Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическое и биохимическое исследование почвенных бактерий-антагонистов фитопатогенной микрофлоры

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое и биохимическое исследование почвенных бактерий-антагонистов фитопатогенной микрофлоры"

АКАДЕМИЯ 11АУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

на правах рукописи

УДК 579.25:579.6:579.222

ИСМАИЛОВ Зафар Файзуллаевнч

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ И БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ - АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОШННОЙ МИКРОФЛОРЫ

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

Автор е фер ат

диссертации на сЬискание ученой степени доктора биологических наук

Ташкент, 1896 г.

Patara выполнена в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова и Центре "Бишзнжаиеирмя" Российской Академии Наук

ОФЩИМЬШЕ оппадагш:

доктор биологических наук, профессор Прозоров A.A. доктор биологических наук, профессор Азимова Ш.С. доктор биологических наук МУрадов М.М.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Ташкентский государственный университет

им. М.Улугбека, биолого-почвенный факультет

„ „ ^ ^ ^ „, „ Q /оо

Защита состоится "''f/^v^re-O/А*1оааг. в ■*■' ч.^ юш.

на васедании Специализированного совета Д.015.02.21 при

Институте микробиологии АН Республики Увбекистан

по адресу: 700128 г.Ташкент, ул. Абдулла Кодири, ?б

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института мшфобиологии АН Республики Увбекистан

ан " ^

Автореферат разослан "•<--*-" /г^у //j\ 1906г.

Учений секретарь Специализированного совета

доктор биологические наук- яс^л.-^ Ходкибаева С.М.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Одной из актуальных проблем биологии является исследование механизмов взаимодействия разных видов организмов в биоценозе. В отличии от высших организмов, для которых основные принципы и механизмы взаимодействия их популяций достаточно хорошо исследованы и с экологической и с генетической точек зрения (АПала, 1984; Алтухов, 1989; Бигон и др., 1989; Одум. 1986), влияние одних видов микроорганизмов на другие, а тем более генетические механизмы, лежащие в основе этих процессов, остаются недостаточно исследованными (Егоров, 1986; Зенова. 1986; Кожевин, 1989; Тирранен, 1989; Никитина, 1991; Davison,- 1988; Weller, 1988; Weiler. Thomashow. 1993; Lara, Gaffney, 1993). Изучение механизмов антагонистической активности микроорганизмов показало. что в осноЕе этого лежит их способность более эффективно конкурировать за экологическую нишу, агрессивно колонизировать поверхность растений и продуцировать вещества антимикробного действия (антибиотики, сидерофоры, гидролитические ферменты, ле-'тучие соединения и др.). Значительно меньше сведений имеется о генетических механизмах процессов, лежащих в основе взаимодействия микроорганизмов друг с другом (Lara, Gaffney, 1993; Weller, Tomashow, 1993). Известно, что во взаимодействии микроорганизмов друг с другом часто принимает участие более чем одна из присущих км активностей. Оценить вклад и роль каждой из этих активностей является актуальной проблемой взаимодействия микроорганизмов, которую невозможно решать только традиционными микробиологическими методами. Современные методы генетики открывают широкие перспективы в решении данной*проблемы, - с помощью набора мутантов соответствующего микроорганизма вычленить роль и вклад всех возможных механизмов влияния одного вида или штамма бактерии на другой (Hass et al., 1991; Keel et al., 1992; Weller, Thomastiow. 1993). Решение проблемы биохимических и молекулярно-генетических механизмов взаимодействия микроорганизмов друг с другом позволит по новому взглянуть на вторичные метаболиты микроорганизмов, как генетически обусловленный и эволюционно сложившийся комплекс соединений, обеспечивающий выживание данного микроорганизма в окружающей среде.

Решение данной проблемы имеет важное прикладное значение. Массовое применение пестицидов для защиты растений от возбудите-

лей их болезней, которые являются причиной около трети потерь урожая культурных растений (Черменский. 1987; Попкова, 1989), нарушило экологическое равновесие в природе таким образом, что в природе появились устойчивые к ядохимикатам особи и популяции практически среди всех видов,возбудителей болезней растений. Использование микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности в качестве альтернативы химическим пестицидам, для разработки и создания биопрепаратов, направленных на подавление фитопатогенной микрофлоры, показало в ряде случаев их слабую эффективность в производственных условиях (Lynch, 1988; Лысак, Максимова, 1994; Новикова и др., ' 1994). Одним из основных препятствий по созданию такого рода'"экологически чистых" препаратов является недостаток знаний как о жизнедеятельности микроорганизмов в природе, так и механизмах их взаимодействия друг с другом. Поэтому решение проблемы взаимодействия микроорганизмов в природе может стать теоретической основой для создание эффективных экологически безопасных препаратов для защиты растений от возбудителей их болезней.

Цель исследования. Основной целью данного исследования является скрининг, идентификация и комплексное генетическое и биохимическое изучение почвенных бактерий, которые характеризуются выраженной антагонистической активностью против фитопатогенных бактерий и грибов. Отобранные штаммы бактерий предполагается исследовать на их способность синтезировать биологически активные продукты (антибиотики,- сидерофоры и гидролитические ферменты) и определить локализацию их генетических детерминантов. Выделенные в результате выполнения данной работы штаммы бактерий и полученные сведения о механизмах их антагонистической активности предполагается использовать для создания экологически безопасных препаратов для биологического контроля возбудителей болезней сельскохозяйственных растений (виноград, огурец, томат, хлопок и др.).

Задачи.

а) Провести скрининг бактерий на способность подавлять In vivo рост фитопатогенных бактерий (A.tumefaclens, Е. carotovora. P.syringae pv. lachrlmance, P.syrlngae pv. syrlngae, X.campestris pv. malvacearum и др.) и грибов (В.cinerea. F.graminearum. F. oxysporum. R. solanl, V.dahllae и др.).

б) Определить систематическое положение отобранных штаммов -антагонистов. % . '

ного текста, содержит 37 таблиц и 59 рисунков.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. .

В данной главе приведены основные сведения о генетических и биохимических механизмах антагонистической активности почвенных микроорганизмов против фитопатогенной ■ микрофлоры. На • примере представителей Agrobacterium sp., Bacillus sp., Enterobacter sp. и Pseudomonas sp. показана возможность использования их предста- . вителей в качестве средств, позволяющих контролировать развитие болезней, вызываемых фитопатогенной микрофлорой. Рассмотрены перспективы использования микроорганизмов в системе защиты растений от фитопатогенов.

Глава II. МАТЕРНАШ И МЕТОДЫ.

В главе приведен перечень штаммов бактерий и плазмид использованных при проведении данной работы, а также список штаммов микроорганизмов, которые служили в качестве тест-культур при исследовании антагонистической активности. Номенклатура генетических маркеров даны в соответствии с .предложенной Новиком с соавторами. '(Novlck et al.. 1976).

В работе использованы генетические, биохимические, микробиологические, вегетационные и полевые методы исследований. Статистическую обработку результатов исследований проводили с-использо-. ванием пакета программ Statgrafics (version 3.0), а графики и гистограммы построены с помощью пакета программ Harvard Graflcs (version 2.00, 1987).

Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Раздел I. ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЧЗООЗПТАКЩНХ БАКТЕРИЙ - АНТАГОНИСТОВ вЩЮПАТОГШОЙ МИКРОФЛОРЫ.

Антагонистическая активность выделенных штаммов -антагонистов против патогенных бактерий и грибов. Из ризосферы растений, произрастающих на сероземных почвах Республики Узбекистан (Самаркандская область), среди более, чем 3000 изученных клонов бактерий, отобранных из различных органов и тканей растений и прилегающей к ним почвы, было выделено 11 наиболее активных изолятов , бактерий - антагонистов широкого круга фитопатогенных бактерий и грибов. Исследование антимикробной активности данных изолятов показало. что они способны подавлять рост и развитие около 40 видов бактерий и грибов - фитопатогенов-растений, а также патогенных и условнопатогенных бактерий человека и животных. Исследование

чувствительности патогенов к действию отобранных изолятов бактерий показало, что выраженное антимикробное действие было характерно для клонов 51, 57, 1270 и 27, которые были идентифицированы как A.radlobacter, B.polymyxa, E.agglomerans и P.putlda, соответственно. В таблице 1 представлены данные об антимикробной активности штаммов бактерий по отношению к некоторым из изученных фитопатогенных микроорганизмов. Видно, что рост основной массы изученных видов фитопатогенных микроорганизмов в той или иной степени подавлялся представленными в данной таблице штаммами-антагонистами. Видно, что штамм A. radlobacter 51 достаточно эффективно подавляет рост лишь 3-4 видов грибов, а штамм B.polymyxa 57 подавлял рост всех представленных фитопатогенов (табл. 1). Высокая биологическая активность данного штамма была выявлена против таких грибов как B.cinirea, F.oxysporum и V.dahliae. Штамм P.putlda 27 характеризовался, по сравнению со штаммом B.polymyxa 57. способностью подавлять рост меньшего количества фитопатогенных штаммов. Из представленных штаммов Enterobacter sp. практически все бактерии в той или иной степени подавляли рост фитопатогенных грибов. Относительно высокой антагонистической активностью в отношении грибов F.oxysporum, F.oxysporum f.solanl и R. solani характеризовались штаммы Е. agglomerans 960, 993 и 1270.

Исследования проведенные с патогенными и условнопатогенными бактериями человека и животных продемонстрировали высокую антимикробную активность штаммов B.polymyxa 57, P.putlda 27 и E.agglomerans 992, 1270 и 960 против возбудителей болезней человека (гастроэнтерит, дизентерия). При этом, лишь штамм B.polymyxa 57 характеризовался способность подавлять рост одного из самых опасных возбудителей госпитальных инфекций, - синегнойной палочки (P.aeruginosa).

Исследование эффектов штаммов -антагонистов на культуру нематоды Caenorhabdltls elegans. Исследование влияния штаммов-антагонистов на культуру нематоды С. elegans показало, что они не способны оказывать непосредственное токсическое-воздействие на данный организм. Однако, было отмечено наличие таких явлений как обрастание клетками штаммов E.agglomerans 993 и 1270 поверхности кутикулы нематоды, что сопровождалось нарушением двигательной активности этого организма и гибелью личинок и части яиц. Наличие в среде обитания нематоды штамма-антагониста В. polymyxa 57 приводи-

Таблица 1.

ВЛИЯНИЕ ШТАММОВ АНТАГОНИСТОВ НА НЕКОТОРЫЕ ФИТОПАТОГЕННЫ.

1 ......г 1 1 ■ i j Бактерии-пнтагонисты |

! .'! 1 Вид, штамм

l • t

I /1 фитопатогена IA.radio- B.poly-!P.putidai E.agglo- |

1 и ! I bacter rsyxa j \ rasrans !

! ! 1 I j 51 « 57 | 1 27 | i 1270 1

Г 1 1 ! Б А К T E P И И: С ! 1 ! ! 1

i 1 1 А. tumefaciens 1D1 1 ++ M. | ++ | +++ |

1 2 | C.ntichiganese 13а 1' ++ 4+ 1 44 j 44+ |

1 з ! Е. carotovora 8982 ! ++ 44 j ++ j 444 |

! 4 j 1 ! Р. syringae pv. lachrirnancs 7595 f +4 +4 1 i 4-+ j 1 444 j

1 5 | ! 1 Р. syringae pv. syringae 8511, ! ■<•+ 1 1 ä ++ 1 1 444 |

1 6 ! Serratia sp. 1198a-l | ++ j +4 | + |

1 7 1 X. aiapilina 10a 1 +*+ j +♦ J 0 !

1 8 | X.campsstris pv. 1 *■ ++ I + 1 + |

I 1 caapestris 8003b s i

1 9 I 1 1 1 ! X. caspsstris pv. räalvaceanim 651S ГРИБЫ: | ++ 1 i 444 l 1 1 ++ ! ! |

1 101 В. sorokiniana 1 о +♦+ ! 0 1 + |

1 iil 3. cinerea 1 +/- " 444 | «■s- ! + 1

1 128 F. graminearaa 1 ++ 44 1 +++ j + |

1 аз! F. oxysporaa ! ++ 4444 i +++ | 4+ |

S Hj i 1 F. oxysporm f.lycopersicoa S и.о. I 44 j i и.о. 1 I 44 |

i 15f F.oxysporaa i.Esloni | + 44 f 0 ! * 1

1 16! F.oxysporaa f.solani 1 + * ! 44 j 44 |

i 17! ! 1 F. sporotrichiella f. pcas | •«■++ 1 +++ | J 4 |

1 18! P. oryzae I +/- ++ 1 +/- | 4 |

! 19 S R. solani 1 + ++ I + 1 44 |

I 20| 1____u 4. daJilias I о -i____ +«■+ f _u о 1 . i. 4 | 1

ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр зоны подавления роста (в мм): н. о. - не определяли; 0 - не подавляет; (+/-) - менее 5; (+) - от 5 до 10; (++) - от от 11 до 20; (+++) - -21 до 30; (++++-) - свыше 30.

ло к замедлению индивидуального развития данного организма, снижению его яйцепродукции и низкой плотностью популяции нематод с преобладанием большого количества недоразвитых мелких особей.

Раздел II. СИСТЕМАТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ОТАММОБ-АНТАШШСТОВ И ИХ ИКЭТОЗКОЛОГЕЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА В этом разделе представлены данные о систематическом положении отобранных штаммов-антагонистов и их происхождении. Значительное место уделено, подробному микробиологическому описанию характеристики штаммов бактерий A.radlobacter 51, B.polymyxa 57, E.agglomerans 1270 и P.putida 27, которые были выделены из ризосферы хлопчатника (A. radlobacter 51), из тканей виноградника пораженных бактериальном раком (B.polymyxa 57 и E.agglomerans 1270) и ризосферы яблони (P.putida 27). Анализ плазмидных профилей этих штаммов по методу (Kado. Liu, 1981) показал, что они не содержат плазмид с молекулярной массой менее 130 мД (около 200 тпн). Кривая роста данных бактерий имеет типичную форму, - после лаг-фазы, которая продолжается в течении 3,5 - 4 часов, начинается фаза экспотенциального роста, продолжительностью в 5 - 6 часов, переходящая в фазу замедленного роста.

Представленные штаммы антагонисты ■ были исследованы в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А.Тарасевича (Россия) на патогенность для лабораторных мышей. Штаммы-антагонисты депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. .

Раздел Ш. ШОКСНТРОШРУЩАЙ , АКТИВНОСТЬ ETAMS АНТАГОНИСТОВ ПРОТИВ СИТСПАТОГЕЙОБ В УСЛОВИЯХ ВЕОТ/ЩШШШ И ТОЛЕВЫХ ОГОГГОЗ. ' В данном разделе представлены результаты испытания способности штаммов-антагонистов (A.radlobacter ■ 51, B.polymyxa 57, E.agglomerans 1270, P.putida 27) и их смесей подавлять развитие болезней растений, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами в условиях вегетационного и полевого опыта, а также в условиях защищенного грунта. На примере И моделей фитопатоген - хозяин (растение) показано, что биоконтролиругацая активность штаммов-антагонистов в зависимости от условий эксперимента и используемой модели варьирует в широких пределах (табл. 2)..В качестве показателя способности бактерий влиять на развитие болезни у растений использовали индекс подавления болезни (ИПБ),, который определяли

Индекс подавления болезни (%) растений в системе фитопатоген -

Таблица 2. штаммами антагонистами хозяин.

|И

Бактерии-антагонисты

Смесь!

I/ | Патоген - хозяин г 1 т- атак-1

!М 1 1 i 1* 1 2 [ 3 ! 4 I MOB | I

f . ,.......................................... , 1 | ВЕГЕТАЦИОННЫЙ СПИТ I i ! l 1 ! 1

|1 lA.ttusefaciens - виноград! 70.4 1 - - 1 - " 1

¡2 ¡Erysipiiales томат 1 23,1 8 74.4 80. 0 ! 43.8 91.3 1

¡3 |Р. lachryisans - огурец 1 - ! 92.2 89.6 ! so.s - 1

|4 ¡B.solani хлопах 1 - I 32.3 79.2 I - - 1

|?i. trifoliorum - •спезгр 1 - 1 78.0 93.9 ! - зо.о !

|5 ¡X. ca-mpestris - кг-устг 1 - ! 92.1 - 1 82.7 - !

i | В ЗАЩЩЕШШМ ГРУНТЕ 1 1 1 !

|i 5 В.cinerea томат | • - ■ ! Si.o 48.2 { 49.3 - 1

¡2 |В.cinerea огурец 1 - ! - 24.5 5 44.7 - !

¡3 ¡ErysipHales томат 5 20.3 ! S3.4 55.8 S 43.3 64,3 1

|4 ¡Erysiptiales огурец | - ! - 55.3 ! 53.6 84.9 |

15 lU.necator виноград! - ' ! 50.4 ЗЭ.З ! 36.2 62.7 i

j i ПОЛЕВОЙ ОПЫТ | ! I 1

|1 |В.cinerea виноград! - ! 30.7 26.7 S 37.4 SO. 7 !

12 SB.cinerea огурец ! - ! - 47.5 8 49.7 - s

|3 ¡F.oxysporum томат | - 1 - 62.3 1 70.5 J

¡4 jW. trifoliorum ~ ii. клевер | 1 50.0 ! 23.0 -1-, __ 63.4 ________ ! 64.5 !------ . 89.1 i i

Примечание: * - 1 - А. radiobacter 51; 2 -3-Е. agglomerans 1270; 4 - Р. putlda 27.

3.polymyxa 57;

по формуле ИПБ = (1 - /Нк) *ЮО. где И0 и Н» - количество больных растений в опыте и в контроле, соответственно. У штамма В.ро~ 1ушуха 19 ИПБ варьировал от 23% в модели М^гШИогигл - клевер луговой до 92% в моделях . X. сатреэ^э - капуста и Р.зуг1гщае ру.1асПг1шапз - огурец. Аналогичные колебания ИПБ были характерны' и для штаммов E.agglomerans 1270 и Р.риШа 27. Напротив, при использовании смесей культуральных жидкостей данных микроорганизмов в соотношении 1:1:1:1 ИПБ растений варьировал в значительно мень-

Таблица 3.

Индекс подавления болезни (%) растений штаммами-антагонистами в различных условиях эксперимента

Опыт

Бактерии-антагонисты т-1-г

Т

1*

Смесь штаммов М ± ш

Вегетационный

В закрытом грунте

45.8^-23.6173.6+11.0! 87.2+4.9 165. 7+13.6 I ! 1

20.8**|53.2±3.7 844.3+8.1 ¡44.8+4.9

I 1.1

50.О*»¡28.1+3.3 {51.2+7.8 ¡55.5+8.6

85.7+5. 7 68. £+6.3! 70.2+9.5

1.75 0.55 0.26

Средний показатель

41. Iill.8l55.4i7.1 160.9+5.4 ¡53.0+4.0

72.9+4.6

2.5 I 2.1 1 1.69 | 2.96 ' ■ '_

а

Примечание: *. - 1 - А. гас31оЬааег 51; 2 - В.ро1утуха 57;

3-Е. а^1отегапз 1270; 4 - Р.риШа 27. ** - был проведен один эксперимент.

шей .степени, - от 60 до 91%. • .

Сравнение способности штаммов антагонистов подавлять развитие болезней растений в разных «условиях эксперимента, независимо от использованой модели показывает снижение ИПБ данных микроорганизмов от вегетационного опыта в контролируемых условиях к опыту в защищенном грунте и тем более в полевом опыте (табл. 3). Видно, что ИПБ штамма В.ро1ушуха 57 в вегетационном опыте был почти в 2.5 раза больше того, что наблюдалось в условиях полевого опыта. Статистически достоверное снижение показателя ИПБ между вегетационным и полевым опытом было характерно и для штамма Е. agglomerans 1270. Для штамма Р.риШа 27 различие между этими опытами' было ' недостоверно. Анализ биоконтролирующей активности смесей штаммов антагонистов показывает, что ИПБ данной смеси в зависимости от условий экспериментов варьирует в узком пределе и наблюдаемое различие статистически не достоверно. •

Рис. 1; Индекс подавления болезни (в %) серая гниль огурца (В. cinlrea) штаммами-антагонистами на искусственном инфекционном .фоне в условиях открытого (газ) и закрытого (S23) грунта: 1 - триходермин; 2 - топсин; 3 - Е. agglomerans 1270; 4 - P.putlda 27.

Показано, что способность штаммов P.putidá 27 и Е.agglomerans 1270 подавлять развитие серой гнили у огурцов сравнима с действием 'на возбудителя данной болезни химического-фунгицида топсин и биопрепарата триходермин. Причем, результаты эксперимента на модели огурец - серая гниль в условиях полевого' опыта и в закрытом грунте на искусственном инфекционном фоне показывают, что в случае использования триходермина и бактерий штамма P.putidá 27 ИПБ, независимо от почвенно-климатических условий, имеет .практически одинаковые значения (рис. 1). Сравнимая с антигрибной активность» химического Фунгицида тилт эффективность подавлять мучнистую росу винограда была показана для штамма P.putlda 27. Аналогичные результаты были получены при сравнении способности штампов B.polymyxa 57, E.aggloinerans 1270 и P.putlda 27. с одной стороны, и фунгицида болетин, с другой стороны, выступать в качестве протравливателя для предпосевной обработки семян клевера против его болезней.

Раздел IV. ИССЛЕДОВАНИЕ СПОСОБНОСТИ ШТМШОВ-АНТАГСШСТОВ К

КОЛОНИЗАЦИИ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕШШ. В данном разделе показана способность изученных бактерий колонизировать поверхность корней растений.

Исследование колонизации бактериями корней огурцов, томатов и пшеницы сорта "Безос'тая-1" с помощью генетически маркированных антибиотиками штаммов-антагонистов A.radiobacter 51. B.polymyxa 57, E.agglomerans 1270 показало их способность активно заселять ризосферу данных растений. При этом, .по мере роста корневой системы растений, клетки штаммов данных микроорганизмов активно размножались на поверхности корней и 'заселяли поверхность корня по мере его роста.

Способность штаммов антагонистов колонизировать ризосферу растений было подтверждено на примере клеток штамма E.agglomerans 1270, в которые конъюгацией была введена плазшда pBS16 содержащая гены lux-оперона морокой бактерии Photobacterlum leiognathi (Бурмакина и др. 1993). В результате клетки данного штамма приобрели способность люминисцировать. При этом штамм E.agglomerans 1270 pBS16 сохранил свои антимикробные свойства против изученных тест-культур, а плазмида pBS16 достаточно стабильно поддерживалась в клетках данного штамма (при росте клеток E.agglomerans в жидкой питательной среде элиминация плазмиды pBS16 наблюдается у 5% клеток лишь через 10 дней).

Изучение колонизации корневой системы проростков огурца с помощью штамма E.agglomerans11270 pBS16 позволило непосредственно наблюдать за распределением клеток данных бактерий на поверхности корня в темноте. Аналогичные исследования, проведенные с семенами кормовых культур (рапс, горчица, горох, пелюшка, кормовые бобы, люцерна и клевер), показали, что в процессе прорастания семян данных растений, которые предварительно были обработаны клетками E.agglomerans 1270 pBS16, клетки бактерий "переходят" на поверхность органов проростков и, таким образом, распределяются на его поверхности. Исследование выживаемости клеток, штамма E.agglomerans 1270 (pBS16) в нестерильной- сухой почве позволило продемонстрировать динамику изменения численности популяции данных бактерий, - при внесении в почву данных микроорганизмов из расчета кл/ил на одш грамм почвы) количество этих бактерий через 30 дней снизилась почта в 1000 раз.

Раздел V. БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОДУКТОВ. ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ-МИКРООРГАНИЗМОВ.

5.1. Исследование антибиотических веществ штаммов-антагонистов.

Исследование способности вторичных метаболитов штаммов-антагонистов В. ро1угауха 57. Е. agglomerans 1270 и Р.риШа 27 диализо-ваться через целлофановую мембрану показало, что клетки данных бактерий выделяют в окружающую среду вещества с низкой молекулярной массой. Учитывая характеристику мембраны, можно заключить, что антимикробные вещества, продуцируемые данными штаммами-антагонистами. имеют молекулярную массу менее 12 кД (Дэвени, Гергей, 1976; Ленинджер, 1976). Изучение чувствительности данных метаболитов к нуклеазам (ДНК-аза - 100 мкг/мл и РНК-аза - 50 мкг/мл) и протеазам (проназа Е - 50 мкг/мл и трипсин - 50 мкг/мл) показало их устойчивость к указанным ферментам.

В результате проведенных опытов была разработана методика выделения антибиотика-сырца штамма В.ро1ушуха 57. Поиск оптимального растворителя для элюции данного антибиотика с поверхности активного угля позволил выбрать в качестве реадсорбента смесь бу-танол-1 - Нг0 - уксусная кислота в соотношении 78:17:5. С ломощыо данного элюента была получена фракция антибиотика-сырца, которая сохраняла свою активность при разведении более чем в- 500 раз и имела светло коричневую окраску. Исследование подвижности молекул антибиотика-сырца в трех электродных буферах с рН=9.О, рН=7.О и в 2% растворе уксусной кислоты в электрическом поле показало, что молекулы антибиотика-сырца штамма В.ро1ушуха 57 имеют положительный заряд. Предварительный анализ антибиотика сырца показал, что он имеет молекулярную?;массу менее 12.5 кД. Дальнейшие исследования антибиотика-сырца проводились с наиболее активной фракции данного антибиотика, которая была получена в результате его очистки на фосфоцеллюлозе Р-1. С помощью гельфильтрации и масс-спектрометрии было показано, что антибиотик имеет молекулярную массу около 1200Д. Полученное вещество было устойчиво к нагреванию в течении 5 минут.при температуре ЮО°С.

Исследование культуральной жидкости клеток штамма Е.agglome~ гапэ 1270 показало, что в ней содержание антимикробного вещества' значительно уступает тому, что мы имели в случае штамма В.ро1ушу-ха 57. Тем не менее в результате проведенных исследований удалось экстрагировать хлороформом антибиотик-сырец штамма Е.agglomeranз

1270 из агар-агара, на котором культивировали клетки данного микроорганизма.

5.2. Сидйрофорная активность апгаммоа антагонистов. Исследование способности отобранных штаммов-антагонистов

синтезировать сидерофоры, проведенное на среде МПА с хлорным железом (FeCl3, 100 мкг/мл) и без него показало, что наличие хела-тирующего соединенияи было характерно лишь для клеток штаммов P.putida 03 и P.putida 27. При этом на примере клеток тест-культуры фитопатогенного штамма P.syrlngae pv.syrlngae 8511 было показано, что избыток ионов Fe3* в питательной среде снимает анти-'■ микробную активность штаммов P.putida. Наблюдение за ростом штамма-антагониста P.putida 27 на среде King В показало, что колонии данного штамма имеют желто-зеленую пигментацию, которая исчезает при добавлении в среду FeCl3 (100 мкг/мл). При этом штамм P.puti-аа 27 утрачивал свою антагонистическую активность против фитопа-тогенной бактерии P.syrlngae pv.syrlngae 8511 так, как это наблюдалось в случае со средой МПА+РеС13.

В потоке УФ-лучей (360 - 390ны) наблюдается интенсивное желто-зеленое свечение бесклеточной культуральной жидкости штамма P.putIda 27 за счет флюоресценции природного пигмента, синтезируемого клетками данного штамма. При внесении в данную культураль-ную жидкость FeCl3 (100 мкг/мл) флюоресценция мгновенно прекращается. а цвет супернатанта при дневном освещении изменяется от желто-зеленого к красно-коричневому цвету. Подобное изменение культуральной жидкости в результате внесения ионов железа свидетельствует о связывании ионов Fe3* сидерофорами P.putida 27.

Таким образом, было показано, что антагонистическая активность, по крайней мере, двух изученных штаммов (P.putida 03 и 27) определяется синтезом сидерофоров. Приведенные данные позволяют предположить, что штамм P.putida 27 продуцирует сидерофор, сходный с псевдобактерином или пиовердином.

5.3. Гидролитическая активность вташов антагонистов Анализ хитинолитической и протёолитической активностей у

клеток штаммов-антагонистов привел к их обнаружению лишь у штаммов Enterobacter sp. Было показано, что при культивировании штаммов Enterobacter sp. на среде SM+LB (3:1) с коллоидным хитином (0.2%) в течении 72 - 96 часов вокруг колоний клеток данных штаммов появляются цеткие зоны просветления среды образующиеся за

смет гидролиза хитина. Из данных литературы известно о важной роли хитинолитических ферментов для биоконтролиругацей активности штаммов-антагонистов (Shaplra et al.. 1989: Inbar, Chet, 1991; Lim et al., 1991).

Исследования проведенные со штаммами A.radlobacter, B.poly-myxa и P. putida показали, что они не способны гидролизовать коллоидный хитин и использовать его в качестве единственного источника питания.

Хитинолитическая активность штаммов Enterobacter sp. Исследования культуральной жидкости клеток штаммов Е. agglomerans 960, 993 и 1270, которые росли в среде SM с хитином показало, что максимума хитинолитическая активность в культуральной смеси достигает через 60 часов от начала культивирования, что соответствует переходу культур клеток данных штаммов, и, в частности Е. agglomerans 1270, в стационарную фазу.

Наличие хитинолитической активности в культуральной жидкости оставляло открытым вопрос о ее присутствии внутри клетки. Анализ фильтрата разрушенных клеток показал. чт° хитинолитическая активность обнаруживается также и внутри клеток штаммов Е. agglomerans.

Аналогичные исследования, проведенные с культурой клеток штаммов Е. agglomerans 960, 993 и 1270, которые росли на среде SM с сахарозой в качестве источника углерода вместо хитина показало наличие хитинолитической активности лишь у клеток штамма Е.agglomerans 960. Правда, при этом ее уровень составлял менее 1055 от того, что мы имели в случае ее индукции хитином. Иными словами, из числа изученных штаммов, лишь в случае клеток штамма Е.agglomerans 960 было продемонстрировано наличие слабого конститутивного синтеза хитинолитических ферментов.

Исследование ферментов, ответственных за хитинолитическую активность клеток штаммов Е.agglomerans 960, 993 и 1270 с помощью субстратов, в которых мономер хитина Н-ацетил-О-глюкозамин связан с флюоресцентным веществом 4-метилумбеллиферил (4-MU): 4-MU -GlcNAc). 4-MU - (GlcHAc)j, 4-Ш - (GlcNAc)j (Sigma МО., США), позволило определить наличие хитинолитических ферментов внутри и вне клеток указанных микроорганизмов (McGrew, Green, 1990; Haran et al.. 1994).

Показано, что штаммы Е. agglomerans 960, 993 и 1270 синтезируют и выделяют в окружающую среду, по крайней мере, 4 различных

1 2 3 4 5 6 7 8 ЩКОа)

Л_I_а___I__ и I

Рис. 2. Электофореграмма белков штаммов Е. ая£1ошегапз растущих на среде ЗМ с хитином. Положение полос на электрофореграмме определяли субстратом 4-Ми-рЧ)-и, Я-диацетилхитобиозид

[4-ми-(С1сНАс)г). Секретируемый белок: 1 - Е.а^1отегапз 1270; 5 - мутант 1270-Е1; 2 - Е.авз1 олвгапэ 960; 3 - Е.agglomerans 993; белок Е-а^отегапэ 993 нагретый до 55°С без 2-меркаптоэтанола (7) с 2-меркаптоэтанолом (8). Внутриклеточный белок Е. agglomerans 1270 (4) и его мутанта 1270-Е1 (6).

