Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биологическая роль грибов рода Trichoderma в различных биоценозах Средней Сибири

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологическая роль грибов рода Trichoderma в различных биоценозах Средней Сибири"

РГВ од

I;:> ДЗГ

На правах рукописи

Прудникова Светлана Владиславна

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ГРИБОВ РОДА ТШСНОБЕКМА В РАЗЛИЧНЫХ БИОЦЕНОЗАХ СРЕДНЕЙ СИБИРИ

03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск, 2000

Работа выполнена на кафедре физиологии и микробиологии Красноярского государственного университета.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.М.Гольд

кандидат биологических наук, доцент Т.И.Громовых

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Н.Д.Сорокин

кандидат биологических наук, доцент Т.В.Марченкова

Ведущая организация:

Красноярский государственный аграрный университет

Защита состоится « 22. » (¿лОЬсЛ2000 г в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.70.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте леса им. В.Н.Сукачева по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт леса им. В.Н.Сукачева СО РАН

факс: (3912)433-686, e-mail: Ifor@krsk.infotel.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института леса им. В.Н.Сукачева СО РАН

Автореферат разослан « »

Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н.

ESQI 463

£кр<:.Й Шм. W. О

О.АЗырянова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы во всем мире постоянно ухудшается фитопатологическая ситуация в связи с нарушением экологического равновесия в природе - увеличением площадей монокультуры основных видов культурных растений, накоплением возбудителей болезней и вредителей, прогрессирующим повышением их устойчивости к химикатам. В этих условиях в агроэкосистемах создается необычайно высокий инфекциошшй фон по сравнению с естественными биогеоценозами, поэтому корневые гнили растений становятся экологически неизбежным явлением.

Одними из естественных антагонистов фитопатогенных микроорганизмов являются грибы рода Trichoderma, обнаруживающие космополитизм i и встречающиеся во всех типах почв. В связи с широким применением грибов рода Trichoderma в самых разных странах, накоплен огромный фактический материал, касающийся физиолого-морфологических, биохимических и генетических исследований грибов, а также технологии получения биопрепаратов и их успешного применения. Однако, в большинстве случаев не учитывается тот факт, что внесение антагониста в сложившийся агроценоз вызывает комплекс сложных взаимодействий с почвенной микрофлорой и высшими растениями. Таким образом, недооценка биотических факторов может стать одной из причин более низкой эффективности биопрепаратов по сравнению с лабораторными испытаниями. Кроме того, остается малоизученным вопрос о возможности использования для защиты растений местных изолятов грибов рода Trichoderma, как наиболее приспособленных к конкретным почвенно-климатическим условиям. В связи с этим представляет большой интерес изучение сибирских изолятов рода Trichoderma, которые до настоящего времени не исследовались.

Цель работы; изучение грибов рода Trichoderma как потенциальных агентов биологического контроля фитопатогенов в arpo- и лесных биоценозах Средней Сибири.

Задачи исследований:

1. Оценка влияния интродукции гриба Trichoderma harzianum Rifai aggr. на структуру микробоценозов ризосферы и ризоплана зерновых культур и сеянцев ели.

2. Исследование динамики численности популяции грибов рода Trichoderma, интродуцированных в различные биоценозы.

3. Оценка эффективности интродукции гриба Т. harzianum в оздоровлении корневой системы растений и подавлении фитопатогенов в ризосферной почве.

4. Выделение и идентификация грибов рода Trichoderma, встречающихся в почвах лесопитомников Средней Сибири.

5. Исследование биологических свойств выделенных видов рода Trichoderma.

Научная новизна. Проведенная комплексная экологическая оценка влияния интродукции гриба Т.harzianum на различные почвенные микробоценозы позволила определить возможность интродукции активных штаммов рода Trichoderma для биологического контроля фитопатогенов.

Установлены сроки ограничения численности возбудителей корневых гнилей зерновых культур и сеянцев хвойных в Средней Сибири. Выделены виды рода Trichoderma, ранее не описанные в почвах лесопитомников Средней Сибири, и проведена оценка их антагонистической активности в отношении почвенных фитопатогенов. В экспериментальных исследованиях, проводимых в условиях фитотрона и лесопитомника, выявлена необходимость подбора оптимальной дозы биологического агента, превышение которой может приводить к ингибированию прорастания семян и снижению некоторых ростовых показателей сеянцев ели.

Практическая значимость. Выделены и собраны в коллекцию виды грибов рода Trichoderma, встречающиеся в почвах лесопитомников Средней Сибири. Показана возможность использования биологического антагонизма в борьбе с сосудистыми микозами сеянцев хвойных в лесопитомниках Сибири. Отобраны два перспективных штамма, которые могут быть рекомен- ] дованы для защиты сеянцев хвойных в Сибири. Штамм гриба Trichoderma sp. МГ 97 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов. Установлено, что использование грибов рода Trichoderma в защите зерновых культур от корневых гнилей в Красноярском крае не только эффективно подавляет возбудителей инфекции, но и позволяет повысить урожайность и улучшить качество зерна нового поколения.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на ХХХШ Международной студенческой конференции "Студент и научно-

технический прогресс" в Новосибирском госуниверситете, 1995; II Всероссийской научной конференции "Агроэкология и устойчивое развитие регионов" в КрасГАУ, 1998; П Региональной научной конференции "Экология Южной Сибири - 2000

год" в Хакасском государственном университете, 1998; IUFRO. International Symposium "Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization" Krasnoyarsk, 1998.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, четырех глав экспериментальной части, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 163 работы отечественных и 138 - зарубежных авторов, приложение. Материалы диссертации изложены на 139 страницах текста, содержат 10 таблиц, 39 рисунков, 10 фотографий.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований стали 5 видов грибов, принадлежащих к роду Trichoderma Pers.:Fr.: Trichoderma harzianum Rifai aggr., Trichoderma ана-морфа Hypocrea gelatinosa (Tode:Fr.), T.virens (Miller, Giddens & Foster) von Arx, T.longibrachiatum Rifai и T.viride Pers.:Fr.

