Термотолерантные актиномицеты в пустынных, вулканических и горной почвах

Курапова, Анна Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Термотолерантные актиномицеты в пустынных, вулканических и горной почвах
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Термотолерантные актиномицеты в пустынных, вулканических и горной почвах"

На правах рукописи

Курапова Анна Игоревна

ТЕРМОТОЛЕРАНТНЫЕ АКТИНОМИЦЕТЫ В ПУСТЫННЫХ, ВУЛКАНИЧЕСКИХ И ГОРНОЙ ПОЧВАХ

Специальность 03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-6 ОКТ 2011

Москва-2011

4856689

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится « /¿Г » (¿¡сТ^о^Ь 2011 г. в 15 ч. 30 мин. в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д.1, строение 12, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » се-^стаъ 2011 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д.1, строение 12, факультет почвоведения, Ученый совет.

доктор биологических наук, профессор Г.М. Зенова

доктор биологических наук, профессор Л.П. Терехова

кандидат биологических наук Е.О.Омарова

Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева

Ученый секретарь

диссертационного совета ^^ . „у .

доктор биологических наук, профессор Г. М. Зенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Традиционно считалось, что мицелиальные бактерии (актиномицеты) не могут занимать природных экологических ниш, характеризующихся экстремальными условиями, и не являются чемпионами устойчивости к воздействию факторов внешней среды. В настоящее время ясно, что такое представление следует изменить. Возможность существования почвенных экстремофильных и экстремотолерантных актиномицетов (ацидотолерантных и алкалотолерантных, психротолерантных и термотолерантных, галотолерантных и галоалкалотолерантных, ксеротолерантных) не вызывает сомнения у специалистов (Goodfellow, Kim, 1999; Evtushenko et al., 2000; Звягинцев, Зенова, 2007).

Среди представителей спороактиномицетов, имеющих развитый воздушный мицелий и споры, преобладают мезофильные формы, оптимальный интервал для роста которых 20-35°С. Термофильные актиномицеты, способные расти при 50°С, описаны и подробно исследованы в составе рода Thermoactinomyces, согласно современной классификации выведенного из порядка Actinomycetales. Отдельные термофильные виды описаны в составе родоз Actinomadura, Thermomonospora, Microbispora, Saccharopolyspora, Saccharomonospora и Streptomyces (Агре, 1986; Kim et al., 1999).

Исследование закономерностей действия температурного фактора на жизнедеятельность микробных популяций имеет важное значение как с теоретической, так и практической точек зрения. Теоретически представляют интерес механизмы температурных адаптаций. С практической точки зрения важно знать, как адаптации к температуре влияют на интенсивность микробного дыхания, в ходе которого выделяется двуокись углерода. СОг, является одним из парниковых газов, изменение концентрации которых приводит к общему изменению климата. Поэтому актуальна проблема зависимости от температуры функциональной активности микробного населения почвы, в число которых входят грамположительные мицелиальные бактерии - актиномицеты.

термотолерантных актиномицетов в почвах весьма ограничены. Можно предполагать, что в почвах, подверженных периодическому прогреванию до высоких температур при недостатке влаги и питательных веществ, термофильные и термотолерантные актиномицеты, споры которых способны прорастать в экстремальных условиях при высоких температурах и низких значениях влажности почвы, могут составлять существенную часть прокариотного сапротрофного гидролитического блока микробного сообщества (Звягинцев и др., 2009; Kim et al, 2002; Kumar et al, 2004).

Целью работы явилась оценка распространения, метаболической активности и таксономической структуры комплексов термотолерантных актиномицетов в периодически прогреваемых почвах.

Задачи исследования:

1. Сравнительные характеристики численности и таксономического состава мезофильных и термотолерантных актиномицетов в пустынных, горной и вулканических почвах.

2. Наблюдение за динамикой численности и биомассы мезофильных и термотолерантных актиномицетов, развивающихся в почвенных микрокосмах в ходе сукцессии, инициированной увлажнением бурой пустынно-степной почвы.

3. Определение наличия одноклеточных и мицелиальных представителей филума Actinobacteria в прокариотном микробном сообществе пустынной почвы с использованием молекулярно-биологического метода - денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ-метод).

4. Оценка биомассы метаболически активных одноклеточных и мицелиальных представителей филума Actinobacteria в прокариотных микробных комплексах исследуемых почв с использование молекулярного метода гибридизации in situ (метод FISH - fluorescent in situ hybridization).

5. Экофизиологическая характеристика культур термотолерантных актиномицетов, выделенных из исследуемых периодически прогреваемых почв.

сопоставимы по численности и более разнообразны в таксономическом отношении по сравнению с мезофильными формами. Впервые в вулканических периодически прогреваемых почвах выявлены специфические актиномицетные комплексы, в которых термотолерантные формы представлены родами Micromonospora и Microtetraspora, мезофильные - родом Microbispora. Показано, что термотолерантные актиномицеты в периодически прогреваемых почвах растут, развиваются, образуют мицелий и проходят полный цикл развития. Впервые молекулярно-биологическими методами (методом FISH и DGGE) установлено присутствие в прокариотных микробных комплексах исследованных почв физиологически активных представителей филума Actinobacteria. Биомасса метаболически активных мицелиальных актинобактерий превышает биомассу метаболически активных одноклеточных актинобактерий. Впервые экспериментально показана ксеротолерантность умеренного термофильного стрептомицета. Установлено, что с повышением температуры культивирования от 28°С до 45°С в липидах мембран клеток умеренного термофильного стрептомицета повышается содержание насыщенных длинноцепочечных жирных кислот-гексадекановой, изо-гептадекановой, антеизо - гептадекановой и изо-октадекановой. Показано, что экониши термотолерантных стрептомицетов отличаются от экониш мезофильных культур не только по температурным показателям, но и по спектру потребляемых субстратов (гистидина, маннита, сахарозы).

Практическая значимость. Термотолерантные стрептомицеты, выделенные из исследуемых почв, проявляют антимикробные свойства, способность к разложению хитина и углеводородов при высокой температуре и, очевидно, могут служить объектами биотехнологии для получения термостойких биологически активных веществ. Знание закономерностей распространения и функционирования термотолерантных актиномицетов в периодически прогреваемых почвах будет способствовать созданию схем управления микробными популяциями в аридных почвах. Материалы исследования могут быть использованы в лекционных курсах по биологии почв и экологии.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на XIV, XV и XVII Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008»

(Москва, 2008) и «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), на V Международной научной конференции «Вулканизм, биосфера и экологические проблемы» (Туапсе, 2009), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), на XI-th и XII-th Young Systematists' Forum (Лондон, 2009, 2010) и на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

Публикации. По результатам исследования опубликовано 17 печатных работ, из них 4 экспериментальные статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

_ страницах текста, содержат _ рисунков и _ таблиц. Список

литературы включает_источников, в том числе_на иностранном языке.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю профессору, д.б.н. Г.М. Зеновой, сотруднику Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН к.б.н. В.К. Орлеанскому, сотрудникам кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ, особенно профессору, д.б.н. Д.Г. Звягинцеву, д.б.н. П.А.Кожевину, к.б.н. H.A. Манучаровой, к.б.н. Т.А. Грачевой, к.б.н. A.B. Якушеву. Благодарю сотрудницу Биологического института АН Монголии д.б.н. Норовсурэн Ж., аспиранта Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (Пущино) A.B. Миронова и аспирантку кафедры земельных ресурсов факультета почвоведения МГУ И.З. Ибатуллину за предоставление образцов почв для исследования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объектами исследования явились образцы периодически прогреваемых почв: пустынных, отобранных в зоне пустынных степей Монголии, горно-луговой почвы Центрального Кавказа, вулканических почв Камчатки (вулканическая дерновая, слаборазвитая слоисто-пепловая), а так же лугово-каштановой солончаковатой почвы, загрязненной нефтью (табл.1).

Таблица 1

Характеристика объектов исследования

Номер образца Название почвы, горизонт, глубина взятия образца (см) Район взятия образца

117,175,179 бурая пустынно-степная почва, Ад (0-10) Монголия, Южный Гоби, Булган сомон

315 серо-бурая пустынная почва, В1 (6-18) Монголия, Южный Гоби, Ханбогд-Галбын Гоби

389 остепненно-пустынная лугово —светлобурая засоленная почва, Ад (0-5 см) Монголия, Южный Гоби, Ханхонгор сомон

390 остепненно-пустынная светлобурая средняя мощная суглинистая, Ад (0-2 см) Монголия, Южный Гоби, Номгон сомон

391 остепненно-пустынная светлобурая засоденная почва, Ад (0-3 см) Монголия, Южный Гоби, Номгон сомон

392 такыровидная, К (0-5 см) Монголия, Южный гоби, Ханхонгор сомон

393 отепненно-пустнная лугово-бурая солончаковатая почва, Ад (0-1,5 см) Монголия, Восточно-Гобийский аймак, Улаанбадрах сомон

Б1 горно-луговая почва Центральный Кавказ; ущелье Мижирт,2350м над ур. моря

Б2 горно-луговая почва Центральный Кавказ; ущелье Укю, 3420 м над ур. моря

БЗ горно-луговая почва Центральный Кавказ; ущелье Укю, 3500 м над ур. моря

Б4 горно-луговая почва Центральный Кавказ; Безенгский ледник 2600 м над ур. моря

1,2, 3,4 слаборазвитая слоисто-пепловая Камчатка, район Карымского вулкана близь горячих источников,ручей Горячий

5,6 слаборазвитая слоисто-пепловая Камчатка, термальные поля, Паужетское

7 слаборазвитая слоисто-пепловая Камчатка, гейзерит, источник Печка

10 слаборазвитая слоисто-пепловая Камчатка, пепел

11 (К-09-1) 12 (К-09-2) 13 (К-09-3) 14 (К-09-5) 15 (К-09-6) слаборазвитая слоисто-пепловая Камчатка, подножье вулкана Безымянный Камчатка, мерзлая стенка оврага глубина отбора 160 см глубина отбора 130 см глубина отбора 100 см глубина отбора 0 см

8,9 вулканическая дерновая почва Камчатка, кальдера вулкана Узон

лугово - каштановая солончаковатая почва, загрязненная нефтью, (0-17 см) Восточное Предкавказье, Ставропольский край Прикунский нефтегазоносный район, Ачикулатское нефтяное месторождение

Названия почв приведены по «Классификации и диагностике почв России» (2004), названия монгольских почв приведены по книге «Почвенный покров основных природных зон Монголии»,

1976.

Выделение и дифференцированный учет актиномицетов проводили методом посева на плотные питательные среды. Идентификацию выделенных культур актиномицетов осуществляли по фенотипическим и молекулярно-генетическим показателям. Мезофильные актиномицеты выделяли при 28°С, термотолерантные при 37°С и 45°С.

Оптимальные и ограничительные для роста культур актиномицетов температуры определяли по величине радиальной скорости роста колоний на агаризованной среде при температурах культивирования 5°С, 15°С, 20°С, 28°С, 37°С, 45°С, 50°С, 55°С, 60°С.

Наблюдение за динамикой длины мицелия и биомассы актиномицетов проводили в почвенных микрокосмах. Навеску бурой пустынно - степной почвы массой 25 г помещали в стеклянный сосуд, инициировали микробную сукцессию увлажнением почвы (60% от полной влагоемкости ПВ) и инкубировали почву при температуре 28°С в одном варианте опыта и 45°С - в другом. Определение длины мицелия актиномицетов в исследуемых пустынных почвах проводили с помощью люминесцентно-микроскопического метода. Препараты для подсчета мицелия актиномицетов окрашивали акридином оранжевым. Биомассу определяли расчетным методом (Кожевин, 1989; Полянская и др., 1995).

Молекулярный метод флюоресцентной гибридизации in situ (метод FISH -fluorescent in situ hybridization) использовали для оценки биомассы метаболически активных одноклеточных и мицелиальных представителей филума Actinobacteria в прокариотных микробных сообществах исследуемых почв (Ravenschlag et al., 2001; Манучарова, 2008). Применен спектр зондов, специфичных для представителей домена Bacteria и филогенетической группы Actinobacteria.

Количество метаболически активных микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы, вычисляли по формуле: N=(S1an)/(vS2c), где N - длина мицелия (мкм) в 1 г почвы; а - средняя длина мицелия в поле зрения; S! - площадь препарата (мкм2); п -показатель разведения почвенной суспензии (мл); v- объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 - площадь поля зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г) При расчете биомассы учитывали, что 1 м сухого актиномицетного мицелия диаметром 0,5мкм имеет биомассу 3,9x10"8 г (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Препараты анализировали с использованием люминесцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 plus (Германия) со светофильтрами Filter set 15 для зондов и Filter set 09 для окраски акридином оранжевым. Численность целевых групп микроорганизмов в образцах определяли путем учета количества гибридизированных с зондами клеток в 50 полях зрения микроскопа на одной ячейке, с последующим расчетом численности соответствующих популяций на 1 г почвы.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез ШГГЭ-метод). С образцами пустынной такыровидной почвы был проведен анализ продуктов амплифицированного 16S гена суммарной ДНК, выделенной из почвы, и ДНК чистых культур на основе денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ-метод). Для выделения ДНК из чистых культур микроорганизмов применяли Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США). Суммарную ДНК из почв экстрагировали с помощью PowerSoil DNA Isolation Kit (MO BIO, США), руководствуясь инструкциями производителя. Более подробная методика амплификации приведена в диссертации.

Полученные ПЦР-фрагменты разделяли с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) на оборудовании DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, США) в Институте микробиологии РАН согласно протоколу (Кравченко и др., 2010). ПЦР-фрагменты разделяли в 6% полиакриламидном геле (отношение содержания акриламида к бисакриламиду 37.5:1) в денатурирующем градиенте 40%-65% (100% денатурант содержал 7М мочевину и 40% формамид). Форез проводили в однократном ТАЕ-буфере (40 тМ Tris-ацетат, 1 mM EDTA, pH 7.4) при температуре 60°С и напряжении 100 V в течение 16 часов. Окрашивание геля осуществляли с помощью бромистого этидия (0.5 мкг/мл) в течение 30 минут, затем гель отмывали от остатков красителя в течение 30 минут. Результаты документировали с помощью имидж-системы GelDoc (BioRad, США). Основные видимые полосы были вырезаны, и ДНК была элюирована стерильной деионизованной водой.

Секвенирование генов 16S гРНК проводили в Центре «Биоиженерия» РАН с использованием автоматического капиллярного секвенатора (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США).

Последующий анализ нуклеотидных последовательностей был проведён с помощью программного пакета BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) и EzTaxon (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/). Редактирование последовательностей осуществляли с помощью редактора BioEdit (http://iwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). а их множественное выравнивание с использованием программы MAFFT (http://mafft.cbrc.ip/alignment/software). Построение дендрограмм осуществляли с помощью алгоритма «neighbor-joining» (NJ) в программе MEGA 4. Статистическую достоверность филогенетических реконструкций оценивали методом «Bootstrap» путем построения 1000 альтернативных деревьев. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК выделенных штаммов депонированы в GenBank NCBI с присвоением индивидуальных номеров доступа.

Определение состава жирных кислот липидов мембран актиномицетов проведено в лаборатории д.б.н. Г.А. Осипова с помощью хромато-масс-спектрометрического метода на масс-спектрометре AG-5973 Agillent technologies, США (Осипов и др., 2004; патент РФ № 2086642 от 10.08.97). Автор выражает искреннюю благодарность Георгию Андреевичу Осипову.

Методом мультиреспирометрического тестирования (МРТ) определяли специфичность употребления ресурсов исследуемыми культурами мезофильных, психротолерантных и термотолерантных актиномицетов (Campbell et al., 2003). Использовали модифицированный метод МРТ (Марченко и др., 2005).

В каждую ячейку планшета вносили по 0,5 мл суспензии, содержащей стрептомицет с высокой популяционной плотностью (не менее 109 КОЕ/мл), и один из трех ресурсов: гистидин, маннит, сахарозу (концентрация 35 мг/мл). В качестве контроля в соответствующие ячейки заливали дистиллированную воду. В крышку планшета заливали индикаторный гель с необходимыми для регистрации С02 компонентами. Планшеты инкубировали при 28°С в течение 3 суток. В зависимости от количества образовавшегося в ячейках углекислого газа изменялась оптическая плотность гелевого материала. Интенсивность окраски индикаторного геля оценивали колориметрически с помощью специальной программы. Анализ данных, полученных при сканировании крышек с индикаторным гелем, производился с помощью методов многомерной математической статистики.

В опытах по определению ксеротолерантности умеренного термофильного стрептомицета Streptomvces sp. 315 FR716528 различные уровни влажности создавали в эксикаторах при помощи насыщенных растворов различных солей. Создавали три уровня влажности воздуха, соответствующие различным уровням давления влаги Р (aw): -96.4 МПа (aw 0.50) - экстремально низкий, -22.6 МПа (aw 0.86), приблизительно соответствующий максимальной адсорбционной влагоемкости почвы (MAB), и -2.8 МПа (aw 0.98), соответствующий максимальной гигроскопической влажности почвы. Использовали моноспоровую суспензию актиномицета (106 спор/мл), каплю которой помещали на предметное стекло и распределяли в квадрате площадью 4 см2. Стёкла подсушивали и помещали в эксикатор с соответсвующей влажностью. Просматривали стекла с помощью люминесцентного микроскопа Zeiss Axioskop 2 plus (Германия) после экспозиции 6, 24, 48 и 72 ч. Для каждого срока инкубации на предметном стекле подсчитывали число непроросших и проросших спор (с ростовыми трубками) и определяли длину проростков мицелия. Стекло в эксикатор после просмотра не возвращали.

Оценку интенсивности потребления хитина и разложения углеводородов чистыми культурами микроорганизмов проводили, измеряя эмиссию диоксида углерода и накопление биомассы культурами (Манучарова и др., 2008). Вычисляли коэффициент удельной активности дыхания.

Удельная активность дыхания, рассчитывалась по формуле: B=(a-ao)/(b-bo), где а - эмиссия С02 актиномицетом на среде с хитином/углеводородом, мкг С-СОг/мл среды; ао - эмиссия С02 на среде без хитина /углеводорода, мкг С-С02/мл среды; b -биомасса актиномицета на среде хитином/углеводородом, мкг/мл среды; Ь0 - биомасса актиномицета на среде без хитина /углеводорода, мкг/мл среды.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ STATGRAPHICS Plus 5.1. и STATISTICAL.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Численность н таксономический состав актниомицетных комплексов периодически прогреваемых почв

Численность актиномицетов в исследуемых пустынных, горно-луговой и вулканических почвах при использовании метода посева из разведений почвенных

суспензий на плотные питательные среды гумусо-витаминныи агар и среду с пропионатом натрия (Зенова, 2000) колеблется от сотен до миллионов КОЕ/г почвы. Наибольшее количество мицелиальных актинобактерий отмечено в остепненно-пустынной светлобурой (образцы 390, 391) и такыровидной (образец 392) почве Монголии (до миллионное и десятков миллионов КОЕ/г) (рис.1), что связано с более значительным содержанием органического вещества в этих почвах по сравнению с другими почвами (в такыровидной почве содержание органического вещества достигает 2,64 %) и наличием здесь карбонатного горизонта.

117 175 179 315 359

Образцы ПОЧВ

IgN

■I

23456789 Образцы почв

11 12 13 14 15

Рис.1. Численность мезофильных (выделенных при 28°С dl ) и термотолерантных (выделенных при 37 "С - ^ и 45 "С - Щ ) актиномицетов в исследуемых пустынных почвах Монголии (I), горно-луговой почве Центрального Кавказа (II) и вулканических почвах Камчатки (III), N - КОЕ/г почвы

Установлено, что при инкубировании посевов почвенных суспензий на плотные питательные среды при температуре 28°С на чашках вырастают преимущественно мезофильные актиномицеты, а инкубирование посевов при температурах 37°С и 45°С выявляет преимущественно термотолерантные формы.

Как правило, в актиномицетных комплексах исследованных пустынных почв значительную долю, превышающую долю мезофильных актиномицетов, составляют термотолерантные формы. Во всех исследованных почвах обнаружены термотолерантные актиномицеты, по численности сопоставимые, а иногда и

превышающие по количеству мезофильные формы. Наибольшее количество термотолерантных актиномицетов обнаружено в остепненно-пустынной средне мощной суглинистой почве (образец 390), что, можно объяснить более значительным прогревом суглинистых почв.

Численность актиномицетов по профилю полупустынных почв изменяется незначительно. Это, очевидно, связано с максимальным содержанием органического вещества в иллювиальном горизонте В1 в связи с особенностями распределения корневой системы растений.

Наиболее распространенными представителями порядка Асипотусе1а1ез в пустынных почвах Монголии оказались роды 51гер!отусе$ и \iicromonospora. Стрептомицеты представлены как мезофильными, так и термотолерантными формами. Микромоноспоры в актиномицетных комплексах почти всех исследованных пустынных почв представлены термотолерантными формами (рис. 2).

Термотолерантные актиномицеты исследуемых почв отличаются значительно большим таксономическим разнообразием по сравнению с мезофильными. Среди мезофильных актиномицетов в большинстве случаев доминируют стрептомицеты. Термотолерантные актиномицеты почв пустынных степей Монголии представлены родами §(гер1отусе$, \iicromonospora, Streptosporangium и актиномицетами олигоспоровой группы, включающей роды Лсйпота<1ига, Басскагоро\узрога, КйсгоШгаърога, АИсгоЫзрога, среди которых в бурых пустынных почвах доминируют представители рода ЛсИпотаЛига. Термотолерантные микромоноспоры обнаружены во всех исследованных образцах пустынных почв Монголии в сопоставимых или равных со стрептомицетами долях в актиномицетном комплексе, а иногда и «вытесняют» стрептомицеты из комплекса.

В горно-луговой почве Центрального Кавказа среди термотолерантных актиномицетов наблюдается доминирование родов Мгсготопозрога (особенно в условиях повышенной влажности в ущелье Уюо) и олигоспоровых актиномицетов рода 5'ассИагоро^ярога.

Актиномицетные комплексы вулканических почв очень специфичны. В вулканической дерновой почве кальдеры вулкана Узон, где численность актиномицетов достигает миллиона КОЕ/г почвы, стрептомицетов совсем не обнаружено, здесь среди термотолерантных актиномицетов абсолютно доминируют в

комплексе олигоспоровые актиномицеты рода Засскагоро^рога, среди мезофильных-представители рода КИсготопоярога.

Выявлены специфические актиномицетные комплексы, например, в образце цианобактериального шлейфа термального поля, отобранном на слаборазвитой слоисто-пепловой почве, мезофильные актиномицеты представлены исключительно олигоспоровыми актиномицетами рода М1СгоЫ$рога, а термотолерантные - родом М1сготопо5рога. В образце гейзерита, отобранном из слаборазвитой слоисто-пепловой почвы близ горячего источника в разрастаниях мха, термотолерантные актиномицеты по численности превосходят мезофильные формы, среди термотолерантных актиномицетов кроме представителей рода 31герЮтусез доминируют представители олигоспоровых актиномицетов рода М1сго1е1га$рога.

Дискриминантный анализ исследуемых почв, проведенный на основе таксономического и температурного разнообразия актиномицетов по двум факторам-численности разных родов актиномицетов при разных температурах инкубирования посевов показал, что все исследуемые почвы — пустынные, вулканические и горная -разделяются на три самостоятельные группы (рис.3).

Таким образом, установлено, что в актиномицетных комплексах всех исследованных периодически разогреваемых почв присутствуют термотолерантные актиномицеты, по численности и доле в комплексе сопоставимые с мезофильными формами. В таксономическом отношении термотолерантные актиномицеты разнообразнее мезофильных.

Динамика длины мицелия н биомассы актнномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением пустынных почв Монголии

Опыты по исследованию развития актиномицетов в почвах проводили с использованием микрокосмов.

Наблюдение за динамикой длины мицелия актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением (60% ПВ) бурой пустынно-степной почвы показало, что актиномицеты в почве растут, развиваются, образуют мицелий, который увеличивается в длину. При инкубировании почвы при температуре 28°С длина мицелия актиномицетов в начале опыта (в момент инициации сукцессии) составляет 124 м/г почвы. Затем к 4-м суткам длина мицелия возрастает в 2 раза, составляя 228 м/г почвы и далее стабилизируется к 17-м суткам опыта на уровне 200 м/г почвы.

При инкубировании почвы при 45°С мицелий актиномицетов в начале опыта имеет длину 124 м/г почвы, к 4-м суткам длина мицелия достигает 272 м/г почвы, затем длина мицелия уменьшается до 98 м/г к 10-м суткам опыта и до 42 м/г почвы к 17 суткам опыта.

IgN

flUjJËL

117 175 179 315

390 391 392 393

IgN

ИЛИ

117 175 179 315 389

392 393

IgN

Образцы почв

Рис.2. Численность мезофильных (выделенных при 28 °С - □ ) и термотолерантных (выделенных при 37 °С - ^ и 45 °С -Щ ) актиномицетов родов З^ерЮтусея (А), М^сготопозрога (Б) и актиномицетов олигоспоровой группы (В) в пустынных почвах Монголии, N - КОЕ/г почвы

Plot of Discriminant Functions

-2,7 -0.7 1.3 з.з

Function 1

Рис.3. Графики дискриминантных функций, построенные на основании таксономического и температурного разнообразия актиномицетов, выделенных из пустынных почв Монголии (1), горно-луговой почвы Кавказа (2) и вулканических почв Камчатки (3)

Биомасса актииомицетов в бурой пустынно-степной почве, инкубированной при 28°С, в начальный момент опыта составила 4,8 мкг/г почвы. Затем увеличивалась почти в два раза по сравнению с начальным моментом сукцессии, составляя 8,8 мкг /г почвы. Стабилизация биомассы отмечена на уровне 7,9 мкг/г почвы.

Биомасса актиномицетов в условиях инкубирования почвы при 45°С в начальный момент опыта составляет 4,8 мкг/г в бурой пустынно-степной почве, затем к 4-м суткам возрастала почти в 2 раза, составляя 10,6 мкг/г почвы. К 10-м суткам опыта биомасса уменьшалась до 3,8 мкг/г почвы и до 1,6 мкг/г почвы к 17 суткам (рис.4).

Таким образом, наблюдение за динамикой развития мицелия в условиях микрокосма позволило сделать вывод о том, что термотолерантные актиномицеты в исследованных почвах пустынно-степной зоны активно растут, мицелий увеличивается в длину. Динамика длины мицелия и биомассы термотолерантных и мезофильных форм в ходе сукцессии, инициированной увлажнением исследованных почв, сходны. Величины длины мицелия и биомассы термотолерантных и мезофильных актиномицетов выражены значениями одного порядка, в конце опыта (17-е сут.) длина мицелия и биомасса термотолерантных актиномицетов снижается более резко по сравнению с длиной мицелия и биомассой мезофильных форм. Наибольшая биомасса термотолерантных актиномицетов отмечена на 4-е сутки опыта в такыровидной почве и составляет 14,53 мкг/г. Наибольшая биомасса мезофильных форм отмечена в остепненно-пустынной светлобурой засоленной почве и составляет 11,36 мкг/г почвы.

Исследование таксономического состава прокариотных микробных сообществ периодически прогреваемых почв методом FISH (fluorescent in situ hybridization)

Методом FISH выявлены представители филогенетической группы Actinobacteria и показано, что биомасса метаболически активных представителей этой группы может составлять до 50% в общей биомассе эубактерий микробных прокариотных сообществ исследованных почв. Установлено, что среди метаболически активных представителей филогенетической группы Actinobacteria преобладают мицелиальные формы. Одноклеточные бактерии составляют

значительно меньшую долю в биомассе метаболически активных актинобактерий (рис 5).

250 200 150 100 50

т10 300 J

• 8 250 ■

200 -

■■6 ^ ■•4 * | 150 -

100 •

-•2 50 ■

-• 0 0 -

4 сутки 10

Рис.4. Динамика длины мицелия (столбики) и биомассы (линия) актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением бурой пустынно-степной почвы. А - почва инкубирована при 28°С, Б - почва инкубирована при 45°С

175 389 390 391 392 393 Б1 1 2 175 389 390 391 392 393 Б1 1 2

образцы почв образцы почв

Рис. 5. Соотношение биомасс метаболически активных мицелиальных П и одноклеточны Щ представителей филогенетической группы Actinobacteria в прокариотном микробном сообществе исследованных почв. А - почва инкубирована при 28°С, Б - почва инкубирована при 45°С (Б1 - Кавказ, смешанный образец из образцов Б1, Б2, БЗ, Б4; 1 - Камчатка, смешанный образец из образцов 8 и 9; 2 - Камчатка, вулканический пепел)

Установление наличия филогенетической группы Actinobacteria в прокариотном мнкробном сообществе остепненпо - пустынной почвы методом ДГГЭ

Применение метода денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) для образцов исследуемой остепненно-пустынной почвы позволило установить присутствие в ней представителей филума Actinobacteria. Проанализированные последовательности тотальной ДНК исследуемой почвы,

инкубированной при 28°С и при 45°С показали сходство с последовательностями мицелиальных и одноклеточных актинобактерий. Транслированные последовательности обнаружили около 80% сходства с известными последовательностями организмов библиотеки клонов (табл. 2, 3).

Таким образом, молекулярно-биологическими методами анализа (методом FISH и DGGE) показано присутствие в прокариотных микробных комплексах исследованных почв физиологически активных мицелиальных и одноклеточных представителей филума Actinobacteria.

Зависимость радиальной скорости роста колоний актниомицетов от температуры культивирования

Выделенные из исследованных почв культуры стрептомицетов с помощью расчета радиальной скорости роста колоний классифицировали по их температурным потребностям. Выявлены мезофильные актиномицеты с оптимальной величиной скорости роста колоний при 28°С и растянутым температурным диапазоном роста (8°С-37°С) и термотолерантные актиномицеты, характеризующиеся оптимальной радиальной скоростью роста колоний при 37°С или 45°С и диапазоном роста, лежащим в области 15°С-50 °С или 60°С (рис. 6.).

К умеренным термофильным актиномицетам отнесен

Strepromyces sp. 315 FR716528, выделенный из серо-бурой пустынной почвы Монголии. Штамм характеризуется максимальным значением радиальной скорости роста колоний при 45°С, хорошо растет при 55°С и 37°С, слабо растет при 28°С. К умеренным термофилам отнесены Streptomyces aureofaciens шт. К-6 и шт. К-5 имеющие оптимумы роста при 50°С и при 45°С соответственно, хороший рост при 55°С и 37°С и слабый рост при 28°С.

Создана коллекция термотолерантных актиномицетов. Идентификацию выделенных культу термотолерантных актиномицетов проводили по фенотипическим и/или молекулярно-генетическим признакам. Определено филогенетическое положение выделенных штаммов актиномицетов. Последовательности гена 16S рРНК штаммов были депонированы в GenBank NCBI с присвоением им индивидуальных номеров доступа.

Из серо-бурой пустынной почвы выделен умеренный термофильный штамм 315, по фенотипическим признакам и последовательности нуклеотидов в молекуле

168 рРНК идентифицированный как Е1гер1отусе$ эр. Последовательности гена 16Б рРНК этого штамма депонированы в ОепВапк ЫСВ1 с присвоением индивидуального номера доступа БКерЮтусея эр. 315 БЯ716528.

Таблица 2

Филогенетическая характеристика актинобактерий в прокариотном микробном сообществе остепненно-пустынной почвы, инкубированной при 28°С

Номер доступа Название актинобактерий Процент сходства, %

Одноклеточные

NC_013441.1 Gordonia bronchialis DSM 43247 78

AEUD01000036.1 Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395 78

NC_010397.1 Mycobacterium abscessus AT CC 19977 78

AEAUO 1000076.1 Corynebacterium variabile DSM 44702 77

AAMN01000002.1 Janibacter sp. HTCC2649 77

NC_014246.1 Mobiluncus curtisii ATCC 43063 77

ACKW01000035.1 Mobiluncus mulieris ATCC 35243 77

NC014158.1 Tsukamurella paurometabola DSM 20162 77

NC_003450.3 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 77

NC_013172.1 Brachybacterium faecium DSM 4810 76

NC_013174.1 Jonesia denitrificans DSM 20603 76

NC_013235.1 Nakamurella multipartita DSM 44233 76

ACNOO 1000030.1 Rhodococcus erythropolis SK121 76

Мицелнальные

ADFD01000039.1 Streptomyces sp. ACTE ctg00036 78

ABYX01000136.1 Streptomyces roseosporus NRRL 11379 78

NZ_CM000913.1 Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 78

NC_010572.1 Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350 78

NC_013929.1 Streptomyces scabiei SI.22 78

NC_003155.4 Streptomyces avermitilis MA-4680 78

ACUY02000007.1 Actinomyces sp. oral taxon 848 str. F0332 77

NC_013093.1 Actinosynnema mirum DSM 43827 77

NC_003888.3 Streptomyces coelicolor A3(2) 77

AEDI01000202.1 Streptomyces violaceusniger Tu 4113 77

AEYX01000010.1 Streptomyces griseoaurantiacus M045 77

Таблица 3

Филогенетическая характеристика актинобактерий в прокариотном микробном сообществе остепненно-пустынной почвы, инкубированной при 45°С_

Номер доступа Название актинобактерий Процент сходства, %

Одноклеточные

AEUD01000036.1 Gordonia neofelifaecis NRRL B-59395 82

NC_010397.1 Mycobacterium abscessus ATCC 19977 82

NC_013739.1 Conexibacter woesei DSM 14684 81

АЕЕЕ01000021.1 Mobiluncus curtisii subsp. curtisii ATCC 35241 81

ACNOO1000030.1 Rhodococcus erythropolis SK121 81

AEGE01001139.1 Pseudonocardia sp. P2 PP201241 81

NC013124.1 Acidimicrobium ferrooxidans DSM 10331 80

NC_013235.1 Nakamurella multipartita DSM 44233 78

NC_014158.1 Tsukamurellapaurometabola DSM 20162 78

NC_008578.1 Acidothermus cellulolyticus 1 IB 78

Мицелиальные

NC_013131.1 Catenulispora acidiphila DSM 44928 82

AEYC01000092.1 Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395 81

ABYX01000136.1 Streptomyces roseosporus NRRL 11379 80

NC 010572.1 Streptomyces griseus subsp. griseus NBRC 13350 80

NC_014165.1 Thermobispora bispora DSM 43833 80

NC_013757.1 Geodermatophilus obscurus DSM 43160 79

AEDI01000202.1 Streptomyces violaceusniger Tu 4113 ctg00307 79

NC_003155.4 Streptomyces avermitilis MA-4680 79

NZ_CM000913.1 Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 79

NC_013929.1 Streptomyces scabiei 87.22 79

ACU Y02000007.1 Actinomyces sp. oral taxon 848 str. F0332 78

AEYX01000010.1 Streptomyces griseoaurantiacus M045 ContigOlO 78

NC_007333.1 Thermobiflda fusca YX chromosome 78

NC_003888.3 Streptomyces coelicolor A3(2) 78

NC_013093.1 Actinosynnema mirum DSM 43827 78

NC_008278.1 Frankia aim ACN 14a 78

ACFH01000038.1 Actinomyces urogenitalis DSM 15434 78

ю ■

20 ■

25-

0 С

15 20 28 37 45 50 55 60

температура »

'С

Рис.6. Зависимость радиальной скорости роста колоний актиномицетов от температуры культивирования. Синие линии - мезофильные штаммы, зеленые и красные -термотолерантные, из них II,III,IV умеренные термофильные. I - Streptomyces aureofaciens шт.КЗ; II - S.aureofaciens шт. К5; III - S.aureofaciens шт. Кб; IV - Streptomyces sp.315 FR716528; V - Actinomadura 392-1 FR853173;VI - Streptomyces sp. шт 392-2; VII - S.tendae шт 175 FR846234; VIII - S. alborubidus шт. IM; IX - S. tenebrarius шт ЗА

Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК термотолерантного штамма 175, выделенного из бурой пустынной почвы и по фенотипическим признакам и последовательности нуклеотидов в молекуле 16S рРНК идентифицированного как Streptomyces tendae, депонированы в GenBank NCBI с присвоением индивидуального номера доступа Streptomyces tendae 175 FR846234.

В образце такыровидной пустынной почвы Монголии мезофильные актиномицеты представлены родом Streptomyces, термотолерантные - родами Streptomyes, Micromonospora, Actinomadura, Streptosporangium.

Термотолерантный штамм 392-1, выделенный из такыровидной пустынной почвы, идентифицирован по фенотипическим признакам и последовательности нуклеотидов в молекуле 16S рРНК как Actinomadura sp. Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК этого штамма депонированы в GenBank NCBI с присвоением индивидуального номера доступа Actinomadura sp.392-1 FR853173.

Из такыровидной пустынной почвы выделен штамм S341f, по фенотипическим признакам и последовательности нуклеотидов в молекуле 16S рРНК идентифицированный как Streptosporangium sp. Последовательности гена 16S рРНК

этого штамма депонированы в GenBank NCBI с присвоением индивидуального номера доступа Streptosporangium sp. S341 f FR853175.

Экофизиологические свойства термотолерантных актиномицетов. выделенных из периодически прогреваемых почв

Доказательства ксеротолерантности умеренного термофильного штамма Strepromyces sp. 315 FR716528

Использование методики прорастания спор умеренного термофильного Strepromyces sp. 315 FR716528 на стеклах, экспонируемых в эксикаторах с низкими значениями влажности и температурой 28°С или 45°С в течение 72 часов, показали, что споры стрептомицета прорастают в условиях 45°С и 28°С при всех исследуемых активностях воды: а*, 0,50, aw 0,86 и aw0,98. Усредненные по всем уровням а« графики и полученные уравнения показывают, что при 45°С споры умеренного термофильного стрептомицета прорастают в 2 раза быстрее, чем при 28°С.

Можно сделать вывод, что умеренный термофильный стрептомицет Strepromyces sp. 315 FR716528 является ксеротолерантным (рис. 7).

Выявление функциональных особенностей термотолерантных актиномицетов методом мультиреспнрометрического тестирования (МРТ)

Использование метода МРТ для определения функциональных особенностей почвенных актиномицетов с различными температурными адаптациями позволило выявить их некоторые функциональные особенности.

Рис. 7. Графики прорастания спор умеренного термофильного штамма З^ерЮтусея эр. 315 П1 716528 в условиях низкой влажности при разных температурах

Кластерный анализ показал возможность разделения объектов на два класса, один из которых был представлен только термотолерантными популяциями.

Кластерный анализ результатов опытов по определению способности к усвоению различных субстратов актиномицетами разных температурных групп: мезофильными (оптимум роста 28°С), психрофильными (оптимум роста 5°С) (Дуброва и др., 2011) и термотолерантными (оптимум роста 45°С) показал возможность разделения объектов на два класса, один из которых был представлен только термотолерантными популяциями.

Дискриминантный анализ позволил решить диагностическую задачу определения психротолерантных, мезофильных и термотолерантных актиномицетов в 83% случаев с помощью двух дискриминантных функций. В этом случае термотолерантные популяции образуют особую группировку, не пересекающуюся с другими классами (рис.8). Можно предположить, что экониши почвенных психротолерантных, мезофильных и термотолерантных актиномицетов расходятся не только по фактору температуры, но и по спектрам потребляемых субстратов.

Показано, что при увеличении температуры культивирования Strepromyces sp. 315 FR716528 в липидах мембран умеренного термофильного стрептомицета увеличивается количество насыщенных длинноцепочечных жирных кислот-гексадеценовой, гексадекановой, изо-гептадекановой и антеизо-гептадекановой.

Plot of Discriminant Functions

Function 1

Рис. 8. Графики дискриминантных функций, построеные на основании мультиреспирометрического тестирования психротолерантных (2), термотолерантных (3) и мезофильных (4) актиномицетов

Термотолерантные актиномицеты при температуре 45°С проявляют антимикробные свойства в отношении термотолерантных культур рода Bacillus, хорошо растут на среде с хитином, в качестве единственного источника углерода и азота и на среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода.

У термотолерантного Streptomyces aureofaciens шт. К5, выделенного из вулканической дерновой почвы Камчатки в районе вулкана Безымянный, в динамике увеличиваются биомасса и эмиссия диоксида углерода, и соответственно удельная активность дыхания, при росте на среде с хитином в качестве единственного источника углерода и азота при 45°С (рис. 9).

Рис. 9. Динамика удельной активности дыхания (В) 51гер1отусез аигео/аает шт. К5 при росте на среде с хитином в качестве единственного источника углерода и азота при разных температурах

ВЫВОДЫ

1. В почвах пустынных степей Монголии, горно-луговой почве Центрального Кавказа, в вулканических почвах Камчатки обнаружены мезофильные и термотолерантные актиномицеты в сопоставимых количествах или с преобладанием термотолерантных форм, более разнообразных в таксономическом отношении по сравнению с мезофильными.

2. Установлено, что в исследованных пустынных почвах Монголии и горной почве Центрального Кавказа среди представителей рода 51гер1отусея доминируют мезофильные формы, а среди представителей рода М1сготопо$рога — термотолерантные актиномицеты. Вулканические почвы характеризуются специфическими актиномицетными комплексами, в которых представители родов КИсготопохрога и МгсгоШгаярога доминируют в комплексе.

3. В опыте с микрокосмами в ходе сукцессии, инициированной увлажнением (60% ПВ), показано, что мезофильные и термотолерантные актиномицеты в периодически прогреваемых почвах растут, развиваются, образуют мицелий, который увеличивается в длину.

4. Молекулярно-биологическими методами анализа (методом FISH и DGGE) установлено присутствие в прокариотном микробном комплексе исследованных почв физиологически активных представителей филума Actinobacteria. Биомасса мицелиальных метаболически активных актинобактерий превышает биомассу одноклеточных метаболически активных актинобактерий в филуме Actinobacteria во всех исследованных периодически прогреваемых почвах.

5. Исследованы некоторые экофизиологические свойства термотолерантных актиномицетов, выделенных из периодически прогреваемых почв. Впервые экспериментально показана ксеротолерантность умеренного термофильного штамма Strepromyces sp. 315 FR716528. При увеличении температуры культивирования в липидах мембран умеренного термофильного Strepromyces sp. 315 FR716528 возрастает количество насыщенных длинноцепочечных жирных кислот. Термотолерантные стрептомицеты проявляют антибактериальные свойства, способность к разложению хитина и углеводородов при высокой температуре (45°С). С использованием метода МРТ показано, что экониши термотолерантных и мезофильных актиномицетов различаются не только по фактору температуры, но и спектру потребления субстратов.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Курапова А.И., Зенова Г.М., Орлеанский В.К, Манучаров A.C., Норовсурэн Ж. Мезофильные и термотолерантные актиномицеты в разогреваемых почвах. Вестник Московского университета. Сер.17. Почвоведение. 2008. №3. С.45-50.

2. Зенова Г.М., Лысенко A.M., Манучарова H.A., Курапова А.И., Дуброва М.С. Таксономическая и функциональная структура психротолерантных и термотолерантных комплексов почвенных актиномицетов. Теоретическая и прикладная экология. 2008. № 3. С. 35-40.

3. Зенова Г.М., Курапова А.И., Лысенко А.М., Звягинцев Д.Г. Структурно-функциональная организация комплексов термотолерантных актиномицетов пустынных и вулканических почв. Почвоведение. 2009. №5. С.575-580.

4. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., ГрачеваТ.А., Курапова А.И, Дуброва М.С. Разнообразие почвенных актиномицетных комплексов, обусловленное температурными адаптациями мицелиальных актинобактерий. Теоретическая и прикладная экология. 2011. № 1.С. 4-23.

5. Курапова А.И., Орлеанский В.К., Шадрин Н.В. Разнообразие актиномицетов в горно-луговых почвах альпийского яруса Северного Кавказа. Материалы Всероссийской конференции молодых ученых. Улан-Удэ. Изд-во ГУЗ РЦМП МЗ РБ. 2007. С. 52-53.

6. Курапова А.И., Зенова Г.М., Орлеанский В.К. Мезофильные и термотолерантные актиномицеты в субстратах с разными температурными режимами. Материалы Международной научной конференции. Ростов н/Д. Изд-во Росиздат. 2007. С.141-143.

7. Курапова А.И. Мезофильные и термотолерантные актиномицеты в горных и пустынных почвах. Ломоносов-2007: XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых М. МАКС Пресс. 2007. С. 45-46.

8. Ибатуллина И.З., Курапова А.И. Перспективы использования аборигенных микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных засоленных почв Ставропольского Края. Материалы Международной научно-практической конференции "Плодородие почв-уникальный природный ресурс, в нем будущее России", XI Докучаевские молодежные чтения. Санкт-Петербург. 2008. С. 174.

9. Курапова А.И. Термотолерантные актиномицеты в пустынных, горных и вулканических почвах. Материалы международной научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем». Астрахань. 2008. С. 140- 143.

10. Курапова А.И. Разнообразие термотолерантных актиномицетов в пустынных и вулканических почвах. Бюллетень Московского общества испытателей природы. Приложение 1. Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах. 2009. Т. 14. В.2. С.237- 238.

11. Курапова А.И., Зенова Г.М., Карпов Г.А., Орлеанский В.К. Термотолерантные актиномицеты «редких» родов в вулканических и пустынных почвах. Материалы V Международной научной конференции «Вулканизм, биосфера и экологические проблемы». Туапсе. 2009.С.103.

12. Kurapova A.I., Norovsuren J., Zenova G. M., Actinomycetes with indistinct taxonomic position from dry steppes and semi-deserts soils of Mongolia. Xlth Young Systematists' Forum. London. UK. 2009. P. 9.

13. Курапова А.И. Биогеографические характеристики актиномицетных комплексов периодически прогреваемых почв. Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с международным участием. М. 2009. С. 103.

14. Курапова А.И. Термотолерантные актиномицеты в периодически прогреваемых почвах. Ломоносов-2010: XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам. М.: МАКС Пресс. 2010. С.60.

15. Курапова А.И.,. Кожевин П.А. Анализ периодически прогреваемых почв как источника термотолерантных актиномицетов. Отражение био-, reo, антропосферных взаимодействий в почвах и почвенном покрове: Сборник материалов IV Всероссийской научной конференции с международным участием. Т.2. Томск. ТМЛ-Пресс. 2010. С. 114-116.

16. Норовсурэн Ж, Зенова Г.М., Курапова А. И., Алимова Ф. К., Болормаа Ч,Хапиунаа У., Янжинлхам Ш. Экологические особенности рода StreptomycesB почвах Монголии. Материалы международной научной конференции«Экологические последствия биосферных процессов в экотонной зоне Южной Сибири и Центральной Азии», Улан -Батор, Монголия. Изд-во «Бэмби сан». 2010. С. 235-236.

17. Kurapova A.I.,. Zenova G. M, Mironov V.A.. Periodically warmed up soils of Mongolia and Russia as a bank of thermophilic and thermotolerant actinomycetes. XHth young systematist's forum. London. UK. 2010. P.4.

Подписано в печать:

09.09.2011

Заказ № 5885 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Курапова, Анна Игоревна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Влияние условий окружающей среды на рост и развитие актиномицетов.

1.1.1. Отношение актиномицетов к кислотности среды.

1.1.2. Алкалофильные и галоалкалотолерантные актиномицеты.

1.1.3. Развитие актиномицетов в условиях засухи.

1.2. Термофилия у микроорганизмов.

1.3. Систематическое положение термофильных актиномицетов.

1.4. Экофизиологические особенности термофильных и термотолерантных актиномицетов.

1.5. Распространение термофильных актиномицетов в почвах.

1.6. Термофильные и термотолерантные актиномицеты — продуценты биологически активных веществ.

1.6.1. Актиномицеты — продуценты антибиотиков.

1.6.2. Термофильные актиномицеты - патогены животных и человека.

1.7. Прикладные аспекты изучения термофильных актиномицетов.

1.7.1. Участие в разложении труднодоступных соединений углерода.

1.7.2. Термофильные актиномицеты как индикаторы нефтяного загрязнения почв.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Почвы пустынных степей Монголии.

2.1.2. Горно-луговая почва Центрального Кавказа.

2.1.3. Слаборазвитая слоисто - пепловая почва

Камчатки.

2.1.4. Вулканическая дерновая почва кальдеры вулкана

Узон.

2.1.5. Лугово-каштановая почва, загрязненная нефтью.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Методы выделения и дифференцированного учета актиномицетов.

2.2.2. Методы определения зависимости радиальной скорости роста от температуры культивирования актиномицетов.

2.2.3. Электронно-микроскопические исследования актиномицетов.

2.2.4. Метод сукцессионного анализа для исследования развития актиномицетов в почвах.

2.2.5. Флюоресцентный метод гибридизации in situ для оценки биомассы метаболически активных клеток бактерий.

2.2.6. Оценка интенсивности потребления хитина и разложения углеводородов чистыми культурами микроорганизмов.

2.2.7. Определение белка по Бредфорду.

2.2.8. Выделение ДНК и амплификация фрагментов генов 16SpPHK.

2.2.9. Использоваие метода денатурирующего градиентнтного гель-электрофореза (ДГТЭ) для установления наличия в прокариотном микробном сообществе исследуемой пустынной почвы филума Actinobacteria.

2.2.10. Определение жирокислотного состава липидов мембран актиномицетов.

2.2.11. Метод мультисубстратного респирометрического тестирования.

2.2.12. Опеделение ксеротолерантности умеренного термофильного стрептомицета.

2.2.13. Определение антимикробной активности микроорганизмов методом агаровых блочков.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Численность и таксономический состав актиномицетных комплексов периодически прогреваемых почв.

3.2. Дискриминантный анализ пустынных почв Монголии, вулканических почв Камчатки и горно-луговой почвы Центрального Кавказа.

3.3. Динамика длины мицелия и биомассы актиномицетов в ходе сукцессии, инициированной увлажнением пустынных почв

Монголии.

3.4. Исследование филогенетической группы Actinobacteria прокариотных микробных сообществ периодически прогреваемых почв методом FISH (FISH-fluorescent in situ hybridization).

3.5. Установление присутствия филогенетической группы Actinobacteria в прокариотном микробном сообществе остепненно — пустынной почвы методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГТЭ).

3.6. Зависимость радиальной скорости роста колоний актиномицетов от температуры культивирования.

3.7. Экофизиологические свойства термотолерантных актиномицетов, выделенных из периодически прогреваемых почв.

3.7.1. Доказательства ксеротолерантности умеренного термофильного штамма Streptomyces sp.

FR716528.

3.7.2. Выявление функциональных особенностей термотолерантных актиномицетов методом мультиреспирометрического тестирования (МРТ).

3.7.3 Исследование состава жирных кислот липидов мембран умеренного термофильного стрептомицета Streptomyces sp. 315 FR716528 при разных температурах.

3.7.4. Исследование антимикробных свойств термотолерантных актиномицетов.

3.7.5. Исследование накопления биомассы и эмиссии СОг умеренным термофильным актиномицетом на среде с хитином в качестве единственного источника углерода и азота.

3.8. Численность и таксономическая структура комплексов углеводородокисляющих мезофильных и термотолерантных актиномицетов в лугово-каштановой почве при нефтяном загрязнении.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термотолерантные актиномицеты в пустынных, вулканических и горной почвах"

Среди представителей спороактиномицетов, имеющих развитый воздушный мицелий и споры, преобладают мезофильные формы, оптимальный интервал для роста которых 20-3 5°С. Термофильные актиномицеты, способные расти при 50°С, описаны и подробно исследованы в составе рода Thermoactinomyces, согласно современной классификации выведенного из порядка Actinomycetales. Отдельные термофильные виды описаны в составе родов Actinomadura, Thermomonospora, Microbispora, Saccharopolyspora, Saccharomonospora и Streptomyces (Агре, 1986; Kim et al., 1999).

Исследование закономерностей действия температурного фактора на жизнедеятельность микробных популяций имеет важное значение, как с теоретической, так и практической точек зрения. Теоретически представляют интерес механизмы температурных адаптаций. С практической точки зрения важно знать, как адаптации к температуре влияют на интенсивность микробного дыхания, в ходе которого выделяется двуокись углерода. СОг, является одним из парниковых газов, изменение концентрации которых приводит к общему изменению климата. Поэтому актуальна проблема зависимости от температуры функциональной активности микробного населения почвы, в число которого входят грамположительные мицелиальные бактерии — актиномицеты.

Термофильные актиномицеты широко используются в биотехнологии как продуценты дегидрогеназ и как организмы, быстро разлагающие различные полимеры (Манучарова и др., 2008; Xiaoping Ни et al., 2010; Ganesh D. Saratale, Sang Eun Oh, 2011). Однако сведения о закономерностях распространения термофильных и термотолерантных актиномицетов в почвах весьма ограничены. Можно предполагать, что в почвах, подверженных периодическому прогреванию до высоких температур при недостатке влаги и питательных веществ, термофильные и термотолерантные актиномицеты, споры которых способны прорастать в экстремальных условиях при высоких температурах и низких значениях влажности почвы, могут составлять существенную часть прокариотного сапротрофного гидролитического блока микробного сообщества (Звягинцев и др., 2009; Kim et al., 2002; Kumar et al., 2004).

Задачи исследования:

3. Определение наличия одноклеточных и мицелиальных представителей филума Actinobacteria в прокариотном микробном сообществе пустынной почвы с использованием молекулярнобиологического метода - денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ-метод).

4. Оценка биомассы метаболически активных одноклеточных и мицелиальных представителей филума Actinobacteria в прокариотных микробных комплексах исследуемых почв с использованием молекулярного метода гибридизации in situ (метод FISH - fluorescent in situ hybridization).

Научная новизна. Выявлены и охарактеризованы экологические ниши термотолерантных актиномицетов. Расширены наши представления о биоразнообразии микробного комплекса почв. Установлено, что в периодически прогреваемых почвах (пустынных, вулканических, горной) формируются актиномицетные комплексы, в которых термотолерантные актиномицеты сопоставимы по численности и более разнообразны в таксономическом отношении по сравнению с мезофильными формами. Впервые в вулканических периодически прогреваемых почвах выявлены специфические актиномицетные комплексы, в которых термотолерантные формы представлены родами Micromonospora и Microtetraspora, мезофильные - родом Microbispora. Показано, что термотолерантные актиномицеты в периодически прогреваемых почвах растут, развиваются, образуют мицелий и проходят полный цикл развития. Впервые молекулярно-биологическими методами (методом FISH и DGGE) установлено присутствие в прокариотных микробных комплексах исследованных почв физиологически активных представителей филума Actinobacteria. Биомасса метаболически активных мицелиальных актинобактерий превышает биомассу метаболически активных одноклеточных актинобактерий. Впервые экспериментально показана ксеротолерантность умеренного термофильного стрептомицета. Установлено, что с повышением температуры культивирования от 28°С до 45°С в липидах мембран клеток умеренного термофильного стрептомицета повышается содержание насыщенных длинноцепочечных жирных кислот-гексадекановой, изо-гептадекановой, антеизо-гептадекановой и изо-октадекановой. Показано, что экониши термотолерантных стрептомицетов отличаются от экониш мезофильных культур не только по температурным показателям, но и по спектру потребляемых субстратов (гистидина, маннита, сахарозы).

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на XIV, XV и XVII Международных конференциях, студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), «Ломоносов-2008» (Москва, 2008) и «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), на V Международной научной конференции «Вулканизм, биосфера и экологические проблемы» (Туапсе, 2009), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), на XI-th и XII-th Young Systematists' Forum (Лондон, 2009, 2010) и на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

Объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части (объекты и методы исследования, результаты, обсуждение), выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 149 страницах текста, содержат 35 рисунков и 21 таблицу. Список литературы включает 169 источников, в том числе 113 на иностранном языке.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю профессору, д.б.н. Г.М.Зеновой, сотруднику Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН к.б.н. В.К.Орлеанскому, сотрудникам кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ, особенно профессору, д.б.н. Д.Г.Звягинцеву, д.б.н. П.А.Кожевину, к.б.н. Н.А.Манучаровой, к.б.н. Т.А.Грачевой, к.б.н. А.В.Якушеву. Благодарю сотрудницу Биологического института АН Монголии д.б.н. Норовсурэн Ж., аспиранта Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (Пущино) В.А.Миронова и аспирантку кафедры земельных ресурсов факультета почвоведения МГУ И.З.Ибатуллину за предоставление образцов почв для исследования.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Курапова, Анна Игоревна

выводы

1. В почвах пустынных степей Монголии, горно-луговой почве Центрального- Кавказа, в вулканических почвах Камчатки обнаружены мезофильные и термотолерантные актиномицеты в сопоставимых количествах или с преобладанием термотолерантных форм, более разнообразных в таксономическом отношении по сравнению с мезофильными.

2. Установлено, что в исследованных пустынных почвах Монголии и горной почве Центрального Кавказа среди представителей рода Streptomyces доминируют мезофильные формы, а среди представителей рода Micromonospora - термотолерантные актиномицеты. Вулканические почвы характеризуются специфическими актиномицетными комплексами, в которых представители родов Micromonospora и Microtetraspora доминируют в комплексе.

3. В, опыте с микрокосмами в ходе сукцессии, инициированной увлажнением (60% ПВ), показано, что мезофильные и термотолерантные актиномицеты в периодически прогреваемых почвах растут, развиваются, образуют мицелий, который увеличивается в длину.

4. Молекулярно-биологическими, методами анализа (методом FISH и DGGE) установлено присутствие в прокариотном микробном комплексе исследованных почв физиологически активных представителей филума Actinobacteria. Биомасса мицелиальных метаболически активных актинобактерий превышает биомассу одноклеточных метаболически активных актинобактерий в филуме Actinobacteria во всех исследованных периодически прогреваемых почвах.

FR716528. При увеличении температуры культивирования в липидах мембран умеренного термофильного Streptomyces sp. 315 FR716528 возрастает количество насыщенных длинноцепочечных жирных кислот. Термотолерантные стрептомицеты проявляют антибактериальные свойства, способность к разложению хитина и углеводородов при высокой температуре (45°С). С использованием метода МРТ показано, что экониши термотолерантных и мезофильных актиномицетов различаются не только по фактору температуры, но и спектру потребления субстратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Курапова, Анна Игоревна, Москва

1. Агре Н.С. Систематика термофильных актиномицетов. Пущино. 1986. 130 с.

2. Апродов В.А. Вулканы. Москва: "Мысль", 1982. 367 с.

3. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. Роды Streptomyces, Streptoverticillium и Chaini. М. Наука. 1983. 238 с.

4. Горленко М.В., Кожевин П. А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. Москва: МАКС Пресс. 2005. 88 с.

5. Горленко М.В., Кожевин П.А. Дифференциация почвенных микробных сообществ с помощью мультисубстратного тестирования // Микробиология. 1994. том 63. № 2. С. 289-293.

6. Грандберг И.И. Органическая химия: учеб. для студ.вузов, обучающихся по агроном, спец. — 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Дрофа. 2001.-672 с.

7. Грузина В.Д., Галатенко O.A., Сумарукова И.Г., Ефременкова О.В., Терехова Л.П. Метод увеличения количества выделяемыхактиномицетов, основанный на предварительном внесении в образцы почв водных суспензий бактерий // Биотехнология, 2003, № 4, С. 42-48.

8. П.Гусев М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В Гусев, JI.A. Минеева. — 5-е изд., стер. — М.: Издательский центр «Академия», 2004. 464 с.

9. Гусев М.В., Коронелли Т.В., Максимов В.Н. и др. Изучение микробиологического окисления дизельного тополива методом полного факторного эксперимента // Микробиология. 1980. Т.49. № 1. С.25-30.

10. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ «Академкнига». 2002. 281 с.

11. Доржготов Д. Почвы Монголии (генезис, систематика, география, ресурсы и использование). Авт. дисс.д.б.н. М. 1992. 34 с.

12. Дорошенко Е.А., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И. Прорастание спор и рост мицелия стрептомицетов при разных уровнях влажности//Микробиология. 2005. Т. 74. № 6. С. 795-799.

13. Звягинцев Д.Г., Гузев B.C., Левин C.B., Оборин A.A. Диагностические признаки различных уровней загрязнения почв нефтью// Почвоведение. 1989. № 1. С.72-78.

14. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Экология актиномицетов. М.: ГЕОС. 2001.256 с.

15. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М. Актиномицеты засоленных и щелочных почв. М.: «Книжный дом Университет». 2007. 107 с.

16. Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М, Судницын И.И., Грачева Т. А., Напольская K.P., Белоусова М.А Динамика прорастания спор и роста мицелия стрептомицетов в условиях низкой влажности // Микробиология, Т.78. № 4. 2009. С. 491-495.

17. Зенова Г.М. Почвенные актиномицеты редких родов. М. Изд-во Московского ун-та. 2000. 130 с.

18. Зенова Г.М., Закалюкина Ю.В., Звягинцев Д.Г. Ацидотолерантные актиномицеты в почвах // Почвоведение. 2000 № 9. С. 1114-1116.

19. Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Разнообразие актиномицетов в наземных экосистемах. М.: Изд-во Моск. Ун-та. 2002. 131 с.

20. Зенова Г.М., Початкова Т.Н., Грядунова А.А, Грачева, Т.А., Лихачева A.A., Закалюкина Ю.В. Мицелиальные прокариоты рода Micromonospora в луговой низинной торфяной почве. // Почвоведение. 2005.№ 7. С. 882-888.

21. Ибатуллина И.З., Виноградова Ю.А., Хабибуллина Ф.М. Микробиота засоленных лугово-каштановых почв Ставропольского края при загрязнении нефтью и биорекультивации // Известия Самарского н.ц.РАН. Т. 13, №1(5). 2011.С.1194-1199.

22. Калакуцкий Л.В., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. М. Наука. 1977. 286 с.

23. Киреева H.A., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязннных почв. Уфа: Гил ем. 2001. 376 с.31 .Классификация и диагностика почв России. Смоленск. 2004. 342 с.

24. Классификация и диагностика почв СССР. М.: Колос. 1977. 223 с.

25. Кураков A.B., Ильинский В.В., Котелевцев C.B., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях (ред. Садчиков А.П., Котельцев С.В.).М., Издательство «Графикон». 2006. 336 с.

26. Ли Ю. В., Терехова Л. П., Алфёрова И.В., Галатенко O.A., Гапочка М.Г. применение сукцессионного анализа в комбинации с КВЧ-излучением для селективного выделения актиномицетов из почвы //Микробиология. 2003. Т.72. №1. С. 131-135.

27. Лысак Л.В., Лихачева A.A., Алферова И.В. Методы выделения и изучения почвенных актиномицетов, продуцентов антибиотиков: Учебное пособие:М. МАКС Пресс. 2005.80 с.

28. Манучарова H.A. Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением мелекулярно-биологического флюоресцентномикроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridization (FISH). М.:Университет и школа, 2008.23 с.

29. Манучарова H.A., Власенко А.Н., Турова Т.П., Пантелеева А.Н., Степанов А.Л., Зенова Г.М. Термофильный хитинолитический микробный комплекс бурой пустынно-степной почвы // Микробиология. 2008. Т. 77. №5. с. 683-688.

30. Марченко С.А., Панкратов Т.А.,Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ впочве // Вестник Моск. Ун-та. Серия 17. Почвоведение. 2005. №2. С. 44-48.

31. Морозов Н.В., Николаев В.Н. Влияние условий среды на развитие нефтеразлагающих микроорганизмов // Гидробиол. журн. 1978. Т. 14. № 4. С. 55.

32. Определитель бактерий Берджи // ред. Д Хаулт, Н.Криг и др. М. Мир. 1997. Т 2. 799 с.

33. Орлеанский В.К. Циано-бактериальные маты аналоги ископаемых строматолитов (лабораторное моделирование) // Бактериальная палеонтология. М. ПИН РАН.2002. С.45-58.

34. Осипов Г.А. Способ определения родового состава ассоциации микрорга-низмов//Патент РФ №2086642. 1997. 15 с.

35. Панкратов Т.А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах сиспользованием метода FISH // Микробиология, 2005. Т. 74. № 6. С.831-837.

36. Почвенный покров основных природных зон Монголии. М. Наука. 1976. 273 с.

37. Преображенская Т.П., Терехова Л.П., Галатенко O.A., Алфёрова И.В. и др. Поиск продуцентов антибиотиков среди актиномицетов редких родов. Алма-Ата: Гылым, 1990. 120 с.

38. Работнова И.Л. Роль физико-химических условий (pH и гН2) в жизнедеятельности микроорганизмов. М.: АН СССР. 1957. 275 с.

39. Сангаджиева О.С. Экологические особенности нефтезагрязненных почв республики Калмыкия и разработка методов их биоремедиации. Авт. дисс.к.б.н. Саратов. 2004. 18с.

40. Селянин В.В., Оборотов Г.В., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Почвенные ацидофильные актиномицеты // Микробиология. 2005. Т. 74. №6. С. 838 -844.

41. Современная микробиология. Прокариоты / ред. Й. Ленгелер, Г. Древе, Г. Шлегель, М. Мир. Т 2. 2005. 496 с.

42. Терехова Л.П., Галатенко O.A., Преображенская Т.П. Направленный поиск продуцентов антибиотиков среди актиномадур // Антибиотики. 1988,Т. 33, № 12, С. 930-934.

43. Терехова Л.П., Преображенская Т.П., Галатенко O.A. Поиск новых антибактериальных антибиотиков из редких родов актиномицетов // Антибиотики и химиотерапия. 1989. Т. 34. № 5. С. 390-394.

44. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение: под ред. К. Г. Скрябина, Г. А. Вихоревой, В. П. Варламова. М.: Наука. 2002. 368 с.

45. Чернова Н.В., Былова A.M. Общая экология: учебник для студентовпедагогических вузов-М.: Дрофа, 2004. 416с. 57. Aber J.D., Mellilo J.M. Terrestrial Ecosystems // Saunders College136

46. Publishing, PA. 1991. P. 84-88.

47. Airaksinen S., Heiskanen M.L, Heinonen — Tanski H., Laitinen J., Laitinen S., Linnainmaa M., Rautiala S. Variety in dustnss and hygiene quality of peat bedding // Ann. Agric. Environ. Med. 2005. № 12 (1). P. 53-59.

48. Aitken MD, Stringfellow WT, Nagel RD, Kazunga C, Chen SH (1998) Characteristics of phenanthrene-degrading bacteria isolated from soils contaminated with polycyclic aromatic hydro-carbons // Can J Microbiol. 1998. V.44. P.743—752.

49. Arakane Y., Muthukrishnan S. Insect chitinase and chitinase-like proteins // Cell. Mol. Life Sei. 2010. V. 67 P.201-216.

50. Atlas R.M., Busdosh M. Microbial degradation of petroleum in the Arctic // Proc. Th. Intern. Biodegradation Symp. Appl. Sei (ed. By J.M. Sharpley, A.M. Kaplan).London. 1976. P. 79-86.

51. Barabas G.Y., Vargha G., Szabo I.M., Penyige A., Damjanovich S., Szollosi J., Matk J., Hirano T., M'atyus A., Szab'o I. n-Alkane uptake and utilization by Streptomyces strains //Antonie van Leeuwenhoek. 2001. V. 79 P. 269-276

52. Beg Q.K., B. Bhushan, M. Kapoor, G.S. Hoondal. Production and characterization of thermostable xylanase and pectinase from Streptomyces sp. QG-11-3 // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2000. V.24 P.396-402.

53. Belhaj A., Nicole Desnoues N., Elmerich C Alkane biodégradation in Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a polluted zone: identification of alkB and alkB-related genes // Res Microbiol. 2002. V. 153 P.339-344.

54. Bergey's Manual of Systematic Bacteorolgy 1st ed.(Ed. S. T. Williams, M. Sharpe., J.A. Holt). Baltimore ets. Williams and Wilkins. Ninth Edition. 1989. V. 4. 2648 p.

55. Bergey's Manual of Systematic Bacteorolgy 2nd ed (Ed. Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B.).'Williams & Wilkins. 2009. V.3 1450 p.

56. Bergey's Manual of Systematic Bacteorolgy 2nd ed (Ed. Goodfellow M., Kämpfer P., Hans-Jürgen Busse, Trujillo M., Ken-ichiro Suzuki, Ludwig W., Whitman.W.B.). 2011. V.5 (http://www.bergeys.org)

57. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 9th ed.(Ed. Holt J.G., ICrieg N R., Sneath P.H.A., Staley J.T., Williams S.T.). Williams & Wilkins. 1994. 816 p.

58. Bhattacharya D., Nagpure A., Gupta R.K. Bacterial chitinases: properties and'potential // Grit. Rev. Biotechnol. 2007. 27(1): 21-28.

59. Boot R.G., Blommaart E.F.C., Swart E., Ghauharali-van der Vlugt K., Bijl N., Мое C., Place A. & Aerts J.M.G. Identification of a nivel acidic mammalian chitinase distinct from chitotriosidase // J. Biol. Chem. 2001. V.276 P. 6770-6778.

60. Chen K., Lin Y., Yang S. Application of thermotolerant microorganisms for biofertilizer preparation // J Microbiol Immunol Infect. 2007. V. 40. P.462-473

61. Christopher L., Bissoon S., Singh S., Szendefy J., Szakacs G. Bleach -enhansing abilites of Thermomyces lanuginosus xylanases produced by soil state fermentation // Process Biochemistry. 2005. V.40. № 10. P. 3230-3235.

62. Connon S.A., Lester E.D., Shafaat H.S., Obenhuber D.C., Ponce A. Bacterial diversity in hyperarid Atacama Desert soils // J Geophys Res. 2007. V. 112: P. 9.

63. Dix N.J., Webbster M. Fungal Ecology // London ets. Chapman and Hall. 1995. 497 p.

64. Eilenberg H., Pnini-Cohen S., Schuster S., Movtchan A., Zilberstein A. Isolation and characterisation of chitinase genes from pitches of the carnivorous plant Nepenthes khasiana // J. Exp. Bol. 2006. V.57. P. 2775-2784.

65. Erikson D. Temperature/growth relationships of a thermophilic actinomycete, Micromonospora vulgaris, // J.gen. Microbiol. 1952.V.6. P. 286-294.

66. Escott G.M. and Adams D.J. Chitinase Activity in Human Serum nd Leukocytes // Infection and Immunity. 1995. V.63(12). P. 4770-4773.

67. Farerll Y., Campbell L.L. Thermophilyc bacteria and bacteriophages // Adv. Microbiol. Physiol. 1969. V 3. P. 83-109.

68. Gadkari, D., Mosrsdorf, G. & Meyer, O. Chemolithoautotrophic assimilation of dinitrogen by Streptomyces thermoautotrophicus UBT1: identifcation of an unusual N2-fxing system // J Bacteriol. 1992. V. 174, P. 6840-6843.

69. Garrity G.M., Heimbuch B.K., Gagliardi M. Isolation of zoosporogenous actinomycetes from desert soils // J. Industrial Microbiol. 1996. V. 17. № 34. P. 260-267.

70. Geok Yuan Annie Tan, Robinson S., Lacey E., Goodfellow M Amycolatopsis australiensis sp.nov., an actinomycete isolated from arid soils 11 Int J Syst Evol Microbiol. 2006. V. 56. P. 2297-2301.

71. Gochnauer M.B., leppard G.G., Komaratat p., Kates M., Novitsky T., Kushner D.J. Isolation and characterization of Actinopolyspora halophila, gen.et.sp.nov., an extremely halophilic actinomycete // J. Microbiol. 1975. V.21.P. 1500-1511.

72. Gonzalez-Franco A.C., Deobald L.A., Spivak A. and Crawford D.L. Actinobacterial chitinase-like enzymes: profiles of rhizosphere versus non-rhizosphere isolates // Can. J. Microbiol. 2003. V. 49. P.683-698.

73. Goodfellow M, Simpson K.E. Ecology of streptomycetes // Frontiers in Applied Microbiology 1987. V2. P 97-125.

74. Goodfellow M., Kim S.B. Phylogenetic analysis of acidophilic and netrotolerant actinomycetes isolated from soil and coal wastes // 11th International Symp. on the Biology of Actinomycetes. Heraclion. Greece. 1999. P.13.

75. Goodfellow M., Kim S.B., Minnikin D.E., Whitehead D., Zhi-Hong Zhou, Deirdre Mattmson-Rose A. Amycolatopsis sachari sp. nov., a moderately thermophilic actinomycete isolated from vegetable matter // Int J Syst Evol Microbiol. 2001. V. 51. P. 186-153.

76. Goodfellow M., Quintana E. The family Streptosporangiaceae // The Prokaryotes. 2006. Springer New York. P.725-753.

77. Groth I., Schumann P., Rainey F.A., Martin K., Schuetze B., Augsten K. Bogoriella caseilytica gen.nov., sp. Nov., a new alkaliphilic actinomycete from a soda like in Africa. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V.47. P. 788-794.

78. Hamamura N., Yeager C.M., Arp D.J. Two distinct monooxygenasefor alkane oxidation in Nocardioides sp. Strain CF8 // Appl Environ Microbiol. 2001. V.67. P.4992-^4998.

79. Hayakawa M., Nonomura H. HV agar, a new selective medium for isolation of soil actinomycetes // Abstracts of papers presented at the annual meeting of the actinomycetologists. Osaka. Japan. 1984. P 6.

80. Janssen P.H., Identifyng the dominant soil bacteria taxa in libra^ries of 16S rRNA and 16S rRNA genes. // Appl. Environ. Microbiol., :2.006.V.72. P.1719-1728.

81. Jayani R.S., Saxena S. and Gupta R. Microbial pectinolyticz: enzymes: A review // Process Biochemistry. 2005.V.40. P.2931-2944.

82. Jiang C., Xu L. Actinomycete diversity in unusual habitats // Bioline Enternational. Actinomycetes. 1993.V.4(2). P. 47-57.

83. Jiang C.L., Xu L.H. Diversity of aquatic Actinomycetes in lakes of in Middle platen, Yunnan, China // Appl. Environ. Microbiol. V. 62. Yss. l.P. 249-253.

84. Jin X., Xu L.H., Mao P.H., Hseu T.H., Jiang C.L. Description of Saccharomonospora xijiangensis sp. nov. based on chemical and molecular classification// Intern J. Syst. Bacterid. 1998. V. 48. P. 1095-10S>S>.

85. Jonathan D, Van Hamme AS, Owen PW Recent advances irx petroleum microbiology //Microbiol Mol Biol Rev. 2003. V. 67. P.503-54S>

86. Karlsson M. and Stenlid J: Comparative Evolutionary Histories of Fungal Chitinases. // In Evolutionary Biology. Concept, Modeling and ^application. Ed. by Pierre Pontarotti. Springer Verlag. 2009. Part 3. Chap. 19. P. 323-337.

87. Kashyap D.R., Vohra P.K., Chopra S. and Tewari R. Application of pectinases in the commercial sector: a review // Bioresource Tecimol. 2001. V.77. P.215-237.

88. Kim B., Al-Nai A.M., Kim S.B., Somasundaram P., Goocifellow M. Streptomyces thermocoprophilus sp. nov., a cellulase-free encLo-xylanase-producing streptomycete // Int. J. Syst. Bact. 2000. V.50. P. 505-509.

89. Kim S.B., Falconer C., Williams E., Goodfellow M. Simptomyces thermocarboxydovorans sp. nov. and Streptomyces thermocarbojcydus sp.nov., two moderately thermophilic carboxydotrophic species from soil // Int. J. Syst. Bact. 1998. V.48. P. 59-68.

90. Kim B., Sahin N., Minnikin D.E., Zakzewska -Czerwinska J., Mordarski M., Goodfellow M. Classification of thermophilic streptomycetes, including the description of Streptomyces thermoalcalitolerans sp. nov.// Int. J. Syst. Bact. 1999: V.49. P. 7-17.

91. Kim S.B., Goodfellow M., Streptomyces thermospinisporus sp.nov., a moderately thermophilic carboxydotrophic streptomycete isolated from soil//Int. J. Syst. Evol. Microbilolgy. 2002. V. 52. P. 1225-1228.

92. Kleeberg J., Hetz C., Kroppenstedt R.M., Deckwer W.D., Biodégradation of aliphatic-aromatic copolyesters by Thermomonospora fusca and other thermophylic compost isolates // Appl. Environ Microbiol. 1998. V. 64. № 5. P. 1731-1735.

93. Kok M, Oldenhuis R The Pseudomonas oleovorans alkane hydroxylase gene // J Biol Chem. 1989. V. 264. P.5435-5441.

94. Kotimaa M.H., Terho E.O., Husman K Airborne moulds and actinomycetes in work environment of farmers // Eur J Respir Dis Suppl. 1987. № 152. P. 91-100.

95. Kotimaa M.H., Oksanen L., Koskela P. Feeding and beeding materials as sources of microbial» exposure on diary farms // Scand J Work Environ Health. 1991. V. 17. №2. P. 117-122.

96. Kulkarni N., Shendye A., Rao M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases//FEMS Microbiology Reviews. 1999. V.23. № 4. P. 411-456.

97. Kumar B., Trivedi P., Kumar Mishra A., Pandey A., Lok Man S. Microbial diversity of soil from two hit springs in Uttaranchal Himalaya // Microbiological Research. 2004. V.159. № 2. P. 141-146.

98. Kurtboke D.I, Hayakawa M., Terekhova L., Okazaki T. Selective isolation of rare actinimycetes // Ed. Ipek Kurtboke. Quinsland, Australia: Univ. Sunshine Coast. 2003. P. 128.

99. Lang C., Dornenburg H. Perspectives in the biological function and the technological application of polygalacturonases (Minireview) // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. V.53. P. 366-375.

100. Lazzarini A., Cavaletti L., Toppo G., Marinelli F. Rare genera of actinomycetes as potential producers of new antibiotics // Antonie van Leeuwenhoek. 2000. Y.78. P. 399^05.

101. Loginova L.G., Iakovleva M.B., UsaTte I.A. Variability of the proteolyc activity in the thermotolerant actinomycete, Thermoactinomyces vulgaris II Mikrobiologia. 1978. V. 47. № 4. P. 653-658.

102. Li D.-C. Review of Fungal Chitinases //Mycopathologia. 2006. V. 161 (6). P. 345-360.

103. Maidak B.L., Olsen G.J., Larsen N., Overbeek R., McCaughey M.J., Woese R. The Ribosomal Database Project (RDP) // Nucleic Acids Research. 1996. V. 24. № 1. P.82-85.

104. Mediavilla J., Jain S., Kriakov J., Ford M.E., Duda R.L., Jacobs W.R., Hendrix R.W., Hatfull G.F. Genome organization and characterization of mycobacteriophage Bxbl //Mol. Microbiol. 2000.V.38. P. 955-970.

105. Mikami Y., Miyashita K., Arai T. Diaminophimelic acid profiles of alkalophilic and alkaline -resistant actinomycetes // J.Gen. Microbiol. 1982. V.128.P. 487-493

106. Moyer C.L., Morita R.Y. Psychrophiles and psychrotrophs // Encyclopedia of life sciences. 2007. John Wiley & Sons. Ltd. www.els.net.

107. Mukherji S, Jagadevan S, Mohapatra G, Vijay A Biodegradationof diesel oil by an Arabian Sea sediment culture isolated from the vicinity of an oil field // Bioresource Technol. 2004. Y.95. P.281-286.

108. Nagy. M. L., Pe'rez A., Garcia-Pichel F.The prokaryotic diversityof biological soil crusts in the Sonoran Desert (Organ Pipe Cactus NationalMonument, AZ) // FEMS Microbiol. Ecol. 2005.V. 54. P.233-245.

109. Nawani N.N., Kapadnis B.P., Das A. D., Rao A.S. and Mahajan S.K. Purification and characterization of a thermophilic and acidophilic chitinase from Microbispora sp. v2 // J. Appl. Microbiol. 2002. V.93 (6). P. 965-975.

110. Niemi R.M., Knuth S., Lundstrom K. Actinomycetes and fungi in surface waters and in potable water // Appl. Environ Microbiol. 1982. V. 42. № 2. P. 378-388.

111. Ocshima T., Takada H., Yoshima T., Esaki N., Soda K. Destribution, purification and characterization of thermophilic actinomycetes // J. Bacteriol. 1991. V.173. № 3. P. 3943-3948.

112. Okoro C., Brown R., Jones A., Andrews B., Asenjo J., Goodfellow M., Bull A. Diversity of culturable actinomycetes in hyper-arid soils of the Atacama Desert, Chile // Antonie van Leeuwenhoek , 2009, V.95. P. 121-133.

113. Radwan SS, Baraba's GY, Sorkhoh NA, Damjanovich S, Szabo' I, Szo"llo"si J, Matko' J, Penyige A, Hirano T, Szabo' IM (1998) Hydrocarbon uptake by Streptomyces. FEMS Microbiol Lett 169:87-94

114. Radhakrishnan M., Suganya S., Balagurunathan R., Kumar V. Preliminary screening for antibacterial and antimycobacterial activity of actinomycetes from less explored ecosystems // World J Microbiol Biotechnol (2010) 26:561-566.

115. Pandey KK, Mayilray S, Chakrabarti T (2002) Pseudomonas indica sp. Nov., a novel butane utilizing species. Int J Syst Evol Microbiol 52:15591567

116. Reboux G., Pirroux R., Mauny F., Madroszyk A., Millon L., Bardonnet K., Dalphin J-C. Role of molds in farmer's lung disease in Eastern France // Am J Respir Crit Care Med. 2001. V. 163. № 7. P. 1534 1539.

117. Reiman M, Utti J. Exposure to microbes, endotoxins and total dust in cigarette and cigar manufacturing: an evaluation of health hazards // Ann Occup Hyg. 2000. № 44 (6). P. 467-473.

118. Rintala H. Streptomycetes in indoor inviroments PCR based detection anddiversity, Academic Dissertation, 2003. p

119. Russell N.J. Molecular Adaptations in Psychrophilic Bacteria: Potential for Biotechnological Applications // Advances in Biochemical Engineering. 1998. Biotechnology, V. 61. P. 1-21.

120. Saadoun I, AL-Momani F Studies on soil streptomycetes from ordan // Actinomycetes. 1997. V. 8. P.42-48.

121. Saadoun I., AL-Momani F., Malkawi H.,Mohammad MJ. Isolation, intification and analysis of antibacterial activity of soil streptomycetes solated from north Jordan // Microbios. 1999. V. 100. P.41-46.

122. Ganesh D. Saratale , Sang Eun Oh Production of thermotolerant and alkalotolerant cellulolytic enzymes by isolated Nocardiopsis sp. KNU. Biodégradation. 2011.V.22, № 5, P. 905-919.

123. Saul D., Aislabie J., Brown C., Harris L., Foght J. Hydrocarbon contamination changes the bacterial diversity of soil from around Scott Base, Antarctica // FEMS Microbiology Ecology. 2005. V.53. P. 141-155.

124. Schrempf H. Recognition and degradation of chitin by streptomycetes // Antonie van Leeuwenhoek. 2001.V. 79. P. 285-289:

125. Sette L., Simioni K., Vasconcellos S., Dussan L., Neto E., Oliveira V. Analysis of the composition of bacterial communities in oil reservoirs from a southern offshore Brazilian basin // Antonie van Leeuwenhoek. 2007. V.91. P.253-266.

126. Shu -Hsien Tsai, Ching Piao Liu, Shang - Shyng Yang Microbial conversion of food wastes for biofertilizer with thermophilic lipolytic microbes // Renewable Energy. 2007. V. 32. № 6. P. 904-915.

127. Sluis MK, Sayaverda Soto LA, Arp DJ Molecular analysis of the soluble butane monooxygenase from Pseudomonas butanovora II Microbiol. 2002. V.148. P.3617-3629.

128. Smits T.H.M., Balada S.B., Witholt B., van Beilen J.B. Functional analysis of alkane hydroxylases from Gram negative and Gram positive bacteria // J Bacteriol. 2002. V. 184. P. 1733-1742.

129. Stackebrandt E., Rainey F.A., Ward Rainey N.L. Proposal for a new hieraric classification system, Actinobacteria classic nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. V. 47. № 2. P. 479-491.

130. The Procariotes. A handbook on the biology of bacteria. Ecophysiology, isolation, identification, applications / Eds. A Balows, H.G. Truper, M. Dworkin et al. Springerverlag. N.Y., Berlin ets. 1991. P. 921 -1157.

131. The Prokaryotes. Archaea, Bacteria: Firmicutes, Actinomycetes. Springer New York. 2006. V.3. P.297-321.

132. Tseng M., Yang, S.-F., Hoang K.-C., Liao H.-C., Yuan G.-F., Liao C.-C. Actinomadura miaoliensis sp. nov., a thermotolerant polyester-degradingactinomycete // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology . 2009. V. 59. P. 517-520.

133. Tsujibo H., Minoura K., Miyamoto K., Endo H., Moriwaki M. & Inamori Y. Purification and properties of a thermostable chitinase from Streptomyces thermoviolaceus OPC-520 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V.59. P. 620-622.

134. Wang L., Ruan J.S. Classifiaction of actinomycetes isolated from saline-alkaline soils // ISBA 94.1nt. Symp. Biol. Actinomycetes. Moscow. 1994. P. 238.

135. Watkinson R.J., Morgan P. Physiology of aliphatic hydrocarbon-degrading microorganisms //Biodégradation. 1990. V. l.P. 79-92.

136. Williams S.T., Davies F.L., Mayfield C.I., Khan M.R. Studies on the ecology of actinomycetes in soil. The pH-eqirenments of streptomycetes from two acid soils // Soil Biol. Biochem. 1971. V. 3.P. 186-199

137. Webb M.D., Ewbank G., Perkins J., McCarthy A.J. Metabolism of pentachlorphenol by Saccharomonospora virodis strains isolated from mushroom compost // Soil Biology and biochemistry. 2001. V. 33. № 14. P. 1903-1914.

138. Xiao Y., Bozd J., Grosse S., Beauchemin M., Coupe E., Lau P. Mining Xantomonas and Streptomyces genomes for new pectinase-encoding sequences and their heterologous expression in Escherichia coli II Appl. Microbiol. Biothechnol. 2008. V.78. P.973-981.

139. Xu L., Li Q., Jiang C. Diversity of soil actinomycetes in Yunnan, China // Appl. Environ. Microbiol. 1996.V. 62. № 1. P. 244-248.

140. Yallop C., Edwards C., Williams S.T. Isolation and growth physiology of novel thermoactinomycetes // J. Appl. Microbiol. 1997. V.83. № 6.• P.685-692.

Информация о работе

Курапова, Анна Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Термотолерантные актиномицеты в пустынных, вулканических и горной почвах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы