1 8Ш///^///////Ш>л>Л

1 к« ":; ■У/ШШ 1

1 : ШШ/у шл

1

Хитин Пектин Контроль

Подстилка

г_|

Листья

Хитин

Пектин .. ...

■

Контроль

і

□ Васіегіа нАтсИаеа

□ Неидентмфмцированные

клетки

Рис. 10. Соотношение численности бактерий, архей и метаболически неактивных клеток прокариотных микроорганизмов в образцах почвы, подстилки и листьев на 10-е сутки сукцессии в степной зоне

Для лесного биогеоценоза в целом можно отметить сохранение тенденции максимальной численности прокариот в подстилке и доли метаболически активных клеток во всех рассматриваемых образцах (рис. 11).

Рассматривая долю архей в прокариотных комплексах исследуемых зон, следует заметить, что их доля возрастает в почвенных ярусах, увеличиваясь в экосистемах при движении с юга на север.

Почва Подстилка

Листья

Рис. 11. Соотношение численности бактерий, архей и метаболически неактивных клеток прокариотных микроорганизмов в образцах почвы, подстилки и листьев на 10-е сутки сукцессии в биогеоценозе зоны широколиственных лесов

8. Численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов

черноземной зоны

Рассматривая численность отдельных филогенетических групп в гидролитических комплексах (хитинолитическом и пектинолитическом) следует обратить внимание на смену доминантов в структуре прокариотного микробного комплекса. Выявлены различия в структуре хитинолитического и пектинолитического комплексов. Наряду с высокой численностью Actinobacteria и Firmicutes в почвах с хитином наблюдается увеличение таких филогенетических групп как Alphaproteobacteria, а в пектинолитическом комплексе следует отметить возрастание Acidobacteria и Bacteroidetes (рис.12).

При рассмотрении доминирующих филогенетических групп по профилю вертикальной ярусности в почве следует отметить Firmicutes и Acidobacteria, в подстилке

- Alpha, Betaproteobacteria, а также Bacteroidetes, Verrucomicrobium и Acidobacteria, которые являются доминирующими группами на листьях.

При рассмотрении филогенетических групп лесной зоны можно выделить такие же закономерности распределения доминантов, определяемых методом FISH.

Таким образом, с помощью молекулярно-биологического метода FISH выявлены различия в структуре хитинолитического и пектинолитического комплексов исследуемых биогеоценозов.

а)

б)

jp Контроль в Хитин а Пектуш]

Рис. 12. Численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria: I) Actinobacteria; 2) Firmicutes; 3) Alphaproteobacteria; 4) Betaproteobacteria;

5) Gammaproteobacteria; 6) Deltaproteobacteria; 7) Bacteroidetes; 8) Acidobacteria; 9)

Vemtcomicrobia; 10) Planctomycetes - хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почвы (а); подстилки (б); листьев (в) черноземной зоны

9. Анализ домииаптов хитиполитических и пектинолитических микроорганизмов в исследуемых образцах, выделяемых на плотные питательные среды

На следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ доминантов хитинолитических и пектинолитических микроорганизмов, выделяемых на плотные питательные среды из исследуемых образцов, с доминирующими группами, выявляемыми молекулярно-биологическими методами.

Определение таксономического положения наиболее активных литических микроорганизмов проводили методом секвенирования фрагмента гена 16S рРНК.

Было установлено, что доминанты, выделяющиеся на плотные питательные среды, относятся к доминантным группам, выявляемым методом FISH. Так, на среде с хитином в ряду листья-подстилка-почва выделялись представители следующих филогенетических групп: Alphaproteobacteria (Sphyngopyxis ehilensis), Actinobacteria (Rhodococcus erythropolis; Streptomyces roseolilacinus FR749827j и Firmicutes (Bacillus simplex strain pectin pH 5,4 FR822630/ На среде с пектином - Rhodococcus erythropolis, Arthrobacter Ilicis, Arthrobacter nitroguajacolicus strain pectin4 (HE646351) и Micrococcus Luteus.