Вид T.harzianum штамм «Универсальный» был предоставлен станцией защиты растений. Остальные 4 вида были выделены нами из почв лесопитомников Средней Сибири.

Работа состояла из двух этапов. На первом этапе осуществляли интродукцию гриба T.harzianum Rifai aggr. штамм «Универсальный» в ризосфер-ную почву различных агроценозов. Этот штамм используется для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов и разрешен для применения в сельском и лесном хозяйстве. На втором этапе проводили выделение и идентификацию грибов рода Trichoderma, распространенных в почвах лесопитомников Средней Сибири, и оценивали возможность использования аборигенных изолятов для защиты сеянцев хвойных в лесопитомниках.

Идентификацию проводили на основании физиолого-морфологических и культуральных особенностей выделенных изолятов по методам, предложенным M.Rifai (1960) и J.Bissett (1984, 1991а-с). Изучение антибиотической актвности и спектра действия грибов рода Trichoderma в отношении фитопатогенных микроминетов проводили методами перпендикулярных штрихов и бумажных дисков (Егоров, 1976; Сэги, 1983). Гиперпаразитическую активность оценивали по методике ЛЛ.Великанова и др. (1994). Фунгистатическую активность летучих выделений гриба T.harzianum исследовали по методике, предложенной для фитонцидов (Завелишко, Николаев, 1990).

В период с 1992 по 1994 гг. был поставлен ряд экспериментов по внесению спор гриба T.harzianum в ризосферную почву агроценозов. В качестве модельных агроценозов исследовали посевы зерновых культур на опытных делянках Солянского ОПХ КНИИСХ, которое расположено в лесостепной зоне Канско-Рыбинской котловины. Среднегодовое количество осадков -260-400 мм, продолжительность периода с температурой выше +10 °С -115120 дней. Почва - выщелоченный чернозем.

Исследовали ризосферную микрофлору зерновых культур яровой пшеницы сорта «Красноярская-83» и ярового ячменя сорта «Кедр». Предпосевную обработку семян спорами гриба T.harzianum проводили методом опудривания. Инфекционная нагрузка - 2 г на 1 кг семян (6x109 спор в 1 г). Анализ микробного населения ризосферной почвы и степени инфицированное™ корневой системы растений фитопатогенами проводили в различные фазы развития растений (всходы, кущение, колошение, восковая спелость).

Почвенные образцы отбирали по методу Д.Г.Звягинцева (1976). Методической основой исследования численности микроорганизмов послужили рекомендации отдела почвенных микроорганизмов Института микробиологии РАН. Бактерии, использующие органические формы азота, учитывали на мясопептонном агаре (МПА), бактерии и акгиномицеты, использующие минеральные формы азота - на крахмало-аммиачной среде (КАА), олигонитро-филы и аэробные азотфиксаторы - на среде Эшби. Численность микромице-тов изучали на среде Чапека и сусловом агаре. Идентификацию микроорганизмов проводили по методикам Берги (1980), В.И.Билай (1977), В.И.Билай и З.А.Курбацкой (1990), НАКрасильникова (1974), М.А.Литвинова (1967), Н.М.Пидопличко (1977), T.Watanabe (1994).

Оценку действия гриба T.harzianum на ризопланную микрофлору и морфо-физиологические параметры сеянцев ели сибирской (Picea obovata L) проводили в Проблемной научно-исследовательской лаборатории светофи-зиологии и светокультуры КрасГУ. Обработку семян спорами гриба

T.harzianum штамм «Универсальный» проводили методом опудривания. Инфекционная нагрузка - 2 г на 1 кг семян (титр 8,3х109 спор в 1 г). Посев осуществляли в стерильный керамзит. В процессе выращивания поддерживали температуру 25-30 °С и влажность 55-75%. Образцы для анализа ризо-планной микрофлоры сеянцев отбирали через 3,5 месяца.

Оценку влияния предпосевной обработки семян спорами гриба T.harzianum на морфо-физиологические параметры сеянцев ели проводили при различных световых режимах методом двухфакгорного дисперсионного анализа: I фактор: предпосевная обработка семян,

II фактор: интенсивность света (5 градаций от 32 до 66 Вт/м2 ФАР)

Учитывали следующие показатели: всхожесть, длину надземной части, длину главного корня, диаметр корневой шейки, вес надземной и подземной части, количество хвои, концентрацию хлорофилла в хвое.

Возможность использования грибов рода Trichoderma для защиты сеянцев хвойных в Сибири исследовали на модельном лесопитомнике, расположенном на территории Мининского лесного хозяйства, находящегося в зоне таежного редколесья Восточного Саяна. Среднегодовое количество осадков - 400-600 мм, продолжительность периода с температурой выше +10 °С - 110-115 дней. Исследовали ризосферную микрофлору и некоторые морфометрические параметры сеянцев ели сибирской. Перед посевом семена обрабатывали по следующей схеме:

1. Контроль.

2. Семена опудрены спорами гриба T.harzianum (титр 9 х 109 спор в 1 г) в количестве 7,0 г на 1 кг семян. Инфекционная нагрузка - 1,5 х 105 спор на 1 см2 почвы.

3. Биопрепарат "Триходермин БЛ" (ТУ 10.01.25-88) вносили в почву вместе с посевным материалом. Количество вносимого биопрепарата составляло 125 г на 1 кг семян, инфекционная нагрузка - 6 х 105 спор на 1 см2 почвы.

4. Внесение гриба T.harzianum в почву проводили аналогично варианту № 3, но количество биопрепарата было увеличено в 2 раза (250г на 1 кг семян). Инфекционная нагрузка составила 1,2 х 106 спор на 1 см2 почвы.

Анализировали сеянцы 2-го года вегетации. Учитывали жизнеспособность сеянцев и следующие показатели: длину охвоенной части, длину надземной части, длину главного корня, диаметр корневой шейки, величину приростов 1-го и 2-го года, вес надземной части, вес подземной части. Дисперсионный анализ и оценку достоверности различий по критерию Фишера для уровня вероятности не менее 95% (Зайцев, 1984) проводили с использованием пакета программ Statistíca 5.0.

ГЛАВА 3. Взаимоотношения гриба Trichoderma harzianum с микрофлорой ризосферы растений

Микробиологический анализ ризосферной почвы и пораженных органов растений показал, что среди фитопатогенов, вызывающих болезни зерновых культур в Красноярском крае, наиболее распространены грибы из родов Biporalis Shoem. и Fusarium Bilai (рис. 1). Сосудистые микозы сеянцев в лесопитомниках чаще всего вызывают грибы из родов Fusarium и Alternaría Nees ex Wall. Несколько реже - Botrytis Mich.ex Tt.,Cladosporium Link

ex Fr. и Pythium Hesse (рис. 2). Выбор именно зерновых и хвойных культур для обследования был обусловлен не только их высокой ценностью в народном хозяйстве, но также тем, что большая часть территории, на которой в настоящее время расположены лесопитомники, ранее была занята посевами сельскохозяйственных культур либо находится вблизи них. Поэтому многие из фитопатогенов являются общими для зерновых и хвойных растений.

Фитопатогенные микромицеты, вызывающие болезни зерновых культур и сеянцев хвойных, в большинстве случаев обладали средней и сильной чувствительностью к метаболитам гриба T.harzianum (зона отсутствия роста составляла более 15 мм). Наиболее чувствительными оказались грибы родов Biporalis, Alternaría и Botrytis, а из представителей рода Fusarium -F.gibbosum, F.avenaceum v. herbarum, F.heterosporum, F.avenaceum, F.moniliforme (диаметр зоны отсутствия роста превышал 30 мм).

Проведенный сравнительный анализ активности метаболитов культу-ральной жидкости гриба T.harzianum и ее летучих выделений показал, что зависимость между ними отсутствовала. Этот факт может свидетельствовать о том, что гриб T.harzianum проявляет разные формы антагонистического действия по отношению к фитопатогенам, и при этом контакт с мицелием не является обязательным условием.

Для того, чтобы оценить, насколько избирательно осуществлялось действие вносимых антагонистов, изучали влияние метаболитов гриба T.harzianum на сапрофитную микрофлору почвенного микробоценоза растений. Лабораторные исследования показали, что ризосферные бактерии проявляли только среднюю и слабую чувствительность к антибиотическим веществам гриба T.harzianum (рис. 3).

I 45

га 40

Ö 35

О. 30

§25 ш

Ь 20 &15

Б 10

а 5

§ 0 со

i Д.

Iii

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Виды фитопатогенов

Рис. 1. Биологическая активность метаболитов гриба ТпсИос1еппа Ьатапит в отношении фитопатогенов зерновых культур

1. Biporalis australiensis;

2. Fusarium gibbosum;

3. Fusarium avenaceum v. herbarum;

4. Fusarium heterosporum;

5. Fusarium sporotrichiella;

6. Fusarium soiani v. coeruleum;

7. F. avenaceum;

8. Fusarium graminearum;

9. Fusarium sporotrichiella v. poae;

10. Fusarium moniliforme v. lactis;

11. Fusarium soiani v. argillaceum;

12. Fusarium oxysporum;

13. F. oxysporum v. orthoceras;

14. Fusarium moniliforme;

15. Fusarium tabacinum;

16. Fusarium moniliforme v. subglutinans;

17. Fusarium soiani;

18. Fusarium flavum.

19. Fusarium nivale;

S 5 50 j

(0 4S I-

п 40 -■

о О- 35 ■

к 30 -

Ь." ?R -

о

d 20 -

5; о 15-

S 10 -

га 5 -

т.

о

о

лц

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Виды фитопатогенов

Рис. 2. Биологическая активность метаболитов гриба Тпскойегта Ьатапит в отношении фитопатогенов сеянцев хвойных

1. Alternaria altemata;

2. Alternaria tennuis;

3. Botrytis cinerea;

4 Cladosporium epyphillum;

5. Pythium debaryanum;

6. Fusarium avenaceum;

7. Fusarium moniliforme;

8. Fusarium moniliforme v.lactis;

9. Fusarium oxysporum v. orthoceras;

10. Fusarium nivale;

11. Fusarium oxysporum;

12. Fusarium solani;

13. Fusarium solani v. argillaceum;

14. Fusarium sporotrichiella v. sporotrichioides

1 2 3 А 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Виды бактерий

Рис. 3. Антибиотическая активность гриба ТпсИоёегта Иашапит в отношении ризосферных бактерий

1. Actinomyces globisporus, 10. Bacillus idosus,

2. Actinomyces rectus,

3. Bacillus glutinosus,

4. Bacillus coagulans,

5. Bacillus tenuissimus,

6. Bacillus natans,

7. Bacillus megaterium,

8. Bacillus nudiosporus,

9. Bacillus mycoides,

11. Bacillus brevis,

12. Bacillus subtilis,

13. Bacillus cereus,

14. Bacillus oligonitrophilus,

15. Bacillus mesentericus,

16. Pseudomonas aurantiaca,

17. Pseudomonas fluorescens,

18. Pseudomonas carnea,

19. Pseudomonas herbicola,

20. Pseudomonas pantotropha,

21. Pseudomonas sinuosa,

22. Pseudomonas liquida,

23. Micrococcus roseus,

24. Micrococcus flavus

25. Micrococcus luteus,

26. Micrococcus albus,

Сапрофитные микромицеты в большинстве оказались слабочувствительными, либо совсем нечувствительными к антибиотическим веществам

гриба T.harzianum. Исключение составили Aspergillus fumigatus и Pénicillium chrysogenum, проявившие среднюю чувствительность к метаболитам антагониста.

Для оценки взаимоотношений в почвенном микробоценозе были проведены исследования влияния метаболитов бактерий на гриб T.harzianum. В результате выяснилось, что из 26-ти исследованных видов ризосферных бактерий только 8 оказывали влияние на гриб T.harzianum, однако в целом, степень влияния была слабой за исключением вида P.fluorescens, который проявлял среднюю антибиотическую активность в отношении T.harzianum.

Таким образом, взаимоотношения грибов рода Trichoderma с компонентами микробоценоза ризосферы растений являются разносторонними, а влияние, оказываемое друг на друга, - взаимным. Эти данные подтверждают тот факт, что в естественных условиях большую роль играют конкурентные взаимоотношения с аборигенной микрофлорой почвы, поэтому представляло интерес исследовать влияние интродукции гриба T.harzianum в ризосфер-ную почву на сложившийся комплекс почвенных микроорганизмов.

ГЛАВА 4. Оценка эффективности интродукции гриба Trichoderma harzianum в различные биоценозы

4.1. Изменение структуры микробоценозов при интродукции гриба Trichoderma harzianum в ризосферу растений

По данным исследований, проводимых в 1989-1992 гг, почвы Красноярского края повсеместно имеют высокую заселенность конидиями возбудителей корневых гнилей. В среднем, количество патогенных грибов в ризосфере превышает порог вредоносности в 3-5 раз и повышается к концу вегетационного периода (Воронцов, Семенкова, 1988; Халанская, Громовых, Анисимова, 1992). Это свидетельствует о необходимости проведения мероприятий по оздоровлению почв сельскохозяйствешшх и лесных угодий.

В течение вегетационного периода 1994 г. изучали влияние интродукции гриба T.harzianum на общую численность микроорганизмов, а также на численность сапрофитных и патогенных микромицетов, обитающих в ризосфере пшеницы. Анализ динамики общей численности бактерий показал, что наибольшее количество бактерий было отмечено в фазу кущения (июль) и составило (11,8±0,2)х106 клеток в 1 г воздушно-сухой почвы. Интродукция гриба T.harzianum в ризосферу пшеницы привело к снижению общего количества бактериальной микрофлоры на 12,7-14,2% по сравнению с контролем. Однако, в фазу восковой спелости различия в контроле и опытном варианте уже не являлись достоверными.

Не смотря на некоторое снижение общей численности бактерий в опытном варианте, качественный состав не претерпел значительных изменений и процентное соотношение представителей основных семейств достоверно не изменялось во все фазы развития растений. Преобладающими, как правило, являлись неспоровые формы бактерий, среди которых доминировали представители сем. Pseudomonodaceae, к концу вегетационного периода возрастала доля спорообразующих бактерий сем. Bacillaceae.

Анализируя процентное соотношение представителей различных родов микромицетов ризосферы пшеницы, можно отметить, что в качественном составе произошли изменения. Количество сапрофитных микромицетов родов Pénicillium и Aspergillus достоверно не изменялось, в то же время численность фитопатогенов из родов Biporalis и Fusarium в опытном варианте уменьшилось в 3,6-5,4 раза. Представители рода Altemaria в вариантах с внесением спор T.harzianum обнаружены не были (табл. 1).

В данной работе оценивалась возможность применения грибов рода Trichoderma для защиты сеянцев хвойных от возбудителей сосудистых микозов. Поскольку такие исследования в Красноярском крае проводились впервые, был поставлен лабораторный эксперимент по выращиванию сеянцев ели в условиях светокультуры, на основании результатов которого могли бы судить о целесообразности применения грибов рода Trichoderma для защиты сеянцев хвойных пород.

Таблица 1

Численность микромицетов в ризосфере пшеницы (контроль / опыт)

Представители родов Количество микромицетов, тыс. в 1 г почвы

Июль Август Сентябрь

М±т ^(эксп) Mim ^(эксп) Mim t(3KCn)

Pénicillium 114.5+11.3 107,5±9,7 0,4 127.512.1 121,512,0 2,0 135.0114.4 129,9112,1 0,2

Aspergillus 34.8±6.7 26,5±3,4 1,1 45.016.7 27,512,6 2,4 85.7112.3 68,418,6 2,0

Trichoderma 12.4±1.8 36,6±2,3 *8,2 16.511.3 28.311.4 *б,1 10.012.2 14,615,2 0,8

Alternaria 27.5±6.4 1,4±0,7 ♦4,0 32.5+8.0 0 - 34.2110,0 0 -

Biporalis 92.5±9.9 3,0±0,5 *9,0 132,5110.6 36,715,5 ♦8,0 174,5112.1 32,5111,2 *8,6

Fusarium 25,7±2,2 7,0±1,0 *7,7 27.513.2 10,010,9 *5,2 40,516,8 10,012,3 *4,2

Mucor 8.011.5 3.010.6 ♦3,0 22.511.4 0 - 10.012.5 13,613,2 0,8

Примечание: знаком "*" отмечено достоверное различие с контрольным вариантом при 95% уровне вероятности

Численность фитопатогенных грибов из рода Fusarium и Altemaria в ризоплане контрольных сеянцев была достаточно велика и составляла 24 и 7% соответственно. Это свидетельствовало о том, что большая доля семян ели содержала внутреннюю инфекцию, по скольку в стерильном керамзите сеянцы не могли инфицироваться фитопатогенами из внешней среды. Обработка семян спорами 1риба T.harzianum привела к уменьшению общей численности ризопланной микрофлоры в 1,5 раза. Вероятно, это связано с высокой биологической активностью «Универсального» штамма гриба T.harzianum и низкой конкурентноспособностью микроорганизмов, обитающих в ризоплане сеянцев, выращиваемых в керамзите, а не в почве. Кроме того, изменилось соотношение среди представителей как бактериальной, так

и грибной микрофлоры сеянцев. Количество неспоровых бактерий в опытном варианте увеличилось на 22,4%, а количество грибов - на 39,9%. Рост общей численности грибов в ризоплане сеянцев произошел в основном за счет увеличения популяции грибов рода Trichoderma, в том числе вносимых T.harzianum, в то же время численность фитопатогенных грибов родов Alternaría и Fusarium значительно снизилась по сравнению с контрольным вариантом и составила всего 6 %.

Предварительные исследования в лаборатории светокультуры показали возможность использования грибов рода Trichoderma для защиты сеянцев от возбудителей сосудистых микозов, вызываемых грибами Alternaría и Fusarium. В дальнейших экспериментах исследовали влияние интродукции гриба T.harzianum в ризосферную микрофлору сеянцев ели на модельном лесопитомнике Мининского лесхоза.

Анализ динамики общей численности бактерий в ризосфере ели, проводимый в вегетационный период 1997 г, показал, что максимальная численность бактериального населения приходилась на июль и составила (6,14+0,62) х10 клеток в 1 г почвы. В августе численность бактериального населения уменьшилась до (2,57±0,34) х10 клеток в 1 г почвы. Количество бактерий в ризосфере ели коррелировало со среднемесячной температурой (г = 0,59) и осадками (г = 0,41). Обогащение ризосферы ели грибами T.harzianum привело к снижению общей численности бактерий в июле на 38,1% по сравнению с контролем. Однако, в последующие месяцы это различие уменьшилось и не являлось достоверным.

Соотношение представителей основных семейств бактерий в ризосфере сеянцев существенных различий в контрольном и опытном вариантах не обнаруживало. В течение всего вегетационного периода количественно преобладали неспоровые бактерии, обладающие высокой скоростью размножения и активным полиферменггным аппаратом. К концу вегетационного периода возрастала доля спорообразующих бактерий.

Обогащение ризосферы ели грибами T.harzianum не привело к достоверным изменениям общей численности микромицетов по сравнению с контрольным вариантом. В течение всего вегетационного периода она изменялась слабо и составляла от 103±31 до 144±37 тыс. пропагул в 1 г почвы. Идентификация представителей сапрофитной микобиоты ризосферы показала, что во всех почвенных образцах доминировали представители рода Pénicillium. Численность популяций представителей фитопатогенных микромицетов в контрольном варианте была достаточно высокой. Преобладали грибы родов Alternaría и Fusarium. Интродукция спор гриба T.harzianum в ризосферу сеянцев ели позволила достоверно уменьшить численность фитопатогенных микромицетов в опытных образцах (табл. 2).

4.2. Динамика численности популяции грибов рода Trichoderma, при интродукции в различные биоценозы

В настоящей работе был проведен анализ динамики численности популяции грибов T.harzianum, интродуцированных в ризосферу пшеницы и сеянцев ели вместе с посевным материалом. В результате было установлено, что в первый месяц после интродукции происходило увеличение плотности

популяции грибов рода Тг1сЬос1егта и некоторое время она находилась на достаточно высоком уровне: в 2,5-3,3 раза выше, чем в контрольных образцах. В дальнейшем наблюдалась тенденция снижения плотности популяции грибов рода ТпсЪойегта и постепенного приближения ее к контрольной в конце периода вегетации. В в ризосфере сеянцев ели в опытном варианте численность грибов рода ТпсНоАегта увеличивалась в июле до 31,8 ± 1,3 тыс. в 1 г ризосферной почвы и сохранялась на таком уровне до конца периода наблюдения. Тем не менее, достоверных различий численности в опытном и контрольном вариантах в сентябре отмечено не было (табл. 2). Эти факты свидетельствуют о том, что интродукция гриба Т.Иатстит в естественный микробоценоз не приводит к длительным экологическим нарушениям.

Таблица 2

Численность микроминетов в ризосфере сеянцев ели (контроль / опыт)

Представители Количество микромицетов, тыс. в 1 г почвы

родов Июль Август Сентябрь

M ± m ^(эксп) М±ш ^(эксп) M ±т ^(эксп)

Pénicillium 34.1±1.8 1,9 36,3±2,3 2,86 99,2+7,6 3,5

40,3±2,7 34,6+1,7 67,0±5,0

Aspergillus 23.0±1.4 1,2 22.3±0.9 1,1 54,1±2,4 2,4

25,7±1,6 20,1±1,6 43,1±3,7

Trichoderma 9.7±0.5 *15,8 15.8±0.8 »8,8 23,9+2,3 3,4

31,8±1,3 31,7±1,6 33,9±1,7

Fusarium 7.6±0,3 ♦5,2 5,6±0.3 ♦11,7 6.2±0.2 -

3,1±0,8 1,9±0,1 0

Alternaria 5,4±0,2 *14,7 5.6±0.3 ♦7,7 8.3±0,3 -

2,1±0,1 2,8±0,2 0

Mucor 0,8±0.1 - 3,7+0,4 2,4 6.2±0,3 -

0 4,8+0,2 0

Примечание: знаком "*" отмечено достоверное различие с контрольным вариантом при 95% уровне вероятности

ГЛАВА 5. Влияние гриба Trichoderma harzianum на растения

5.1. Влияние гриба T.harzianum на инфицированностъ зерновых культур возбудителями корневых гнилей

В 1992-93 гг. в Солянском ОПХ были проведены исследования влияния интродукции гриба T.harzianum на пораженность корневой системы пшеницы и ячменя возбудителями корневых гнилей. В качестве эталона для сравнения эффективности использовали химический фунгицид пентатиурам.

Идентификация возбудителей болезни позволила установить, что особую опасность для зерновых культур представляла гельминтоспориозная инфекция, вызываемая грибами Biporalis australiensis (M.B.Ellis)Tsuda. Инфицированностъ корневой системы растений этими грибами в контроле возрастала к концу вегетации и в фазу восковой спелости составила 23,0-33,0 % для ячменя и 51,0-75,0 % для пшеницы в разные годы. Пораженность растений грибами из рода Fusarium, была несколько меньше. Исследования пока-

зали, что пшеница была сильнее подвержена корневым инфекциям, чем ячмень, в том числе и смешанным (гельминтоспориозно-фузариозным).

Предпосевная обработка семян пшеницы и ячменя биологическим (T.harzianum) и химическим (пентатиурам) фунгицидами позволила снизить пораженность зерновых культур возбудителями корневых гнилей, однако эффективность препаратов зависела от специфичности возбудителя и вида исследуемой культуры: наиболее заметный положительный эффект бы получен при обработке семян пшеницы; тенденция снижения инфицированно-сти корневой системы грибами из рода Biporalis достигала 52-79%, а грибами из рода Fusarium - 69,6-89%, при этом защитное действие биологического агента не уступало химическому фунгициду, а в фазу восковой спелости действие гриба T.harzianum было в 1,4-1,9 раза эффективнее.

Интродукция гриба T.harzianum в ризосферу ячменя достоверно снижала инфицированностъ корневой системы грибами рода Biporalis на 65,182% и была менее эффективна в защите от фузариоза. Протравливание семян пентатиурамом принесло положительный результат в борьбе с корневыми гнилями только в 1993 г, но к концу вегетационного периода эффективность этого препарата заметно снижалась.

Длительное действие биологического предполагает возможность защитить растения от проникновения фитопатогенов в зерно и развития внутрисемейной инфекции. В дальнейших исследованиях было показано, что обработка посевного материала спорами гриба T.harzianum позволила значительно уменьшить количество пораженных семян первого поколения. Эффективность предпосевной обработки зерна спорами гриба T.harzianum в наших исследованиях оказалась выше по сравнению с химическим протравителем и достигала 50-90 %. Лабораторная всхожесть зерна, полученного в результате предпосевной обработки спорами T.harzianum, в среднем была на 8,6-10,1 % выше, чем в контроле, а энергия прорастания - на 12,4-12,6%. Результаты исследований также свидетельствуют о том, что предпосевная обработка семян спорами T.harzianum обеспечила достоверную прибавку урожайности яровой пшеницы на 13,7-21,1% и ячменя - на 9,5-20,3% по сравнению с контролем.

5.2. Влияние гриба Trichoderma harzianum на физиологические показатели сеянцев ели в условиях светокультуры и лесопитомника

Вопрос о влиянии грибов рода Trichoderma на растения ставится многими исследователями и является одним из наиболее важных при решении проблемы о возможности использования биологического антагонизма в защите растений. Модельные эксперименты, проводимые в условиях светокультуры, показали, что при недостатке органических веществ и отсутствии фитопатогенов в субстрате (стерильный керамзит) эффективность грибов T.harzianum, вносимых с семенами ели при посеве, была низкая. Тем не менее, в эксперименте было отмечено стимулирование развития корневой системы в опытном варианте при интенсивности света 32-52 Вт/м2 ФАР: увеличивалась длина главного корня, диаметр корневой шейки, биомасса корневой системы, количество хвои, концентрация хлорофилла. Ослабленные се-

янцы ели, выращиваемые в условиях избыточного освещения (60-66 Вт/м2 ФАР), оказались не восприимчивыми к действию гриба Т.Ьатапит (рис. 4).

32-40 40-46 46-52 52-60 60-66 Интенсивность света, Вт/м2 ФАР 0,92

32-40 40-46 46-52 Интенсивность света,

52-60 60-66 Вт/м2 ФАР

' 32-40 40-46 46-52 52-60 60-66 Интенсивность света, Вт/м2 фар

32-40 40-46 46-52 52-60 60-66 Интенсивность света, Вт/м2 фар

Рис. 4. Влияние предпосевной обработки спорами гриба Trichoderma harzianum на развитие сеянцев ели в условиях светокультуры _- контроль,

____- обработка спорами Т.harzianum

Эксперименты, проводимые в условиях лесопитомника, показали, что влияние грибов рода Trichoderma на развитие сеянцев ели проявлялось в большей степени по отношению к корневой системе, чем к надземной части. Длина главного корня увеличивалась при внесении триходермина-БЛ на 18,3-29,3 %, а биомасса корневой системы - на 36,7 % - при внесении чистых спор T.harzianum и на 10,2-34,7 % - при внесении триходермина-БЛ (рис. 5). В то же время, длина надземной части и ее биомасса достоверно не изменялась при всех видах обработки.

Анализ качества сеянцев ели показал, что внесение гриба T.harzianum с посевным материалом позволило увеличить выход здоровых сеянцев по сравнению с контролем. Распределение по категориям жизненного состояния изменялось в зависимости от количества внесенного в ризосферу гриба T.harzianum. Наибольшее количество здоровых сеянцев было получено при внесении в почву спор T.harzianum и составляло 84,1 %. В этом же варианте было меньше всего погибших сеянцев - 2,8 %. При внесении триходермина-БЛ в количестве 125 г количество здоровых сеянцев составляло 73,6 %, а при дальнейшем увеличении инфекционной нагрузки (250 г триходермина-

20

БЛ) - количество здоровых сеянцев уменьшалось до 34,1 % и увеличивалось количество сеянцев с пожелтевшей хвоей,

§.1г 8 ю

£ в

0 8

16

1 2 Se

0,6

0,7 tfW

8 0,5

12 3 4 12 3 4

Варианты опыта Варианты опыта

Рис. 5. Влияние предпосевной обработки спорами гриба T.harzianum на корневую систему сеянцев ели в условиях лесопитомника 1- контроль, 3 - триходермин-БЛ (125г),

2 - споры T.harzienum, 4 - триходермин-БЛ (250г)

Таким образом, интродукция гриба T.harzianum в почву агроценозов и лесопитомников Сибири оказывала оздоравливающее действие на ризо-сферную микрофлору и корневую систему растений и не проводила к нарушению сапрофитного комплекса микроорганизмов.

Гриб T.harzianum, как и большинство видов рода Trichoderma предлагаемых в настоящее время для защиты растений, выделен европейскими исследователями. Но анализ литературных сведений показал, что использование для защиты растений стандартных музейных штаммов не всегда приносит ожидаемый эффект, так как в естественных условиях большую роль играют конкурентные взаимоотношения с аборигенной микрофлорой почвы, поэтому с точки зрения экологической безопасности весьма перспективно вести поиск активных штаммов-антагонистов среди представителей аборигенных микромицетов рода Trichoderma.

Глава 6. Биологические свойства аборигенных штаммов грибов из рода Trichoderma

Обследование почв ряда лесопитомников, расположенных на территории Красноярского края, показало, что грибы рода Trichoderma являются типичными представителями микробоценозов. На основании макро- и микроморфологических признаков, описанных в работах Дж.Биссет (1984, 1991 а-с, 1992), нам удалось проанализировать более 200 изолятов и идентифицировать 4 вида, принадлежащих к 3 секциям.

Секция Pachybasium: Trichoderma анаморфа Hypocrea gelatinosa (Tode:Fr.), Trichoderma virens (Miller, Giddens & Foster) von Arx. Секция Longibrachiatum: Trichoderma longibrachiatum Rifai, Секция Trichoderma: Trichoderma viride Pers/.Fr.

Поиск активных антагонистов, которые могут хорошо развиваться в широком диапазоне температур, важен для защиты растений в условиях Сибири, так как данные условия характеризуются резкими колебаниями температуры и влажности в начале вегетационного периода, когда защитное действие особенно необходимо для растений. Было установлено, что исследуе-

мые виды имеют не одинаковый температурный оптимум: Trichoderma ана-морфа Н.gelatinosa и T.viride лучше развивались при температуре 15-20 °С, а T.virens и T.longibrachiatum - при 25-35 °С. Все исследуемые виды активно утилизировали субстраты растительного происхождения.

В настоящей работе был проведен анализ антибиотической и гиперпаразитической активности выделенных аборигенных видов рода Trichoderma по отношению к наиболее опасным и часто встречающимся в лесопитомниках Средней Сибири почвенным фитопатогенам. Для сравнения использовали T.harzianum "Универсальный" штамм как эталон.

Исследования показали, что все аборигенные виды проявляли разную степень активности. Наибольшей гиперпаразитической активностью (до 10 баллов по методике ЛЛ.Великанова) обладали Trichoderma анаморфа Н.gelatinosa и T.virens. Оценка антагонистической активности метаболитов культуральной жидкости аборигенных ввдов рода Trichoderma показала, что они обладают способностью к быстрому накоплению антибиотиков во внешней среде и проявляют высокую активность в подавлении роста тест-культур (рис. 6).

35 т

Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma Trichoderma harzianum анаморфа virens longibrachiatum viride

Hypocrea gelatinosa

Рис. 6. Сравнительная оценка антибиотической активности метаболитов аборигенных видов рода Trichoderma | | Fusarium avenaceum, j~ : Fusarium nivale Bilai,

(___J Fusarium sporotrichiella v. poae, IUI Fusarium gibbosum

Fusarium moniliforme v. Iactis,

выводы

1. Интродукция гриба T.harzianum в ризосферу растений привела к избирательному подавлению фитопатогенных микромицетов. В ризосферной почве зерновых культур количество фитопатогенов из родов Biporalis и Fusarium уменьшилось на 40,4-65,8 % в сравнении с контролем; в ризосфере сеянцев хвойных количество фитопатогенов из родов Alternaría и Fusarium уменьшилось на 65,3-96,8 %. В то же время численность сапрофитных микромицетов и бактерий в ризосфере исследуемых растений существенно не изменялось.

2. Анализ динамики численности грибов рода Trichoderma, интроду-цированных в естественный микробоценоз, показал, что в течение первых 30-ти суток после внесения спор происходило увеличение плотности популяции в 2,5-3,3 раза. В последующие месяцы наблюдалась тенденция к снижению численности грибов рода Trichoderma и приближение ее к контрольной. Этот факт может свидетельствовать о том, что интродукция гриба T.harzianum в микробоценоз не приводит к длительным экологическим нарушениям.

3. Предпосевная обработка семян ячменя и пшеницы спорами гриба T.harzianum позволила существенно снизить инфицированность корней возбудителями сосудистых микозов, на 50-90% уменьшить количество семян, содержащих внутреннюю инфекцию, а также повысить урожайность на 20,321,1 %.

4. Изучение влияния гриба T.harzianum на развитие сеянцев хвойных в условиях фитотрона и лесопитомника показало, что предпосевная обработка семян спорами гриба является благоприятным фактором для развития корневой системы, предотвращает ее инфицированность и позволяет увеличить выход здоровых сеянцев.

5. Грибы рода Trichoderma являются типичными представителями почвенной микрофлоры лесопитомников Красноярского края. В результате обследования почв ряда лесопитомников было выделено более 200 изолятов грибов рода Trichoderma, принадлежащих к 4 видам: Trichoderma анаморфа Hypocrea gelatinosa (Tode:Fr.), T.viride Pers.:Fr., T.virens (Miller, Giddens & Foster) von Arx, T.longibrachiatum Rifai.

6. Грибы рода Trichoderma, выделенные из почв лесопитомников Красноярского края подавляют рост возбудителей сосудистых микозов сеянцев хвойных. Антагонистическая и гиперпаразитическая активность видов Trichoderma анаморфа Н.gelatinosa и T.virens сопоставима с активностью уже использующегося в защите растений гриба T.harzianum, а в ряде случаев превосходит ее. Высоко активные изоляты выделены из почв малоинфици-рованных питомников, что подтверждает сдерживающее действие антагонистов в природных условиях на возбудителей эпифитотий фузариоза.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Громовых Т. И., Гукасян В. М., Халанская А. П., Саврасова С. В., Черняк Н. Г., Ильина Н. О. Экологические аспекты применения биологических и химических фуншцидных препаратов / Сб. тез. "Актуальные проблемы биологии". Изд-во КГУ: Красноярск, 1994. С. 49.

2. Шмарловская С. В. Эффективность новых форм биологических препаратов в борьбе с корневыми гнилями яровой пшеницы / Тез. Всерос. студ. науч. конф. "Экология и проблемы защиты окружающей среды". Изд-во КГУ: Красноярск, 1994. С. 14.

3. Шмарловская С. В., Сазикова Н. Г. Экологические аспекты интродукции штаммов грибов Trichoderma в агроценозах / Студент и научно-технический прогресс //Мат. ХХХШ Междутар, студ. конф. НГУ: Новосибирск, 1995. С. 13.

4. Голованова Т. И., Гукасян В. М., Громовых Т.И., Шмарловская C.B. Действие грибов рода Trichodeima на компоненты агроценозов томатов. /Методические аспекта экспериментальной работы в исследованиях агрономического профиля: Мат. регион, науч. конф. КрасГАУ. Красноярск, 1995. С.56-57.

5. Громовых Т. И., Тюльпанова В.А., Гукасян В.М., Шмарловская C.B.. Халанская А.П. Эффективность использования биологических препаратов против корневых гнилей злаков в лесостепной зоне Красноярского края /Методические аспекты экспериментальной работы в исследованиях агрономического профиля: Мат. регион, науч. конф. КрасГАУ. Красноярск, 1995. С.47-48.

6. Шмарловская С. В.. Громовых Т. И., Гольд В. М., Тюльпанова В. А. Использование биологического контроля против возбудителей корневых гнилей зерновых культур / Сб. науч. тр. "Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов". Новосибирск, 1997. С. 114-119.

7. Громовых Т. И., Гукасян В.М., Голованова Т.И., Шмарловская С. В. Trichoderma harzianum Rifai aggr. как фактор повышения устойчивости томатов к возбудителям корневой гнили // Микология и фитопатология, 1998. Вып. 2. С. 72-76.

8. Громовых Т. И., Шмарловская С. В.. Гусева Е. А. Оценка антагонистической активности некоторых штаммов гриба Trichoderma harzianum в отношении возбудителей сосудистых микозов сеянцев хвойных. Депонирована в ВИНИТИ за № 466-В98 от 17.02.98 г.

9. Шмарловская C.B. Сравнительная оценка действия биопрепарата на основе гриба Trichoderma harzianum на ризосферную микобиоту в различных биоценозах / Мат. Всерос. науч. конф. "Агроэкология и устойчивое развитие регионов", посвящ. 45-лет КрасГАУ. Красноярск, 1998. С. 41-43.

10. Gromovykh Т. I., Gukasyan V. M., Golovanova T. I., Shmarlovskava S. V.. Shilkina E. A. Perspectives of biopreparations use in increase of Larix sibirica seedling keeping. In "Larix-98: World Resourses for Breeding, Resistance and Utilization" IUFRO Int. Symp., Sept. 1-5, Krasnoyarsk, 1998 (abstracts) P. 36-37.

11. Громовых В. С., Махова Е. Г., Шмарловская С. В. Перспективы использования аборигенных штаммов рода Trichoderma против фузариозов в лесопитомниках Южной Сибири / Мат. Южно-Сибирской Региональной на-

учной конференции студентов и молодых ученых 11-13 ноября 1998, г. Абакан "Экология Южной Сибири - 2000 год". Абакан, 1998. С. 94.

12. Громовых Т.Н., Шмарловская С.В.. Голованова Т.И., Корянова Т.А., Шилкина Е.А. Перспективы использования биометода для лесовозобновления в Сибири / Мат. VI регион, научно-практ. и метод, конф. "Производительные силы Красноярского края в совремешшх социально-экономических условиях". - Красноярск, 1999. - С. 44.

13. Gromovykh Т.. Shmarlovskava S.. Corjanova Т., Malinovsky A. Use of different formes of Trichoderma as a soil fumigant Picea obovata // Ann. Int. Research Conf. On Methyl Bromide Alternatives And Emissions Reductions. -November 1-4, - San Diego, 1999,-P. 38/1-38/5.

14. Gromovykh Т., Tulpanova V., Shmarlovskava S„ Gromovykh V., Makhova H. Strains of Trichoderma benifit for biological control seedlings pathogenes // Ann. Int. Research Conf. On Methyl Bromide Alternatives And Emissions Reductions. - November 1-4, - San Diego, 1999,- P. 39/1-39/4.

15. Гукасян B.M., Громовых Т.Н. Голованова Т.Н., Шмарловская С.В. Ма-хова Е.Г. Микробы-антагонисты как фактор устойчивости сеянцев хвойных / Тез. докл. Международного совещания "Методы оценки состояния и устойчивости сеянцев хвойных". 5-9 августа, Красноярск, 1999

Подписано в печать 13.05.00. Бумага «Xerox Paper». Усл.печ.л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ № 120.

Формат 60x84/16. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,0.

Цена договорная.

Издательский центр

Красноярского государственного университета. 660041 Красноярск, пр. Свободный, 79.

Отпечатано с оригиналов заказчика в ИЦ КрасГУ, ООП биологического факультета.