Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влажность как экологический фактор формирования почвенного гидролитического микробного комплекса

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влажность как экологический фактор формирования почвенного гидролитического микробного комплекса"

004610773

На правах рукописи

Ярославцев Алексей Михайлович

Влажность как экологический фактор формирования почвенного гидролитического микробного комплекса

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 1 ОКТ 2010

Москва —2010

004610778

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

Доктор биологических наук,

Ведущая организация: Российский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится 5 октября 2010 г. в 15 ч. 30 мин. в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета Д 501.002.13 при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, факультет почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан ...03...сентября...2010 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета. Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах просим направлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, МГУ имени М.В.Ломоносова, факультет почвоведения, Учёный совет.

Профессор

Степанов А.Л.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Кандидат биологических наук

Терехова Л.П. Кизилова А.К.

—МСХА имени К.А. Тимирязева

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор ^¿Л//^ Г.М. Зенова

Актуальность темы. Поступающие в почву полисахариды относительно быстро утилизируются микроорганизмами и активно участвуют в почвенно-химических реакциях. Они образуют комплексные соединения с ионами металлов, вступают в химические или адсорбционные взаимодействия с глинистыми минералами, способствуя созданию почвенной структуры. Такие полисахариды, как хитин и пектин входят в состав матрикса клеточных стенок как эукариотических, так и прокариотических организмов и постоянно присутствуют в почве (De Boer W., 2004). Содержание полисахаридов в почве, в зависимости от метода экстракции и типа почвы, колеблется в пределах от 0,06% до 3,0% от массы почвы и от 1% до 14% от массы органического вещества почвы. Из литературы известно, что в почвы с растительными остатками ежегодно поступает от 2 до 14 т/га углеводов, значительная часть которых минерализуется или участвует, как структурные элементы, в формировании гуминовых кислот (Gomez Ramirez, 2004).

С ростом использования биополимеров в промышленности, сельском хозяйстве и медицине становится важным вопрос не только о синтезе, но и о деструкции больших количеств этих соединений. Поэтому представляется актуальным вопрос об активности и субстратной специфичности внеклеточных ферментов в природных системах, и, таким образом, об их участии в микробной реминерализации органического углерода.

Исследование деструкции полимеров в почве обычно проводилось при усредненных значениях влажности и зачастую не отражало объективной картины происходящего в связи с активной динамикой влажности в почвах. В связи с этим эксперимент предлагается провести на широком диапазоне влажности вплоть до переувлажнения почвы и создания анаэробных условий.

Целью диссертационной работы являлось исследование структурных и функциональных особенностей комплекса микроорганизмов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в почвах Европейской части России при широком диапазоне влажностей.

Задачи исследования.

1. Сравнительное исследование динамики эмиссии диоксида углерода из образцов почв с субстратом (хитином или пектином) и без него.

2. Изучение динамики численности и биомассы эукариотных и прокариотных микроорганизмов, развивающихся в исследуемых микрокосмах в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением полисахаридов.

3. Сравнительное определение активности разложения хитина и пектина в условиях различных влажностей исследуемых почв.

4. Оценка филогенетического разнообразия и численности отдельных групп доменов Bacteria и Archea в гидролитическом (пектинолитическом и хитинолитическом) прокариотном комплексе микрокосмов.

Научная новизна. Установлено, что влажность имеет более значимое влияние на деятельность хитинолитического микробного комплекса по сравнению с пектинолитическим. При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно акганомицетов. Впервые с использованием метода FISH оценена численность и выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов серой лесной, глее-слабоподзолистой почв и чернозема в зависимости от влажности. При оптимальной влажности в хитинолитическом и пектинолитическом прокариотном микробном комплексе преобладали филогенетические группы Actinobacteria и Firmicutes. С увеличением влажности отмечается возрастание доли протеобактерий. С иссушением почвы до влажности, близкой к влаге завядания, в гидролитическом комплексе возрастает роль гамма, альфа-протеобактерий и актинобактерий.

Практическая значимость. Дана количественная оценка скорости деструкции полисахаридов (пектина и хитина) в разных типах почв при различных уровнях увлажнения. Выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов серой лесной, глее-слабоподзолистой почв и чернозема в зависимости от влажности. Полученные данные могут быть использованы в биотехнологии для подбора оптимальных условий при поиске и

выделении активных организмов хитино- и пектинолигиков, а также создании биопрепаратов при борьбе с фитопатогенами.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007 и заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 статей, б тезисов докладов.

Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста, содержат 39 рисунков, 7 таблиц. Список литературы включает 120 источников, из них 81 зарубежный.

Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям д.б.н., профессору A.JI. Степанову и к.б.н. Н.А. Манучаровой. Особую благодарность выражаю д.б.н. И.И. Судницыну и д.б.н. П.А. Кожевину за практические советы и помощь в работе. Хочу искренне поблагодарить д.б.н. Г.М. Зенову и к.б.н. J1.B. Лысак за ценные консультации и сотрудничество, а также всех сотрудников кафедры биологии почв.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты и методы исследования

Объектами исследования явились образцы гумусовых горизонтов основных типов почв Европейской части России: чернозема обыкновенного, серой лесной и глее-слабоподзолистой почв. Характеристика исследуемых почв представлена в таблице 1.

Таблица \ . Характеристика исследуемых почв

Почва Место взятия образцов Горизонт, глубина, см рН водный с„рг%

Чернозем обыкновенный среднемощный среднесуглинистый на карбонатном лессовидном суглинке Воронежская область А, 2-10 6,8 3,1

Серая лесная поверхностно глееватая на покровных суглинках Тульская область А, 2-10 5,1 2,1

Глее-слабоподзолистая Ямало-Ненецкий автономный округ А<1 2-10 4,1 0,8

Поскольку доступность воды живым существам в большей степени зависит от ее давления (то есть ее термодинамического состояния или активности), чем от содержания влаги (влажности почвы), то ясно, что попытки искать зависимость активности микроорганизмов и ферментативных комплексов только от влажности в принципе не могут дать репрезентативных результатов. Поэтому в данной работе определяли зависимость биологической активности не только от влажности почв, но и от давления влаги.

Для всех исследуемых почв методом центрифугирования была определена основная гидрофизическая характеристика, то есть зависимость влажности почв (Щ

от матричного давления почвенной влаги (Р) в диапазоне Р от 0 до -808 кПа (таблица 2).

Таблица 2. Влажность исследуемых почв (% от массы абсолютно сухой почвы) при различном матричном давлении почвенной влаги (Р, кПа)

Влажность почвы, % Р, кПа

0 -1,16 -8,34 -18,4 -32,6 -443 -291 -475 -808

Глее- слабоподзолистая 25,64 15,42 12,12 6,97 6,52 6,35 5,40 4,25 3,17

Серая лесная 44,72 40,48 32,11 30,00 29,03 28,93 19,15 14,26 12,25

Чернозем 63,76 62,18 36,56 36,25 36,09 - - 34,66 32,37

В диапазоне Р от -8,34 до -808 кПа для всех трех почв между значениями Р и W существуют линейные зависимости:

\g\P\=A-B-W,

где А и В - коэффициенты, величина которых зависит от свойств почв (в первую очередь - от содержания в них илистой гранулометрической фракции и, следовательно, от их удельной поверхности). Ранее такие зависимости для этих почв были обнаружены и теоретически выведены И.И. Судницыным (1966).

Влажность различных почв (при равных значениях Р) варьирует в очень широких пределах. Так, при Р = -808 кПа (что соответствует W, близкой к влажности завядания растений) W птее-слабоподзолистой почвы равна всего лишь 3.2%, серой лесной - 12.2%, а чернозема - 32,4% (таблица 2). Величина этой влажности приблизительно прямо пропорциональна содержанию в почвах илистой гранулометрической фракции и, следовательно, удельной поверхности твердой фазы почвы.

В суглинистых, серой лесной почве и черноземе при Р = -32,6 кПа (а в песчаной птее-слабоподзолистой почве при Р = -18,4 кПа) W близка к полевой (наименьшей) влагоемкости и равна, соответственно, 29,0 и 36.1% - в суглинистых и 6,5% - в песчаной почве (таблица 2).

При Р = 0 все поры почв полностью заполнены водой, и достигается полная влагоемкость, или водовместимость. При этой влажности в почве почти отсутствует кислород, и поэтому развиваются анаэробные микробиологические процессы, и, следовательно, снижается значение окислительно-восстановительного потенциала.

Изучение активности эмиссии диоксида углерода и метана из почв при внесении полисахаридов и без них оценивали газохроматографичеким методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

Определение численности бактерий, длины мицелия актиномицетов и грибов проводили с помощью люминесцентно-микроскопического метода. Препараты для подсчета бактерий и мицелия актиномицетов окрашивали акридиновым оранжевым, для учета мицелия грибов - калькофлуором белым. Количество микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы, вычисляли по формуле: N=Sian/vS2C, где N - число клеток (длина мицелия, мкм) на 1 г почвы; Si - площадь препарата (мкм2); а — количество клеток (длина мицелия, мкм) в одном поле зрения (усреднение производилось по всем препаратам); п — показатель разведения почвенной суспензии (мл); v — объем капли, наносимой на стекло (мл); S2 — площадь полей зрения микроскопа (мкм2); с - навеска почвы (г).

Удельную массу микроорганизмов принимали равной 1 г/см3, а содержание воды в клетках - 80%. Показатели сухой биомассы для одной бактериальной клетки объемом 0,1 мкм3 - 2-Ю"'4 г, для 1 м мицелия актиномицетов диаметром 0,5 мкм — 3,9-10"8 г. Показатели сухой биомассы 1 м грибного мицелия с условным диаметром 5 мкм — 3,9-10"4 г. С учетом замеренного диаметра мицелия грибов биомассу вычисляли по формуле - 0,628r2-10"6 г. (Полянская, 1996).

С использованием метода молекулярной диагностики микроорганизмов in situ (метод FISH) (Amann, 2000) выявляли специфику бактериального, метаболически активного сообщества, разрушающего полисахариды. В настоящей работе был применен спектр зондов, специфичных для представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп Bacteria, что позволило осуществить анализ бактериального сообщества рассматриваемых почв. Использование метода FISH позволило учесть живые метаболически активные клетки в почвенных образцах с хитином и без него. Окраска препаратов красителем

акридиновым оранжевым дала возможность оценить общую численность клеток микроорганизмов в образцах, включая покоящиеся формы.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ STATISTICAL и Statgraphics Plus.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Динамика эмиссии диоксида углерода из почв с внесением полисахаридов при различном давлении почвенной влаги

Изучение влияния влажности почвы при внесении полисахаридов на эмиссию диоксида углерода показало, что изменение влажности наибольшим образом влияет на динамику и интенсивность эмиссии при внесении хитина по сравнению с остальными исследованными субстратами (пектином, глюкозой и целлюлозой). Масса вносимых субстратов во всех образцах содержала равное количество моль углерода. С возрастанием давления почвенной влаги с -800 кПа до -0,5 кПа интенсивность эмиссии С02 при внесении хитина увеличивалась в два раза от 9 до 18 мкг С-С02/г почвы за час, что не отмечается для других исследуемых субстратов (рис. 1). Аналогичные зависимости наблюдались для образцов всех исследуемых почв. 22 20 18

-800 -3,2 -0,5

Давление почвенной влаги, кПА

- - хитин •О* пектин -у- целлюлолза глюкоза контроль

Рис. 1. Зависимость эмиссии диоксида углерода при разложении полисахаридов, внесенных в чернозём от давления почвенной влаги

Динамика эмиссии метана из почв с внесением полисахаридов в микроаэробных условиях

В связи с тем, что хитин присутствует в почве как в аэробных, так и в анаэробных микрозонах, на следующем этапе работы была рассмотрена трансформация хитина в микроаэробных условиях. В качестве показателя интенсивности трансформации хитина была выбрана эмиссия метана из образцов с хитином и без него.

При влажности, близкой к полной влагоемкости, интенсивная эмиссия метана наблюдалась из всех исследуемых образцов почв, что свидетельствует о наличии строго анаэробных микрозон. Разница между вариантами с хитином и контролем была заметна уже на начальных этапах инкубации, что указывает на использование хитина уже в первые сутки опыта.

серая лесная чернозем

1 5 7 8 12 28 31 33

_ суТ □ хитин

глее-слабоподзолистая

ИВ КОНТРОЛЬ

14 23 27 сутки

каштановая

Рис. 2. Динамика эмиссии метана из почв в ходе сукцессии, инициированной увлажнением до влажности большей ПВ и внесением хитина в микроаэробных условиях

Важно отметить, что наибольшая эмиссия метана и соотношение между вариантами были зафиксирована между 20-30-ми сутками опыта, что связано с развитием метаногенов на продуктах метаболизма хитинолитиков (рис. 2).

Методом центрифугирования с параллельным измерением эмиссии метана из образцов, были установлены уровни эмиссии метана при различных влажностях, для всех исследуемых почв.

Следует отметить, что эмиссия метана из почв наблюдалась при всех исследуемых уровнях влажности, начиная с полной влагоемкости и заканчивая приблизительно максимальной молекулярной влагоемкостью. Было обнаружено, что анаэробная трансформации хитина протекала в почвах при различных уровнях влажности и матричного потенциала. Так, в глее-слабоподзолистой песчаной почве наиболее активная работа анаэробов хитинолитиков проходила в достаточно узком интервале влажности от 15% от массы почвы (матричный потенциал -1,16 кПа) до 25% от массы почвы (полевая влагоемкость, 0 кПа), а для чернозема этот интервал значений увеличивался от 36% от массы почвы (матричный потенциал -32,6 кПа) до 64% от массы почвы (полевая влагоёмкосгь).

8

-А-

100 10 радиус пор занятых водой

—♦—Чернозем Серая лесная

-Глее-слабоподзолиетая -Каштановая

Рис.3. Отношение эмиссии метана из образцов с хитином к эмиссии из контрольного образца (КТХ) в зависимости от радиуса пор занятых водой.

Существует зависимость между интенсивностью трансформации хитина в анаэробных условиях и радиусом пор, занятых водой. Результаты наших исследований показали, что при радиусе пор (занятых водой) менее 6 мкм, работа анаэробного

хитинолитического микробного комплекса минимальна (рис. 3). Это говорит о затрудненном развитии микроорганизмов-анаэробов вследствие малого порового пространства. Таким образом, верхний предел изучаемого процесса определялся полной влагоемкостью почв, а нижний - размером анаэробных зон, при котором еще возможно развитие микроорганизмов.

В почвах с большим содержанием илистых фракций (серая лесная, ЭПЧ < 1мкм — 28%) коэффициент трансформации хитина возрастал в области больших значений влажности, а для песчаных почв — в области меньших (глее-слабоподзолистая ЭПЧ < 1мкм — 5%).

Динамика биомассы хитинолитического и пектинолитического микробного комплекса почв

-800 кПа

-3,2кПа

-0,5 кПа

■ и

■ хитин 8 пектин □ контроль

Рис. 4. Сравнительная динамика биомассы акгиномицет (а), бактерий (б) и грибов (в) в чернозёме при разном давлении почвенной влаги

При рассмотрении численности и биомассы исследуемого комплекса микроорганизмов было отмечено возрастание всех групп микроорганизмов в вариантах с полисахаридами по сравнению с контролем (рис. 4). В хигинолитическом комплексе при давлении почвенной влаги -3,2 кПа особенно сильно относительно контроля возрастает биомасса акганомицетов (в 5-6 раз для серой лесной почвы) (рис. 5). Биомасса бактерий и грибов увеличивается в 1,5-2 раза.

•800 «Па -200 кЛа

-ЕООкПа -200 кПа -3,2 «Па -0,5 «Ла

а) б)

Рис. 5. Максимальные значения в течение эксперимента отношения биомасс в образце с хитином и контроле основных групп микроорганизмов при различных уровнях увлажнения в чернозёме (а) и серой лесной почве (б)

Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почвах

Анализ основной информации о динамике структурных (биомасса грибов, бактерий и акганомицетов) и функционального (эмиссия диоксида углерода) показателей проведен с помощью методов многомерной математической статистики. На дендрограмме кластерного анализа (вертикальная ось отражает относительное сходство) можно выделить два кластера (рис.6). В первом кластере представлено 20, а во втором 7 объектов. По координатам центроидов можно судить о том, какие переменные играют наиболее важную роль в каждом кластере. По показателям обилия актиномицетов и дыхания указанные кластеры практически не различаются. Вместе с тем, для первого кластера характерны относительно низкие значения показателей обилия грибов и бактерий (0,64 и 0,13 соответственно). Для объектов из второго кластера эти показатели существенно выше (2,89 и 0,96 соответственно). Существенно, что все объекты второго кластера представлены образцами, которые

инкубировались при давлении почвенной влаги -3,2 кПа. Можно предположить, что в этом случае создаются более благоприятные условия для развития учитываемых грибов и бактерий.

Таким образом, кластерный анализ показал, что в первом приближении уровень влажности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного сообщества факторами как внесение ресурсов и время.

С помощью дискриминантного анализа проверена возможность определения показателя влажности почв по используемым структурно-функциональным показателям микробного сообщества. Точность диагностики образцов с давлением почвенной влаги -800 кПа составляет 89%. Для образцов с давлением -3,2 и 0,5 кПа показатели точности диагностики равны 78 и 67% соответственно.

Дискриминантные функции для натуральных значений структурно-функциональных признаков имеют следующий вид:

120 100 80 60 40 20 0

Рис.6. Дендрограмма кластерного анализа (объекты обозначены следующим образом: а, Ь и с -давление почвенной влаги -800, -3,2 и -0,5 кПа соответственно; Ь, р и к - внесение хитина, пектина и контроль соответственно; цифры отражают сукцессионные этапы, сутки)

сосгхэсосоюсю1гхосхоцжхэ1осоосооэюо^жхосо ^¿т-сооосо-сч-сосот-^со ог-г-оот- осас^т-о-.ст- о. ГПУ у С-г- гог-^ о^: га поог- о "ППУГГП од га го га о со-о га о о о пш о о опп .о

3,9

О -800 кПа

2,9 X -3,2 кЛа

О -0,5 кПа

Р2 1.9 * центроида

0,9 -0,1 -1,1

-2,3 -0,3 1,7 3,7 5,7 7,7

Рис. 7. Расположение образцов на плоскости двух дискримннантных функций Б1 и Б2

И= -1,41 -9,73* (актиномицеты)+5,71*(бактерии)-0,07*(грвбы)-0,03*(дыхание), И2= -1,49 +17,54* (актиномицеты)+1,71*(бактерии)-0,49*(грибы)+0,12*(дыхание).

На диаграмме рассеивания на плоскости двух дискримннантных функций видно, что объекты с разными значениями потенциала влажности образуют достаточно обособленные группировки (рис.7).

Большой интерес представляет поиск связей между функциональными и структурными показателями природных микробных сообществ. Пошаговый многофакторный регрессионный анализ данных, полученных в разнообразных микробных сукцессиях (с внесением хитина и пектина и без внесения полимеров) в широком диапазоне давления почвенной влаги, позволил выявить и описать такую связь с помощью регрессионной модели:

(Эмиссия, мкг С-С02/г- ч) = 399,03* (актиномицеты, мг/г) + 2,37*(грибы, мг/г).

Дисперсионный анализ свидетельствует о высоких качествах модели (р<0,01, уровень 99%). В целом модель имеет достаточную информационную способность при коэффициенте детерминации 69%. Вполне ожидаемой оказалась его связь дыхания с грибной биомассой, но весьма неожиданным является определяющее влияние на

функциональный показатель актиномицетов, степень влияния которых на дыхание по данным дисперсионного анализа составляет 87% .

Таким образом, налицо существенная роль минорного по биомассе компонента в функционировании почвенного микробного сообщества. Дыхание, как ключевой функциональный показатель природных микробных сообществ, может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых, по всей видимости, определяется не столько их прямым вкладом в стехиометрию процессов разложения органического вещества, сколько вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества, включая механизмы на основе характерной для актиномицетов продукции биологически активных веществ. Существенно, что этот результат получен в условиях, которые имитируют широкий спектр ситуаций (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время), которые могут создаваться in situ.

Исследование прокариотного гидролитического сообщества почв с помощью флуоресцентной гибридизации in situ

На заключительном этапе работы была проведена оценка доли гидролитической биомассы метаболически активных клеток прокариот от биомассы прокариот, выделяемых с помощью окрашивания акридиновым оранжевым. Использовали метод in situ гибридизации с рРНК-специфичными флуоресцентно-меченными олигонуклеотидными зондами (FISH).

В работе был применен спектр зондов, специфичных для представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп домена Bacteria

В целом, суммарная доля метаболически активных клеток, обнаруженных гибридизацией с универсальными зондами на представителей доменов Bacteria и Archaea, составила в образцах исследуемых почв от 38% для чернозема до 78% для глее-слабоподзолистой от общего числа клеток, выделенных окрашиванием акридиновым оранжевым. Причем ни субстрат, ни влажность не влияли на долю метаболически активных клеток от всего комплекса. Использование метода FISH позволило выявить особенности филогенетической структуры пекгинолитического и хитинолитического метаболически активного комплекса в почвенных образцах с различным увлажнением.

Пектин. -800 «Па -

Хитии, -800 кПа -

Контроль, -800кПа -

Хитин, -0,5 кПа —.

Контроль, -0,5 кПа -

Пектин, -0,5 кПа -

Пектин, -3,2 кПа -

Контроль, -3,2 к Па . .......................... ...........

Хитин, -3.2 кПа . .....

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

%

Рис.8. Дендрограмма кластерного анализа общей биомассы всех исследуемых филогенетических групп в чернозёме при внесении полисахаридов и различных значениях давления почвенной влаги

Применение методов математической статистики позволило выявить два кластера, разделяющих структуру гидролитического микробного сообщества чернозёма в экстремальных условиях влажности (-800 кПа, -0,5 кПа) от средней (-3,2 кПа) (рис. 8).

Внутри домена Bacteria при среднем давлении почвенной влаги (-3,2 кПа) среди пектинолитических и хитинолитических доминантов исследуемых почв выделяются представители филогенетических групп Firmicutes и Actinobacteria (рис. 9).

С увеличением влажности отмечается возрастание грамотрицательных форм (протеобактерий). В литературе имеются сведения, указывающие на преобладание в бактериальном пектинолитическом комплексе сфагновых болот филогенетических групп Proteobacteria и Bacteroideíes (Панкратов и др., 2005). Авторы объясняют такую особенность климатическими условиями, преобладающими в почвах исследуемой территории — пониженные температуры и реакция рН, повышенная влажность и дефицит органического вещества.

С понижением матричного давления до влажности, близкой к влаге завядания, в гидролитическом комплексе отмечается роль гамма- и альфапротеобактерий и мицелиальных акгинобакгерий.

вертикальные линии отмечают 95Х доверительный интервал

Рис. 9. Усредненные по всем исследуемым почвам значения численности отдельных филогенетических групп домена Bacteria пектино-и хитинолитического микробного комплекса почв при различных значениях матричного давления почвенной влаги на 14 сутки

инкубации

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что, уровень влажности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного сообщества факторами как внесение ресурсов и время. Влажность имеет более значимое влияние на деятельность хитинолитического комплекса по сравнению с пекгинолшическим.

2. Дыхание на широком спектре условий (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться акгиномицетами, роль которых, по всей видимости, определяется вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества. При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно акганомицет.

3. Впервые с использованием метода FISH оценена численность физиологически активного гидролитического прокариотного комплекса в черноземе, серой лесной и глее-слабоподзолистой почвах при различных уровнях влажности. Численность метаболически активных представителей отдельных филогенетических групп доменов Bacteria составила 10* клеток в грамме почвы. Доля метаболически активных от всех выделяемых клеток прокариот достигала 80% и определялась типом почвы.

4. Выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов всех исследуемых почв в зависимости от влажности. Отличительной чертой активного хитинолитического и пекгинолитического прокариотного микробного комплекса было преобладание групп Actinobacíeria и Firmicuíes в почвах с оптимальным значением влажности. С увеличением влажности отмечается возрастание доли протеобактерий. С понижением матричного давления до влажности, близкой к влаге завядания, в гидролитическом комплексе возрастает роль гамма-, альфапротеобактерий и акгинобакгерий.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Manucharova N.A., Yaroslavtsev A.M., Belova E.V., Sazonov S.N., Stepanov A.L. Microbial chitin transformation in soil. Phytopedon (Bratislava). Vol. 4. 2005. №1. P. 99-103.

2. Манучарова H.A., Ярославцев A.M., Сенченко Д.В., Степанов А.Л., Звягинцев Д.Г. Микробная трансформация хитина в почвах в анаэробных условиях. Известия РАН. Серия Биологическая. 2006. №2.С.239-243.

3. Воробьев А.В., Манучарова НА., Ярославцев А.М., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И. Состав хитинолитического микробного комплекса и его влияние на разложение хитина при различных уровнях влажности. Микробиология. 2007. №5. 7 стр.

4. Н. А. Манучарова, А. М. Ярославцев, А. Л Степанов, А.В. Смагин, Д. Г. Звягинцев, И.И. Судницын. Образование метана и рост микроорганизмов при различной влажности почв с внесением и без внесения хитина. Почвоведение. 2007. №8.8 стр.

5. А.М. Ярославцев, НА. Манучарова, A.JI Степанов, Д.Г. Звягинцев, И.И. Судницын Микробное разложение хитина в почвах при различных уровнях влажности. Почвоведение. 2009. №7. С. 857-866.

6. NA. Manucharova, A.M.Yaroslavtsev, AV.Vorob'ov, E.V.Belova Microbial chitin transformation in soil. Ecosystems of Mongolia and frontier areas of adjacent countries: Natural resources, biodiversity and ecological prospects. / 2005. P. 386-387.

7. Манучарова НА, Белова Э.В., Сенченко ДВ., Ярославцев А.М., Сазонов С.Н. Трансформация хитина микробным комплексом почв основных типов Европейской части России. "Проблемы сохранения, восстановление и обогащение биоразнообразия в условиях антропогенно измененной среды", Кривой Рог. 16-19 мая 2005. С. 460-461.

8. N.A. Manucharova, A.M.Yaroslavtsev, E.V.Belova, A.L. Stepanov Ecological role of microbial chitiniclastic complex in soil. 18th World Congress of Soil Science. 2006. 9-14 July, Philadelphia, USA

9. N.A. Manucharova, A.M.Yaroslavtsev, E.V.Belova, A.L. Stepanov Chitiniclastic microbial complex in soils. 10th International Conference on Chitin & Chitosan Montpellier (France) 6-9 of September 2006.

10. Ярославцев A.M. Микробная трансформация хитина в почвах при различном давлении почвенной влаги. «ХШ Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007», М. 2006. Изд-во Макс Пресс. С.110-111.

11. Ярославцев А.М. Экологическая характеристика активности хитинолитического микробного комплекса в почвах. «XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007», М. 2007. Изд-во Макс Пресс. С.90-91.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ярославцев, Алексей Михайлович

Содержание.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИ!1 ЕРАТУРЫ.

1.1 Отношение микроорганизмов к влажности субстратов.

1.1.1 Характеристика влажности субстратов.

1.1.2 Причины устойчивости микроорганизмов к низкой влажности среды.

1.2 Влияние свойств почвенной влаги на развитие микроорганизмов.

1.3 Гидролитические сообщества почв развивающиеся при внесении пектина или хитина.

1.3.1 Разложение хитина.

1.3.2. Разложение пектина.

1.4 Влияние физико-химических характеристик почв гидролитические сообщества.

1.5 Особенности анаэробного разложения хитина в почвах и связанного с ним метано генеза.

1.6. Роль рассматриваемых полисахаридов и их производных в природе.

1.6.1 Роль хитина и его производных в природных экосистемах.

1.6.2 Роль пектина и его производных в природных экосистемах.

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Методы обнаружения матричного давления почвенной влаги в исследуемых образцах.

2.2.2 Изучение эмиссии диоксида углерода из образцов исследуемых почв газовохроматографическим методом.!.

2.2.3 Определение численности разных групп микроорганизмов люминесцентномикроскопическим методом.

2.2.4 Определение структуры прокариотного хитинолитического и пектинолитического микробных комплексов в почвах методом Fluorescence in situ hybridization.

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнительное исследование динамики эмиссии диоксида углерода из образцов чернозема и серой лесной почвы с в несением полисахаридов в зависимости от давления почвенной влаги.

3.2 Разложение хитина в микроаэробных условиях.

3.2.1 Активность(трансформации хитина микробным комплексом почв в микроаэробных условиях при различных уровнях влажности.

3.2.2 Динамика эмиссии СН4 из образцов глее-слабоподзолистой, дерново-подзолистой, серой лесной, каштановой почвы и чернозёма в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением хитина.

3.3.2 Определение динамики численности и биомассы хитин разлагающих микроорганизмов при инкубации в микроаэробных условиях.

3.4 Анализ структурных и функциональных показателей при деструкции полисахаридов в почвах.

3.5 Исследование прокариотного гидролитического сообщества почв с помощью флуоресцентной гибридизации in situ.

3.6 Разделяюйщий градиентный гель электрофорез.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влажность как экологический фактор формирования почвенного гидролитического микробного комплекса"

Такие полисахариды как хитин и пектин входят в состав матрикса клеточных стенок как эукариотических, так и прокариотичесКих организмов и постоянно присутствуют в почве. Поступающие в почву полисахариды относительно быстро утилизируются микроорганизмами и активно участвуют в почвенно-химических реакциях. Они образуют комплексные соединения с ионами металлов, вступают в химические или адсорбционные взаимодействия с глинистыми минералами, способствуя созданию почвенной структуры. Содержание полисахаридов в почве, в зависимости от метода экстракции и типа почвы, колеблется в пределах от 0,06% до 3,0% от массы почвы и от 1% до 14% от массы органического вещества почв. Из литературы известно, что в почвы с растительными остатками ежегодно поступает от 2 до 14 т/га углеводов, значительная часть которых минерализуется или участвует, как структурные элементы, в формировании гуминовых кислот.

С ростом использования биополимеров в промышленности, сельском хозяйстве и медицине становится важным вопрос не только о синтезе, но и о деструкции больших количеств этих соединений. Поэтому представляется актуальным вопрос об активности и субстратной специфичности ' внеклеточных ферментов в природных системах, и таким образом об их участии в микробной реминерализации органического углерода.

Исследование деструкции полимеров в почве обычно проводились при усредненных значениях влажности и зачастую не отражали объективной картины происходящего в связи с активной динамикой влажности в почвах. В связи с этим эксперимент предлагается провести на широком диапазоне влажности вплоть до переувлажнения почвы и создания анаэробных условий.

Целью диссертационной работы было исследование структурных и функциональных особенностей комплекса микроорганизмов, осуществляющих деструкцию полисахаридов (хитина и пектина) в почвах Европейской части России при широком диапазоне влажностей.

В задачи исследования входит:

1) Сравнительное исследование динамики эмиссии диоксида углерода из образцов почв с хитином и пектином.

2) Изучение динамики численности и биомассы эукариотных и прокариотных микроорганизмов, развивающихся в исследуемых микрокосмах в ходе сукцессии, инициированной увлажнением и внесением

- полисахаридов.

3) Определение активности разложения хитина и пектина в условиях различных влажностей исследуемых почв.

4) Оценка филогенетического разнообразия и численности отдельных групп доменов Bacteria в природном и гидролитическом (пектинолитическом и хитинолитическом) прокариотном комплексе микрокосмов.

Научная новизна. Установлено, что, влажность имеет более значимое влияние на деятельность хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитическим. При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно - актиномицетов. Впервые с использованием метода FISH оценена численность' и выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов серой лесной, глее-слабоподзолистой почв и чернозема в зависимости от влажности. При оптимальной влажности в хитинолитическом и пектинолитическом прокариотном микробном комплексе ' преобладали представители филогенетических групп Actinobacteria и Fiipnicutes. С увеличением влажности отмечается возрастание ¡ • доли протеобактерий. С понижением влажности до влажности, близкой к I i ! влаги завядания, в гидролитическом комплексе возрастает роль гамма, альфа-протеобактерий и актинобактерий.

Практическая значимость. Дана количественная оценка скорости деструкции хитина в разных типах почв при различных уровнях увлажнения. Выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов серой лесной, глее-слабоподзолистой почв и чернозема в зависимости от влажности. Полученные данные могут быть использованы для подбора оптимальных условий при поиске и выделении активных организмов хитино- и пектинолитиков.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на ХЩ Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2007 и заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 статей, 6 тезисов докладов.

Объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы. Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста, содержат 39 рисунков, 7 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ярославцев, Алексей Михайлович

выводы

1. Установлено, что, уровень влажности почвы в заданном диапазоне для некоторых структурных показателей может оказаться более значимым фактором по сравнению с такими существенными для микробного сообщества факторами как внесение ресурсов и время. Влажность имеет более значимое влияние на деятельность хитинолитического комплекса по сравнению с пектинолитич'еским.

2. Дыхание на широком спектре условий (влажность, поступление органического вещества, сукцессионное время) может существенно контролироваться актиномицетами, роль которых, по всей видимости, определяется вкладом в регуляцию функционирования микробного сообщества. При деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе заметно возрастает роль прокариотных микроорганизмов, особенно i актиномицетов.

3. Впервые с использованием метода FISH оценена численность физиологически активного гидролитического прокариотного комплекса в черноземе, серой лесной и глее-слабоподзолистой почвах при различных уровнях влажности. Численность метаболически активных представителей отдельных филогенетических групп доменов Bacteria о составила 10 клеток в грамме почвы. Доля метаболически активных от всех выделяемых клеток прокариот достигала 80% и определялась типом почвы.

4. Выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов всех исследуемых почв в зависимости от влажности. Отличительной чертой активного хитинолитического и пектинолитического прокариотного микробного комплекса было преобладание групп АсИпоЬааепа и РштсШеБ в почвах с оптимальным значением влажности. С увеличением влажности отмечается возрастание доли протеобактерий. С понижением матричного давления до влажности, близкой к влаги завядания, в гидролитическом комплексе возрастает роль гамма, альфа-протеобактерий и актинобактерий. г

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С ростом использования биополимеров в промышленности, сельском хозяйстве и медицине становится важным вопрос не только о синтезе, но и о деструкции больших количеств этих соединений.

Поэтому представляется актуальным вопрос об активности и субстратной специфичности внеклеточных ферментов в природных системах, и таким образом об их участии в микробной реминерализации органического углерода. Выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов серой лесной, глее-слабоподзолистой почв и чернозема в зависимости от влажности. Полученные данные могут быть использованы для подбора оптимальных условий при поиске и выделении активных организмов хитино- и пектинолитиков. Исследование численности и биомассы микроорганизмов изучаемых почв показала возрастающую роль прокариотных микроорганизмов, особенно — актиномицетов при деструкции полисахаридов с увеличением влажности почвы в микробном комплексе. С использованием метода FISH выявлен филогенетический состав метаболически активного гидролитического комплекса гумусовых горизонтов серой лесной, глее-слабоподзолистой почв и чернозема в зависимости от влажности. Отличительной чертой активного хитинолитического и пектинолитического прокариотного микробного комплекса было преобладание группы актинобактерий и фирмикут в почвах с оптимальным значением влажности. С увеличением влажности отмечается возрастание доли про-теобактерий. С понижением матричного давления до влажности, близкой к влаги завядания, в гидролитическом комплексе возрастает роль гамма, альфа-протеобактерий и актинобактерий i I

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ярославцев, Алексей Михайлович, Москва

1. Балабуха B.C., Разбитная J1.M., Разумовский М.О. и. др. Проблема выведения из организма долгоживущих радиоактивных изотопов // М.: Госатомиздат, 1962 167с.

2. Березин П.Н., Гудима ИИ. Физическая деградация почвы: пара метры состояния // Почвоведение 1994 №11

3. Генджиев М.Г. Характеристика состава грибов-микромицетов пустынных областей Туркмении и развитие их при различной активности воды // Автореф. дисс. Канд. Биол. Наук. М.: МГУ, 1978.

4. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов

5. М.: Изд-во Эвалар, 2000. 512 с.i

6. Дорошенко Е.А., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г., Судницын И.И. Спорообразование и мицелиальный рост стрептомицетов при различных уровнях влажности // Микробиология Т. 74, № 6. 2005. С. 795-799

7. Звягинцев Д.Г.Развитие микроорганизмов в тонких капиллярах и пленках // Микробиология. 1970а.Т 39. Вып.1

8. Звягинцев Д.Г., Питрюк А.П. Развитие микроорганизмов в проточных и непроточных капиллярах разной толщины // Микробиология. 1973. Т 42. Вып.1.

9. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв // М.:МГУ, 2005

10. Зенова Г.М. Актиномицеты в наземных экосистемах. // Автореферат докт. дис.М.:МГУ,1998.

11. Качалай и др. Методические указания по использованию в лечебно-профилактических целях пектинов и пектин с о держащих продуктов // Киев: Урожай, 1990 №504989- 15 с.

12. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе // М.: МГУ, 1989. -175 с.

13. Кравченко И.К., Кизилова А.К., Быкова С.А., Менько Е.В., Гальченко В.Ф. Молекулярный анализ накопительных культур с высоким сродством к метану, выделенных из почв лесного биоценоза и агроценозов // Микробиология. 2009.I

14. Моисеева В.Г., Зайко Г.М. Влияние чистоты пектинового препарата на физико-химические и комплексообразующие свойства пектина // Пищевая технология, 1976 №3, стр.27-30.

15. Орлов, Бирюкова, Суханова Органическое вещество почв Российской Федерации // М. Наука, 1996

16. Панкратов Т. А., Белова С.Э., Дедыш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия прокариотных микроорганизмов в сфагновых болотах с использованием метода FISH,// Микробиология, 2005. Т. 74, №6, С. 831-837.

17. Панкратов Т.А. Бактериальные сообщества сфагновых болот и их участие в деструкции природных полимеров// Диссер.к.б.н. ИнМи РАН, М., 2007

18. Полянская JI.M. Микробная сукцессия в почве // Автореф. дис.докт. Биол. Наук. М.: МГУ, 1996. 96 с.

19. Смагин A.B., Садовникова Н.В., Мизури Маауиа Бен Али Определение основной гидрофизической характеристики почв методом центрифугирования // Почвоведение. 1998. №11. С. 1362-1370.

20. Смагин A.B., Садовникова Н.Б., Хайдапова Д.Д., Шевченко Е.М. Экологическая оценка биофизического состояния почв. Методическая разработка к курсу "Биогеофизика" // Москва. МГУ ф-т Почвоведения. 1999. 48 с.

21. Хенглейн Н.Ф. Пектины // Биохимические методы анализы растений. М.Ин.лит, 1960. с.280-323I

22. Шелухина Н.П., Ашубаева З.Д., Аймухамедова Г.Б. Пектиновые вещества их некоторые свойства и производные // Фрунзе:Илим, 1970. 73с.t

23. Aber N.J., Mellilo J. D. & J. M., Terrestrial Ecosystems // Saunders College Publishing, PA. 1991.

24. Amann R.I., Krunholz L., Stahl D.A. Fluorescent-oligonucleotide probing of * whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental studies in microbiology // Bacterid., 1990. V. 172. P. 762-770. '

25. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. 1995. V. 59. P. 143-169.

26. Amann R.I., Ludwig W. Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology //FEMS Microbiol. Reviews, 2000. V. 24. P. 555-56^.

27. Arotupin D. J., Akinyosoye F. A. and Onifade A. K. Purification and characterization of pectinmethylesterase from Aspergillus repens isolated from cultivated soil // African Journal of Biotechnology Vol. 7 (12), pp. 1991-1998, 17 June, 2008

28. Baker, G.C., and D.A. Cowan. 16S rDNA primers and the unbiased assessment of thermophile diversity // Biochem. Soc. Trans. 2004. 32:218-221.

29. Black Sharon A., Smit C J.B. The grading of low ester pectin for use in dessert gels // J.Food Sci., 1972. vol. 37,5 p.726-729

30. Bouvier, T., and P.A. del Giorgio. Factors influencing the detection of bacterial cells using fl uorescence in situ hybridization (FISH): A quantitative review of published reports // FEMS Microbiol. Ecol. 44:3-15.2003.i

31. Boyer J.N. Aerobic and Anaerobic Degradation and Mineralization of 14C-Chitin by Water Column and Sediment Inocula of the York River Estuary, Virginia // APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Jan. 1994, p. 174-179

32. Brock, T. D. M. T. Madigan. Biology of Microorganisms 5th edn //Prentice Hall Incorporation. 1988.

33. Casida L.E. Jr. Industrial Microbiology. Enzymes as Fermentation Products 4th edition // Wiley Eastern Limited New Delhi, 1991. pp. 390-401.

34. Chandler, D.P., J.K. Fredrickson, and FJ. Brockman. Effect of PCR template concentration on the composition and distribution of total community 16S rDNA clone libraries // Mol. Ecol. 6: 1997.475^18?. .

35. Conrad R., Bak F., Seitz H.B., Thebrath B., Mayer H.P., Schutz H. Hydrogen turnover by psychrotrophic homoacetogenic and mesophilic methanogenic bacteria in anoxic paddy soil and lake sediments //FEMS Microbiol. Ecol. 1989. V. 62. P. 285-294.

36. Culbreath AK, Rodriguez-Cabana R, Morgan-Jones G. Chi'tin and Paecilomyces lilacinus for control of Meloidogyne arenaria II Nematropica 16: 1986. p. 153-166.

37. Daims, H., K. Stoecker, and M. Wagner. Fluorescence in situ hybridization for the detection of prokaryotes. // In A.M.Osborn and C.J. Smith (ed.) 2005. p. 213-239

38. De Boer W, Klein Gunnewiek PJA, Lafeber P, Janse JD, Spit BE, Woldendorp JW Antifungal properties of chitinolytic dune soil bacteria // Soil Biol Biochem 30 :p. 193-203. 1998 •

39. Dedysh, S. N*., Panikov N. S., Liesack W., Grobkopf R., Zhou J., and Tiedje J. M. Isolation of acidophilic methane-oxidizing bacteria from northern peat wetlands // Science, 1998. V. 282. P. 281-284.

40. Dedysh S. N., Pankratov T.A., Belova S.E., Kulichevskaya I.S. and Liesack W. Phylogenetic analysis and in situ identification of

41. Bacteria community composition in an acidic Sphagnum peat bog // Appl. Envir Microbiol., 2006

42. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids Res. 1989. V. 17. P.7843-7853.t

43. Frankenberger, W. T. Jr. & W. A. Dick. Relationships between enzyme activities and microbial growth and activity indices in soil // Soil Science Society of America Journal 47: 1983. p. 945-951.

44. Friedrick J., < Cinerman A., Steiner W. Production of pectolytotic enzymes by Aspergillus niger. Effect of inoculum size and Potassium Hexacyanoferrate II Trihydrate. // Appl. Microbiol. Biotechnol, 1990. 33:377.

45. Freeman, C., G. Liska, N. Ostle, S. E. Jones & M. A. Lock. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands //Plant and Soil 175: p. 147-152. 1995.52.

46. Garcia J.L., Patel B.K.C., Ollivier B. Taxonomic, phylogenetic, and ecological diyersity of methanogenic Archae // Anaerobe. 2000. V. 6. P. 205-226.

47. Gelsomino, A., A.C. Keijzer-Wolters, G. Cacco, and J.D. van Elsas. Assessmentof bacterial community structure in soil by polymerase chain reaction and denaturing gradient gel electrophoresis // J. Microbiol. Methods 38:1-15. 1999.

48. Gemma Reguera 1, Susan B. Leschine Chitin degradation by cellulolytic anaerobes and facultative aerobes from soils and sediments // FEMS Microbiology Letters 204. 2001. pp 367-374.

49. Ginige, M.P., P. Hugenholtz, H. Daims, M. Wagner, J. Keller, and

50. L. Blackall. Use of stable-isotope probing, full-cycle rRNA ?analysis, and fluorescence in situ hybridization-microautoradiography to study a methanol-fed denitrifying microbial community // Appl. Environ. Microbiol. 2004. 70:588596

51. Gomes, R. C., Semedo, L. T., Soares, R. M., Alviano, C. S., Linhares, L. F., and Coelho, R. R.: Chitinolytic activity of actinomycetes from a cerrado soil and their potential in biocontrol //1.tt. Appl. Microbiol., 30, 146-150 (2000) <

52. Gould WD, Bryant RJ, Trofymow JA, Anderson RV, Elliott ET,Coleman DC 1981. Chitin decomposition in a model soil system // Soil Biol Biochem 13 : p. 487-49

53. Gray TRG, Baxby P. Chitin decomposition in soil. II. The ecology of chitinoclastic micro-organisms in forest soil // Trans Br Mycol Soc 51 : p. 293-309. 1968

54. Griffin DM. 11985. A comparison of the roles of bacteria and fungi. In: Leadbetter ER, Poindexter JS (eds) Bacteria in nature. I. Bacterial activities in perspective // Plenum, New York, pp 221255

55. Gummadi S.N., Kumar D.S. Microbial pectic transeliminäses // Biotechnology Letters, 2005. V. 27. P. 451-458.

56. Jeffries P. Mycoparasitism within the zygomycetes // Bot J Linn Soc 91: p. 135-150. 1985

57. Kapoor M., Kuhad R.C. Improved polygalacturonase production from Bacillus sp. Mg Cp - 2 under submerged (SMF) and solid state (SSF) fermentation.// Lett. Appl. Microbiol. 2002. 34: 317-322.

58. Klappenbach, J.A., P.R. Saxman, J.R. Cole, and T.M. Schmidt. rrndb:The ribpsomal RNA operon copy number database // Nucleic Acids Res.29:181-184. 2001.

59. Kobabe, S., D. Wagner, and E.-M.- Pfeiffer. 2004. Characterization of microbial community composition of a Siberian tundra soil by fl uorescence in situ hybridization // FEMS Microbiol. Ecol. 50:1323.

60. Kox E. Der durh Pilze und aerobe Bacterien veranlasste Pectin -und Cellulose Abbau im Hochmoor unter besonerer Berücksichtigung des Sphagum - Abbaus // Archiv für microbiologic. 1954. V. 20. P. 111-140.

61. Kropf, S., H. Heuer, M. Gruning, and K. Smalla. Signifi cance test forcomparing complex microbial community fi ngerprints using pairwise similarity measures // J. Microbiol. Methods 57:187-195. 2004.

62. Krsek M &Wellington EMH. Comparison of different methods for the isolation and purification of total community DNA from soil // J. Microbiol. Methods 39: p. 1-16. 1999

63. Krsek Martin? & Elizabeth M.H. Wellington. Assessment of chitin decomposer diversity within an upland grassland // Antonie van Leeuwenhoek 79: p. 261-267. 2001.

64. Le Mer J., Roger P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: A revew // Eur. J. Soil Biology. 2001. V. 37. P.25-50.

65. Maloy O.C. Plant disease control: principles and practice // Wiley, Chichester. 1993i

66. Mann, K. H. Production and use of detritus in various freshwater, estuarine, and coastal ecosystems // Limnology and Oceanography 33: 910-930. 1988.

67. Manz W., Amann R., Ludwig W., Wagner M., Schleifer K.-H. Phylogenetic oligonucleotide; probes for the major subclasses of Proteobacteria: problems and solutions// Syst. Appl. Microbiol., 1992. V. 15. P. 593-600.

68. Meier H., Amann R., Ludwig W., Schleifer K.-H. Specific oligonucleotide probes for in situ detection of a major group of grampositive bacteria with low DNA G+C content// Syst. Appl. Microbiol, 1999. V. 22. P. 186-196.

69. Mitchell R, Alexander M. Microbiological processes associated with the use of chitin for biological control // Soil Sci Soc Proc 26 : p. 556558. 1962.

70. Mitsch, W. J! Global Wetlands: Old World and New // Elsevier, NY. 1994.

71. Morgan, C.A., A. Hudson, A. Konopka, and C.H. Nakatsu. Analyses of microbial activity in biomass-recycle reactors using denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA and 16S rRNAPCR products // Can. J. Microbiol. 48:333-341. 2002.

72. Nakatsu, C.H., Y. Torsvik, and L. 0vreas. Soil community analysis using DGGE of 16S rDNA polymerase chain reaction products // Soil Sci. Soc.'Am. J. 64:1382-1388. 2000.

73. Neef A., Amann R., Schlesner H., Schleifer K.-H. Monitoring a widespread bacterial group: in situ detection of Planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes // Microbiology, 1998. V. 144. P. 3257-3266.

74. Neufeld, J.D., and W.W.; Mohn. Fluorophore-labeled primers improve the sensitivity, versatility, and normalization of denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ // Microbiol. 71:48934896. 2005. f

75. Newman S. & K. R. Reddy. Alkaline-phosphatase activity in the sediment-water column of a hypereutrophic lake // Journal of Environmental Quality 22: p. 832-838.1993

76. Ward. Microscopic examination of distribution and phenotypic properties ofi phylogenetically. diverse Chlorofl exaceae-related bacteria in hot spring microbial mats // Appl. Environ. Microbiol. 68:4593-4603. 2002.

77. Odutola O.O., Ikenebomeh M.J. Polygalacturonase and pectinmethylestherase produced by Erwinia carotovora and Fusarium oxysporum isolated from stared tomatoes (Lycopersicum esulentum)fruits.//Niger. J.Microbiol., 1997, 11: 108-111.

78. Okafor N. Ecology of micro-organisms on chitin buried in soil // J Gen Microbial 44 : p. 311-327. .1966

79. Potgieter HJ, Alexander M. Susceptibility and resistance of several fungi to microbial lysis // J Bacteriol 91 : p. 1526-1532. 1966.

80. Raskin L., Stromley J.M., Rittmann B.E., Stahl D.A. Group-specific 16S rRNA hybridization probes to describe naturalcommunities of methanogens // Appl. Environ. Microbiol., 1994.- V. 60. P. 1232-1240.

81. Roller C., Wagner M., Amann R., Ludwig W., Schleifer K.- H. In situ probing of Gram-positive bacteria with high DNA G+C content using 23S rRNA- targeted oligonucleotides // Microbiology, 1994. V.140. P. 2849-2858

82. Satokari, R.M., E.E. Vaughan, A.D.L. Akkermans, M. Saarela, and W.M. de VoSj. Bifi dobacterial diversity in human feces detected by genusspecifi c PCR and denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. 67:504-513. 2001

83. Schippers B, Palm LC Ammonia, a fungistatic volatile in chitin-amended soil // Neth J Plant Pathol. 1973. 79 : p. 279-281.

84. Seymour G.B., Knox J.P. Pectin's and their manipulation // USA: Blackwell, 2002 250p.

85. Smucker, R. A. & R. Dawson. Products of photosynthesis by marine phytoplankton: chitin in.TCA 'protein' precipitates // Journal of Experimental Marine Biology and Ecology 104: p. 143— 152. 1986.

86. Sokal, R., and P.H.A. Sneath. Principles of numerical taxonomy // Freeman, San Francisco. 1963.

87. Stahl D.A., Amann R. Development and application of nucleic acidiprobes // In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.) Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. 1991. Wiley, New York, N.Y. P. 205-248.

88. Torsvik, V.,R. Sorheim, and J. Goksoyr. Total bacterial diversityin soil and sediment communities—a review // J. Indus. Microbiol. 1996. 17:170-178.

89. Uffen R.L. Xylan degradation: a glimpse at microbial diversity // J. of1.dustr. Microb. Biochem., 1997. v. 19. p. 1-6 t

90. Veldkamp H. A study of the aerobic decomposition of chitin by microorganisms // Meded Landbouwhogesch Wageningen 55 : p. 127-174. 1955.

91. W. De Boer & S. Gerards 7 P.J.A. Klein Gunnewiek R. Modderman. Response of the chitinolytic microbial community to chitin amendments of dune soils // Biol Fertil Soils 29 : p. 170177.2001.

92. Watt, M., P. Hugenholtz, R. White, and K. Vinal. Numbers and locations of native bacteria on field grown wheat roots quantifi ed by fluorescence in situ hybridization // Environ. Microbiol. 8:871884. 2006.

93. Wilbur, J.D., J.K. Ghosh, C.H. Nakatsu, S.M. Brouder, and R.W. Doerge. Variable selection in high-dimensional multivariate binary data with application to the analysis of microbial community DNA fingerprints // Biometrics 58:378-386. 2002.

94. Williamson, N., Brian, P., and -Wellington, E. M.: Molecular detection of bacterial and streptomycete chitinase in the environment // Antonie Van Leeuwenhoek, 78,315-321. 2000

95. Woese C.R., Magrum L J., Fox G.E. Archaebacteria // J. Mol. Evol. 1978. V. 11. P. 245-252.

96. Yang, C.H., and D.E. Crowley. Rhizosphere microbial communityfstructure in relation to root location and plant iron nutritional status // Appl. Environ. Microbiol. 66:345-351. 2000.