10. Анализ доминантов хитинолитических и пектинолитических микроорганизмов, выделяемых на плотные питательные среды из исследуемых

образцов

С целью определения возможности использования выделенных культур хитинолитиков в биотехнологии, в частности, борьбе с фитопатогенными грибами был поставлен эксперимент, включающий культуры, обладающие высокой хитинолитической способностью - актиномицета - Streptomyces roseolilacinus (FR749827), и гриба -Fusarium culmorum, характеризующиеся фитопатогенной активностью. Способность прокариот защищать растения от фитопатогенных организмов зависит как от успеха конкуренции с последними за элементы питания, так и от способности прокариот к продуцированию антигрибных метаболитов и от хитинолитической активности, определяющей деградацию клеточной стенки грибов.

Использовали моноспоровую суспензию актиномицета-хитинолитика (106 спор/мл воды) с биомассой фитопатогенного гриба и моноспоровую суспензию актиномицета, которая служила контролем. В процессе эксперимента учитывали динамику численности спор (рис. 13), длину мицелия и биомассу актиномицета-хитинолитика (рис.14). В течение всего эксперимента наблюдается возрастание биомассы мицелия актиномицета в варианте с грибом по сравнению с контролем. К 20-м суткам опыта отмечается наибольшая биомасса актиномицета, что указывает на потребление грибной биомассы фитопатогена.

0 7 14 21 28 сутки

Рис. 13. Динамка биомассы спор актиномицета в условиях опыта с моноспоровой суспензии Streptomyces roseolilacinus и биомассой гриба Fusarium culmorum (а) и контроля (б)

Рис. 14. Динамика биомассы актиномицетного мицелия в условиях опыта с моноспоровой суспензии З/ге/^отусет говеоЫастш и биомассой гриба (а) и контроля (б)

28 сутки

11. Регрессионный анализ структурных показателей микробного сообщества (грибов и актииомицетов) в наземных экосистемах разных биоклиматических зон в рамках вертикально-ярусного подхода

Возвращаясь к рассмотрению исследуемых экосистем интересно отметить взаимодействие грибов и актиномицетов.

По всем полученным данным в рамках вертикально-ярусного подхода всех рассматриваемых биогеоценозов был проведен регрессионный анализ, показывающий с точностью - квадрат коэффициента корреляции (коэффициента детерминации) 75% -взаимозависимость обилия грибов от обилия актиномицетов во всех исследуемых экосистемах. Формально полученную картину можно назвать конкуренцией, так как зависимость показывает нам некий процесс взаимоисключения - при возрастании обилия грибов наблюдается падение обилия актиномицетов и наоборот (рис. 15).

fung = 90,89 - 1,37*act R-squared = 75,4%

act

Рис. 15. Регрессионный анализ структурных показателей микробного сообщества (грибов и акгиномицетов) в наземных экосистемах разных биоклиматических зон в рамках вертикально-

ярусного подхода

Таким образом, зная количественную характеристику обилия в экосистеме грибов или актиномицетов на 10-е сутки сукцессии при добавлении хитина или пектина, с математической точки зрения можно предсказать обилие второго компонента сообщества. Такая закономерность применима для различных биоклиматических зон с учетом профильного подхода вертикальной ярусности.

Говоря об экологических функциях организмов в зависимости от внешних факторов, можно констатировать, что в одних случаях будут развиваться быстрорастущие организмы, в других - способные усваивать вещества из рассеянного состояния.

ВЫВОДЫ

1. Установлена специфическая функциональная роль микроорганизмов при деструкции биополимеров в наземной и почвенной системах. В наземных ярусах субстратная специфичность прослеживается в развитии преимущественно пектинолитической, а в почвенном ярусе—хитинолитической составляющей микробной компоненты.

2. Во всех исследуемых ярусах наземной экосистемы развитие хитинолитических сообществ обусловлено, главным образом, прокариотными организмами, а пектинолитических - эукариотной составляющей системы. Для определенных условий эксперимента установлена регрессионная зависимость структурных показателей микробного сообщества (грибов и актиномицетов) в наземных экосистемах разных биоклиматических зон в рамках вертикально-ярусного подхода.

3. Удельная активность дыхания почвенного микробного сообщества при использовании хитина в качестве субстрата, вне зависимости от исследуемого биогеоценоза, приблизительно в 2 раза превышает удельную активность дыхания при использовании пектина, что может быть использовано для развития современной биотехнологии.

4. Среди экологических параметров, определяющих структурные показатели гидролитического комплекса в определенных условиях эксперимента, наиболее значимым является тип биогеоценоза по сравнению с внесением органического вещества и профильным уровнем системы.

5. Установлена возможность классификации и биодиагностики образцов наземных экосистем по структурному показателю микробного комплекса, в том числе по его гидролитической составляющей.

6. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических комплексов исследуемых биогеоценозов. В хитинолитическом комплексе наряду с высокой численностью АсйпоЪас1епа и Пгт'юШез наблюдается увеличение таких филогенетических групп как Рго1еоЬас1епа, а в пектинолитическом комплексе следует отметить возрастание Ас1&Ьас1епа и Вас(его '1с1е1е$.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лукачева Е.Г., Чернов Т.И., Быкова Е.М., Власенко А.Н., Манучарова Н.А. Характеристика филогенетической структуры гидролитического прокариотного комплекса в почвах. // Ивестия РАН. Сер. Биологическая. №1 2013. С.24-31

2. Манучарова Н.А., Корнюшенко Е.Г. (Лукачева), Ярославцев A.M., Степанов А.Л.,. Смагин А.В., Звягинцев Д.Г., Судницын .И.И. Образование метана и рост микроорганизмов при различной влажности почв с внесением и без внесения хитина. Почвоведение. 2007. №8. С. 961-967.

3. Lukacheva Е., Manucharova N. Chitinolytic and pectinolytic community of chernozem and podzol soils. // Conference European Geoscience Union, Vienna, Austria-April, 2011. Vol.13, P.697

http://meetingorganizer.copernicus.org/EGU2011/EGU201 l-697.pdf

4. Lukacheva E., Manucharova N. Chitinolytic and pectinolytic community in the vertical structure of chernozem's zone ecosystems // Conference European Geoscience Union, Vienna, Austria- April, 2012. Vol.14, P.576 http://meetingorganizer.copernicus.org/EGU2012/EGU2012-576.pdf

5. Lukacheva E., Manucharova N. Chitinolytic and pectinolytic community of terrestrial ecosystems. // Eurosoil, Bari, Italy - July, 2012 http://rps.entecra.it/pages/PageData/allegati/FinalProgramme200612.pdf

6. Лукачева Е.Г. Микробная деструкция хитина и пектина в черноземе и глее-слабо-подзолистой почвах / Материалы докладов VI съезда Общества почвоведов им. В.В.Докучаева, книга 2, С.374, Петрозаводск, 13-17 авг., 2012

7. Клепцова И.Е., Корнюшенко Е.Г. (Лукачева), Глаголев М.В. Эмиссия СН4 в подзоне лесотундры: «стандартная модель» АаЗ. Динамика окружающей среды и глобальные изменения климата: Сборник научных трудов кафедры ЮНЕСКО Югорского государственного университета. 2008. Вып. 1. С.191-199

Подписано в печать: 25.04.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 120 экз. Заказ № 105 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лукачева, Евгения Георгиевна, Москва

московский государственный университет

имени М.В. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

04201357026

Лукачева Евгения Георгиевна

ХИТИНОЛИТИЧЕСКИЙ И ПЕКТИНОЛИТИЧЕСКИЙ МИКРОБНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ

03.02.03 - микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Манучарова Н.А.

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИИЕ...........................................................................4

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................11

1.1 Микробные сообщества разных ярусов....................................11

1.2 Гидролитические микроорганизмы.........................................16

1.3Хитин и его производные.....................................................17

1.4 Использование хитина в промышленности и сельском хозяйстве .. .20

1.5 Разложение хитина почвенными микроорганизмами..................24

1.6 Хитин и целлюлоза............................................................30

1.7 Пектин. Строение и свойства................................................31

1.8 Использование пектина в промышленности и медицине..............41

1.9 Действие ферментов...........................................................43

1.10 Разложение пектина микроорганизмами................................50

Глава И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...................51

2.1. Объекты исследования.......................................................51

2.2. Методы исследования........................................................52

2.2.1 Изучение эмиссии диоксида углерода из образцов исследуемых почв газовохроматографическим методом.............................................51

2.2.2 Определение численности разных групп микроорганизмов

люминесцентномикроскопическим методом................................53

2.2.3 Определение структуры хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов в почвах методом FISH...............................55

2.2.4 Дифференцированный учет хитинолитических и пектинолитических

микроорганизмов.....................................................................60

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Эмиссия С02 и общая биомасса микроорганизмов для контрольных и опытных образцов микрокосмов надземного, наземного и почвенного ярусов на примере лесной экосистемы на 10-е сутки эксперимента................64

3.2 Динамика эмиссии С02 из образцов микрокосмов разных ярусов лесного биогеоценоза....................................................................65

3.3 Биомасса микроорганизмов в пространственно-сукцессионном ряду (листья, подстилка, почва) наземных экосистем, принадлежащих разным биоклиматическим зонам...............................................................66

3.4 Отклик разных групп микроорганизмов на внесение хитина...........67

3.5 Удельная активность дыхания микробных сообществ лесного биогеоценоза при внесении полисахаридов на 10-е сутки опыта..............69

3.6 Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почвах................................................................71

3.7 Соотношение численности эубактерий, архей и метаболически неактивных клеток прокариотных микроорганизмов в образцах почвы, подстилки и листьев на 10-е сутки сукцессии.....................................76

3.8 Численность отдельных филогенетических групп

домена Bacteria хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов черноземной зоны.......................................................78

3.9 Анализ доминантов хитинолитических и пектинолитических микроорганизмов в исследуемых образцах, выделяемых на плотные питательные среды......................................................................80

3.10 Анализ доминантов хитинолитических и пектинолитических микроорганизмов в исследуемых образцах, выделяемых на плотные питательные среды......................................................................88

3.11 Регрессионный анализ структурных показателей микробного сообщества (грибов и актиномицетов) в наземных экосистемах разных

биоклиматических зон в рамках вертикально-ярусного подхода..............89

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................92

ВЫВОДЫ.................................................................................94

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.......................................96

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................97

ВВЕДЕНИЕ

Растительные сообщества благодаря вертикально-ярусной организации определяют пространственную структуру микробных комплексов в экосистемах. Вертикально-ярусный подход подразумевает одновременное исследование микробоценозов в пределах надземного, наземного (подстилка) и почвенного ярусов экосистем.

Для наземных биогеоценозов определяющим фактором, влияющим на стратификацию микроорганизмов, является характер и доступность субстрата, формирующего определенный тип питания микробиоты. Так в филлоплане это прижизненные экссудаты растений, в подстилках -биополимеры, в почве - гумусовые компоненты. При этом все ярусы связаны между собой единым потоком органического вещества и представляют собой разделенные в пространстве стадии сукцессии по разложению органических веществ (Звягинцев и др., 2005). В связи с тем, что микробные сообщества играют первостепенную роль в круговороте веществ и потоках энергии, определяя тем самым гомеостаз экосистем, актуальным представляется вопрос о закономерности распространения гидролитических микробных комплексов наземных экосистем, их видового состава и метаболической активности.

В микробиологии направление, связанное с ярусной организацией растительных сообществ до последнего времени почти не развивалось (Звягинцев, 2005). При сравнении микробных комплексов разных природных

зон анализировались лишь гумусовые горизонты (А1) почвенного профиля. При таком подходе учитывалась лишь незначительная часть микробного сообщества. Но с развитием современных молекулярно-биологических методов в рамках вертикально-ярусного подхода стратиграфический анализ микробных сообществ позволяет определить таксономическую принадлежность, активность и функциональную значимость компонентов микробных гидролитических комплексов.

Такие полисахариды, как хитин и пектин входят в состав матрикса клеточных стенок различных организмов и, постоянно присутствуя в наземных биогеоценозах, представляют собой пул органического углерода и азота (МаписЬагоуа, 2009), их минерализация имеет важное значение для биогеохимических циклов этих элементов в биосфере (Ооос1ау, 1990; Каг^ е1 а1., 2005). Наличие в молекуле хитина ацетамидных групп придает ему особо ценные в практическом отношении свойства (Феофилова, 1992). Известно, например, что препарат на основе бактериальной хитиназы является перспективным экологически безопасным средством биологического контроля над фитопатогенными грибами (ЕкагаЬПу е1 а1., 2000). Кроме того, в последнее время активно ведутся работы по изучению этих полисахаридов в качестве биосорбента.

В связи с ростом применения в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, медицине и косметологии таких полисахаридов как пектин и хитин, а также с их широкой распространенностью в наземных

экосистемах, актуальным является вопрос определения активности и структуры гидролитических комплексов этих полисахаридов.

Целью диссертационной работы - установить закономерности распространения гидролитических микробных комплексов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в наземных экосистемах различных биоклиматических зон, их метаболическую активность и филогенетическую принадлежность.