фермента с молекулярными массами 89кД. 67кД, 59кД и 50 кД, которые были обозначены как СН1Т89, СН1Т67, СН1Т59 и СН1Т50. соответственно (рис. 2 и табл. 4). В культуральной жидкости клеток штаммов Е. agglomerans 960 и 993. растущих на среде БМ с хитином, были обнаружены все четыре фермента, тогда как в случае штамма E.agglomerans 1270 было обнаружено только три фермента. - СН1Т89, СШТ67 и СН1Т59. Результаты проведенных исследований показывают, что в клетках штамма E.agglomerans 1270 активность фермента СН1Т59 значительно слабее по сравнению с тем. что мы наблюдаем у штаммов E.agglomerans 960 и 993.

Использование набора указанных флюоресцирующих соединений (4-ми - б 1сМАс), 4-ми - №сШс)г: 4-М1) - (С1сМАс)3) позволил определить субстратную специфичность выявленных хитинолитических ферментов. Например, ферменты СН1Т89 и СН1Т67 регистрировались в случае использования всех трех субстратов, а фермент СН1Т59, - с три- и тетрамерными субстратами и СН1Т50 - только с димерным субстратом. Кроме того, анализ результатов электрофореза фильтрата культуральной жидкости клеток штаммов Е. а^1отегапз 960. 993 и 1270, полученных с помощью три- и тетрамерных субстратов, продемонстрировал наличие дополнительного белка с молекулярной массой

Таблица 4.

свойств^ хитинолитических ферментов штаммов Е^в1отегапз.

1-г |Н | 1/ 1 |Н | Свойство Ферменты 1 1 и

СН1Т89 1 1 1 I СНХТ67 СН1Т59 5 * 1 ШТ50 |

1 И Молекулярная масса 89 { I 67 59 ! 50 I

1 21 Субстраты: 1 1 !

4-Ми-(ИсНАс) ♦ 1 * | - I

4-Ми-(ИсНас)2 + | « + | * ^

4-М1ЫС1сМАс)3 + | + + | - 1

I з! Среда БМ^хиетш ! 1 !

Е^§1стегапз 950 ♦ 1 + + 1 ♦ 1

Е.а^1шегапз 933 1 + + | » 1

Е.айз1шегапз 1270 I + * 1 (

! 4! Среда БМ+глюкоза 1 1 !

Е.аёа1отегапз 920 + 1 * ♦ 1 - 8

Е.ай81отегапз 993 - ( 8 - 1

Е. аййЮаегапз 1270 - 1 ! - !

1 5! Восстановление 1 I 1

акткзкости после I 1 1

обработки: 1 1 8

- температурой + I - ♦ 1 ♦ !

- температура + - I + 1 + 5

2-меркаптоэтанол • 1 1 1

1 6| Тип фермента М-ацзтад- |Н-ацетал- эидохзН хмтобио-1

Ь-1,4-гли- тимаза | й£5даза 9

козакики- !козамши- !

1_1 даза { дгга • — ' 1 ль ! ____1

Примечание: наличие,(+) либо отсутствие (-) хитинолитической

активности

более ЮбкД, который отсутствовал среди внутриклеточных ферментов (рис. 2). Правда, в случае предварительного нагревания внеклеточного фильтрата культуральной жидкости, например штамма Е.айПоте-гапэ 993 до 55°с, данная полоса на электрофореграммах не регист-

-аэ-

рировалась.

Исследование конститутивного синтеза хитинолитических ферментов штамма Е. ай!>1ошегапз 960, растущих на среде ЭМ с хитином или без него (БМ+глюкоза), показал наличие четкой разницы между профилем ферментов, синтезируемых данным штаммом в условиях индукции и конститутивно. При культивировании клеток данного штамма в жидкой питательной среде БМ с глюкозой, при использовании три-мерных и тетрамерных флюоресцентных субстратов, наблюдаются лишь два фермента, - СН1Т89 и СН1Т59, тогда как фермент СН1Т67 регистрировался лишь при использовании димерного субстрата.

Анализ электрофореграмм общего белка культуральной жидкости клеток штаммов Е. аяя1отегапз окрашенных кумасси ярко-голубым показал, что в культуральной жидкости клеток штаммов-антагонистов Е.agglomerans 960 и 993, выращенных в присутствии коллоидного хитина, наблюдается очень высокая интенсивность окрашивания белковых полос в местах, соответствующих положению белков хитинолитических ферментов (СН1Т67, СН1Т59, СН1Т50). Следовые'количества этих ферментов наблюдаются в клетках штамма Е.аяя1отегапз 993, которые росли в среде с глюкозой. В культуральной жидкости клеток штамма Е. а^1отегапз 1270 среди секретируемых белков наблюдаются полипептиды с молекулярной массой 89, 67, 59 и 53 кД, соответственно. За исключением белка с молекулярной массой 53 кД все эти белки видны при обработке геля флюоресцирующим красителем. Электрофорез внутриклеточного белка клеток штамма Е. agglomerans 1270 показывает интенсивное окрашивание белковых полос с молекулярной массой 89 и 67 кД. и слабое окрашивание в положении 59 кД.

Таким образом, в результате окрашивания ПААГ кумасси после разделения препаратов внутриклеточного и секретируемого белка показано соответствие интенсивно окрашенных полос полипептидов тем, которые выявляются с помощью специфических флюоресцирующих субстратов. Эти данные свидетельствует о том, что хитинолитические ферменты составляют значительную часть общего белка выделяемого в культуральную жидкость штаммами Е. agglomerans..

Исследование термостабильности хитинолитических Ферментов. Исследование влияния температуры на стабильность хитинолитических ферментов штаммов Е. аевЮтегапэ 960, 993 и 1270 проводили при нагревании фильтратов до 55°С в течении 3 минут с и без внесения в реакционную смесь 2-меркаптоэтанола. В результате было показана

чувствительность фермента CHIT67 и устойчивость ферментов CHIT59 и CHIT50 к воздействию высоких температур (рис. 2 и табл. 4). Показано. что фермент CHIT89 при температуре 55°С в присутствии 2-меркаптоэтанола необратимо инактивируется. Известно, что в процессе температурной денатурации-ренатурации белка наличие 2-мер-каптоэтанола препятствует восстановлению дисульфидных (-S-S-) связей и. таким образом, препятствует восстановлению нативной структуры белка (Доссон и др.. 1991). Результаты описанного исследования показывают, что третичная активная форма фермента CHIT89 поддерживается дисульфидными связями, тогда как для функционирования фермента CHIT59 наличие таких связей не существенна.

Исследование влияние pH среды на активность и стабильность хитинолитических Ферментов. ' Изучение активности и стабильности хитинолитических ферментов при разных значениях pH буферных растворов (от рН=3 до рН=10) показало, что оптимум суммарной хитино-литической активности ферментов Enterobacter sp. лежит в широком диапазоне значений рн, - от 5 до 8. В данном диапазоне pH среды хитинолитические ферменты сохраняют свою стабильность при температуре 40°С в течении 2 часов.

Представление в таблице 4 основные характеристики хитинолитических ферментов Enterobacter sp. показывают, что они отличаются друг от друга по специфичности их воздействия на соответствующие субстраты. Как мы уже отмечали выше, ферменты CHIT89 и CHIT59 способны отщеплять флюоресцентную группу 4-MU от тримерного и тетрамерного хитина, и не способны на димерном субстрате 4-MU -(GlcNAc). Фермент CHIT50 регистрировался только в том случае, когда использовали 4-MU-(GlcNac)z. В соответствии с существующей номенклатурой (Muzzarelll, 1993; Harmatl et al.. 1993) полученные результаты исследований позволили обозначить хитинолитические ферменты следующим образом: CHIT59 - эндохитиназа. CHIT89 и CHIT67 - 1}-ацетил-М.4-Ю-глюкозаминидаза и CHIT50, возможно, как •хитобиозидазу.

5.4. Продукция летучих совдшекяЯ Втгмшш-Еиташшстами.

Исследование способности штаммов-антагонистов выделять в окружающую среду летучие соединения (Звягинцев, 1979; Тирранен, 1989) показало, что клетки А.radiobacter 9. A.radiobacter 51 и E.agglomerans 960 выделяют некие соединения, которые подавляют рост Фитопатогенного гриба F.oxysporum. Влияние штамма E.agglome-

Таблица 5.

Биологически активные вещества штаммов-антагонистов, подавляющие рост патогенных бактерий и грибов

I—-г

! И ! 8 / 8 i s ! i

®Т£ММ,

нзолят

jtora-j биотак

Признак

~г

Проте-&за

-г

-г

Хитин-наза

Летуч, в- ва

i

radiobacter 9 rziiobacter Si polymyxa 57 putißa 3 ¡paUüa 27 agglon&erana S33 &5gl0№8rans 1270 dgglcmrans SSO äEnterobacter sp. 1080 iOiEnierobacter sp. 1623 11¡Enterobacter sp. 15SS „i .................

Примечание: наличие (+), либо отсутствие (-) признака.

rans 993 на рост данного гриба выражалось в том, что колонии F.oxysporum имели рыхлую структуру в виде отдельно, радиально, растущих гифов. Напротив, клетки штамма B.polymyxa 57, в процессе своей жизнедеятельности, выделяют некие летучие соединения, которые стимулируют не только рост мицеллия F.oxysporum, но и его спороношение. Стимулирование роста гриба F.oxysporum. было характерно для летучих соединений, продуцируемых штаммами Enterobacter sp. 1566. Ингибирующее действие метаболитов клеток A.radiobacter на рост гриба F.oxysporum было показано ранее (Moore-Landecker, Stotzky. 1972. 1974). Из представителей рода Enterobacter, данные авторы упоминают об ингибирующем действиие на рост фузариума лишь вида Е. aerogenes.

Аналогичные исследования, проведенные с клетками фитопато-генных штаммов бактерий не выявили стабильной ингибирующей, либо стимулирующей активности штаммов антагонистов.

+

+

о

* * *

Из результатов биохимических исследований штаммов-антагонистов представленных в таблице 5 видно, что штаммы бактерий условно можно разделить на три группы, - в первую группу входят бактерии, которые синтезируют только антибиотические вещества (штаммы A.radiobacter 9 и 51 и штамм В.polymyxa 57); во вторую группу входят штаммы P.putida, характеризующиеся способностью синтезировать антибиотик и сидерофор и, наконец, группа штаммов Е.agglomerans, способных синтезировать наряду с антибиотиком гидролитические Ферменты. Целью дальнейших исследований было определить наличие детерминантов в геноме данных штаммов бактерий, .ответственных за их антагонистическую активность. На основании этих, а также результатов предыдущих исследований по определению спектра антагонистической активности мтаммов-антагонистов, для дальнейших генетических исследований было отобрано лишь 4 штамма бактерий, - а именно A.radiobacter 51, Е,agglomerans 1270, P.putida 27 и В.polymyxa 57.

Раздел VI. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ АНтАГОШСТЯ:Ш>® АКТИВНОСТИ ВВДОЕНМ ШТАМКОВ-АКТАЖЖСТОЗ.

6.1. Инсерцждаый, транспозоном Тп5. мутагенез гранотрмцателькых бактерий

Предварительные исследования клеток штаммов антагонистов, .проведенные в процессе определения их систематического положения, показали, что они не содержат плазмид размером менее 130 мД. На основании этого было сделано заключение о локализации детерминант, ответственных за биоконтролирущую активность клетки на хромосоме штаммов-антагонистов. Для локализации генов, ответственных за антимикробную активность был проведен инсерционный мутагенез клеток штаммов антагонистов с помощью транспозона Тп5 так, как это описано в материалах и методах. В качестве донора транспозона Тп5 использовали клетки штамма Е. coll S17-1 pSUP 2013 -и E.coll С600 collb drd: :Тп5. Частота транслокации транспозона Тп5 в клетках изученных штаммов-антагонистов составила около 10"5 на клетку реципиента. Характеристика некоторых мутантов штаммов-антагонистов, которые утратили способность подавлять рост патогенных тест-культур, представлены в таблице 6. Генетический ло-кус. соответствующего признака итаммов-антагокистов обозначен: abp

(от англ. antibiotic production - продукция антибиотиков), cha (от англ. chltlnoiytlc activity - хитинолитическая активность), рга (от англ. proteolytlc activity - протеолитическая активность), sip (от англ. slderophore production - продукция сидеро-фора) и voc (от англ.. volatile compaunds - летучие соединения).

Мутанта «панна h.raaiobacter Si. В результате инсерционного мутагенеза штамма A. radiobacter 51, среда 2470 трансконьюгантов было отобрано два мутанта. При этом, один из мутантов потерял свою антагонистическую активность полностью, а другой частично.

Мутанта итамма р.&юЦоаегаца 1270. Выше мы отмечали, что клетки штамма E.agglomerans 1270 спосо'бны синтезировать комплекс биологически активных соединений, которые и определяют антагонистическую активность' данного штамма против фитопатогенных микроорганизмов. В результате отбора мутантов данного штамма, по таким признакам, как способность клеток E.agglomerans 1270 подавлять рост тест-культуры A.tumefaciens 1D1, наличие хитинолитической и протеолитической активностей, а также продукция летучих соединений среди более чем 7500 трансконьюгантов с фенотипом SmrRifrKmr. было выделено 14 клонов (характеристика некоторых мутантов представлена в таблице 6).

Отбор мутантных форм штамма E.agglomerans 1270, потерявших свою антимикробную активность против тест-культуры A. tumefaciens 1D1 позволил выделить 8 мутантов (АЬр~), которые утратили способность подавлять рост данной тест-культуры и четыре мутанта (Cha"), которые потеряли способность гидролиэовать хитин. Мутант 1270-EI характеризовался тем, что он потерял и способность подавлять рост тест-культуры A.tumefaciens 1D1, и хитинолитическую. и протеолитическую активности ( Рга").

При описании свойств штаммов-антагонистов мы отмечали, что среди штаммов Enterobacter sp.. лишь один штамм, - E.agglomerans 960 обладал способностью подавлять рост фитопатогенного гриба F.oxysporum за счет вырабатываемых им летучих соединений (Voc*). Поэтому устойчивые к канамицину трансконьюганты клеток штамма E.agglomerans 1270 (SmrRlfrKmr) также изучались на способность продуцировать летучие соединения. В результате проведенных исследований оказалось, что мутанты 1270-2Î1-9 (Abp* Cha" Рга* Voc*) и [270-110 (АЬр" СПа* Рга* Voc*) выделяют в окружающую среду некие летучие метаболиты, которые заметно подавляют; рост Фитопатогенно-

Таблица 6.

ХАРАКТЕРИСТИКА ИНСЕРЦИОННЫХ МУТАНТОВ ШТАММОВ АНТАГОНИСТОВ

1- 1 N T - - "■ 1 Мутант Фенотип —i I

1 / "Г - -r -1

1 N 1 Abp 8 Cha Pra S ■ Voc Sip í

1 1 1 A. radiobacter 51. И.Т. i » - 1 - í _ 1 0 - !

i 2 1 51-3 - 1 - - 1 - 1

1 э 1 Е.agglomerans 1270, W. Т. + i + ♦ 1 - 1

! 4 1 127Q-CVI - 1 ♦ 8 - - 1

1 5 1 1270-EI - ! - - 1 - - ¡

I 6 1 127Q-2h-9 ♦ 1 - ♦ 5 + - 1

1 7 i 1270-218 * 8 + ♦ 1 - 1

1 8 1 1270-110 - \ + ♦ ! 1 - 1

i 9 1 P.putida 27. W,T. 1 - - 1 - ♦ I

lio 1 27-2/3 - 1 - - 1 - - 1

t _Д- л JL ___________i. i

Примечание: W.T. - дикий тип; (+) - наличие признака;. (-) - отсутствие признака.

го гриба R. solani. Видно, что в отличии от клеток дикого типа E.agglomerans 1270 (Abp* Cha* Pra* Voc"), мутант 1270-2h-9 утратил способность вырабатывать хитинолитические ферменты, а мутант 1270-110 - антибиотическое вещество.

Некоторые из полученных в - процессе первоначального отбора мутантов, при дальнейшем их анализе имели нестабильный фенотип в ряду последовательных пассажей. Поэтому, такого рода трансконь-юганты с фенотипом (Abp* Cha* Рга+ Voc" Кгаг), изучались на их способность подавлять рост нескольких фитопатогенных грибов. В результате такого дополнительного скрининга был отобран мутант 1270-218 который, по сравнению с клетками дикого типа, более вы-раженно подавлял рост гриба В.cinerea. Из-представленной таблицы видно, что аналогичной особенностью обладал мутант 1270-2h-l. Более высокая, по сравнению с клетками дикого типа штамма E.agglome-rans 1270, антагонистическая активность была характерна и для описанных выше мутантов 1270-110 и 1270-52.

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов было отобра-

но 14. мутантов клеток штамма E.agglomerans 1270, которые, в результате инсерции транспозона Тп5 б хромосому данной бактерии, утратили необходимые для подавления роста фитопатогенных микроорганизмов активности. Два из выделенных мутантов, напротив, приобрели способность выделять некие летучие соединения и. таким образом, эффективно подавлять рост патогенного гриба.

Отобранные клетки мутантов были получены в результате скрещивания клеток штамма E.agglomerans 1270 с донором транспозона Тп5 клетками E.coll. Поэтому, клетки отобранных мутантов были исследованы на соответствие штамму E.agglomerans 1270, а также на то, что возникшая, в результате инсерционного мутагенеза транспо-зоном Тп5, устойчивость к канамицину не является результатом какого-либо другого события.

С помощью микробиологического теста на способность бактерий сбраживать углеводы было показано, что полученные мутанты E.agglomerans 1270: :Тп5 соответствовали клеткам дикого типа по 18 из изученных признаков. Различие между клетками дикого типа и мутантами было характерно для мутантов 1270-CVI (lac"), 1270-EI (lac"), 1270-PL (rha") и 1270-DVI (lac"arg"). Кроме того методом электрофореза общего белка клеток донора и реципиента, а также описанных мутантов E.agglomerans 1270 были показано, что профиль полос общего белка мутантов в целом соответствует профилю полос общего белка клеток дикого типа.

В результате Саузерн-гибридизации. показано, что на хромосоме мутантов 1270-EI и 127Ó-2h-9 имеется один и два, соответственно. участка гомологии ДНК с нуклеотидной последовательностью транспозона Тп5, что свидетельствует о том. что устойчивость к канамицину, которая имеет место, по-крайней мере, у мутантов 1270-EI и 1270-2h-9 клеток штамма E.agglomerans 1270 произошла в результате встраивания в его хромосому одного и двух транспозо-нов, соответственно.

Исследование хитинолитической активности экстракта клеток и фильтрата культуральной жидкости мутанта E.agglomerans 1270-EI (Abp"Cha"Pra"Voc"Kmr) показало, что несмотря на отсутствие зоны просветления коллоидного хитина на среде SM с хитином, экстракт клеток данного мутанта способен проявлять очень низкий, по сравнению с клетками дикого типа Cha*, уровень хитинолитической активности (рис. £). Анализ электрофореграмм внутриклеточного белка

мутанта 1270-EI показал, что при использовании флюоресцирующего субстрата 4-MU-GlcNAc и 4-MU - (GlcNAc)2 наблюдаются две. слабо флюоресцирующие,, полосы с молекулярной массой 89 и 67 кД. Наличие полос с указанной молекулярной массой наблюдалось и в случае окрашивания полиакриламидного геля кумасси. Напротив, аналогичное исследование фильтрата культуральной жидкости мутанта 1270-EI с помощью использованных методов не выявило наличия полос соответствующих хитинолитических ферментов ни в случае использования кумасси, ни в случае использования .флюорогенных субстратов (рис. 2). Очень низкий уровень хитинолитической активности в экстракте клеток данного мутанта, по-видимому, свидетельствует о том, что в результате инсерции транспозона Тп5 в хромосому Е. agglomerans 1270 мутация cha EI затронула регуляторную область синтеза хитинолитических ферментов.

Биоконтролируюшая активность мутанта Е.agglomerans 1270::EI. В результате встраивания -транспозона Тп5 в хромосому Е.agglome-ransl270, клетки мутанта 1270-EI (Abp' ChaPra' Voc" Kmr) потеряли свои активности, которые существенны для подавления роста и развития фитопатогенных микроорганизмов in vitro. Поэтому, целью дальнейших исследований было определить способность клеток данного мутанта подавлять развитие болезней растений на модели хлопчатник - R. solani. В случае использования суспензии клеток дикого типа Е. agglomerans 1270 количество пораженных проростков составляло 14.2 + 5.6 ТО, тогда как в случае мутанта 1270-EI - 55.5 + 0.0 (55), что практически не отличается от контроля (Р>0.05). При этом индекс подавления корневой гнили, ■ вызываемой R. solani, у клеток дикого типа достоверно (td = 6.4) отличался от данного показателя мутанта.

Таким образом, в результате эксперимента было показано, что биоконтролирующая активность клеток штамма Е.agglomerans 1270 коррелирует с показателями функциональной активности генетических детерминант, расположенных на хромосоме данного штамма.

Мутанты штамма Pseudorocnas putIda 27. Исследование биохимических основ антимикробной активности клеток штамма Р.риШа 27 показало, что способностью данных бактерий синтезировать сидеро-Фор. коррелирует с желто-зеленой окраской их колоний. В результате инсерционного" мутагенеза транспозоном Тп5, среди 2000 колоний трансконьюгантов с фенотипом KmrSmr были отобраны 4>кепигментиро-

ванные колонии бактерий, которые исследовались на способность подавлять рост клеток фитопатогенной тест-культуры P. syrlngae pv. syringae 8511. При этом, 2 клона (P.putida 27-2/3 и P.putida 27-5/6) характеризовались полной потерей способности подавлять рост данной тест-культуры, а 2 клона (P.putida 27-42/10 и P.putida 27-23/11), - частично. Дополнительное исследование свойства этих мутантов показало, что клетки мутантов P.putida 27-2/3 и P.putida 27-5/6 не способны флюоресцировать в темноте. Проведенная, подобно клеткам мутантов штамма E.agglomerans 1270 оценка профиля общего белка клеток отобранных мутантов штамма P.putida 27 по сравнению клетками дикого типа с' помощью электрофореза в SDS-ПААГ показала соответствие клеток мутантов клеткам дикого типа.

Клонирование sip-генов P.putida. Выраженная селективность маркера, каковым является пигментированность колоний клеток дикого типа штамма P.putida 27 позволило приступить к клонированию sip -гена(ов). Схема клонирования и отбора sip генов представлена на рис. 3. В качестве вектора для конструирования клонотеки генов хромосомной ДНК штамма P.putida 27 была использована плазмида PRK415 (10.5 тпн, Тсг, lacZ*, mob\ [oriV RK2. oriT RK2]) (Keen e. a., 1988).

Хромосомную ДНК клеток штамма P.putida 27 расщепляли рест-риктазами EcoRI или. PstI в условиях частичного гидролиза, отбирали фракции фрагментов ДНК и после обработки щелочной фосфатазой лигировали с фрагментами соответствующим образом обработанной ДНК плазмиды pRK 415. Полученными в результате гибридными плазмидами трансформировали компетентные клетки E.coll JM109 и на среде LA + Тс5 + [X-gal + IPTGJ отбирали рекомбинантные клоны. Полученные таким образом рекомбинантные клоны из геномной библиотеки ДНК использовались в комплементационном анализе! При этом мы исходили из того, что если в клетки Sip мутантов P.putida 27 ввести клонированные на плазмиде pRK415 фрагмент ДНК из клеток дикого тина, то полученная таким образом мерозигота, восстановит исходный фенотип клетки (Sip*). Путем трехродительского скрещивания, рекомбинантные плазмиды. из клеток штамма Е. coll JM109, переносили в реципиентный штамм P.putida 27-2/3 посредством их мобилизации коныогативной плазмидой pRK2013 (E.coll С600) (Dlttaetal.. 1980). Отобранные в результате трансконьюгакты мутантных клеток

""*........ЧАСТНИКОВ РАСЩЙЛЕНШ

ХРОМОСОМНОЙ ДНК ПЛАЗМИДЫ рЖ 415

P.putMa 21 ЕсоШ (PstI)

АЙГИРШАНИИ

Трансформация E.coll JMI09

I

ЕлоЦ CSOO X Е-соЦ JM109 X P.putlda 27аТп5 (pRK20l3) (pîS ?) «dp-

Отбор sip+-j

P.putida 27:iTnS jpIS) slp+

Рис. 3. Схема клонирования и отбора sip-генов штамма P.putlda 27.

P.putlda 27-2/3. содержащие рекомбинантные плазмиды исследовались на способность подавЯй'ть рост клеток тест-культуры штамма P. sy-rlngae pv. syrlngae 8511. Проведенный анализ около 2000 рекомби-нантных клонов позволил отобрать два трансконьюганта. которые благодаря введенной рекомбинантной плазмиды в клетки Sip" мутанта P.putlda 27-2/3 восстанавливали фенотип дикого типа этих клеток, - Sip*.

Таким образом, на плазмиде pRK4l5 был клонирован фрагмент ДНК штамма P.putlda 27, который содержит генетический детерминант обеспечивающий клеткам данного штамма способность синтезировать и секретировать в окружающую среду сидерофор. G.2. Генетические особенности атамма-аитагоннста B.polyrayxa 57,

В результате неоднократных попыток перенести, путем скрещивания. коньюгативный транспозон Тп916 из клеток Enterococcus fae-

calls DS16C3 в клетки B.polymyxa 57 было показано, что частота перехода данного транспозона в клетки штамма антагониста составляет менее 10"10 на клетку реципиента (в результате более чем 20 проведенных скрещиваний было получено лишь три клона B.polymyxa 57::Тп916). Использованная для мобилизации транспозона Тп91б плазмида pAMpi также передавалась с очень низкой частотой (около 10"9) из клеток штамма E.faecalls DS16C3 (pAMpij в клетки B.polymyxa 57. Низкая частота коньюгативного переноса плазмиды рАМ(51 и транспозона Тп916 в клетки B.polymyxa 57 можно объяснить активностью системы рестрикции и модификаци исследованного штамма. Предпринятая попытка обойти систему рестрикции-модификации данного штамма путем взаимного переноса плазмиды рАМ(И и транспозона Тп916 среди клеток B.polymyxa 57 показала, что случаи взаимного переноса указанной плазмиды и транспозона Тп916 не наблюдаются. При использовании стандартных методов трансформации клеток B.polymyxa 57 плазмидой pTVlts случаев проникновения данной плазмиды в клетки бацилл не обнаружено. По-видимому, в используемых нами условиях трансформация клеток данного штамма бацилл происходит с частотой менее 10"6, либо, как это отмечалось выше система рестрикции - модификации штамма B.polymyxa 57 не позволяет инородной ДНК функционировать в клетке данного штамма. Кроме того причиной неудачи по трансформации клеток может быть либо невозможность трансформации клеток данного штамма B.polymyxa,. либо несоответствие используемых методов трансформации клеток тем, которые необходимы для данного штамма бактерий (Ярославцева и др.. 1985; Пропоров. 1988).

* * *

В результате инсерционного мутагенеза штаммов-антагонистов A.radlobacter 51, Е. agglomerans 1270 и P.putlda 27 были отобраны мутанты данных микроорганизмов, которые утратили соответствующие активности, необходимые для подавления роста и развития фитопато-генных микроорганизмов. Ранее мы отмечали, что представленные штаммы антагонисты не содержат плазмид с молекулярной массой менее 130 мД. Тот факт, что в результате мутагенеза были отобраны мутанты, определяющие антагонистическую активность данных бактерий, указывает на то, что соответствующие генетические детерминанты располагаются'на их хромосоме. В случае штамма Е.agglomerans 1270 была .отобрана серия мутантов, у которых, в результате

инсерции транспозона Тп5, были затронуты практически все его активности. Кроме того у одного из мутантов (1270-EI), мутация носила плейотропный характер и сопровождалась потерей антибиотической, хитинолитической и протеолитической активностей. Неожиданным оказался фенотип мутантов 1270-2Й9 и 1270-110, которые в отличии от клеток дикого типа, выделяли в окружающую среду летучие соединения с антимикробной активностью. Результаты Саузерн гибридизации показали, что в хромосому мутанта 1270-2)19 встроилось "две копии транспозона Тп5, к поэтому природа мутаций возникших в результате интеграции данного элемента требует, дальнейшего анализа.

. Один из мутантов (1270-218) штамма Е.agglomerans 1270 в результате инсерции транспозона Тп5 в хромосому данного штамма приобрел устойчивость к канамицину. Несмотря на то, что списанные антимикробные активности этого штамма не изменились, мутант 1270-218. по сравнению с клетками дикого типа, более выражено подавлял рост фитопатогенного гриба В. clnerea.

По-видимому, мутант 218 (Abp* Cha* Pra+ Voc") в результате инсерции транспозона Тп5 сохранил все свойства штамма дикого типа и, в результате мутации дополнительно приобрел способность выделять в среду некое неидентифицированное соединение с антимикробной активностью.

Селективные преимущества сидерофорной активности штамма P.putlda 27, которая связана с соответствующей окраской пигмента, позволили не только отобрать соответствующие мутанты, но и клонировать фрагмент ДНК хромосомы,- который содержит генетический детерминант ответственный за синтез сидерофора.

К сожалению неудачей закончилась попытка получить инсерцион-ные мутанты штамма В. polymyxa 5Д, который характеризовался более выраженной антимикробной активностью по отношению к бактериям и грибам. По-видимому, для того, чтобы исследовать генетику данного штамма, необходимо адаптировать соответствующие методы исследования грамположительных бактерий применительно-к данному микроорганизму.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Биохимические исследования . описанных штаммов-антагонистов показали, что в основе антагонистической активности штаммов А. га- • dlobacter 51. В.polymyxa 57, Е.agglomerans 1270 и P.putlda 27 против фнтопатогенов лежит их способность синтезировать и внде-

лять в окружающую среду различные биологически активные вещества (антибиотики, сидерофор, хитинолитические и гидролитические ферменты, летучие соединения). Комплекс нескольких видов микроорганизмов, характеризующихся способностью синтезировать разные группы биологически активных соединений в сочетании со способностью бактерий колонизировать поверхность растений, позволяет им с достаточно высокой эффективностью контролировать развитие фитопато-генов в ризосфере растений (рис. 4). Результаты экспериментов в условиях вегетационного, а также открытого и защищенного грунта продемонстрировали более выраженное и стабильное действие смеси |;;таммоЕ-антагонистов против фитопатогенной микрофлора на. разных моделях патоген-хозяин.

Исследование мутантов изученных микроорганизмов позволили показать наличие на хромосоме данных бактерий генов, мутации в которых приводят к тому, что бактерии утрачивают способность синтезировать биологически активные соединения. На примере такого рода мутантов показано, что они такта утрачивают способность подавлять развитие возбудителей болезней растений.

Полученные результаты исследований, а также опубликованные в литературе данные позволили предложить схему скрининга микроорганизмов (и их продуктов) для отбора штаммов с целью защиты растений от фитопатогенов. Согласно предложенной схеме, после отбора пзолятов микроорганизмов на антимикробную активность , на тест-культурах, в состав которой должны быть включены по крайней мере по одному виду фитопатогенной бактерии и гриба соответствующей сельскохозяйственной культуры, следующие этапы отбора должны ¡зключать исследование способности данного изолята агрессивно ко-^ лонизировать ризосферу растения и на высоком уровне поддерживать свою численность в нестерильной почве. Отобранные таким образом микроорганизмы имеет смысл изучать на способность подавлять развитие болезни в условиях вегетационного а, затем (или параллельно. если имеется такая возможность) и полевого эксперимента.

Изолят. характеризующийся способностью подавлять рост фитопатогенов In vitro, должен быть изучен на способность вырабатывать биологически активные соединения независимо от последующих результатов отбора. В литературе имеются сведения об использовании 'рыделенных из бактерий антибиотиков и хитинолитичэских ферментов для целей защиты растений (Лапина и др.,, 1974; Shapira et

Рис. 4. Основные механизмы с помощью которых бактерии защищают растения от патогенов.

al., 1989; Vidaver, 1992). ■ ' '

Полученные в работе результаты показали перспективность использования мутантов почвенных бактерий для исследования механизмов взаимодействия микроорганизмов в естественных условиях. Кроме того, наличие такого рода мутантов позволяет расширять, необходимый для генной инженерии растений, банк генов устойчивости к -возбудителям болезней. 'Перспективным можно считать и путь совмещения, с помощью методов генной инженерии, нескольких существенных для защиты растений активностей в клетке одного штамма.

ВЫВОДЫ.

1. Двухэтапный отбор, проведенный среди почвенных изолятов позволил выделить бактерии-антагонисты широкого спектра действия, способные In plate подавлять рост и развитие около 40 видов фито-патогенных бактерий и грибов, а также патогенных и условнопато-.. генных видов бактерий человека и животных. Высокую антимикробную ■ активность против изученных тест-культур показали изоляты 51, 57, 1270 и 27. идентифицированные как A.radlobacter, В.polyrayxa, Е.aggloraerans и P.putlda, соответственно.

2. В условиях закрытого грунта, в вегетационн|ж и полевых опытах показана способность кулътуральных жидкостей изученных штаммов бактерий и их смесей подавлять развитие серой гнили и мучнистой росы у винограда, томата и огурца; бактериального рака - винограда и клевера; сосудистог.о бактериоза - качанной капусты; угловатой пятнистости - огурца; фувариовного увядания - томата. Антимикробная активность штаммов B.polymyxa 57, E.agglmerans 1270 и Р.pulida 2? в изученных концентрациях была сравнима с активностью химических фунгицидов (болетин, топсин, тилт) и биопрепарата триходермин.

3. Антимикробная активность изученных штаммов бактерий определяется их способностью колонизировать ризосферу растений и выделять в окружающую среду антибиотик (A.radiobácter 51, В.polymyxa 57 и Е. agglomerans 1270), сидерофор (P.putida 27) и хитинодитические ферменты (E.agglomerans 1270).

4. Способность штаммов E.agglomerans синтезировать хитинодитические ферменты (зндохитинаву, N-ацетил-s-1,4-D-пнокозашнидазу и хитобмовидаву) для данного вида бактерий показана впервые. ■

5. На хромосоме изученных штаммов A.radiobacter 51, E.agglcmerans 1270 и P.putida 27 присутствуют гены, которые определяют антимикробную активность данных бактерий против фитопатогенных микроорганиемов. фрагмент ДНК, ответственный 'ва синтез сидерофора у клеток штамма P.putida 27, клонирован в составе плавмиды pRK415.

6. На примере штамма Е.agglomerans 1270-Е1 показано, что его способность подавлять развитие корневой гнили хлопчатника определяется генетическим детерминантом локализованным на хромосоме.

7. Система отбора изолятов почвенных бактерий, перспективных для разработки микробиологических средств защиты растений, должна включать фитопатогенные бактерии и грибы, a Tarase тестирование на способность синтезировать биологически активные соединения. ■

- 35 -

Список работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Исмаилов З.Ф. Фитопатогенные агробактерии почв Самаркандской области. Сборник Сам ГУ "Экология и морфология животных". Самарканд, 1990, 39-45.

2. Бурмакина C.B., Авдиенко И. Д.. Исмаилов З.Ф., Мироиникова Л. К., Степанов А.И., Чернин Л.С. Использование биолюминесценцеен-тной метки для изучения почвенных бактерий - антагонистов фитопа-тогешгой микрофлоры. Биотехнология, 1993. 9, 35 - 38.

3. Исмаилов З.Ф. Почвенные бактерии как средство защиты растений от бактериального рака. Узб. биол. журн. 1993, 5. 9 - И.

4. Стехин И. Н.. Ковальчук М. В., Мельник А. И., Полевода Б. В., Столяр С.М., Исмаилов З.Ф.,' Чернин Л.С. Получение мутантов Pseudomonas putlda 27, потерявших способность к продукции антимикробных веществ и их комплемеитационный анализ с клонстекой исходного штамма. Цитол. и генет., 1994, 28, 1, 77 - 79

5. Исмаилов З.Ф., Стехин H.H., Чернин Л.С. Исследование генетических детерминант антагонистической активности почвенных микроорганизмов. Узб. биол. журн. 1994, 4, 15 - 18.

6. Исмаилов З.Ф., . Грищенко O.A., Овадис М.И., Терентьев М.А.. Чернин Л.С. Исследование антибиотика-сырца штамма-антагониста фитопатогенных микроорганизмов B.polymyxa. Узб. биол. журн. 1994. 5, 17 - 20.

7. Исмаилов З.Ф., Терентьев И.А. Чернин Л.С. Исследование .механизмов антагонистического действия микроорганизмов против фи-топатогенной микрофлоры. Сб.'науч. трудов "Актуаль.лробл. биол. и мед. ю-запад. Узбекистана", Вып.1., Самарканд, 1995, 71 - 74.

8. Исмаилов в.Ф., Терентьев М.А., Чернот Л.С. О хитинолити-ческой активности некоторых штаммов рода Enterobacter.-' антагонистов фитопатогенной микрофлоры. Увб.биол.журя. 1996, 1-2, 21-23.

9. Исмаилов З.Ф., Терентьев М.А. Чернин Л.С. Хитинолитичес-кие ферменты почвенной бактерий Enterobacter agglomérons - антагонистов фитопатогенной микрофлоры. Узб.биол.журн. 1996, 3,.17-20

10. Chemin L.Brandls A., Ismaiíov Z.', Chet I. Pyrrolnit-rin production by an Enterobacter agglomérats strain with a broad spectrum of antagonistic activlrty towards fungal and bacterial phytopatbogens. Current Microbiology, 1996, 32. 4, 208 - 212.

11. Cberaln L.S., Khmel I.A., Ismallov Z.F., Lemanova N.B., Sorokina T.A., Avdienko I.D.. PvadisM.l., Brlschenko 0. A., Pozd-nyakov y.N., Terentjev M.A., Llpasova V.A., Mlrosbnlkova L.K., Kovalchuk M.V., Stekhln I.N., Soil-born bacteria with wide host range spectrum of antagonistic activity against phytopathogenlc

•■■ria and fungi perspective for biological control of. pi

diseases. Plant Biotechnol. S Mol.Biology, Moscow-1993, 76 - 86.

12. Chemin L., Ismilov Z., Haran S., Chet I. Chitlnolytic E.agglomerans antagonistic to fungal plant pathogenes. Appl. En-vlr. Mlcrob., 1995. v. 61, 5, 1720 - 1726.

13. Исмаилов З.Ф. Почвенные агробактерии Самаркандской области - продуцента бактериоцинов против A. turnefaciens. Тезисы докл. IV респ. научно-теор. конфер. молодых ученых и специалистов микробиологов "Биология культивирование и биотехнология микроорганизмов". Ташкент 24 -26 мая 1989, Ташкент 1989, 74 - 75.

14. исмаилов З.Ф., Чернин Л.С. _перспективы использования микроорганизмов ризосферы растений для их защиты от бактериального рака. II - городская науч. -тех. конфер. молод, ученых. Тезисы докл. Самарканд - 1990, 168.

15/Исмаилов З.Ф., Чернин Л. С. Почвообитающие микробы-антагонисты фитопатогенной бактерии A.tumefaciens. Тезисы докл. I съезд Почвоведов и агрохимиков Узбекистана. Ташкент, 1990, 106 -108.

"16. Хмель И. А., Чернин Л. С., Леманова Н. Б.. Сорокина Т. А.. Авдиенко И. Д., Липасова В. А., Сахарова М.Н., Исмаилов З.Ф., Поздняков В.М. Выделение, изучение и перспективы использования для борьбы с фитопатогенньши микроорганизмами штаммов агробактерий и псевдомонад - продуцентов антибиотических веществ широкого спектра действия. Тезисы докл. на Всес. конфер. Фитонциды, Бактериаль- " ные болезни растений. Часть 2. Львов, 1990, 117 - 118.

Í7." Чернин Л. С., Стехин И. Н., Исмаилов З.Ф., Авдиенко И. Д., Поздняков В.н., Грищенко 0.А., Овадис М. И., Ковальчук М. В. Подходы к созданию трансгенных растений , устойчивых к бактериальным и грибным болезням. I Всес. Симп. Новые методы биотехнологии растений. Пущино, 20 - 22 ноября 1991 Г., Пущино - 1991, 45

г18. Исмаилов 3.Ф., Кабулора Ф. Д., Чернин Л.С. Использование почвенных микроорганизмов для биологичской защиты культурных растений. Тезисы докл. Совещания "Загрязнение,почв и пути его предотвращения" (5-7 ноября 1992г.), Ташкент, 1992, 23.

19." Авдиенко И. Д., Мирошникова Л. К., Бурмакина С. В., Исмаилов З.Ф. Чернин Л.С. Использование биолюминесцентной метки для изучения бактерий -антагонистов , фитопатогеннной микрофлоры. II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений. 18 - 20 мая 1903 г., ПущЙНО. Пущино - 1993, 69.

го. Бурмакина C.B., Авдиенко И.Д., Исмаилов З.Ф. .Степанов . 11.. Чорннн Л. С. Маркирование штаммов почвенных бактерий с по-

мощью генов биолюминесценции Photobacterium lelognathi. II Российский симп. Новые методы биотехнологии растений. 1В - 20 мая 1993 г.. Пущино, Пущино - 1993, 73.

21. Авдиенко И.Д., Бурмакина С. В., Исмаилов З.Ф., Терентьев М. А. Чернин Л.С. Использование биолюмииесцентной метки для илле-дования миграции микроорганизмов в ризосфепе растений. Тезисы докл. конфер. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду, 17 - 19 мая 1994, М., 1994, 5 - 6.

22. Исмаилов З.Ф., Стехинй.Н., Терентьев М. А., Чернин Л. С. Исследование детерминантов антагонистической активности штаммов B.polymyxa, P. cepacia, P.putida. Тезисы докл. конфер. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду, 17 - 19 мая 1994, М.. 1994, 43 - 44.

23. Терентьев М.А., Авдиенко И.Д., Суркова Т.А., Исмаилов З.Ф., Чернин Л.С. Отбор штаммов-антагонистов фитопатогенной микрофлоры для защиты растений огурца от поражения серой гнилью. Тезисы докл. конфер. Интродукция микроорганизмов в окружающую среду, 17 - 19 мая 1994, М., 1994. 101 - 102.

24. Khmel I.A. .Lemanova N. В., Avdienko I.D., Ovadis M. I,, Soro-klna Т.A., Ismailov Z.F.,Chernin L.S. - Potential application of new isolates of soil bacteria for biological control of-grapevine against crown disease. Int.conf.Pathol. &= Molecul.Biol, of-Crown Gall. Glf sur Yvette.- France. 25-27 September, 1991.

25. chernin L.S.. Stekhln I.N., Ismailov Z.F., Avdienko I.D.. Pozdnyakov V. N., Grischenko 0. A., Ovadis M. I., Kovalchuk M. V. An approaches to the construction of transgenic plants resistant to diseases*:, caused by bacteria and fungi. First Symp. Trends in plant biotechnology. USSR, Nov. 20 - 22, 1991, 148.

26. Chernin L.S., Ismailov Z.F. Avdienko I.D., Grischenko 0.A., Pozdnyakov V.N., Terentjev M,A.. Ovadis M.I.. Miroshnlkova L.K., Stekhln I.N. New izolates of soil bacteria antagonistic to wide range of phytopathogenes and their- practical application for biological control of plant diseases. 8 Int. Confer, on Plant Pathogenic bacteria . Versailles, France. 1992, P5/A5 . . ;-■

2?, Avdienko I.D.. Mlroshnlckova L.K., Burmaklna S.V., Isma-^ ilov Z.F., Chernin L.S. - The use of biolumlnescent marcer for studying of bacteria antagonistic to phytopathogenie microflora. Second Symp. Trends in plant biotechnology, Russia, May, 18,- 20,

1993, PUShchlno 1993. 304.

28. Burmakina S.V., Avdlenko I.D.. Ismailov Z.F.. Stepanov A. I., Chernin L.S. Labeling or soil bacterial strains with the bioluminescence genes of photobacterlum leiognathl. Second Syrap. Trends in plant biotechnology, Russia, May, 18 - 20, 1993, Pushchlno 1993. 307.

■29. Stekhln I.N., Kovalchuk M.V.. Zdorovenko A. L., Melnlk A.I., Polevoda B. V., StolyarS.M., Ismailov Z.F., Chernin L.S. Genetic determinants in Pseudomonas putida 27, which determine the inhibition of phytopathogenic fungal and bacterial growth. In Advanced school on: "Gene trnsfer and regulation of their expression in eukaryots", Kiev (Ukralnia) - Toulouse (France). September, 6 - 10. 1993, 98 - 101, angl.-franc.

'30. Stekhln I.N., Kovalchuk M.V., A.I. Zayats, Zdorovenko A.L., Ismailov Z.F., Chernin L.S. Cloning of genetic determinants for phytopathogens growth inhibition. In: Int. Simp. "Plant Blo-tehnol. & Genet.Engineering. Kiev (Ukrainia), October, 3-6,

1994, 157.

3i; Chernin L., Ismailov Z., Terentyev M., Peleg I., Frid-lender B.. Hofstein R., Skryabln K., Chet I. Developing novelbio-pestlcides as a russian-lsrael enterprise collaboratively developed between universities and industry. International cooperation for development of biotechnology conference. Jerusalem, Israel. October 30 - November 3, 1994,'- 29.

327 Chernin L., Ismailov Z., Terentyev M.. Peleg I.. Frid-lender B., Hofstein R., Chet I. Protection of plants against fungal pathogens by antagonistic bacteria with multiple control mechanisms. International cooperation for development of biotechnology conference. Jerusalem, Israel, October 30 - November 3, 1994, 97.

Аннотация на узбекском языке -IfTCilATOrai ШШШОРА А!ГГЛГ01 i!'СИЛП' - ТУПГОК ВА2СГЕРИЯЛАШИГ ТО1ЕГИК RA БВ0В<ШшЯ

Исмаилов З.Ф.

Диссертация 34? бетдан иборат булкб, сузбоаи, аяабиьтлер тах/лши, тад^ккрт материалларц ва усуллари, тадкккрт натихалари, хулосалар, адабиёглар руйхати ва иловадан ташгсил топган. Диссер-тацияда 37 хадвал ва 59 раем бор.

Ушбу ипнинг зсссий макради фигопатоген мпкрофлоранинг туп-роь$да яшайдиган антагонист бактерияларини генетик ва биохимик текширишдал ¡¡борат. Алратилган бактерияларда антибиотикдар, си-дерофор ва хитинолитик фернентларини ишлаб чга$ариш грбилияти ур-ганилган.

Тад^мрт жараенида 3 минг тупрск бактерия изолятларилач, скрининг натижасида 30 дан кулрок фитопатоген- бактериялар ва замбуругларнинг 11 ачтагонистлари ажратилган. Булардан турттаси энг фаол антагонистлар буллб ^исобланади: Agrobacterium radJo-bacter, Bacillus polymyxa, Enterobacter agglomerans ва Pseudomonas putida. By бактериялар ^аммаси культурал му^итда антибиотик-лар (A.radiobacter 61, В.polymyxa 57, E.agglomerans 1270), сиде-рофорлар СР. putida 27) ва хитинолитик ферментларни (E-.aggloms-rans штаммлари) адратади.

Е. agglomerans ларнинг хитнялик озю$а мухитвда уеш даврида туртта 89 kD, 67 kD, 59 kD ва 50 kD молекуляр огирлягидаги хитинолитик ферментлар хрет кшшши курсатилган. Ушбу ферментлар эи-дохнтиназа (CHIT89 и CHIT59), Н-ацетил-О-глюкозаминидаза ЧСН1Т59) ва хиобиозидаэа (СН1ТБ0) дс-б атазди. Увдан таа^ари аж-ратилган бактериялар бутдой, бодршг ва помидор усимликларпиинг илдизи устида яшаш хусусиятнга эга эканлиги аяикланди.

Трзлслозон Тпб мутагекези псосида, фитолагоген бактерия ва замбуругларнинг уенвши ту.чтатш г^обшшяткга эга булган бир неча мутант бактерияларнинг мутантлари ажратилган. Бу мутантлар био-

логик фаол моддадарни х,осил qmm хоссаларини йу^отди. Айрим итаммлар антимикроб хусусиятларининг детерминантлари хромосомада жойлашганлиги курсатилган.

Комплементацион тщлш асосида рекомбинант плазмида олин-ган. Бу плазмида таркибида P. putida ишлаб чщарадиган сидерофор- . ни детерминанта борлигини аникланган!

Айрим урганилган бактерия штаммларнинг усимликлар касаллик-ларга ^арши таьсир чилиш ^обшшятининг мавжудлиги исси^она ва дала шароитида хам ашугаэди.

Олинган натижалар микроорганизмларнинг антагонистик • фаолли-гини генетик назорат килиш, бактерия ва усимликларнинг бир-бирига таъсир этиши хусусиятларини фундаментам текшириш учун катта aja-миятга зга экаялигини курсатади. Вундан таш$ари олинган натижалар усимликларни фитопатоген бактерия ва замбуруглардан ^имоя ¡^илишнинг янги биотехнология усулларкни ишлаб чккиа учун хам )^улланилади.

Аннотация на английском языке GENEIICAL AND BIOCHEMICAL INVESTIGATION OF SOIL-BORNE BACTERIA-ANTAGONISTS OF THE PHYTOPATHOGENIC MICROFLORA.

Z.F.Ismaiiov

The thesis was typewritten on 347 pages. It consists of introduction, 3 chapters (review of literature, materials and methods, and results of own experiments), conclusions, a list of used literature and appendix. The work contains 37 tables and illustrated by 59 figures.

The aim of the work is the isolation of soil-born bacteria -antagonists of the phytopathogenic microflora and investigation of their genetical and biochemical characteristics. Isolated strains of bacteria will be tested on their ability secrete antimicrobial substances. As a results of this work some of the investigated strains will be search on their quality decrease of plant diseases caused by phytopathogenic bacteria and fungi in greenhouse and field.

As a results of the screening more then 3000 bacterial isolates of the soil-borne bacteria on their activity against phytopathogenic fungi and bacteria. Eleven strains of then are characterized by an

unusual wide raftge of antagonistic ability against more than 30 species of phytopatogenic bacteria and fungi. The most active four isolates were identified as Agrobacterim radiobacter, Bacillus polymyxa, Enterobacter agglomerans and Pseudomonas putida.

All this strains may secrete into the culture medium antimicrobial substances such as antibiotics (Aradiobacter 51, B.polymyxa 57, E.agglomerans 1270), siderophore (P.putida 27) and chltinase (E.agglomerans strains). It was shown that four different hitinolitic enzymes with molecular weights 89 kD, 67 !d>, 59 kD and 50 lcD was produced by E.agglomerans cells under the induction conditions by hitin. Tha described enzymes can be assigned to endohitinase (CHTT89 and CHTT59), N-acetil-D-glucosaminidase (CHTT59) and chitobiozidase (CHIT50). Besides antagonistic activity these strains are able for root colonization of wheat, cucumber and tomato.

With tha help of Tn5 mutagenesis it was obtained a number of mutants of tha bacteria which lost their ability to inhibit growth of phytopathogenic fungi and bacteria and produce biological active substances were obtained using the Tn5 mutagenesis. For some strains the chromosomal localization of determinant responsible for ■antagonistic activity was found. A complemented analysis of P.putida mutants was performed by matimjs with P.putida 27 (wild type cells) library. Some recombinant strains which restore antimicrobial activity of the initial strain were selected.

Some investigated strains have efficiency for biological control of plant diseases in greenhouse and field experiments.

Obtained results will be essential to fundamental research of the genetical control of antagonistic activity of microorganisms and microbe plant interaction. In addition thp results will be useful for elaboration of a new biotechnological trials for plant protection from diseases provoking by phytopathogenic bacteria and fungi.