Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, состав и свойства микробных полисахаридов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, состав и свойства микробных полисахаридов"

всесоюзный нлучно-исследовательскип

проектно конструкторский институт прикладной

биохимии

Нз правах рукописи

ДЕРЯБИН Владимир Викторович

УДК 547.4; 577.1; 576.8

ВЫДЕЛЕНИЕ, СОСТАВ И СВОЙСТВА МИКРОБНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ

Специальность 03.00.23 — Биотехнология

ДИССЕРТАЦИЯ

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва — 1991 г.

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии полисахаридов Всесоюзного научно-исследовательского института биотехнологии (Москва).

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

A. Я. ХОРЛИН

доктор химических наук, профессор

И. Л. ЯМСКОВ

доктор биологических наук

B. Д. ЩЕРБУХИН

Ведущая организация:

Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского АН СССР

Защита состоится « </ » . (^Лтргг^л^. 1992 г. в и час. лг^мин. на заседании специализированного совета Д 098.09.01 во Всесоюзном научно-исследовательском проектно-конструк-торском институте прикладной биохимии по адресу: 125299, Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского проектно-конструктор-ского института прикладной биохимии.

Диссертация разослана .(¿¿^/¿¡^■-Р . 199/ г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук И. И. ГУСЕВА

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Несмотря на достигнутые успехи в области биотехнологии микробных полисахаридов, число их, выпускаемое промышленностью, крайне невелико; проблема поиска новых экономичных способов их получения стоит по-прежнему остро. Изучение состава и свойств микробных полисахаридов дает ключ к разработке рациональных методов их выделения, созданию оптимальных готовых форм и композиций на их основе, что в итоге расширяет выбор полисахаридов и области их эффективного использования. Экономические расчеты показывают, что переоборудование действующих предприятий под выпуск микробных полисахаридов вместо строительства новых объектов снижает стоимость производства полисахаридов почти втрое. Соединение этих путей представляется весьма перспективным. В этом случае проблемы, связанные с выделением, исследованием состава и свойств микробных полисахаридов,становятся особенно актуальны, так как их решение дает возможность выбрать общее направление поиска практически ценных полисахаридов микроорганизмов с учетом особенностей их производства и применения.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью исследования было изыскание микробных полисахаридов, представляющих практический интерес, имея в виду реализацию их производства. Эта цель обусловила три направления иссследования:

- изыскание полисахаридов на основе кормовых дрожжей - продуктов отечественной микробиологической промышленности;

- изыскание полисахаридов на основе штаммов-продуцентов белка, рекомендованных к промышленному использованию;

- изыскание полисахаридов на основе новых штаммов-продуцентов.

Соответственно решались следующие задачи:

- определение возможности использования кормовых дрожжей и мице-

лиальной биомассы грибов как источников полисахаридов;

- определение возможности использования штаммов метанолоокисляю-щих бактерий - продуцентов белка для синтеза экзополисахаридов;

- разработка методов выделения полисахаридов и их характеристика;

- исследование состава и свойств новых экзополисахаридов,синтезируемых культурами Acinetobacter sp. и B.polymyxa, определение влияния условий культивирования на состав экзополисахаридов и вязкостные свойства их водных растворов;

- поиск рациональных готовых форм экзополисахаридов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Найдены, выделены и идентифицированы новые экзополисахариды, синтезируемые бактериями Acinetobacter sp. и В. polymyxa (названия полисахаридов соответственно "симусан" и "полиииксан"}, которые по ряду функциональных свойств превосходят бактериальный полисахарид ксантан. Установлено, что водные растворы симусана обладают необычным для полисахаридов комплексом свойств - устойчивостью в присутствии минеральных кислот, повышением вязкости в присутствии солей, в кислой среде и после нагревания. Показано также, что растворы полиииксака обладают ярко выраженной псевдопластичностью. Показано, что слизь, которая образуется при определенных условиях культивирования метанолокисляющих бактерий - M.methylophilus, Acetobacter sp. и A.methylicum, представляет собой экзополисахариды и экзогликопротеины. Разработан новый метод их выделения из кулыуральной жидкости. Установлено, что кислый экзополисахарид М. methylophilus способен к гелеобразованию в щелочной среде; изучен механизм этого процесса. Показано, что кормовые дрожжи могут использоваться для получения стабильных по составу манна-нов; выявлены межвидовые и межштаммовые различия маннанов C.maltosa и С,.tropicalis. Разработан способ выделения маннанов

непосредственно из культуральной жидкости. Обнаружено, что мицелий гриба P.ostreatus в результате УФ-мутации утрачивает способность синтезировать гликогеноподобную капсулу; это открывает перспективу использования мицелия различных грибов как источника биологически активных полисахаридов. Найдено, что продуцентом таких полисахаридов монет служить мицелий гриба Fusarium sp. Впервые для исследования надмолекулярной структуры полисахаридов применен метод спектротурбидиометрического титрования; на основе полученных данных разработаны оптимальные готовые формы препаратов полисахаридов. Для выделенных и изученных полисахаридов с учетом их функциональных свойств определены области применения, что в итоге позволило организовать в СССР производство микробных полисахаридов с помощью оригинальных штаммов-продуцентов; общее производство симусана и полимиксана в виде различных готовых форм достигло 2 тыс. тонн в год.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были должены на II Всесоюзной конференции "Результаты и перспективы научных исследований микробных полисахаридов" Ленинград,1984 , YII съезде Всесоюзного микробиологического общества Алма-Ата,1985 , Всесоюзной конференции "Перспективы создания лекарственных препаратов на основе биотехнологии" Москва, 1985 , конференции СССР - ГДР "Новые продукты микробиологического синтеза из метанола" Лейпциг, Германия, 1986 , Всесоюзном совещании ВАСХНИЛ Киев,1985 , УШ Всесоюзной конференции "Химия и биохимия углеводов" Тбилиси, 1987 , II Международном симпозиуме "Сверхсинтез микробных продуктов" Прага,ЧСФР,1988 , У Европейском симпозиуме по углеводам Прага, ЧСФР, 1989 , Всесоюзной конференции "Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах" Могилев, 1990 , YI Европейском симпозиуме по методам повы-

шения нефтеотдачи Ставангер, Норвегия, 1991 , YI Европейском симпозиуме по углеводам Эдинбург, Шотландия, 1991 .

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 42 работы, в том числе получено 4 авторских свидетельства.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.1.ОБЪЕКТАМИ ИССЛЕДОВАНИЙ были полисахариды, выделяемые из постферментационной суспензии культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента микроорганизмов: Candida maltosa ВСБ-569, ВСБ-779, ВСБ-899, ВСБ-908; Candida tropicalis ВСБ-928, ВСБ-658; Pleurotus ostreatus ВСБ-963, ВСБ-963-А; Fusarium sp. ВСБ-917; Acetobacter sp. ВСБ-924; Acetobacter methylicum ВСБ-867; Methy-lobacillus methylophilus ВСБ-792; Bacillus polymyxa 1459, 1459-B; Acinetobacter sp. шт.12.

1.2.ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ проводили известными и разработанными нами методами. Идентичность полисахаридов, выделенных различными способами, определяли по их составу и свойствам.

1.3.ГОМОГЕННОСТЬ, СОСТАВ И СТРУКТУРУ ПОЛИСАХАРИДОВ определяли с помощью методов аналитической и препаративной бумажной хроматографии, электрофореза на бумаге и в ПАА геле, гель-фильтрации на колонках с Сефадексами G-100, G-200, Сефарозой 4В, Г1Х (нейтральные сахара анализировали в виде ацетатов полиолов, аминосахара - триметилсилиловых эфиров полиолов), аминокислотного анализа,

масс-спектроскопии для индивидуальных веществ и хромато-масс-13

спектрометрии, С-ЯМР- и ИК-спектрометрии, спектрофотометрии, поляриметрии и потенциометрического титрования. Количественное определение сахаров выполняли по реакции с 5% фенолом и конц. серной кислотой. Белки определяли по методу Лоури. Количественное

определение уроновых кислот выполняли по методу Дише. Для качественного анализа моносахаридного состава гидролиз биополимеров проводили при 100°С в 1н Н2504- 18 часов, в 2н и 4н ^БС^- 6 часов, для анализа аминокислотного состава - при 115°С в 6н НС1 -б часов. Фракционирование полисахаридных препаратов проводили с помощью бромида цетилтриметиламмония, хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе А-32. Восстановление карбоксильных групп в полисахаридах проводили последовательно их обработкой НС1 в сухом метаноле и ЫаВН^. Метилирование Сахаров проводили по Хакомори. Расщепление полисахаридов проводили с помощью периодатного окисления и деградацией по Смиту.

1.4. ДЛЯ ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКИХ ОПРЕДЕЛЕНИЙ использовали капиллярные вискозиметры Оствальда стандартного образца. Характеристическую вязкость определяли графически экстраполяцией крявой зависимости приведенной вязкости при ® —* 0 от концентрации полисахарида в растворе (с г/мл); для определения Цуд/с ПРИ О ;—> 0 от 0 (с ^экстраполировали к 1)=0. Динамическую вязкость и напряжение сдвига определяли с помощью ротационного вискозиметра.

1.5. ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ НАДМОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ полисахаридов в растворах и гелях использовали метод спектротурбидиометрии. Параметры дисперсности систем - размер частиц массово-объемную концентрацию вещества С, входящего в состав коллоидно-дисперсной фазы в расчете на полный объем суспензии, и числовую концентрацию частиц N определяли по оптической плотности О при пяти значениях длины волны в диапазоне X = 400-600 нм при различных значениях рН и ионного состава среды с последующей автоматизированной обработкой результатов.

2. ИЗЫСКАНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ НА ОСНОВЕ КОРМОВЫХ ДРОШЕЙ И МИЦЕЛИ-АЛЬНОЙ БИОМАССЫ - ПРОДУКТОВ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ.

2.1.КОРМОВЫЕ ДРОЖШИ КАК ИСХОДНЫЙ ПРОДУКТ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МАННАНОВ.

К началу настоящей работы в литературе были достаточно хорошо изучены дрожжевые полисахариды, в первую очередь, ианнаны, которые представляют собой эффективные противоопухолевые и бактерицидные препараты. Мы поставили задачу установить структуру углеводного скелета маннанов выбранных нами штаммов, определить возможность получения стабильных по структуре соединений и разработать способ их выделения из постфернентационной суспензии.

2.1.1. СТРУКТУРА МАННАНОВ ПРОМЫШЛЕННЫХ ШТАММОВ ДРОШЕЙ Candida.

При обработке выращенной в стандартных условиях биомассы дрожжей C.maltosa и С.tropicalis (## штаммов см. п. 1.1.) 3% NaOH при нагревании с последующим выделением маннанов с помощью реактива Фелинга были получены три пары маннанов, каждая из которых характеризуется определенной молекулярной массой. Элементы структуры маннанов и их относительное содержание представлены в табл.1.

Таблица 1

Характеристика маннанов C.maltosa и С.tropicalis

Штамм, ВСБ

мол. масса (кД)

I .20

вода, с 0,8

Элементы структуры маннанов и их относительное содержание (в *

1 6-Г

Ман--»Ман-»

"2 П5 Г5 -»Ман-» -»Ман-» —»Ман

т

Т~5-1

-> -»Ман-» 2 f 3

150 150 100 100 200 200

+74,6 +76,2 +63,7 +63,4 +62,2 +71,8

25,5 26,1 24,4 21,8 16,0 17,2

11,0 8,7 12,2 13,0 8,0 13,8

29.0 30,5 29,3

26.1 40,0 38,0

9,0 8,7 9,7 17,4. 20,0 13,8

14,5 13,0 12,2 13,0 16,0 17,2

11,0 13,0 12,2 8,7

*) по данным С-ЯМР спектроскопии

Из таблицы 1 следует, что углеводные скелеты маннанов близки, хотя и незначительно отличаются друг от друга. Маннаны С.tropicalis ВСБ-928 И ВСБ-658 оказались близки по структуре маннанам этого вида дрожжей. Маннаны C.maltosa имеют общие элементы структуры с MaHHaHOMCsubtropicalis. Для обоих характерны 1,3,6-разветвления в главной цепи и достаточно большое количество 1,3-связей в боковых цепочках, однако у полученных нами маннанов боковые цепочки короче. Можно полагать, что, подобно известным из литературы маннанам С.tropicalis, полученные нами соединения могут обладать биологической активностью.

2.1.2.ВЛИЯНИЕ ИСТОЧНИКА УГЛЕРОДА НА НАКОПЛЕНИЕ МАННАНОВ C.maltosa И С.tropicalis И ИХ СТРУКТУРУ.

Для определения влияния источника углерода на накопление маннанов в биомассе и их структуру *ы сравнивали маннаны, выделенные нами из биомассы, выращенной на глюкозе (все штаммы Candida, п. 1.1.) , на н-углеводородах (штаммы ВСБ-569, ВСБ-779, ВСБ-908, ВСБ-928) и выделенные непосредственно из "паприна" (ВСБ -569 и ВСБ-779). Выход маннанов, выделенных из дрожжевой биомассы, выращенной на глюкозе - ок.1,4%; из биомассы, выращенной на н-углеводородах различного состава - ок. 2,4%, что хорошо согласуется с литературными данными. Молекулярная масса и структура углеводного скелета маннанов, выделенных из биомассы одних и тех же штаммов, практически идентичны вне зависимости от источника углерода. Очевидно, они могут служить характеристиками исследованных нами штаммов. В то же время оказалось, что количество фосфатных

групп выше в маннанах, выделенных из биомассы, выращенной на 13

н-углеводородах. С ЯМР-спектр маннана ВСБ-569, содержащего наибольшее количество фосфора, указывает на то, что в состав манна-

нов входят моно- и диэтерифицированнне фосфатные группы что подтверждается потенциометрическим титрованием . Согласно литературным данным, у таких соединений следует ожидать более выраженную антигеннуй активность.

2.1.3. ВЫДЕЛЕНИЕ ДРОЖЖЕВЫХ МАННАНОВ С ПОМОЩЬЮ ГИДРООКИСИ КАЛЬРЯ.

В полисахаридных фракциях, получаемых экстракцией биомассы водной щелочью, содержание маннанов невелико - около 10%. Мы показали, что экстракция биомассы дрожжей насыщенным раствором Сафн)^ проходит более избирательно. Так,для ВСБ-569 доля маннана в выделенной таким образом фракции максимальна см. табл.2 .

Таблица 2

Углеводный состав продуктов экстракции биомассы Candida maltosa ВСБ-569

Экстрагент Моносахариды (мол.%) в продуктах гидролиза выделенных препаратов Манноза С") к исходной биомассе

Ман Глю Гал Кси

3% NaOH 10,1 56,6 1,0 32,3 0,25

Вода деионизи-

рованная 12,5 65,0 3,7 18,8 0,14

Са (ОН)^ насыщ. 32,0 32,4 0,6 35,0 0,25

С помощью Сафн),, маннозосодержащую фракцию удается выделить агрегацией клеток и последующим нагреванием концентрированной суспензии, минуя промежуточные стадии сепарации и распылительной сушки, и тем самым' сделать производство маннанов экологически безопасным.

2.2. МИЦЕЛИАЛЬНАЯ БИОМАССА ГРИБОВ КАК ИСТОЧНИК ПОЛИСАХАРИДОВ.

Известно, что полисахариды грибов - вещества с разнообразными иммунологическими свойствами. К настоящему времени противоопухолевая активность обнаружена у полисахаридов, относящихся более

чем к 100 родам. То,что они практически не токсичны, выгодно отличает полисахариды от других противоопухолевых препаратов. Первые работы, посвященные выделению полисахаридов из грибов, основаны на экстракции их из плодовых тел. Сравнительному анализу полисахаридов плодовых тел и мицелия посвящено очень небольшое число работ. Показано, что их состав, соответственно, биологическая активность могут заметно отличаться в процессе развития гриба и плодового тела. В связи с успехами в области глубинного культивирования мицелиальной биомассы появилась возможность ее получения в значительных количествах. Поэтому мы поставили задачу определить влияние условий культивирования на состав и выход полисахаридов мицелия и найти критерий выбора штаммов-продуцентов мицелиальной биомассы как продуцента практически ценных полисахаридов .

2.2.1. ПОЛИСАХАРИДЫ МИЦЕЛИЯ ГРИБОВ Р1еиго1из озЬгеа^э ВСБ-963 И ЕГО УФ-МУТАНТА ВСБ-963А.

К числу известных в литературе полисахаридов, обладающих выраженной противоопухолевой активностью, относятся гетерополиса-хариды, выделенные из плодовых тел гриба Р1еиго<;из оз1;геа<;из (Вешенка).

В качестве объекта исследования мы выбрали мицелиальную биомассу Р.оз^еа^э ВСБ-963, учитывая, что его мицелиальные клетки образуют слизистую капсулу, как мы показали, углеводной природы. Оказалось, что смесь, выделенная из мицелия ВСБ-963 экстракцией в стандартных условиях выделения противоопухолевых препаратов из грибов, состоит из двух гликогеноподобных полисахаридов с мол. массами ниже 100 тыс. с остатками о(.-1,4-глюкозы в основной цепи и боковыми звеньями, присоединенными 1,6- и о(.-1,2-связями. Выделенные глюканы отличались от истинного гликогена невысокой мол.

массой и наличием 1,2-связанных остатков глюкозы.

Сотрудниками лаборатории селекции ВНИИсинтезбелок многократным УФ-облучением мицелия гриба ВСБ-963 был получен мутантный штамм - ВСБ-963-А, лишенный слизистой капсулы. Поэтому представлялось целесообразным сравнить углеводный состав клеток мицелия ВСБ-963 и ВСБ-963-А тем более, что до настоящего времени в литературе отсутствовали систематические данные по влиянию мутации на углеводный состав клеток грибов.

В продуктах гидролиза смеси, выделенной в аналогичных условиях из мицелия ВСБ-963-А, были обнаружены глюкоза, галактоза, манноза и фукоза в соотношении 1,0 : 1,3 : 1,8 : 0,3, что близко по составу полисахаридным фракциям, выделенным различными авторами из плодовых тел базидиомицетов, в том числе и P.ostreatus.

По-видимому, отмеченная в литературе более низкая биологическая активность полисахаридных фракций, выделенных из мицелия высших грибов, по сравнению с активностью аналогичных фракций, выделяемых их плодовых тел, в ряде случаев может быть вызвана большим количеством в ней гликогена. Отсутствие слизистой капсулы может служить одним из возможных критериев выбора источника противоопухолевых полисахаридов из мицелиальной биомассы.

2.2.2. ПОЛИСАХАРИДЫ МИЦЕЛИЯ ГРИБОВ Fusarium, sp. ВСБ-917.

Выбор нами мицелия гриба Fusarium sp. ВСБ-917 был обусловлен тем, что для него характерно отсутствие слизистой капсулы. Другая характерная особенность культуры - способность утилизировать различные субстраты - свекловичную мелассу и этиловый спирт.

Ранее при исследовании маннанов Candida мы обнаружили, что при смене источников углеродного питания моносахаридный состав полисахаридных фракций, полученных экстракцией дрожжей Candida, значительно различается. Аналогично оказалось, что состав моноса-

харидов и их относительное содержание в продуктах гидролиза фракций, выделенных нами из биомассы ВСБ-917, зависит от источника углеродного питания. В случае свекловичной мелассы как субстрата были обнаружены глюкоза, галактоза и манноза (б:5:4), в случае этанола - глюкоза, галактоза, манноза и фукоза (2:3:4:1). Оказалось, что полисахаридная фракция (углеводный субстрат - меласса) при дозе 1 мг/кг тормозит на 76% рост Саркомы-180 и не токсична при дозе 250 мг/кг. Подобно описанным в литературе противоопухолевым полисахаридам, она эффективна только при определенных концентрациях, выше и ниже которых ее противоопухолевое действие снижается. Напротив, полисахаридная фракция (углеводный субстрат -этанол), выделенная в аналогичных условиях, практически не обладает противоопухолевой активностью. Возможно, в состав выделенных нами полисахаридных фракций входят компоненты, обладающие более выраженной биологической активностью, при этом следует учитывать, что как на состав углеводных компонентов мицелия гриба ВСБ-917, так и на их биологическую активность, скорее всего, влияет источник углеродного питания.

Наиболее часто в составе полисахаридных фракций грибов, получаемых . экстракцией горячей водой, обнаруживают р -глюканы и галактоманнаны. Из обеих полисахаридсодержащих фракций мицелия ВСБ-917 с помощью препаративной хроматографии мы выделили галактоманнаны с мол. массами не выше 100 тыс., которые по данным 13

С-ЯМР оказались практически идентичны. Фрагменты их структуры, 13

приписанные на основании С-ЯМР спектров, представлена на рис.1.

Очевидно, источник углеродного питания не влияет на структуру галактоманнана ВСБ-917, хотя его относительное содержание в биомассе различно.

-»6-оН>-Ман-1-»

-*6-о6-0-Ман-1-» II

Т?

оНЬНан I

-»6-оН)-Нан-1—> III

Т!

11

о£-Г)-Гал

оКЬГал

Рисунок 1.

Таким образом, первый этап исследования показал возможность получения на основе, продуктов микробиологической промышленности стабильных по составу полисахаридов, которые могут найти применение как потенциальные биологически активные вещества.

3. ИЗЫСКАНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ НА ОСНОВЕ ШТАИИОВ ЫЕТАНОЛОКИСЛЯВДИХ БАКТЕРИЙ - ПРОДУЦЕНТОВ БЕЛКА.

Помимо здравоохранения, наиболее крупные области применения полисахаридов - нефтяная и пищевая промышленности; на их нужды идет около 90% микробных экзополисахаридов, выпускаемых в мире. Соответственно, следующие направления нашего исследования посвящены изысканию этого класса полисахаридов.

За рубежом основной промышленный микробный полисахарид -ксантан (продуцент - углеводокисляющие фятопатогенные бактерии Х.сашреэ^в). Каждый новый микробный полисахарид, представляющий практический интерес, прежде всего сравнивают по физико-химическим и реологическим свойствам с ксантаном. у

К началу нашей работы способность синтезировать экзополиса-хариды в значительных' количествах была обнаружена как у облигат-ных, так и у факультативных мегилотрофов; был обнаружен новый источник получения экзополисахаридов метилотрофных бактерий -смешанные культуры микроорганизмов (ассоциаты), выделяемые либо из природных источников, либо создаваемые искусствено. Хотя выход экзополисахаридов метилотрофных бактерий обычно несколько ниже,

чем у углеводокислящих бактерий, однако низкая стоимость и стабильность таких субстратов, как метанол, могут компенсировать этот недостаток.

При разработке технологии получения бактериальной биомассы, выращиваемой на средах с метанолом, сотрудниками ВНИИсинтезбелок были селекционированы штаммы метилотрофов, которые при культивировании в определенных условиях способны образовывать значительное количество слизи. Полученные нами предварительные результаты показали, что слизь представляет собой экзополисахариды. Мы поставили задачу определить состав экзополисахаридов, их свойства, накопление в постферментационной суспензии при направленном культивировании, что в итоге позволяло определить возможности их производства и применения.

3.1.ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ И ЭКЗОГЛИКОПРОТЕИНЫ ОБЛИГАТНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ МеЫ1ПоЬасШиз те№у1орЬИиз ВСБ-792.

До настоящего времени экзополисахариды в промышленных условиях получают периодическим культивированием. Метанолокисляющие бактерии ВСБ-792 способны накапливать слизь при непрерывном культивировании в присутствии небольшого числа неметилотрофных спутников. Было показано также, что в определенных условиях чистая культура ВСБ-792 также образует слизь. Все это обусловило интерес к культуре М.те№у1орЬ11из.

3.1.1. ЭКЗОГЛИКОПРОТЕИНЫ БАКТЕРИЙ ВСБ-792.

В культуральной жидкости ВСБ-792 независимо от условий культивирования удается обнаружить водо- и щелочерастворимый углевод-содержащие компоненты. В условиях направленного биосинтеза накопление целочерастворимого компонента - до 26 г/л. В его составе были обнаружены экзогликопротеины ГП-1 и ГП-2, состоящие

из субьединиц с мол. массами 40 тыс. и 70 тыс. соответственно.

Содержание углеводов в ГП-1 - 21,5%, углеводная часть состоит из остатков глюкозамина и глюкозы. Содержание углеводов в ГП-2 - 17,4%, в состав ГП-2 входят остатки глюкозамина, глюкозы, рам-нозы и маннозы. Белковые части гликопротеинов состоят из остатков кислых аминокислот (16,6% и 21,2% соответственно), основных аминокислот (13,IX и 9,3%), ОН-содержащих аминокислот (13,9% и 14,9%) и неполярных амнокислот (56,0£и 54,6%). БН-содержащие аминокислоты входят в состав гликопротеинов в качестве минорных компонентов (0,5% и 0,1% соответственно), что является характерным признаком экзогенных белков и служит подтверждением, что гликопротеины ГП-1 и ГП-2 - экзогенные продукты бактерий ВСБ-792.

По данным щелочной деградации, в гликопротеинах ГП-1 и ГП-2 углеводные цепи связаны с пептидными частями молекул главным образом 0-гликозидными связями. В продуктах гидролиза наблюдается снижение содержания углеводов; по-видимому, их значительная часть связана в виде коротких цепочек или даже единичных остатков, которые в условиях щелочной обработки в присутствии ИаВН^ превращаются в полиолы. Частичное совпадение профилей элюции углеводных и белковых составляющих в высокомолекулярных продуктах щелочного гидролиза гликопротеинов указывает на то, что часть углеводных компонентов не отщепляется. Возможно, в части гликопротеинов име-' ются И-гликозидные связи.

Биологическая роль внеклеточных гликопротеинов пока окончательно не установлена. Очевидно, они играют роль в процессах межклеточного взаимодействия, включая узнавание, и могут выполнять защитную функцию.

3.1.2. ЭК30П0ЛИСАХАРИДН БАКТЕРИЙ ВСБ-792. ЭЛЕМЕНТЫ СТРУКТУРЫ КИСЛОГО ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА.

Водорастворимый компонент, выделенный из культуральной жидкости ВСБ-792, представляет собой смесь полисахаридов, которую с помощью цетавлона удалось фракционировать на нейтральный (ПС-1) и кислый (пС-2) экзополисахариды. Содержание кислого и нейтрального экзополисахаридов меняется в зависимости от условий культивирования незначительно и составляет - 10:1. В условиях направленного биосинтеза содержание экзополисахаридов - 9г/л, что достаточно высоко для метилотрофных бактерий.

ПС-1 состоит из остатков глюкозы, галактозы и маннозы в

2.0 о

соотношении 1,0 : 0,18 : 0,26, [о(.]р.= +49,2 , мол.масса около 150 тыс.

ПС-2 состоит из остатков глюкозы, галактозы, маннозы, рамно-зы и глюкуроновой кислоты в соотношении 1,0:0,2:0,45:0,4:1,5. Наличие одной точки перегиба на кривой потенциометрического титрования ПС-2 указывает на отсутствие в нем других кислотных группировок. По данным ИК-спектроскопии в ПС-2 сложноэфирные группы отсутствуют. Мол.масса ПС-2 ок. 250 тыс., [о(.]^.= +54°.

Для проверки индивидуальности ПС-2 был фракционирован на ДЭАЭ-целлюлозе и на Сефарозе 4В. Полученные после фракционирования препараты практически не отличались от исходного по моносаха-ридному составу, что подтверждает гомогенность ПС-2 и его гете-рополисахаридную природу.

Для определения типа связей в кислом полисахариде его восстановленное производное метилировали, подвергали формолизу, гидролизу, продукты гидролиза анализировали методом ХМС в виде частично метилированных ацетатов полиолов. Полученные данные указывают на то, что полисахарид ПС-2 представляет собой линейную

молекулу с 1,3-связями. Это согласуется с результатами периодат-ного окисления ПС-2, при котором не наблюдалось сколько-нибудь значительного расхода периодата (е0 =0,135 ; Еконечн = 0,128).

Для выявления типа уронидных связей из продуктов кислотного гидролиза ПС-2 селективной сорбцией на анионите были выделены и фракционированы кислые олигосахариды - ОС-1 CR GlcA = ">08б> 1(Х.]р0=+7,5о) и ОС-2 CR GlcA = 0'033, lol-]I)0 = +4,6°)' Установление состава ОС-1 и ОС-2 и типа связи мы выполняли по схеме, представленной на рис.2, и рис.3. Полученные данные служат дополнительным подтверждением, что в кислом полисахариде ВСБ-792 глюкуроновая кислота связана с глюкозой преимущественно 1,3 -связью, причем в цепи полисахарида имеются блоки из остатков двух глюкуроновых кислот, связанных друг с другом. Исходя из значений оптической активности кислых олигосахаридов ОС-1 и ОС-2, можно полагать, что остатки глюкозы и глюкуроновой кислоты связаны между собой ^-связями. Поскольку сам полисахарид имеет довольно высокое положительное значение удельного вращения, остальные моносахариды, обладающие D-конфигурацией, скорей всего, связаны (¿-связями.

3.1.3. ЭФФЕКТ ГЕЛЕ0БРА30ВАНИЯ РАСТВОРА КИСЛОГО ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА ВСБ-792.

>

Вязкость водных растворов кислого экзополисахарида M.methy-lophylus невысока (qOTH0,lX раствора при 20°С составляет 1,9; ксантана "Sigma" в тех же условиях - 6,7). Это обусловлено сравнительно низкой по сравнению с ксантаном мол. массой экзополисахарида ПС-2 и, возможно, наличием в его цепи гибких участков -трисахаридных звеньев из р-1,3-связанных остатков глюкуроновой кислоты и глюкозы.

ОС-2

присутству- . ' ет зона, 1, Н"/ соответст- ^ вущая ^^ 2, НаВНд

глюкозе ^ о »- п

гекса-0-

-ацегат

сорбита

отсутствует

1. ИаВНл 2.Н"*" зона, соот-

2. СН,Н; -*

3. ас20

3. ИаВН^

ветствующая глюкозе

5. НаВН,

6. Ас^О

4

гекса-0- пента-0--ацетат + -ацетат-сорбита, . глюкозы

^ : ^ / о..

* т/х-37б

л/г: 331 <-1 т/г: 619«

СН20Ас

. 4/ -20Ас т/г: 409

Рисунок 2. Установление строения кислого олигосахарида ОС-2

т/2:331 4

■> т/г: 376

Рисунок 3. Производное кислого олигосахарида ОС-1

К началу настоящей работы был известен экзополисахарид

Р.у1Бсо£епа АТСС-31504, в состав которого входит около 30% уроно-

вых кислот, а гибкие участки цепи представляют собой тетрасаха-

ридные звенья из (1-1,3-связанных остатков галактозы. Растворы

экзополисахарида АТСС-31504 обладают невысокой вязкостью, однако

2 +

превращаются в гели в присутствии Са при рН 10. Мы ожидали, что в аналогичных условиях экзополисахарид ПС-2 также сможет образовывать гели.

Оказалось, что растворы кислого экзополисахарида ВСБ-792 в концентрации более 0,3% в щелочной среде в присутствии катионов одно- и двухвалентных металлов образуют разнообразные по консистенции гели, разрушающиеся при нейтрализации растворов. Характер фазовых переходов не меняется с повышением концентрации полисахарида до 1,5% и в интервале 4? - 40°С, фазовые переходы воспроизводятся при их многократном повторении рис.4 .

без солей СН3С02Ма

Рисунок 4. Зависимость доли полисахарида ВСБ-792 в растворенном состоянии (Р%) от рН растворов и ионного состава среды.

Использование биополимеров в технических и пищевых целях часто связано с направленным переводом их растворов в гелеобраз-ное состояние. Поэтому выяснение механизмов гелеобразования экзополисахарида ВСБ-792 представляло определенный интерес. Для этой цели мы использовали метод спектротурбидиометрии, который ранее применялся при изучении процессов фазового разделения разбавлен-

них растворов неуглеводных полимеров. Полученные нами данные (рис.5) указывали на довольно стабильную фракцию надмолекулярных частиц полисахарида ВСБ-792 (пС-2) в растворе, параметры которых до достижения условий гелеобразования мало зависели от ионного состава среды. Доля полимера, входящего в состав коллоидно-дисперсной фазы, составляла 2-3% от его общего количества в системе (Сд/С0).При достижении рН гелеобразования размер частиц возрастал на ~30%, Сд/С0 достигало ~50% при добавлении ЫаОН и 100% при добавлении Са^Н^- При этом число частиц уменьшалось. Это связано, по-видимому, с фазовым разделением системы, обусловленным экранированием заряда макромолекул при образовании ионных связей между катионами и карбоксильными и алкоголятными группами полимера. В то же время оказалось, что при добавлении к раствору ПС-2 ацетата натрия при достижении точки гелеобразования концентрация полимерного вещества, находящегося в коллоидно-дисперсной фазе, практически не менялась. По-видимому, в этом случае при застудневании новая система не возникает, почти двукратное увеличение г^, сопровождающееся почти пятикратным снижением Н, обусловлено коагуляцией надмолекулярных частиц, существующих в системе до достижения условий образования геля. Можно предположить, что в зависимости от ионного состава среды в процесс гелеобразования раствора ПС-2 могут вносить вклад как сегрегация макромолекул, так и образование молекулярной сетки геля.

Гели, полученные в присутствии ионов К+, На+, ацетата, про-пионата или малоната, не разрушались при нагревании их до 90°С в воде и в 4М НаС1 в течение 30-40 мин. Гели, полученные в присутствии катионов двухвалентных металлов, не "плавились" при 90°С около двух недель, при 7° С - около двух месяцев.

1&н

110 105 95 90

"п—и

и Сл

-2,5 -3,0 "3,5 -4,0

и—И

Рисунок 5. _ ,

Зависимость радиуса г>, (мкм), числовой концентрации N Ссм ) и массово-объемной концентрации Сд. С г/см3) надмолекулярных частиц кислого полисахарида ВСБ-792 от рН.

1.титрование раствором НаОН;

2.титрование раствором Са(0Н)2;

3.титрование раствором НаОН в присутствии 0,1М ацетата натрия.

3.1.4. ВЫДЕЛЕНИЕ ЭК30П0ЛИСАХЛРИД0В И ЭКЗОГЛИКОПРОТЕИНОВ ВСБ-792.

Присутствие в суспензии ВСБ-792 экзогенных продуктов двух типов - полисахаридов и гликопротеинов, обладающих различной растворимостью, показывает, что при кислотной обработке суспензии полисахариды будут находиться в жидкой фазе, а клетки и гликопро-теины - в твердой. При подщелачивании суспензии в жидкой фазе окажутся и полисахариды, и гликопротеины. При этом удаление остатков питательных солей из постферментационной суспензии, как мы полагали, может способстововать ее дестабилизации. Мы обнаружили, что клетки M.methylophilus ВСБ-792 коагулируют при добавлении катионообменной смолы в Н+- форме. Коагуляция ускоряется при нагревании суспензии, при этом вязкость ее падает. На этом основан разработанный нами способ отделения раствора полисахаридов от гликопротеинов и клеток продуцента без разведения суспензии центрифугированием при невысоких скоростях сдвига (рис. б).

Другой способ выделения экзогенных биополимеров ВСБ-792, разработанный нами, заключается в обработке разбавленной в 4 раза суспензии 0,1 М NaOH при 20°С. При этом в жидкую фазу переходят полисахариды и гликопротеины, которые удается разделить подкисле-нием раствора до рН 4,5.

По мол. массе, мономерному составу и физико-химическим свойствам полисахариды и гликопротеины, выделенные из культуральной жидкости различными способами, практически не отличались от аналогичных препаратов, выделенных традиционным способом. Разработанные нами методы оказались достаточно эффективны, так как позволяют практически количественно отделять бактериальные клетки без значительного разведения суспензии. Примечательно, что этим же методом нам удалось отделить клетки метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus и Micrococcus methanolica. При этом

агрегация клеток этих культур из постферментационной суспензии ухе при 20°С протекала со скоростью ионных реакций.

Рисунок 6.

Схема выделения экзополисахаридов и гликопротеинов

из бактериальной суспензии БСБ-792.

3.2. ЭК30П0ЛИСАХАРИДЫ АЦИДОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Асе^Ьа^ег ер. ВСБ-924.

Мы показали, что ацидофильные метанолокисляющие бактерии Асе1оЬас1ег зр. в процессе культивирования способны накапливать до 11 г/л экзополисахаридов, что является высоким показателем для метилотрофов. Фракционированием с помощью цетавлона удалось выделить нейтральный и кислый полисахариды в соотношении -1:6. В состав нейтрального полисахарида входят остатки глюкозы, галактозы

и рамнозы в соотношении 5:2:4, по данным Ш-спектроскопии сложно-

ЛЛ

эфирные группы отсутствуют, [о!. 1 ^=-17,7°. Кислый экзополисахарид

состоит из остатков глюкозы, галактозы, маннозы, глюкуроновой

20 о

кислоты в соотношении 6:6:1:3 и О-ацетильных групп; [сЦ^ = -44 С указывает на то, что остатки моносахаридов связаны между собой в основном р-связями. По данным гель-хроматографии можно полагать, что мол. масса обоих полисахаридов относительно невелика. В первую очередь мы поставили задачу определить вязкостные свойства суммарных фракций полисахаридов ВСБ-924 и вклад нейтрального компонента в эти свойства. Полученные данные представлены в табл. 3.

Мы ожидали, что вязкость раствора кислого экзополисахарида ВСБ-924 окажется выше вязкости раствора смеси полисахаридов. Действительно, для 0,1% раствора Г|огн составило 3,4 (ср. табл.з). После щелочной обработки кислого экзополисахарида в условиях дез-ацетилирования г| снизилось до 1,78, тогда как после обработки смеси в аналогичных условиях 1\отн напротив, заметно возросло (табл.з). Можно полагать, что кислый и нейтральный экзополиса-хариды ВСБ-924 взаимодействуют между собой подобно ксантану и галактоманнану по механизму "ключ-замок".

Резкое падение вязкости постферментационной суспензии ВСБ-924 при рН $ 3,5 позволяет упростить выделение из нее экзополисахаридов на стадии отделения клеток. Для этого обработка суспензии вплоть до центрифугирования проводится при рН 2.7-3,0. Свойства выделенных таким образом полисахаридов ВСБ-924 практически не меняются по сравнению с выделенными стандартным методом.

Таблица 3.

Вязкость (^отн) растворов полисахаридов ацидофильных нетилотрофных бактерий ВСБ-924 и ВСБ-867.

Полисахарид Концентрация (% вес.) ,/20°С, рН 5,5/

0,05 0Д 0,3 0,5

ВСБ-924 (сумм.) ВСБ-924 (сумм, дезацетилиров л ВСБ-867 1,51 2,34 5.24 , 22,3 1,98 3,26 12,07 47,7 1,83 3,11 24,51 80,8

ЗО 1 40 I 50 1 60 1 70 1 во

2.24 1,88 1,55 а,9) а,5> си) 1,24 1,10 (0,9) (0,7)

рН /0,1% р-р, 20°С/

2,0 3,2 3,9 5,0 6,0 6,Ь 8,6 '9,4 11,2

2,12 2,13 3,06 3,1

3~Ж

ТГГ1

Оказалось, что растворы полисахаридов ВСБ-924 устойчивы в присут-4. 2+ 3 +

ствии ионов К , Са и А1 . При их добавлении вязкость растворов обратимо падает. Неожиданно оказалось, что как смесь экзополисахаридов ВСБ-924, так и компоненты ее, а также дезацети-лированные производные способны сохранять высокую вязкость продолжительное время в водном растворе без добавления консервантов. Так, за 30 дней при 20°С вязкость 0,1% раствора смеси снизилась всего на 10%, тогда как в тех же условиях раствор ксантана пол- / ностью потерял вязкость за 5 дней.

3.3. КИСЛЫЙ ЭК30П0ЛИСАХАРИД АЦИДОФИЛЬНЫХ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИИ АсеЬоЬасЬег теМуПсит ВСБ-867.

Подобно ВСБ-924, ацидофильные бактерии ВСБ-867 также оказались способны синтезировать экзополисахариды на средах с метанолом. Как видно из табл.4, для получения экзополисахаридов с наибольшей вязкостью предпочтительно 20-30 часов. В соответствии

с этим, для выделения зкзополисахаридов мы использовали суспензию, полученную через 30 часов роста. Оказалось, что в этих условиях бактерии ВСБ-867 синтезируют практически только кислый экзополи-сахарид, в состав которого, помимо нейтральных Сахаров (табл. 4) входят остатки уроновой кислоты и О-ацетильные группы.

Таблица 4.

Характеристика экзополисахарида А.теЬЬуНсит ВСБ-867.

Время ферментации (час) Накопление экзополисахарида (мг/мл) Вязкость 0,1% раствора экзополисахарида Состав нейтральных моносахаридов в продуктах гидролиза (% вес)

Глю Гал Ман Рам Ара

14 4,2 2,5 72,0 21,8 2,6 2,8 0,7 20 4,3 3,1 86,3 13,7 сл. сл. 30 8,3 3,1 86,7 13,3 сл. 40 13,1 1,9 59,0 32,7 8,3

Вязкость 0,5% раствора дезацетилированного производного ВСБ-867 вдвое ниже вязкости раствора исходного экзополисахарида той же концентрации. Для 0,05-0,IX растворов, где межмолекулярное взаимодействие невелико, величины вязкости растворов обоих полисахаридов практически одинаковы и при этой концентрации значительно уступают ксаитану, что согласуется с данными об их невысокой мол. массе.

С повышением концентрации полисахарида ВСБ-867 вязкость его раствора возрастает более резко, чем для полисахарида ВСБ-924 (табл.3). Подобно полисахариду ВСБ-924, вязкость растворов полисахарида падает в кислой, щелочной среде, в присутствии солей К+, и Са , однако при добавлении солей Сг и А1° полисахарид коагулирует. Как и ксантан, экзополисахарид ВСБ-867 в растворе без добавления консервантов легко деградирует.

3.4. ПУТИ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ.

Выделенные нами полисахариды метилотрофных бактерий ВСБ-792, ВСБ-924 и ВСБ-867 уступают ксантану как загустители и стабилизаторы суспензий в нейтральных средах. В то же время, функциональные свойства этих полимеров - гелеобразующая способность, совместимость с солями, устойчивость к биодеградации позволяют рассматривать их с точки зрения практического использования. Так, благодаря устойчивости экзополисахарида ВСБ-792 в гелеобразном состоянии к тепловой обработке и к присутствию солей удалось разработать метод его применения для временной изоляции пластов при нефтедобыче. Сочетание устойчивости экзополисахарида ВСБ-924 в растворах солей и стабильность его водных растворов позволили разработать метод его применения в качестве реагента для вытеснения нефти из пласта. Эти же свойства наряду с загущающей способностью открывают возможность использования его в областях, где требуется совместимость с солями, а введение консервантов нежелательно, в частности, при приготовлении красителей для тканей. Благодаря высокому содержанию в экзополисахариде ВСБ-792 остатков рамнозы и глюкуроновой кислоты, он может также найти применение как источник получения этих практически ценных моносахаридов.

4. ИЗЫСКАНИЕ ПОЛИСАХАРИДОВ НА ОСНОВЕ НОВЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ.

Проведенные нами исследования показали, что можно получать практически ценные полисахарида на основе штаммов, которые уже используют при производстве дрожжевой и бактериальной биомассы. Тем не менее, очевидно, что для производства полисахаридов, способных конкурировать с такими биополимерами, как ксантан, необходим направленный поиск полисахаридов на основе новых штаммов-продуцентов. При этом, в соответствии с целью работы, при

выполнении третьего направления нашего исследования были необходимы штаммы-продуценты, которые бы при культивировании мало инфицировались посторонней микрофлорой и синтезировали экзополи-сахариды с высоким выходом и выраженной загущающей способностью, псевдопластичностью и т.п. В итоге мы выбрали два штамма-продуцента экзополисахаридов - углеводокисляющие бактерии Bacillus polymyxa и этанолокисляющие бактерии Acinetobacter sp.

4.1.ЭК30П0ЛИСАХАРИДЫ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ Bacillus polymyxa 1459-В.

К началу настоящей работы было известно, что к числу культур продуцентов полисахаридов относятся бактерии Bacillus polynyxa, которые, как правило, мало инфицируются посторонней микрофлорой. Кислый экзополисахарид, синтезируемый этой культурой, штамм NCIB11429 ^фирма "Lever Brothers") образует высоковязкие растворы и рассматривается как один из лучших псевдопластиков. В то же время бактерии В.polymyxa, как правило, синтезируют смесь полисахаридов, что осложняет использование этого вида бактерий в практических целях. Мы поставили задачу найти штамм В.polymyxa, который бы синтезировал преимущественно кислый экзополисахарид, и определить вязкостные свойства этого полисахарида. Мы нашли, что таким условиям удовлетворяет штамм В.polymyxa 1459-В, полученный в ИБФРМ АН СССР направленной мутацией музейной культуры, штамм 1459.

Состав полисахаридов фракций, полученных с использованием штаммов 1459 и 1459-В, представлен в табл. 5.

Мы показали, что при использовании глюкозы в качестве источника углерода образуется преимущественно кислый полисахарид. Он оказывается практически единственным компонентом в случае мутант-ного штамма 1459-В, у которого способность к биосинтезу нейтрального экзополисахарида, очевидно, нарушена.

Таблица 5.

Состав полисахаридных фракций В.ро1ушуха 1459 и 1459-В.

Источник углерода Штамм Соотношение кислого и нейтрального полисахаридов Потн. -0,1%р-ра,20 С

Сахароза 1459 1:2,0 1,15

Глюкоза — 1:0,3 2,78

Сахароза 1459-В 1:0,03 2,60

Глюкоза _и_ 1:0,008 5,22

Нейтральные полисахариды 1459 и 1459-В представляют собой фруктаны, практически идентичные по иол.массе (ок. 150 тыс!) и величинам удельного вращения = -48,5°).

Состав кислых экзополисахаридов и их характеристика представлены в табл.6. Оказалось, что состав кислых полисахаридов незначительно меняется в зависимости от выбранного штамма и источника углерода. Повышение содержания глюкозы в продуктах гидролиза восстановленных полисахаридов указывает на то, что в его состав входят остатки глюкуроновой кислоты. Из данных табл.6 следует, что для практических целей штамм 1459-В предпочтителен.

Таблица 6.

Характеристика кислых полисахаридных препаратов 1459 и 1459-В.

Источник углерода Етами Ионосахаридный состав * Содержание уро- потн. 0,1% Выход ЗПС

новых р-ра, 20 С г/л г/г сухой

Глю Нан Гал кислот (X) кж биомассы клеток

Сахароза ' 1459 Глюкоза -"Сахароза 1459-В Глюкоза

24.1

22.2 20,1

(1,0) (1,0) (0,03)

1,0 0,7 0,2

(1,0) (0,1) (0,13)

1,0ч 1,3 0,Зч

(1,0) (0,8) (0,2)

1,0 0,8 0,6

(1,0) (0,3) (0,4)

4,5 3,8 7,8

5,27 15,57 8,9

1,02 1,97 1,6

* - в скобках - относительное содержание моносахаридов в продуктах гидролиза восстановленных производных кислых ЭПС

Полисахарид' 1459-В не уступает как загуститель ксантану

(табл.7) и обладает хорошей псевдопластичностью . При снятии

напряжения сдвига исходная вязкость его растворов восстанавливается за 3-5 секунд. С увеличением скорости сдвига с 17,7 сек~^ до 150 сек~*динамическая вязкость l'A раствора полисахарида 1459-В снижается в 10 раз, тогда как для ксантана - в 5,5-5,8 раза. Это указывает на сильное молекулярное взаимодействие полисахарида в растворе.

Таблица 7.

Зависимость напряжения сдвига (Па) от скорости сдвига (сек-*) 1% растворов полисахаридов 1459-В, 20°С, выделенных различными

методами.

Скорост! сдвига

Г777"

27.2 41,7 64,0

98.3 150,0 233,0 358,0 549,0 842,0

1290,0

Препараты

1

2

~3~

5

6

60,6 64,3 67,6

72.1 76,0

81.2

ТТ7Т

46.8 50,7

53.9 55,9 60,4

41.6

42.5 44,2 46,8

48.7

52.6

14,9

15.6 16,2 18,8 20,1

22.7 24,0 26,6

7

23, Ь 24,9 26,2 28,2 30,8 41,5

10,4 13,7

11,0 13,6 17,0

18,5 20,2 24,5 27,1

12,8 14,0 16,0 18,5 21,9

В

4

1. Осаждение спиртом без нагревания суспензии и отделения клеток.

2. Предварительное автоклавирование, 105°С.

3. Предварительное автоклавирование, 121°С.

4. Ультрафильтрация суспензии и распылительная сушка.

5. Ультрафильтрация, добавление CaCL,, распылительная сушка. "Полимиксан-С".

6. Распылительная сушка, отделение клеток, осаждение спиртом. "Полимиксан-СП".

7. (образец для сравнения); Ксантан "Sigma" для лабораторных исследований

8. (образец для сравнения); Ксантан "Kelzan-S" для технических целей Подобно ксантану, полисахарид 1459-В сохраняет высокую вязкость

в широком интервале рН - 2,0 - 11,0. Как и ксантан, он хорошо совместим в растворах с солями жесткости (рис.7.) . Растворы полисахарида 1459-В при нагревании до 70°С резко теряют вязкость, которая восстанавливается до первоначальной величины при охлажде-

нии. На этом свойстве основан разработанный нами метод его очистки.

Таким образом, полученный полисахарид В.ро1ушуха 1459-В обладает загущающей способностью, псевдопластичностью, он устойчив в присутствии солей и превосходит ксантан; по этим свойствам.

отн.

0,005 0,01 0,025

■07ШГ

С, моль

Рисунок 7.

Зависимость вязкости 0,1% раствора кислого экзополисахарида

1459-В от концентрации солей, 20ЬС:

1- СН3С02На, 2- NaCl, 3- КС1, 4- MgCl2, 5- СаС12, 6- aici3.

4.1.1. ГОТОВЫЕ ФОРМЫ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА 1459-В.

С помощью спектротурбидиометрии мы разработали метод получения экзополисахарида 1459-В в виде мелкодисперсного порошка. При определении концентрации диспергированных частиц в 0,5% растворе полимера оказалось, что в присутствии ионов кальция она ниже, чем в деионизированной воде и в растворе NaCl. При рН 4,0-8,0 в присутствии СаС12она не превышает 3,5%,тогда как в деионизированной воде и в присутствии НаС1 при рН 7,0-7,5 - около 10%. В соответствии с полученными нами данными оказалось,что при распылительной сушке полисахарида 1459-В в присутствии СаС12 получается мелкодисперсный порршок, который при 20°С и рН 3-8 растворяется с образованием 1% раствора менее, чем за 2 часа. Аналогичный эффект был обнаружен нами и для ксантана.

Вязкость растворов полисахаридов 1459-В, в которых входит до 25% СаС12 (на общий вес порошка) достаточно высока, однако дальнейшее повышение в порошке концентрации СаС^ ведет к резкому падению вязкости растворов. Полученные данные хорошо согласуются с данными об экзополисахаридах БИеПИо-Б и БЬеППо-ХА, которые служат хорошими загустителями в присутствии 28% СаС12- При содержании СаС1£ в порошке ниже 7% эффект повышения скорости растворения исчезает; очевидно, оптимальная концентрация СаС^- 7-25%. Растворы нативных полисахаридов - ксантана и 1459-В сохраняют высокую вязкость в широком интервале рН. В присутствии СаС1£ область применения полисахаридов ограничена рН 4-8, т.к. при рН ч< 4 вязкость растворов резко снижается, а при рН > 8 увеличивается время растворения. Тем не менее, относительная простота получения полисахарида 1459-В в такой форме компенсирует этот недостаток. Метод положен в основу опытно-промышленного регламента на производство биополимера 1459-В порошкообразного "Полимиксан-П".

Обратимое снижение вязкости раствора экзополисахарида 1459-В при нагревании позволяет относительно легко концентрировать его растворы. На этом основан опытно-промышленный регламент на производство биополимера пастообразного с содержанием основного вещества до 6% (ТУ оп. 64-13-128-88).

Известно, что отделение бактериальных клеток из растворов экзополисахаридов достаточно сложно, так как полисахариды -хорошие стабилизаторы суспензий. Мы обнаружили, что бактериальные клетки, содержащиеся в "Полимиксане-П", практически количественно коагулируют при его растворении при 70-80°С и легко отделяются при этой температуре центрифугированием. В то же время, нагревание непосредственно культуральной жидкости 1459-В, в том числе и с добавлением СаС!^, не приводит к полной коагуляции клеток.

Полученный таким образом полисахарид "Полимиксан-СП", ТУ оп. 6413-138-89 с низким содержанием водонерастворимых компонентов хотя и уступает по вязкости нативным соединениям (табл.7) .однако благодаря хорошей псевдопластичности может найти практическое применение.

4.2.ЭК30П0ЛИСАХАРИД ЭТАНОЛОКИСЛЯЩИХ БАКТЕРИЙ Ас1пе1оЬааег эр. ШТАММ 12.

В настоящее время один из лучших эмульгаторов микробного происхождения, нашедших применение в нефтяной промышленности -экзополисахарид эмульсан, продуцент которого - этанолокисляющие бактерии Ас1пеЪоЬасЪег са1соасеЬ1сиг. Мы поставили задачу найти среди этанолокисляющих бактерий продуцент экзополисахарида, близкого по свойствам эмульсану, определить состав, реологические свойства и влияние на них условий культивирования. Предварительные результаты, полученные нами, показали, что бактерии Ас1пеЬо-Ьас1ег Бр. шт.12 (штамм селекционирован в отделе газоокисляющих микроорганизмов ИМВ им.Заболотного АН УССР) как продуценты полисахарида представляются весьма перспективными: синтез высокомолекулярного кислого гетерополисахарида идет с выходом 60% по этанолу , накопление в суспензии - до 1,3-1,8%, время культивирования - 24-36 часов. Таким образом, невысокое накопление полисахарида в суспензии (у ксантана - 2,4-3,3%) компенсируется более высокой скоростью его биосинтеза. Это обусловило наш интерес к полисахариду шт.12.

4.2.1. СТРОЕНИЕ ЭКЗОПОЛИСАХАРИДА АсШе^Ьа^ег ар. ШТАММ 12.

Мы показали,что полисахарид шт.12 отличается от эмульсана по своему моносахаридному составу. В состав эмульсана входят остатки аминосахаров и аминоуроновых кислот; в состав полученного нами

полисахарида входят остатки рамнозы, маннозы, галактозы, глюкозы, глюкуроновой и пировиноградной кислоты в соотношении 1:2:1:3:1:1. Экзополисахарид ацетилирован и, подобно эмульсану, ацилирован насыщенными жирными кислотами Ссостав и количество

которых в большой степени зависит от условий культивирования.

\ 13

По данным * С-ЯМР и химических методов анализа можно полагать, что основная цепь кислого полисахарида шт.12 представляет собой р-1,4- связанные остатки глюкозы, к двум из каждых трех остатков глюкозы присоединены боковые цепочки (рис.8).

—> [-4-0-Глю-р-1—»4Ч)-Глю-р-2—>4Ч)-Глю-р-1-}-» п ?2 3 3

11 II

Ь-Рам- оС ОАс 1ЬМан

п Т1

Б-Глю к-та-б Б-Гал •<•4 2 г II Ц-Ман-.

Ч4

Рисунок 8.

Вероятная структура повторяющегося звена кислого экзополи-

сахарида.

Как видно из рис.8, экзополисахарид Ас1пе1;о >ас1ег ер. шт.12 по своей структуре может быть отнесен к полисахаридам ксантаново-го типа. Присутствие по сравнению с ксантаном "лишней" боковой цепи в повторяющемся звене придает молекуле дополнительную конформационную подвижность, в то же время увеличивая жесткость основной цепи и тем самым повышая вязкость раствора экзополисаха-рида по сравнению с ксантаном. Наличие О-ацетильных групп, остатков жирных кислот и 6-дезоксисахара - рамнозы обусловливают более выраженную по сравнению с ксантаном эмульгирующую способность и гидрофобность полисахарида.

4.2.2.ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА СОСТАВ ЭКЗОПОЛИСАХАРИ Ас1пеЪоЬасЪег Ер. ШТ.12.

При определении влияния условий культивирования на состав экзополисахарида шт.12 оказалось, что ионосахаридный состав полимера исключительно стабилен независимо от природы источника углерода, что повышает его практическую ценность. Содержание жирных кислот в полисахариде зависит от природы источника углерода. Максимальное содержание жирных кислот (0,3%) обнаружено при использовании С^-соединений. Включение в среду фумарата калия (натрия) снижает содержание жирных кислот. Природа источника углерода влияет и на состав жирных кислот. При использовании С^ -источника углерода образуются С^, С^, С^-жирные кислоты, при

культивировании на глюкозе - преимущественно С.., С.а, С.„ и Сял

1Ь 10 1? ¿и

-жирные кислоты.

Наличие в полисахариде шт.12 остатков жирных кислот объединяет его с змульсаном, но в эмульсане их количество в зависимости от условий культивирования может достигать 15%.

Оказалось, что при культивировании на С^-соединениях образуется практически только кислый экзополисахарид. При культивировании на глюкозе наряду с кислым идентифицирован нейтральный полисахарид (до 5% от общего количества полисахаридов). В состав нейтрального полисахарида входят остатки глюкозы, маннозы и галактозы в соотношении 3:2:1.

4.2.3. РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАЗБАВЛЕННЫХ РАСТВОРОВ ПОЛИСАХАРИДА Ас1пе1оЬасЪег эр. ШТ. 12.

Разбавленные (40,1%) растворы полисахарида шт.12 представляют собой псевдопластические неньютоновские жидкости. Подобно ксантану, вязкость раствора полисахарида шт.12 падает с увеличе-

нием скорости сдвига. Даже для сильно разбавленных (0,015% вес) растворов вязкость падает на 90% при повизспип скорости сдвига с 0,02 сек до 100 сек Реологические свойства полисахарида шт.12 имеют ряд специфических черт, отличающих его от ксантана. К их числу относится поведение растворов полисахарида шт.12 в зависимости от рН, ионного состава среды и тепловой обработки растворов.

Мы обнаружили, что при понижении рН вязкость раствора полисахарида шт. 12, в отличие от ксантана, резко возрастает (рис.9). При понижении рН до 1,3 полисахарид осаждается из раствора в виде резиноподобной массы, ^отн.

. ;_;_•_;_._ 1Л1

-2-Л-5-8-

Рисунок 9.

Зависимость вязкости растворов полисахарида шт. 12 различной концентрации от рН, при 20°С.

Осадок полисахарида шт.12 в кислой среде медленно гидролизу-

ется при продолжительном нагревании. Так, в 2н серной кислоте при

100°С через б часов в осадке остается 88% исходного вещества, в

аналогичных условиях в 2н НС1 - 81%, в 4н НС1 - 68%.

Вязкость растворов полисахарида шт.12 резко возрастает в + о+ о ц.

присутствии ионов К , Саь , Ва^ и др. При этом характер изменения вязкости зависит в первую очередь от валентности катиона (рис.10). Характерной чертой полисахарида шт.12 является его специфическая реакция на ионы К"*"- в их присутствии резко увеличива-

ется вязкость раствора полисахарида, причем вязкость не снижается в широком интервале концентраций К^в растворе.

Зависимость вязкости 0,1% раствора полисахарида шт. 12 от природы и концентрации солей, рН 6,5, 20°С.

Методом спектротурбидиометрии мы показали, что в зависимости от ионного состава среды и рН структурирование растворов полисахарида шт.12 протекает различными путями: либо с образованием молекулярной сетки геля в присутствии ионов К+, либо с образованием крупных агрегатов молекул полисахарида в присутствии 2 +

ионов Са , в кислои среде . Эффект структурирования раствора полисахарида солями заметно падает с уменьшением концентрации полисахарида и при повышении температуры (рис.11).

По данным гель-фильтрации, нагревание как полисахарида шт.12, так и ксантана до 95°С приводит к образованию низкомолекулярных минорных компонентов. Тем не менее, в отличие от ксантана, вязкость растворов которого после тепловой обработки несколько снижается, вязкость растворов полисахарида шт.12 даже после

нагревания до 120 С и последующего быстрого охлаждения возрастает (рис.12).

отн.

-20°С ,30° С , 40°С

.-/ /50°С //, 60° С " /Х70вС -V/80°C

20°С«

->80°С

-^S"

ЖГ

"072" С(м)

Рисунок 11.

Зависимость вязкости 0,1% раствора полисахарида шт. 12 от концентрации КС1 и температуры, рН 6,5.

отн.

полисахарид шт. 12 В-3243 \ у

ксантан "Sigma"

■ . _._Концентрация

TJ7BI 0~ИЗ ЕГ7П5 ОТ 05 ¡МТ полисахарида

(% вер)

Рисунок 12.

Зависимость вязкости растворов полисахаридов от их температурной обработки 100°С, 30 мин. : - до нагревания;

-- - после нагревания.

Подобно большинству кислых полисахаридов, экзополисахарид шт.12 коагулирует в присутствии ионов А13+ и Ре^+ . При добавлении хелатообразователей полисахарид вновь переходит в раствор. Мы показали, что полисахарид шт.12 легко осаждается солями меди. Выпавший осадок легко растворяется при добавлении глицина. При этом вязкость полученного раствора резко возрастает.

Таблица 8.

Динамическая вязкость раствора, содержащего 0,1% полисахарида Ас1пеЪоЬасЬег ер. шт.12, 0,002 К СиБОи и 0,01 И глицина, 20°С. 4

Скорость л сдвига (сек ) 1 2 3 4

17,7 1,080 0,887 0,926 1,510

27,2 0,809 0,672 0,655 1,060

41,7 0,561 0,439 0,464 0,738

64,0 0,397 0,308 0,331 0,522

98,3 0,297 0,215 0,231 0,394

152,0 0,277 0,146 0,163 0,161

233,0 0,138 0,100 0,109 0,236

355,0 0,094 0,068 0,073 0,185

1- свежеприготовленный раствор;

2- раствор после стояния при 20°С, 20 суток;

3- повторное растворение высушенного при 130°С осадка - по-

лисахарид-СиБО^; 4- 1,0% раствор полисахарида шт.12 в деионизированной воде.

Как следует из табл.8, вязкость 0,1% раствора экзополисахарида

9 + о

Ас1пе1оЬас1ег эр. шт.12 в присутствии Си и глицина при 20 С

сравнима с вязкостью 1,0% раствора этого же полисахарида в деионизированной воде.

Очевидно, снижение количества полисахарида в 10 раз может оказаться достаточно экономичным для тех областей применения, где присутствие ионов Си^"*"не является препятствием. Эффект возрастания вязкости раствора полисахарида в системе Си^ - глицин обнаружен нами пока только для биополимера Ас1пеЬоЬасЪег эр. шт.12.

4.2.4. РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ РАСТВОРОВ ПОЛИСАХАРИДА Ас1пе1;оЬасгег эр. ШТ. 12.

Кривые течения 1% растворов полисахарида шт.12 и ксантана представлены на рис. 13. Растворы полисахарида шт.12, как и ксантана - неньютоновские псевдопластические жидкости; растворы полисахарида шт.12 в КС1 как до, так и после нагревания имеют более высокую по сравнению с ксантаном степень псевдопластичности.

Рисунок 13. .

Кривые течения 1% растворов полисахарида шт. 12 и

ксантана "Sigma" (ов) в воде (1) и 0,IM KCl (2) до (od) и после (*в) тепловой обработки. Гд) - культуральная жидкость Acinetobacter sp. (симусан), содержащая 0,95% вес. полисахарида после стабилизации и тепловой обработки.

Показатель структурной прочности растворов - динамический предел текучести Pij> - после тепловой обработки раствора полисахарида шт. 12 возрастает в 1,5 раза, тогда как в тех же условиях для раствора ксантана величина Ргр несколько убывает (рис.13) . 1% растворы как полисахарида шт.12, так и ксантана проявляют свойства твердообразных тел - имеют статический предел текучести Рст, ниже которого системы не текут. Максимальное значение Рс^, имеют растворы полисахарида шт. 12 в KCl. Таким образом, его присутствие повышает структурную прочность растворов полисахарида Acinetobacter sp. шт.12 и псевдопластичность (в отличие от ксан-

-1.

300

200

100

(Па)

тана), при этой динамическая вязкость растворов значительно возрастает. Как разбавленные, так и концентрированные растворы полисахарида шт. 12 превосходят по ряду функциональных свойств растворы ксантана той же концентрации, что позволяет использовать его с большей по сравнение с ксантаном эффективностью.

4.2.5. ЭМУЛЬГИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ПОЛИСАХАРИДА Аипе^Ьа^ег ер. ШТ. 12.

Большие по сравнению с ксантаном гидрофобность и кажущаяся мол. масса полисахарида шт.12 позволили предположить, что полимер будет обладать эмульгирующей активностью. Действительно, оказалось, что эмульгирующая активность полисахарида шт.12 почти в 3 раза выше, чем у ксантана. Подобно эмульсану, наибольшая эмульгирующая способность полисахарида шт.12 проявляется в системе с сырой нефтью, меньшая - с индивидуальными углеводородами. Полисахарид шт.12 близок по эмульгирующей способности эмульсану и является более универсальным эмульгатором, чем ксантан.

4.2.6. ВЛИЯНИЕ О-АЦЕТИЛЬНЫХ ГРУПП НА ВЯЗКОСТНЫЕ СВОЙСТВА ПОЛИСАХАРИДА Ас1пеи>ЬасЪег эр. ШТ. 12.

Мы показали, что структурирование растворов полисахарида шт. 12 различными катионами обусловлено присутствующими в нем О-ацетильными группами. После их удаления вязкость растворов модифицированного полисахарида при добавлении солей как одно-так и двухвалентных катионов в концентрации 0,005 М незначительно снижается и остается практически постоянной с увеличением концентрации солей до 0,2М. Аналогично в пределах рН 2-10 вязкость раствора дезацетилированного полисахарида меняется крайне незначительно, однако при рН 1,8 модифицированный полисахарид шт.12 также выпадает в осадок.

4.2.7. РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОСТФЕРМЕНТАЦИОННОЙ СУСПЕНЗИИ А<ппе1;оЬас^ег эр. ИТ.12.

Одна из готовых форм микробных полисахаридов, которая нашла применение в практических целях - постферментационная суспензия. Кривая течения постфермеггтационтэй суспензия Ае1пб1оЬас1б"р ар-, после ее тепловой обработки представлена на рис.13. Характер течения постферментационной суспензии существенно отличается от характера течения раствора полисахарида шт.12 той же концентрации. Основное отличие заключается в более выраженном свойстве ползучести у постферментационной суспензии - при низких величинах скорости сдвига наблюдается линейная зависимость напряжения сдвига от скорости.

Для постферментационной суспензии шт.12 (в том числе и после ее разведения) характерны те же реологические свойства, что и для растворов полисахарида - повыпепие вязкости после тепловой обработки, в присутствии КС1 и при понижении рН среды.

Таким образом, постферментационная суспензия после стабилизации и тепловой обработки - более структурированная система по сравнению с раствором полисахарида Ас1пе1;оЬас1ег эр. шт. 12 той же концентрации. Очевидно, это связано с присутствием 8 культу-ральной жидкости ионов металлов, структурирующих раствор полимера. Псевдопластические свойства постферментационной суспензии выражены слабее, чем у раствора полисахарида той же концентрации. Это может быть обусловлено дисперсным характером системы из-за присутствия в ней клеток продуцента. На основании полученных данных разработаны опытно-промышленные регламенты на производство "симусана" - полисахарида Ас1пе<;оЬасЪег эр. шт. 12 в виде стабилизированной постферментационной суспензии.

/

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Выделение и исследование состава и свойств микробных полисахаридов, полученных с помощью штаммов-продуцентов белка и новых штаммов-продуцентов, показали возможность реализации их производства и широкого использования в народном хозяйстве. Разработанный метод выделения маннанов позволяет получать их непосредственно из постферментационной суспензии дрожжей Candida, минуя стадию распылительной сушки, что может благотворно сказаться на экологической обстановке. Исследование показало, что маннаны, выделенные из готовых продуктов, стабильны по мол. массе и иммунохимическим детерминантным группам. Будучи модуляторами, маинаны могут найти применение как добавки к продуктам питания людей, находящихся в особо загрязненных регионах страны, а также зонах, подверженных радиации. Получение новых практически ценных экзополисахаридов на основе штаммов метанолокисляющих бактерий - продуцентов белка, открывает путь к их широкомасштабному получению. Поиск полисахаридов с выраженными функциональными свойствами, разработка методов их выделения,исследование состава и реологических свойств легли в основу технологий получения новых биополимеров "симусан" и "полимиксан". Высокая вязкость и псевдопластичность растворов полимиксана позволили получать его в виде различных готовых форм в соответствии с требованиями различных отраслей: сухой препарат - для промывочных жидкостей при бурении геолого-разведочных скважин (ТУ оп.64-13-139-89), пастообразный препарат - для интенсификации разработки нефтяных месторождений (ТУ оп.64-13-128-88), высокоочищенный препарат - для загущения водных систем и как наполнитель в различных отраслях промышленности (ТУ оп.64-13-138-89), препарат в виде постферментационной суспензии - для природоохранных мероприятий (ТУ оп.64-13-156-90). Симусан пред-

ставляет собой полисахаридсодержащую постферментационную суспензию с добавлением консервантов (ТУ оп. 61-13-127-88 и Извещения к ТУ ## 1 и 2). В нативном виде симусан используется как нефтевы-тесняющий агент для повышения нефтеотдачи пластов. Благодаря своим функциональным свойствам симусан оказался эффективным компонентом в различных композициях. Так, в настоящее время на основе симусана совместно с МНТК "Нефтеотдача" получены полимер-силикатные гели, которые нашли применение для изоляции обводненных протоков и при создании фильтрационных завес в технике подземного выщелачивания. Благодаря эмульгирующей способности симусан оказался эффективным компонентом моющих средств. На его основе разработана технология получения биологических моющих средств (ТУ оп.64-13-135-89 и ТУ 64-00567-90) для мытья посуды и технического оборудования. Принципиально важным является то, что производство микробных полисахаридов на основе почвенных микроорганизмов в виде постферментационной суспензии как готовой формы представляет собой безотходный процесс, а их использование (в частности, в виде таких композиций как биополимер-силикатные гели) экологически безвредно. К настоящему времени в мировом производстве водонабухающих и водорастворимых полимеров наблюдается тенденция, по крайней мере, к стабилизации стоимости этих продуктов и выпуску полимеров с ярко выраженными функциональными свойствами. При такой тенденции будущее принадлежит микробным полисахаридам. Действительно, цена синтетических полимеров из-за стремительно сокращающихся запасов нефти может только возрастать, тогда как промышленный синтез полисахаридов основан на использовании воспроизводимого сырья. При этом среди полисахаридов различного происхождения микробные полисахариды обладают свойствами, наиболее удовлетворяющими различные отрасли промышленности.

Уже найдены штаммы-продуценты полисахаридов к числу которых относятся и продуценты полимиксана и симусана , которые более технологичны, чем продуценты ксантана, и синтезируют полимеры с более . выраженными по сравнению с ксантаном функциональными свойствами. Сочетание таких штаммов-продуцентов с разработкой функциональных методов выделения полисахаридов и создание эффективных композиций на их основе открывает новые возможности широкого производства и применения микробных полисахаридов.

6.ВЫВОДЫ.

6.1. Найдены, выделены и идентифицированы новые экзополисахариды "симусан" и "полимиксан"которые превосходят ксантан по ряду функциональных свойств.

6.2. Показано, что симусан по структуре может быть отнесен к полисахаридам ксантанового типа; в отличие от ксЗнтана симусан необычно устойчив к присутствию минеральных кислот при нагревании, вязкость его раствора возрастает в кислой среде, в присутствии солей и после нагревания.

6.3. Обнаружена высокая загущающая способность и псевдопластичность экзополисахарида полимиксана. На основе функциональных свойств полимиксана разработаны методы его выделения и очистки.

6.4. Найдено, что штаммы метанолокисляющих бактерий - продуценты белка М.ше(;Ьу1ор1и1и£, АсеЬоЬасЬег эр. и А.ше-Ы1уПсит способны синтезировать в значительных количествах экзополисахариды и экзогликопротеины. Разработан новый метод выделения экзогенных полимеров Н.ше№у1ор1111из из культуральной жидкости.

6.5. Установлено, что кислый экзополисахарид Ы.те1;Ьу1ор1и1и5 способен к гелеобразованию в щелочной среде и изучен механизм

этого процесса.

6.6. Показано, что кормовые дрожжи - источник стабильных по составу наннанов, выявлены межвидовые и межштаммовые различия маннанов штаммов C.maltosa и С.tropicalis. Разработан метод выделения маннанов непосредственно из культуральной жидкости.

6.7. Обнаружено, что мутант, полученный УФ-облучением мицелия гриба P.ostreatus, утрачивает способность синтезировать ми-целиальный капсульный полисахарид типа гликогена. Установлено, что продуцентом биологически активных полисахаридов может служить мицелий гриба Fusarium sp.

6.8. Впервые для исследования надмолекулярной структуры микробных полисахаридов применен метод спектротурбидиометрического титрования; с его помощью разработаны быстрорастворимые готовые формы полисахаридов.

6.9. На основе результатов исследования разработана технология получения биополимеров симусана и полимиксана в виде различных готовых форм и композиций и организовано их производство.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Бланко Ф.Ф. , Дерябин В.В., Пименов A.A., Бовина Е.В. - Выделение, структура и биологическая активность дрожжевых маннанов.-Антибиотики и мед.биотехнология, 1987,32,N 12, 925-937.

2. Бовина Е.В., Дерябин В.В., Ланге A.B. - Влияние фракционного состава н-парафинов на состав углеводных компонентов клеточной стенки дрожжей Candida maltosa. -Тезисы докл. II Всесоюзн.конф. "Результаты и перспективы научн. исследований микробных полисахаридов", Л-д, 1984.

3. Бовина Е.В., Дерябин В.В. - Специфичность маннозосодержацих полисахаридов клеточных оболочек микроорганизмов. - Тезисы докл. YII Всесоюзн. микробиол.об-ва "Достижения микробиологии - практике", т.2, Алма-Ата, 1985, 24.

4. Бовина Е.В., Дерябин В.В. - Способ выделения дрожжевых манна-нов. - Труды МХТИ им. Д.И.Менделеева, вып.135 "Биотехнология и промышл.экология",М., 1985, 73-77.

5. Бовина E.B.j Дерябин В.В., Ланге A.B., Яроцкий C.B.- Структура маннана дрожжей Candida maltosa. - Прикл.биохимия и микробиология, 1986, XXII, N 5, 679-684.

6. Бовина Е.В., Дерябин В.В., Гаглоев В.Н., Серебряков Н.Г. -Изучение структуры маннанов дрожжей Candida maltosa и Candida tropicalis методом "С-ЯМР спектроскопии. - Прикл.биохимия и микробиология, 1988, XXIY, H 2, 218-225.

7. Зобнина В.П., Родионова Г.С., Дерябин В.В., Шакир И.В.,Логинова Т.Н., Яроцкий C.B. - Влияние ультрафиолетового облучения на мицелий гриба Pleurotus ostreatus. - Биотехнология, 1988, 4, N 5, 596-599.

8. Дерябин В.В., Бовина Е.В., Шерашов С.Г., Суворова Е.А., Лям-цев В.И. - Противоопухолевая активность полисахаридных фракций мицелия и культуральной жидкости гриба Fusarium sp. - Указатель неопубл. и ведомств, материалов., 1984, N 4 N 189 мб-Д 84 .

9. Дерябин В.В., Бовина Е.В., Морозова Г.Р. - Углеводный состав полисахаридных фракций из мицелия гриба Fusarium sp.- Указатель неопубл. и ведомственных материалов, 1984, N 4 H 188 мб-Д 84 .

10. Гринберг Т.А., Дерябин В.В., яшвшшЁЯштишт Старухина Л.А., Малашенко Ю.Р.- Экзополисахариды метилотрофных бактерий. - Микро-биол. ж-л, 1987, 49, H 2, 101-112.

11. Старухина Л.А., Дерябин В.В., Яроцкий C.B., Калунянц Н.П., Диканская Э.М., Родионов A.B. - Экзогенные углеводсодержащие биополимеры облигатного метилотрофа Methylobacillus methylophylus ВСБ-792 ЦМПМ В-1946 . - Тезисы YIII Всесоюзной конф. "Химия и биохимия углеводов", Тбилиси, 1987, 14-15.

12. Старухина Л.А., Дерябин В.В., Яроцкий C.B., Диканская Э.М., Калунянц Н.П. - Экзогенные гликопротеины облигатного метилотрофа Methylobacillus methylophylus ВСБ-792 ЦМПМ В-1946 . - Тезисы Всесоюзн.конф. "Перспективы создания лек.средств с использованием биотехнологии", М., 1985, 122.

13. Дерябин В.В., Старухина Л.А., Усов А.И., Яроцкий C.B., - Состав и свойства кислого экзополисахарида облигатно-метилотрофных бактерий. Тезисы II Всесоюзн. конф. "Результаты и перспективы научн. исследов. микробных полисахаридов", Л-д, 1984.

14. Калунянц Н,П., Диканская Э.М., Дерябин В.В., Долгая М.Б., Фе-дулова О.В., Старухина Л.А. - Образование экзополисахаридов обли-гатно- метилотрофными бактериями Methylobacillus methylophilus ВСБ-792. - Биотехнология, 1986, N 4, 35-39.

15.Дерябин В.В., Старухина Л.А., Усов А.И., Яроцкий C.B. - Кислый экзополисахарид облигатно-метилотрофных бактерий Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 ЦМПМ В-1946 .- Биотехнология, 1986, N 5,

16. Щеголев С.Ю., Старухина Л.А., Дерябин В.В. - Надмолекулярная структура кислого экзополисахарида облигатного метилотрофа Methy-

lobacillus methylophilus при гелеобразовании в щелочных средах.

- Тезисы YIII Всесоюзн.конф."Химия и биохимия углеводов".Тбилиси. 19S7, 166-167.

17. Shchyogolev S.Yu., Deryabin V.V., Starykhina L.A., Glukhova E.V.- Formation of supermolecular of bacterial exopolysaccharides by spectroturbidiometric method. -Y Eur. Symp. on Carbohydr., Prague, Czechoslovakia, 1989, B-66.

18. Щеголев С.Ю., Старухина Л.А., Дерябин B.B. - Надмолекулярная структура кислого экзополисахарида облигатного метилотрофа Methy-lobacillus methylophilys при гелеобразовании в щелочных средах.

- Прикл. биохимия и микробиология, 1989, XXY, H 5, 651-657.

19. Шкоп Я.Я., Фомченко Н.В., Яроцкий C.B., Дерябин В.В. - Способ выделения биомассы метанолокисляющих бактерий. - А.с.СССР N1054410 1982 . Б.И. N42, публ. от 15.11.83.

20. Дерябин В.В., Старухина I.A., Яроцкий C.B., Усов А.И., Шкоп Я.Я., Фомченко Н.В. - Способ получения раствора полисахарида из бактериальной суспензии. - A.c.СССР N 1255642 1984 . Б.И. N33, публ. от 07.09.86.

21. Starukhina L.A., Yarotsky S.V., Deryabin V.V., Rodionov A.V., Vyadro M.M. - Exoglycoprotains of obligate methylotrophic bacteria Methylobacillus methylophilus.- Y Eur. Symp. on Carbohydr., Prague, Czechoslovakia, 1989, C-13.

22. Калунянц H.П., Диканская Э.М., Старухина Л.А., Федулова О.В., Куликова В.П., Дерябин В.В. - Биосинтез внеклеточных углеводов ацидофильными метанолокисляющими бактериями.- Тезисы YIII Всесо-юзн.конф. "Химия и биохимия углеводов", Тбилиси, 1987, 182-183.

23. Глухова Е.В., Яроцкий C.B., Дерябин В.В., тендеров Б.А., Игнатов В.В. - Внеклеточные полисахариды почвенной бактерии Bacillus polymyxa и ее мутантного штамма. - Антибиотики и медицинская биотехнология, 1986, 31, N9, 669-674.

24. Глухова Е.В., Игнатов В.В., Дерябин В.В. - Влияние субстрата на соотношение и состав экзополисахаридов культуры Bacillus polymyxa. - Тезисы Всесоюзн. совещ. ВАСХНИЛ "Фитонциды. Бактериальные болезни растений", Киев, 1985, т.2, 5-6.

25. Glukhova E.V., Sokolova I.V., Ignatieva I.N., Deryabin V.V., Senchenkova S.N., Shashkov A.S., - Bacterial levans for medical purposes.- Eurocarb-YI, Edinburg, Scotland, 8-13 Sept.,1991,С.40.

26. Дерябин В.В., Краснопевцева Н.В., Бовина Е.В., Яроцкий C.B., Усов А.И. - Влияние компонентов питательной среды на соотношение и состав экзополисахаридов дрожжеподобного гриба Cryptococcus laurentii.- Прикл.биохимия и микробиол., 1985, 21, N 3, 407-411.

27. Малашенко D.P., Гринберг Т.Д., Пирог Т.П., Дерябин В.В. -Консорциум дрожжей С.tropicalis и бактерий Acinetobacter sp. -продуцент экзополисахарида. - A.c. СССР N 1311256 1985 . Б.И. N10, публ. от 15.03.90.

28. Гринберг Т.А., Дерябин В.В., Пирог Т.П., Краснопевцева Н.В., Бедрина E.H., Степанюк В.В., Малашенко Ю.Р. - Некоторые свойства полисахарида, синтезируемого культурой Acinetobacter sp. - Микробиол. журнал, 1987, 49, N 4, 24-30.

29. Гринберг Т.А., Дерябин В.В., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р. -Микробный синтез экзополисахаридов на основе С^ и С2 соединений.

- Тезисы YIII Всесоюзн.конф. "Химия и биохимия углеводов", Тбилиси, 1987,14-15.

30. Grinberg T.A., Pirog Т.P., Deryabin V.V..Krasnopevtseva N.V., Malashenko Y.R.- Some properties of polysaccharide synthesized by Acinetobacter sp. - II Int. Symp. "Overproduction of microbial products" - Ceshe Budejovice, Czechoslovakia, Prague, 1988, 191.

31. Дерябин B.B., Гринберг Т.А., Старухина Л.А.¡Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Игнатьева И.Н. - Реологические свойства водных растворов экзополисахаридов Acinetobacter sp., полученных при использовании различных источников углерода. - Биотехнология, 1990, N6, 44-46.

32. Дерябин В.В., Сенченкова С.Н., Лихошерстов Л.М., Старухина Л.А., Буторина H.H. - Состав и характеристика экзополисахаридов

бактерий Acinetobacter sp. - Тезисы Всесоюзн.конф. "Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в пищевых продуктах", Могилев, 1990, 218.

33. Дерябин В.В..Сенченкова С.Н..Старухина Л.А..Лихошерстов Л.М., Буторина H.H.. Чекарева Н.В. - Влияние условий культивирования бактерий Acinetobacter sp. на состав кислого экзополисахарида -Тезисы Всесоюзн.конф."Химия пищевых веществ. Свойства и использование биополимеров в швдевых продуктах", Могилев, 1990, 219.

34. Гринберг Т.А., Дерябин В.В., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р. -Микробный синтез экзополисахаридов на основе С1-С2 -соединений. - Прикл.биохимия и микробиол., 1990, 26, N 4, 445-455.

35. Пирог Т.П., Гринберг Т.А., Дерябин В.В., Малашенко Ю.Р. -Эмульсан - представитель нового типа промышленно важных внеклеточных биополимеров. - Биотехнология, 1990, N 4, 3-6.

36. Старухина Л.А., Павлова А.И., Дерябин В.В., - Сравнительная оценка эмульгирующих свойств бактериальных экзополисахаридов -ксантана и симусана, синтезируемого Acinetobacter sp., -ВНИИЭОНГ Сер."Техника и технология добычи нефти и обустройство нефтяных месторождений", Зкспресс-инф., М., 1990, вып.7, 38-43.

37. Дерябин В.В., Старухина Л.А., Григорьев Е.Ф. - Выделение экзополисахаридов микроорганизмов. - Биотехнология, 1988, 4, N 6, 735-743.

38. Григорьев Е.Ф., Болоховская В.А..Шинкаренко Л.Н., Халабузарь В.Г., Микша Т.Е., Кравец Л.Ф., Дерябин В.В., Бовина Е.В., - Способы получения высокоочищенных препаратов микробных полисахаридов, - A.c. СССР N1549996 1989 . Б.И. N10, публ. от 15.03.90.

39. Дерябин В.В., Титов В.И., Гарейшина А.З., Чижова И.Н. - Биополимеры для нефтяной промышленности, - ВНИИЭОНГ, Сер."Техника и технология добычи нефти и обустройство нефтяных месторождений", М., 1990, 1-39.

40. Starukhina L.A., Deryabin V.V., Titov V.l. - New biopolimer for EOR Moskow.- 6th Eur.IOR Symp., Stavanger, Norway, May 21-23, 1991, Vol I, Book I, 371-393.

41. Deryabin V.V., Starukhina L.A., Titov V.l., Likhosherstov L.M., Senchenkova S.N., Knirel Y.A. - Stadies of a new xanthan-like exopolysaccharide from an ethanol-consuming Arthrobacter sp. - Eurocarb-YI, Edinburg, Scotland, 8-13 Sept., 1991, A.47.

42. Дерябин B.B., - Применение микробных полисахаридов в промышленности,- Тезисы Всесоюзной конференции "Химия пищевых веществ. Свойства и использов. биополимеров в пищевых продуктах", Могилев, 1990, 215