Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем

Манучарова, Наталия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем"

005014813

Манучарова Наталия Александровна

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ПРОКАРИОТНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 ? 2012

Москва —2012

005014813

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант:

чл.-корр. РАН, доктор биологических наук Чернов Иван Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Галина Ивановна

доктор биологических наук, профессор Терехова Лариса Петровна

доктор биологических наук, профессор Лихачев Александр Николаевич

Ведущая организация:

Российский государственный аграрный университет —МСХА имени К.А.Тимирязева

Защита диссертации состоится 13 марта 2012г. в 15 часов 30 мин. в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, строен. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан _2012г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строен. 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, факультет почвоведения, Учёный совет. E-mail: manucharova@mail.ru.

Учёный секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

Г.М. Зенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Вертикальная дифференциация наземных биогеоценозов обусловлена формированием вертикальных ярусов, существенно различающихся по составу и структуре микробных сообществ. Все три яруса, надземный, наземный (подстилка), и почвенный ярусы связаны единым потоком органического вещества и представляют собой разделенные в пространстве стадии сукцессии по разложению органических веществ (Звягинцев и др., 1999; Redford et al., 2010). Разложение органических остатков связано, прежде всего, с деятельностью микроорганизмов, продуцирующих ферменты - гидролазы и лиазы, разрушающие сложные органические соединения. Совокупность этих микроорганизмов формирует гидролитический микробный комплекс, структура которого, во многом, влияет на особенности круговорота веществ и превращения энергии в биогеоценозе.

Масштабы развития микробных гидролитических комплексов и эффективности микробной деструкции биополимеров, в частности, полисахаридов различны в биогеоценозах разных климатических зон, однако в научной литературе имеется лишь первичная информация о структурном разнообразии и устойчивости микробных гидролитических комплексов при изменении экологических факторов. Долгое время считалось, что основной группой организмов, обладающих комплексом гидролитических ферментов, являются грибы. За последнее десятилетие появляется все больше информации о способности прокариот синтезировать самые различные деполимеразы (De Boer, 2001; Schrempf, 2001; Bhattacharya, 2007), что ставит вопрос о пересмотре роли этой группы микроорганизмов в превращении органических соединений и круговороте веществ в природе. Не все прокариоты обладают полным комплектом гидролитических ферментов, в следствие чего степень разложения полимеров разными группами прокариот различна. Интенсивность деятельности прокариот - деструкторов, как и всех микроорганизмов, очень сильно зависит от экологических факторов, в том числе температуры, влажности, окислительно-восстановительных условий, осмотического давления почвенных растворов и др. (Gohel et al, 2005). Выявление закономерностей устойчивости и функциональной

активности гидролитических прокариотных сообществ в широком диапазоне изменений основных экологических факторов важно для решения задач почвенного плодородия и запросов биотехнологии, связанных с переработкой возобновляемого сырья.

Поступающие в природную систему полисахариды различного строения чрезвычайно широко распространены в природе и являются важным источником органических веществ. Такие полисахариды как хитин, пектин, целлюлоза, постоянно присутствуя в наземной системе, составляют возобновляемый пул органического углерода и азота (De Boer, 2004, Parcham, Deng, 2000). Содержание полисахаридов в почвах разного типа колеблется в пределах от 0,06% до 3,0% от массы почвы и от 1% до 14% от массы органического вещества почв. В почвы с растительными остатками ежегодно поступает от 2 до 14 т/га полисахаридов, значительная часть которых минерализуется или участвует, в качестве структурных элементов, в формировании гуминовых кислот (Gomez Ramirez, 2004). Для включения элементов питания в биологический круговорот необходима деструкция полисахаридов, которую осуществляют соответствующие ферментные комплексы микроорганизмов. Как в России, так и за рубежом эта область исследований практически не затронута. Хотя имеется обширнейшая научная и технологическая литература по вопросам синтеза микробных гидролаз в лабораторных и промышленных условиях и по их применению в различных областях хозяйственной отрасли, медицине и сельском хозяйстве. Опубликованные в мировой научной литературе материалы по предлагаемой проблеме, как правило, содержат результаты исследований микробных деполимераз (хитиназ, целлюлаз, лигниназ и др.), не в естественных системах, а получаемых из культур микроорганизмов, инкубируемых на искусственных питательных средах.

проблема микробной деструкции полисахаридов в естественных системах, особенно почвах, несмотря на свою высокую востребовательность, до настоящего времени почти не изучалась. Изучение структурного и функционального разнообразия гидролитических микробных комплексов, локализованных в вертикальных ярусах, поможет составить более полное представление о поэтапном разрушении биополимеров в наземных биогеоценозах и оценить роль различных групп микроорганизмов на разных стадиях этого процесса.

Цель работы - выявить специфику устойчивости и развития гидролитических прокариотных комплексов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в наземных экосистемах, установить закономерности их распространения в биогеоценозах и зависимость функциональной активности от основных экологических факторов (влажности, температуры, присутствия метаболизируемого субстрата).

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Оценить разнообразие и определить численность отдельных филогенетических групп прокариотных метаболически активных микроорганизмов -гидролитиков в наземных экосистемах, различающихся параметрами основных экологических факторов.

2. Разработать методические подходы для определения молекулярно-биологическими методами in situ таксономического разнообразия прокариот -гидролитиков (хитинолитиков и пектинолитиков) и их метаболической активности.

3. Проанализировать динамику функциональных и структурных показателей (дыхание, численность, биомасса) метаболически активных микроорганизмов -гидролитиков в микробных комплексах наземных экосистем при различных параметрах основных экологических факторов в наземных экосистемах.

таксономии, включая использование как фенотипических, так и молекулярно-генетических критериев.

5. Определить в различных условиях лабораторного микрокосма (влажность, температура, метаболизируемый субстрат) скорости деструкции полисахаридов в почвенных образцах и установить с помощью математического планирования эксперимента относительную значимость исследуемых экологических факторов и величину отклика микробных гидролитических комплексов на изменение их параметров в структурных и функциональных показателях.

Научная новизна

Впервые выявлены закономерности распространения в биогеоценозах гидролитических прокариотных комплексов в зависимости от влажности, температуры, окислительно-восстановительного потенциала и проведена оценка потенциальной гидролитической активности микробных комплексов наземных экосистем, развивающихся в широком диапазоне параметров основных экологических факторов. На основе экофизиологических критериев определена функциональная значимость гидролитических прокариотных микробных комплексов в наземных экосистемах, выявлена степень толерантности исследуемых микробных комплексов к экстремальным параметрам экологических факторов.

Разработана модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) для определения филогенетического положения метаболически активных гидролитических прокариот вертикальных ярусов наземных экосистем - почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера).

Впервые с использованием метода FISH оценена численность и выявлен

филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических

(хитинолитических и пектинолитических) комплексов наземных экосистем в

зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-

восстановительного режимов. Численность, метаболически активных

гидролитических прокариот составила третью часть от численности всех

прокариотных организмов надземного (филлосфера), наземного (подстилка) и

почвенного ярусов экосистем. Установлено, что деструкция полисахаридов

осуществляется преимущественно представителями филогенетических групп

Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в

филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа- и бета-); в почвенном гидролитическом комплексе уменьшается доля протеобактерий и увеличиваются доли фирмикут и актинобактерий.

Установлено, что в почвенном ярусе уровень увлажненности в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей оказывается наиболее значимым фактором среди таких существенных для микробного сообщества параметров, как внесение органических веществ и время. Влажность более значима для деятельности хитинолитического комплекса, чем для пектинолитического. Впервые показано, что наиболее благоприятные условия для микробного разложения хитина складываются при влажности почв, близкой к полной влагоемкости. В глинистых и суглинистых почвах интервал значений влажности, необходимый для интенсивной микробной трансформации хитина шире, чем в песчаных. При увеличении влажности почв увеличивается деятельность мицелиальных бактерий (актиномицетов) в хитинолитическом комплексе. Вместе с тем впервые показано, что развитие гидролитического комплекса происходило и при низкой влажности почвы, близкой к влажности завядания растений.

Установлена высокая активность (по структурным и функциональным показателям) минорных по биомассе компонентов микробного сообщества мицелиальных и одноклеточных прокариот, проявляемая при гидролизе полисахаридов в широком диапазоне температур. При этом, в процессах деструкции хитина, особенно велика роль актиномицетов.

Обнаружено, что дыхание почвенного микробного сообщества в широком спектре условий (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться минорными по биомассе компонентами - мицелиальными и одноклеточными прокариотами, роль которых, очевидно, реализуется их вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества. В процессе деструкции полисахаридов в почве при увеличении как влажности, так и температуры в микробном гидролитическом комплексе заметно

возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно мицелиальных актинобактерий (актиномицетов).

С помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры, влажности и сукцессионного времени) для функционального показателя микробного гидролитического комплекса (дыхания).

Практическая значимость

Разработана модификация флюоресцентномикроскопического метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH) для определения численности и филогенетической принадлежности метаболически активных гидролитических прокариот ярусов наземных экосистем - почвенного, наземного (подстилка) и надземного (филлосфера).

Проведенная оценка потенциальной и реализуемой гидролитической активности микробных сообществ наземных экосистем, развивающихся в широком диапазоне действия экологических факторов, и анализ их компонентного состава могут быть полезны для разработки и применения хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика), а также для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов микробиологической, медицинской и пищевой промышленности. Полученные данные могут быть использованы в биотехнологии для подбора оптимальных условий при поиске и выделении активных организмов хитино- и пектинолитиков, а также создании бакпрепаратов для борьбы с фитопатогенами.

Выявление закономерности микробного разложения биополимеров даст возможность управлять микробными популяциями, в частности откроет новые перспективы повышения урожайности сельскохозяйственных культур.

Оценка потенциальной гидролитической активности и анализ компонентного состава микробных сообществ наземных экосистем в широком диапазоне действия экологических факторов могут быть полезны: 1) для разработки и применения хитинсодержащих компостов и биодеградабельного упаковочного материала (биопластика); 2) для решения проблемы утилизации хитин- и пектинсодержащих отходов; 3) для подбора оптимальных условий выделения изолятов хитино- и пектинолитиков и 4) для содания биопрепаратов для борьбы с фитопатогенами.

Результаты проведенных исследований включены в учебные пособия «Образование и поглощение парниковых газов в почвенных агрегатах» (2006); «Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флюоресцентно-микроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridisation (FISH)» (2008); «Молекулярно-биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии» (2010); «Экстремофильные и экстремортолерантные актиномицеты в наземных экосистемах» (2011) и использованы в лекционных курсах по биологии почв, почвенной бактериологии, молекулярной биологии, экологии почвенных микроорганизмов, читаемых на факультете Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Проведение исследований было поддержано грантами РФФИ (проекты 11-04-00931а; 11-04-92202-Монг_а; 00-04-49162а; 02-04-49061а; 05-04-49252а; 08-04-01233а; 06-04-48165а; 08-04-90201-Монг_а; 03-04-06911 (мае); грантами президента РФ для молодых ученых (МК-4000.2005.4 ); грантами президента РФ для поддержки Ведущих научных школ (НШ-1518.2003.4, НШ-8797.2006.4, НШ-2227.2008.4), ФЦНТП «Биологическое разнообразие».

Основные защищаемые положения диссертации

1. Применение молекулярно-биологических методов (FISH) в экологических исследованиях обеспечивает получение более полной информации о таксономическом разнообразии и потенциальной гидролитической активности микробных комплексов наземных экосистем, существующих в широком диапазоне экологических факторов (влажности, температуры, окислительно-восстановительного потенциала, поступления органического вещества). Сочетание двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE-анализа суммарного амплификата фрагментов гена 16S rRNA) обеспечивает возможность информативной оценки различий в структуре доминантных и минорных компонентов гидролитических комплексов, формирующихся в различных ярусах наземных экосистем.

представителями филогенетической группы Proteobacteria (классы альфа и бета). В минеральных горизонтах почвы усиливается роль гидролитических представителей групп Firmicutes и Actinobacteria.

3. Среди основных экологических параметров, определяющих функциональную активность гидролитического (хитинолитического) комплекса почвенного яруса (влажность, питательный ресурс, время сукцессии) наиболее значимым является влажность. Уровень влажности, обусловливающий максимальную активность гидролитического микробного комплекса зависит от типа почвы. Развитие гидролитического микробного комплекса происходит в крайне широком диапазоне влажности - от близкой к полной влагоемкости до близкой к влаге завядания.

4. Функциональная роль мицелиальных актинобактерий в метаболизме хитина заключается, с одной стороны, в активном разложении этого биополимера, а с другой - в регуляции функционирования микробного гидролитического комплекса посредством продукции биологически активных регуляторных метаболитов, что реализуется в широком диапазоне экологических параметров (влажность, температура, поступление органического вещества, сукцессионное время).

5. Математическое планирование эксперимента принципиально применимо для определения in situ оптимальных значений экологических факторов, существенно влияющих на функциональные показатели гидролитических микробных комплексов.

Апробация работы

научной конференции "Проблемы сохранения, восстановление и обогащение биоразнообразия в условиях антропогенно измененной среды", (Кривой Рог, 2005); 18th World Congress of Soil Science (Philadelphia, 2006); 10th International Conference on Chitin & Chitosan (Montpellier, 2006); 14th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (Sunday, 2007); X European Workshop on Astrobiology (EANA'2010) (Pushchino, 2010); Доклад на научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2009); Научной конференции «Чтения памяти академика В.Е. Соколова» (Москва,2009); на заседании кафедры в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм (Штутгарт, 2010), на заседаниях кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Публикации

Материалы диссертации содержатся в 93 печатных работах: 2 коллективных монографиях, 37 экспериментальных статьях (в том числе обзорах), опубликованных в реферируемых журналах, входящих в список ВАК, 7 учебных пособиях и 47 тезисах докладов на Международных и Всероссийских симпозиумах и конференциях.

Объем работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 300 страницах, содержат 109 рисунков, 17 таблиц. Список литературы включает 306 источников, из них 237 зарубежные.

Место проведения работы.

Основная часть работы проводилась на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова с 2000 по 2011г. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность всем коллегам -соавторам публикаций, принимавшим участие в представленной работе на различных этапах ее выполнения. Особую благодарность автор выражает своим учителям и наставникам - чл.-корр. РАН И.Ю.Чернову, д.б.н., профессору Д.Г.Звягинцеву, д.б.н.

П.А.Кожевину, д.б.н., проф. А.Л.Степанову, д.б.н., проф. М.М.Умарову, д.б.н., проф.

Г.М.Зеновой, д.б.н., проф. Е.В.Шеину, д.б.н., проф. И.И.Судницыну, д.б.н., проф. А.В.Смагину, к.б.н., вед. научн. сотр. Т.Г.Добровольской, д.б.н. Л.В.Лысак, д.б.н., проф. Л.М.Полянской, д.б.н. О.Е.Марфениной, к.б.н. И.К.Кравченко.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 Обзор литературы

Сформулированы общие представления о масштабах развития микробных гидролитических комплексов и микробной деструкции биополимеров (на примере полисахаридов) в наземных биогеоценозах разных климатических зон. Охарактеризованы и проанализированы известные ферментные системы, принадлежащие гидролитическим наземным сообществам.

Глава 2 Объекты и методы исследования

Полевые исследования и сбор материалов проводились в наземных экосистемах различных биоклиматических зон с учетом вертикальной ярусности. Объектами исследования явились образцы, отобранные из разных ярусов вертикальной структуры наземных экосистем, представляющие собой: 1) верхние гумусовые горизонты чернозема обыкновенного (Воронежская обл., Таловский р-н), каштановой (Волгоградская область, Иловлинский р-н), серой лесной (Тульская обл., Щекинский р-н), дерново-подзолистой (Московская обл., Солнечногорский р-н), глее-слабоподзолистой (Тюменская обл., г. Надым) почв и текстурного уплотненного горизонта бурой пустынно-степной почвы Монголии (Южный Гоби, Булган сомон) -почвенный ярус; 2) наземные образцы подстилок соответствующих почв - наземный ярус (смешанный образец, включающий все три слоя - L, F и Н) и 3) растительные субстраты - надземный ярус (зеленая хвоя ели (Picea abies), листья липы (Tilia cordata), березы (Betula sp.)). Образцы субстратов отбирались с по-вторностыо, достаточной для учета пространственных и временных вариаций структуры гидролитических микробных сообществ.

Особое внимание в исследованиях уделено анализу динамики структурных и функциональных показателей в ходе сукцессии гидролитических (хитинолитического и пектинолитического) микробных сообществ наземных биогеоценозов. При определении структуры гидролитического микробного комплекса в исследуемых образцах наземных экосистем использовали метод микрокосмов с инициацией микробной сукцессии увлажнением и внесением очищенных полисахаридов (хитина («ICN Biomedicals», Германия), пектина («Sigma», Германия) или целлюлозы

(«Sigma», Германия)). Масса вносимых субстратов во всех вариантах не превышала десятых долей процента от массы образца. Инкубацию почвенных микрокосмов проводили в широком диапазоне матричного давления почвенной влаги, Р (от 0 до -808 кПа) (Смагин, 2005), окислительно-восстановительного потенциала и температур (5, 27 и 50°С).

Определение численности и таксономической принадлежности доминирующих групп микроорганизмов проводили молекулярно-биологическими методами FISH (fluorescence in situ hibridisation) и DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis). Определение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов и грибов проводили с использованием метода люминесцентной микроскопии препаратов, окрашенных набором различных флюорохромов (микроскоп «Ax¡oskop2+»). С использованием метода флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) (Amann, 2000), модифицированного нами для работы с почвой выявляли специфику прокариотного, метаболически активного сообщества, разрушающего полисахариды. Применен спектр зондов, специфичных для представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп Bacteria. Общую биомассу и долю метаболически активных микроорганизмов определяли расчетным методом (52).

Таксономическую принадлежность доминирующих групп гидролитических прокариотных комплексов наземных экосистем выявляли с использованием метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ), основанного на анализе фрагментов 16S rRNA и функциональных генов, полученных в ПЦР. Разделение фрагментов генов 16S rRNA и хитиназного гена группы «А» проводили на оборудовании DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, США) в Институте микробиологии РАН имени C.H.B иноградского согласно протоколу (Кравченко и др., 2010) с использованием денатурирующего градиента (формамид, мочевина) 50-65% под напряжением 40 V в течение 16 ч для 16S rRNA (и 35-60% при 200V в течение 6 ч для chiA) при постоянной температуре 60° С. Результаты электрофореза регистрировали с помощью системы гель-документирования BioDoc Analyzer II (Biometra, Германия) после окрашивания этидий бромидом. Характерные видимые полосы были элюированы, полученные растворы очищены и использованы для определения нуклеотидных последовательностей.

Выделение ДНК. Для экстрагирования тотальной ДНК из образцов наземных экосистем (листьев, подстилки и почвы) применяли стандартные методики PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя; из клеток чистых культур микроорганизмов ДНК извлекали с помощью Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США).

Выбор олигонуклеотидных праймеров и амплификация ДНК. Для амплификации путем ПЦР фрагментов генов, кодирующих 16S и 23S rRNA, в большинстве экспериментов были использованы универсальные праймерные системы: llF-1492Re и 341F+GC-907R (Muyzer et al., 1993) и ITSlF-NL4Re, соответственно. Также в работе были использованы специально модифицированные праймерные системы и подобраны соответствующие условия реакции для амплификации фрагментов функциональных генов (гена, кодирующего хитиназу группы «Л», chiA).

Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью как горизонтального электрофореза в 1,2-2% геле агарозы при напряженности электрического поля 6 V/cm, так и вертикального электрофореза (ДГГЭ) (Muyzer et al., 1993).

Секвенирование ДНК проводили с использованием прямых и обратных праймеров с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США).

Фшогенетический анализ. Для предварительного анализа полученных нуклеотидных последовательностей генов 16S rRNA и chiA использовали программное обеспечение баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.eov/blast) и Ribosoma! Database Project (RDP) (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://iwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). а их множественное выравнивание - с использованием программы CLUSTAL W 1.75. Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма ближайшего связывания "neighbor-joining" (NJ) в программе MEGA 4 (Tamura, 2007). Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев. Все вновь полученные последовательности различных генов были депонированы в базу данных нуклеотидных последовательностей (GenBank) с присвоением им индивидуальных номеров доступа.

Активность гидролитических ферментов и наличие хитиназного гена группы «A» (chiA), вырабатываемых разными группами микроорганизмов в системах микрокосмов определяли молекулярно-биологическими и спектрофотометрическим методами. Интенсивность образования фермента хитиназы в исследуемых образцах in situ, а также чистыми культурами микроорганизмов определяли спектрофотометрически с использованием в качестве субстрата хитиназура -коммерческого препарата окрашенного хитина (Gomes Ramizes et al., 2004), также с применением 4-метилумбеллиферон-меченого М-ацетил-О-глюкозоаминида дигидрата (Pritsch et al., 2004). Наличие хитиназного гена группы «A» chiA в

образцах исследуемых микрокосмов наземных экосистем обнаруживали с помощью «вложенного» ГГЦР („nested"PCR) согласно протоколу (Williamson et al., 2000).

Эмиссию парниковых газов (диоксида углерода, закиси азота и метана) из образцов наземного (подстилка) и почвенного ярусов при внесении полисахаридов и без них оценивали газохроматографическим методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Статистическую обработку данных проводили методами многомерной математической статистики с использованием программ STATISTICA-6 и Statgraphics Plus.

Глава 3 Филогенетическое разнообразие гидролитических прокариотных комплексов в пространственно-сукцессионном ряду наземных лесных

экосистем

Молекулярно-экологический подход не ограничен обязательным принципом «чистой культуры» и полученные с его применением результаты могут существенно дополнить и расширить представления о микробном разнообразии. Для того чтобы подчеркнуть, что молекулярная экология изучает природные сообщества не на уровне целых организмов, а на уровне отдельных элементов их геномов, предложен термин филотип (Турова, 2009). Применение молекулярных методов в экологических исследованиях позволяет получить филогенетическую информацию об отдельных членах сообщества, даже если они не были ранее известны микробиологам. С целью характеристики исследуемых сообществ были использованы молекулярно-экологические методы флюоресцентного анализа гибридизации клеток in situ (FISH) и сиквенс-анализа, проведенного по результатам метода DGGE филогенетических (фрагментов гена 16S rRNA) и функциональных (с/г ¿4) генов. Оценивая метаболически активные гидролитические природные комплексы в пространственно-сукцессионном ряду, следует обратить внимание на то, что во всех исследуемых ярусах, надземном (филлосфера), наземном (подстилка) и почвенном, доля метаболически активных клеток составляла приблизительно третью часть (35%) от комплексов всех прокариотных организмов. Филогенетическая структура метаболически активного гидролитического комплекса при переходе от филлосферы к подстилке и почве значимо изменялась. Если в надземном и наземном ярусах значительную часть гидролитического комплекса составляли протеобактерии, то при переходе к почвенному доля активных представителей протеобактерий сокращалась от 50% до 25% от всех выявляемых клеток бактерий. В почвенном ярусе отмечено возрастание численности фирмикут и актинобактерий, доля которых составляла до 50 %% от всех активных прокариот (рис.1).

Современный молекулярно-биологический метод денатурирущего градиентного гель-электрофореза (DGGE) суммарного амплификата фрагментов гена 16S rKNA домена Bacteria (Novinscak et al., 2007) был использован с целью оценки состава и выявления различий в структурах доминантных составляющих микробных гидролитических сообществ надземного, наземного и почвенного ярусов.

На полученных профилях ДГГЭ интенсивность и количество дискретных полос в микрокосмах с добавлением полисахаридов были выше по сравнению с контрольными вариантами (без внесения полисахаридов). Сиквенс-анализ характерных ДГГЭ полос выявил в образцах микрокосмов спектр сиквенсных типов, сходных с группами, получаемыми флюоресцентным методом гибридизации клеток in situ (FISH).

59%

38%

Физиологически активные клетки домена Bacteria | Клетки, не окрашенное зондами Физиологически активные клетки домена Archaea

Надземный ярус

5% 5% 9%

10%

22%

3% 5%

21%

Наземный ярус

2% 5% 10%

13%

19%

Почвенный ярус

7% _ 15%

18%

29%

Proteobacteria:

Alpha

Beta

Gamma

Delta

Actinobacteria

Firmicutes

Verrucomicrobia

Planctomycetes

Bacteroidetes

Acidobacteria

Рис.1. Соотношение отдельных филогенетических групп домена Bacteria (метод FISH) в вертикально-ярусном ряду (серая лесная почва (почвенный ярус), подстилка (наземный ярус), листья надземный слой (филлосфера)

Для образцов филлосферы обнаружено присутствие филотипов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteraceae класса Betaproteobacteria и семейству Acidobacteriaceae филума Acidobacteria (рис.2а). Представители ацидобактерий нового рода Granulicella выделены из мхов сфагновых болот отечественными исследователями (Дедыш, 2009) и характеризуются как гидролитики, обладающие комплексом пектинолитических ферментов. Выделение таксонов этого рода стало возможным только в результате применения молекулярно-биологических методов. Бактериальный компонент в наземном ярусе (в образцах подстилки с полисахаридом) был представлен четырьмя филотипами, составляющими два филогенетических кластера. Один из них наиболее близок к семейству Enterobacteriaceae класса Gammaproteobacteria, второй - к семейству Clostridiaceae грамположительных бактерий. В почвенном ярусе гидролитический бактериальный компонент оказался наиболее разнообразным, составляя 8 филотипов, принадлежащих к трем основным линиям эволюции бактерий (семейства Chitinophagaceae филума Bacteroidetes, семейства Bacillaceae грамположительных бактерий и филума Actinobacteria актиномицетами рода Streptomyces) (рис. 26). На дендрограмме представлены профили ДГТЭ для образцов листьев и почвы с полисахаридом и без него.

Таким образом, комбинирование двух молекулярно-биологических методов (FISH и DGGE) дало возможность информативно оценить различия в структурах доминантных составляющих гидролитических сообществ наземных экосистем, формирующихся в различных ярусах.

Оценена численность физиологически активного гидролитического прокариотного комплекса в надземном (филлосфера), наземном (подстилка) и почвенном ярусах, установлено, что она составляет третью часть от комплекса всех прокариотных организмов. Выявлены различия в филогенетической структуре гидролитического прокариотного комплекса пространственно-сукцессионного ряда наземных экосистем. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой (альфа- и бета-) протеобакгерий. В почвенном гидролитическом комплексе увеличивается доля фирмикут и актинобактерий. Результаты подтверждают полученные ранее сотрудниками кафедры биологии почв МГУ данные о вертикально-ярусной структуре микробного комплекса (Звягинцев и др., 1999), и дополняют их оценкой доли физиологически активных гидролитиков представителей прокариот в филлосфере, подстилке и почве.

Massilia sp. gi|323362903|emb|FM99801...~^ Naxibacter alkalitolerans gi|31965878... Massilia sp. gi|323362893|emb|FM99800.. Massilia aerolata gi|312179362|gb|HQ4... V Uncultured Massilia sp. gi|209421525|... Uncultured Massilia sp. gi|209421848|... Uncultured Massilia sp. gi|209421513|...

-07 H Хитин

Oxalobacteraceae (Betaproteobacterii

-08 H Хитин

Acidobacteriac

Uncultured proteobacterium clone gi|1(2)

-O Bacillus sp. LChit9 partial 16S rRNA ...

-O Pseudomonas sp. LChit68 partial 16S r...

-— O Pseudomonas sp. LChit57 partial 16S r...

• 2 ЦКонтроль

[• Streptomyces sp. 5GP1-1 partial 16S r... I Streptomyces globosus EF371433.1 Streptomyces griseus NBRC 13350 18243... Streptomyces griseus strain E989 GU38... Streptomyces microftaws strain B-10 ... Streptomyces griseus HQ597007

Chitinophaga pinensis DSM 2589 256419... Chitinophaga pinensis DSM 2588 256419(2) Chitinophaga pinensis DSM 2588 256419057 г Une. Bacteroidetes bacterium AS9 DQ00... ¿1 Une. Bacteroides sp.4 225 GU271825

i— Вас

¡lr<

8sl#

44I Une. Cytophaga sp.1 272 GU271431 "2 Хитин Bacillus cereus Rock3-28 contig01536 .. • 1 DКонтроль 8Sl#5 J Хитин Geobacillus sp. Y412MC52 319765157 i®4 JКонтроль 1 Bacillus cereus NVH 391-98 152973854 Geobacillus sp. WCH70 239825584 Geobacillus sp. WCH70 239825584(2) 3 ХИТИН

_I-®з □Контроль

lool— Bacillus coagulans 36D1 229324934

(Actinobacteria)

Chitinophagaceae (Bacteroidetes)

Bacillaceae (Firmicutes)

0 2

Рис 2. Филогенетический анализ бактериальной компоненты микробного гидролитического комплекса: надземного яруса (зеленые листья березы) (а) и почвенного яруса (гумусовый горизонт серой лесной почвы) (б), основанный на результатах DGGE-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA. Опытные варианты обозначены кружками. Дерево построено с помощью алгоритма neighbour-joing, масштаб представляет собой эволюционные расстояния и соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» - анализа 1000 альтернативных деревьев

Глава 4 Разложение биополимеров (хитина и пектина) почвенными гидролитическими микробными комплексами

При сравнении интенсивности микробной деструкции хитина, определяемой по величине КТХ, в опытах с микрокосмами почв разных типов показано, что в микрокосмах чернозема и серой лесной почвы разложение полисахарида протекало почти в 2 раза интенсивнее, чем в микрокосмах почв других типов (рис.3) (20).

По результатам оценки дыхания почв с внесенным полисахаридом, полученной с помощью кластерного анализа (STATISTICA-6), образцы объединялись в следующие группы: 1) каштановая и солонец, 2) бурозем и дерново-глеевая, 3) серая лесная почва и чернозем. Последняя группа почв по отклику на внесение полисахарида выделялась среди других (рис.4).

По результатам оценки общей биомассы микроорганизмов методом кластерного анализа выделялись две группы почв: 1) каштановая и солонец, 2) серая лесная и чернозем, в которых прирост биомассы после внесения полисахарида происходил активнее, чем в других почвах.

Следует отметить, что именно в этих почвах при внесении хитина происходило особенно заметное увеличение биомассы гидролитического прокариотного комплекса, главным образом, его актиномицетного компонента.

В исследуемых образцах почвенных микрокосмов in situ было зарегистрировано образование фермента хитиназы и определена динамика ее активности (рис.5).

сутки

Рис.3. Динамика разложения биополимеров в почвах разных типов (КТХ= мкг С-С02 опыт /мкг С-СОг контроль)

Метод одиночной связи Евклидово расстояние 101---■----

у 8

1 £ 1

г- о

2 -- г ------ --—-—--==i

П6 П5 П4 ПЗ П2 П1

Рис.4. Дендрограмма кластерного анализа по отклику эмиссии СОг в разных почвах при внесении полисахарида (хитина). П1-чернозем, П2-каштановая, ПЗ-солонец, П4-серая лесная, ГО-бурозем, П6-дерново-подзолистая

При этом максимальная активность хитиназы в увлажненном черноземе in situ, измеренная с использованием 4-метилумбеллиферон-меченого Т\[-ацетил-.5-В-глюкозоаминид дигидрата, отмечался на 7-е сутки опыта и достигала уровня 600 мкмоль/г почвы. Важно, что данная зависимость коррелирует с результатами, полученными для эмиссии диоксида углерода и биомассы микроорганизмов в микрокосмах.

5 ч осч ОчЧ .чч -.44 -.44 -.44 .44 ОчЧ \4Ч чЧЧ чЧЧ .44

W чч> --ЧЧЧ W W чч> Ч4-- й ч44 Ч4Ч ччч, ччч ччч ччЧ pfe ЧЧ*- чЧ4 ч4Ч 444 444 ч4Ч ч44

44"1 44*-44s

1 3 7 14 55 сутки

Рис. 5. Динамика биомассы микроорганизмов (а) и активности хитиназы (б) в черноземе

тишиццм

¡№( J

с Oil!

5 Ой

в»

1 4 7 14 30

-И +1

1-контроль Ьит

сум

Глава 5 Молекулярно-генетическая детекция продуцентов хитиназ в почвенных системах

Для изучения функциональных харвактеристик природных микробных сообществ широкое распространение получил подход на основе анализа функциональных генов. Определяли наличие хитиназного гена группы А (chiA) 18 семейства гликозилгидролаз в почвенном микробном сообществе in situ и чистых культурах микроорганизмов, выделенных из исследуемых почв с помощью метода «вложенного» ПЦР-анализа (nested PCR) с использованием специфических праймеров и последующим разделением полученных продуктов ПЦР денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Среди известных хитиназ гены группы А обладают высоко консервативными участками, обеспечивающими их специфическую детекцию среди широкого филогенетического разнообразия микроорганизмов, и обнаруживаются у 70-80% микробов-хитинолитиков (Williamson et al, 2000). ДГГЭ-анализ амплифицированных фрагментов хитиназного гена показал возрастающую сложность микробных сообществ в почве при добавлении хитина по сравнению с сообществами, развивающимися в почве без хитина. Согласно результатам секвенирования последовательности гена были обнаружены у ряда некультивируемых организмов и представителей таких филогенетических групп, как Actinobacteria и Firmicutes. Среди близкородственных организмов, у которых методом ДГГЭ выявлен хитиназный ген, не всегда обнаруживались доминанты, выделенные нами методом посева образцов на плотные среды с хитином. Наблюдалась корреляция между результатами, полученными исследованием филогении функционального хитиназного гена, и результатами филогении 16S rRNA. Следует отметить, что используемые методы дополняют друг друга для выявления разнообразия микроорганизмов-гидролитиков. Полученные данные предполагают, что внутри микробного сообщества имеет место горизонтальный перенос генов хитиназ, как и большинства генов биодеградации, локализованных в плазмидной ДНК.

Анализ результатов показал, что наиболее активное разложение полисахаридов, наблюдаемое в образцах чернозема и серой лесной почвы, определяется структурой гидролитического микробного комплекса этих почв. В комплексах почв с наиболее активным разложением полисахаридов основными гидролитиками являются прокариоты. Комбинированными методами «вложенного» ПЦР-анализа и ДГГЭ показано наличие in situ хитиназного гена chiA группы А у представителей Actinobacteria и Firmicutes.

Глава 6 Воздействие экологических факторов на структуру и функциональную деятельность почвенных гидролитических микробных комплексов

Знание масштабов распространения гидролитических микробных комплексов, устойчивых к экстремальным значениям экологических факторов, важно не только с теоретических позиций, но и в практическом аспекте в связи с такими биотехнологическими задачами, как получение гидролитических ферментов, устойчивых к экстремальным значениям влажности, температуры, рН; применение микробов-гидролитиков для биоконтроля и биоремидиации почв, а также для борьбы с фитопатогенными грибами.

6.1 Влияние почвенной влаги на функциональную активность микробных гидролитических комплексов

Изучение влияния увлажненности почвы на эмиссию диоксида углерода из почв при внесении разных полисахаридов показало, что давление почвенной влаги влияет на динамику и интенсивность эмиссии диоксида углерода в большей степени при внесении хитина, чем других исследованных субстратов (пектина, глюкозы и целлюлозы). Масса вносимых субстратов во всех образцах содержала равное количество молей углерода. С возрастанием давления почвенной влаги от -800 кПа до -0,5 кПа интенсивность эмиссии С02 при внесении хитина в микрокосмы с образцами чернозема увеличивалась больше, чем в два раза (от 4 до 18 мкг С-С02/г почвы за час), что не отмечалось при внесении в почву других исследуемых субстратов (рис. 6). Аналогичные закономерности наблюдались для микрокосмов всех исследованных почв.

В связи с тем, что полисахариды находятся в почвах как в аэробных, так и в анаэробных микрозонах, рассмотрена их трансформация в микроаэробных условиях. Показателем интенсивности трансформации была выбрана эмиссия метана из образцов почвы с внесенным хитином и без него. При влажности, близкой к полной влагоемкости, интенсивная эмиссия метана наблюдалась для образцов всех исследуемых почв, что свидетельствует о наличии строго анаэробных микрозон во всех этих почвах. Разница в величинах эмиссии метана для образцов почвы с внесением хитина и без него (контроль) была заметна уже на начальных этапах инкубирования почвы, что свидетельствует о его использовании микроорганизмами уже в первые сутки опыта.

Наиболее высокие показатели эмиссии метана и различия в величинах эмиссии между опытными и контрольным вариантами были зафиксированы на 20-30 сутки опыта, что, очевидно, связано с развитием метаногенов на продуктах метаболизма хитиноли-тиков. Следует отметить, что эмиссия метана из почв наблюдалась при всех исследуемых уровнях матричного давления почвенной влаги: от -800 до -0,5 кПа. Установлено, что анаэробная трансформация хитина протекает в почвах с разной интенсивностью при исследуемых уровнях влажности и матричного потенциала. Интервалы значений влажности для анаэробной трансформации хитина в разных почвах различны. Так, в глее-слабоподзолистой песчаной почве наиболее активная работа анаэробов-хитинолитиков зафиксирована в достаточно узком интервале влажности от 15% от массы почвы (матричное давление -1,16 кПа) до 25% от массы почвы (полная влагоемкость 0 кПа), в то время как в черноземе этот интервал увеличивался от 36% от массы почвы (матричное давление -32,6 кПа) до 64% от массы почвы (полная влагоемкость 0 кПа). В почвах с большим содержанием илистых фракций (серая лесная, ЭПЧ < 1мкм — 28%) коэффициент трансформации хитина возрастал в области больших значений влажности, а для песчаных почв — в области меньших (глее-слабоподзолистая, ЭПЧ < 1мкм — 5%). Существует зависимость между интенсивностью трансформации хитина в анаэробных условиях и радиусом пор, занятых водой.

и 16 Я

Т 14 12

О 10

т / / т

----- 1

" 1 т/

у ^ ......•

-800 -3,2 -0,5

Давление почвенной влаги, кПа

- — хитин

пектин —Г - целлюлолза

глюкоза -4- контроль

Рис. 6. Зависимость эмиссии диоксида углерода из образцов чернозема при разложении полисахаридов и глюкозы от давления почвенной влаги

При радиусе пор (занятых водой) менее 6 мкм работа анаэробного хитинолитического микробного комплекса, определяемая по величинам коэффициентов трансформации хитина, была минимальна, что свидетельствует о затрудненном развитии

микроорганизмов-анаэробов вследствие малого диаметра пор. Таким образом, верхний предел влажности для изучаемого процесса определяется полной влагоемкостью почв, а нижний - размером пор, в которых еще возможно развитие бактерий.

6.2 Влияние температуры на функциональную активность микробов-гидролитиков

Исследование активности дыхания в почвенных микрокосмах с внесением хитина и пектина показало, что эмиссия С02 в этих вариантах превышала эмиссию в контроле, в среднем, в 2-6 раз для всех исследованных почв. Скорость продукции С02 в опытных вариантах с внесением полисахаридов варьировала в зависимости от температуры инкубации. При минимальной температуре (5°С) пик активности наблюдался к концу 3-й недели эксперимента, при 27°С - к концу первой недели, а при 50сС - уже на первые сутки опыта. В контрольных вариантах подобной активности не наблюдалось, что свидетельствует о высокой функциональной способности микробных комплексов гидролизовать полисахариды.

Эмиссия диоксида углерода была использована в качестве функционального показателя микробного хитинолитического комплекса в экспериментах на основе математического планирования для оптимизации условий (оптимальных значений факторов), обеспечивающих микробное разложение хитина в почвах. Эксперимент спланирован по схеме центрального композиционного плана «22+звезда».

Установлено, что оптимальные значения факторов различались для почв различных типов. На контурных графиках (рис. 7) видно, что для чернозема максимальное дыхание обнаруживается примерно на 20-е сутки при температуре 25°С, для пустынно-степной почвы - на 10-е сутки при температуре 30°С.

Contours of Estimated Response Surface Contours of Estimated Response Surface

0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50

temperature temperature

Рис. 7. Оптимальные значения факторов (температуры и сукцессионного времени) на контурном графике в экспериментах с внесением хитина в бурую пустынно-степную почву (А) и чернозем типичный (Б)

Таким образом, с помощью математического планирования показана принципиальная возможность решения оптимизационной задачи с определением оптимальных значений факторов (температуры и сукцессионного времени) для

функционального показателя (дыхания) микробного гидролитического комплекса, развивающегося в почвах разных типов.

6.3 Корреляция накопления биомассы и активности хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почв, развивающихся при различных параметрах температуры и давления почвенной влаги

При определении численности микроорганизмов и биомассы гидролитического микробного комплекса отмечено их возрастание для всех групп микроорганизмов в вариантах развития комплекса с внесением полисахаридов по сравнению с контрольными вариантами. Эксперименты по определению динамики численности и биомассы разных групп микроорганизмов в ходе микробной сукцессии в образцах почв, инкубируемых при разных температурах, в целом, подтвердили закономерности, полученные при исследовании динамики активности дыхания во всех почвах и коррелировали с результатами, полученными при определении активности хитиназы in situ с использованием 4-метилумбеллиферон-меченого Ы-ацетил-Д-1Э-глюкозоаминид дигидрата (рис. 8) . Так, максимальная активность хитиназы в увлажненном черноземе in situ даже без внесения хитина при 27°С приходилась на 8-е сутки эксперимента и в шесть раз превышала активность хитиназы в этой же почве, инкубируемой при 5°С,

Определения отношений биомассы отдельных групп микроорганизмов (прокариот, грибов) в образцах с добавлением субстрата и без него (рис. 9) показали, что вне зависимости от вида субстрата и типа почвы грибы (в отличие от прокариот) имеют тенденцию имеют тенденцию разлагать полисахариды более активно при низких температурах.

