Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Актиномицеты рода Streptosporangium в различных типах почв

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Маслова, Екатерина Михайловна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

МАСЛОВА Екатерина Михайловна

актиномицеты тяазтертояронамаимв различных

типах почв

Специальность 03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Д.Г. Звягинцев

Москва 1999г.

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................4

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР................................................... 7

1.1. Экологическая характеристика актиномицетов...............................7

1.2. Экологическая характеристика актиномицетов с использованием сукцессионного анализа.........................................................16

1.3. Актиномицеты рода Streptosporangium........................................27

1.3.1. Положение рода Б^ер^зрогащшт в порядке Actinomycetales.................................................................27

1.3.2. Идентификация актиномицетов рода Streptosporangium..............28

1.3.3. Местообитания актиномицетов рода 8&ерШрогащшт..............30

1.3.4. Селективные методы выделения актиномицетов

рода Streptosporangium.......................................................32

1.3.5. Практическое использование актиномицетов

рода 8ь*ерШрога^шт......................................................34

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ НАСТЬ ГЛАВА И. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ...........................36

2.1. Объекты исследования...............................................................36

2.2. Методы исследования................................................................49

2.2.1. Методы дифференцированного учета актиномицетов....................49

2.2.2 Методы исследования закономерностей вертикально-ярусного

распространения актиномицетов в биогеоценозах.........................50

2.2.3. Методы исследования актиномицетных комплексов

в ходе сукцессий, инициированных увлажнением почвы................41

2.2.4. Методы идентификации актиномицетов....................................41

2.2.5. Выявление диаминопимелиновых кислот и Сахаров в гидролизатах целых клеток актиномицетов................................ 54

2.2.6. Методы селективного выделения актиномицетов

рода Streptosporangium........................................................55

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА III.

3.1. Динамика численности актиномицетов рода Streptosporangium в различных биогеоценозах...........................................................56

3.2. Частота встречаемости и показатель доминирования актиномицетов рода Streptosporangium в различных биогеоценозах.................................59

3.3. Закономерности распространения актиномицетов

рода Streptosporangium по биогеоценозам.......................................61

3.4. Характеристика комплекса почвенных актиномицетов в ходе инициированной сукцессии.......................................................69

3.4.1. Динамика популяционной плотности актиномицетов в ходе

инициированной сукцессии.....................................................70

ГЛАВА IV.

4.1. Идентификация выделенных культур актиномицетов........................74

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.......................................................79

ВЫВОДЫ....................................................................................89

ЛИТЕРАТУРА..............................................................................91

ВВЕДЕНИЕ

•Актуальность темы: До последнего десятилетия считалось, что наиболее распространенными в почве являются актиномицеты рода Streptomyces. Использование селективных методов выделения позволяет выявить и другие, считавшиеся редкими роды. Один из них - род Streptosporangium.

Закономерности распространения стрептоспорангиев в наземных экосистемах мало изучены, в литературе имеются лишь отдельные упоминания об обнаружении актиномицетов рода Streptosporangium в листовом опаде в торфяных, черноземных и красноземных почвах. Стрептоспорангии являются продуцентами многих ценных антибиотиков, в том числе противоопухолевых и других биологически активных веществ (The Prokary otes, 1989).

Исследование структуры актиномицетных комплексов позволит не только установить закономерности распространения мицелиальных прокариот в биогеоценозах основных природных зон, но и показать, что традиционно считающиеся редкими роды актиномицетов, в частности род Streptosporangium, в определенных условиях могут иметь равную со стрептомицетами численность, а иногда и доминировать в комплексе.

•Целью работы явилось установление закономерностей распределения и определение экологической специфики актиномицетов рода Streptosporangium в биогеоценозах основных природных зон России и СНГ. Эти исследования расширят наши знания о биоразнообразии микробного мира и дадут возможность определять "адрес" спорангиальных форм - объектов биотехнологии.

•Задачи исследования:

1. Подбор и разработка методических приемов селективного выделения актиномицетов рода БЬ-ерШрога^шт из почв и растительных субстратов.

2. Сравнительное определение пространственной и временной локализации актиномицетов рода Streptosporangium в биогеоценозах основных природных зон России и СНГ.

3. Использование сукцессионного анализа для определения места актиномицетов рода 81гер1о8рогащшт в таксономической структуре актиномицетных комплексов почв основных биоклиматических зон.

4. Составление экологической характеристики актиномицетов рода Streptosporangium с использованием сукцессионного анализа.

5. Составление коллекции культур стрептоспорангиев.

•Научная новизна:

Предложен новый комплексный метод для выделения стрептоспорангиев из почв и растительных субстратов.

Впервые показано, что стрептоспорангии не являются редкими формами, в определенных условиях они могут постоянно выявляться в актиномицетном комплексе и даже доминировать в нем. Установлено, что стрептоспорангии составляют неотъемлемый компонент актиномицетных комплексов почв лесной и степной зоны. В северных почвах стрептоспорангии встречаются чаще и в большем числе, чем в южных почвах.

Сукцессионный анализ позволил выявить наиболее благоприятные временные промежутки для выделения из почвы актиномицетов рода Streptosporangium - это промежуточные этапы сукцессии. Наблюдения за динамикой численности стрептоспорангиев показало присутствие этих

организмов на всех этапах сукцессии, инициированной увлажнением почвы.

Определены благоприятные условия для развития актиномицетов рода Streptosporangium'. низкие значения рН среды обитания, высокая влажность и небольшое содержание гумуса в почве.

• Практическая значимость:

Выявление экологической ниши стрептоспорангиев в рамках мониторинга биоразнообразия, важно как для биотехнологии, так и для пополнения наших знаний о биоразнообразии микробного мира и способах его сохранения. В этом плане особенно интересны данные, получаемые в отношении биогеоценозов заповедных зон, которые могут быть рассмотрены в качестве эталонов природного биоразнообразия микробного мира.

Информация, полученная при изучении динамики численности и таксономического состава актиномицетного комплекса в ходе сукцессии, инициированной увлажнением почвы, дает возможность оптимизировать процедуру выделения нужного объекта из природных субстратов или решать вопрос об управлении объектом непосредственно в почве, что имеет важное значение с точки зрения поиска природных штаммов микроорганизмов для нужд биотехнологии.

ГЛАВА I.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Экологическая характеристика актиномицетов

Актиномицеты (порядок Actinomycetales) составляют весьма обширную группу грамположительных бактерий, в пределах которой можно обнаружить разнообразные случаи перехода от достаточно простой клеточной дифференциации к более сложной. Понятие ,"актиномицеты" собирательное, оно объединяет мицелиальные и немицелиальные организмы. Критерием, преимущественно используемым для объединения указанных организмов, служат такие признаки, как прокариотический тип клеточной организации в сочетании с грамположительным типом строения и химического состава клеточных стенок, сравнительно высокое (60-75 %) относительное содержание ГЦ в ДНК, способность к формированию ветвящегося мицелия диаметром 0,41,5 мкм. Последняя отмечалась в виде тенденции у предположительно "низших" представителей .группы, у "высших" же сочеталась со способностью к образованию разнообразных специализированных покоящихся клеток и наличием сложных, а в некоторых случаях, по-видимому, множественных путей репродукции (Калакуцкий, Агре, 1977). Объединение микроорганизмов в группу актиномицетов как по перечисленным, так и по некоторым другим традиционным признакам, равно как и представление о "естественности" группы в целом, нашли себе определенное подтверждение и дальнейшее развитие в исследованиях 2-х последних десятилетий, непосредственно направленных на анализ возможных таксономических и филогенетических связей в мире микроорганизмов и использующих на этом пути в первую очередь сведения о сравнительном составе таких консервативных молекул, как 16S рРНК, а также многие другие хемотаксономические признаки (Fox et al.,

1980; Kandier, Schleifer, 1980; Stackebrandt, Woese, 1981; Калакуцкий, Зенова, 1984; Stackebrandt et al, 1997).

Следует отметить, что если генетический (и, возможно, филогенетический) "вес" такого признака, как образование мицелия, подвергается в настоящее время пересмотру, то внимание к экологической его значимости лишь усиливается (Калакуцкий, Шарая, 1990). Мицелиальная организация актиномицетов обуславливает схожесть экологических стратегий этих прокариотических организмов с эукариотическими микроорганизмами -грибами. Сказанное побуждает нас выделить эту группу мицелиальных прокариот среди прочих бактерий и описать пространственно-функциональные закономерности распределения ее в почвах.

В настоящее время порядок Actinomycetales и предположительно родственные актиномицетам организмы составляют свыше 60 родов, возможные связи между которыми интенсивно анализируются и пересматриваются. Группа собственно актиномицетов насчитывает более 40 родов (Bergey's Manual Determinative Bacteriology, 1994), в числе этих родов так называемые "гиганты", насчитывающие в настоящее время многие сотни "таксовидов", так и "карлики", состоящие всего из одного вида. Далеко неравномерная изученность актиномицетов находит отражение не только в неодинаковом числе видов ныне рассматриваемых в составе отдельных родов (и таксонов более высокого ранга), но и имеет своим важнейшим следствием положение, при котором достаточно трудно выделить биохимические, физиологические или морфологические особенности, которые можно было бы безоговорочно считать присущими всем актиномицетам. Поскольку именно такие особенности конституции организмов находят проявление в их

экологии, то в настоящее время логично рассматривать не экологию актиномицетов вообще, а экологию какой-либо лучше изученной или наиболее распространенной в природе группы родов.

Актиномицеты представляют собой единое звено в трофической цепи любой экосистемы, осуществляя в ней функции микробов-редуцентов. Основная роль мицелиальных прокариот состоит в разложении таких сложных полимеров, как лигнин, хитин, ксилан, целлюлоза, гумусовые соединения (McCarthy, Williams, 1990; Truncer et al., 1996; Berens et al., 1996; Li, 1997; Jendrossek et al., 1997). „

В настоящее время представители почти всех известных родов актиномицетов выделены из почвы или обнаружены в почве. Актиномицеты обнаруживаются во всех типах почв. Абсолютное (в ряде случаев и относительное) количество актиномицетов, учитываемое высевом на плотные питательные среды, имеет тенденцию нарастать по мере продвижения с севера на юг (Мишустин, 1981; Звягинцев и др., 1996)).

По данным Мишустина (1973) почвы северных климатических зон значительно беднее южных по числу актиномицетов. Если в почвах полярной тундры актиномицеты составляют всего 0,4-3,4% от общего количества учитываемых посевом бактерий (Мишустин, Мйрзоева,1953), в торфяниках и торфяно-болотных почвах - 1,8-2,7% (Зименко и др., 1983; Широких, 1993) и не являются доминантами в подзолистых почвах, то в черноземах, каштановых почвах, желтоземах влажных субтропиков, сероземах актиномицеты составляют 20-40 % от общего числа учитываемых посевом бактерий (Рыбалкина, Кононенко, 1957; Зенова, Вустина, 1980, цитировано по Зеновой, 1984; Андреюк, Валагурова, 1992). Богаты актиномицетами горные почвы,

особенно альпийских и субальпийских лугов; в песчанно-пустынных почвах актиномицеты по численности превосходят бактерии (Мишустин, 1975; Зенова, 1984; Андреюк, Валагурова, 1992).

Однако закономерности распределения мицелиальных прокариот в почвах до недавнего времени были исследованы только в отношении представителей родов . БкерЮтусея и 31гер1омегйсИИит. Определение структуры комплекса почвенных актиномицетов позволило установить закономерности распределения других родбв актиномицетов, традиционно считающихся редкими или редко встречающимися в почве (Зенова, Звягинцев, 1994, 1997; Зенова и др., 1996; Звягинцев и др., 1995; Зенова, 1998).

Несомненно, что сама постановка вопроса о приуроченности определенных групп микроорганизмов вообще, и актиномицетов в частности, к определенным типам почв осложняется тем, что большинство микробов обнаруживаются во всех типах почв, т.е. являются космополитами. Это положение утверждается первой частью правила Бейеринка : "Всюду есть все...". Однако, вторая часть девиза: "но среда отбирает..." - обнадеживает и предполагает, что исследователь может и должен найти те экологические факторы, которые определяют формирование микробных сообществ, адаптированных к данному типу почв (Добровольская и др., 1996). Это в полной мере может быть отнесено к мицелиальным прокариотам.

Широкое распространение актиномицетов в природе определяется их устойчивостью к высушиванию, временному отсутствию питательных веществ в среде обитания и эффективностью расселения спор. Многие актиномицеты в лабораторных культурах способны медленно расти на водном агаре и других средах с низким содержанием питательных веществ. В почве активно

. 11 растущий вегетативный мицелий обнаруживается преимущественно в микрозонах с повышенным содержанием органических веществ. Корреляцию между содержанием актиномицетов в почве и количеством органического вещества в ней отмечал Н.А.Красильников (1958). Обладая небольшой скоростью роста, актиномицеты обычно не оказываются среди r-стратегов при попадании в . почву легкодоступных органических веществ и начинают доминировать при наличии сравнительно труднодоступных субстратов.

Большинство актиномицетов нейтрофилы (оптимальные для роста значения рН среды 6-8). Однако, существуют сведения о присутствии в почве ацидофильных и алкалофильных форм (Калакуцкий, Зенова, 1984; Зенова, 1984; Miyashita et al., 1984). Все же можно предполагать, что в природных средах со значениями 3 > рН > 9 рост и активность большинства известных актиномицетов будут сильно подавлены.

Поскольку подавляющее большинство ныне известных почвенных актиномицетов являются аэробными микроорганизмами с окислительным типом обмена и развитыми системами переноса электронов на кислород, можно достаточно уверенно предполагать, что недостаток кислорода угнетает их рост и активность в почве. Отмечалось, тем не менее, что из затопленных почв рисовников выделяются в аэробных условиях стрептомицеты, микромоноспоры и стрептовертицилы (Watanabe, Furusaka, 1980). Динамика почвенных популяций анаэробных или мйкроаэрофильных организмов с рудиментарным мицелием (представители Actinomyces и Agromyces) почти совершенно не исследована.

При исследовании действия лимитирующих факторов на актиномицеты в природной среде обитания необходимо помнить о том, что мицелиальные

прокариоты - организмы со сложным жизненным циклом. Им свойственна способность к формированию разнообразных специализированных покоящихся структур (споры, склероции и т.п.), причем один и тот же организм может формировать в зависимости от условий покоящиеся клетки или иные репродуктивные структуры (например, зооспоры) различного типа, характеризоваться множественными или альтернативными путями репродукции. Поэтому, рассуждая о селекции условиями среды, можно говорить об адаптированности вегетативной стадии по таким параметрам, как способность использовать различные источники питания, скорость роста, с одной стороны, а с другой - об адаптированности репродуктивной стадии по таким параметрам, как способность к ^переживанию неблагоприятных условий, способность к расселению. Общее представление об эффективности взаимодействия со средой обитания организма со сложным жизненным циклом не может основываться только на особенностях любого из упомянутых двух аспектов спектра его возможностей, лишь с оговорками может использоваться и их "арифметическая сумма" (Калакуцкий, Зенова, 1984).

Широко практикуемый учет количества актиномицетов в почве по числу колоний, вырастающих при высеве из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды, может лишь весьма приблизительно отражать

потенциальную активность этих организмов in situ, коль скоро такая

\

активность может быть связана не столько со спорами, сколько с растущим вегетативным мицелием. Тем не менее, судя по данным полученным с лабораторными культурам