Психротолерантные актиномицеты в наземных экосистемах различных климатических зон

Дуброва, Мария Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Психротолерантные актиномицеты в наземных экосистемах различных климатических зон
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Психротолерантные актиномицеты в наземных экосистемах различных климатических зон"

На правах рукописи

Дуброва Мария Сергеевна

ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ В НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ РАЗЛИЧНЫХ КЛИМАТИЧЕСКИХ ЗОН

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

10 ОКТ 2013

Москва-2013

005534648

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Зенова Галина Михайловна

Официальные оппоненты: Терехова Лариса Петровна

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе» Российской академии медицинских наук, руководитель отдела микробиологии

Демкина Елена Витальевна кандидат биологических наук, Федеральное государственное учреждение науки Институт микробиологии имени

С.Н. Виноградского Российской академии наук, научный сотрудник

Ведущее учреждение: Государственное научное учреждение

«Зональный научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока имени Н.В. Рудницкого» Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита диссертации состоится «29» октября 2013 года в 15:30 в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 в МГУ имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан » сентября 2013 года.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, факультет почвоведения, Ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета

Зенова Галина Михайловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Исследование закономерностей действия температурного фактора на активность жизнедеятельности микробных популяций является актуальной современной задачей. Адаптации к температуре влияют на интенсивность микробного дыхания, в ходе которого выделяется двуокись углерода, являющаяся одним из «парниковых газов». Изменение концентрации этих газов приводит к общему изменению климата. Поэтому актуальна проблема зависимости от температуры функциональной активности микроорганизмов, в частности активности мицелиальных актинобактерий - актиномицетов (Звягинцев и др., 2011).

Традиционно считалось, что актиномицеты с трудом адаптируются к низким температурам, и среди них очень мало представителей, способных жить в холодных местах обитания. В последнее время в литературе появились работы, посвященные выделению психротолерантных мицелиальных актинобактерий из холодных мест обитания (Xu, Jiang, 1996). Существуют лишь разрозненные сведения об обнаружении психротолерантных актиномицетов в почвах (Wang et al., 2004). Так отмечалось, что в почвенных образцах, собранных в альпийских луговых экосистемах, обнаружены психротолерантные актиномицеты, принадлежащие к родам Streptomyces, Micromonospora, Nocardia, Promicromonospora. Исследование ферментативной активности выделенных штаммов показало, что стрептомицеты более активны по сравнению с представителями других родов (Xu, Jiang, 1996). Авторы показали, что в условиях холодного климата в Китае среди почвенных актиномицетов преобладают представители рода Streptomyces. Среди психротолерантных актиномицетов, выделенных из лесных и луговых почв юго-восточного Тибета, обнаружены представители рода Actinosynnema (Не et al., 2004). Однако до сих пор остается невыясненным вопрос о том, насколько значимо участие психротолерантных актиномицетов в процессах формирования микробных комплексов наземных экосистем разных климатических зон, и каков потенциал продукции биологически активных веществ почвенными психротолерантными актиномицетами.

Цель работы.

Определение закономерностей распространения и функционирования психротолерантных актиномицетов в наземных экосистемах различных климатических зон.

Задачи исследования:

1. Определение численности психротолерантных и мезофильных актиномицетов в почвах и растительных субстратах наземных экосистем разных почвенно-климатических зон.

2. Исследование динамики роста мицелия психротолерантных актиномицетов в почве.

3. Определение доли метаболически активных психротолерантных представителей филума Actinobacteria от метаболитически активных психротолерантных представителей домена Bacteria в прокариотных микробных сообществах почв и растительных субстратов наземных экосистем.

4. Экофизиологическая характеристика культур психротолерантных актиномицетов, выделенных из экосистем различных климатических зон.

5. Определение температурного диапазона и диапазона влажности роста выделенных культур психротолерантных актиномицетов.

Научная новизна.

Впервые установлено, что в северных почвах с низкими температурами, не превышающими 10°С даже в поверхностных слоях в летнее время года, психротолерантные актиномицеты активно растут и развиваются, образуют мицелий и составляют неотъемлемую часть гидролитического микробного блока, принимающего участие в деградации растительных остатков. Численность психротолерантных актиномицетов составляет в почвах и растительных субстратах тысячи и сотни тысяч КОЕ/г субстрата, достигая наиболее высоких значений в местообитаниях с высоким содержанием органического вещества и постоянно низкой температурой. Количество психротолерантных актиномицетов достоверно снижается в почвах южных климатических зон по сравнению с северными. Доля психротолерантных метаболитически активных представителей филума Actinobacteria составляет от 4 до 33% от биомассы психротолерантных метаболитически активных представителей домена Bacteria в прокариотных микробных сообществах почв и растительных субстратов изученных наземных экосистем. Биомасса психротолерантных метаболитически активных мицелиальных актинобактерий, как правило, превышает биомассу психротолерантных метаболитически активных одноклеточных актинобактерий. Исследование экофизиологических свойств почвенных психротолерантных актиномицетов показало, что при уменьшении температуры культивирования от 20°С до 5°С повышается содержание ненасыщенных жирных кислот в липидах

клеточных мембран стрептомицетов. Экониши психротолерантных и мезофильных актиномицетов различаются не только по фактору температуры, но и по спектру потребляемых субстратов. Экспериментально показано, что психротолерантный актиномицет Лгер/оотусе^ ^¡яеш Н.5.6 РЯ837628 является ксеротолерантным.

Практическая значимость.

Исследования актиномицетов, адаптированных к существованию в холодных почвах, позволяют не только расширить пределы наших представлений об экологических нишах, занимаемых мицелиальными актинобактериями, но и выявить среди холодостойких видов продуценты новых биологически активных веществ. Знание закономерностей распространения и функционирования психротолерантных актиномицетов в экосистемах различных климатических зон будет способствовать созданию схем управления микробными популяциями в исследованных районах. Материалы исследований могут быть использованы в лекционных курсах по биологии почв и экологии актиномицетов.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (20092013), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (2009) и на VI Всероссийском съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева (2013).

Публикации.

По результатам исследований опубликовано 16 печатных работ, из них 7 статей в реферируемых журналах, входящих в список журналов, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ для опубликования результатов диссертационных работ.

Объем работы.

Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части (объекты и методы исследования, результаты, обсуждение), выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертации изложены на Л ^ страницах текста, содержат 29 рисунков и таблиц. Список литературы включает ¿2./ источников, в том числе на иностранном языке.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность заведующему кафедры биологии почв факультета почвоведения, член-корр. РАН, профессору, д.б.н. И.Ю. Чернову, своему научному руководителю профессору, д.б.н. Г.М. Зеновой, сотрудникам кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ, особенно профессору, д.б.н. Д.Г. Звягинцеву, д.б.н. П.А. Кожевину, д.б.н. H.A. Манучаровой, к.б.н. Т.А. Грачевой, к.б.н. A.B. Якушеву. Благодарю аспирантов факультета почвоведения МГУ Е.П. Макарову и М.Н. Маслова за предоставление образцов почв для исследования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы почв и растительных субстратов, отобранные в экосистемах различных климатических зон, контрастных по температурному фактору - зоны тундры, северной и южной тайги, лесостепной зоны (табл. 1).