Активность прокариотного комплекса в значительной степени была связана с типом почвы. Так, и бактериальный, и актиномицетный гидролитические комплексы глее-подзолистой почвы особенно были активны при низких температурах, тогда как в бурой пустынно-степной почве вклад прокариотных организмов в процесс разложения полисахаридов был максимален при 50°С. Активность актиномицетов при повышенных температурах была особенно велика в бурой пустынно-степной почве и черноземе при внесении хитина. Таким образом, филогенетическая структура природного гидролитического микробного комплекса обусловливается особенностями климатических условий и свойствами почвы.

№¡11« 1атМа= ,04873, р(30, 311,81)=18,701, р=0,0000 УегИса! Ьагз denote 0,95 солАйепсе п1егуз1к

0,25

Контроль

Хитин

Пектин

\ЛЛ11та 1атЬйа=,07445, Р(30, 311,81 )=14,790. р=0,0000 Уег^са! Ьагэ denote 0,95 соп^йепсе тгепя!з

Контроль

Хитин

Пектин

0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 30 0 1 4 8 15 30

сутки

Рис. 8. Динамика биомассы микроорганизмов (мг/г почвы) при различных температурах в ходе хитино- и пектинолитической сукцессии в черноземе типичном: А - бактерии, Б - актиномицеты, В -грибы

А К 6

4 2 О

»».,1«

грибы

бактерии

Б к

В к

1, °С:

□ 5 В 27 □ 50

Рис. 9. Максимальные значения коэффициентов К - соотношений биомассы основных групп микроорганизмов в почвах с добавлением хитина (х) или пектина (п) и биомассы тех же групп в контрольных образцах - в ходе эксперимента при различных температурах инкубации чернозема (А), глее-слабоподзолистой (Б) и пустынно-степной (В) почв

6.4 Анализ структурных и функциональных показателей развития гидролитического микробного комплекса

Новые и интересные данные были получены при анализе основной информации о динамике структурыых (биомасса грибов, бактерий и актиномицетов) и функциональных (эмиссия диоксида углерода) показателей развития гидролитического комплекса, проведенного с помощью методов многомерной математической статистики.

Пошаговая множественная регрессия для выявления связи между функциональными и структурными показателями выявила существенную роль для функционирования почвенного микробного комплекса минорных по биомассе компонентов - мицелиальных и одноклеточных бактерий, особенно актиномицетов вне зависимости от температуры (рис.10). Полученная регрессионная модель на основе двух переменных имеет высокую статистическую значимость (объясняет до 90% дисперсии функционального показателя). Зависимость описывается следующими уравнениями для исследуемых почв:

Яевр = 52,87*В + 89,27*А - пустынно-степной почва

Яевр = 37,77*В + 555,49*А - серая лесная почва, где Леер - эмиссия С02 (мкг С-С02/г-ч), А - биомасса актиномицетов (мг/г), В - биомасса бактерий (мг/г).

с э

Рис. 10. Регрессионная модель зависимости эмиссии диоксида углерода (Яевр) от биомассы [мг/г] актиномицетов (А) и бактерий (В) в пустынно-степной почве (С) и серой лесной почве (О)

Таким образом, установлена высокая значимость при гидролизе полисахаридов вне зависимости от температуры процесса минорных по биомассе компонентов микробного комплекса - мицелиальных и одноклеточных прокариот, которые, как показано, вносят существенный вклад в контроль дыхания микробного комплекса в широком диапазоне экологических параметров (температура, влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время). При этом в процессах деструкции хитина особенно велика роль актиномицетов.

С помощью методов многомерной математической статистики был проведен анализ структурных (биомасса грибов, бактерий и актиномицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей гидролитических микробных комплексов в почвах с внесением и без внесения полимеров при различной увлажненности. На дендрограмме кластерного анализа (вертикальная ось отражает относительное сходство) можно выделить два кластера (рис.11). В первом кластере представлено 20, а во втором - 7 объектов. По координатам центроидов можно судить о том, какие переменные играют наиболее важную роль в каждом кластере. По показателям обилия актиномицетов и интенсивности дыхания указанные кластеры практически не различаются.

Вместе с тем, для первого кластера характерны относительно низкие значения показателей обилия грибов и бактерий (0,64 и 0,13, соответственно). Для объектов второго кластера эти показатели значительно выше (2,89 и 0,96, соответственно). Существенно, что все объекты второго кластера представлены образцами, которые инкубировались при давлении почвенной влаги -3,2 кПа.

Рис. 11. Дендрограмма кластерного анализа (объекты обозначены следующим образом: а, Ь и с -давление почвенной влаги -800, -3,2 и -0,5 кПа соответственно; Ь, р и к - внесение хитина, пектина и контроль соответственно; цифры отражают сукцессионные этапы, сутки.

Можно предположить, что в этом случае создаются более благоприятные условия для развития учитываемых грибов и бактерий.

Таким образом, кластерный анализ показал, что, в первом приближении, уровень увлажненности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного комплекса факторами как внесение органического вещества и время.

С помощью дискриминантного анализа проверена возможность определения показателя увлажненности почв по структурно-функциональным показателям микробного комплекса. Точность диагностики образцов с давлением почвенной влаги -800 кПа составила 89%. Для образцов с давлением -3,2 и -0,5 кПа показатели точности диагностики были равны 78 и 67%, соответственно.

Дискриминантные функции для натуральных значений структурно-функциональных признаков имеют следующий вид:

Р1 = -1,41-9,73* (актиномицеты) +5,71 *(бактерии)-0,07*(грибы)-0,03 *(дыхание), Р2=-1,49+17,54*(актиномицеты)+ 1,71 *(бактерии)~ 0,49*(гри6ы)+0,12*(дыхание).

На диаграмме рассеивания (рис. 12) на плоскости двух дискриминантных функций видно, что объекты с разными значениями давления влаги образуют достаточно обособленные группировки. Большой интерес представляет поиск связей между функциональными и структурными показателями природных микробных комплексов.

3,9

2,9

О И1)0к11а X -3,2 «На О -0,5 к!1а

-2,3 -0,3 1,7

3,7 5,7 7,7

Р1= -1,41 -9,73(актиномицеты)+5,71(6актерии)-0,07(грийы)-0,03'(дыхание), Р2= -1,49 +17,54'(актиномицсты)+1,71 (6актерни]-0,49 (гря6ы)+0,12 (дыхание).

(Эмиссия, мкг С-С02/г-ч) = 399,03-{актиномицеты,мг/г) + 2,37(грибы, мг/г)

Рис. 12. Расположение образцов на плоскости двух дискриминантных функций и Р2

Пошаговый многофакторный регрессионный анализ данных, полученных для разнообразных микробных сукцессий (с внесением хитина и пектина и без внесения полимеров) в широком диапазоне давления почвенной влаги, позволил выявить и описать определенную связь с помощью регрессионной модели: (Эмиссия С02, мкг С-ССУг- ч) = 399,03* (актиномицеты, мг/г) + 2,37*(грибы, мг/г).

Дисперсионный анализ свидетельствует о высоких качествах модели (р<0,01, уровень 99%), которая в целом имеет достаточную информационную способность при коэффициенте детерминации 69%.

Вполне ожидаемой и традиционной оказалась связь дыхания с грибной биомассой, но весьма новым и неожиданным явилось определяющее влияние на этот функциональный показатель комплекса актиномицетов. Степень влияния актиномицетов на дыхание по данным дисперсионного анализа составляет 87% .

Таким образом, выявлена существенная роль минорного по биомассе компонента (актиномицетов) в функционировании почвенного микробного комплекса. Дыхание как ключевой функциональный показатель природных микробных комплексов, может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых, по всей видимости, определяется не столько их прямым вкладом в стехиометрию процессов разложения органического вещества, сколько вкладом в регуляцию функционирования всего микробного комплекса. Регуляторная роль актиномицетов, по-видимому, обеспечена механизмами, основанными на

характерной для актиномицетов продукции биологически активных веществ. Существенно, что этот результат получен в условиях, которые имитируют широкий спектр экологических ситуаций (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время), которые могут создаваться in situ.

Также отмечено, что уровень увлажненности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного комплекса факторами как поступление пищевых ресурсов и время. При этом влажность имеет более значимое влияние на деятельность хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитическим.

При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно, актиномицетов. Дыхание в широком диапазоне условий (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых, по-видимому, определяется их регуляторным вкладом вкладом в контроль функционирования микробного сообщества.

Глава 7 Молекулярно-биологический анализ компонентного состава гидролитических бактериальных комплексов почв, развивающихся при различных значениях влажности и температуры

7.1 Исследование прокариотных хитинолитических и пектинолитических комплексов почв in situ методом FISH

Оценку численности метаболически активных клеток прокариот в микробных гидролитических комплексах исследуемых почв проводили с помощью метода in situ-гибридизации с rRNA-специфичными флуоресцентномечеными олигонуклеотидными зондами (метод FISH) в сроки эксперимента, соответствующие максимальному накоплению микробной биомассы, которую измеряли с помощью люминесцентной микроскопии, и наибольшей интенсивности дыхания при инкубировании почвы при 5 °С, 27 °С и 50°С.

Эксперименты показали, что общая суммарная доля клеток, обнаруживаемых

гибридизацией с универсальными зондами для представителей доменов Bacteria и

Archaea, составила в образцах исследуемых почв от 26% для чернозема до 90% для

глее-слабоподзолистой и бурой пустынно-степной почв от общего числа клеток,

выявленных окрашиванием акридином оранжевым. Особенно низкая численность

учитываемых методом FISH клеток была отмечена в контрольных вариантах в образцах чернозема, инкубируемых при 5°С. Следует отметить, что при развитии микробного комплекса этого образца при всех температурах, но особенно, при 5°С, основная масса бактерий была представлена неидентифицированными клетками мелких размеров. Эти данные позволяют предположить, что значительная доля прокариотных организмов чернозема находится в форме покоящихся или метаболически неактивных клеток. В вариантах почв разных типов, инкубированных при всех исследуемых температурах с хитином и пектином по сравнению с контрольными вариантами отмечалось возрастание (в 1,5-3 раза) численности метаболически активных представителей доменов Bacteria и Archaea (рис. 13): их количество составило от 4 до 20,5-Ю8 клеток/г почвы для Bacteria и от 9 до 29-Ю7 кл/г почвы для Archaea. Обращает на себя внимание высокая доля архей в гидролитическом микробном комплексе пустынно-степной и глее-слабоподзолистой почв, как при высоких, так и при низких температурах, особенно в образцах с внесением хитина. Участие архей в минерализации азотсодержащего органического вещества в почвах обсуждается во многих работах (Leininger et al., 2006; Timonen, Bomberg, 2009; Stopnisek et al., 2010).

10 20 30 ДО 50 60 TO 80

10" КЛ./Г п.

контроль

5й*ТИН

пектин

контроль

хитин

пектин

контроль

ХИТИН 3

пектин

1 О" кл./г п.

контроль

------LO

хитин контроль

ХИТИН CSJ

пектин

□ Bacteria ■ Arhaea

□ Неццентифицированные клоны (акрццин оранж.)

15 10 КЛ./ГП.

контроль ХИТИН контроль хитин

t,°C

Рис. 13. Численность метаболически активных представителей доменов Bacteria и Archaea в микробном комплексе почв при различных температурах: А - чернозем, Б - глее-подзолистая почва, В - пустнынно-степная почва

Влияние температуры на метаболическую активность представителей домена Bacteria проявлялось наиболее наглядно в гидролитических комплексах глее-подзолистой и пустнынно-степной почв, где численность активных клеток возрастала с понижением или увеличением температуры, соответственно.

В хитинолитическом и пектинолитическом комплексах чернозема общая численность метаболически активных форм Bacteria незначительно колебалась при разных температурах, что, очевидно, связано с высокой буферной способностью чернозема и высоким содержанием органического вещества в этой почве.

Анализ компонентного состава клеток внутри домена Bacteria в гидролитическом комплексе образцов чернозема типичного выявил различия в реагировании разных групп бактерий на изменение температуры инкубирования почвы, что определяло численность доминант (рис 14).

^Sh

3,5 3

с 2,5

5 2

S 1,5 1

0,5 0

-f i: i

3 4 5 6 7 В 9

Рис. 14. Численность отдельных филогенетических групп домена Bacteria (1 - Actinobacteria, 2 -Firmicutes, 3 - Alphaproteobacteria, 4 - Betaproteobacteria, 5 - Gammaproteobacteña, 6 -Deltaproteobacteria, 7 -Bacteroidetes, 8 - Chitinophaga, 9 - Verrucomicrobia) в черноземе с внесением полисахаридов и без них при различных температурах инкубирования: А - 5°С, Б - 27°С, В - 50°С

Было показано, что представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes и Bacteroidetes отвечали значительным увеличением численности метаболически активных форм на внесение хитина и пектина во все исследованные почвы вне зависимости от температуры, что свидетельствует об активном участии представителей перечисленных филогенетических групп в разложении полисахаридов в широком диапазоне температур. Эти группы организмов наиболее часто упоминаются в числе основных агентов деструкции органического вещества в природных экосистемах (Pourcher et al, 2001; Звягинцев, Зенова, 2001). При понижении температуры до 5°С в гидролитическом микробном комплексе почв наблюдалось возрастание численности группы Firmicutes и Betaproteobacteria и уменьшение количества грамположительных бактерий с высоким содержанием Г+Ц пар в ДНК, относящихся к филогенетической группе Actinobacteria, по сравнению с их численностью в почвах при 50°С.

Численность представителей филогенетической группы Actinobacteria заметно возрастала в опытных вариантах и составляла до 35% среди идентифицированных одноклеточных единиц внутри домена Bacteria в гидролитическом комплексе почв. Заслуживает внимания выявленное увеличение мицелиальных форм актинобактерий, биомасса которых в пустынно-степной почве и черноземе с добавлением хитина возрастала почти на порядок. Кроме того, в вариантах с полисахаридами и инкубацией при 50°С (в некоторых почвах и при 27°С) численность метаболически активных клеток Gammaproteobacteria была выше, чем в контрольных образцах. Увеличение численности Verrucomicrobia в вариантах с пектином указывает на их возможное участие в процессах деструкции этого субстрата.

В настоящее время среди описанных и узаконенных представителей Verrucomicrobia выявлены бактерии, способные к росту на целлюлозе, пектине, крахмале (Chin et al., 2001 ; Sangwan et al., 2004).

Результатом следующего блока экспериментов было выявление особенностей филогенетической структуры пекгинолитического и хитинолитического комплексов в почвенных образцах различной степени увлажненности. При развитии пектинолитических и хитинолитических комплексов внутри домена Bacteria при среднем значении давления почвенной влаги (-3,2 кПа) доминантами являются представители филогенетических групп Firmicutes я Actinobacteria, что было отмечено для всех исследуемых почв (рис. 15).

-Ш кПа -1,2 кпа -0,4 кпа

Рис. 15. Усредненные значения биомассы отдельных филогенетических групп пектино- и хитинолитического микробных комплексов исследуемых почв при различных значениях матричного давления почвенной влаги на 14 сутки инкубирования

С увеличением влажности возрастало число грамотрицательных форм (протеобактерий). В литературе имеются сведения о преобладании в бактериальном пектинолитическом комплексе сфагновых болот филогенетических групп Proteobacteria и Bacteroidetes (Панкратов и др., 2005). Авторы объясняют такую особенность климатическими условиями, характерными для этих территорий, пониженными температурами, pH, повышенной влажностью и дефицитом органического вещества. С понижением матричного давления до влажности, близкой к влаге завядания, в гидролитическом комплексе отмечается повышение численности гамма и альфа-протеобактерий и одноклеточных актинобактерий.

Таким образом, использование метода FISH, модифицированного нами для целей почвенной микробиологии, позволило установить особенности в структуре гидролитического микробного комплекса исследуемых почв в условиях действия различных экологических факторов (температуры и влажности). Внутри домена Bacteria при средней влажности (60% от полной влагоемкости) и температуре (27°С) среди пектинолитических и хитинолитических доминантов исследуемых комплексов преобладают представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры увеличивается численность грамотрицательных альфа- и бета-протеобактерий. При понижении влажности и

возрастании температуры в исследуемых прокариотных микробных комплексах увеличивается численность актинобактерий, что заслуживает особого внимания.

7.2 Исследование компонентного состава гидролитических почвениы-х комплексов методом ДГГЭ-анализа амплифицированных фрагментов гена гЬЩА.

ДГТЭ-анализ (денатурирующий градиентный гель-электрофорез суммарного амплификата фрагментов гена 16Б гК№\) бьш применен для состава оценки сложности микробных гидролитических комплексов почв и различий в структурах их доминантных составляющих (рис. 16).

Для анализа использовали суммарную ДНК, выделенную из микрокосмов чернозема и бурой пустынно-степной почв, инкубируемых при различных температурах и значениях влажности с внесением полисахаридов и без них.

На полученных профилях ДГГЭ (рис.16 а) интенсивность и количество дискретных полос в образцах с добавлением пектина и хитина были выше по сравнению с контрольными образцами. Установлена практически полная идентичность ДГГЭ-профилей образцов, инкубированных при различных значениях давления почвенной влаги, с дендрограммой кластерного анализа общей биомассы всех исследуемых филогенетических групп (рис. 16 б).

; г

Пектин, -800 кПа Хитин, -800 к Па Контроль, -вООчПа

Хигик, -0.5 «Па Контроль, -0.5 к Па Пектин, -0,5 «Па Пектин, -3,2 «Га Контроль, -3,2 кПа Хитин, -3,2 кПа

10 20 30 40 50

Рис. 16. ДГТЭ профиль амплифицированных фрагментов гена 168 г!ША почвенных микробных комплексов чернозема при внесении полисахаридов и различных значениях давления почвенной влаги

В целом, для всех исследованных образцов влажность в большей степени влияла на ДГГЭ-профиль, чем тип вносимого субстрата. Филогенетическое дерево, представленное на рис. 17, объединяет результаты ДГГЭ-анализа амплифицирован-ных фрагментов гена 16S rRNA почвенных комплексов.

Сиквенс-анализ некоторых характерных ДГГЭ полос выявил в образцах почв с хитином, инкубируемых при 5°С, присутствие сиквенсных типов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteriacea (.Janthinobacterium, Massilia) группы Betaproteobacteria (рис. 17, кластер а). Большинство проанализированных последовательностей из комплекса, развивающегося при 27°С, относилось к филуму Bacteroidetes (кластер с). Характерные полосы ДГГЭ, выявленные при анализе ДНК, выделенной из образца, инкубированного при 50°С, принадлежали представителям семейства Xanthomonadaceae гаммапротеобактерий, среди которых наиболее близкими оказались бактерии рода Lysobacter (кластер Ь).

Таким образом, комбинирование двух молекулярно-биологических методов, FISH и DGGE, дало возможность информативно оценить различия в структуре доминантных составляющих гидролитических комплексов почв, формирующихся при различных температурах и влажностях. Среди сиквенсных типов, полученных методом ДГГЭ, были представители, изолированные нами методом посева на плотные питательные среды.

Заключение

В работе приведено комплексное исследование структуры и функциональной активности гидролитических микробных почвенных комплексов с использованием широкого набора молекулярно-биологических и классических методов, что позволило многосторонне охарактеризовать биологическую активность изучаемых экосистем. В зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов и времени сукцессии разработанная модификация флюоресцентномикроскопического метода гибридизации in situ (FISH) дала возможность оценить численность и выявить филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических (хитинолитических и пектинолитических) комплексов вертикальных ярусов наземных экосистем. Оказалось, что численность метаболически активных клеток гидролитических комплексов составляет третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного, наземного и почвенного ярусов биогеоценозов, определяемой окрашиванием акридиновым оранжевым.

• FJ391493 Oxalobacteraceae bacterium е... EF650937Unc. Jarthinobactertum sp. A... —О chernosem 27 chit LAM412138Masslllasp. P-105

-О chernosem 5 chit

EU730926.1 Massllla timmae 'EF575567 Beta proteobacterlum DQ39M91 Uncul.beta proteobactertum FJ165491 Oxalobacteraceae Bacterium q/13

— О Pust 5 chit

L FR691428 Beta proteobacterium R-36978 i FR774560Xanthomonadaceaebactetlun L...

T— HM163243 Gamma proteobacterium OR-187 I—О Pust 50 chit

GQ369134 Lysobacter oiyzae YC6269 EU376963 Lysobacteroiyzae YC6269 I— О chernosem 50 chit EU83

Mlc

"If

I-AF

EU833999 Lysobacter sp. RCML-52 EU328034 Unc. Cytophagales bacterium ... HQ396933 Unc. Bacteroidetes bacterium... AF348716 Unc. Cytophaga sp. MPO-32

-FJ218352 Bacteroidetes bacterfum S154

■ AM990877 Bacteroidetes bacteriun MOLA... 1001AY162091 Bacteroidetes bactetlun GMDJ... -О Pust 27 chit

100.GU271825 Unc. Bacterddes sp.4 225 IGU271431 Unc. Cytophaga sp. 1 272 — О chernosem 27 chit

loo IО Pust 27 control

J Л

С)

'О Pust27 chit 33rAF5505M Bacteroidetes bacterium Ko31(2) ~L NR 025822 Gillisia mltskftlchlae KMM ... щ .AJ244698 Fiaobacterlum sp. V4.BS.09 AJ244698 Fla\obacterlum sp. V4.BS.09(2) - FR691444 Gilll sla sp. R-36928 EU196XO Gillisia sp.NPB

1001

Рис. 17. Дендрограмма, основанная на результатах DGGE-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA почвенных комплексов. Опытные варианты обозначены кружками. Дерево построено с помощью алгоритма neighbour-joing, масштаб соответствует 5 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов, цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap» - анализа 1000 альтернативных деревьев. Буквенные обозначения выделенных кластеров см. в тексте

Доминировали в гидролитических комплексах, преимущественно, представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространствешю-сукцессионного ряда. Если деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа- и бета-), то в гидролитических комплексах почв всех исследуемых типов, увеличивается доля фирмикут и актинобактерий за счет уменьшения доли протеобактерий. Таким образом, в каждом ярусе формируется специфический гидролитический прокариотический комплекс.

Применение метода анализа суммарного амплификата 16S rRNA методом ДГГЭ показало существенно большее число компонентов гидролитического комплекса в образцах с добавлением полисахаридов по сравнению с контрольными (фоновыми) вариантами. Сиквенс-анализ характерных ДГГЭ полос во-первых выявил в образцах опытных микрокосмов спектр сиквенсных типов, сходных с группами, которые были определены флюоресцентным методом гибридизации клеток in situ (FISH) и, во-вторых, позволил охарактеризовать структуру комплексов. Для образцов филлосферы обнаружено присутствие филотипов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteriaceae класса Betaprateobacteria и семейству Acidobacteriaceae филлумаAcidobacteria. Бактериальный компонент в наземном ярусе (для образцов подстилки ) был представлен четырьмя филотипами, составляющими два филогенетических кластера, один из которых наиболее близок к семейству Enterobacteriaceae класса Gammaproteobacteria, второй - к семейству Clostridiaceae грамположительных бактерий. В почвенном ярусе гидролитический бактериальный компонент оказался наиболее разнообразным и включал 8 филотипов, принадлежащих к трем основным линиям эволюции бактерий: к семейству Chitinophagaceae филлума Bacteroidetes, семейству Bacillaceae грамположительных бактерий и филлуму Actinobacteria (роду Streptomyces).

Функциональная активность гидролитических комплексов в исследуемых

образцах почвенных микрокосмов, развивающихся при различных уровнях

экологически различных параметров (влажность, температура, время сукцессии) была

охарактеризована комплексом показателей, которые согласовывались между собой.

Для хитинолитического комплекса зарегистрировано образование фермента

хитиназы и определена динамика его концентрации в почвах, которая коррелировала

с величинами эмиссии диоксида углерода и накоплением биомассы микроорганизмов

в микрокосмах. При изменении экологических параметров в пределах заданных

величин степень увлажненности почвы оказывается более существенным фактором для развития хитинолитического микробного комплекса (чем внесение органических веществ и время сукцессии), при этом в большей степени для деятельности хитинолитического комплекса, чем пектинолитического. Изменение влажности оказывает координирующее влияние на развитие доминантных компонентов гидролитического комплекса. Так, с увеличением влажности в хитинолитическом микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных организмов, особенно, актинобактерий.

Была обнаружена новая функция актинобактерий (мицелиальных форм) в развитии гидролитического комплекса. Оказалось, что дыхание комплекса в широком диапазоне значений (влажности, поступления органического вещества, сукцессионного времени) может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых определяется не столько их непосредственной гидролитической активностью, сколько вкладом в контроль функционирования микробного комплекса, по-видимому, посредством характерной для актиномицетов продукции биологически активных веществ, в данном случае - с регуляторной функцией.

Эти результаты были подтверждены обнаружением в почвенных образцах функциональных генов. Так, методом «вложенного» ПЦР-анализа (nested PCR) с использованием специфических праймеров было выявлено наличие хитиназного гена (■chiA) группы Л (семейства гликозилгидролаз) в почвенных микробных комплексах in situ и чистых культурах микроорганизмов, изолированных из исследуемых почв. По результатам сиквенс-анализа полученных последовательностей хитиназного гена он принадлежал представителям ряда некультивируемых бактерий и филогенетических групп Actinobactería и Firmicutes. Наблюдалась корреляция между результатами, полученными при исследовании филогении функционального хитиназного гена, и филогении 16S rRNA, однако среди близкородственных организмов, у которых методом ДГГЭ был выявлен хитиназный ген, не всегда обнаруживались те, которые выделялись нами методом посева на плотные среды с хитином.

Внутри домена Bacteria при оптимальных для жизнедеятельности большинства

микроорганизмов условиях (влажность 60% от полной влагоемкости, температура

27°С) среди хитинолитических и пектинолитических доминантов исследуемых почв

выявляются представители филумов Firmicutes и Actinobactería. С возрастанием

влажности и понижением температуры отмечается увеличение представителей

филума Proteobacteria (альфа- и бета- классов), а с уменьшением влажности и

возрастанием температуры в прокариотном микробном комплексе усиливается роль

филума Actinobactería, что демонстрирует регуляторную роль комбинаций

экологических параметров для изменения филогенетического состава гидролитических комплексов.

Таким образом, совокупность методов молекулярно-генетического анализа гидролитических прокариотных комплексов позволила пополнить перечень и отметить разнообразие микроорганизмов-гидролитиков. Полученные результаты предполагают наличие горизонтального переноса хитиназных генов, как большинства генов биодеградации, локализованных в плазмидпой ДНК, внутри микробного комплекса. В приведенных исследованиях получена новая информация, интересная для понимания закономерностей стабильного существования и развития прокариотных гидролитических комплексов и важная для решения ряда почвоведческих и биотехнологических задач. Получение этой информации стало возможным благодаря применению целого комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов, модифицированных для анализа почвенных систем.

ВЫВОДЫ

1. Проведено комплексное исследование гидролитических прокариотных комплексов, формирующихся в зависимости от структуры биогеоценоза и экологических факторов (температуры, влажности, окислительно-восстановительного потенциала, органического вещества, времени).

2. Установлено, что численность физиологически активных гидролитических прокариотных комплексов, по данным модифицированного метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH), составляет третью часть от количества всех прокариотных организмов надземного (филлосфера), наземного (подстилка) и почвенного ярусов исследованных биогеоценозов. Выявлены различия в филогенетической структуре гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда: функциональными и филогенетическими доминантами при деструкции биополимеров в надземном ярусе являются представители группы Proteobacteria (альфа- и бета-), тогда как в почве усиливается роль бактерий групп Firmicutes и Actinobacteria.

3. Исследование структурных и функциональных показателей гидролитических микробных комплексов широкого ряда почв выявило, что наиболее активно процессы разложение полисахаридов протекают в черноземе и серой лесной почвах, где роль основных гидролитиков принадлежит прокариотам.

4. В черноземе впервые выявлены in situ молекулярные детерминанты хитинолитической активности микроорганизмов - фермент хитиназа и ген chi А (хитиназ группы А), принадлежащий представителям филогенетических групп Actinobacteria и Firmicutes. Эти филумы определены как доминирующие в прокариотном хитинолитическом комплексе чернозема совокупным применением классических методов посева из почвы и молекулярно-биологическими методами -гибридизации клеток in situ (FISH) и ДГГЭ-анализом денатурирующего градиентного гель-электрофореза.

5. Среди широкого ряда исследованных в условиях микрокосмов экологических факторов (температура, влажность, внесение органического вещества, время сукцессии), влияющих на развитие и функциональную деятельность гидролитических микробных сообществ почв, наиболее значимым оказывался уровень увлажненности почв, при этом в большей степени для хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитическим. Уровень влажности, обусловливающий максимальную активность гидролитического комплекса, определялся типом почвы.

6. Продемонстрировано соответствие филогенетического состава гидролитических комплексов каждой совокупности факторов (температура, влажность, органическое вещество), при которых формируется специфический микробный комплекс. При высоких уровнях увлажненности и температуры в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных организмов, в основном актиномицетов.

7. Обнаружена новая функциональная активность актиномицетов в гидролитическом прокариотном комплексе: их контролирующее влияние на уровень дыхания комплекса в широком диапазоне параметров (влажности, поступления органического вещества, сукцессионного времени).

8. При оптимальных для жизнедеятельности большинства микроорганизмов влажности (60% от полной влагоемкости) и температуре (27°С) среди пектинолитических и хитинолитических комплексов исследуемых почв внутри домена Bacteria доминантами являются представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры в прокариотном микробном комплексе возрастает доля протеобактерий (альфа- и бета-). С понижением влажности и возрастанием температуры отмечается увеличение одноклеточных актинобактерий.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК Минобриауки России для публикации основных результатов докторских диссертаций

1. Зенова Г.М., Грачева Т.А., Манучарова Н.А., Звягинцев Д.Г.. Актиномицетные сообщества лесных экосистем//Почвоведение. 1996. №11. С. 1347-1351.

2. Степанов А.Л., Манучарова, Н.А., Полянская Л.М. Продуцирование закиси азота бактериями в почвенных агрегатах // Почвоведение. 1997. № 8. С. 973-976.

3. Штина Э.А., Зенова Г.М., Манучарова Н.А. Альгологический мониторинг почв // Почвоведение. 1998. № 12. С. 1449-1461.

4. Манучарова Н.А., Степанов А.Л., Умаров М.М.. Особенности образования конечных продуктов денитрификации в водопрочных агрегатах почв разных типов // Почвоведение. 1999. №6. С. 634-638.

5. Судницын И.И., Манучарова Н.А., Степанов А.Л., Умаров М.М. Влияние микробиологических процессов на динамику окислительно-восстановительного потенциала в агрегатах суглинистых почв различного генетического типа // Почвоведение. 1999. №7. С. 866-870.

6. Манучарова Н.А., Добровольская Т.Г., Степанов А.Л. Таксономический состав денитрифицирующих бактерий в дерново-подзолистой почве // Микробиология.

2000.Т.69. №2. С.214-219.

7. Манучарова Н.А., Степанов А.Л., Умаров М.М. Особенности микробной трансформации азота в водопрочных агрегатах почв разных типов // Почвоведение.

2001. №10. С.1261-1267.

8. Манучарова Н.А., Сазонов С.Н., Садовская Э.Н., Степанов А.Л., Умаров М.М. Влияние минеральных удобрений на эмиссию закиси азота из дерново-подзолистой почвы//Почвоведение. 2002. №5. С. 532-536.

9. Норовсурэн Жадамбаа, Манучарова Н.А., Зенова Г.М. Актиномицеты редких родов пустынных экосистем Монголии // Почвоведение. 2003. №8. С.967-972.

10. Норовсурэн Жадамбаа, Зенова Г.М., Манучарова Н.А., Шильникова В.К. Динамика популяций редких родов актиномицетов в пустынной почве Монголии // Почвоведение. 2003. №10. С.1235-1238.

11. Zvyagintsev D.G., Umarov М.М., Chernov I.Yu., Marfenina O.E., Lysak L.V., Guzev V.S., Volde M.I., Kurakov A.V., Stepanov A.L.,.ManucharovaN.A. Microbial communities in soil degradation and self-restoration processes // Eurasian Soil Science. 2003.V.36. Suppl.l. P.S25-S42.

12. Сазонов C.H., Манучарова H.A., Горленко M.B., Терехов А.В., Умаров М.М. Оценка микробиологического состояния дерново-подзолистой почвы, выведенной из сельскохозяйственного использования // Почвоведение. 2004. №3. С. 373-377.

13. Манучарова Н.А., Белова Э.В., Полянская Л.М., Зенова Г.М. Хитинолитический актиномицетный комплекс чернозема//Микробиология. 2004. Том. 73, №1. С.67-72.

14. Manucharova N.A., Yaroslavtsev A.M., Belova E.V., Sazonov S.N., Stepanov A.L. Microbial chitin transformation in soil//Phytopedon (Bratislava). 2005.V. 4. №1. P. 99-103.

15. Сазонов C.H., Манучарова H.A., Горленко M.B., Умаров М.М. Микробиологическая оценка процесса самовосстановления дерново- подзолистой почвы // Почвоведение. 2005. №5. С.575-580.

16. Манучарова H.А., Белова Э.В., Воробьев А.В., Полянская Л.М., Степанов A.JI. Сукцессия хитинолитических микроорганизмов в черноземе // Микробиология. 2005. Том. 74. №5. С.693-698.

17. Степанов А.Л., Манучарова Н.А., Смагин А.В., Курбатова А.С., Мягкова А.Д., Башкин В.Н. Характеристика биологической активности городских почв // Почвоведение. 2005. №8. С.978-983.

18. Степанов А.Л., Манучарова Н.А., Смагин А.В., Курбатова А.С., Мягкова А.Д., Башкин В.Н. Оценка функционального микробного комплекса городских почв // Вестник Московского ун-та. Сер. 17 Почвоведение. 2005. №3. С. 18-22.

19. Манучарова Н.А., Ярославцев А.М., Сенченко Д.В., Степанов А.Л., Звягинцев Д.Г. Микробная трансформация хитина в почвах в анаэробных условиях // Известия РАН. Серия Биологическая 2006. №2. С.239-243.

20. Манучарова Н.А., Белова Э.В., Степанов А.Л., Полянская Л.М. Трансформация хитина микробным комплексом различных почв // Почвоведение. 2006. №9. 10881097.

21. Павлова Н.Н., Егорова Е.И., Степанов А.Л., Манучарова Н.А. Биодиагностика экологического состояния почв в районе расположения предприятия атомной энергетики //. Вестник Московского ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2006. №4. С. 33-39.

22. Манучарова Н.А, Власенко А.Н., Степанов А.Л. Температура как аутэкологический фактор формирования хитинолитического микробного комплекса в почвах // Известия РАН. Серия Биологическая 2007. № 2. С. 205-211.

23. Воробьев А.В., Манучарова Н.А., Ярославцев А.М., Белова Э.В., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И. Состав хитинолитического микробного комплекса и его влияние на разложение хитина при различных уровнях влажности // Микробиология. 2007. том 76. №5. С. 632-638.

24. Манучарова Н. А., Ярославцев А. М., Степанов А. Л., Смагин А.В., Звягинцев Д. Г., Судницын И.И.. Образование метана и рост микроорганизмов при различной влажности почв с внесением и без внесения хитина // Почвоведение. 2007. №8. С.961-967.

25. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Турова Т.П., Пантелеева А.Н., Степанов А.Л., Зенова Г.М. Термофильный хитинолитический микробный комплекс бурой пустынно-степной почвы // Микробиология. 2008. №5. С.683-688.

26. Манучарова Н. А., Власенко А. Н., Зенова Г.М., Добровольская Т. Г., Степанов А. Л. Методические аспекты определения использования хитина почвенными микроорганизмами // Известия РАН. Серия Биологическая. 2008. №5. С. 635-640.

27. Зенова Г.М., Лысенко А.М., Манучарова Н.А., Курапова А.И., Дуброва М.С. Таксономическая и функциональная структура психротолерантных и термотолерантных комплексов почвенных актиномицетов // Теоретическая и прикладная экология. 2008. №3. С. 66-72.

28. ManucharovaN. A. The Microbial Destruction of Chitin, Pectin, and Cellulose in Soils // Eurasian Soil Science. 2009. V. 42. Suppl. 13. pp.1526-1532.

29. Ярославцев A.M., Манучарова H.A., Степанов A. Л., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И. Микробное разложение хитина в почвах при различных уровнях влажности // Почвоведение. 2009. №7. С. 857-866

30. Кухаренко О.С., Манучарова Н.А., Добровольская Т.Г. Особенности бактериальных сообществ гидроморфных почв северных регионов // Вестник Московского ун-та. Сер. 17 Почвоведение. 2010. №4. С.308-312.

31. Зенова Г.М., Манучарова Н.А., Дуброва М.С. Температурные адаптации мицелиальных бактерий почв тундры и тайги // Теоретическая и прикладная экология. 2010. №4. С.65-71.

32. Поздняков Л.А., Степанов А.Л., Манучарова Н.А. Анаэробное окисление метана в осушенных торфяных и дерново-подзолистых почвах // Вестник Московского ун-та. Сер. 17 Почвоведение. 2011. №1. С. 27-33.

33. Манучарова Н.А., Власенко А.Н., Менько Е.В., Звягинцев Д.Г. Специфика хитинолитического микробного комплекса в почвах, инкубируемых при различных температурах // Микробиология. 2011. Т.80. №2. С219-229.

34. Зенова Г.М., Манучарова Н.А., Звягинцев Д.Г. Экстремофильные и экстремотолерантные актиномицеты в почвах разных типов // Почвоведение. 2011. №4. С. 457-478.

35. Дуброва М.С., Лубсанова Д.С., Макарова, Кожевин П.А., Манучарова Н.А., Зенова Г.М. Психротолерантные актиномицеты почв зоны тундры и северной тайги // Вестник Московского ун-та. Серия 17 Почвоведение. 2011. №2. С.3-8.

36. Манучарова Н.А., Ярославцев A.M., Степанов А.Л., Судницын И.И., Кожевин П.А. Влажность как экологический фактор формирования почвенного гидролитического микробного комплекса// Вестник Московского ун-та. Серия 17 Почвоведение. 2012. №1. С.29-36.

37. Курапова А.И., Зенова Г.М., Кизилова А.К., Манучарова Н.А., Норовсурэн Ж., Звягинцев Д.Г. Термофильные и термотолерантные актиномицеты в пустынных почвах Монголии// Микробиология. 2012. Т.81. №1. С.98-108.

Статьи в сборниках и журналах:

38. Stepanov A., Hattori Т., Manucharova N., Polanskaiy L. Microbial transformation of carbon and nitrogen compounds within soil aggregates // Workshop XVI Intern. Congress of Soil Science. Montpellier, France, 1998. P.71-73.

39. Stepanov A.L. ..Manuchrova N.A. Nitrous oxide and methane production within soil aggregates at ambient oxygen atmosphere // The Royal Veterinary and Agricultural University Copenhagen, Denmark. 1999. Vol.1. C.527-533.

40. Manucharova N.A., Sazonov S.N. Emission of nitrous oxide from cultivated sward-podzolic soil // Materials of Intern. Congress "Non-C02 Greenhouse Gases". Holland. 2001. P. 345-347.

41. Kozlova E., Stepano A., Manucharova N. Changes of Carbon Dioxide Emission From Agricultural Soils Under the Influence of Mineral Fertilizers // Materials of 6-th Int. Carbon Dioxide Conf., Ext. Abs., Vol. 1, 2001, Sendai, Japan, Oct. 1-5, P. 548-550.

42. Stepanov A.L., Manucharova N.A. and Tsutomu H. The role of aggregates in biosphere production and consumption of greenhouse gases in soils // Materials of the international symposium "Functions of soils in the geosphere-biosphere systems". Moscow. 2001. p. 176178.

43. Manucharova N.A.,Sazonov S.N., Stepanov A.L. Microbial productoin of nitrous oxide in cultivated soil // Materials of 17 World Congress of Soil Science, Vol. 3, Symposium № 65, 2002, Thailand, Bangkok, P.211-213.

44. Kozlova E.A., Stepanov A.L., Manucharova A.N. Changes of greenhouse gases emission from agricultural soils under the influence of mineral fertilizers // Materials of 17 World Congress of Soil Science, Vol. 3, № 65, 2002, Thailand, Bangkok P.314-316.

45. Сазонов С.Н., Манучарова H.A., Умаров М.М. Сравнительная оценка потока парниковых газов из дерново-подзолистой почвы, подверженной разным периодам самовосстановления // Труды международного биотехнологического центра МГУ им. М.В.Ломоносова. М. Изд-во Спорт и культура. 2004. С. 158-162.

Коллективные монографии:

46. Звягинцев Д.Г., Умаров М.М., Чернов И.Ю., Марфенина O.E., Лысак Л.В., Гузев B.C., Волде М.И., Кураков A.B., Степанов А.Л., Манучарова H.A. Микробные сообщества и их функционирование в процессах деградации и самовосстановления почв // Деградация и охрана почв / Под ред. Акад. РАН Г.В.Добровольского. М.: Изд-во Московского ун-та. 2002. С. 401-455.

47. Зенова Г.М., Омарова Е.О., Орлеанский В.К., Жегалло Е.А., Манучарова H.A. Возникновение биожизни на планете Земля и микроорганизмы // Современные проблемы палеофлористики, палеофитогеографии и фитостратеграфии: Выпуск 1. М.: Изд-во ГЕОС. 2005. С.102-106.

Учебные пособия:

48. Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева A.A., Манучарова H.A. Практикум по биологии почв. Учебное пособие. Гриф УМО. М.: Изд-во Московск.ун-та. 2002. 120 с.

49. Зенова Г.М., Захарова О.С., Манучарова H.A. Экология актиномицетов рода Actinomadura. Учебное пособие. Гриф УМО. М.: Изд-во МАКС Пресс. 2004. 100 с.

50. Степанов А.Л., Манучарова H.A. Образование и поглощение парниковых газов в почвенных агрегатах. Учебное пособие.Гиф УМО. М.: Изд-во Московск.ун-та. 2006. 81 с.

51. Манучаров A.C., Манучарова H.A., Дмитриев Е.Д. Математическая статистика для почвоведов. Учебное пособие. Гриф УМО. М.: Издательство Московск. ун-та. 2006. 84 с.

52. Манучарова H.A. Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флюоресцентномикроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridisation (FISH). Учебное пособие. Гриф УМО. М.: Издательство Московск. ун-та. 2008.24 с.

53. Манучарова H.A. Молекулярно-биологические аспекты исследований в экологии и микробиологии. Учебное пособие. Гриф УМО. М.: Издательство Московск. ун-та. 2010.48 с.

54. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Манучарова H.A. Экстремофильные и экстремотолерантные актиномицеты в наземных экосистемах. Учебное пособие. Гриф УМО. М.:Изд-во Университетская книга. 2011. 136 с.

Тезисы докладов:

55. Манучарова H.A. Микробная регуляция потока закиси азота из почв в атмосферу // Тезисы докладов Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-96, Москва. 1996. С. 23

56. Степанов А.Л., Костина Н.В., Манучарова H.A., Соколов М.А. Микробная регуляция потока закиси азота (N20) из почв в атмосферу в процессе денитрификации

// Тезисы докладов II-го съезда общества почвоведов России. Санкт-Петербург. 1996. С.76.

57. Зенова Г.М., Лихачева A.A., Манучарова H.A. Специфические связи водорослей и актиномицетов в наземных экосистемах // Тезисы докладов конференции "Эколого-физиологические исследования водорослей и их значение для оценки состояния природных вод". Пос. Борок (Ярославская обл.). 1996. С. 28.

58. Манучарова H.A. Микробная трансформация соединений углерода и азота в почвенных агрегатах // Тезисы докладов Международной конференции студентов и аспирантов по (фундаментальным наукам Ломоносов-97, Москва. 1997. С.54.

59. Манучарова H.A. Образование и поглощение газообразных соединений азота микроорганизмами в водопрочных агрегатах почв разных типов // Тезисы докладов Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным паукам Ломоносов-98, Москва. 1998.С.43.

60. Манучарова H.A., Степанов А.Л., Умаров М.М. Динамика образования и поглощения закиси азота в водопрочных агрегатах // Тезисы докладов Всероссийской конференции «Микробиология почвы и земледелие», Санкт-Петербург. 1998. С.23. 61.Зенова Г.М., Лихачева А. А., Манучарова H.A. "Актинолишайники на скальных породах". Тезисы докладов Международной конференции "Вулканизм и биосфера", Туапсе. 1998 С. 75-76.

62. Манучарова H.A. Таксономический состав денитрифицирующих бактерий в водопрочных агрегатах дерново-подзолистой почвы // Тезисы докладов Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-99, Москва. 1999. С. 84.

63. Манучарова H.A., Садовская Э.Н., Степанов А.Л., Умаров М.М. Газообразные потери азота почвой при внесении удобрений // Доклады симпозиума «Лизиметрические исследования в агрохимии, почвоведении, мелиорации и агроэкологии», п. Немчиновка.1999. С. 92-95.

64. Манучарова H.A., Сазонов С.Н. Активность денитрифицирующих микроорганизмов при внесении азотных удобрений // Всероссийская конференция «Проблемы экологии и физиологии микроорганизмов». Сб. трудов научи, конф. к 110-летию проф. Е.Е. Успенского. М. Диалог МГУ. 2000. С. 39.

65. Манучарова H.A. Образование и потребление окислов азота в водопрочных агрегатах почв разных типов // Национальная конференция с международным участием «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». Пущино. 2000. С. 97.

66. Сазонов С.Н., Манучарова H.A. Эмиссия закиси азота из дерново-подзолистой почвы // Национальная конференция с международным участием «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии». Пущино. 2000. С.76.

67. Умаров М.М., Степанов А.Л., Костина Н.В., Манучарова H.A. Газообразные потери азота из почв агроэкосистем // Тезисы докладов III Съезда Общества Почвоведов. Сим.: Биолого-агрохимическая оценка азотного состояния почв. Кн. 1.Суздаль. 2000. С. 109.

68. Постников A.B., Садовская Э.Н., Манучарова H.A. Влияние агрохимических приемов на интенсивность процессов азотного цикла в почве // Тезисы докладов III Съезда Общества Почвоведов. Сим.: Роль биоты в морфогенезе почв. Кн. 1.Суздаль. 2000. С. 123.

69. Манучарова H.A., Сазонов С.Н. Влияние агрохимических приемов на газообразные потери азота почвой // Тезисы докладов III Съезда Общества Почвоведов. Кн.2.Суздаль. 2000. С.39.

70. Манучарова H.A., Сазонов С.Н. Влияние минеральных удобрений на газообразные потери азота почвой // Тезисы докладов научной конференции "Растение и почва". Москва. 2001. С. 25.

71. Sazonov S.N., Manucharova N.A. Emission of nitrous oxide from cultivated sward-podzolic soil // Materials of the international symposium «Functions of soils in the geosphere-biosphere systems». Moscow. 2001. P.173.

72. Манучарова H.A., Самсонова K.E., Сазонов C.H., Степанов А.Л. Влияние минеральных удобрений на активность азотфиксации и эмиссию азотсодержащих газов из почв в атмосферу // Международная научная конференция «Экология и биогеохимическая деятельность микроорганизмов». Одесса. 2001. С. 56.

73. Сазонов С.Н., Самсонова Е.Е., Манучарова H.A. Оценка влияния минеральных удобрений и их последействия на газообразные потери азота и азотфиксацию в дерново-подзолистой почве // Биология - наука XXI века. Сборник тезисов 6-й Путинской школы-конференции молодых ученых. 2002. С. 67-68.

74. Манучарова H.A., Белова Э.В. Разложение хитина почвенными актиномицетами // Биология - наука XXI века. Сборник тезисов 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых. 2002. С. 42-43.

75. Сазонов С.Н., Манучарова H.A. Оценка потока парниковых микрогазов из почвы при последействии минеральных удобрений // Биология - наука XXI века. 7-ая Путинская школа молодых ученых. 2003. С.423.

76. Сазонов С.Н, Манучарова H.A. Поток парниковых микрогазов из почвы, выведенной из сельскохозяйственного использования // Микробиологические аспекты процессов эмиссии и стока парниковых микрогазов. Пущино. 2003. С.100-101.

77. Manucharova N.A. Beiova E.V. Peculiarity of chitinolitic actinomycetes complex in soil. Australia. 2003. P. 74.

78. Манучарова H.A., Белова Э.В. Эмиссия парниковых микргазов из почв при внесении хитина // Микробиологические аспекты процессов эмиссии и стока парниковых микрогазов. Пущино. 2003. С.17-18.

79. Сенченко Д.В., Манучарова H.A. Сообщество сапротрофных прокариотных организмов гиперсоленых лагун Сиваша // Биология - наука XXI века. 7-ая Путинская школа молодых ученых. 2003. С.426.

80. Сенченко Д.В., Манучарова H.A. Сапротрофное прокариотное сообщество соленых лагун Сиваша // Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии. Улан-Удэ. 2003.С.112-114.

81. Сенченко Д.В., Манучарова H.A. Оценка сапротрофного прокариотного комплекса соленых лагун Сиваша // Труды международного биотехнологического центра МГУ имени М.В.Ломоносова. М. Изд-во Спорт и культура. 2004. С. 169-172.

82. Манучарова H.A., Белова Э.В., Степанов А.Л. Особенности микробной трансформации хитина в почве // Материалы IV Съезд Всероссийского общества почвоведов. Новосибирск. 2004. Кн.1. С.649.

83. Степанов А.Л., Манучарова H.A., Судницын И.И., Кожевин П.А. Биосферная функция почвенных агрегатов // Материалы IV Съезд Всероссийского общества почвоведов. Новосибирск. 2004. Кн.1. С.54.

84. Manucharova N.A., Yaroslavtsev A.M., Vorob'ov A.V., Belova E.V. Microbial chitin transformation in soil // Ecosystems of Mongolia and frontier areas of adjacent countries: Natural resources, biodiversity and ecological prospects. 2005. P. 386-387.

85. Манучарова H.A, Белова Э.В., Сенченко Д.В., Ярославцев А.Л., Сазонов С.Н. Трансформация хитина микробным комплексом почв основных типов Европейской части России // Проблемы сохранения, восстановление и обогащение биоразнообразия в условиях антропогенно измененной среды, Кривой Рог. 2005. С. 460-461.

86. Степанов А.Л., Манучарова Н.А., Умаров М.М., Судницыи И.И. Функции микробиоты почвенных агрегатов в биосферных процессах // Сб. Биосферные функции почвенного покрова. Пущино. 2005. С. 51.

87. Manucharova N.A., Yaroslavtsev A.M., Belova E.V., Stepanov A.L. Ecological role of microbial chitiniclastic complex in soil. 18th World Congress of Soil Scicnce. 2006. Philadelphia, USA. P.110.

88. Manucharova N.A., Yaroslavtsev A.M., Belova E.V., Stepanov A.L. Chitiniclastic microbial complex in soils. 10th International Conference on Chitin & Chitosan Montpellier (France). 2006. P.95.

89. Манучарова H.A. Мониторинг развития микробной деструкции хитина и целлюлозы в почвах. V Съезд Всероссийского общества почвоведов. Ростов на Дону. 2008. С.68-69.

90. Манучарова Н.А. Разложение полисахаридов в почвах разных типов. Доклад на научной конференции «Ломоносовские чтения». Секция Почвоведение. 16.04.2009. http://soil.msu.ru/index.php?option=com content&task=view&id=1336&Itemid=218

91. Манучарова Н.А. Мониторинг микробной деструкции полисахаридов в почвах. Доклад на научной конференции «Чтения памяти академика В.Е. Соколова» в институте проблем экологии и эволюции А.Н.Северцева. РАН. 04.02.2009.

92. Kriagevskich N.A., Demkina E.V., Soina V.S., Manucharova N.A., and EL-Registan G.I. Modifications of the standart methods of bacterial reactivation from permafrost sediments // X European Workshop on Astrobiology (EANA'2010) Russia, Pushchino, Theme 2: Life in extreme environment. 2010. P.25-26. www.astrobiologia.pl/eana/

93. Рапопорт A.M., Власенко A.H., Манучарова H.A. Гидролитические микробные сообщества и их роль в наземных экосистемах. «Материалы Всероссийской научной конференции XIV Молодежные Докучаевские чтения - 2011», СПб: СПбГУ, 2011, С. 359-360.

Отпечатано в типографии ООО «Даймонд Тим» 115280, г. Москва, 2-ой Автозаводский пр-д, д. ЗА Тираж 150 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Манучарова, Наталия Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

Актульность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость.

Основные защищаемые положения.

Апробация работы.

Публикации.

Благодарности.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Вертикально-ярусная структура сообществ микроорганизмов.

1.2 Полисахариды (хитин и пектин) в природных экосистемах.

1.2.1 Хитин.

1.2.2 Пектиновые вещества.

1.2.3 Сферы применения исследуемых полисахаридов.

1.3 Микроорганизмы и гидролитические ферментные комплексы в наземных экосистемах.

1.3.1 Хитинолитические ферментные системы.

1.3.2 Пектинолитические микробные комплексы.

1.3.3 Воздействие экологических факторов на основные группы хитинолитических и пектинолитических микроорганизмов.

1.4 Молекулярно-биологических анализ хитинолитических сообществ в природных экосистемах.

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Постановка эксперимента по инициации микробной сукцессии.

2.2.2 Изучение эмиссии диоксида углерода и метана из исследуемых микрокосмов.

2.2.3 Определение численности разных групп микроогранизмов люминесцентномикроскопическим методом.

2.2.4 Определение структуры прокариотного хитинолитического и пектинолитического сообществ почв методом FISH.

2.2.5 Выделение суммарной ДНК из исследуемых микрокосмов и амплификация фрагментов генов 16S rRNA и chiA.

2.2.6 Денатурирующий градиентный гель-электрофорез.

2.2.7 Филогенетический анализ.

2.2.8 Получение и идентификация чистых культур хитинолитических микроорганизмов.

2.2.9 Оценка интенсивности потребления хитина чистыми культурами микроорганизмов.

2.2.10 Определение интенсивности образования хитиназы чистыми культурами микроорганизмов.

2.2.11 Определение хитиназной активности in situ.

ГЛАВА 3 ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ПРОКАРИОТНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ПРОСТРАНСТВЕННО-СУКЦЕССИОННОМ РЯДУ НАЗЕМНЫХ ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМ.

ГЛАВА 4 РАЗЛОЖЕНИЕ БИОПИЛИМЕРОВ (ХИТИНА И ПЕКТИНА) ПОЧВЕННЫМИ ГИДРОЛИТИЧЕСКИМИ МИКРОБНЫМИ КОМПЛЕКСАМИ.

ГЛАВА 5 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕКЦИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ХИТИНАЗ В ПОЧВЕННЫХ СИСТЕМАХ.

ГЛАВА 6 ВОЗДЕЙСТВИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ПОЧВЕННЫХ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ МИКРОБНЫХ КОМПЛЕКСОВ.

6.1 Влияние почвенной влаги на функциональную активность микробных гидролитических комплексов.

6.2. Влияние температуры на функциональную активность микробов-гидролитиков.

6.3 Корреляция накопления биомассы и активности хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов почв, развивающихся при различных паметрах температуры и давления почвенной влаги.

6.4 Анализ структурных и функциональных показателей развития гидролитического микробного комплекса.

ГЛАВА 7 МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПОЧВ, РАЗВИВАЮЩИХСЯ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ЗНАЧЕНИЯХ ВЛАЖНОСТИ И ТЕМПЕРАТУРЫ

7.1 Исследование прокариотных хитинолитических и пектинолитических комплексов почв in situ методом FISH.

7.2 Исследование компонентного состава гидролитических почвенных комплексов методом ДГГЭ-анализа амплифицированных фрагментов гена 16S rRNA.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем"

Актуальность проблемы

Масштабы развития микробных гидролитических комплексов и эффективности микробной деструкции биополимеров, в частности, полисахаридов различны в биогеоценозах разных климатических зон, однако в научной литературе имеется лишь первичная информация о структурном разнообразии и устойчивости микробных гидролитических комплексов при изменении экологических факторов. Долгое время считалось, что основной группой организмов, обладающих комплексом гидролитических ферментов, являются грибы. За последнее десятилетие появляется все больше информации о способности прокариот синтезировать самые различные деполимеразы (De Boer, 2001; Schrempf, 2001; Bhattacharya, 2007), что ставит вопрос о пересмотре роли этой группы микроорганизмов в превращении органических соединений и круговороте веществ в природе. Не все прокариоты обладают полным комплектом гидролитических ферментов, в следствие чего степень разложения полимеров разными группами прокариот различна. Интенсивность деятельности прокариот - деструкторов, как и всех микроорганизмов, очень сильно зависит от экологических факторов, в том числе температуры, влажности, окислительно-восстановительных условий, осмотического давления почвенных растворов и др. (Gohel et al., 2006). Выявление закономерностей устойчивости и функциональной активности гидролитических прокариотных сообществ в широком диапазоне изменений основных экологических факторов важно для решения задач почвенного плодородия и запросов биотехнологии, связанных с переработкой возобновляемого сырья.

Поступающие в природную систему полисахариды различного строения чрезвычайно широко распространены в природе и являются важным источником органических веществ. Такие полисахариды как хитин, пектин, целлюлоза, постоянно присутствуя в наземной системе, составляют возобновляемый пул органического углерода и азота (De Boer, 2004, Parcham, Deng, 2000). Содержание полисахаридов в почвах разного типа колеблется в пределах от 0,06% до 3,0% от массы почвы и от 1% до 14% от массы органического вещества почв. В почвы с растительными остатками ежегодно поступает от 2 до 14 т/га полисахаридов, значительная часть которых минерализуется или участвует, в качестве структурных элементов, в формировании гуминовых кислот (Gomez, 2004). Для включения элементов питания в биологический круговорот необходима деструкция полисахаридов, которую осуществляют соответствующие ферментные комплексы микроорганизмов. Как в России, так и за рубежом эта область исследований практически не затронута. Хотя имеется обширнейшая научная и технологическая литература по вопросам синтеза микробных гидролаз в лабораторных и промышленных условиях и по их применению в различных областях хозяйственной отрасли, медицине и сельском хозяйстве. Опубликованные в мировой научной литературе материалы по предлагаемой проблеме, как правило, содержат результаты исследований микробных деполимераз (хитиназ, целлюлаз, лигниназ и др.), не в естественных системах, а получаемых из культур микроорганизмов, инкубируемых на искусственных питательных средах.

В последнее время большой интерес вызывают хитиназы и препараты, полученные с их помощью, как перспективные экологически безопасные средства биологического контроля за фитопатогенными грибами и средства защиты растений от инфекций и биосорбенты широкого назначения (Eltarabily, 2000; De Boer, 1998; Downing, Thomson, 2000; Kobayashi et al., 2002). Кроме того, на основе процессов микробной деструкции полисахаридов, особенно деятельности хитиназ, могут быть разработаны эффективные способы биоремедиации и детоксикации почв. Однако, проблема микробной деструкции полисахаридов в естественных системах, особенно почвах, несмотря на свою высокую востребованность, до настоящего времени почти не изучалась. Изучение структурного и функционального разнообразия гидролитических микробных комплексов, локализованных в вертикальных ярусах, поможет составить более полное представление о поэтапном разрушении биополимеров в наземных биогеоценозах и оценить роль различных групп микроорганизмов на разных стадиях этого процесса.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Оценить разнообразие и определить численность отдельных филогенетических групп прокариотных метаболически активных микроорганизмов - гидролитиков в наземных экосистемах, различающихся параметрами основных экологических факторов.

2. Разработать методические подходы для определения молекулярно-биологическими методами in situ таксономического разнообразия прокариот - гидролитиков (хитинолитиков и пектинолитиков) и их метаболической активности.

3. Проанализировать динамику функциональных и структурных показателей (дыхание, численность, биомасса) метаболически активных микроорганизмов - гидролитиков в микробных комплексах наземных экосистем при различных параметрах основных экологических факторов в наземных экосистемах.

4. Выявить наиболее активные группы прокариот, участвующих в разложении биополимеров (хитина и пектина) в наземных экосистемах; выделить и определить видовое разнообразие доминантов гидролитичеких сообществ методами полифазной таксономии, включая использование как фенотипических, так и молекулярно-генетических критериев. !

Научная новизна

Впервые с использованием метода FISH оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических (хитинолитических и пектинолитических) комплексов наземных экосистем в зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов. Численность, метаболически активных гидролитических прокариот составила третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного (филлосфера), наземного (подстилка) и почвенного ярусов экосистем. Установлено, что деструкция полисахаридов осуществляется преимущественно представителями филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа- и бета-); в почвенном гидролитическом комплексе уменьшается доля протеобактерий и увеличиваются доли фирмикут и актинобактерий.

Установлена высокая активность (по структурным и функциональным показателям) минорных по биомассе компонентов микробного сообщества -мицелиальных и одноклеточных прокариот, проявляемая при гидролизе полисахаридов в широком диапазоне температур. При этом, в процессах деструкции хитина, особенно велика роль актиномицетов.

Практическая значимость

Проведение исследований было поддержано грантами РФФИ (проекты 11-04-0093la; 11-04-92202-Монга; 00-04-49162а; 02-04-49061а; 05-04-49252а; 08-04-01233а; 06-04-48165а; 08-04-90201-Монга; 03-04-06911 (мае); грантами президента РФ для молодых ученых (МК-4000.2005.4 ); грантами президента РФ для поддержки Ведущих научных школ (НШ-1518.2003.4, НШ-8797.2006.4, НШ-2227.2008.4), ФЦНТП «Биологическое разнообразие».

Основные защищаемые положения диссертации

2. Функциональная деятельность гидролитических микробных комплексов наземных экосистем определяется активностью как доминантных, так и минорных компонент, которые также обладают высокой валовой ферментативной активностью. Деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, представителями филогенетической группы Proteobacteria (классы альфа и бета). В минеральных горизонтах почвы усиливается роль гидролитических представителей групп Firmicutes и Actinobacteria.

Апробация работы

Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены и обсуждены на международных конференциях и симпозиумах: II (Санкт-Петербург, 1996), III (Суздаль, 2000), IV (Новосибирск, 2004), V (Ростов-на-Дону, 2008) съездах Докучаевского общества почвоведов; Национальной конференции с международным участием «Эмиссия и сток парниковых газов на территории Северной Евразии» (Пущино, 2000); Научной конференции "Растение и почва" (Москва, 2001); International symposium "Functions of soils in the geosphere-biosphere systems" (Moscow, 2001); Международной научной конференции "Экология и биогеохимическая деятельность микроорганизмов" (Одесса, 2001); Международной научной конференции «Ecosystems of Mongolia and frontier areas of adjacent countries: Natural resources, biodiversity and ecological prospects» (Ulan-Bator, 2005); Международной научной конференции "Проблемы сохранения, восстановление и обогащение биоразнообразия в условиях антропогенно измененной среды", (Кривой Рог, 2005); 18th World Congress of Soil Science (Philadelphia, 2006); 10th International Conference on Chitin & Chitosan (Montpellier, 2006); 14th International Symposium on the Biology of Actinomycetes (Sunday, 2007); X European Workshop on Astrobiology (EANA'2010) (Pushchino, 2010); Доклад на научной конференции «Ломоносовские чтения» (Москва, 2009); Научной конференции «Чтения памяти академика В.Е. Соколова» (Москва,2009); на заседании кафедры в Институте почвоведения и оценки земель университета Хохенхайм

Штутгарт, 2010), на заседаниях кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Публикации

Объем работы

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Манучарова, Наталия Александровна

выводы

2. Установлено, что численность физиологически активных гидролитических прокариотных комплексов, по данным модифицированного метода анализа гибридизации клеток in situ (FISH), составляет третью часть от количества всех прокариотных организмов надземного (филлосфера), наземного (подстилка) и почвенного ярусов исследованных биогеоценозов. Выявлены различия в филогенетической структуре гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда: функциональными] и филогенетическими доминантами при деструкции биополимеров в надземном ярусе являются представители группы Proteobacteria (альфа- и бета-), тогда как в почве усиливается роль бактерий групп Firmicutes и Actinobacteria.

3. Исследование структурных и функциональных показателей гидролитических микробных комплексов широкого ряда почв выявило, что наиболее активно процессы разложение полисахаридов протекают в черноземе и сербй лесной почвах, где роль основных гидролитиков принадлежит прокариотам.

4. В черноземе впервые выявлены in situ молекулярные детерминанты хитинолитической активности микроорганизмов - фермент хитиназа и ген chi А (хитиназ группы А), принадлежащий представителям филогенетических групп Actinobacteria и Firmicutes. Эти филумы определены как доминирующие в ; прокариотном хитинолитическом комплексе чернозема совокупным применением классических методов посева из почвы и молекулярно-биологическими методами - гибридизации клеток in situ

259

FISH) и ДГГЭ-анализом денатурирующего градиентного гель-электрофореза.

5. Среди широкого ряда исследованных в условиях микрокосмов экологических факторов (температура, влажность, внесение органического вещества, время сукцессии), влияющих на развитие и функциональную деятельность гидролитических микробных сообществ почв, наиболее значимым оказывался уровень увлажненности почв, при этом в большей степени для хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитическим. Уровень влажности', обусловливающий максимальную активность гидролитического комплекса, определялся типом почвы.

8. При оптимальных для жизнедеятельности большинства микроорганизмов влажности (60% от полной влагоемкости) и температуре (27°С) среди тюктинолитических и хитинолитических комплексов исследуемых почв внутри домена Bacteria доминантами являются представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры в прокариотном микробном комплексе возрастает доля протеобактерий (альфа- и бета-). С понижением влажности и возрастанием температуры отмечается увеличение одноклеточных актинобактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе приведено комплексное исследование структуры и функциональной активности гидролитических микробных почвенных комплексов с использованием широкого набора молекулярно-биологических и классических методов, что позволило многосторонне охарактеризовать биологическую активность изучаемых экосистем. В зависимости от уровня увлажненности, температурного и окислительно-восстановительного режимов и времени сукцессии разработанная модификация флюоресцентномикроскопического метода гибридизации in situ (FISH) дала возможность оценить численность и выявить филогенетический состав метаболически активных бактериальных гидролитических хитинолитических и пектинолитических) комплексов вертикальных ярусов наземных экосистем. Оказалось, что численность метаболически активных клеток гидролитических комплексов составляет третью часть от численности всех прокариотных организмов надземного, наземного и почвенного ярусов биогеоценозов, определяемой окрашиванием акридиновым оранжевым.

Доминировали в гидролитических комплексах, преимущественно, представители филогенетических групп Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes и Proteobacteria. Выявлены различия в филогенетической структуре метаболически активных гидролитических прокариотных комплексов пространственно-сукцессионного ряда. Если деструкция биополимеров в надземном ярусе осуществляется, главным образом, группой протеобактерий (альфа- и бета-), то в гидролитических комплексах почв всех г исследуемых типов, увеличивается доля фирмикут и актинобактерий за счет уменьшения доли протеобактерий. Таким образом, в каждом ярусе формируется специфический гидролитический прокариотический комплекс.

Применение метода анализа суммарного амплификата 16S rRNA методом ДГТЭ показало существенно большее число компонентов гидролитического комплекса в образцах с добавлением полисахаридов по сравнению с контрольными (фоновыми) вариантами. Сиквенс-анализ характерных ДГТЭ полос во-первых выявил в образцах опытных микрокосмов спектр сиквенсных типов, сходных с группами, которые были определены флюоресцентным методом гибридизации клеток in situ (FISH) и, во-вторых, позволил охарактеризовать структуру комплексов. Для образцов филлосферы обнаружено присутствие филотипов, наиболее близких к бактериям семейства Oxalobacteriaceae класса Betaproteobacteria и семейству Acidobacteriaceae филлума Acidobacteria. Бактериальный компонент в наземном ярусе (для образцов подстилки ) был представлен четырьмя филотипами, составляющими два филогенетических кластера, один из которых наиболее близок к семейству Enterobacteriaceae класса Gammaproteobacteria, второй - к семейству Clostridiaceae грамположительных бактерий. В почвенном ярусе гидролитический бактериальный компонент оказался наиболее разнообразным и включал 8 филотипов, принадлежащих к трем основным линиям эволюции бактерий: к семейству Chitinophagaceae филлума Bacteroidetes, семейству Bacillaceae грамположительных бактерий и филлуму Actinobacteria (роду Streptomyces).

Функциональная активность гидролитических комплексов в исследуемых образцах почвенных микрокосмов, развивающихся при различных уровнях экологически различных параметров (влажность, температура, время сукцессии) была охарактеризована комплексом г показателей, которые согласовывались между собой. Для хитинолитического комплекса зарегистрировано образование фермента хитиназы и определена динамика его концентрации в почвах, которая коррелировала с величинами эмиссии диоксида углерода и накоплением биомассы микроорганизмов в микрокосмах. При изменении экологических

256 параметров в пределах заданных величин степень увлажненности почвы оказывается более существенным фактором для развития хитинолитического микробного комплекса (чем внесение органических веществ и время сукцессии), при этом в большей степени для деятельности хитинолитического комплекса, чем пектинолитического. Изменение влажности оказывает координирующее влияние на развитие доминантных компонентов гидролитического комплекса. Так, с увеличением влажности в хитинолитическом микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных организмов, особенно, актинобактерий. г

Была обнаружена новая функция актинобактерий (мицелиальных форм) в развитии гидролитического комплекса. Оказалось, что дыхание 1 комплекса в широком диапазоне значений (влажности, поступления органического вещества, сукцессионного времени) может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых определяется не столько их непосредственной гидролитической активностью, сколько вкладом в контроль функционирования микробного комплекса, по-видимому, посредством характерной для актиномицетов продукции биологически активных веществ, в данном случае - с регуляторной функцией.

Эти результаты были подтверждены обнаружением в почвенных образцах функциональных генов. Так, методом «вложенного» ПЦР-анализа (nested PCR) с использованием специфических праймеров было выявлено наличие хитиназного гена (chiA) группы А (семейства гликозилгидролаз) в почвенных микробных комплексах in situ и чистых культурах микроорганизмов, изолированных из исследуемых почв. По результатам г сиквенс-анализа полученных последовательностей хитиназного гена он принадлежал представителям ряда некультивируемых бактерий и филогенетических групп Actinobacteria и Firmicutes. Наблюдалась корреляция между 'результатами, полученными при исследовании филогении функционального хитиназного гена, и филогении 16S rRNA, однако среди

257 близкородственных организмов, у которых методом ДГТЭ был выявлен хитиназный ген, не всегда обнаруживались те, которые выделялись нами методом посева на плотные среды с хитином.

Внутри домена Bacteria при оптимальных для жизнедеятельности большинства микроорганизмов условиях (влажность 60% от полной влагоемкости, температура 27°С) среди хитинолитических и пектинолитических доминантов исследуемых почв выявляются представители филумов Firmicutes и Actinobacteria. С возрастанием влажности и понижением температуры отмечается увеличение представителей филума Proteobacteria (альфа- и бета- классов), а с уменьшением влажности и возрастанием температуры в прокариотном микробном комплексе усиливается роль филума Actinobacteria, что демонстрирует регуляторную роль комбинаций экологических параметров для изменения филогенетического состава гидролитических комплексов.

Таким образом, совокупность методов молекулярно-генетического анализа гидролитических прокариотных комплексов позволила пополнить перечень и отметить разнообразие микроорганизмов-гидролитиков. Полученные результаты предполагают наличие горизонтального переноса хитиназных генов, как большинства генов биодеградации, локализованных в плазмидной ДНК, внутри микробного комплекса. В приведенных исследованиях получена новая информация, интересная для понимания закономерностей стабильного существования и развития прокариотных i гидролитических комплексов и важная для решения ряда почвоведческих и биотехнологических задач. Получение этой информации стало возможным благодаря применению целого комплекса микробиологических и молекулярно-генетических методов, модифицированных для анализа почвенных систем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Манучарова, Наталия Александровна, Москва

1. Агафонов Ю.В., Быкова В.М., Кривошейка Л.И., Сидоров H.H.,

2. Белоцерковец В.М. Применение хитозана в сельскохозяйственном и декоративном растениеводстве. Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана. Москва Щелково. 1999.

3. Агре Н.С. Систематика термофильных актиномицетов. Пущино. 1986.130 с.

4. Александрова И.В. Роль продуктов жизнедеятельности актиномицетовв образовании гумусовых веществ // Почвоведение. 1962. №12. С. 1315.

5. Алимова Ф.К. Trichoderma/Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales):таксономия и распространение. Казань: Казанский государственный университет имени В.И. Ульянова-Ленина. 2005. 264с.

6. Ананьева Н.Д. Микробиологические аспекты самоочищения иустойчивости почв. Наука. 2003. 223 с.

7. Булыгина Е.С. Выделения ДНК из бактерий // Микробиология. 2002. Т.71. №4. С. 500-508.

8. Бызов Б.А. Збомикробные взаимодействия в почве. М.: ГЕОС.2005. 212с.

9. Виноградский С.Н. Микробиология почвы. М.: Изд-во АН СССР, 1952.792 с.

10. Воробьева Л.И. Археи. М.: ИКЦ «Академкнига», 2007. 447 с.

11. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П.,

12. Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М.: Наука. 1983. 245с.

13. Генджиев М.Г. Характеристика состава грибов-микромицетовпустынных' областей Туркмении и развитие их при различной активности "Воды // Автореф. дисс. .канд. биол. наук. М.: МГУ. 1978. 23 с.

14. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.:

15. Изд-во Эвалар, 2000. 512 с.

16. Гузев В. С., Зайцев С. А., Бабьева И. П. Микробное сообщество филлосферы ели // Биологические науки. №2. 1980

17. Дедков В.П., Гунин П.Д. Тепловой режим почвогрунтов пустынныхэкосистем // Экология. 1984. №5 с. 16-22.

18. Дедыш С.Н., Куличевская И.С.Плангтомицеты: Загадочные красавцыиз мира бактерий // Природа. 2010. № 5. С. 27-35.

19. Добровольский Г.В. Урусевская И.С. География почв. М.: МГУ, 2004.460 с.

20. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.:1. Академкнига. 2002. 281 с.

21. Докучаев В.В. Русский чернозем. М.: ОГИЗ, 1948. 480 с. (Избр. Соч.:1. Т. 1).

22. Донченко Л.В., Фирсов Г.Г. Пектин основные свойства, производство иприменение. М.: ДеЛи принт, 2007. 276 с.

23. Доржготов Д. Почвы Монголии. Улан-Батор. Изд-во «Аётоп». 2003.287 с. '

24. Дорошенко Е.А., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И.

25. Спорообразование и мицелиальный рост стрептомицетов при различных уровнях влажности // Микробиология Т. 74, № 6. 2005. С. 795-799. 1

26. Егорова Е.В. Влияние отходов биотехнологического производстваантибиотиков на агрохимические свойства и ферментативную активность дерново-подзолистой почвы // Вестник Московск. университета. Серия Почвоведение. 2004. №3. С. 48-52.

27. Звягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Московск. ун-та.1987. 256.

28. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: Изд-во

29. Московск. ун-та. 2005. 445 с.

30. Звягинцев Д.Г., Добровольская Т.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Лысак

31. J1.B., Полянская JI.M., Чернов И.Ю. Структурно-функциональная организация микробных сообществ / «Экология в России на рубеже 21 века». М.: Изд-во Научный мир, 1999, С. 147-180.

32. Звягинцев ДТ., Зенова Г.М. Экология актиномицетов. М.: ГЕОС,2001.257 с.о

33. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Актиномицеты засоленных и щелочныхпочв. М.: Книжный Дом Университет. 2007. 107с.

34. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Экстремофильные и экстремотолерантныеактиномицеты в наземных экосистемах. М.: Университетская Книга. 2011. 134 с.

35. Звягинцев Д.Г., Питрюк А.П. Развитие микроорганизмов в проточных инепроточных капиллярах разной толщины // Микробиология. 1973. Т. 42. Вып. 1.С. 23-31.

36. Зенова Г.М.,,.Звягинцев Д.Г. Разнообразие актиномицетов в наземныхэкосистемах. М.: Изд-во Московск. ун-та. 2002. 130 с.

37. Зенова Г.М., Курапова А.И., Лысенко A.M. и Звягинцев Д.Г.структурно-функциональная организация комплексовтермотолерантных актиномицетов пустынных и вулканических почв // Почвоведение. 2009. №5. С. 575-580.

38. Зенова Г.М., Дуброва М.С., Звягинцев Д.Г. Структурнофункциональные особенности комплексов почвенных психротолерантных актиномицетов // Почвоведение. 2010. №4. С. 482487.

39. Иванушкина(Н.Е. Влияние температуры и водного потенциала на рости развитие почвенных грибов. Автореф. диссерт. канд. биол. наук. 1984.23 с. ■

40. Ильина А.В.,Варламов В.П. Энзимология синтеза и деградации хитинаи хитозана / Хитин и хитозан: получение свойства и применение. Подред. акад. РАСХН К.Г. Скрябина, д.х.н. Г.А. Вихоревой, д.х.н. В.П. Варламовой. М.: Наука. 2002. 368 с.V

41. Калакуцкий Л.В., Шарая JI.C. Актиномицеты и растения // Успехимикробиологии. 1990. Т.25. С. 26-65.

42. Качалкин A.B., Глушакова A.M., Юрков A.M., Чернов И.Ю.

43. Особенности дрожжевых группировок в филлосфере сфагновых мхов //Микробиология. 2008. Т.77. №4. С. 533-541.

44. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М.: Изд-во Московск.ун-та. 1989.Л 75 с.

45. Кравченко И.К., Кизилова А.К., Быкова С.А., Менько Е.В., Гальченко

46. В.Ф. Молекулярный анализ накопительных культур с высоким сродством к метану, выделенных из почв лесного биоценоза и агроценозов//Микробиология. 2010. Т. 79. №1. С. 114-122.

47. Куличевская- И.С., Зайчикова М.В., Деткова E.H., Дедыш С.Н.,

48. Заварзин Г.А. Larkinella arboricola sp. nov. новая спиралеобразующая бактерия филогенетической группы Bacteroidetes из микробного сообщества разлагающейся древесины. Микробиология. 2009. Т.78. № 6 С.780-785.

49. Кухаренко О.С., Манучарова H.A., Добровольская Т.Г. Особенностибактериальных сообществ гидроморфных почв северных регионов // Вестн. Московск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 2010. №4. С. 41-43.

50. Лихачев А.Н. Род Botrytis micheli (Mititit fungi). Диссерт.докторабиологических наук. 2000. 300с.

51. Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Конова И.А., Звягинцев Д.Г. Численность ибиол. наук. 2000. 300 с.таксономический состав ультрамикробактерий в почвах // микробиология. 2010. Т.79. № 3. С.432.

52. Манучарова * H.A., Власенко А.Н., Белова Э.В., Зенова Г.М.,

53. Добровольская Т. Г., Степанов А. Л. Методические аспекты определения использования хитина почвенными микроорганизмами. Известия РАН. Сер. Биол. 2008. №5. С. 635-640.

54. Марфенина O.E. Микробиологические аспекты охраны почв. М. Изд-во1. МГУ.1991.120 с.

55. Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э., Галимзянова Н.Ф. Роль хитиназы впроявлении и антигрибной активности штаммов Bacillus sp. 739. // Микробиология. 2001. Т. 70. №5. С. 636-641.

56. Методы почвенной микробиологии и биохимии // М.: Изд-во МГУ.1991.303 с.

57. Мишустин E.H. Термофильные микроорганизмы в природе и практике.

58. М.: Изд-во АН СССР. 1950. 635 с.

59. Мишустин E.H., Перцовская М.И. Микроорганизмы и самоочищениепочвы. М.: Изд-во АН СССР, 1954. 650 с.

60. Нетрусов А.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Горленко В.М. и др. Экологиямикроорганизмов. Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Изд. центр «Академия», 2004. 272 с.

61. Определитель бактерий Берджи. 1997. М.: Мир. 799с.

62. Орлов Д.С., Бирюкова О.Н., Суханова Н.И. Органическое веществопочв Российской Федерации. М. Наука. 1996. 253 с.

63. Панкратов TIA., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетическогоразнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH // Микробиология 2005. Т. 74. №6. С. 831-837. <

64. Паринкина О.М. Микрофлора тундровых почв. Л.: Наука, 1989. 159с.

65. Полянская JI.M. Микробная сукцессия в почве. Автореферат дисс .доктора био!л. наук М.: Изд-во МГУ. 1996. 98 с.

66. Смагин A.B. Газовая фаза почв. Москва: Издательство Московскогоун-та. 2005.-301 с.

67. Современная микробиология. Прокариоты. Т.2/ Отв. Редакторы Й.

68. Ленглер, Г. Дрефе, Г. Шлегель. М.: Мир. 2005. 496 с.

69. Степанов А.Л. Микробная трансформация парниковых газов в почвах.1. М.:ГЕОС. 2011. 192 с.

70. Судницын И.И. Движение почвенной влаги и водопотреблениерастений. М.: Изд-во Московск. ун-та. 1979. 254 с.

71. Сусьян Е.А., Ананьева Н.Д., Благодатская Е.В. Разделение грибного ибактериального субстрат-индуцированного дыхания с использованием антибиотиков в почвах разных экосистем // Микробиология. 2005. Т.74.№З.С? 394-400.

72. Терехов А.С. Экологические ниши почвенных актиномицетов.

73. Диссертация кан. биол. наук. М.: МГУ, 2003. 182 с.

74. Терехова Л.П, Алфёрова И.В. Комплексный метод выделения из почвыактиномицетов антагонистов // Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов. Алма - Ата: Гылым. 1990: 20-29.

75. Терехова Л.П., Галатенко О.А.„ Алферова И.В., Преображенская Т.П.

76. Использование селективных сред для выделения актиномицетов // Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов. Алма-Ата. Гылым. 1990. С.5-12.

77. Тиунова Н.А., Пиреева Д.А., Фениксова Р.В. Образование хитиназы

78. Actinomyces kurssanovii. // Микробиология. 1976. Т. XLV. С. 625-629.

79. Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическаятрансформация азота в почве. М.: ГЕОС. 2007. 137.

80. Феофилова Е.П. Хитин грибов: распространение, биосинтез, физикохимические свойства и перспективы использования / Хитин и хитозан. Под ред. акад. РАСХН К.Г. Скрябина, д.х.н. Г.А. Вихоревой, д.х.н. В.П. Варламовой М.: Наука, 2002. 365 с.

81. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов: современные представленияо составе и биологической функции // Микробиология. 2010. Т.79. №6. С.723-733.

82. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Под ред. К. Г.

83. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. М.: Наука. 2002. 368с.

84. Чернов И.Ю., Лысак JI.B. Общая экология. М.: МАКС Пресс. 2008.74с.

85. Чернов И.Ю., Добровольская Т.Г., Лысак Л.В. Почва и микробноесразнообразие / Роль почвы в формировании и сохранении биологического разнообразия. Отв. Ред. Г.В.Добровольский, И.Ю.Чернов. М.: Товарищество научных изданий КМК. 2011. С.22-85.

86. Чернов И.Ю. Марфенина O.E. Адаптивные стратегии грибов в связи сосвоением наземных местообитаний / Палеопочвы и индикаторы континентального выветривания в истории биосферы. М.: ПИР РАН. 2010. С.95-111.

87. Шеин Е.В. Физика почв. М.: Изд-во Московско ун-та . 2005. 445с.с

88. Шишов Л.Л., Тонконогов В.Д., Лебедева И.И, Герасимова М.И. Подред. Добровольского Г.В. Классификация и диагностика почв России. Смоленск: Ойкумена. 2004. 342 с.

89. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Изд-во иностр. лит-ры, 1972.476 с.

90. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л., Николаев Ю.А., Сузина Н.Е.,

91. Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т.75. С. 446-456. |с

92. Aber J. D. and Mellilo J. M. Terrestrial Ecosystems. Saunders College

93. Publishing, PA. 1991. P. 84-88.

94. Alves M.P., Rainey F.A., Nobre M.F. & Cosata M.S. Thermomonashydrothermalis sp. nov., a new slightly thermophilic y-proteobacterium267isolated from a hot spring in central Portugal // Syst. Appl. Microbiol.2003. 26: 70-75.

95. Amann R.I., Krunholz L., Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing ofwhole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology//Bacteriol. 1990. 172: 762-770.

96. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and insitu detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. 59: 143-169.

97. Amanda J. Redford, Robert M. Bowers, Rob Knight, Yan Linhart, Noah

98. Fierer. The ecology of the phyllosphere: geographic and phylogenetic variability in the distribution of bacteria on tree leaves // Environmental Microbiology, 2010, 12(11), P. 2885-2893

99. Anderson A. S. and Wellington E. M. H. The taxonomy of Streptomyces andrelated Genera // Int. J. Syst. Evol. Bacteriol. 2001. 51: 797-814.

100. Andrews, J.H., and Harris, R.F. The ecology and biogeography ofmicroorganisms of plant surfaces. // Annu Rev Phytopathol, 2000, 38 : 145-180. '

101. Anjaiah V., Cornalis P., Koedam N. Effect of genotype and root colonizationin biological control of fusarium wilts in pigeonpea and chickpea by Pseudomonas aeruginosa PNA1 // Can. J. Microbiol. 2003. 49: 85-91.

102. Arakane Y. & Muthukrishnan S. Insect chitinase and chitinase-like proteins

103. Cell. Mol. Life Sei. 2010. 67: 201-216.

104. Arotupin D. J., Akinyosoye F. A. and Onifade A. K. Purification andcharacterization of pectinmethylesterase from Aspergillus repens isolatedfrom cultivated soil // African Journal of Biotechnology Vol. 7 (12), pp. 1991-1998, 17 June, 2008.

105. Baker G.C. and Cowan D.A. 16S rDNA primers and the unbiasedassessment of thermophile diversity // Biochem. Soc. Trans. 2004. 32: 218— 221.

106. Barros M. D., Bonetti S. J. and Carsella J. S. Isolation of Pénicilliumchitinases: a comparison of enzymes isolated from supernatant and pelleted fractions // FASEB J. 2006. 20: A 57.

107. Beg Q.K., B. Bhushan, M. Kapoor, G.S. Hoondal. Production andcharacterization of thermostable xylanase and pectinase from Streptomyces sp. QG-11-3 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2000. 24: 396-402.

108. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology // Eds. J.A.Holt, N.R. Krieg, Peter H.A. Smath, J.T. Stanley, S.T. Williams. Baltimore ets: Williams and Wilkins, 1994. 787 p.

109. Bertaux J., ©loger U., Schmid M., Hartmann A., Scheu S. Routinefluorescence in situ hybridization in soil // J. Microbiol. Methods. 2007. 69: 451-460.

110. Berthrong S.T., Schadt C.W., Pineiro G. and Jackson R.B. Afforestationalters the composition of functional genes in soil and biogeochemical processes in South American grasslands // Appl. Environ. Microbiol. 2009. 75 (19): 6240-6248.

111. Berensmeier S., Singh S.A., Meens J. & Buchholz K. Cloning of the pelAgen from Baicillus licheniformis 14A and biochemical characterization of recombinant, thermostable, high alkaline pectate lyase // Appl. Microbiol. Biothechnol. 2004. 64: 560-567.

112. Bhattacharya D., Nagpure A., Gupta R.K. Bacterial chitinases: propertiesand potential // Crit. Rev. Biotechnol. 2007. 27(1): 21-28.

113. Bhushan B. and Hoondal G.S. Isolation, purification and properties of athermostable chitinase from an alkalophilic Bacillus sp. BG-11 // Biotechn. Lett. 1998. 20(2): 157-159.

114. Boot R.G., Blommaart E.F.C., Swart E., Ghauharali-van der Vlugt K., Bijl

115. N., Moe C., Place A. & Aerts J.M.G. Identification of a nivel acidic mammalian chitinase distinct from chitotriosidase // J. Biol. Chem. 2001. 276: 6770-6778.

116. Boyer J.N. Aerobic and Anaerobic Degradation and Mineralization of 14C

117. Chitin by Water Column and Sediment Inocula of the York River Estuary,Virginia//Appl. Environmen. Microbyol. 1994. P. 174-179.

118. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitationof microgramquantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. 72: 248-254.

119. Brock T. D. & Madigan M. T., 1988. Biology of Microorganisms. 5th edn. Prentice Hal| Incorporation. 835 pp.

120. Brühlmann F., Kim K.S., Zimmerman W. and Fiechter A. Pectinolytic Enzymes from actinomycetes for the degummining of raimie bast fibers // Appl. & Environ. Microbiol. 1994. 60 (6): 2107-2112.

121. Busse H.-J., Kämpfer P., Moore E.R.B. & 7 other authors. Thermomonas haemolytica gen. nov., sp. nov., a c-proteobacterium from kaolin slurry // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. 52: 473-483.

122. Campbell J.H., Clark J.S. and Zak J.Z. PCR-DGGE Comparison of Bacterial Community Structure in Fresh and Archived Soils Sampled along a Chihuahuan Desert Elevational Gradient // Microb. Ecol. 2009. 57 (2): 261-266.

123. Casida L.E. Jr. Industrial Microbiology. Enzymes as Fermentation Products 4th edition // Wiley Eastern Limited New Delhi, 1991. pp. 390-401.

124. Castle D. & Kirchman D.L. Composition of estuarine bacterial communities' assessed by denaturing gradient gel electrophoresis and fluorescence in situ hybridization // Limnol. Oceanogr.: Methods. 2004. 2: 303-314.

125. Chandler D.P., Fredrickson J.K. and Brockman F.J. Effect of PCR template concentration on the composition and distribution of total community 16S rDNA clone libraries // Mol. Ecol. 1997. 6: 475^182.

126. Chen M.Y., Tsay S.S., Chen K.Y., Shi Y.C., Lin Y.T. & Lin G.H. Pseudoxanthomonas taiwanensis sp. nov., a novel thermophilic, N20-producing species isolated from hot springs // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. 52:2155-2161.

127. Chin K.-J., Liesak W. and Janssen H. Optitus terrae gen nov., sp. Nov., to accommodate novel strain of the division "Verrucomicrobia" isolated from rice paddy soil//IJSEM. 2001. 51: 1965-1968.

128. Christopher C.A. and Clauset A.O. 1980. U.S. Patent 4,210,204.

129. Conrad R., Bak F., Seitz H.B., Thebrath B., Mayer H.P., Schutz H. Hydrogen turnover by psychrotrophic homoacetogenic and mesophilic methanogenic bacteria in anoxic paddy soil and lake sediments // FEMS Microbiol. Ecol. 1989. V. 62. P. 285-294.

130. Cottrell M.Tt, Wood D.N., Yu L., Kirchman D.L. Selected chitinase genes in cultured and uncultured marine bacteria in the alpha- and gamma-subclasses of the proteobacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2000. 66(3): 1195-201. '

131. Culbreath AK, Rodriguez-Cabana R, Morgan-Jones G. Chitin and Paecilomyces lilacinus for control of Meloidogyne arenaria // Nematropica. 1986.16: 153-166.

132. Dahiya N., Tewari R., Tiwari R.P., Singh Hoodndal G. Chitinase from Enterobacter' sp. NRG4: Its purification, characterization and reaction pattern // Electron. J. Biotechnol. 2005. V.8. №2.

133. Dahiya N., Tewari R., Hoondal G.S. Biothechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. 71: 773-782.

134. Davila-Rodriguez J.L.; Escobar-Barrios V.A., Shirai K. & Rangel-Mendez J.R. Synthesis of a chitin-based biocomposite for water treatment: Optimization for fluoride removal // Journal of Fluorine Chemistry. 2009. 130(8): 718-726.

135. Davis B., Eveleigh D.E.// In: Chitin, Chitosan and Related Enzymes. J.P. Zikakis ed. Orlando Academic Press. 1984. P. 161-179.

136. De Boer W,, Gunnewiek PJAK, Lafeber P., Janse J.D., Spit B.E., WoldendorpiJ.W. Antifungal properties of chitinolytic dune soil bacteria // Soil Biol. & Biochem. 1998. 30(2): 193-203.

137. De Boer W.,' Gerards S., Klein G. P.J.A. and Modderman R. Response of the chitinolytic microbial community to chitin amendments of dune soils // Biol. Fertil. Soils. 1999. 29: 170-177.

138. De Boer W., Klein Gunnewiek P.J., Kowalchuk G.A. and Van Veen J.A. Growth of Chitinolytic Dune Soil B-Subclass Proteobacteria in Response to Invading Fungal Hyphae // Appl. Environ. Microbiol. 2004. 67(8): 33583362.

139. Dedysh S. N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S. and Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of Bacteria community composition. in an acidic Sphagnum peat bog // Appl. Envir Microbiol. 2006. 72(3): 2110-2117.

140. Deshpande M.V. Enzymatic degradation of chitin and its biological applications // J. Sci. Ind. Res. 1986. 45: 273-281.

141. Dinter S., Bunger U., Siefert E. // In: Advan.Chitin Sci. M.G. Peter, A. domard, R.A.A. Muzzarelli, eds. Postdam. Univercity of Postdam. 2000. V. 4. P. 506-510.

142. Domsch K.H., Gams W., Traute-Heidi Anderson. "Compendium of soil fungi"// Eching: IHW Verl. Reprint der Ausg. Von 1980. Vol. 1 (1993).

143. Downing K.J. & Thomson J.A. Introduction of the Serratia marcescens chiA gene into an endophytic Pseudomonas fluorescens for the biocontrol of fitophatogenic fungi // Can. J. Microbiol. 2000. 46: 363-369.

144. Edenborn S.L. and Sexstone A J. DGGE fingerprinting of culturable soil bacterial communities complements culture-independent analyses // Soil Biol. & Biochem. 2007. 39 (7): 1570-1579.

145. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P.7843-7853.

146. Eickhorst T.iand Tippkotter R. Improved detection of soil microorganisms using fluorescence in situ hybridization (FISH) and catalyzed reporter deposition (CARD-FISH) // Soil Biol.& Biochem. 2008. 40(7): 18831891. i

147. Eilenberg H., Pnini-Cohen S., Schuster S., Movtchan A. & Zilberstein A. Isolation and characterisation of chitinase genes from pitches of the carnivorous plant Nepenthes khasiana // J. Exp. Bol. 2006. 57: 2775-2784.

148. Eltarabily-K.A., Soliman-M.H., Nassar-A.H., Alhassani-H.A. Biologycal-Control of Sclerotinia Minor Using a Chitinolytic Bacterium and Actinomycetes // Plant Pathology. 2000. 49(5): 573-583.

149. Escott G.M.: and Adams D.J. Chitinase Activity in Human Serum and Leukocytes // Infection and Immunity. 1995. 63(12): 4770-4773

150. Favela-Torres E., Volke-S.T. and Viniegra-Gonzalez G. Production of Hydrolytic Depolymerising Pectinases // Food Technol. Biotechnol. 2006. 44 (2) 221-227.

151. Feller G., Narynx E., Arpigny J. L., Zekhini Z., Swings J. and Gerday C. Temperature dependence of growth, enzyme secretion and activity of psychrophilic Antarctic bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. 41: 477—479.

152. Fenice M., Selbmann L., R. Di Giambattista and Federici F. Chitinolytic activity at lpw temperature of an Antarctic strain (A3) of Verticillium lecanii//Research in Microbiol. 1998. 149(4): 289-300.

153. Flach J., Pilet E., Jolles P. // In: Chitin Enzimology. R.A.A. Muzzarelly , Italy, ed. Atec. 1992. V. 48. P. 701-716.

154. Friedrich J., Cinerman A., Steiner W. Production of pectolytotic enzymes by Aspergillus niger. Effect of inoculum size and Potassium Hexacyanoferrate II Trihydrate. // Appl. Microbiol. Biotechnol, 1990. 33: 377.

155. Gao J., Bauer M. W., Shockley K.R., Pysz M.A. and Kelly R. M. Growth of Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus furiosus on Chitin Involves Two Family .18 Chitinases // Appl. Environ. Microbiol. 2003. 69(6): 31193128.

156. Gao X.D., Katsumoto T., Onodera K. Purification and Characterization of Chitin Deacetylase from Absidia coerulea // J. Biochem. 1995. 117:257263.

157. Garcia J.L., Patel B.K.C., Ollivier B. Taxonomic, phylogenetic, and ecological diversity of methanogenic Archae // Anaerobe. 2000. V. 6. P. 205-226. :

158. Georlette D., Blaise V., Collins T., D'Amico S., Gratia E., Hoyoux A., Marx J.-C., Sonan G., Feller G., Gerday C. Some like it cold: biocatalysis at low temperatures // FEMS Microbiol. Rev. 2004. 28: 25-42.

159. Giersher K. Pectin and pectic enzymes in fruit and vegetables technology // Gordian. 1981. V.81. №№ 7-8. p. 171-176.o

160. Gillichinsky D., Vishnivetskaya T., Petrova M., Spirina E., Mamykin V. and Rivkina E. Bacteria in Permafrost // In "Psychrophiles: from biodiversity to biotechnology" ed. by Margesin R., Schinner F., Marx J.K., Cerdey C. Springer Verlag. 2008. 462 p.

161. Gohel V., Singh A., Vimal M., Ashwini P. and Chhatpar H.S. Bioprospecting and antifungal potential of chitinolytic microorganisms. // African Journal of Biotechnol. 2006. 5 (2): 54-72.

162. Gonzalez-Franco A.C., Deobald L.A., Spivak A. and Crawford D.L. Actinobacterial chitinase-like enzymes: profiles of rhizosphere versus non-rhizosphere isolates // Can. J. Microbiol. 2003. 49: 683-698.

163. Gooday G.W. Physiology of microbial degradation of chitin and chitosan //

164. Biodégradation. 1990. 1: 177-190.275

165. Gortari M.C. and Hours R. A. Fungal chitinases and their biological role in the antagonism onto nematode eggs. A review. // Mycol. Progress. 2008. 7(4): 221-238.

166. Gould W.D., Bryant R.J., Trofimow J.A., Anderson R.V., Coleman D.C. Chitin decomposition in a model soil system. // Soil Biol. & Biochem. 1981. 13:487-492.

167. Gounot A.M. & Russell N. J. Physiology of cold-adapted microorganisms // In "Cold-adapted Organisms", Edited by R. Margesin & F. Schinner. New York: Springer. 1999. 416 p.

168. Gray T.R.G. and Baxby P. Chitin decomposition in soil. II. The ecology of chitinoclastic micro-organisms in forest soil // Trans. Br. Mycol. Soc. 1968. 51: 293-309J

169. Griffin DM. 1985. A comparison of the roles of bacteria and fungi. In: Leadbetter ER, Poindexter JS (eds) Bacteria in nature. I. Bacterial activities in perspective // Plenum, New York, pp 221-255 x

170. Gschwendtner S., Reichmann M., Miiller M., Radl V., Munch J.C. and Schloter M. Abundance of bacterial genes encoding for proteases and chitinases in the rhizosphere of three different potato cultivars // Biol. Fertil. Soils. 2010. 46: 649-652.

171. Gummadi S.N., Kumar D.S. Microbial pectic transeliminases // Biotechnology Letters, 2005. V. 27. P. 451-458.

172. Haki G. D. and Rakshit S. K. Developments in industrially important thermostable enzymes: a review // Bioresourse Technology. 2003. 89(1): 17-34.

173. Hallmann J., Rodriguez-Kabana R., Kloepper J.W. Chitin-mediated changes in bakterial communities of the soil, rhizosphere and within roots of cotton in relation to nematode control // Soil biology and biochemistry. 1999. 31: 551-560.

174. Hatada Y., Saito K., Yoshimatsu T., Ozawa T., Kobayashi T. & Ito S.

175. Deduced amino-acid sequence and possible catalytic residues of a novel276pectate lyase from an alcalophilic strain of Bacillus // Eur. J. Biochem. 2000. 267: 2268-2275.

176. Henrissat B. & Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities // Biochem. J. 1993. 293: 781-788.

177. Henrissat B. Classification of chitinase modules // In Chitin and chitinases. Muzzarelli RAA (ed). Basel, Switzerland: Birkhauser-Verlag. 1999. pp. 137-159.

178. Herron S.R., Benen J.A.E., Scavetta R.D., Visser J. & Jurnak F. Structure and function of pectic enzymes: virulence factors of plant pathogens // Proc. Natl. acad. Sci. USA. 2000. 97: 8762-8769.

179. Hirsbrunner P. 1988. U.S. Patent 4,743,288.

180. Howard M.B., Ekborg n.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. B'iot. 2003. 30: 627-635.

181. Ikeda S., Ytow N. Ezura H., Minamisawa K., Miyashita K., Fujimura T. Analysis of molecular diversity of bacterial chitinase genes in the maize rhizosphere using culture-independent methods // Microbes and Environm. Microbiology. 2007. 66: 3290-3296.

182. Iseli B., Boiler T., Neuhaus J.-M. // In: Chitin Enzimology. R.A.A. Muzzarelly, Italy, ed. Atec. Edizioni. 1996. V. 2. P. 135-142.

183. Jayani R.S., Saxena S. and Gupta R. Microbial pectinolytic enzymes: A review // Process Biochemistry. 2005. 40: 2931-2944.

184. Jeffries P. Mycoparasitism within the zygomycetes // Bot J Linn Soc 91: p. 135-150.1985

185. Jiang C., Xu L. Actinomycete diversity in unusual habitats // Bioline Enternational. Actinomycetes. 1993. 4(2): 47-57.

186. Kafetzopoulos D., Martinou A., Bouriotis V. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 2564-2568.

187. Kang H., Freeman C., Park S.S., and Chun J., N-Acetylglucosaminidase Activities in Wetlands: A Global Survey // Hydrobiologia. 2005. 535: 103110. !

188. Kapoor M., Kuhad R.C. Improved polygalacturonase production from Bacillus sp. Mg Cp - 2 under submerged (SMF) and solid state (SSF) fermentation.// Lett. Appl. Microbiol. 2002. 34: 317-322.

189. Karlsson M.and Stenlid J. Comparative Evolutionary Histories of Fungal Chitinases. .// In Evolutionary Biology. Concept, Modeling and Application. Ed. by Pierre Pontarotti. Springer Verlag. 2009. Part 3. Chap. 19. pp. 323-337.

190. Kashyap D.R., Vohra P.K., Chopra S. and Tewari R. Application of pectinases in the commercial sector: a review // Bioresource Technol. 2001. 77: 215-237.

191. Kasugai H., Motojima S. and Inouse K. 1975. U.S. Patent 3,891,756.

192. Kawase T., Saito A., Sato T., Kanai R., Fujii T., Nikaidou N., Miyashita K., Watanabe T. Distribution and phylogenetic analysis of family 19 chitinases in Actinobacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2004. 70 (2): 1135-1144.

193. Kertesz L.I. The pectin substances. New York: Intersciense Publishers, 1951.-628p.

194. Kim S.-K. Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and Their Derivatives: Biological Activities and Applications. CRC Press, USA. 2010. 662 p.

195. Kirchman D.L. The ecology of Cytophaga-Flavobacteria in aquatic environments // FEMS Microbiol. Ecol. 2002. 39: 91-100.

196. Klappenbach J.A., P.R. Saxman P.R., Cole J.R. and Schmidt T.M. rrndb: The ribosomal RNA operon copy number database // Nucleic Acids Res. 2001.29: 18|-184.

197. Klyotaka M;, Takeshi F., Akio W., Hideto U. Nucleotide sequence and expression of a gene (chB) for a chitinases from Streptomyces lividans // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1997. V. 83. Iss. I. P. 26-31.

198. Knudsen K.E.B. Carbohydrate and lignin contents of plant materials usedin animal feeding // Animal Feed Technology. 1997. 67: 319-338279

199. Kobayashi D.Y., Reedy R.M., Bick J. & Oudemans P.V. Characterisation of a chitinase gene from Stenotrophomonas maltophilia strain 34S1 and its involment in biologicalcontrol // Appl. Environ. Microbiol. 2002. 68(3): 1047-1054.

200. Kogan G., Machova E., Chorvatovicova D., Sandula J. // Prog. 3 rd Asia-Pacific Chitin and Chitosan Symp. 1998. P. 372-379.4.

201. Kong Y.H., Beer M., Seviour R.J., Lindrea K.C. and Rees G.N. Structure and functional analysis of microbial community in an aerobic: anaerobic sequencing batch reactor (SBR) with nophosphorus removal // Syst. Appl. Microbiol. 2001. 24: 597-609.

202. Kopecny J., Hodrova B. // Folia Microbiol. 2000. V. 45. P. 465-468.

203. Kramer K. Ji, Muthukrishnan S., Lowell J., White F. Chitinases for insect control // In Advances in insect control. Eds. N. Carozzi, M. Koziel. Taylor and Francis, Bristol, 1997, p. 185-193.

204. Krsek M. & Wellington E.M.H. Assessment of chitin decomposer diversity within an upland grassland //Antonie van Leeuwenhoek. 2001. 79: 261-267.

205. Kuhad R.C.,' Kapoor M., Rustagi R. Enhanced production of an alkaline pectinase from Streptomyces sp. RCK-SC by wHole-cell immobilization and solid-state cultivation // World J. Microbiol. Biotechnol. 2004. 20: 257-263.

206. Kuk J.H., Jung W.J., Jo G.H., Kun Y.C, Kim K.Y., Park R.D. Production of N-acetyl-beta-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp. GJ-18 crude enzyme // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. 68(3): 384-389.c

207. Labrie C., Heclerc P., Cote N., Roy S., Brzezinski R., Hogue R. and Beaulieu C. Effect of chitin waste-based composts produced by two-phase composting on two oomycete plant pathogens // Plant and Soil. 2001. 235: 27-34. i

208. LeCleir G.R., Buchan A., Hollibaugh J.T. Chitinase Gene Sequences Retrieved from Diverse Aquatic Habitats Reveal Environment-Specific Distributions // Appl. Environ. Microbiol. 2004. V. 70(12). P. 6977-6983.

209. LeCleir G.R., Buchan A., Maurer J., Moran M.A. and Hollibaugh J.T. Comparision of chitinolytic enzymes from an alkaline, hypersaline lake and an estuary // Environ. Microbiol. 2007. 9: 197-205.

210. Lee E.M., Jeon C.O., Choi I., Chang K.S., Kim C.J. Silanimonas lenta gen. nov., sp. nov., a slightly thermophilic and alkaliphilic gammaproteobacterium isolated from a hot spring // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. 55: 385-389.

211. Leininger S.j T. Urich, M. Schloter, L. Schwark, J. Qi, G. W. Nicol, J. I. Prosser, S. C. Schuster & C. Schleper. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils //Nature. 2006. 442: 806-809.

212. Leisner J. J., Larsen M. H., Jorgensen R. L., Brondsted L., Thomsen L. E. and Ingmer H. Chitin Hydrolysis by Listeria spp., Including L. monocytogenes // Appl. Environ. Microbiol. 2008. 74(12): 3823-3830.

213. Le Mer J., Roger P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: A revew // Eur. J. Soil Biology. 2001. V. 37. P.25-50.

214. Leuven van L. W. 1967. U.S. Patent 3,346, 407.

215. Lezica R.P.,, Quesada-Allue L. Chitin // Methods in Plant Biochemistry. 1990. 2:443-474.

216. Li D.-C. Review of Fungal Chitinases // Mycopathologia. 2006. 161 (6): 345-360.

217. Lindow S.E., Brandl M.T. Microbiology of the Phillosphere. // Applied and Environmental Microbiology, 2003. Vol. 69. № 4. p. 1875-1883.

218. Makarios-Laham I. and Lee T.-C. Biodegradability of chitin- and chitosan-containing films in soil environment // J. of Polymers&Environ. 1995. 3(l):31-36.

219. Makoi J. H. J. R. and Ndakidemi P. A. Selected soil enzymes: Examples of their potential roles in the ecosystem // African Journal of Biotechnology. 2008. 7(3): 181-191.

220. Manz W., .Amann R, Ludwig W., Wagner M., Schleifer K.-H. Phylogenetic oligonucleotide probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and solutions// Syst. Appl. Microbiol. 1992. 15: 593-600.

221. Markovic O. & Janecek S. Pectin degrading glycoside hydrolases of family 28: sequence-structural features, specificities and evolution // Protein Eng. 2001. 14:615-631.

222. Marx M.-C., Wood M. and Jarvis S. C. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils // Soil Biol, and Biochem. 2001. 33: 1633-1640. .

223. Mavromatis K., Feller G., Kokkinidis M. and Bouriotis V. Cold adaptation of a psychrophilic chitinase: a mutagenesis study. // Protein Engineering. 2003. 16(7): 497-503.

224. Mediavilla J., Jain S., Kriakov J., Ford M.E., Duda R.L., Jacobs W.R., Hendrix R.W., Hatfull G.F. Genome organization and characterization of mycobacteriöphage Bxbl // Mol. Microbiol. 2000. 38: 955-970.

225. Meier H., Amann R., Ludwig W., Schleifer K.-H. Specific oligonucleotide probes for in1 situ detection of a major group of gram-positive bacteria with low DNA G+C content // Syst. Appl. Microbiol. 1999. 22: 186-196.

226. Mercier J., Lindow S.E. Role of Leaf Surface Sugars in Colonization of Plants by Bacterial Epiphytes. // Applied and Environmental Microbiology, 2000. Vol. 66. № 1. p. 369-374.

227. Metcalfe A.C., Krsek M., Gooday G.W., Prosser J.I. and Wellington E.M.H. Molecular analysis of a bacterial chitinolytic community in an upland pasture // Appl. Environ. Microbiol. 2002a. 68 (10): 5042-5050.

228. Metcalfe A.C., Williamson N., Krsek M. and Wellington E.M.H. Molecular diversity within chitinolytic actinomycetes determined by in situ analysis // Aetinomycetol. 2002b. 17: 18-22.

229. Meyer A. F., Lipson D.A., Martin A.P., Schadt C. W., Schmidt S. K. Molecular and metabolic characterization of cold tolerant alpine soil Pseudomonas sensu stricto // Appl. Environ. Microbiol. 2004. 70(1): 483489. <

230. Mitchell R. & Alexander M. Microbiological processes associated with the use of chitin for biological control // Soil Sci. Soc. Am. Proc. 1962. 26: 556-558.

231. Mitchell R. Additionof faungal cell-wall components to soil for biological disease control//Phytopathology. 1963. 53(9): 1068-1071.

232. Morris C. Phyllosphere. Encyclopedia of life sciences. 2001. P. 1-8.

233. Muyzer G., de Waal E.C., Uitterlinden A.G. Profiling of Complexc

234. Microbial Populations by Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of Polymerase Chain Reaction-Amplified Genes Coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1993. 59(3): 695-700.

235. Muzzarelli R. Native, industrial, and fossil chitins // In R. A. Muzzarelli and P. Jooaes (ed.), Chitin and chitinases. Birkhauser, Basel, Switzerland. 1999. P. 1-5.

236. Nakatsu C.H., Torsvik V. and Ovreas L. Soil community analysis using DGGE of 16S rDNA polymerase chain reaction products // Soil Sci. Soc. Am. J. 2000/64: 1382-1388.

237. Nawani N. N., Kapadnis B. P., Das A. D., Rao A. S. and Mahajan S. K. Purification and characterization of a thermophilic and acidophilic chitinase froin Microbispora sp. v2 // J. Appl. Microbiol. 2002. 93 (6): 965975.

238. Neef A., Amann R., Schlesner H, Schleifer K.-H. Monitoring a widespread bacterial group: in situ detection of Planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes//Microbiology. 1998. 144:3257-3266.

239. Nishimura T., Toyota K., Mochizuki M. Predominant culturable Bacillus species in Japanese arable soils and their potential as biocontrol agents // Microb. Environ. 2005. 20: 61-68.

240. Novinscak A., Surette C., Allain C, Filion M. Application of molecular technologies to monitor the microbial content of biosolids and composted biosolids // Water Sci Technol. 2008. - V. 57. - № 4. - P. 471-477.

241. Odutola O.O., Ikenebomeh M.J. Polygalacturonase and pectinmethyl'estherase produced by Erwinia carotovora and Fusarium oxysporum isolated from stared tomatoes (Lycopersicum esulentum) fruits.// Niger. J. Microbiol, 1997, 11: 108-111

242. Okafor N. Ecology of microorganisms on chitin buried in soil // J. Gen. Microbiol. 1966a. 44: 311-327.

243. Okafor N. Estimation of the decomposition of chitin in soil by the method of carbon dioxide release // Soil Science. 1966b. 102:140-142.

244. Ordentlich A, Elad Y, Chet I. The role of chitinase of Serratia marcescens in biocontrol'of Sclerotium rolfsii // Phytopathology. 1988. 78: 84-88.

245. Pankratov T.A, Kulichevskaya I.S, Liesack W. and Dedysh S.N: Isolation of aerobic, gliding, xylanolytic and laminarinolytic bacteria from acidic

246. Sphagnum peatlands and emended description of Chitinophaga arvensicola // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. 56: 2761-2764.

247. Parcham J. A., Deng S. P. Detection, guantification of (3-glucosaminidase activity in soil // Soil Biol. & Biochem. 2000. 32: 1183-1190.

248. Pectinase database http://pec.biodbs.info/index.html

249. Pel R., Hessels G., Aalfs H., Gottschal J.C. Chitin degradation by Clostridium sp. strain 9.1 in mixed culture with saccharolytic and sulfate-reducing bacteria // FEMS Microbiology Letters. 1989. V. 62. Iss. 3. P. 191-200.

250. Pitt J.I. 1988. A laboratory guide to common Penicillium species. 2nd ed. North Ryde, N.S.W., Australia: Publ. by the author. 187 p.

251. Poulsen P.H.'B., Muller J., Magid J. Determination of relationship between chitinase activity and microbial diversity in chitin amended compost // Bioresource Techonoly. 2008. 99: 4355-4359.

252. Pourcher A-M., Sutra L., Hebe I., Moguedet G., Bollet C, Simoneau Ph., Gardan L. Enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from refuse of a landfill // FEMS Microbiology Ecology. 2001. 34: 229-241.

253. Ramaiah N., Hill R.T., Chun J., Ravel J., Matte M.H., Straube W.L. and Colwell R/r/ Use of a chiA probe for detection of chitinase genes in bacteria from the Chesapeake Bay // FEMS Microbial. Ecol. 2000. 34: 6371.

254. Raskin L., Stromley J.M., Rittmann B.E., Stahl D.A. Group-specific 16S rRNA hybridization probes to describe natural communities of methanogens // Appl. Environ. Microbiol. 1994. 60: 1232-1240.

255. Reguera Gemma L., Leschine Susan B. Chitin degradation by cellulolytic anaerobes and facultative aerobes from soils and sediments // FEMS Microbiology Letters 204. 2001. pp 367-374.

256. Repka V. Intra- and extracellular isoforms of PR-3 class chitinase in virus-infected cucumber plants // Acta Virol. 1997. 41(2): 71-75.

257. Revah-Moiseev S. & Carroad A. Conversion of the enzymatic hydrolysate of shellfish chitin to single-cell protein // Biotechnol.& Bioengng. 1981. 23(8): 1067-1072.

258. Rodrigues J;, Santos M. J., Copa-Patio J. L. and Peprez-Leblic M. I. Chitinolytic Activity produced by Penicillium oxalicum in different culture media.//Letters Applied Microbiol. 1993. 16(2): 69-71.

259. Rodrigues-Kabana R., Godoy G., Morgan-Jones G. and Shelby R. A. The determination of soil chitinase activity: Conditions for assay and ecological studies. // Plant and soil. 1983. 75 (1): 95-106.

260. Roller C., Wagner M., Amann R., Ludwig W., Schleifer K.-H. In situ probing of Gram-positive bacteria with high DNA G+C content using 23 S rRNA-targeted oligonucleotides//Microbiology. 1994. 140: 2849-2858.

261. Rossello-Mora R., Thamdrup B., Shafer H., Weller R. and Amann R. The response of ■ the microbial community of marine sediments to organic carbon input'under anaerobic conditions // Syst. Appl. Microbiol. 1999. 22: 237-248.

262. Rowena L., Gabib R, Gabib E. // Anal. Biochem. 1982. V. 127. P. 402412.

263. Ruiz- Sanchez A., Cruz-Camarillo R., Salcedo-Hernandes R., Ibarra J.E., Barboza-Corona J.E. Molecular Cloning and Purification of an Endochitinase from Serratia marcescens // Mol. Biotechnol. 2005. № 31 (2). P. 103-112.

264. Sahai A. S., Manocha M. S. Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction. // FEMS Microb. Reviews. 1993. 11: 317-338.

265. Sakai T., Sakamoto T., Hallaert J. & Vandamme E.J. Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties, and applications // Adv. Appl. Microbiol. 1993. 39: 213-294.

266. Sato K., Azama Y., Nogawa M., Taguchi G. And Shimosaka M. Analysis of a change in bacterial community in different environments with addition of chitin or chitosan // J. Bioscience & Bioengineering. 2010. 109 (5):472-478.

267. Satokari, R.M., E.E. Vaughan, A.D.L. Akkermans, M. Saarela, and W.M. de Vos. Bifi dobacterial diversity in human feces detected by genusspecific PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. 2001. 67: 504-513.

268. Schafer H., Muyzer G. Denaturing gradient gel electrophoresis in marine microbial ecplogy // Marine Microbiology. Methods in Microbiology. Ed. J.H. Paul. London: Acad. Press. 2001. 30: 425-468.

269. Schiewer S. and Patil S.B. Pectin-rich fruit wastes as biosorbents for heavy metal removal: Equilibrium and kinetics. // Bioresource Technology. 2008. 99(6): 1896-1903.

270. Schrempf H. Recognition and degradation of chitin by streptomycetes // Antonie vanLeeuwenhoek. 2001. 79: 285-289.

271. Seidl V., Huemer B., Seiboth B., Kubicek C.P. A complete survey of Trichoderma chitinases reveals three distinct subgroups of family 18 chitinases // FEBS J. 2005. 272: 5923-5939.

272. Sembiring, L., Ward, A.C., and Goodfellow, M. Selective isolation and characterization of members of the Streptomyces violaceusniger clade associated with the roots of Paraserianthes falcataria // Antonie Van Leeuwenhoek. 2001. 78: 353-366.

273. Seymour G.B., Knox J.P. Pectin's and their manipulation. USA: Blackwell, 2002. 250p.

274. Song J. H., R. J. Murphy, R. Narayan and G. B. H. Davies. Biodegradable and compostable alternatives to conventional plastics. // Phil. Trans. R. Soc.B. 20091 364: 2127-2139.

275. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: A place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology//Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. 44 (4): 846-849.

276. Stackebrandt E., Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards // Microbiology today. 2006. P. 152-155.

277. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes // In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic Acid Techniques in

278. Bacterial Systematics. 1991. Wiley, New York. p. 205-248.289

279. Stopnisek N., Gubry-Rangin C., Hôfferle S., Nicol G.-W., Mandic-Mulec I. and Prosser J.I. Thaumarchaeal Ammonia Oxidation in an Acidic Forest Peat Soil Is Not Influenced by Ammonium Amendment // Appl. Environm. Microbiol. 2010. 76 (22): 7626-7634.

280. Stutzenberger F.J. Inducible thermoalkalophilic polygalacturonate lyase from Thermonomospora fusca // J. Bacteriol. 169: 2774-2780.

281. Suzuki K., Taiyji M., Sugawara N., Nikaidou N., Henrissat B. and Watanabe TV The third chitinase gene (chi C) of Serratiamarcescens 2170 and the relationship of its product to other bacterial chitinases // Biochem. J. 1999. 343: 587-596.

282. Takayanagi T., Ajisaka K., Takiguchi Y. &Shimahara K. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u // Biochim. Biophys. Acta. 1991. 1078: 404-410.

283. Thakur B.R., Singh R.K. and Handa A.K. Chemistry and Uses of Pectin — A Review // Crit. Rev. Food Sci.& Nutrition. 1997. 37(1): 47-73.

284. Tamura K., Dudley J., Nei M. and Kumar S. MEGA4: Molecular Evolutionary genetic Analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and ¡Evolution. 2007. 24: 1596-1599.

285. Terahara T., Ikeda S., Noritake C., Minamisawa K., Ando K., Tsuneda S., Harayama S J Molecular diversity of bacterial chitinases in arable soils and the effects of environmental factors on the chitinolytic bacterial community

286. Soil. Biol, and Biochem. 2009. 41: 473-480.29029k Taranathan R.N. and Kittur F.S. Chitin the undisputed biomolecule of great potential // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2003. 43: 61-87.

287. Thompson S.E, Smith M, Wilkinson M.C, Peek K. // Identification and Characterization of a Chitinase Antigen from Pseudomonas aeruginosa Strain 385 // Appl. and Environmental Microbiology. 2001. № 9. V. 67. P. 4001-4008.

288. Timonen S. and Bomberg M. Archaea in dry soil environments // Phytochem. Rev. 2009. 8: 505-518.

289. Tsigos I, Bouriotis V. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 26286-26291.

290. Tsujibo H, Minoura K., Miyamoto K, Endo H, Moriwaki M. and Inamori Y. Purification and properties of a thermostable chitinase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. 59: 620-622.

291. Veldkamp H. A study of the aerobic decomposition of chitin by microorganisms // Meded Landbouwhogesch Wageningen. 1955. 55: 127174.

292. Uffen R.L. Xylan degradation: a glimpse at microbial diversity // J. of Industr. Microb. Biochem, 1997. v. 19. p. 1-6e

293. Wagner M, 'Horn M, Daims H. Fluorescence in situ hybridisation for the identification and characterisation of prokaryotes. // Curr. Opin. Microbiol. 2003. 6(3): 302-309.

294. Watanabe TJ, Kanai R, Kawase T, Tanabe T, Mitsutomi M, Sakuda S, Miyashita K. Family 19 chitinases of Streptomyces species:ccharacterization and distribution//Microbiology. 1999. 145: 3353-3363.

295. Williamson, N., Brian, P., and Wellington, E. M.: Molecular detection of bacterial and streptomycete chitinase in the environment // Antonie Van1.euwenhoek. 2000. 78: 315-321.

296. Woods D. 1988. U.S. Patent 4,735,737.

297. Xiao X., Yin X., Lin J., Sun L., You Z., Wang P., and Wang F. Chitinase Genes in Lake Sediments of Ardley Island, Antarctica // Appl. Environm. Microbiol. 2005. 71 (12):7904-7909.

298. Xiao Y., Bozd J., Grosse S., Beauchemin M., Coupe E., Lau P. Mining Xantomonas and Streptomyces genomes for new pectinase-encoding sequences and their heterologous expression in Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biothechnol. 2008. 78: 973-981.

299. Yang C.H. ahd Crowley D.E. Rhizosphere microbial community structure in relation to'root location and plant iron nutritional status // Appl. Environ. Microbiol. 2000. 66: 345-351.

300. Zelentski S.N., Akopova T.A. Solid state modification of polysaccharides under conditions of plastic flow // Polymer Degradation and Stability. 2001. V. 73. P. 557-560.

Информация о работе

Манучарова, Наталия Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем"

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Манучарова, Наталия Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем"

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Манучарова, Наталия Александровна

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Манучарова, Наталия Александровна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гидролитические прокариотные комплексы наземных экосистем
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология