Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мультисубстратное тестирование почвенных микробных сообществ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Мультисубстратное тестирование почвенных микробных сообществ"

РГ8 ОД !i" НОЯ 1995

На ttfiatfax ¡и/кониси

Горленко Михаил Владимирович

МУЛЬТИСУБСТРАТНОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ПОЧВЕННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ

Специальность 03.00.07 - микробиология

. . АВТО РЕ.Ф Е PAT

- „ S

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995 •к -к -к

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского Государственного университета имени М.ВЛомоносова.

Научный руководитель -

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук

Доктор биологических наук.

Ведущая организация- Московская сельскохозяйственная академия

им ILA. Тимерязева.

Защита диссертации состоится 'ijj1 1995 года »1530 на

заседании диссертационного совета К 053.05.86 МГУ по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения, аудитория М-2.

С диссертацией -можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан " " i 1995 года

Приглашаем вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета К 53.05.86 в МГУ им. М.ВЛомсносова, а отзывы на автореферат в 2-х экземплярах, просим направлять по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения, ученый совет.

Ученый секретарь диссертационного совета И.П.Бабьева.

ПА. Кожевин

Д.И.Никишн ЕАДиитриев

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Изучение сложных естественных сообществ является ключевой задачей современной экологии. В пределах экоснстемного подхода к этой проблеме различают структурное направление, уделяющее основное внимание изучению строения различных экологических систем, и функциональное, связанное с анализом " происходящих в экосистемах процессов. В экологии микроорганизмов комплексное структурно-функциональное направление связано обычно с описанием структуры природных микробных систем на основе списка учитываемых популяций, и гипотезами о процессах in situ на основе функциональных характеристик выделенных чистых культур in vitro .

Этот подход позволил ввести различные схемы микробных систем с описанием составляющих элементов в виде функциональных блоков, таких как гидролитики, микрофлора рассеяния, копиотрофы, олиготрофы и т.д. Вместе с тем известно, что экстраполяция на природу данных о физиологии, биохимии, кинетике роста чистых культур in vitro может привести к некорректным выводам. Остается в силе подход С.Н.Виноградского, 1 который указывал на необходимость экспериментального анализа изменений природных почвенных микробных сообществ после воздействий, связанных с внесением различных органических субстратов.

Недостаточность существующих попыток структурно-функционально охарактеризовать природные микробные системы по списку выделенных видов и свойствам чистых культур in vitro совершенно ясна из концепции дублирования, сформулированной Д.Г.Звягинцевым." В частности, на примере." грибов установлено существование в однотипных местообитаниях "элементарных сообществ". - функционально интегрированных единиц, которые тем не менее различаются по видовому составу.

Хорошо известно также,' что функциональные характеристики существенно изменяются в случае образования разнообразных ассоциаций. Пример тому - разложение природных полимеров ассоциациями гидролитиков.

Поэтому необходимо специальное исследование структурно-функциональных параметров природных микробных сообществ, не связанное с таксономическим описанием, нацеленное на охват сообщества -в целом и допускающее даже возможность проявления активности неописаных видов. Такой подход должен обеспечить возможность формирования спонтанных ассоциаций. Наконец,, такой подход должен базироваться на возможности изучения и сопоставления сообществ разных местообитаний, разных стадий сукцессии и при разных антропогенных нарушениях сообществ, а это возможно только в случае независимости описания от видового состава и популяционных характеристик.

Появление в последние годы технологии BIOLOG, основанной на оценке интенсивности потребления микробными сообществами органических субстратов по накоплению красителя формазана, образуемого метаболически активными клетками из добавляемого в срсду тетразолия фиолетового, позволило по новому подойти к проблеме функционального описания микробных сообществ. Современные компьютерные методы обработки многомерных данных дают возможность сравнения микробных сообществ по характеристическим спектрам потребления большого числа субстратов. Таким •образом, объектом, обладающим определенной целостностью, будет не одна популяция, а микробное сообщество в целом.

Частично такая возможность была продемонстрирована в серии работ на конференции по структурно-функциональному анализу почвенных микробных сообществ в Великобритании в 1994 году (Garland, Mi lis, 1994.,Winding, 1994). Однако эти работы носили сравнительно-описательный характер и не - получили" дальнейшего качественного развития.

Цель работы: Комплексное структурно - функциональное исследование естественных микробных сообществ почв .разных типов и ризосферы на основе метода мультисубстратного тестирования, с оценкой изменений, связанных с микробными сукцессиями и антропогенными воздействиями. Задачи исследования:

I. Разработка нового метода мультисубстратного тестирования (МСТ) для функционального описания сложных природных сообществ почвенных микроорганизмов.

II. Сравнительная функциональная характеристика 5 зональных типов почв методом МСТ.

Ш.Оценка возможностей применения метода МСТ для мониторинга загрязнений на примере индикации загрязнений почв синтетическими моющими средствами(СМС).

IV.Использование метода МСТ для вьивления изменений в структуре естественных микробных сообществ в результате интродукции инородного комплекса микроорганизмов.

V. Сравнительный анализ структурных и функциональных изменений микробных сообществ в ходе микробных сукцессии в различных почвенных местообитаниях.

ч

Научная новизна:

Разработан новый метод изучения функциональных свойств микробных сообществ - мультисубстратное тестирование.

Впервые при помощи метода МСТ выявлены функциональные различия между микробными сообществами различных зональных- типов почв.

Доказана возможность применения МСТ для индикации и мониторинга загрязнений почв. Установлено, что загрязнение почв синтетическими моющими средствами' приводит к значительному и

специфическому изменению функционального отклика микробного сообщества, которое легко выявляется с помощью МСТ.

Впервые с помощью метода МСТ удалось выявить изменение функциональных характеристик естественных микробных сообществ после интродукции сложного микробного комплекса,' что позволяет решать сложные теоретические и прикладные задачи выживаемости желательных и нежелательных популяций. .

Сочетание методов люминесцентной микроскопии, метода МСТ и газовой хроматографии, а так же комбинация метода МСТ с ингибиториым анализом (для определения функциональной значимости микромицетов и бактерий ) позволило получить, комплексное структурно-функциональное описание сукцессионных процессов в микробных сообществах различных почвенных местообитаний.

Практическая ценность работы:

• Доказана эффективность предложенного нами метода МСТ

для функционального экспресс-мониторинга почвенных

микробных сообществ. Показана возможность индикации нарушений почвенных микробных сообществ при загрязнении почв синтетическими моющими средствами.

• Метод МСТ может быть использован также для оценки изменений в почвенном микробном сообществе после интродукции инородных компонентов (бактериальные удобрения, микробное загрязнение среды).

• Разделы настоящей работы, посвященные . проблемам . мониторинга загрязнений,- выполнены в - рамках программы

"Экологическая безопасность России" по теме 11.1.10 "Разработка методов экспресс-оценки реакций почвенных экосистем на антропогенные нагрузки в лабораторных микрокосмах" а так же программы ГНТП "Биотехнология защиты окружающей среды".

Апробация работы: Результаты исследований доложены на IV конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущиво, 1992), на конференциях молодых ученых факультета почвоведения МГУ (Красновидово, 1993, 1994), а так же на заседании кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ (1994).

Публикации: Материалы диссертации изложены в 5 печатных работах.

Объем и структура работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения и выводов, списка цитируемой литературы,' приложений. Работа содержит ¿2о страниц текста, 1 иллюстрированна ^ рисунками, *н Ч таблицами. Список литературы содержит 12»р наименований из зарубежных авторов.

Автор выражает глубокую признательность к.б.н. O.E.

Марфениной, к.б.н. А.Л. Степанову, к.б.н. Л.В. Лысак д.б.н.

И.И.Судницину и д.б.н.Градову Н.Б. за консультации и содействие в проведении работ.

. Объекты и метода исследования

В работе использовались образцы дерново-подзолистой (Московская область), серой лесной (Тульская область), каштановой почв, чернозема (Ростовская область), краснозема (Грузия) отобранные из гумусовых горизонтов .

Воздушно-сухие образцы почв увлажнялись дек 60% от полной влагоемкости растворами глюкозы (контроль) и

CMC (в экспериментах

по мониторингу загрязнений) в концентрации 0.05 г/г почвы для инициации микробной сукцессии . Навески почв инкубировались при 25°С во влажной камере. Образцы были- взяты на 0, 3, 7, 13 и 25 сутки сукцессии. Для анализов почвенную суспензию(1:50) обрабатывали ультразвуком при частоте 22 кГц и силе тока 0,04 А в течении 1 минуты. Из полученной почвенной суспензии отбирались пробы для приготовления препаратов для микроскопии, затем суспензию центрифугировали в режиме ускоренного отстаивания (1500 об/мин, 5 минут) до получения прозрачной надосадочной жидкости. Для определения относительной функциональной значимости микромицетов, в качестве дополнительного варианта использовали образцы с добавлением актидиона (0,2мкг на 1 мл почвенной суспензии). ■ что подавляло эукариотический компонент микробного сообщества.

В отдельной экспериментальной серии были предусмотрены варианты предполагающие инициацию сукцессий в дерново-подзолистой почве при различных, значениях влажности (5%, 13% и. 20%). ...

В опытах по интродукции использовали микробный комплекс, выделенный из естественного типичного среднесуглинистого чернозема (Курский заповедник) при помощи ультразвуковой обработки (1 мин, 22 кГц, 20 тА, диспергатор УЗДН-2) с последующим центрифугированием (5 мин, 4 тыс. об/мик). Бактеризация ячменя (107 кл/семя) проводилась путем замачивания (24час) в препарате. Контрольным вариантом служила аналогичная обработка семян водой.

Для проведения культасубстратното тестирования использовались микрокюветы для иммунологических тестов, представляющие собой "пластины из оптически прозрачного пластика с 96 ячейками, объемом 250 микролитров. В каждую ячейку добавляли свой субстрат в концентрации 1%, набор минеральных солей и тетразолий фиолетовый как индикатор потребления субстрата. В наших исследованиях - использовался набор из 47 субстратов (Табл. 1). Содержимые компоненты находились в ячейках в сухом виде,. и растворялись - при добавлении исследуемой суспензии, которую готовили на фосфатном буфере (рН 6,5) .В каждую ячейку добавляли 0.2 мл почвенной суспензии. Микрокюветы инкубировали 72 часа при температуре 28°С, после чего проводили измерение окрашенности ячеек.

Таблица!. Набор субстратов для мультисубстратного тестирования.

Углеводы. с^ХОЛИ Аминокислоты Полимеры !

инозит [1] ацетат[ 13] норлейцин(25] декстран500[40]

Ь+арабиноза[2] аспартат[14] Ь цистеин!26] твин 80[41]

Ь+рамноза[3] цитрат[ 15] гистидин[27] крахмал [43]

дульцит[4] сукцинат(16] норвалин [28] Амиды 1

0+сорбит[5] малеинат!17] треонин [29] ацетамид [22]

лактоза?6] пропионат[18] аланин[30]

Г)-ианнит[7] октаноат[19] аспарагин[31] ФосФооилирова

Б+мальтоза[8] валерианат[20] Б-Ь валин!32] иные соединения

0+глюкоза[9] малат [21] ■серин[33] Глюкоза-6Р[42] II

сахароза! 10] пропионат[24] ! Ь ! Фенилаланин[34] Амины

ксилоза[ 11 ] лактат [35] ! Ь глутамин[36] креатин [47]

пуллулан( 12] аргинин[37]

фруктоза[ 44] 4 ншяни ПИИ/ МИР аминобутират • Г 23] _________ Нуклеозпды

рафиноза[45] глицерин! 46] | тимидин[39] |

Для измерения интенсивности окраски каждой ячейки, был

сконструирован прибор, измеряющий поглощение проходящего сквозь ячейку света в зеленой части спектра с помощью фотодиода и цифрового вольтметра. При этом степень окрашенности данной ячейки сравнивали с аналогичным показателем контрольной ячейки, в которую не добавляли субстрат. В условиях эксперимента разность между максимально окрашенной и бесцветной ячейкой достигала 250 единиц. Для окончательного выражения окрашенности ячейки использовался (С-Л)

показатель V = _ Л.— ' . „ , где С - выраженная в показаниях {¿.{С-Щ/И

прибора окраска' данной ячейки, К - то же для контрольной ячейки, N -количество субстратсодержащих ячеек.

Описанный метод в заданных условиях характеризовался высокой воспроизводимостью. Так, для 10 испытаний коэффициенты вариации для всего спектра ресурсов в случае с дерново-подзолистой почвой не превышали 6%. Сравнение микробных сообществ образцов на базе, трансформированных описанным образом данных проводили с п.омошью методов многомерной статистики, таких как факторный анализ, метод главных компонент,4 кластерный анализ, многомерное проецирование.В ряде экспериментов проводились также измерения скорости выделения

СОг комплексом почвенных микроорганизмов с использованием газового хроматографа .

Исследование структурных характеристик предусматривали измерение длины "активного* мицелия почвенных микромицетов путем прямой люминесцентной микроскопии с окраской диацетатом флюоресцеина (ФДА), подсчет численности почвенных бактерий и длины мицелия актиномицетов при помощи прямой люминесцентной микроскопии с окраской акридином оранжевым' (АО) и измерение обшей длины мицелия почвенных микромицетов с помощью v фазово-контрастной микроскопии и прямой люминесцентной микроскопии с окраской калькофлюором. Использовался люминесцентный микроскоп МЛ-4 (объективы х90, х40, масляная иммерсия).

Расчеты и статистическую обработку результатов проводили на персональных компьютерах типа' IBM PC АТ486 и PENTIUM. Использовались статистические программы STATEX, CSS, BMDP, для расчетов и оформления использовались пакеты EXEL 4.0, HarvardGraphics for- Windows, Origin Plot for Windows а также специально написанные автором на языке QuickBasic программные продукты.

Результаты и обсуждение Дифференциация почвенных микробных сообществ с помощью мудьтисубстратного тестирования.

Применение метода" мультисубстратного тестирования с использованием тетразолия фиолетового как индикатора потребления субстрата позволило охарактеризовать микробные сообщества. 5 зональных типов .почв. В. . ходе анализа полученной информации с помощью метода главных компонент установлены различия между микробными сообществами различных типов почв. УСЛОВНЫЕ ЕДИНИЦЫ

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19.21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 2 4 6 8 10 12 14 16 18-29 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 №СУБСТРАТА Рис.1. Спектр потребления субстратов 3 типами почь. (Названия субстратов см. табл.1)

На рис.1 представлен спектр ассимиляции субстратов для серой лесной, дерново-подзолистой почв и чернозема. Четко видны специфические различия в потреблении субстратов, позволяющие говорить о наличии у каждого типа почвы характерного спектра ассимиляции. Различия между микробными сообществами различных зональных типов почв особенно легко выявляются при использовании метода главных компонент. В данном исследовании нас интересовали нагрузки на две первых главных компоненты, отражающие наиболее существенные различия. В этой системе координат произошло четкое разделение образцов (рис 2). ГК2

0.8 0.6 0.4 0.2 0 -0.2

-0.4

0.4

0.5

0.6

0.7 ГК1

0.8

0.9

«ДПП * Чернозем * Краснозем т Серая лесная * Каштановая__-

т

■ Рис.2 .Разделение образцов почв методой" главных компонент'.'

Наиболее значительными были различия в координате второй главной компоненты. Надо отметить, что в большинстве случаев наблюдается плотное расположение точек, относящихся к одному образцу, й значительное разделение разных образцов в плоскости двух первых главных компонент. Метод главных компонент не позволил четко разделить лишь сообщества чернозема и каштановой почвы, но эта задача была решена с помощью дискриминантного анализа, позволившего разделить варианты (рис.3).

Надо отметать большое влияние пространственной неоднородности почв на структуру регистрируемых данных. Поэтому, учитывая высокую чувствительность метода мультисубстратного тестирования необходимо использование в анализах репрезентативных смешанных образцов. Быстрота и чувствительность метода представились достаточным основанием для проверки его индикационных способностей в задачах мониторинга загрязнений почв.

сш

Рис.3. Разделение образцов почв с помощью дискриминаитного анализа.

Индикация загрязнения почв синтетическими ноющими средствами' по функциональной реакции почвенного микробного комплекса.

Традиционные методы биологического мониторинга обычно связаны с выявлением структурных изменений микробного сообщества, включая поиск индикаторных популяций и анализ динамики численности отдельных представителей сообщества. Такой подход, в частности, используется в чрезвычайно актуальной проблеме загрязнения природных местообитаний синтетическими моющими средствами (CMC) (Рабинович, Маленкова, Градова,1993); но в этом случае отсутствует информация о функциональных изменениях микробного сообщества в целом, а сами методы анализа, связанные с выделением и определением чистых культур и количественными учетами, весьма трудоемки и далеко не всегда приемлемы с точки зрения воспроизводимости, чувствительности и экспрессности. Нами изучена возможность применения метода мультисубстратного тестирования для характеристики функциональных изменений в микробных сообществах почв разных типов и их мониторинга при загрязнении CMC.

Задача сводилась к выявлению функциональных изменений в микробных сообществах, происходящих под воздействием загрязнения CMC с определением минимального набора характеристических субстратов, необходимых для уверенной диагностики изучаемого загрязнения.

Преобразование системы исходных признаков, представленных данными о потреблении 47 субстратов естественными микробными комплексами 14 загрязненных и незагрязненных образцов дерново-подзолистой почвы и чернозема на разных стадиях сукцессии, позволило с помощью метода главных компонент снизить размерность задачи.

Наибольшую нагрузку на первую главную компоненту имели иистсии (0.93) и крахмал (-0,67). Вторая компонента ГК2 в данном случае практически полностью определяется валериаиатом (0,96).

Положение микробных комплексов исследуемых почв в пространстве двух ГК показано на рис 4. Микробные комплексы загрязненных почв значительно отличаются от таковых для контрольных почв. Практически это означает, что независимо от типа почвы (дерново-подзолистая или чернозем) и сукиессионного фактора (время от момента загрязнения от 3 до 25 дней) можно уверенно диагностировать почвы, подвергшиеся загрязнению CMC,' по изменению функциональных характеристик естественных микробных комплексов.

ГК1

40

го

-го

- ДПП

. *

Чернозем

ГК2

Рие.4. Мониторинг загрязнения почв CMC с помощью МСТ.

*

*

В данной примере загрязненные почвы существенно отличаются от контрольных по повышенному уровням потребления валерианата (ГК2), цистеина (ГК1) и пониженному уровню использования крахмала (ГК1).

Анализ на основе теории распознавания образов позволил определить решающие правила. Обшее заключение о загрязнении почв CMC независимо от времени загрязнения и его уровня в рассматриваемых диапазонах будет правомерным, если нормированные показатели по валерианату выше 0.105, а по крахмалу нйже 0,712. При положительном ответе имеется принципиальная возможность определить примерный момент времени, когда почва была загрязнена CMC. Если активность по пропионату превышает 0,137, а активность по крахмалу ниже 0,446, можно утверждать, что почва была загрязнена не более чем за 3 дня до анализа. Такой же вывод верен, если показатели по манниту to валину превышают 1,793 и 0,313 соответственно, либо если активность по валерианату выше 0,114, а активность по норлейиину ниже 0,172, или если показатели для. дульцита ниже 0,243, а для аминомасляной кислоты выше 0,155. Заключение о том, что почва была загрязнена более чем за 3 недели до анализа образцов' справедливо в тех случаях, когда

активность по цистеину выше 0,152, а активность по аспартату ниже 1,786. Такой же вывод должен быть сделан, если показатели по малеинату и аминомасляной кислоте превышают 0,627.

Полученные данные указывают на высокую эффективность метода мультисубстратного тестирования для оценки функциональных изменений в природных микробных сообществах в результате антропогенного воздействия. В прикладном отношении можно ^сделать , вывод о перспективности функционального тестирования природных микробных сообществ по небольшому. набору индикаторных субстратов как относительно простом и экспрессном методе индикации загрязнения почв.

Влияние интродукции бактериального комплекса чернозема на функциональные характеристики микробных сообществ-реципиентов.

Эффективность интродукции чужеродной популяции или комплекса микроорганизмов в почвенное микробное сообщество зависит прежде всего от выживаемости в новом местообитании. Проследить судьбу интродудированного сложного микробного комплекса до недавнего времени не представлялось возможным, поскольку основные методы популяционного подхода ориентированы на выявление и учет конкретных видов и штаммов. Использование МСТ позволило решить данную задачу. "

Для исследования влияния интродукции бактериального комплекса чернозема в различные почвенные микробные системы, проведен эксперимент с анализом сообществ исходного чернозема, дерново-подзолистой почвы и ризосферы ячменя с внесением и без внесения препарата баккомплекса чернозема.

Применение алгоритмов распознавания образов позволило выделить основные характеристические признаки для групп образцов. Так, основным критерием "черноземности" т.е общим свойством для всех образцов, в которых присутствовала микрофлора чернозема явилось снижение нормированного потребления аминопропионовой кислоты ниже , 1,49. Для исходной черноземной почвы характерно повышенное потребление аланина (>2,7) и креатина(>0,0147). Для ризосферы отмечали повышенное потребление ацетата (>0,86), а для ДПП цитрата(>2,29).

Применение метода главных компонент для выделенных субстратов позволило наглядно дифференцировать варианты (рис.5).

. Для достоверной интерпретации результатов анализа достаточно было 2х главных компонент, вклад в суммарную дисперсию которых составил 84%, при этом ГК1 наиболее тесно была связана с амкнопропионатом, а ГК2 с апететом и аланином. • Все варианты с бактеризацией значительно отличаются от контрольных и в рассматриваемом пространстве признаков

близки к чернозему. Таким образом внесение бактериального комплекса чернозема

15

ю

5 О -5 -10 -15

-15 -10 -5 0 5 10

ПО

Рис.5. Эффект интродукции бактериального комплекса чернозема & ряд

микробных сообществ реально изменило свойства микробных сообществ дерново-подзолистой почвы и ризосферы что объясняет ранее установленный факт ( Кожевин, Корчмару, 1995) увеличение урожая после применения препарата.

дпп

—:-Ризосфера*_ БК

Ризосфера ( *# . ^ ;

\ ' / # /

/"* '*>ДПЛ+БК

\ * * ч. * \ "Чернозем ~—■===—==?*-

Комплексный подход к описанию микробных сообществ.

Сочетание метода МСТ с традиционными методиками дает уникальную возможность многостороннего структурно-функционального описания микробйых сообществ.

В качестве основного объекта выбрана дерново -подзолистая почва, в качестве дополнительного - чернозем. Наибольший интерес представлял вопрос о значимости микромицетов и бактерий на разных стадиях сукцессии и в разных местообитаниях , а также характеристики функциональных процессов.

Динамика структурных показателей, описывающих сукцессию в дерново-подзолистой почве показана на рис.б. Отмечено,что на ранних этапах сукцессии велика роль микромицетов, которые, являясб относительном!! г-стратегами, вероятно, играют решающую роль в процессах первичной деструкции.

общая жизнеспособная ЕЗ % жизнеспособного мицелия • -а- Бактерии_

Рнс.6. Динамика структурных показателей в ходе сукцессии.

В дальнейшем в связи с реутилизацией органики, накопленной микромицетами происходит увеличение обилия бактерий и снижение значимости микроминетов. Большая часть мицелия на этих этапах . представлена мертвой биомассой, доля жизнеспособного мицелия имеет тенденцию к снижению на фоне накопления мертвой трудноразложимой мицелиальной биомассы.

Задача адекватного сравнения значимости бактерий и микромицетов по •показателям обилия -является нетривиальной. Нами был- применен подход, в основе которого лежит сравнение значимости данных групп по площадям поверхностей организмов, поскольку именно через поверхность осуществляется.взаимодействие организма со средой(поглошение ресурсов • и выделение метаболитов). При расчетах площадей мы рассматривали грибную гифу как цилиндр диаметром 5 мкм, а бактериальную клетку как сферу диаметром 0.5 мкм.

На основе показателей обилия и вышеуказанных допущений значимость бактерий в ходе сукцессии определена как отношение площадей поверхностей бактерий и микромицетов (рис 7).

Установлено также влияние фактора влажности на структуру сообщества, причем по индексу, встречаемости повышение влажности повышает относительную значимость бактерий (рис.8). Таким образом микробные сообщества в одной и той же почве могут иметь различную структуру в зависимости от влажности.

Ббисгерт/Змшфомюкти

Рнс.7.Значимость бактерий в ходе сукцессии при разной влажности.

(Отношение площадей поверхностей)

Вместе с тем (рис.7) очевидно, что при всех влажностях максимальная значимость бактерий отмечается на 16 сутки сукцессии. Во всех рассмотренных экспериментальных сериях именно на этот срок приходится минимум обилия микромицетов и начало роста численности бактерий. Показатели скорости дыхания (Рис. 9) сообщества сходны для всех вариантов, подтверждая функциональную инвариантность почвенного микробного сообщества по этому параметру. Они максимальны на первых этапах, активного потребления субстрата и в последующие этапы сукцессии ллавно снижаются-

5% , 13%

Уровень влажности □Бактерии ®Микромицеты ИАктиномшеты

Рис.8.Структура микробного комплекса при 3 уровнях влажности (индекс встречаемости)."

0.5

0.4

0.3

0.2

0.4

скорость выделения СО 2 |мкГЛ*часЗ

Рис.9.Динамика дыхания сообщества.

Применение метода МСТ в сочетании с ингибиторным анализом позволило оценить вероятную функциональную значимость микромицетов на разных стадиях сукцессии. При ожидаемом действии актидиона степень различия между вариантами с акгидионом и без него должна быть пропорциональна значимости микромицетов (Рис.10). В качестве меры' различия использовано Эвклидово расстояние между экспериментальными точками в 47-мерном пространстве признаков. График демонстрирует снижение значимости микромицетов в ходе сукцессии. Минимальный уровень значимости достигается на 14-16 сутки, что подтверждает выводы, сделанные из анализа динамики бактерий и микромицетов.

Таксономические расстояния между вариантами(ингиб!Пор/6ез)

15

РУТ™ . . '

Рис. 10.Значимость микромицетов в сукцессии (пояснения в тексте) Возвращаясь к обсуждению структурных параметров, отметим наличие двух пиков в динамике показателей обилия, причем пики обилия

микромицстов и бактерий следуют один за другим в противофазе. Появление бактериального пика порождает возникновение нового пика микромицстов.

Поведение данной системы напоминает изменения, происходящие в классической системе хищник-жертва. По всей видимости, процессы перераспределения субстрата между микромицетами и бактериями носят колебательный характер. Как известно из теории систем и теоретической экологии, подобная динамика характерна для циклических процессов, и предполагает наличие фазы задержки. Причина задержки вероятно связана с тем, что наличие значительных капиллярных сил внутри фрагментов гиф делает самопроизвольное •вытекание цитоплазмы маловероятным. Можно рассматривать мертвые грибные гифы как своеобразные "консервы" в полимерной оболочке, которые сложно вскрыть силами сообщества микромицетов, являющихся

преимущественно г-стратегами. Поэтому дальнейшее развитие этой группы временно лимитируется отсутствием богатого субстрата. Затем лизис полимерных оболочек мертвых гиф в основном бактериями и актаномицетами вызовет вторичное обогащение среды, что приводит к новой активизации г-стратегов.

Изучение микробных сукцессии методом МСТ также подтверждает циклический характер сукцессионных изменений. Результаты анализа сукцессионных изменений в дерново-подзолистой почве методом главных компонент приведены на рис.11.

ГК2

Рис. 11. Сукцессконная траектория в фазовом пространстве главных

компонент.

Сукцессионная траектория в фазовом пространстве главных компонент . имеет циклический характер; • напоминающий фазовую . плоскость классической модели хищник-жертва. Переход от абстрактных главных компонент к реальным субстратам (лактоза и глицерин), имеющих максимальные нагрузки на первые две главных компоненты, позволяет построить траекторию сукцессионных изменений в пространстве реальных

признаков (рис.12). Наблюдаемая функциональная динамика во всех рассматриваемых случаях также согласуется с описанием сукцессии как предельного цикла. Если рассматривать климаксную систему как систему вблизи устойчивого положения равновесия, то запуск сукцессии будет дестабилизирующим воздействием, которое переводит систему в колебательный режим, порождающий предельный цикл.

Классическое описание сукцессии в общей экологии постулирует возрастание видового и функционального разнообразия сообщества в ходе сукцессионного процесса.

Нами предпринята попытка оценки динамики меры разнообразия почвенного микробного сообщества в ходе сукцессии. В качестве информационных индексов использовались дисперсия серии и количество потребляемых субстратов .

Лактоза

Глицерин

> | + ДПШ *ДПП2 ■ ДПП+СМС * Чернозем|

Рис.12.Сукцесснонные траектории в пространстве признаков..

■ Серия полярных диаграмм, представленных на рис.13 иллюстрируют качественные изменения, которые претерпевает микробное сообщество дерново-подзолистой почвы в ходе сукцессионного цикла. При этом длина каждого луча отражает интенсивность потребления одного субстрата. Таким образом, удается визуализовать многомерное пространство признаков, получив образы, которые можно трактовать как изображения пространства функциональных возможностей сообщества. График (Рис.14) демонстрирует динамику дисперсии, трактуемой как 'степень возмущённое™ системы, ее неравновесносги. ' .Ее можно интерпретировать также как величину, обратную таким показателям, как сложность системы или ширина пространства функциональных возможностей.

Из рисунков видно, что максимальные потенциальные функциональные возможности заключает климаксное сообщество, характеризуемое минимальной дисперсией, наиболее равномерным и интенсивным заполнением пространства функциональных возможностей. Инициация сукцессии внесением глюкозы резко усиливает специфичность данного местообитания, вызывая неравномерное сжатие пространства функциональных возможностей, что проявляется в резком увеличении дисперсии. Дальнейшая динамика системы описывает возвращение системы к стационарному (климаксному) состоянию,- сопровождающемуся постепенным "расправлением" пространства функциональных возможностей, повышением его равномерности, и, как следствие , снижением дисперсии. Эти закономерности подтверждает и увеличение в ходе сукцессии числа потребляемых сообществом субстратов(Рис. 15).

Диаграмма на рисунке 16 показывает динамику потребления номинальных групп субстратов в ходе сукцессии, а так же функциональную структуру сообщества ризосферы. Очевидно, что сообщество ризосферы значительно отличается от почвенных сообществ. Такая специфика обусловлена вероятнее всего снижением относительной роли грибного компонента в данном сообществе.

7

Рис. 13.Изменение пространства функциональных возможностей сообщества в ходе сукцессии.

т

Рис. 14.Изменение дисперсии потребления субстратов в ходе сукцессии.

сутки

Рнс.15.Измевение количества потребляемых сообществом субстратов В ходе сукцессии регистрируется равномерное повышение потребления органических кислот и снижение . потребления полимеров при незначительном увеличении потребления углеводов. В рамках описанной концепция зтй закономерности можно объяснить следующим образом: добавленная. глюкоза в кратчайшие сроки используется сообществом г-стратегов (в основном микромицетами), что приводит к накоплению активной биомассы, способной в отсутствии мономеров переключатся', на полимерные субстраты. Небольшое повышение суммарного потребления углеводов происходит не замечет увеличения интенсивности, а за счет расширения спектра используемых субстратов и увеличения его равномерности. Повышение роли органических кислот объяснимо фактом . доминирования .на поздних этапах микрофлоры- рассеяния,-представленной бактериями. Увеличение потребления^аминокислот на поздних стадиях объясняется накоплением мертвой биомассы, обогащенной белковыми ^компонентами.

Нормированное потребление

"Молодое" "Промежуточное" "Зрелое" "Ризосфера"

Микробная система

Типы субстратов

□ Углеводы в Аминокислоты ЕЗОрганическис кислоты ЕЯ Полимеры Рнс.16. Потребление номинальных групп субстратов микробными , сообществами Таким образом все результаты, полученные нами на основе использованных в данном исследовании подходов и методов подтверждают правомерность применения к почвенным микробным сообществам известной из теоретической экологии циклической концепции сукцессионных изменений. Характерные для этого типа динамики особенности выявляются как на структурном так и на функциональном уровнях во всех исследованных местообитаниях.

Выводы

=>1. Доказана возможность определения функциональных характеристик микробных сообществ почв и ризосферы растений с помощью МСГ, что позволяет развить в почвенной микробиологии классическое экологическое направление -функциональный подход ("физиология сообществ"). Чувствительность предложенного нами метода МСТ, основанного на регистрации потреблении 47 различных субстратов, достаточна не только для описания сообществ различных местообитаний, но и для распознавания различных стадий сукцессии и индикации разнообразных воздействий.

=> 2. Микробные сообщества различных местообитаний и различных стадий сукцессии имеют характерные различия по потреблению основных групп субстратов, что доказано с помощью факторного анализа и алгоритмов теории ' распознавания образов. Диапазоны различий между местообитаниями значительно шире таковых для сукцессионных событий в одном местообитании.

=> З.На примере загрязнения почв синтетическими моющими средствами . доказана возможность выявления изменений в

функциональной структуре микробных сообществ разных почв в результате антропогенных воздействий. Достаточным

признаком наличия данного типа загрязнения является повышение уровней потребления валерианата и цистеина и понижение потребления крахмала.

=> 4. Показана принципиальная возможность определения выживаемости сложных природных микробных комплексов неопределенного • состава при интродукции в новое местообитание с выявлением изменений в структуре естественных микробных сообществ.

=> 3.Сочетание метода МСТ с традиционными методами (количественные учеты, дыхание) позволили составить обобщенное структурно-функциональное описание микробных сукцессии в почвах. Все описанные сукцессии соответствуют классической циклической модели. Начальные этапы характеризуются снижением потенциальных функциональных возможностей. Для них характерно повышенное потребление полимеров, что наблюдается на фоне выраженного развития мицелия грибов. Затем в ходе сукцессии спектр потребления органических веществ смешается в сторону низкомолекулярных соединений, что коррелирует с возрастанием значимости бактериального компонента. Повышается стабильность системы, ее потенциальные функциональные возможности.

' => 6. В зависимости от внешних ограничений (влажность), сукцессия в одной и той же почве проходит по разным маршрутам, что установлено по динамике учитываемых групп микроорганизмов' в " дерново-подзолистой почве. "Однако изменение влажности почвы в исследуемом диапазоне не обязательно влияет на характер динамики интегральных функциональных „ показателей . (дыхание,

Збактерии/Бмикромицеты) ,что свидетельствует о

функциональной инвариантабсти рассматриваемого сообщества.

* * *

Список опубликованных работ

О 1. Кожевин П.А. Корчмару С.С. Майорова Т.Н. Горленко М.В.

Сомова.Н.Г. Неопределенности при применении инородных популяций в качестве бактериального удобрения.в сб."Микроорганизмы в сельском хозяйстве".(Тезисы докладов IV всесоюзной научной конференции Пущино,январь 1992.) стр.89. О 2. Горленко М.В.Дифференциация "почвенных микробных сообществ с помощью мультисубстратного тестирования.//Тезисы конференции молодых - ученых "Современные проблемы почвоведения н экологии" Красновидово,1993. Ф 3. Горленко М.В.,Кожевин П.А. Дифференциация почвенных микробных сообществ с помощью мультисубстратного

тестирования//Микробиология, Т.63 Вып.2, 1994,стр.289-293. О 4. Горленко М.В. Рабинович Н.Л. Чернец C.B. Изучение микробной сукцессии в дерново-подзолистой почве с помощью мультисубстратного тестирования.//Тезисы конференции молодых ученых ' "Современные проблемы почвоведения и экологии" Красновидово, 1994.