Для выделения и учета актиномицетов в исследуемых почвах и растительных субстратах использовали традиционный метод посева из разведений почвенных и растительных суспензий на агаризованную питательную среду Гаузе 1 (Гаузе и др., 1983). Учитывая температурные границы и оптимумы роста исследуемых мезофильных и психротолерантных актиномицетов, чашки с посевами инкубировали при трех температурах 5, 20 и 28°С. Психротолерантными считали актиномицеты, выделяющиеся при инкубировании посевов при 5 и 20°С.

Для изучения динамики длины мицелия почвенных психротолерантных актиномицетов использовали метод микрокосмов. Исследовали образцы почв и растительных субстратов разных климатических зон. Подготовку и инициацию микробной сукцессии увлажнением проводили согласно традиционно используемой методике (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991). Инкубирование почвы, а также посевов из почвенных суспензий проводили в термостатах при температурах 5, 20°С. Посевы из почвенных образцов производили на 1, 3, 7, 14, 21, 28-е сутки после инициации сукцессии. Определение длины мицелия в исследуемых почвах и растительных субстратах проводили с помощью люминесцентно-микроскопического метода. Препараты для подсчета мицелия актиномицетов окрашивали акридином оранжевым (Кожевин, 1989; Полянская и др., 1995).

Таблица 1. Характеристика объектов исследования

Название почвы, исследуемый образец и глубина взятия образца (см) Ряйон взятия обпазиа Среднегодовая температура почвы на глубине 20 см (по Лнмо, 1976) Сумма активных температур почв выше !0°С на глубине 20 см (по Димо, 1976)

Криозем палево-метаморфизированный, (0-30) нано-полигональная тундра, остров Хейса, архипелаг Земля Франца Иосифа от-12 до-8 400е

Торфя но-криозем типичный, образцы мха и горизонты ТО* Т1-ВС8 типичная тундра, Центральный Ямал от-12 до -8 400°

Цветковые растения тундровые биоценозы, Тарея, п-ов Таймыр от -8 до -4 400-1200е

Криозем грубогумусный глееватый, образцы мха н торфяного горизонта мохово-лишайниково-кустарничковая тундра в районе г. Воркуты от -8 до -4 400-1200°

Литоземы, сухоторфяно-подбур иллювиально-гумусовый, образцы мхов, лишайников и верхнего горизонта (0-10) горная тундра, Северо-Западная Фенноскандия, Швеция от -8 до -4 400-1200°

Глее «слабоподзол истая, горизонт Ап (0-10) северная тайга, окрестности г. Надыма, Надымский район Ямало-Ненецкого автономного округа от -8 до -4 400-1200°

Подзол, гипсовый петрозем, серо-гумусовые турбнрованые почвы (0-5) северная тайга, Чугский заказник, Архангельская обл. от 4 до 8 1200-2000°

Подзол иллювиалыю-железистый, образцы подстилок и минеральной части почвы (9-30) северная тайга, Большой Соловецкий остров от 4 до 8 1200-2000°

Пелозем гумусовый глсевый (0-5) северная тайга, Пинежский заповедник, Архангельская обл. от 0 до 4 -

Торфяная олиготрофная, торфяный горюонт (0-10) южная тайга, Западнодвинский р-н Тверской обл. от 4 до 8 1200-2000°

Торфоземы, торфяный горизонт (о-зо) южная тайга. Дмитровский район, Московской области от 4 до 8 1200-2000°

Подзол иллювиалыю- железистый образцы подстилок и минеральной части почвы (5-50) южная тайга, Кировская область в районе г. Нолинска от 4 до 8 1200-2000°

Аллювиальная темно-гумусовая почва, образцы подстилки и минеральная часть (0*100) лесостепь, Днепропетровская область, г. Павлоград, Украина от 8 до 12 2800-3600°

Серо гумусовая (дерновая) образцы подстилки и минеральной части почвы (3-100) лесостепь, Днепропетровская область, г. Павлоград, Украина от 8 до 12 2800-3600°

Названия почв приведены по «Классификации и диагностике почв России» (2004).

Определение эмиссии диоксида углерода психротолерантными актиномицетами. Культуру микроорганизма помещали в пенициллиновые флаконы (размер инокулята соответствовал одной бактериологической петле) с 5 мл стерильной среды Гаузе 1 с крахмалом и герметично закрывали стерильными резиновыми пробками. Инкубацию проводили динамически — на качалке (130 об/мин) при трех различных температурах — при 5, 20 и 28°С. Контролем во всех экспериментах служили культуры во флаконах со средой, отличающейся от опытных сред отсутствием крахмала. С целью избежания создания давления газа над образцом, за сутки перед измерением флаконы проветривали. Углекислый газ определяли методами газовой хроматографии (Степанов, 2002).

Молекулярный метод флюоресцентной гибридизации in situ (метод FISH-fluorescent in situ hybridization) использовали для оценки биомассы метаболически активных клеток бактерий. В работе применен спектр зондов, специфичных для представителей домена Bacteria, а также отдельной филогенетической группы Actinobacteria (Ravenschlag et al., 2001; Манучарова, 2008). Использовали рРНК-специфичные флюоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды с последовательностью нуклеотидов для группы Bacteria-. 5' GCT GCC ТСС CGT AGG AGT 3' для группы Actinobacteria: 5' TAT AGT TAC CAC CGC CGT 3' в сочетании с немеченым олигонуклеотидом 5' TAT AGT TAC GGC CGC CCGT 3'.

Количество метаболически активных микробных клеток и длину мицелия, содержащиеся в 1 г почвы, вычисляли по формуле: N=(Sian)/(vS2c), где N -количество клеток или длина мицелия (мкм) в 1 г почвы; а - среднее количество клеток или длина мицелия в поле зрения; Si — площадь препарата (мкм2); п - показатель разведения почвенной суспензии (мл); v — объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 - площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г). При расчете биомассы учитывали, что 1 м сухого актиномицетного мицелия диаметром 0,5 мкм имеет биомассу 3,9х10'8 г (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Препараты анализировали с использованием люминесцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filter set 15 для зондов и Filter set 09 для окраски акридином оранжевым. Численность целевых групп микроорганизмов в образцах определяли путем учета количества гибридизированных с зондами клеток в 50 полях зрения микроскопа на одной ячейке, с последующим расчетом численности соответствующих популяций на 1 г почвы.

Оптимальные и ограничительные для роста культур актиномицетов температуры определяли по величине радиальной скорости роста колоний на плотной питательной среде Гаузе 1 при температурах 5, 8, 10, 15, 20, 28 и 37°С.

Определение состава жирных кислот липидов мембран актиномицетов проведено в лаборатории д.б.н. Г.А. Осипова с помощью хромато-масс-спектрометрического метода на масс-спектрометре AG-5973 Agillent technologies, США (Осипов и др., 2003; патент РФ № 2086642 от 10.08.97). Автор выражает искреннюю благодарность Георгию Андреевичу Осипову.

Методом мультиреспирометрического тестирования (МРТ) определяли специфичность потребления ресурсов исследуемыми культурами мезофильных и психротолерантных актиномицетов (Campbell et al., 2003). Использовали модифицированный метод МРТ (Марченко и др., 2005).

В каждую ячейку планшета вносили по 0,5 мл суспензии, содержащей актиномицет с высокой популяционной плотностью (не менее 10 КОЕ/мл), и один из трех ресурсов: гистидин, маннит, сахарозу (концентрация 35 мг/мл). В качестве контроля в соответствующие ячейки заливали дистиллированную воду. В крышку планшета заливали индикаторный гель с необходимыми для регистрации С02 компонентами. Планшеты инкубировали при 28°С в течение 3 суток. В зависимости от количества образовавшегося в ячейках углекислого газа изменялась оптическая плотность гелевого материала. Интенсивность окраски индикаторного геля оценивали колориметрически с помощью специальной программы. Анализ данных, полученных при сканировании крышек с индикаторным гелем, производился с помощью методов многомерной математической статистики.

В опытах по определению ксеротолерантности умеренного психрофилыюго стрептомицета Streptomyces griseus Н.5.6 FR837628 различные уровни влажности создавали соответствующей концентрацией глицерина в среде. Создавали три уровня влажности воздуха, соответствующие различным уровням давления влаги Р (aw): -53,6 МПа (aw 0,67) - экстремально низкий, -22,6 МПа (aw 0,86), приблизительно соответствующий максимальной адсорбционной влагоемкости почвы (MAB), и -2,8 МПа (aw 0,98), соответствующий максимальной гигроскопической влажности почвы. За образованием микроколоний и развитием актиномицета наблюдали, используя оптический микроскоп Carl Zeiss Axiostar.

Суммарную ДНК из культур актиномицетов экстрагировали с помощью PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями

производителя. Более подробная методика амплификации приведена в диссертации.

Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA изучаемого штамма был проведен с помощью программы BLAST. (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://iwbrown.mbio.ncsu.edu/ BioEdit/bioedit.html). а их множественное выравнивание - с использованием программы CLUSTAL W 1,75. Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма «neighbor-joining» (NJ) в программе MEGA 4. Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев. Нуклеотидные последовательности гена 16S rRNA выделенных штаммов депонированы в Gen Bank NCIB с присвоением культурам индивидуальных номеров доступа.

Секвенирование генов 16S rRNA проводили в Центре «Биоинженерия» РАН с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver sequence d/dNTP Vixes, Promega, США).

Результаты исследований

Характеристика численности и таксономической структуры актиномнцетных комплексов почв и растительных субстратов экосистем различных климатических зон

Влияние среднегодовой температуры почвы как экологического фактора на численность актиномицетов, выделяемых из почв разных температурных режимов при различной температуре инкубирования посевов, было оценено методом двухфакторного дисперсионного анализа (рис. 1).

Показано, что при инкубировании посевов при 28 и 20°С наибольшее количество актиномицетов выделяется из почв с положительными среднегодовыми температурами, тогда как количество актиномицетов, выделяемых при тех же условиях из почв с отрицательными среднегодовыми температурами, достоверно ниже. Количество психротолерантных актиномицетов, выделяемых из почв при инкубировании посевов при 5°С, достоверно снижается в почвах с положительными среднегодовыми температурами, по сравнению с количеством психротолерантных актиномицетов, выделяемых из почв с отрицательными температурами. Фактор среднегодовой температуры почвы влияет на количество актиномицетов, выделяемых при всех трех температурах, на 10%.

Сигтвп! е(Й01: Р(8. 105)= ,88550, р»,53140

5 4 3

3 ,

X 2

•■«■■■ 5 'С ЗЕ2СО ЗЕ 28°с

-8-14 8 12

Среднегодовая температура почвы. °С

Рис. 1. Зависимость количества выделяемых из почв актиномицетов от среднегодовой температуры почвы и температуры инкубирования посевов

Ранговое распределение частот встречаемости актиномицетов показало, что при инкубировании посевов при 5°С актиномицеты выделяются из почвы реже в 2-3 раза, чем при инкубировании посевов при 20 и 28°С (рис. 2). При этом численность актиномицетов колеблется от сотен до сотен тысяч КОЕ/г

■ 5°С I I28°С

|30%1

ШЗ шр

[Т8%1 ГГо%1

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0

КОЕ

Рис. 2. Ранговое распределение частот встречаемости актиномицетов, выделяемых из почв при разной температуре

Модальная численность при инкубировании посевов при 5°С составляет от тысяч до десятков тысяч КОЕ/г почвы (в 10% случаев), а при инкубировании посевов при 20 и 28°С от десятков до сотен тысяч КОЕ/г почвы (25 и 30%).

В тундровых криоземах численность психротолерантных актиномицетов сопоставима с численностью мезофильных форм. Особенностью исследованных криоземных почв является крайне неравномерное распределение психротолерантных актиномицетов по горизонтам. Во всех исследованных криоземах психротолерантные актиномицеты, выделяемые в посевах, инкубированных при 5°С, выявлены только в нижних горизонтах (10-20 см).

Особое место среди исследуемых северных почв занимают почвы, расположенные в карстовом ландшафте Северной тайги (рис. 3), где за счет перепадов рельефа образуются крупные замкнутые понижения, в которых после зимы застаивается холодный воздух и не тает снег под затененными склонами.

Гипсово-пегрозём гумусовый типичный

|а]Ч________ПОДЗОЛ

п" • ■■ " .....иллювиально-железистыи

з _____ Серо-гумусовая

" ^ИЩ '»» (ДР тГ— гурбированная

ДО ^-

Поток-

холодного воздуха

Пелозём гумусовый глеевый

Рис. 3. Распределение актиномицетов разных температурных групп в почвах отдельных геоморфологических элементов карстового ландшафта Северной тайги

Важным фактором формирования здесь низких температур является поток холодного воздуха из трещин, связанных с карстовыми пещерами. В результате, температура почвы на дне карстовой воронки на глубине 10 см не превышает 4°С даже в летний период времени. Здесь формируются богатые гумусом пелоземы, профиль которых имеет мощность 3-5 см и состоит из подстилки, гумусового горизонта и нижнего оглееного горизонта. Низкие температуры этих почв способствуют развитию в них психротолерантных актиномицетов в количествах десятков и сотен тысяч КОЕ/г субстрата. Доля этих актиномицетов в комплексе превышает долю мезофильных форм.

Литоземы горной тундры Северо-Западной Фенноскандии (Швеция) характеризуются высокой численностью психротолерантных актиномицетов, выделяемых при инкубировании посевов при 5°С, иногда превышающей численность мезофильных.

Отметим, что как для пелоземов, так и для литоземов характерно постоянно низкая температура и высокое содержание гумуса (до 10% и выше).

Значительное количество (десятки и сотни тысяч КОЕ/г субстрата) психротолерантных форм, часто превышающее количество мезофильных, выявлено в подзолах иллювиально-железистых (Большой Соловецкий остров). Психротолерантные актиномицеты составляют значительную часть актиномицетного комплекса (а иногда и целиком комплекс) в лесных подстилках этих почв. В некоторых минеральных горизонтах подзолов численность психротолерантных актиномицетов, выделяемых при 5°С, составляет миллионы КОЕ/г почвы.

Из всех таежных почв торфозем (окультуренная торфяная почва), используемый в сельском хозяйстве более 50 лет, оказался наиболее богат актиномицетами. Численность психротолерантных актиномицетов исчислялась здесь сотнями тысяч КОЕ/г почвы при инкубировании посевов при 5°С и при 20°С, лишь незначительно (недостоверно) уступая численности мезофильных форм.

Из аллювиальной темно-гумусовой почвы под сосновым бором в лесостепной зоне Украины психротолерантные актиномицеты при инкубировании посевов при 5°С не выделялись. Численность психротолерантных форм, выделяемых при 20°С, составляла- от тысяч до сотен тысяч КОЕ/г почвы и была сопоставима с численностью мезофильных форм. Численность актиномицетов в исследуемой почве падает с глубиной.

В серогумусовой (дерновой) почве под смешанным лесом в лесостепной зоне Украины при 5°С выделяются психротолерантные актиномицеты из

верхних богатых гумусом горизонтов в количестве до сотен тысяч КОЕ/г почвы. В нижнем иллювиальном горизонте их количество достигало тысяч КОЕ/г почвы. Из элювиальных бедных горизонтов при 5°С актиномицеты не выделялись. При 20°С психротолерантные актиномицеты выделялись из всех горизонтов в количестве десятков тысяч КОЕ/г почвы, что сопоставимо с численностью мезофильных форм. Наблюдается понижение численности актиномицетов с глубиной.

Выделяемые из исследованных почв на плотную питательную среду Гаузе 1 актиномицеты по фенотипическим признакам идентифицированы как представители рода Streptomyces. Видовое разнообразие стрептомицетного комплекса в исследованных северных почвах (криоземах, подзолах, литоземах) было невелико и ограничивалось двумя-тремя видовыми секциями и сериями — Albus Albus, Cinereus Achromogenes, Helvolo-Flavus Helvolus. В почвах лесостепной зоны Украины преобладали те же три видовые секции и серии рода Streptomyces.

В торфоземе южной тайги, богатом органическими остатками, при инкубировании посевов при 20°С в актиномицетном комплексе увеличивается число видовых секций и серий рода Streptomyces до пяти, часто выделяются редкие в других экосистемах виды фиолетовых и розовых актиномицетов - Streptomyces violaceoruber, Streptomyces lavendulae.

Доля психротолерантных актиномицетов, выделяемых из почв при инкубировании посевов при 5°С, составляет, как правило, третью часть почвенного актиномицетного комплекса. Психротолерантные актиномицеты (выделяемые при инкубировании посевов при 5 и 20°С) составляют большую часть комплекса.

В растительных субстратах экосистем тундровых и таежных зон (моховых разрастаниях, очесе, подстилках, тундровых растениях) психротолерантные актиномицеты выявляются в количествах, сопоставимых с мезофильными формами (от тысяч до сотен тысяч КОЕ /г субстрата), часто превышая последние по численности. Количество актиномицетов, выделяемых из растительных субстратов, остается сопоставимым с числом актиномицетов в соответствующих почвах. Доля актиномицетов, выделяемых из растительных субстратов при инкубировании посевов при 5°С, составляет третью часть актиномицетных комплексов. Психротолерантные актиномицеты (выделяемые при инкубировании посевов при 5 и 20°С) составляют большую часть комплекса.

Во мхах и лишайниках на поверхности литоземов видовое разнообразие стрептомицетов увеличивается по сравнению с почвой. Здесь доминируют

стрептомицеты, отнесенные к видовым секциям и сериям рода Streptomyces-Cinereus Chromogenes, Helvolo-Flavus Helvolus, Albus Albus. Часто встречаются виды из секций и серий Cinereus Achromogenes, Albus Albocoloratus, Roseus Lavendulae-roseus, Azureus Coerulescens.

Наиболее часто встречающимися в цветковых тундровых растениях являлись актиномицеты видовых секций и серий Cinereus Achromogenes и Helvolo-Flavus Helvolus. Из растений луга выделены фиолетовые актиномицеты Streptomyces violaceoruber, которые из других исследованных растений не выделялись.

В подстилке соснового леса на серогумусовой почве лесостепной зоны Украины разнообразие представлено тремя видовыми секциями и сериями рода Streptomyces - Albus Albus, Cinereus Achromogenes, Helvolo-Flavus Helvolus.

Как и в почвах, видовое разнообразие стрептомицетных комплексов в растительных субстратах падает при уменьшении температуры инкубирования посевов.

В растительных субстратах исследуемых экосистем численность психротолерантных актиномицетов составлет тысячи и сотни тысяч КОЕ/г субстрата и сопоставима с численностью мезофильных актиномицетов и с количеством почвенных актиномицетов. Однако в растительных субстратах психротолерантные актиномицеты более постоянный компонент актиномицетных комплексов, чем в почвах. Из всех исследованных растительных субстратов актиномицеты, выделяемые при инкубировании посевов при 5°С, не обнаружены только в тундровых мхах и в разрастаниях тундрового вереска и составляют в большистве исследуемых экосистем третью часть актиномицетного комплекса.

Динамика длины мицелия психротолерантных актиномицетов в ходе

сукцессии, инициированных увлажнением почв, контрастных по температурным режимам

Для наблюдения за динамикой развития мицелия актиномицетов в почве нами были выбраны три контрастные по температурным режимам почвы: криозем палево-метаморфизированный и глее-слабоподзолистая с отрицательными среднегодовыми температурами, а также торфяная олиготрофная почва с положительными среднегодовыми температурами, не превышающими 10°С.

Люминесцентно-микроскопические исследования показали, что в ходе микробной сукцессии, инициированной увлажнением почвы в микрокосмах, мицелий актиномицетов растет и развивается. Прирост мицелия при

инкубировании почвы при 5°С составлял наибольшую величину 389 м/г в торфяной почве, наименьшую - в глее-слабоподзолистой почве - 110 м/г, в криоземе - 250 м/г почвы (рис. 4). Экспериментальные сведения, полученные при прямом люминесцентно-микроскопическом исследовании развития мицелия психротолерантных актиномицетов в микрокосмах с разными по температурному режиму почвами, подтвердили положения, выведенные при исследовании численности психротолерантных актиномицетов методом посева — психротолерантные актиномицеты обнаруживаются в наибольшем количестве в постоянно холодных почвах, богатых растительными остатками или органическим веществом. Развитие мицелия психротолерантных актиномицетов при инкубировании почвы при 5°С в холодных почвах (криозем палео-метаморфизированный) или богатых растительными остатками (торфяная олиготрофная почва) происходит более интенсивно по сравнению с развитием мицелия психротолерантных актиномицетов при инкубировании при 5°С бедной органическим веществом глее-слабоподзолистой почвы.

Криозем палево-метаморфншрованый

I лес-слаоомодзолистаи почва

Торфяная олиготрофная почва

г почвы

Рис. 4. Динамика длины мицелия психротолерантных актиномицетов в ходе сукцессий, инициированных увлажнением почвы, при разных температурах инкубирования

В микрокосмах с образцами лесных подстилок психротолерантные актиномицеты развивались, мицелий увеличивался в длину, достигая около 450 м/г в подстилках кедра на Соловецком острове и 500 м/г в лесных подстилках на черноземе.

Исследование прокариотных микробных сообществ почв и растительных субстратов методом in situ гибридизации (метод FISH) с помощью 16S rRNA специфичных олигонуклеотидных зондов, определяющих представителей филума Actinobacteria

Исследования почвенных прокариотных микробных сообществ показали, что психротолерантные метаболически активные представители филума Actinobacteria составляют приблизительно от 4 до 33% в зависимости от типа почвы и температуры культивирования микрокосма от всех психротолерантных метаболитически активных представителей домена Bacteria (рис. 5).

Криозе.м Глее-слабопоазолистая

палево-метаморфнзированый почва

Торфозем типичный

Рис. 5. Доля психротолерантных метаболически активных представителей филума Actinobacteria (1) от биомассы психротолерантных метаболически активных представителей домена Bacteria (2) в прокариотных микробных сообществах исследуемых почв, инкубированных при разных температурах (метод FISH)

Наибольшая доля филума Actinobacteria в составе биомассы всех психротолерантных метаболически активных представителей домена Bacteria отмечена в прокариотном сообществе глее-слабоподзолистой почвы, наименьшая - в сообществе торфозема и литозема.

Исследование прокариотных микробных сообществ растительных субстратов показало, что в составе биомассы психротолерантных метаболитически активных представителей домена Bacteria доля филума Actinobacteria составляет от 10 до 23% при инкубировании при 5°С; и от 13 до 32% при 20°С. Отмечено, что при увеличении температуры инкубирования растений и очеса доля представителей филума Actinobacteria от всех бактерий прокариотного сообщества увеличивается, а при увеличении температуры инкубирования подстилки эта доля уменьшается.

В филуме Actinobacteria микробного прокариотного сообщества большинства исследуемых почв среди психротолерантных метаболически активных представителей мицелиальные формы составляют большую долю по сравнению с одноклеточными (рис. 6). Исключение составляет филум Actinobacteria микробного прокариотного сообщества криозема палево-метаморфизированного, где отмечено абсолютное доминирование одноклеточных психротолерантных метаболически активных представителей актинобактерий.

Крпозем палево-метаморфнзированый

5° «sL 20°

Глее-слабоподзол истая почва

Крпозем грубогумусный глееватый

5° 20°

/^46%

f46% В

Пелозем гумусовый глесвый

5° 20°

Литозем псрсгнойно-темногумусовый

5° 20°

Торфозсм типичный

5° 20°

Рис. 6. Соотношение биомасс метаболически активных мицелиальных (а) и одноклеточных (б) представителей филума АсИпоЬас1ег1а в прокариотных микробных сообществах исследованных почв, инкубированных при разных температурах

В составе филума Actinobacteria микробного прокариотного сообщества исследуемых растительных субстратов в наземных экосистемах тундры и тайги психротолерантные метаболически активные мицелиальные актинобактерии составляют большую долю по сравнению с одноклеточными. При повышении температуры инкубирования от 5 до 20°С доля метаболически активных одноклеточных актинобактерий в прокариотных микробных сообществах сфагнового очеса и лесной подстилки увеличивается. Исключение составляют тундровые растения, при инкубировании которых при 5°С метаболически активные психротолерантные одноклеточные представители доминируют в филуме Actinobacteria прокариотного микробного сообщества, а при повышении температуры до 20°С численность их уменьшается, и доминантами в филуме Actinobacteria становятся метаболически активные психротолерантные мицелиальные формы.

Экофизиологическая характеристика выделенных пихротолерантных

актиномицетов

Составлена коллекция культур психротолерантных актиномицетов, выделенных из почв и растительных субстратов экосистем различных климатических зон.

Диапазон роста выделенных психротолерантных актиномицетов.

Культуры идентифицированы по фенотипическим и молекулярно-биологическим признакам как представители рода Streptomyces и разделены на две группы по температурному диапазону роста. В одну группу отнесены культуры актиномицетов, растущих в температурных границах 5-37°С с оптимальной радиальной скоростью роста колоний при 20°С. Это психротолерантные стрептомицеты (рис. 7). К другой группе отнесены два штамма рода Streptomyces, идентифицированные по сиквенсу как S. beijiangensis 5.4.1 FR 837628 и S. griseus Н.6.5 FR 837632, имеющие диапазон роста от 0 до 28°С, оптимальный рост при 5°С. Это умеренные психрофильные стрептомицеты (рис. 7). Нуклеотидные последовательности последних двух культур стрептомицетов помещены в Gen Bank NCIB с присвоением культурам индивидуальных номеров доступа.

Оценка влияния температуры культивирования на эмиссию диоксида углерода при росте культур психротолерантного Streptomyces parvus шт. м!8 и умеренных психрофильных стрептомицетов S. beiiiansensis 5.4.1 .FR837628 и S. sriseus Н.6.5 FR 837632 на среде с крахмалом (среда Г1). При росте культур психротолерантного и умеренных психрофильных актиномицетов на среде с крахмалом в качестве единственного источника углерода и азота

эмиссия диоксида углерода увеличивалась в динамике и была значительно выше контроля (эмиссии диоксида углерода культурами исследуемых актиномицетов на среде без источника углерода и азота). Показано, что эмиссия диоксида углерода культурой 81гер1отусев beijiangensis 5.4.1 Р11837628 при инкубировании на среде с крахмалом при 5°С была выше по сравнению с эмиссией диоксида углерода другими культурами в адекватных условиях (рис. 8).

—х -б

—а -э

—««+ • 10

5 20 28

Температура, "С

Рис. 7. Зависимость радиальной скорости роста колоний стрептомицетов от температуры: 1 — 5. beijiangensis 5.4.1 FR 837628; 2 -5. griseus Н.5.6 FR837632; 3-5. lavendulae шт.ДН.5.1; 4-5. parvus м 18 FR846234; 5 -5. helvaticus шт. 8.5.2; 6-5. helvaticus шт.8.5.3; 7-5. wedmorensis шт.Н.5.2; 8-5. xantochromogenes шт.5.1; 9-5. caeruleus шт.Н. 5.4; 10-5. caeruleus шт.6.20.3

Величина эмиссии диоксида углерода при росте исследуемой культуры актиномицета при 20°С была выше по сравнению с величиной эмиссии при росте при 28°С. Таким образом, подтверждается наше положение, что исследуемую культуру Streptomyces beijiangensis 5.4.1FR837628 можно отнести к умеренным психрофильным актиномицетам. У двух других исследуемых культур стрептомицетов эмиссия диоксида углерода статистически достоверно не отличается при росте при 20°С и 28°С.

tern'sir: Unweighted Means Current effect: F(4, 45)=78,09i, p=0:0000 Type 111 decomposition Vertical bars denote 0,95 confidence intervals

110

100

£ 90

7. 70

Г*

о Hi)

ф 50

и ф 40

ф ч 30

л я 20

"Г 6 ......п. уЬ • ■• . .................

''/Г : .'•"¿••^..........

W/7 '^Sf':......................... 1 :

.............................................. ........................ .........................

EE 1

3E 2 з:: з

Температура, °C

Рис. 8. Зависимость эмиссии диоксида углерода психротолерантными стрептомицетами от температуры культивирования: 1 — Streptomyces beijiangensis 5.4.1FR837628; 2-5. griseus Н.6.5 FR837632; 3-5. parvus м 18 FR846234

Выявление функциональных особенностей психротолерантных актиномицетов методом мультиреспирометрического тестирования

(МРТ)

Мультиреспирометрическое тестирование почвенных психротолерантных и мезофильных актиномицетов (9 популяций) позволило выявить некоторые функциональные особенности исследуемых популяций. Все объекты были разделены на две условные температурные группы: «группа 1» -психротолерантные актиномицеты, «группа 2» - мезофильные актиномицеты (рис. 9).

Судя по диаграмме рассеивания и координатам центроидов можно утверждать, что исследуемые объекты имеют частичные пересечения в пространстве дискриминантных функций. Центроиды групп психротолерантов и мезофилов находятся близко друг к другу, а их области частично перекрываются. Отдельно от остальных членов группы психротолерантов располагается объект №3, представляющий собой культуру Streptomyces beijiangensis FR837628, которую мы считаем умеренным психрофилом. Этот объект образует самостоятельную, четко выраженную группировку, не пересекающуюся с группой 1 и 2.

Рис. 9. Мультиреспирометрическое тестирование популяций психротолерантных и мезофильных стрептомицетов

Можно предполагать, что экониши почвенных психротолерапнтных и мезофильных актиномицетов расходятся не только по фактору температуры, но и по другим измерениям, отражающих спектры потребления субстратов.

Доказательства ксеротолерантности умеренного психрофильного актиномицета еп'леи.у Н.6.5 Р11 837632

Выявлена зависимость роста психротолерантного стрептомицета ¿тоег« Н.5.6. Ж 837632 от двух экологических факторов - температуры и влажности. Показано, что каждому уровню влажности и температуры соответствует определенная специфика развития. Психротолерантный стрептомицет растет на среде при ОВ 98% (а„ 0,98) при температурах 20 и 28°С и проходит полный цикл развития от споры до образования колоний с субстратным, воздушным мицелием и цепочками новой генерации спор. При 5°С в условиях ОВ 98% отмечено образование субстратного мицелия, тогда как воздушный мицелий и споры не образуются. При ОВ 86% (а„ 0,86) культура растет при 28, 20 и 5°С, однако не проходит полного цикла развития: споры прорастают, образуя лишь субстратный мицелий без воздушного мицелия и спор. При экстремально низком уровне влаги ОВ 67% (а„ 0,67) видимого роста колоний актиномицета не наблюдается. Можно заключить, что исследуемый стрептомицет 5. griseus Н.5.6. РЯ 837632 является психротолерантным и ксеротолерантным.

Кг, мм/сутки

а 8,00-9.00 В 7,00-8,00 S 6.00-7.00 И 5,00-6,00

■ 4,00-5,00

■ 3,00-4.00

■ 2,00-3.00

■ 1,00-2,00 ■ 0,00-1,00

Температура, °С

Рис. 10. Зависимость скорости роста колоний стрептомицета Streptomyces griseus Н.5.6 FR 837632 от влажности среды и температуры инкубирования

Определение состава жирных кислот в липидах клеточных мембран умеренного психрофильного стрептомицета

Анализ состава жирных кислот актиномицетов Streptomyces beijiangensis 5.4.1FR837628, S. parvus м 18 FR846234 и 5. griseus Н.5.6 FR837632 показал, что при уменьшении температуры культивирования от 20°С до 5°С в липидах клеточных мембран повышается содержание ненасыщенных жирных кислот— изопентадеценовой, изо-9-гексадеценовой, 9-гексадеценовой, изо-11 -гептадеценовой и 9-октадеценовой. Этот экспериментальный факт свидетельствует о приспособленности культуры стрептомицета к развитию при низкой температуре.

выводы

1. Исследование широкого спектра почв и растительных субстратов экосистем разных климатических зон дало возможность показать, что численность психротолерантных актиномицетов составляет в почвах и растительных субстратах разных климатических зон от тысяч до сотен тысяч КОЕ/г субстрата, достоверно снижается в почвах южных климатических зон по сравнению с северными и достигает значительных величин в местообитаниях с высоким содержанием органического вещества и постоянно низкой температурой.

2. В опыте с микрокосмами в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и инкубированием почвы при разных температурах, показано, что мезофильные и психротолерантные актиномицеты в почвах растут, развиваются, образуют мицелий, который увеличивается в длину.

3. Впервые показано, что доля психротолерантных метаболически активных представителей филума Actinobacteria составляет от 4 до 33% от биомассы метаболически активных представителей домена Bacteria в прокариотных микробных сообществах почв и растительных субстратов. Биомасса мицелиальных психротолерантных метаболически активных актинобактерий, как правило, превышает биомассу одноклеточных актинобактерий. Исключение составляет криозем палево-метаморфизированный, образцы которого отобраны на территории архипелага Земли Франца-Иосифа, где доминируют психротолерантные метаболически активные одноклеточные актинобактерии.

4. Исследование некоторых экофизиологических свойств психротолерантных актиномицетов позволило экспериментально показать, что при уменьшении температуры культивирования от 20°С до 5°С повышается содержание ненасыщенных жирных кислот в липидах клеточных мембран стрептомицетов.

5. С использованием метода МРТ впервые показано, что экониши психротолерантных и мезофильных актиномицетов различаются не только по фактору температуры, но и по спектру потребляемых субстратов.

6. Экспериментально показано, что психротолерантный Streptomyces griseus H.5.6.FR837632, выделенный из промерзающей почвы, проявляет ксеротолерантность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Дуброва М.С., Зенова Г.М., Лысенко A.M., Манучарова H.A., Курапова А.И. Таксономическая и функциональная структура психротолерантных и термотолерантных комплексов почвенных актнномицетов // Теоретическая и прикладная экология. 2008. №3. С. 66-82

2 .Зенова Г.М., Дуброва М.С., Звягинцев Д.Г. Структурно-функциональные особенности комплексов почвенных психротолерантных актнномицетов // Почвоведение. 2010. Т. 43. №4. С. 482-487

3.Зенова Г.М., Манучарова H.A., Дуброва М.С. Температурные адаптации мицелиальных бактерий почв тундры и тайги // Теоретическая и прикладная экология. 2010. №3. С. 82-90

4. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Дуброва М.С., Грачева Т.А.,

Курапова А.И. Разнообразие почвенных актиномицетных комплексов, обусловленное температурными адаптациями мицелиальных актинобактерий // Теоретическая и прикладная экология. 2011. № 1. С. 4-23

5.Дуброва М.С., Лубсанова Д.А., Макарова Е.П., Кожевни П.А., Манучарова H.A., Зенова Г.М Психротолерантные актиномицеты в почвах тундры и северной тайги // Вестник Московского университета. Сер. 17 «Почвоведение». 2011. №2. С. 13-19

6. Зенова Г.М., Дуброва М.С., Кожевин П.А., Манучарова H.A.,

Звягинцев Д.Г. Температура как фактор формирования комплексов психротолерантных мицелиальных бактерий в почвах северных регионов // Известия РАН. Серия биологическая. 2012. №5. С. 493-500

1.Дуброва М.С., Зенова Г.М., Якушев A.B., Манучарова H.A., Макарова Е.А., Звягинцев Д.Г., Чернов И.Ю. Психротолерантные актиномицеты в органогенных горизонтах почв и растениях наземных экосистем тундры и тайги // Почвоведение. 2013. №8 С. 956-962

8. Дуброва М.С. Психрофильиые актиномицеты в торфяных почвах// «XV международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2008». М.: МАКС Пресс, 2008

9. Дуброва М.С. Психротолерантные актиномицеты в торфяных почвах //

«XVI международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2009». М.: МАКС Пресс, 2009

10. Дуброва М.С., Зенова Г.М. Почвенные умеренно психрофильные актиномицеты // «Материалы Всеросийского симпозиума с международным участием современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». М.: МАКС Пресс, 2009

11. Дуброва М.С. Сообщество психротолерантных актиномицетов в тундровых почвах России // «XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых секция Ломоносов — 2010». М.: МАКС Пресс, 2010

12. Дуброва М.С. Рост и развитие психрофильных актиномицетов в почвах северных широт // «XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых секция Ломоносов - 2011». М.: МАКС Пресс, 2011

13. Дуброва М.С., Зенова Г.М. Экофизиологические особенности психрофильных и психротолерантных актиномицетов // «Материалы Всеросийского симпозиума с международным участием биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее». М.: МАКС Пресс, 2011

14. Дуброва М.С., Зенова Г.М., Сообщество психротолерантных актиномицетов в холодных почвах России // «Материалы докладов VI Съезда общества почвоведов им. В.В. Докучаева». Кн. 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2012. С. 338

15. Зенова Г.М., Грачева Т.А., Курапова А.И., Дуброва М.С., Лубсанова Д.А. Температура как фактор формирования комплексов почвенных термотолерантных и психротолерантных мицелиальных актинобактерий // «Материалы докладов VI Съезда общества почвоведов им. В.В. Докучаева» Кн. 2. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2012. С. 347-348

16.Дуброва М.С. Сообщества психротолерантных актиномицетов в лесных подстилках Большого Соловецкого острова // «XX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых секция Ломоносов - 2013». М.: МАКС Пресс, 2013. С. 18-20

Подписано в печать: 23.09.2013 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 153 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дуброва, Мария Сергеевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

04201362844

Дуброва Мария Сергеевна

ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ В НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ РАЗЛИЧНЫХ КЛИМАТИЧЕСКИХ ЗОН

Специальность 03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Зенова Галина Михайловна

Москва-2013

Оглавление

Введение........................................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы..........................................................................................8

1.1. Понятие о психрофильных и психротолерантных микроорганизмах.........8

1.2. Физиолого-биохимические механизмы адаптации микроорганизмов к низким температурам.......................................................11

1.3. Распространение психрофильных актиномицетов в природных экосистемах.............................................................................................................17

1.4. Микробные комплексы почв северных территорий...................................23

1.5. Прогнозы изменений активности микробных сообществ и углеродного баланса северных почв в условиях глобального потепления.....28

Глава 2. Объекты и методы.......................................................................................33

2.1. Объекты исследования...................................................................................33

2.2. Методы исследования....................................................................................45

Глава 3. Результаты исследования...........................................................................53

3.1. Численность и таксономическая структура психротолерантных и мезофильных актиномицетных комплексов в почвах разных климатических зон.................................................................................................53

3.2. Численность и таксономическая структура психротолерантных актиномицетных комплексов в исследованных растительных субстратах экосистем различных климатических зон...........................................................63

3.3. Динамика длины мицелия психротолерантных актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением почв, контрастных по температурным режимам......................................................................................69

3.4. Исследование прокариотных микробных сообществ почв и растительных субстратов методом гибридизации in situ с помощью 16S rRNA специфичных олигонуклеотидных зондов, определяющих представителей филогенетической группы Actinobacteria................................73

3.5. Исследование таксономической структуры психротолерантного прокариотного микробного сообщества криозема палево-метаморфизированого...........................................................................................77

3.6. Зависимость радиальной скорости роста колоний актиномицетов, выделенных из почв и растительных субстратов наземных экосистем разных климатических зон....................................................................................81

3.7. Экофизиологические свойства психротолерантных актиномицетов, выделенных из почв разных климатических зон................................................84

Глава 4. Обсуждение результатов...........................................................................93

Выводы......................................................................................................................100

Список литературы..................................................................................................102

Приложение..............................................................................................................114

Введение

Актуальность темы.

формирования микробных комплексов наземных экосистем разных климатических зон, и каков потенциал продукции биологически активных веществ почвенными психротолерантными актиномицетами.

Цель работы.

Задачи исследования:

2. Исследование динамики роста мицелия психротолерантных актиномицетов в почве.

Научная новизна.

Численность психротолерантных актиномицетов составляет в почвах и растительных субстратах тысячи и сотни тысяч КОЕ/г субстрата, достигая наиболее высоких значений в местообитаниях с высоким содержанием органического вещества и постоянно низкой температурой. Количество психротолерантных актиномицетов достоверно снижается в почвах южных климатических зон по сравнению с северными. Доля психротолерантных метаболитически активных представителей филума Actinobacteria составляет от 4 до 33% от психротолерантных метаболитически активных представителей домена Bacteria, в прокариотных микробных сообществах почв и растительных субстратов изученных наземных экосистем. Биомасса психротолерантных метаболитически активных мицелиальных актинобактерий, как правило, превышает биомассу психротолерантных метаболитически активных одноклеточных актинобактерий. Исследование экофизиологических свойств почвенных психротолерантных актиномицетов показало, что при уменьшении температуры культивирования от 20°С до 5°С повышается содержание ненасыщенных жирных кислот в липидах клеточных мембран стрептомицетов. Экониши психротолерантных и мезофильных актиномицетов различаются не только по фактору температуры, но и по спектру потребляемых субстратов. Экспериментально показано, что психротолерантный актиномицет Streptomyces griseus Н.5.6 FR837628 является ксеротолерантным.

Практическая значимость.

Материалы исследований могут быть использованы в лекционных курсах по биологии почв и экологии актиномицетов.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (20092013), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов - 2009» и на VI Всероссийском съезде Общества почвоведов им. В.В. Докучаева - 2013.

Публикации.

По результатам работы опубликовано 16 печатных работ, из них 7 статей в реферируемых журналах, входящих в список журналов, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ для опубликования результатов диссертационных работ.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность заведующему кафедры биологии почв факультета почвоведения, член-корр. РАН, проф., д.б.н. И.Ю. Чернову, своему научному руководителю профессору, д.б.н. Г.М. Зеновой, сотрудникам кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ, особенно профессору, д.б.н. Д.Г. Звягинцеву, д.б.н. П.А. Кожевину, д.б.н. H.A. Манучаровой, к.б.н. Т.А. Грачевой, к.б.н. A.B. Якушеву. Благодарю аспирантов факультета почвоведения МГУ Е.П. Макарову и М.Н. Маслова за предоставление образцов почв для исследования.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Понятие о психрофильных и психротолерантных

микроорганизмах

Температура влияет на многие клеточные процессы, поэтому микроорганизмы должны обладать системами восприятия этого важного фактора для адаптации к его изменениям в окружающей среде. Для микроорганизмов существуют значения температуры, которые в данных условиях будут являться минимальными, оптимальными и максимальными. В зависимости от их значений микроорганизмы принято делить на три группы: мезофилы, термофилы и психрофилы. Оптимальная температура для роста мезофилов (к ним относится большинство прокариот) - 20-40°С. Термотолерантные виды способны выживать при температуре до 50°С. Строгие термофилы растут при 70°С.

Первые упоминания о психрофильных организмах появились в 1884 году (Моуег, Morita, 2007), до этого в литературе встречались сведения скорее о факультативных психрофилах, чем об истинных. В 1840-х годах в Антарктике были замечены психрофильные водоросли в куске льда (Russell, 1998), а первым психрофильную бактерию из рыбных консервов выделил Форстер в 1887 году.

Исследователи предлагали разные термины для их обозначения: термофобы, ригофилы, психроробы, глициобатерии и др. (Моуег, Morita, 2007). Термин «психрофилы» впервые был предложен Шмидтом-Нильсеном в 1902 году для обозначения бактерий, способных расти при 0°С (Ермилова, 2007). Для более сложно организованных биологических видов (например, полярных рыб), обитающих в холодных условиях, используется термин «криофилы» (Моуег, Morita, 2007). Некоторые исследователи применяют термин «психрофилы» как к прокариотам, так и к эукариотам (Feller, Gerday, 2003).

Среди микроорганизмов, способных к росту при низких температурах,

выделяют две группы - облигатные психрофилы и факультативные

психрофилы (иногда называемые психротрофами), различающиеся по своим экологическим нишам и механизмам адаптации к холоду. Но четкого разделения между этими группами нет. Существование двух типов психрофилов объясняется особенностями их мест обитания. Облигатные психрофилы приспособились к устойчивым холодным условиям (глубины морей и океанов, ледяные пещеры), факультативные же - к обитанию в неустойчивых холодных условиях, что делает их более распространенными по сравнению с первыми (Заварзин, Колотилова, 2001). Например, на поверхности льда, который в дневное время может значительно прогреваться (до 28°С), обнаруживаются именно психротрофы, а истинные психрофилы существовать не могут. Существует предположение, что психрофилы эволюционировали из психротрофов (Моуег, Monta, 2007).

В 1970-х годах Р. Морита (Monta, 1975) предлагает такую характеристику этих групп. Психрофилы - организмы, оптимальная температура для роста которых составляет 15°С и ниже, а максимальная - не превышает 20°С. К психротрофам относят организмы, для которых оптимальная температура выше 15°С, а максимальная - превышает 20°С, хотя при этом они могут размножаться при значениях близких к нулю. Поскольку термин «трофия» обычно используется, когда речь идет о питательных субстратах, то во избежание путаницы в литературе используют термин психротолерантные организмы для обозначения мезофильных видов, способных адаптироваться к низким температурам (Helmke, Weyland, 2004).

В соответствии с концепцией экологической толерантности, согласно которой каждый экологический фактор, воздействующий на организм, имеет максимальные и минимальные границы действия, в пределах которых организм может к нему адаптироваться, т. е. быть толерантным, были предложены два новых термина: «стенопсихрофилы» и «эврипсихрофилы» для обозначения микроорганизмов с ограниченным интервалом температур (истинные психрофилы) и микроорганизмов, толерантных к более широкому интервалу

значений температур (психротрофы и психротолерантные) соответственно (Feller, Gerday, 2003).

В работе Джанга и Key (Jiang, Xu, 1993) приводится следующие разделение мицелиальных бактерий (актиномицетов) на группы в отношении их роста при различных температурах.

1-я группа - организмы, растущие при 0°С с оптимумом роста от 10 до 28°С и плохо растущие при 37°С - факультативные психрофилы.

2-я группа - организмы, хорошо растущие при 0°С, имеющие оптимум роста от 10 до 20°С и не растущие при 37°С - умеренные психрофилы.

3-я группа - организмы, растущие при 0°С, оптимум роста отмечен при 10-14°С и не растущие при 28°С. Это истинные психрофилы.

Гоу и Милз (Gow, Mills, 1984) провели исследования для определения различий между психрофилами и психротрофами. Большинство исследователей для подобного разделения инкубировало культуры при 4°С и 20°С. Психротрофы не росли при 4°С, тогда как для психрофилов эта температура была оптимальной (Gow, Mills, 1984). Другие ученые, оценивая психрофильность по длительности лаг-фазы при 0°С и быстроте роста, при исследовании р. Arthobacter (Roth, Wheaton, 1962) сделали вывод о том, что мезофилы и психрофилы не являются четко ограниченными группами.

Некоторые бактерии, получившие название экстремальных психрофилов, хорошо растут при температуре -10°С в микроскопических водных «карманах» на границах раздела между льдом и морской водой. Температурный диапазон роста психрофильных бактерий выделяемых из почвы, значительно шире, чем у психрофилов, выделенных со дна моря, где постоянная температура 5°С (Jiang, Xu, 1993).

Необходимо подчеркнуть, что часто для отнесения микроорганизма к

одной из этих температурных групп недостаточно пользоваться только

скоростью роста как критерием для определения оптимальной температуры.

Например, некоторые морские бактерии Антарктики быстрее всего растут в

интервале температур 20-25°С, однако при этих значениях у них уменьшается

синтез некоторых экзоферментов и снижается общее число жизнеспособных клеток. В связи с этим было предложено использовать новую кардинальную температуру - температуру оптимальной активности Toa (temperature of optimal activity)(EpMMOBa, 2007).

1.2. Физиолого-биохимические механизмы адаптации микроорганизмов

к низким температурам

В отличие от ответа на тепловой шок, компоненты которого изучаются уже давно у различных организмов, анализ механизмов адаптации бактерий к действию охлаждения начал проводиться в относительно недавнее время (Thieringer et al., 1998). Зависимость скорости роста колонии от температуры в основном сходна у всех бактерий. В ограниченном диапазоне температур (2137°С) кривая роста описывается уравнением Аррениуса; в этом нормальном температурном интервале клеткам не требуются особые механизмы терморегуляции. Изменение температуры в рамках этого диапазона не влияет на физиологическое состояние бактерий (Современная микробиология, 2005).

В монографии Е.В. Ермиловой (Ермилова, 2007) обсуждаются два основных вопроса:

1. Как бактерии воспринимают снижение температуры среды, какие молекулы исполняют роль температурных сенсоров?

2. За счет, каких механизмов происходит их адаптация к новым температурным условиям?

Низкие температуры замедляют и ингибируют химические реакции, катализируемые ферментами, снижается текучесть мембран и стабилизация вторичных стр

Информация о работе

Дуброва, Мария Сергеевна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Психротолерантные актиномицеты в наземных экосистемах различных климатических зон - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы