Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДИНАМИКА РАЗЛОЖЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В ПОЧВЕ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДИНАМИКА РАЗЛОЖЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ В ПОЧВЕ"

ЫИЖОЭСИШЙ ОРДША ЛЕВИНА, ОЩВНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВСЛЕЦИИ И ОЖШЛ ТРУДОВОГО КРАСНОГО зншвш ГОСУДАРСГВШНЫЙ УНИВІРСИТЕТ ИЫВНИ M.B.IQUOHOCOBA

МШБГВГ ДОЧВОЩЩМЯ

На правше рух отгон

УДК 631.461

БЛ1ГОДАТСКАЯ BHTWHHff WDffiFHHTM

ЛИШИШ РАЗІШНШ ЦВШЖШ В ШЗДЕ -, Смцншность 03.00.07 - мккробжиіогжя

АВТОРЕ!ВРАТ лоовргацп ш соискание ученоЯ отелен* ханвдатя бкикздпмли шук

МОСКВІ - 1989

^ " ■ ■ ■ > —

■ \ .'■ Работа выполнена ; на кафедре биолсщш дочв ■■■Vг'^^.ТЧ факультета почвоведения Московского государственного > : ■■':. университета имени II.В.Ломоносова

Научные руководители! доктор биологических наук: ;

' Н.С.ПАШКОВ, ' : : ; ' :

. кандидат биологических наук ' ■■"'.:"■'.'.■ доцент И.В.АСЕЕВА

: Официальные оппоненты: 'доктор биологически! наук V:;- В.Ы.ГОРЛЕНКО, '

', •' . ■ '■; : "' кандидат биологических наук '..'■■ ■ "

... \ Л.1.ВЕЛИКАН03 " 'Г-- :; .■ ''

; Ведущая организация: - Институт биасиши а физиологии /

МИКрООргаПИЗМОВ АН СОСР Д V" Ч ■

Защита состоится 1989 г. ва:ааседанпк спе-г

циалиэированного совета К.053.05.86; в ЩУ имени М.В.Ломоносова - -в аудитории М-2. V . ; ' "Д

С ' диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке факультета появо. ведения МГУ» . ■■.' / , :■■ Д. '. Д-. '. '' '. Автореферат раэоолая п1$ " гХсТЛ&^Л} 1989 г»

V Приглашаем Вас ^ принять участие в обсуждении днооертации аа заседании специализированного совета, а отзывы на автореферат в 2-х экземплярах прооим направлять по адресу; ІІ9899 , Москва, ' Ленинские горі, ИГУ, факультет почвоведения. Ученый совет.

';■■ ;■'*.' Учений секретарь ■■/■■■' ■' 47; ■ л, 7; ■'■ ■

специализированного совета • ■ - ■':. И.П.БАЕЬЕВА

'л.--*'

:.. " л- • - • г • • ; * •• : ••*•

Актуальность" проблемы. Разложение растительного. опала играет первостепенную роль в формировании таодородпя почвы, приводит к мобилизации элементов минерального питания растений, обеспечивает енергией функционирование гетеротрофных почвенных '. микроорганизмов. Основным растительным полисахаридом является целлюлоза. Разложение её микроорганизмами - наиболее крупный по масштабам процесс, связанный с круговоротом углерода в природе (biuagdahl, Eriksson, 1986).

>". Скорость микробиологического разложения, цедлилозыв разных почвах и в различных условиях неоднократно использовалась для -характеристики биологической активности почв и для оценки почвенного плодородия (tes«rova, I9S4¡ Gulyas et al., I984-). Однако до сих сор разложение целлшозы в почве изучали по отдельным показателям - убыли массы целлюлозного образца (unger, 1966 ¡ Gamal KL Din, 1976 ) > накоплению цщццдрвн-под сжит ельшх соединений (Мишустин, Петрова, 1966), динамике выделения С02 (Афремо-ва, 1965; Bzegi, 1988 ) увеличению биомассы микроорганизмов ÍEÜrensen, 1985 ) И Т.Д. ■ ■ ■■ _

Целостные представления о процессе трансформации разлагаемого субстрата практически отсутствуют, остаются неизвестными механизмы регуляции гидролитической активности микроорганизмов, причины замедления деградации полимеров в почве.

Наиболее перспективным для комплексного изучения процесса микробиологического разложения целлюлозы в почва является кинетический подход.:Он предполагает сочетание экспериментального изучения и математического моделирования процесса (Пашков,1988).'

Цель шботы. Выяснение механизмов разложения целлюлозы в почве путем изучения кинетических закономерностей процесса. \

Задачи исследования. I. Разработка и совершенствование методов регистрации процесса разложения целлюлоза, включая опреде-/-/2Р?

"iVT-i»

¡ J С я i. и L .. .. J. ' L • 4 1 • V . .

.ление биомассы микроорганизмов, количества продуктов деполимеризации целлюлозы искорости окислений мономеров. 2. Изучение динамики разложения 14С-цедлшозы в почве, с учетом включения мет-; кн в состав микробной биомассы, а такав во фракцию мобильных водорастворимых соединений. 3. Изучение динамики микробной биомасса и качественного состава микробного сообщества в ходе сукцессии, инициированной целлюлозой. 4. Изучение процесса разложения целлюлозы в активности целлшолитических микроорганизмов в полевой опте'с различншли вариантами обраб отки: почвы.

-Научная ровиэна. Впервые на основе метода радиоизотопыого ' разбавления определены показатели гетеротрофной активности микробного сообщества в процессе разложения целлюлозы в почве; рас- . считана потенциальная скорость минерализации продуктов деполимеризации целлюлозы у110*, время оборачиваемости субстрата т. и

* " *

его содержание непосредственно в почве (к^ + й^)( оценено в динамике включение углерода целлюлозы в микробную биомассу;

Практическое значение. В практику фундаментальных и прикладных исследований по микробиологии и биогеоценологии рекомендовав метод кинетической характеристики микробного сообщества почвы, а также регидратациощщй метод определения микробной биокассы в почве с использованием радиоактивного-углерода для определения коэффициента пересчета. Материалы диссертации используются вкурсах лекций по биокинетике и в практических занятиях студентов кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ.

. Дттробят^шт работ». Результаты исследований были, доложены на УШ конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ (Ысюква, 1935), а также на заседаниях кафедрн биологии почв МГУ (1936, 1987, 1939).

■Г^.тпг^трга. Материалы диссертации изложены в 5' работах.

2 ' " ' ■'

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, 2 глав, заключения и выводов, содержит . fIZ страниц машинописного текста, ¿3 рисунков, Z таблиц и список литературы из (V^названий (пз них *$S~ - зарубежные). .

овшта и шподы изоддршшя /

В работе были использованы образцы светло-серой лесной почвы пса озимой пшеницей, отобранные с глубины 0-10 см (вариант полевого опыта с повершостной обработкой почвы без внесения удобрений,' опытно-полевая станция КПСС Ш. СССР, г* Пуцино, Московская обл.). Сразу после отбора образцы почвы освобождали от корней, просеивали через сито 3 мм и использовали для инкубационного эксперимента или. высушивали при комнатной температуре и до начала опыта хранили в воздушно—сухом состоянии.

Чистые КУЛЬТУРЫ микроорганизмов ArthXOtacter globiformis 94- A, Pseudomonee fluoresceins 1^72, Penicillium verruooeum, var opium вкм у263 были получены из коллекции кафедры биологин почв и ЕГО! ИБО! АН СССР. Бактерии выращивали в периодическом режиме на синтетических средах при 25° на качалках (180 об/мин) (Бондаре нко и др., 1985). Для получения меченой биомассы микроорганизмов в среду (u)-d -глюкозу в количестве 2 мкКи/50 мл. \ Титнтпга постановки экспериментов и аналитические методы. Для.изучения динамика разложения целлюлозы в потау вносили следующие субстрата: фильтровальную бумагу, целло|аа или микрокрис-т&шшчесвуп i.vie«l -целлюлозу в количестве 1-10 кг/т почвы, а такке ^С-целлплозу в количестве 2,5 мкг/г почвы о активностью 0,4 мк Ки. Ылнераляые солж вяосмн в почву в процессе инкубации-в следуладс количествах (мг/г почвы): <нн4) 0,94; KHgPO^ -- 0,88:' кгзо4 - 0,87, Оботаденную субстратом почву пснвщали в количестве 1-10 г в стеклянные флаконы еикосгьв 15-100 мк ж жнхуби-: - .5 ' ' , " " .

ровади при 20°С в термостате, поддерживая влажность на постоянном уровне (22 вес.;?). Исследовали динамику следущих параметров инїєнмшность дахания почвы по скорости выделения 00^ метсщш газовой хроматографии, количество растворимых органических воде с тв в водной вытяхке из почвы - датодои бихроиатвого окисления (Пашков и др., 1987), концентрацию глвкоэы - о глгаозоокои-даэой и пероксидазой (Щербупш и др., 1975), a также углерод микробной биомассы - разработанным нами репшратационным методом (см. nose).

учитывали, продувая воздух через поглотитель о К0Н, или после абсорбции на бумаге, пропитанной феншгетгдашном. Определение радиоактивного углерода в водной вытяхке проводили после центрифугирования потаи с 5 мл ваш при 508 ч в течение 15 кинут. „Лликвоту (0,1 мл) жидкой фазы или кусочек бумаги офе-нвдэтиламином помещали во флакон с 8 ви сцинтхшищионноЗ жлдкоо-тя следующего состава (г/л): толуол — 700, этанол — 300, 2,5-ди-,феннлоксазол*-4, 1,4-ди- С 2С5-фенилоксазолил)] -бенэен — 0,2, а затеи определяли радиоактивность на жидкостных; счетчиках si -40 ("lutertedmlque" франция) или Eeckmaa -100 (США).'Количество целлюлозоразлагавдшс микроорганизмов в почве учитывали методом . цредельныг разведений на жидкой среде Гетчинсона (иет<эдг почвенной микробиологии, 1979).

Биомассу одхроорганизмов, использующшс опре-

деляли регидратащюнным методом путем высушивания почвы при 70° в течение 24 час. с последующей регидратацией и определением ^с в вытяжке (Едагодатский и др., I9&7).

Иияробные пейзажи сообщества, развивающегося на целлюлозе -(целлофан, фильтровальная бумага), изучали на морфологическом уровне с помощью сканирующего электронного микроскопа gsm-2 (Япония). . ; ' ■ 4

Гетеротрофную активность микробного сообщества определяли методом Вайта-Хоббй ( Wright, н<ял1е,Х9бб), адаптированном нами для почвенных условий. В почву вносили серию концентраций глюкоэы (от 10 до 200 шсг С/г почвы), определяли в динашке скорость выделения ^CQg ж рассчитывали следующие кинетические параметры (потенциальную скорость окисления vmax , время оборачиваемости' естественного субстрата и количество доступного субстрата в почве) со модифицнрованному уравнению ЫихЕэлиса—Меятен •

Статистическую обработку результатов (дисперсионный, корре- . ляционннй и регрессионный анализы) и численное моделирование , провешил на ЭЕМ ЕС 1010 с помощью диалоговой системы "Диана" . (Комаров и-др., 1985), а также на персональной ЭШ Ш-0010.

• РЕЗУДЬТЩЦ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Разработка методов изучения разложения целлюлозы в почве

М^уод определения иикшбяой биомассы в почве. Дня количественной оценки микробной биомассы вами бил предложен регядра-, тадионный метод определения биомассы микроорганизмов в почве (Даников и др., 1987) с определением коэффициента пересчета, основанном на включении метки С в почвенные микроорганизмы in situ . Для этого в почну вносили низкие дозы ^С-глюкозы, которая быстро (за 6 ч - на 85-90J6) потреблялась микроорганизмами. При этой часть метки включалась в состав клеточного вещества, а оставшаяся часть выделялась в виде COg. Пля. нахождения К-проводили измерение радиоактивности, которая переходит в волней раствор после шсушжванЕЯ почвы (пв), а также остаточного количества 14С в дата после удаления водорастворимых веществ ( а0 ). Пере-счетньй коэффициент Крвсочитывали по формуле:

, ■: 2-яр,? .■:■■■." г. s, , .., •./

Джя контроля меченую глвкозу вносили в стерильную почву. При

этш'драхтически.вся внесенная глвкоза переходила в водный раст- -

вор. Коэффициент пересчета''К для регидратационного ив хода оказад-

в среднем равным 0,25 (табл." I). \/ -'Vr''."'^v'V^V'^V-v'-

. С:":' ■.''■ --■V'- '"vv : Таблица I

Определение коэффициента'пересчета винкубационнои' / ; ' : '. эксперименте с "С-глюноэой . . ':

Время -{Содержание 14С в { Остаточное . ! - • 1 • * • • . " -■■■'.'■■ инкубации Jводной вытяхке - j содержание , ■ ■ К ■■-■■. -ч..

Ч ; после выстония 14с { По)

-;■■-■■ - ■ > ) tab), ими/мин : {шш/мин - ■ ,- i - - - - -1ч 5П10 -V--.)^ Ш122 • 0,28 . ' ; 6 • • 61787 • • 126299 / 0,33 • • ' . • 28 G2342 4 227253 "о,22"' 'Л: 72 • 40068 - I969I9 0,17 -

Щи доследовании процеооов трансформации меченых органиче-; ' ских суботретов, внесенных в почвенные образцы.-бшю показано, : * чтов наше условишс: не ^существовало избирательности, в потребле- -нии меченой И кешченоГгЬжозы-датаешшыи микроорганизмами. Кро-не.того, соотношение меченого и немеченого углерода в выделявшемся из ' почвы СС*2 соответствовало соотношению^С; и ^С во, вяо-

■ - самом в почву субстрате. :V; - • ' ■"','■■■

Пшменение метода Райта-Іобби для характеристики микробного ; уорбщеотва почрі. ■ Для изучения кинетические механизмов разложе-' нвя целлюлозы почвенными микроорганизмами нами был использован -иетод ЕаЙта^-їобби, основанный на принципе изотопного, разбавде-',.

и изучения зависимости скорости минерализации субстрата.от ' .'-дозы еговнесения в почву (А). Эта эаввсимостьподчивяется кине-

■ тике Шссаэлдса-Ментен. Метод позволяет оценить изменение таких ■ ' -.■^важных показателей функционирования микробной популяции, как

.максимальная скорость окисления (v®®* ) и время ÍTt), необходи-ше ддяполаой минерализация субстрата в необогшценной глюкозой □отве. Эти параметры определяли-по уравнению:

ь . к* + . - <2) -

■ у _ уМ* ,

где: V - скорость выделения "^Cí^í sn - концентрация о кисля е- ' мого субстрата в необогащенвой почве; ss - суммарная концентрация "почвенного" и внесенного субстрата• (se = + ж); ка - кон-, станта, равная концентрации субстрата, при которой скорость минерализации равна 1/2 v™8* , a rt - время оборота оуОстрата в необогащениой почве (т*. = (к + )/ V1®* ), Действие метода

V -О и •

Райта-Хобби в условиях почвы иллюстрирует следующий _ опыт. Зависимость интенсивности выделения I4C0g.от,концентрации вносимого субстрата определяли в неойогащенной почве, увлажненной за 3 дня до .опыта, и в почве, в которую эа 3 часа до определения было внесено 200 мкг глюкозы. Иными словами во второй случае ш изменили концентрацию субстрата ss и предположили, что это повлияет . и на остальные параметры гетеротрофной активности микроорганизмов. Действительно, во втором случае значение гетеротрофного потенциала достоверно увеличилось с 2,10 до 2,44 мкг С/ч, что характеризует возрастание микробной активности (рис. I). Величина времени оборачиваемости irt возросла примерно на порядок по . сравнению с неойогащенной почвой. Это можно объяснить увеличением количества субстрата при незначительно изменившейся максимальной теоретической скорости минерализации v®" . Показатель (ке + sn), определяющий количество доступного субстрата, увеличился с 8,5 до 86,5 мкг С. Величина, на которую возросло значение (Ke + Sn), тактически совпадает о количеством внесенной глюкозы — 80 мкг углерода. На основании проведенного опыта мохно сделать вывод о том, что метод Райта-Хобйи вполне приемлем для

s/v, час

Рис.1. Показатели гетеротрофной активности микроорганизмов в необогащенной почве (I) и в почве после 3-х часовое инкубации о 80'мкг 12С-глюкозы{2).*

.*■■'-■ характеристики состояния in situ , микробного сообщества почвы -участвующей в процессах; минерализация легко- ■ труднодоступных органических субстратов. ■.;"^

Ошт из м»™- вопросов наше! работыбшюуотановлениедиа-' -У'оазона концентраций вносимой в почву глюкозы,в котором применим ; метод Райта-Хобби. В почву вносили от 10 нхг до 5 ыг глюкозы/г ; -| почвы, в интервале от 10 «кг до 2 мгглюкозы/г почвы зависимость • ~ скорости выделения. (Х>2 от концентрации субстрата подчинялась ки- -1 ■ нетике Михаэлиса-Ментен (рис. 2А), а в координатах ^ /з - ад- С • ' - _ проксимировалась прямой у = 8,5 > 0,27 х" с коэффициентом корре- ~ v _ . ляции г» 0,999 (рис.* 2Б). Можно заключить, что в этом диапазоне, : концентраций потребление субстрата микроорганизмами идет по типу активного транспорта.: Что касается значений, s/v для более высоких концентраций глюкозы, то- соответствующиеатим;.значениям.точ-ки лежали. ниже; рассматриваемой прямрй {рис. 2Е). Это свидетельств ' вуето кинетической^гетерогенности микробного сообщества почвы и ' о существовании'в интервале высоких концентраций'субстрата дру-.• гих типов.транспорта; возможно,' таких как облегченная или пассив^ -■■ ■ лая диффузия. ':'■ ■ [S'i'y - ' ~ "

:" 2. Динамика разложения целлюлоза в почве_:} • ■; 1" :

•В наиболее общем виде механизм разложения целлюлозы может ;;^ . , бш'ь представлен блочной-схемоЗ, изображенной на рис. 3. Под

. . действием целдюлаэ полимерная кристаллическая целлюлоза распада-■", ётся до ннзкомолекулярных фрагментов -;олиго- и моносахаридов, : , ' часть которих потребляется микроорганизмами с образованием:внут- ■". , ^ . риклеточных веществ, и часть выделяется в ниже С02- Количество - ■.'-* цедлюдаз зависит от- количества микроорганизмов и от.условий их ; v ; ■ .роста, в частности, предполагается, что синтез'целлюлаз может ■ репрессироваться шносахаридаш^ Мгороадо-анизмы, вырастающие на.

2-по? .д. :■ .у-'.'■■

500

200 -

100

S ,мкг С/гв

№. 2. Зависимость скорости ввдеденжя І4С02 от концентрации

. вносимой в почву глюкоза, і - первичные экопвргмвнталь-ныв данные. Б — ех представление в линеаризующих координатах. ,

целлшозе, впоследствии отмирают окисляясь »ндогенно до СС>2, либо выедается хищниками. Часть внутриклеточных веществ превращается микроорганизмами во внеклеточные метаболиты, которые могут рассматриваться в качестве исходного субстрата процессов гумификации.

Рис. 3. Схема превращения целлюлозы в почве под действием . микроорганизмов

В наших исследованиях мы применили системный принцип ' анализа процессов разложения целлюлозы в почве: изучали разные, блохи приведенной схемы, а затем обобщали полученную информацию.

Динамика микробной биомассы - ключевого блока схемы {рис.3), была прослежена в процессе разложения 14С-целлщозы, вносимой в почву^при помощи .регвдратационкого метода (рис.4, кривая 3). '

Увеличение микробной биомассы, обусловленное утилизацией продукту

тов разложения . С-целлюлозы, становилась заметным на пятые сутки опыта и - достигало максимального значения на девятые сутки. В' течение последующих двух месяцев эксперимента количество микробной биомассы монотонно снижалось. В составе биомассы микроорганизмов в ходе разложения обнаруживалось от 13 до 56£ углерода разложившейся целлюлозы (на 9-е сутки опыта). Выход биомассы X ,

сутки*г п.

.3.

150.

' ' ' —--------- ■ —

Ю 20 30 40 50 60 - 70сутки Еис.4. Динамика разложения целлшозы в серой лесной почва:

X - количество выделившегося 14С02> ■ 2 - скорость образо— вания^Ц,; 3 - в составе биомасса микроорганизмов; 4 - тс водорастворимой фракции; 5 - остаточное cosejaa-■ вне "*С-целлюлозы.

рассчитанный как отношение меченого углерода, включившегося в биомассу микроорганизмов, - к количеству разложившегося субстрата (определенного как сумма ^СО^* в микробной биомассы), был довольно высоким в начале опыта 0,50-0,56 г С биом./г С оубстр. Затем к 20-м суткам величина к сндаалаоь до О.Зб , к 28-м.— до 0,26 и к 70-м - до 0,13 г С биом./г С оубстр. Такое изменение величины экономического коэффициента у на поздних стадиях разложения целлюлозы свидетельствует об уменьшении биомассы микроорганизмов, растущих на 14С-цедлюлозе, и о наличии процессов реутани-

14

зядпя С, включившегося в микробную биомассу*

Для изучение качественного состава микробного сообщества, разлагающего целлюлозу, был проведен инкубационный опыт свнесе-вием в почву целлюлозы в форме фильтровальной бумаги и целлофана. В ходе инкубации исследовали микробные пейзажи о использованием электронного микроскопа (рис. 5). Суммируя наблюдения, можно сделать вывод о том, что частицы внесенной в почву целлюлозы довольно быстро колонизируются грибными гифами, ■ максимальное количество которых приходится на 10-25 сутки (что совпадает с данными, полученными о помощь» регидратационного метода). В период с 18 по 25-е сутки наблюдается обильное спороношение грибов и акти-номицетов, появление на грибных гифах большого количества бактерий, затем плотность мицелия уменьшается. К 105-м суткам появляются бактерии, развивающиеся непосредственно на волокнах целлюлозы, накапливается большое количество кристаллов, которые, вероятно, являются продуктами деградации целлюлозы.

В параллельной серии опытов о микрокристаллической целлюлозой была определена динамика потенциальной дыхательной активноо* . .; ти , которая дает информацию о размере и активности микробной популяции, потребляющей субстрат. В ходе разложения цеддюло-

п.

V I

V

суток..

Рис.5. Вазвитде иикрооргализмов в почве после внесения целлюлозы; А - иикробдае пейзахи, л' , Б - «Зноиасса иакроорганиэыов (регвдратационныЗ-метод), В - потенциальная лнгдтулькяя активность микроорганизмов.

зн значение тг1®8* увеличивалось более плавно, чем количество микробной биомассы, определенное регндратацяонным методом, и до-, стигало максимального значения 7,1 мкг С/ч на 1±-е сутки инкубации. Характерно, что повышение активности микробного сообщества происходило уже'в перше четверо суток опыта, когда количество биомасса микроорганизмов не увеличивалось (рис.5), С 10-е по 14-е сутки опыта активность микроорганизмов, разлагающих целлюлозу, снизилась белее, чем в 4 раза, в то время как резкого' ' снижения микробной биомассы не наблюдалось.

В следущем разделе целесообразно рассмотреть динамику со-; " держания р по^ре ддиго- и моносахаридов - продуктов разложения целлюлозы (рио.З).

Об изменении доли углерода глюкозы в составе водорастворимого уг- . лерода в процессе деполимеризации целлюлозы ыохно судить, сопоставляя данные, полученные о помощью глюкозооксидазного метода и метода бихроиатного окисления. Эта доля резко уменьшалась - от 1/4 в начале ошта до 1/15 на 4-е сутки опыта, затем постепенно увеличивалась, и к концу опыта содержание углерода глюкозы составляло примерно половину от суммарного количества водорастворимого углерода (рис. 6).

' Динамика показателя (К6+ ад ), который отражает содержание в почве доступного оубстрага, совпадала с динамикой содержания глюкозы, исключая первые "две недели опыта. Величина этого показателя была максимальной на,4—е и минимальное на 14-е сутки инкубации. Величина ка , определенная в начале я конце опыта, имела низкие абсолютные значения (0,9-3,0 мкг С/г почвы). Это позволяет считать, что (к8+ еп ) *» Несовпадение динамики содержания глюкозы и показателя (кв+ в^ в течение первых двух недель можно объяснить тем,' что' по методу Райта и Хобби определяется суммарное количество продуктов деполимеризации целлюлозы, .включая не толь- -

15

-.л ■ V"'-"■■ • . сутки

- Рис.6. Динамика показателей гетеротрофной' активности микробного , ■ V : сообщества почвы в процессе разложения, целлюлозы: . *

I - .водорастворимые органические вещества (бихрокатный \ метод); 2 - глюкоза'(глюкозооксидазный метод); Э - сумма ' - ' константы насыщения в содержания легкодоступных органиче- ';

; ских соединений в ночве; 4 - ТГ'Ч'АИТИГУП-НП^ Ц<1КСТТМЯ.ТЬНЯЯ Х > '"V ■ скорость окисленин субстрата;-5 - время оборачиваемости / -■ • субстрата; 6 - скорость выделения С02 из почвы. ; ! т -V ■

ко мономеры, но к одвгомеряые соединения, а таете продукта катаболизма глюкозы.

Динамика содертания водорастворимых продуктов деполимеризации била также прослежена после внесения в почву 1<*С-целлюдозы (рис.4). Количество водорастворимого 14с было довольно низкам 0,2-2 нг С/г почва, на 20-е сутки наблюдался локальный размытый максимум. Содержание в водорастворимой фракции составляло 0,1-1? от внесенной целлюлозы, что совпадает о результатами одре-деленкй в опыте с домеченной целлюлозой.

Еще сдвой важной зарактеркстакой процесса депмгимеризяцгзг целлюлозы в почве является дтааюоса выделения <Хи. Как видно из рис.4, скорость выделения 14С02 (кривая 2) в первые сутки после внесения.в почву меченой 14С-целлюлозы бола высокой (около I ВТ 14с/сутет г почвы), достигала максимального значения (3 нг 14С/сутви г почвы) на девятые сутки опыта, что совпадало с максимальным содерианием ^С в биомассе микроорганизмов. Затем интенсивность духяяш почвы довольно резко снижалась (к 20-ы суткам почти в 6 раз) я в последние 40 дней опыта оставалась на одном и том же низком уровне (около 0,2 нг 14С/сутки г почвы). Всего за -70 суток в виде

шделилось 18-20$ от внесенной целлюлозы.

Следует отметить, что динамика интенсивности выделения ^СО? после внесения в почву меченой целлюлозы качественно в количественно совпадала с динамикой выделения из почвы "^СС^ в процессе разложения микрокристаллической Ж?1се1 -целлюлозы, фильтровальной бумаги г целлофана.

Б^ла^овая опенка дропеооов разложения реллшоэы в поч^е.

На рисунке 4 представлены результаты изучения разложения 14С-цедлшозы ш четырем динамическим переменным: количеству С02 (р) содержанию одито- и моносахаридов (т ), биомассе минроорта-

низмоа (х) я остатку неразложишейся целлшозы (в ). В составе , продуктов деполимеризации целлшозы не удалось обнаружить летучих органических соединений (таких как летучие жирные кислоты и углеводороды). " '

" Для проверки правильности измерения динамических переменных . было использовано уравнение материального баланса по ^С-углероду: х + В + И + р » о . Сз)

При переходе к конечным разностям уравнение (3) приобретает с начальными условиями г = О, а , следующий вид (величины Б > Ш . х и р выражены в ед. нт почвы):

3 » - (д + О + р) (4)

Путем подстановки в уравнение (4) конкретных численных значений переменных х, ш и р , был построен "теоретический" ход кривой . шдения остаточного оедехжания целлюлозы (рис. 4, кривая 5). Вполне удовлетворительное согласие с экспериментальными определениями свидетельствует л.достаточно точном и полном учете всех динамических переменных на протяжении всего срока эксперимента.

За весь исследуемый период (70 суток) разложении подверглось 25-305? 14С

внесенного субстрата. Остальные 70-75? целлюлозы, та- ■ кии образом сказались труднодоступными микробному разложению.

Для того, чтобы выяснить причина низкой доступности целлвло— зы, были поставлены дополнительные лабораторные опыты по сравнению згккдщгки разложения целлилоэы в свежих я предварительно высушенных образцах почвы. Результаты этих опытов, показывают, что . цеддплозоразрушагщая активность предварительно высушенной почвы в 3-4 доза выше по сравнении со свежеотобранной почвой.. За 60 суток опыта в свежих образцах почвы разложилось 12% ^С-целлюлоэ ы, а в предварительно высушенной — 42%, Это явление стимулирующего действия высушивания-увлажнения уже было описано в' отношении раэ-

жжения целлюлозы (іфремова, 1385) и крахмала в почве/ййов, \ 1985). Оно'связывается с тем," что в свежей почве микроорганизмы-;^ -гидролигики пребнвают в"репрессированном состояния, причем в ка- Л честве рвпрессоров выступают такие продукта гвдролзза растнтель-нкх полимеров как глшоааі. - Высушивание с последующим увлажнением приводит к явлению дерепрессш синтеза, гидролитичесжшс, феріентов - • , н ускорению разделения целлюлозы. Результаты наших исследований/ "■,"' в частности, динамика ■ и 8,(рис,4) свидетельствуют в польз; : : 7 этого првдполокения.Бсяее того, необратимой репрессией синтеза -целльлаз можно объяснить замедление распада целлюлозы, которое: ' I наблюдается в предварительно высушенной почве'о 10-х суток' опытам.

Нами была исследована возможность снятия репрессии синтеза " целяюлаз путем внесеная в почву солей азота, фосфора и калия после того как прсщесо .разложения целлюлозы в ней практически црек- ' радвдея." Растворы минеральных содей вносили в почву через 59 суток инкубации, когда в виде 14С02 выделилось 20-25? 14С-целшло-: зв. Через 4 для скоросп выделения возросла в 5-7 раэ, прі- ."

чем наибольший эффект дало совместное внесение солей азота, фосфора и калия, а самый низкий еффект. наблюдали после внесения калийной с<шж. Важно у отметить^ скорость выделения 14С02 после .-■■■ совместного внесения минеральных осяей была выше, чем в других -вариантах даже на 150-е сутки инкубации* Высушивание и. последую- . . цее увлажнение почвы; проведенное на 198-е сутки опыта, также1 привелов кіатковреиенному увеличению интенсивности выделения

В результате веек проведенных обработок в виде 14С0я выделилось дополнительно всего 5-7ІЇ от внесенной С-целлтоэы. :Еоли 7 учесть рассчитанный ранее экондашческий коеффшшент (ї = 0,13- ' -0,56 г С биои./г С субстр.) , то окажется, что разложению под--верглось лишь 40-50^ внесенной целлюлозы.' : - ': Д1

- Для того, чтобы глубже исследовать механизмы процессов, ; , ' ,

протекающих во время разложения целлюлозы в почве, ваши был применен метод Райта-Хобби. Динамика содержания доступного субстрата (ка+ вп ) и максимальной скорости минерализации v®31 была поз-, робно описана в предвдущих разделах. Здесь мы хотим обсудить как комплексное определение э гшс показателей помогает расшифровать механизмы процессов, протекаицих в почве.

Время оборачиваемости мономерного субстрата Et , то есть вр»^ мя, которое было бы затрачено ва полное-его потребление микроорганизмами цри отсутствии возобновления, достигало максимального значения на 4-е сутки опыта (рис. 6, кривая 3), что соответствовало максимальному содержанию продуктов разлогения целлюлозы (к + ). Затем значение т./" падало, но более резко, чем (к+s_)

8 Д - . v в &

- (на 7-есутки) - почти в два раза. Вероятно, это произошло в связи со значительным увеличением в эток промежуток времени величины максимальной скорости минерализации увах , характеризующей количество активных микроорганизмов. Время оборачиваемости оставалось, довольно низким до 25-х суток опыта и вновь возрастало к '40-м суткам. Это соответствовало накоплению к сороковым суткам глюкозы в водорастворимой фракции, увеличению значения (ка+ ви ) на фоне невысокого и уменьшающегося значения у®8*-. Резкое падение интенсивности выделения С02, происходящее о 10-х во 20-е сут-ки,инкубации, нельзя объяснить только уменьшением количества микроорганизмов (рос. 6). В действительности на фоне относительного постоянства суммарной биомассы обнаруживается быстрое снижение максимальной скорости-окисления у*8* , которое происходит с II-i по 14-е сутки опыта {рнс.6, кривая 2). Это свидетельствует о возможном переходе части микроорганизмов в состояние спор, что подтверждается прямой микроскопией частиц целлюлозы (pie. 5). Ва 4-е сутки после высушивания.и последующего увлажнения почвы -

скорость выделения СО^ увеличилась в три раза, а содержание водорастворимых органических веществ ( ка+ еп) уменьшилось с 37 до 7,8 мкг С, т.е. регидратадня приводила к быстрому потреблению на-копжвшихся продуктов деполимеризации целлюлозы. Величина времени оборачиваемости в связи с этим также уменьшалась почти в 2 раза, ■ Огнако величина и®"* {равная на ;40-е сутки опыта 3,5 мкг С/ч) снизилась к 4-и суткам после высушивания до 0,91 , а к 11-м суткам - до 0,2 мкг С/ч. Это говорит об уменьшении количества активных микроорганизмов, разлагающих субстрат, что подтверждается до. вольно резким увеличением времени оборачиваемости ва 11-е сутки после высушивания, несмотря на продолжающее снижаться значение

К* V-' '■■'■■ , / . ■" ... „ -

Таким образом, можно заключить, что высушивание-увлажнение почвы, длительное время инкубировавшейся с целлюлозой, стимулирует" не деполимертзацию, а усвоение ранее накопившихся мономерных продуктов, т.е. происходит снятие лимитирования роста микроорганизмов субстратами конструктивного обмена без увеличения активности гидролитиков.

3. Целлюлозоразлагающал активность почвенных микроорганизмов в полевом опыте ва серой лесной почве

Результаты определения целлюлозоразлагающеЗ активности в образцах почвы, отобранных в разное время в течение вегетационной го сезона, показали (ряс. 7), что интенсивность разложения целлюлозы была значительно ниже в образцах, отобранных в мае, чем в конце июня. Эти данные подтверадаются результатами учета численности целлюлозоразргушаицих микроорганизмов,* количество которых в конце июня было на несколько порядков выше, чем в мае. В конце апреля на варианте.с глубокой вспашкой количество анаэробных целлюдозоразлагатедей било ва 3 порядка выше, чем аэробных. Ве-

.поверхностная отвальная обработка вспапка !

4400

поверхностная отвальная обработка вспашка

4800 '

19

1600 I I

I

7600

М А Й.

ИЮНЬ

и »10

1

40-60^

п. 10е

1

5£

МАЙ

(инкубация 60 суток)

_ ' ИЮНЬ

(инкубация 30 суток)

.Рис,7 Сравнение интенсивности разложения .14С-цадлкозн в голевых ■ и модельных опытах: количество выделившегося ^СОо в имп/мин - I, растительная биокасса в ц/га - 2, количество разложившейся цёллшозы в % от внесенного в свежей (3) к ' ; в высушенной и увлажненной .почье (4), количество целлшело-■ - ,: разрушающих микроорганизмов (о) в клетках "в сй!3''влага'1оЯ' 1 почвы. . .■.'■.'.■'■■..; ■ ..-- ■ - . .

роятво, это связано о высокой влажностью почва в начале вегетации одного сезона. Затем с уменьшением влажности почвы целлюлолитиче-ская активность'анаэробов уменьшалась, а аэробов"- увеличивалась н .достигала максимума в начале июня, затеи происходило довольно резкое снижение количества аэробных микроорганизмов в увеличение количества анаэробов. Возможно, это связано с повышением влаянос-ти почвы после осадков.

В полевом опыте было изучено также влияние механической об- , работки почвы (поверхностная и традиционная - глубокая вспашка). на скорость разложения ^^С-целлюлозы. Результаты показали, что на делянках с глубокой вспашкой и с большим количеством зеленой массы растений цеддшозораздатающая активность была примерно в 2 раза выше, чем ца делянках о поверхностной обработкой почвы и меньшим количеством растений.

• швады - ■ /

1. Разработана система методов регистрация процесса.разложения вносимой в. почву.целльлозы с использованием меченых и немеченых субстратов. Она включает: регидратационный метод определения микробной биомассы с более простым способом калибровки по измерение скорости выделения С0£ и остаточного содержания полимерного субстрата, а также количественный учет продуктов деполи-, меризации целлюлозы на основе прямого определения и принципа изотопного разбавления. Произведен учет основных слагаемых материального баланса углерода в процессе деградации целлшозы. .

2. Определены условия применения для почвы кинетического подавда в сочетании с методом изотопного разбавления. Установлен диапазон концентраций продуктов деполимеризации целлюлозы (на . црпмере глюкозы), в котором потребление вносимого в почву субстрата подчиняется кинетике Ыихаэлиса-Ментен. С помощью этого под-

■■ V • 23 ■'. '■ "

хода оценена потенциальная скорость окисления У*** , вреия оборачиваемости it и содержание se легкодоступных субстратов в не-обогащеяной почве; Прослежена динамикавтих показателей в продео-се разложения' целлшозы. '

3. С наибольшей скоростью разложение целлюлозы протекает в первые 2 недели после внесении субстрата в почву. Этому периоду соответствует максимальное включение углерода ц&йлелозн в биомассу микроорганизмов (т •> 0,56 г С биомассы/г С субстрата на 9-е сутки) и интенсивное развитие грибного мицелия. Затем процесс деградации целлюлозы замедляется, награбит: гв$ах появляется большое количество бактерий, плотность грибного мицелла уменьшается и наблюдается переход грибов н актипомицетов к обяхьпому спорообразованию. За 70-150 суток опыта разложению подвергается от 25 до 50$ от внесенной целлюлозы. На первых стадиях микробиологического процесса высушивание-увлажнение аяитняирует разложение целлюлозы в 3-4 раза по сравнению со свежей почвой.

4. Мехшшям разложения целлюлозы в почве можно охарактеризовать следующим образом: полимерный субстрат индуцирует синтоз целлюдаз, а также рост гидролитиков и сопутствующей микрофлоры, потребляющей мономерше продукты. Исчерпание одного из биогенных злементов (вероятно, азота ш фосфора) приводит к накоплению глгаозы, что вызывает репрессию 'синтеза гшфшштическнх ферментов и переход целлюлолитиков в покоящееся состояние. Под'действием . пула внеклеточных гидролаз происходит, медленное накопление моно-мернюс продуктов разложения целлюлозы, котораа не потребляются ¿з—за дефицита минеральных соединений. Внесение минеральных солей и внсушиванхе-увха&аение почвы на поздних стадиях разложения приводят х мхнервлязации до С02 дополнительно 5-7$ от неходкого во- " личества субстрата. При »том происходит потребление накопившихся

ранее мономерных продуктов» во активность микроорганиэмов-гидро- ' литиков не увеличивается. -

5. В полевой опыте установлена положительная корреляция между скоростью разложения ^С-цеялшозы . in eitu и урожаем растений. В варианте с глубокой отвальной вспашкой целлюлолитяческая ; активность в 2-3 раза выше » чем в варианте с поверхностной обработкой почвы.

ч Материалы диссертации опубликованы в габотах:

1. Динамика разложения ^^С-целлюлозы 'в серой десной почве. Труды ■УШ научной конференции молодых ученых факультета почвоведения

М., 1986 (редколл. Вестник МГУ, пер. Почвоведение, II., ■ 1986, I о. Рукопись деп. в ВИНИТИ, 1986). . ..

2. РегидратационЕЫй метод определения биомассы микроорганизмов

в почве (в соавторстве с Елагодатским С .А., Горбенко А.Ю., Па. никовыы F.C.). Почвоведение, 1987, JI 4, с. 64-73.

3. Способ определения биомассы микроорганизмов в почве (в соав- . торстве о Паниковым Н.СГорбенко A.C., Елагодатским С .А. ).

^ Авторское свидетельство Л 1388802 (51)4 С 01 * 33/48 заявлено ■ 21.03.86. с. 201. ; ; - ' .

4. Динамика роста, микроорганизмов в процессе разложения с-цел-" люлозы в серой лесной почве (в соавторстве с Асеевой И.В.,

Вамсараевым В.Б., Паниковым Н.С.). Вестник ШУ, сер. 17 - Еоч-. - ' воведение, 1988, * 4, С. 44-50. . ' '...■'.'

5. Application оГ Wriebt-Hobbie technique forinve8tigation of , cellulose decompoeition 1л soil (withP«nikoT H. 8.). Ab streets

\ofXth International Symposium on Soil Biology» Нипв*гу»1989.

Поотсаво < пит /(^Й?/У Л- fâSS&vçu*г во* 90/16. . Уся, он. л. ffí* Уч.-иад.л. J 0 Ткраж m «з. Зм*э f*/?£î?

Орлми 'Эм* Почет«* издлт«льс-гю Мое ношеного ^шреп«*, 10300Ô, Моете*, ул- Гс^пмш, 3/7, Тширфя ofKl.Ha 'Звок Почата' ізіиппьспа МГУ, И0&99. Мосжм, Латавші» горы. '