В задачи исследования входило:

1. Оценить динамику функциональных и структурных показателей метаболически активных микроорганизмов-гидролитиков, населяющих надземный (филлосферу), наземный (подстилку) и почвенный (гумусовый горизонт Al) ярусы наземных экосистем различных биоклиматических зон.

2. В условиях лабораторного микрокосма определить активность микробной деструкции полисахаридов в различных ярусах степной, лесной и таежной экосистем.

3. Исследовать разнообразие и численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria метаболически активных микроорганизмов-гидролитиков исследуемых биогеоценозов.

4. Выявить наиболее активные группы прокариот, участвующих в разложении исследуемых биополимеров, и видовое разнообразие

доминантов гидролитических сообществ. В условиях микрокосмов установить возможность использования выделенных культур активных хитинолитиков в борьбе с фитопатогенными грибами.

Научная новизна работы заключается в определении биоразнообразия гидролитических микробных комплексов (хитинолитического и пектинолитического) и степени их функционирования в наземных экосистемах различных биоклиматических зон.

По результатам работы установлена специфическая функциональная роль микроорганизмов при деструкции биополимеров в надземной и почвенной частях экосистем.

Впервые отмечено, что развитие хитинолитического сообщества обусловлено, главным образом, прокариотными организмами, в то время как пектинолитического - его эукариотной составляющей. Для определенных условий эксперимента установлена регрессионная зависимость структурных показателей микробного сообщества (грибов и актиномицетов) в наземных экосистемах разных биоклиматических зон в рамках вертикально-ярусного подхода. Рассчитана удельная активность дыхания микробных сообществ, и установлено, что удельная активность при использовании хитина, вне зависимости от яруса исследуемого биогеоценоза, в 2-3 раза превышает удельную активность дыхания при использовании пектина, что может быть полезно для развития современной биотехнологии.

Данные, полученные в результате обработки с помощью дискриминатного и кластерного анализов, дают возможность утверждать, что среди экологических параметров, определяющих структурные показатели гидролитического комплекса, для определенных условий эксперимента, более значимым фактором является тип биогеоценоза по сравнению с внесением органического вещества и профильным уровнем системы. Подобные данные могли бы быть полезны для понимания наиболее значимых параметров для управления микробными комплексами. По результатам дискриминатного анализа установлена возможность классификации и биодиагностики образцов наземных экосистем по структурному показателю микробного комплекса, в том числе по его гидролитической составляющей.

По результатам работы выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических комплексов исследуемых биогеоценозов. В хитинолитическом комплексе наряду с высокой численностью АсипоЬа^епа и Р1гпис1йе$ наблюдается увеличение таких филогенетических групп как РШеоЬаМепа, а в пектинолитическом комплексе следует отметить возрастание АЫ<ЛоЬас1епа и ВаМего1с1е1е8.

Сформулированные в диссертации положения позволяют расширить представление о распространенности гидролитических комплексов, их таксономической принадлежности и функциональной значимости. Полученные выводы позволяют оценить экологическую стратегию

структурных компонентов гидролитических комплексов.

Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы для разработки методов борьбы с фитопатогенными грибами и биотехнологии. Разработанные математические модели могут найти применение в биодиагностике и биогеографии. Полученные в результате диссертационной работы выводы полезны для понимания наиболее значимых параметров в управлении микробными комплексами, что может открыть новые перспективы для повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. Положения работы изложены в материалах к 3 международным и 1 всероссийской конференциях: Conference European Geoscience Union (Vienna, Austria - April, 2011; 2012); Eurosoil (Bari, Italy - July, 2012); VI Всероссийский съезд почвоведов им. B.B. Докучаева (Петрозаводск, Россия - август, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 108 страницах текста, содержит 18 иллюстраций и 5 таблиц. Состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследований, экспериментальных результатов, заключения, выводов и списка литературы (97 источников, из них 57 источников на иностранных языках).

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н. H.A. Манучаровой. Особую благодарность выражаю д.б.н. П.А. Кожевину. Искренне благодарю всех сотрудников кафедры биологии почв.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Микробные сообщества разных ярусов

Для наземных экосистем основным фактором, определяющим

вертикальное распределение микроорганизмов, является характер

субстрата, обеспечивающего определенный тип питания микробиоты.

Так, в филлоплане это прижизненные выделения растений,

представляющие собой водорастворимые органические соединения

(сахара, органические кислоты, аминокислоты). В лесных и степных

подстилках это различные полимеры: крахмал, целлюлоза, ксиланы,

лигнин, содержащиеся в растительном опаде; в почве — гумусовые

вещества, минеральные компоненты. Температура, освещенность и

концентрация кислорода не имеют такого значения для вертикальной

стратификации микробных сообществ наземных биогеоценозов, как для

водных экосистем. В лесных экосистемах при переходе от надземного

яруса (филлоплана растений) к наземному (подстилка) наблюдается

резкое увеличение численности всех групп микроорганизмов. Если для

дрожжей и грибов это увеличение составляет около одного порядка, то

для бактерий оно может измеряться двумя-тремя порядками. В этом

специфическом горизонте происходит ежегодное пополнение

органическим веществом за счет хвои, шишек, веточек, листьев деревьев

и кустарников, цветков, семян и ягод лесных растений, остатков

животных и продуктов их жизнедеятельности. В отличие от почвенных

горизонтов подстилка динамична: ее мощность и запасы (масса) резко

п

изменяются в течение года и по слоям. В этом наиболее подвижном биогеоценотическом горизонте наблюдаются и наибольшие сезонные колебания численности микроорганизмов. Самые высокие показатели соответствуют влажным и часто холодным периодам года (весна, осень, зима) и большей частью приходятся на верхний слой подстилки.

Наземные части растений обычно колонизируются разнообразными видами бактерий, дрожжей и грибов. Бактерии выделяются как из тканей, так и с поверхности здоровых растений. Самыми многочисленными колонистами листьев являются бактерии (до 10Л7 клеток/см листовой поверхности) (Lindow, Brandl, 2003). С живыми растениями, метаболитами которых питаются бактерии, наиболее тесно связан класс протеобактерий. Доминирующими родами бактерий в наземном ярусе на листьях деревьев и кустарников являются Flavobacterium, Micrococcus, Rhodococcus, относящиеся к функционально-трофическим группам эккрисотрофов и копиотрофов (Звягинцев и др., 1999). Среди актиномицетов доминантами надземного яруса являются Streptomyces, Actinoplanes, Thermomonospora, Saccaropolyspora, Microbispora, Actinomadura, Micromonospora. Ассоциации микроорганизмов находятся в различных отношениях с растением, варьирующим от относительно незначительных (непостоянные эпифитные сапрофиты) до существенных (эпифитные комменсалы, мутуалистические комменсалы, мутуалистические

симбионты, эндофиты или патогены) (Andrews J., Harris R., 2000).

Живое растение представляет собой совокупность специализированных экониш бактерий. Для каждой зоны на поверхности растения характерен свой комплекс микроорганизмов, включающий в себя представителей доменов Bacteria, Archae и Eucarya. Хотя грибы и археи способны колонизировать листья, бактерии численно доминируют в филлосфере (Lindow, Brandi, 2003). Распределение микроорганизмов по поверхности различных органов носит ярко выраженный микролокусный характер. По кинетическим параметрам роста бактерии филлопланы относятся к популяциям, характеризующимся низкой инерционностью, высокими скоростями роста, но и быстрым отмиранием клеток при прекращении поступления питательных веществ, слабой конкурентной способностью, что позволяет отнести их к г-стратегам (Звягинцев и др., 1999).

Межвидовые различия бактериального состава сообщества превосходят уровень внутривидовой изменчивости. В то же время существенных различий в общей численности микробных сообществ голосеменных и покрытосеменных растений не было выявлено. Учет люминесцентно-микроскопическим методом и с красителем DAPI выявил 104-106 кл/см2 на листьях и лиственных, и хвойных растений. Методом пиросеквенирования были исследованы образцы хвои различных деревьев p.Pinus были выявлены доминанты нативных микробных сообществ - Sphingobacteriales из Bacteroidetes (22%), Alfa-,

Beta- и Gammaproteobacteria (24%, 16%, 8%), Actinobacteria (10%) (Redford A.J., Robert M etc, 2010).

При переходе от надземного яруса (филлосфера растений) к наземному (подстилка) наблюдается резкое увеличение численности актиномицетов. Если в надземном ярусе численность актиномицетов не превышает сотен тыс