Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно-климатических зон на территории Республики Татарстан

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно-климатических зон на территории Республики Татарстан"

На правах рукописи

АЛИМОВА ФАРИДА КАШИФОВНА

Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно - климатических зон на территории Республики

Татарстан

03.00.07 - микробиология 06.01.11 - защита растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КАЗАНЬ 2006

Работа выполнена в лаборатории сельскохозяйственной микробиологии кафедры микробиологии и лаборатории молекулярно-генетического анализа кафедры биохимий ГОУ ВПО «Казанский государственный университет им. В.И.Ульянова-Ленина»

Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор,

директор ГУ ТатНИИ агрохимии и почвоведения Россельхозакадемии Яппаров Ахтям Хусаинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор кафедры

биологии почв факультета почвоведения МГУ, зав. отделением почвенной биотехнологии международного биотехнологического центра МГУ им. М.В.Ломоносова Умаров. Марат Мутагарович

доктор ветеринарных наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии ФГОУ ВПО Казанской государственной академии ветеринарной медицины Госманов Рауис Госманович

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией защиты растений РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева Джалилов Февзи Сеид-Умерович

Ведущая организация: Институт экологии и генетики

микроорганизмов Уро РАН, г. Пермь

Защита состоится 22 июня 2006 г. в 1300 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.081.08 . в Казанском государственном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского государственного университета

Автореферат разослан «_22_» _мая_2006 г.

И.о. ученого секретаря

диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

З.И.Абрамова

Актуальность работы. В современных условиях ведения земледелия особую актуальность приобретают две проблемы. Это постоянно растущие затраты на производственную продукцию, вызванные применением традиционных многооперационных технологий возделывания сельскохозяйственных культур, постоянным и значительным повышением цен на энергоносители, сельскохозяйственную технику, минеральные удобрения, средства защиты растений и другие виды промышленной продукции. Вторая проблема связана с потерей плодородных почвенных ресурсов, снижением видового разнообразия микроорганизмов и ухудшением экологической и фитосанитарной обстановки окружающей среды. В настоящее время идет быстрое и повсеместное сокращение площадей с естественной растительностью. В то же время известно, что только природные комплексы с условно коренной растительностью способны поддерживать состояние среды на приемлемом для жизни уровне. В связи с этим особый интерес при экологических исследованиях представляют ненарушенные леса, расположенные ' на территории заповедников, которые могут служить эталоном природных ландшафтов со всем видовым разнообразием, населяющих их организмов, а также почвы не затронутые деятельностью человека."

Территория Республики Татарстан, в настоящее время имеет около 19% территории, покрытой сильно нарушенными лесными природными системами. Исключение составляют отдельные хорошо сохранившиеся хвойные участки леса Раифского лесничества Волжско-Камского заповедника Национального парка «Нижняя Кама». Лесопитомники, используемые для восстановления лесов, характеризуются резким ухудшением агрохимических характеристик. В результате этого, почти пятая часть всходов и сеянцев ежегодно погибает от болезней, а в отдельные годы отмечалась даже стопроцентная гибель сеянцев.

Современные технологии обеспечивают последовательную замену энергоемких минеральных удобрений и пестицидов биопрепаратами нового поколения, разработанными отечественными микробиологами, и -ъ препаратами,'производимыми отечественными биологическими • фабриками. В современных процессах используется микробиологический мониторинг почвенных угодий с целью своевременной оценки ухудшения экологической ситуации, безопасных технологий для сельскохозяйственной промышленности.

Одним из наиболее перспективных видов микроорганизмов для внедрения ресурсосберегающих технологий в сельское хозяйство являются грибы рода Тпскойегта, которые представляют собой наиболее изучаемые грибы в настоящее время. Представителей рода ТпскоЛегта можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере, частично ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенов и микотоксинов, выделяющихся в окружающую среду. Возможно, что ТпсИос1егта - это единственный род грибов, для которого

каждый вид представлен в СепеВапк ИСВ1, по крайней мере, одним геном, и многие виды представлены последовательностью двух или более генов. В целом, в Банке генов хранится информация о 427 видах Нуросгеа (телеоморф) и о 110 видах ТНскойегта. Согласно последним данным, более 40% видов, представленных в СгепеВапк ИСВТ, (44 названия) являются синонимами или идентифицированы неверно.

Причиной возрастающего интереса к ТИсИоЛегта является большая практическая и экологическая значимость рода. Виды Тпскойегта являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитин аз, пектиназ, ксиланаз, серинзависимых протеиназ и др.), используемых в целлюлозно-бумажной и пищевой промышленностях, в производстве моющих средств, в получении спирта, преобразовании отходов, содержащих целлюлозу и глюкозу, для получения кормовых добавок и в текстильной промышленности. На основе антибиотиков, токсинов и ферментов грибов этого рода получают препараты для биологического контроля болезней и стимуляции роста растений и получения трансгенных растений. Тпскос1егта также используется для биологической очистки почвы и для получения биокомпостов.

В рамках данного вопроса исследования биоразнообразия определяются как зондирование перспективности использования определенных природных источников с коммерческой целью. Именно такой подход определил разработку международной «Конвенции по биологическому разнообразию» в качестве законодательства по использованию ценных генетических ресурсов.

В настоящее время перед микологами, изучающими ТпсЬойегта, стоит ряд вопросов: по систематическому положению вида, адекватным методам идентификации, по построению естественного филогенетического древа, географической распространенности, разнообразию и выявлению способности к антагонистической активности к фитопатогенам среди всех видов данного рода, по наличию в природе новых видов, в том числе промышленно значимых.

В связи с вышесказанным представляет большой практический интерес анализ распространенности <и сохранения .видового разнообразия грибов рода ТпсИос1егта на территории Республики Татарстан и их-роли в биогеоценозе и антропогенных ландшафтах, а также возможности использования в сельскохозяйственной промышленности.

Целью настоящего исследования явилась оценка биоразнообразия, динамики численности и характеристик структуры популяций Тпскос1егта в современных почвенных и антропогенных ландшафтах, в эталонных зонах (погребенных и заповедных) на территории РТ, а также выявление основных закономерностей изменения микробиологической активности агроценозов под влиянием антропогенных факторов и роль в этих процессах интродукции штаммов Тггскойегта.

Задачи исследования

1. Исследование распространения грибов рода Тпскойегта и идентификация аборигенных штаммов ТпсЬойегта, выделенных на

территории Республики Татарстан с использованием морфологических, кинетических и молекулярно-генетических методов.

2. Исследование стратегии жизни, внутривидовой и популяционной гетерогенности местных штаммов ТпсЬос1егта, выделенных из различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан.

3. Исследование биохимических свойств штаммов видов ТНскойегта-. фитотоксичности культуральных жидкостей и некоторых ферментов гидролазного комплекса.

4. Оценка степени влияния различных экологических параметров на выживаемость штаммов Тпскойегта.

5. Изучение взаимоотношения штаммов ТпсИоскгта с растениями, фитопатогенными и сапротрофными почвенными микроорганизмами.

6. Отбор стабильных штаммов — продуцентов биопрепаратов по культурально — морфологическим признакам, антибиотической активности, вегетативной совместимости, устойчивости к фунгицидам, взаимодействию с регуляторами роста и бактериями.

7. Оценка биологической активности различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан по данным микробиологического мониторинга. Изучение влияния антропогенных факторов и биоудобрений с активными штаммами ТНсЪойегта на микробиологическую активность почв Республики Татарстан.

8. Разработка способов применения местных штаммов Тпс}гос1егта в промышленности Республики Татарстан с целью получения кормовых добавок (ксиланазы Тп'сИоДегта) для животноводства, переработки растительных, животноводческих, а также городских отходов с целью получения биоудобрений, и для получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Научная новизна. Впервые определен видовой состав и географическое распространение фибов рода ТНсИойегта на территории РТ. Выделены типичные и случайные виды Тпс}гос1егта в современных, погребенных и затопляемых почвах. По данным молекулярно-генетического - - анализа выделены новые :виды ТИсЬекИегта ••• из. > погребенных. • почв и могильников на территории РТ. Установлена гетерогенность природных популяций ТНскойегта и их структура. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода ТпсИоДегта и теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов (например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз). Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Тпскойегта в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений. Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов,

связанных с организацией контроля применения биофунгицидов и биоудобрений. Впервые изучена эколого-биологическая значимость видов рода ТпсУюАегта в почвенной биоте. Выявлена роль ТпсЪоёегта в рефляции супрессивности почв на территории Республики Татарстан. Описана структура популяций ТпсИоЫегта при взаимоотношении с растениями. Установлено, что доля фитотоксических видов зависит от типа стадии сукцессии и типа экологической ниши. Описан комплекс видов фитопатогенных микромицетов, вызывающих поражение сеянцев хвойных, овощных и зерновых культур. Впервые выявлены местные изоляты ТпсИоскгта с высокой антагонистической активностью в отношении почво-обитающих патогенных микромицетов и семенных инфекций. Разработаны оптимальные условия культивирования активных штаммов в различных биотехнологических системах и получен биопрепарат новой формы на основе микромицетно — бактериального сообщества с использованием природных регуляторов и промышленных и сельскохозяйственных отходов. Впервые показана целесообразность использования биопестицида на основе ТНскойегта в ограничении численности возбудителей инфекционных заболеваний яровых и озимых зерновых культур, а также и сеянцев сосны на территории Республики Татарстан. Впервые с позиций системного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных микробиологических и биохимических параметров различных природных - климатических зон на территории Республики Татарстан. Показано, что введение в агроэкосистему определенных видов и различных сочетаний удобрений, известкования и сочетания удобрений с известкованием, а также биоудобрений оказывает положительное фитотерапевтическое действие на растения и влияет на уровень супрессивности и плодородие почв. Установлены закономерности биосинтеза ксиланаз у представителей родов Тг1сУюс1егта. Впервые проведено исследование влияния рН и температуры, соответствующих параметрам желудка моногастричных сельскохозяйственных животных, а также воздействия гидротермической обработки на активность ксиланаз, синтезированных представителями рода Тпскойегта.

Основные защищаемые положения:

1. Запасы жизнеспособных пропагул ТНскойегта изменяются в зависимости от расположения в почвенном профиле, от затопляемости почв, антропогенной нагрузки.

2. Распространение, морфологические, молекулярно-генетические, кинетические характеристики и экологические стратегии штаммов рода ТНсЪойегта зависят от типа экологических ниш и почв.

3. Смена популяций штаммов Тпскойегта с различной стратегией жизни зависит от стадий сукцессии экологической ниши.

4. Микробиологическая активность, биотический потенциал фитопатогенных грибов в агроценозах изменяются в широком диапазоне в зависимости от типа почвы, биологической активности, окультуренности, внесения удобрений, мелиорантов и фитосанитарного состояния культур в севообороте.

5. Минеральные, органические удобрения и известкование почвы оказывают разнонаправленное действие на биологическую активность и супрессивность агроценозов.

6. Отдельные изоляты рода ТпсИоЛегта могут использоваться для восстановления плодородия почв в виде биокомпостов на основе осадков сточных вод крупного промышленного города, отходов пищевых предприятий и сельскохозяйственных производств, а также для получения биопестицидов, биогербицидов для защиты растений от заболеваний, с целью восстановления супрессивности и регуляции биологической активности почв.

7. Стабильность культурально — морфологических признаков Тг1скос1егта является критерием отбора антагонистов.

Практическая значимость работы. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода ТпсНос1егта, теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно" важных микроорганизмов. Например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз. Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Тпс1юс1егта в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений. Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и биоудобрений. Предложен комплекс методов для проведения микробиологического мониторинга, адекватно отражающего состояние биоты и позволяющего прогнозировать возможные эпифитотии. Предложены способы получения биокомпостов на основе осадков сточных вод, отходов пищевых и сельскохозяйственных производств с использованием штаммов Тпс1юс1егта с высокой гидролазной, фунгицидной и гербицидной ^ активностями с целью- внедрения, препаратов. в практику лесного и сельского хозяйств Республики Татарстан для восстановления плодородия и супрессивности почв. Разработана технология получения биопестицида на основе отходов пищевых предприятий, которая была внедрена в практику производства биопрепаратов на базе биозавода на территории совхоза «Казанский тепличный». Показана возможность использования гидролазного комплекса Тпскос1егта для переработки отходов спиртовой промышленности в РТ. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз Тпскос1егта, что позволило правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащие пентозаны. Результаты исследований используются для подготовки лекций' на биолого - почвенном факультете КГУ по курсам «Биология почв», «Сельскохозяйственная микробиология», «Экология микроорганизмов», «Микология», «Почвенная микробиология».

Монография «Микробная биотехнология» Изд-во Казань УНИПРЕСС 2006г. рекомендована для обучения студентов и аспирантов биолого - почвенного факультета КГУ.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзн. Конф. «Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных». - Ташкент. — 1989, Всесоюзн. Совещ.: Нуклеазы микроорганизмов и их практическое применение // Рига. — 1989, Всесоюзн. Конф.: Методы получения, анализа и применения ферментов. - Рига. - 1990. -, 5 Междунар. Симп. Молодых Ученых. - Болгария, Варна. - 1990., Научн. Конфер. // Днепропетровск. - 1991. , Всесоюз. Симпозиуме: Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия. - Оренбург. - 1991, Всесоюзной Конфер. «Экологические проблемы фармакологии и токсикологии». - Москва. - 1991, Раб. Совещ.: Регуляторы роста и развития растений. - Москва. - 1991,.5-ой Всероссийск. Конфер.: Новые направления в биотехнологии. - Пущино. - 1990, Всесоюз. Конфер.: Ферменты микроорганизмов. - Казань. - 1991, Всесоюзн. Конфер.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. - Пущино. - 1992., Научн. Конфер.: Эволюция почв и почвенного покрова в связи с изменением природной среды // Пущино. — 1992, 6-ой Всероссийской Конфер.: Новые направления биотехнологии. -Пущино. - 1994, Конф.: Фйзиология и биохимия мицелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии. - М. - 1994., Конфер.: Генетика -народному хозяйству. - Москва. - 1994, Всесоюзная конфер.: Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. - М. — 1994, Forum for applied biotechnology. - Brugge. - 1995, Advanced Biotechnologies and Agriculture. -Ferrary-Itali. - 1995, 7Ih international symposium. - Santos-Brazil. - 1995, III Международн. Конфер.: Регуляторы роста и развития растений. - М. — 1995, Intern. Co-Conf. On ICEP95-ICONE95. - St.Peterburg, Russia. - 1995, Материалы 3-й международной коференции по химии нефти. - Томск. —1997, 3-й Республ. Научн. Конфер.: Актуальные экологические проблемы районов Татарстана. - Казань. - 1997, 3-й Научно-практич. Конфер.: Достижения и перспективы развития селекции семеноводства сельскохозяйственных : ,: культур.' - 'Пенза.>—(1999, Всероссийской Научной Конфер.:- Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья. - Саранск. -1999, 9th International Congress of Mycology. - Sydney. - 1999, Yl-th International Simposium: In suti and onside biorenudiation. - San-Diego, California. — 1999, Междунар. Научн. Конфер. Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов русской равнины: - Пенза. — 1999, X-th International Soil Conservation Organisation Conferens. — 1999, Научной конфер.: Новочеркасск. - 2000, Всероссийской научно-практич. Конфер.: Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно-нарушенных территорий. -Ульяновск. — 2000, Всероссийской конференции «сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках» 14-19 июня 2001г, 1-ом Съезде микологов России «Современная микология в России» М., 2002, Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. 7-ая международная конференция Санкт- Петербург 15-18 сент 2003, «8-ой, 9-ой Пущинской

школах-конференциях молодых ученых. Биология - наука XXI века. 17-21 мая 2004, 2005,2006». - Пущино, 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»,Санкт-Петербург - Репино, 15-18 сентября 2003г.,Научно- практическая конференции «Биотехнологии - на поля Татарстана». ОАО "Казанская ярмарка", Казань-2004, Международной научной конференции авг. 25 — сент. 5, 2003, 13-ая международная конференция «Ферменты микроорганизмов: структура, функция, применение». - Казань: КГУ, 2005, Международной научно- практической конференции «Перспективы и проблемы развития битехнологии в рамках единого экологического пространства стран содружества» 25-28мая, 2005, Минск-Нарочь, Республика Белорусь, Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 17-18 июня 2004, Втором съезде Общества биотехнологов: Москва, 13-15 октября 2004, Межд. научно-практ. конф. по развитию сотрудничества между Республикой Татарстан и Германией в рамках Президентской программы "Дни Германии в Татарстане и перспективы развития экологического сельского хозяйства и природопользования в Республике Татарстан". 5-6 ноября 2004, Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» 28 - 29 ноября, 2005, XX Congreso Nacional Microbiología Cáceres, España. 19 — 22 septiembre 2005 Ponencias y Comunicaciones "Universidad de Extremadura" Sociedad Española de Microbiología, Symposium of Biology Students in Europe" Finland 2005 University of Helsinki Department of Biology July 29a to August 7th 2005, Межд. Конф «Грибы и водоросли в биогеоценозах- Москва МГУ., 31янв. - 3 февраля 2006, 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium. Vienna, Aistria, 5-8 April 2006.

Публикации. По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 90 научных работ, в том числе 1 коллективная и 2 авторские монографии, 68 научных статей, 15 учебных пособий и методических руководств. Получено 4 патента.

V Структура « объем диссертации. Диссертация изложена на стр. компьютерного текста,- состоит из "введения/ 4 глав, включающих

44

разделов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей наименований (из них \Ъ%> на иностранных языках) и приложения. Работа содержит £б таблиц, иллюстрирована ^рисунками и'ЗУ/ фотографиями.

Личный вклад автора. Основная работа по получению экспериментального материала,, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. В выделении отдельных изолятов из тепличного грунта совхоза «Майский», фитоэкспертизе семян зерновых, испытаниях в тепличных грунтах принимали участие доцент кафедры микробиологии Захарова Н.Г. и старший инженер кафедры микробиологии Мочалова Н.К. В организации полевых исследований на базе ТатНИИСХ и. ГУ «Татарский НИИ агрохимии и почвоведения РАСХН», принимали

участие д.с.х. наук Шатров P.C., д.с.х.н. Яппаров А.Х. , зав. лаб. к.с.х.н. Ломако Е.И. Молекулярно-генетические исследования проводились при активной помощи доц. кафедры биохимии Аскаровой А.Н. и сотрудника Института химической инженерии в Вене д.б.н. Дружининой И.А., хроматографические исследования по азотфиксации и респираторной активности почв проводилось с помощью вед.н.с Гарусова A.B., консультации по методам анализа видов Trichoderma и гетерогенности популяций получены на кафедре микологии и альгологии МГУ у зав.каф. д.б.н. Дьякова Ю.Т., д.б.н. Лихачева A.B., к.б.н. Александровой A.B., микрофотосъемки конидий были сделаны с помощью д.б.н. Камзолкиной О.В., консультации по методам микологического анализа антропогенных ландшафтов были получены у д.б.н. поф. Марфениной O.E., участие микроорганизмов в силосовании кормов исследовалось при участии к.б.н. Вершининой В.И., полевые испытания биоудобрений на основе компостов на основе отходов очистных сооружений г. Казани и Trichoderma для применения под сеянцы сосны проводили на базе лесопитомника Матюшинский при участии д.с.х..н. проф.Ведерникова Н.М. , д.б.н., проф. Селивановской С.Ю., пробы из зон контакта площадей питания Pinus sylvectris L. Раифского заповедника получены от нач. отдела Росприроднадзора России к.б.н. Морозкина А.И., к.б.н.Каримуллиной С.Н., почвенные образцы из древних поселений получены с помощью доц. каф. почвоведения и агрохимии КГУ Мельникова Л.В., образцы черепов из древних захоронений и описания к ним получены с помощью сотрудников ин-та истории им. Марджани АНРТ Газимзянова И.Р.,Чижевского A.A., к.б.н., конструирование праймеров и программные модели для морфологической и молекулярно - генетической идентификации Trichoderma сделаны при участии преп. каф. биохимии к.б.н. Акберовой Н.И. и аспиранта каф. генетики Тарасова Д.С.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

. .Идентификация ифилогениягрибов — второй.по численности видов группы организмов после насекомых - представляет ^неразрешенную проблему. Причиной такого положения является относительная бедность таксономических (морфофизиологических) признаков и их значительная внутривидовая изменчивость. Грибы, благодаря особенностям их жизненных циклов, и чередованию полового и бесполого способов размножения с частым превалированием последнего, представляют собой быстро эволюционирующую группу организмов. Поэтому большая их часть, по-видимому, представляет не обособленные «значимые» виды, а дивергентные видовые комплексы, идентификация которых в принципе затруднена из-за сложности вычленения таксономически достоверных признаков. Кроме того, как показали молекулярно-генетические исследования последних лет, видовое разнообразие грибов и других микроорганизмов гораздо богаче, чем было принято считать.

Доминирование грибов Trichoderma в микробоценозах связано с реализацией в экосистемах различных типов гетеротрофного и биотрофного взаимодействий с микробиотой и макробиотой (путем паразитизма и даже оппортунистического эндофитизма, и способностью разрушать органический материал и сохранение супрессивности почв). Использование видов Trichoderma в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней и вредителей - началось в 1980 - х годах. Однако в результате неточной идентификации отдельных видов исследователи на практике столкнулись с некоторыми проблемами. Так, в 1980 - х годах была впервые отмечена эпидемия шампиньонов («зеленая плесень»), вызванная видом Trichoderma, идентичным по морфологическим признакам Trichoderma harzianum, который широко использовался в защите растений. Наблюдаемое явление могло вызвать дискредитацию вида Trichoderma, как перспективного антагониста фитопатогенов для сельского хозяйства. В результате микологи вынуждены были вновь пересмотреть систему описаний рода Trichoderma. Благодаря использованию молекулярно-генетических методов был обнаружен новый вид, морфологически сходный с Trichoderma harzianum, идентифицированный как возбудитель «зеленой плесени» шампиньонов T.aggressivum. Известно, что Банк NCBI Taxonomy содержит названия всех организмов, для которых установлен и помещен в генетические базы данных хотя бы сиквенс гена одного белка.

С момента первого описания этого рода в 1794 г по 1969 г было дано морфологическое описание 8 агрегатов рода Trichoderma, за последующие 20 лет (к 1991 г) число описанных видов возросло до 27. В эру молекулярно-генетического анализа наблюдается критический пересмотр старой систематики Trichoderma, основанной на морфологических критериях. С помощью различных молекулярно-генетических методов, таких как неспецифичный ПЦР анализ с использованием праймеров к рибосомным ITS 1 и 2 сиквенсам, были идентифицированы ранее не определенные виды и были построены новые филогенетические древа. В результате количество видов Trichoderma к 2002 г возросло до 46. Мультигенный филогенетический > анализ позволилиi выявить 88видов Trichoderma к 2005 г...С..помощью компьютерной программы Barcode к началу 2006 г. определено 110 видов. Предполагается, что в ближайшие годы количество видов Trichoderma может достигнуть 130 и более. В настоящее время исследования рода Trichoderma идут параллельно по 3 направлениям: (а) биоразнообразие и распространение в различных регионах биосферы, (б) скрининг видов, перспективных для биотехнологии из новых выделенных и описанных изолятов Trichoderma, и (в) разработка методологии быстрой и правильной идентификации и построения филогенетического древа рода Trichodema /Нуросгеа.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Образцы почвы (табл. 1) отобраны в соответствии с правилами отбора проб для микробиологического анализа (Методы ..., 1991).

Выделение Тпскоёегта из образцов почвы проводили методом серийных разведений с последующим высевом на среду с пароморфогенным веществом (Бенкен, Хацкевич, 1972). Данный метод позволяет провести количественный учет выросших колоний грибов, так как пароморфогенное вещество не дает им разрастись по всей чашке.

Моноспоровые культуры грибов получали методом разведения конидиальной суспензии в различных модификациях (Васин, 1966; Кузнецов и др., 1968), а также использовали предложенный Лихачевым метод выделения моноспоровых культур на жидких питательных средах с добавлением глицерина до получения ими определенной вязкости (Лихачев, 1994).

Таблица 1

Объекты исследования_

объект район тип почвы зоны анализа глубина, см

1 Раифский заповедник Зеленодольский серая лесная Коп 0-20

к,

к2

К,

2 Больше- Кляринское городище Камско-Устьинский чернозем выщелоченн ый А! 10-35

fEA,] 122-130

ГА,1 134-144

А, 0-52

Ali 52-63

Ab 77-87

3 Мурзихинский II могильник Алексеевский чернозем выщелоченн ый раскоп 196, череп № 1

раскоп 162, череп № 2

4 лесопосадки/агр оценозы Высокогорский серая лесная подстилка/ [А,] 0-20

Лаишевский серая лесная

Сабинский серая лесная

Агрызский дерново-подзолистая

Тюлячинский чернозем

Буинский чернозем

5 теплицы Казань, Зеленодольск тепличные грунты - - •

6 нефтезагрязненн ые почвы, нефтешлам Альметьевский чернозем [А,] 0-20

Обозначения: Коп - территория, свободная от площадей питания; Кь Кг, Кз - зоны перекрытия площади питания растений, могли быть однократного, двукратного и т.д. контакта.

Морфолого-культуральные свойства изучали на минеральной среде (Samuel, 1989), картофельно-глюкозном агаре (PDA), среде Чапека-Докса с низким содержанием сахарозы, специальном питательном агаре (SNA) (по Samuels et al., 1998). Для выращивания использовали как твёрдые (агаризованные), так и жидкие среды.

Идентификация по морфологическим признакам проводилась по ключу Александровой (Александрова с соавт., 2001), Samuels (2003) и Chaverri (Chaverri et al., 2003).

Идентификация по кинетическим признакам проводилась по ключу Chaverri (2004).

Размеры объектов замеряли с помощью окуляр-микрометра, так же с помощью программы Paint.

Определение цвета колонии, что необходимо для описания изолятов проводили двумя способами. С помощью шкалы Бондарцева (1959) и с помощью модели RGB. Модель RGB описывает излучаемые цвета и основана на трех базовых цветах' - Red (Красный), Green (Зеленый), Blue (Синий). Остальные цвета образуются при смешивании этих трех основных.

Вегетативную совместимость моноспоровых клонов изучали сращиванием от двух до восьми колоний на чашках Петри на среде картофельно-глюкозный агар, с последующим визуальным наблюдением за поведением колонии и микроскопированием пограничной зоны между колониями, что позволило наблюдать за анастомозами и оценить относительную частоту их образования. Характер проявления реакций при визуальной оценке и микроскопировании сравнивали с описаниями, приведенными у Дьякова и Долговой (1995).

Антагонистическую активность и конкурентоспособность изолятов Trichoderma определяли методом встречных культур на среде Чапека, КГА (Семонян и Мамиконян, 1982).

Гетерогенность популяций выделенных изолятов оценивали по их разделению на культурально-морфологические типы (КМТ) и появлению секторов при росте на чашках Петри (Дьяков, 1998).

Определение .....ксиланазной, лротеазной и . целлюлазной

активностей изолятов Trichoderma проводилино Konig (2002).

Активность азотфиксация в почве измеряли «ацетиленовым» методом (Методы..., 1991; Гарусов А. В., 1998).

Определение активности почвенного дыхания осуществляли на газовом хроматографе (Ананьева Н. Д. и др., 1997; Гарусов А. В., 1998).

Дегидрогеназную активность почвы определяли методом Ленарда в модификации Колешко (Колешко, 1981).

Для определения уреазной активности почвы использовали метод Галстяна (Галстян, 1974).

Определение интенсивности разложения целлюлозы в почве определяли методом Звягинцева (Методы ..., 1991).

Протеолитическую активность почвы определяли методом Галстяна

и Арутюняна (Колешко, 1981).

Определение каталазной активности почвы определяли методом Звягинцева (Методы..., 1991).

Измерение углерода микробной биомассы проводили экстракционно-фумигационным методом (ISO 14240-2,1997).

Определение численности микроорганизмов в почве проводили методом прямого счета в люминесцентном микроскопе по Звягинцеву и Кожевину (Головченко и др., 1995; Кожевин, 1989; Методы ..., 1991).

Количественный учет грибов проводился методом Хансена в модификации Мирчинк (1988).

Определение фитотоксичности почвы и КЖ проводили на семенах растений (Методы ..., 1991).

Выделение ДНК, ПЦР-анализ. ДНК было выделено из свежего мицелия фенол/хлороформным методом, включающим лизис клеток, с высвобождением ядерной ДНК и очистку ДНК от белков, нуклеаз с использованием органических растворителей (Druzhinina et al, 2005). Участок ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и ген 5,8S рРНК, был амплифицирован в реакции ПЦР с использованием комбинации праймеров Ф4 (5'-ТСТ GAG ССТ ТСТ CGG CGC СТ-3') и А5 (5'-GCG CAG GAA AGG CTG CGG CG-3'), а участок, содержащий ген эндоглюконазы, - с праймерами Ф2 (5'-GGC AAG АСА TGA CAA GT-3') и A3 (5'-АСА TTG GAG AGT GCG AAG С-3').

Также для проведения ПЦР были использованы следующие праймеры: ПР1 - 5'-GAG GTG GNG GNT СТ-3' - неспецифический праймер, консенсусная последовательность белка III фага X М13; ПР2 - 5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3' - стандартный прямой праймер фага X М13; ПРЗ-5' -GGC AAG АСА TGA CAA GT-3' - неспецифическая последовательность.

Для проведения ПЦР и секвенирования по последовательностям ITS 1 и 2 были использованы праймеры forward SR6R 5'-AAG TAG AAG TCG TAA CAA GG-3' и reverse LR1 5'-GGT TGG TTT CTT TTC CT-3'.

Режимы ПЦР - амплификации: а) денатурация ДНК - 95°С; 1 мин,

б) отжиг праймеров - 54°С; 1,5 мин, в) элонгация - 72°С; 1 мин.

Результаты ПЦР оценивались в агарозном и полиакриламидном . (ПААГ) гелях i различной концентрации.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Распространение Trichodernta на территории Республики Татарстан

При исследовании распространения Trichoderma нами использовались зональный, морфологический, таксономический и экологический подходы. Изучение взаимоотношений Trichoderma с растениями рассматривалось с позиций ярусного и консортивного подходов.

Незатронутые деятельностью человека и являющиеся резервуарами сохранения видового разнообразия почвы рассматривались как эталонные по отношению к антропогенным ландшафтам. В качестве эталонов были отобраны почвы из древнего захоронения (Мурзихинский II могильник), зоны археологических раскопок на территории древних поселений (Больше-

Кляринское городище), из Раифского заповедника Волжско-Камского биосферного резервата (статус, присвоенный президиумом Международного координационного совета МАБ ЮНЕСКО 29 июня 2005 г), который из-за особенностей рельефа представляет ¿обой модель, имитирующую широтную зональность всей лесной полосы Европейской части России. В качестве альтернативного объекта былы отобраны образцы под Матюшинским лесопитомником с обедненной серой лесной почвой, почвы агроценозов под зерновыми культурами, защищенные грунты, нефтезагрязненные почвы, а также почвы вдоль автотрасс (табл. 2).

Нами было выделено свыше 700 изолятов Trichoderma из образцов почв и подстилок археологических раскопок, государственного Раифского заповедника, почв и агроценозов, антропогенных ландшафтов. Применение консортивного подхода к изучению влияния растений и животных на распространение позволило выявить виды, ассоциированные с ризосферой, филлосферой и спермисферой, а также виды, ассоциированные с почвенными животными, и обитающие в экскрементах, а также транзитные формы из кишечника дождевых червей сем. Lumbricidae.

В результате исследований была отмечена высокая частота встречаемости (КОЕ/г почвы) изолятов Trichoderma в эталонных почвах и защищенных грунтах. Антропогенные ландшафты — агроценозы и почвы вдоль автотрасс, нефтезагрязненные почвы и нефтешламы характеризовались снижением популяционного уровня более, чем в 100 раз, снижением частоты встречаемости и видового разнообразия. Из комплекса исследованных антропогенных ландшафтов исключение составляли защищенные грунты в теплицах, что связано с ежегодной интродукцией популяций Trichoderma в составе с биофунгицидов, изготавливаемых на основе штаммов - антагонистов фитопатогенов.

Видовое разнообразие Trichoderma на территории Республики Татарстан

При исследовании структуры микромицетного сообщества почв выявлено в разных климатических зонах на территории Республики ■ -Татарстан- . -, более ■ 11 видов Trichoderma, - к идентифицированных морфологическими и молекулярно-генетическими методами. Для отдельных изолятов не обнаружено гомологичных сиквенсов, которые бы позволили их отнести хотя бы к одному из известных видов.

Идентификация по морфологическим признакам выделенных изолятов показала, что наиболее распространенным и часто встречающиеся оказался вид T. koningii (161 изолят). На втором месте по распространенности стоит T.hamatum (100 изолятов), а на третьем —T.longibrachiatum (92 изолята). Далее следуют T. harzicmum (87 изолятов), T. asperellum (80 изолятов) и Т. citrinoviride (69 изолятов), Г. atroviride (22 изолята), T.viride (12 изолятов) и T. oblongisporum (10 изолятов). Последний вид встречается немного реже, но все-таки его также можно считать обычным видом. Редко встречались виды T. satumisporum (8 изолятов) и T. spirale (2 изолята (табл.3). Можно проследить некоторые закономерности распределения видов рода

ТпсИснИегта в зонах лесопосадок разных климатических областей на территории РТ (рис.1, табл. 3). Из таблицы 4 видно, что виды группы Т. копт&г чаще встречаются в прохладной климатической зоне, а в более южных областях количество пропагул (КОЕ/1г почвы) этого вида сокращаются.

Таблица 2

Места выделения и частота встречаемости (%) изолятов Тп'сЬоЛегта

объект Район тип почвы зоны анализа глуб [частота ина, встречаем рмости изолятов, |%

1 Раифский заповедник Зеленодольский серая лесная Коп 0-20 40-60

к,

к2

К3

2 Болыпе- Кляринское городище Камско-Устьинский чернозем выщелоченн ый А, 10-35 60-70

[ЕА,] 122130

[А,] 134144

А, 0-52

А1, 52-63

А12 77-87

3 Мурзихинский II могильник Алексеевский чернозем выщелоченн ый раскоп 196, череп № 1 60-70

раскоп 162, череп № 2

4 лесопосадки/агр оценозы Высокогорский серая лесная подстилка/ [А,] 0-20 20-25/0-6

Лаишевский серая лесная 22-29/4-7

Сабинский серая лесная 25-26/4-6

Агрызский дерново-подзолистая 23-28/0-2

Тюлячинский чернозем 22-27/5-7

Буинский чернозем 26-30/4-6

5 Защищенные грунты теплиц Казань, Зеленодольск тепличные грунты - - 40 - 5025/4-6

б Лесопитомник Столбищенский Серая-лесная [А1] 0-20 0

Рис.1. Карта Республики Татарстан

*- районы, в которых выделены изоляты Тпскодегта

Таблица 3

Список видов и количество изолятов грибов рода ТпсИос1егта,

Вид Количество изолятов, %

от общего числа

Trichoderma sect. Trichoderma

T.hamatum (Bon)Boner 100/13,67

T. asperellum Samuels, Lieckfelt et Nirenberg * 80/10,94 •

T. atroviride Karsten * 22/3,01

группа T. koningii Oudemans et Koning 161/22,02

группа T. viride Pers.: Fr. - 12/1,64

ч.Trichoderma sect. Pachybasium

T. harzianum Rifai 87/11,90

T. oblongisporum Bissett * 10/1,36

T. spirale Bissett * 2/0,27

Trichoderma sect. Longibrachiatum

T. citrinoviride Bissett * 69/9,44

T. longibrachiatum Rifai 92/12,58

T. saturnisporum Hammill * 8/1,09

неидентифицируемые изоляты 90/12,52

Сумма 733

Виды T.hamatum, T. asperellum, T. harzianum и T. citrinoviride имеют широкий диапазон распространения. T. longibrachiatum и T. atroviride чаще

выделялись в умеренно-теплой й теплой зонах. Находок видов T. spirale и Т. saturnisporum слишком мало для того, чтобы можно было сделать какие-либо выводы об их распространении (рис.1, таб.4).

Таблица 4

Распространение Trichoderma в почвах лесопосадок на территории

Республики Татарстан по климатическим зонам

Зона Прохладная* Умеренно Теплая** * Умеренн

Вид прохлада ая** теплая** **

число число число число

изолятов изолятов изолятов изолятов

Т. koningii Oudemans et Körting 100 20 23 18

Т. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg 20 24 14 22

T. atroviride Karsten 4 4 10 4

T. viride Pers.: Fr. 8 0 4 0

T. harzianum Rifai 23 17 27 20

T. longibrachiatum Rifai 15 22 25 30

T. citrinoviride Bissett 20 13 17 19

T. spirale Bissett 2 0 0 0

T. saturnisporum Hammiii 8 0 0 0

T. oblongisporum Bissett 0 0 10 0

T.hamatum (Bon)Boner

* Прохладная зона-Высокогорский, Лаишевский, Сабинский, Зеленодольский, \ Агрызский районы; * *.Умеренно-прохладная зона—Альметьевский, Тюлячинский " районы; ***Теплая зона-Буинский район, тепличные субстраты; ****Умеренно-теплая зона - Алексеевский район

Анализ исследуемых почв показал, что наибольшее разнообразие видов обнаружено в эталонных почвах и наименьшее - в антропогенных ландшафтах. Уменьшение видового разнообразия в антропогенных и современных ландшафтах отмечалось ранее и для других микроскопических грибов. Так, в эталонных почвах нами было выделено 11 видов и группа новых, неидентифицируемых по морфологическим признакам изолятов.

В антропогенных ландшафтах обнаружено среди типичных только 7 видов. Практически не обнаружились в агроценозах ни одной климатической зоны виды T. atroviride, T. spirale, T. citrinoviride, Т. saturnisporum, а также не представлена группа новых видов (табл. 5).

Распространение Trichoderma на территории Раифского заповедника и лесопитомника «Матюшинского»

Исследование распространения Trichoderma в зоне подстилки на современной территории Раифского заповедника позволило выделить свыше 150 изолятов. Пробы отбирались в местах отсутствия деревьев (КО), в непосредственной близости от одного дерева (К1), зонах контакта двух деревьев (К2) и под валежником КОп.

Нами обнаружено морфологическими методами 9 видов T. harzianum, T. koningii, T. satumisporum, T. viride, T. longibrachiatum, T. hamatum, Т. atroviride, T. asperellum, T. spirale и группа неидентифицируемых (табл. 6).

Наибольшее разнообразие видов обнаружено в почве под валежником и на поверхности гниющего дерева, что, вероятно, связано с тем, что типичной зоной распространения видов Trichoderma являются места произрастания древесных культур.

Таблица 5

Места выделения видов Trichoderma на территории РТ

Вид Место выделения

T. koningii тепличное хозяйство «Майский», грунт

Раифский заповедник, почва

T. viride . Раифский заповедник (подстилка, почва) Больше-Кляринское городище (почва), тепличное хозяйство «Казанский тепличный», грунт

T. atroviride Больше-Кляринское городище, почва

Раифский заповедник (подстилка, почва)

T. hamatum Раифский заповедник, почва

тепличное хозяйство «Майский», грунт

T. spirale Раифский заповедник, почва

T. longibrachiatum Раифский заповедник, почва

с поверхности семян огурца сорта «Эстафета»

Мурзихинский II могильник, почва (8-6 вв. до н.э.)

T.dtrinoviride - * - Больше-Кляринское городище, почва (8-10 вв.)

Мурзихинский II могильник, почва (8-6 вв. до н.э.)

T. oblongisporum тепличное хозяйство «Тепличный», грунт

T. satumisporum Раифский заповедник, почва

T.asperellum тепличное хозяйство «Майский»; «Казанский тепличный» грунт

серая лесная почва лесопосадок с.различными нормами тяжелых металлов, агроценозы

Раифский заповедник, подстилка, почва, Мурзихинский II могильник, почва

Неидентифицируемые виды Мурзихинский II могильник, почва (8-6 вв. до н.э.), Раифский заповедник

Анализ распространения ТпсЪснИегта в зонах произрастания растений, характеризуемых как зоны возможного аллелопатического взаимодействия растений, показало, что наибольшее количество изолятов обнаружено в зоне питания одного растения.

Отмечена отрицательная коррелятивная зависимость числа клонов от числа растений в зоне питания. Наименьшее количество изолятов обнаружено в зоне питания трех'растений.

Таблица б

Распространение видов ТпсЬойегта и изолятов, охарактеризованных

Зона КОп К1 К2 КЗ

Изоляты, Изоляты, Изоляты, Изоляты,

Вид\изолЗкы*, 60** 22** 18** 10**

количество

T. koningii 183 150 65,9

T. asperellum В(з), 63 60 V(3)

T. atroviride 5(з)

T. viride 6(3) 23(з)

T. harzianum 18(з) 3(з) 90

Т. longibrachiatum Ю(з)- 16(3)

T. spirale 0(з)

Т. saturnisporum 11(3)

T. hamatum 14(з) 32р/ф

*Изоляты, охарактеризованные по комплексу морфологических, молекулярно -„ генетических и физиологических признаков; **Общее число клонов идентифицировано "-только по морфологическим признакам

Морфологические и молекул ярно-генсгические исследования изолятов, выделенных на территории РТ

Для анализа видовой принадлежности и внутривидовой изменчивости организмов (выявления клональной изменчивости в гетерогенных популяциях), как необходимое условие, требуется подбор соответственных универсальных праймеров как необходимого условия. Исходя из двух важных свойств UP PCR (неспецифический ПЦР или НП ПЦР) паттернов, видо- и праймероспецифичности на уровне ДНК, можно заключить, что НП ПЦР технология представляет собой удобный инструмент, позволяющий проводить строгую экспресс-идентификацию видов любых организмов. Для этого можно использовать универсальные праймеры. Вместе с тем, на основе

широкого набора универсальных олигонуклеотидов, строго специфически прайм ирующих соответствующие локусы в геноме, появилась возможность детального изучения структуры генома отдельных организмов и генетической структуры популяций и видов любых организмов по локусам, ранее не подлежащих анализу. Выявляемые по ряду праймеров полиморфизмы (измененные по отдельным фрагментам ПЦР паттерны) могут быть использованы в качестве генетических маркеров клонов. Использование НП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) стала возможной благодаря использованию произвольных или универсальных олигонуклеотидов, праймирующих ДНК любых геномов. Основным свойством амплифицированной с этим праймером ДНК оказалась видоспецифичность, т.е. сходство ПЦР паттернов организмов в пределах биологического вида. Вместе с тем, выяснилось, что некоторые виды организмов характеризуются весьма гетерогенными ПЦР паттернами независимо от используемых универсальных праймеров. Кроме того, обнаружилась разница в действии самих праймеров, часть которых на особях данного вида может давать сходные или идентичные ПЦР паттерны (вариабельные «праймеры).. Первые известные попытки идентифицировать грибы методом ПЦР были предприняты с использованием праймеров, сконструированных на основе клонированных видоспецифичных ДНК последовательностей.

Для получения фингерпринтов изолятов Trichoderma, максимально отражающих видовые и внутривидовые различия, нами были взяты неспецифические, случайные, универсальные и специфические праймеры к гену, кодирующему эндоглюканазу, а также к ITS последовательностям участка гена рибосомальной ДНК. Исследование ДНК с помощью ПЦР анализа изолятов Trichoderma из древних захоронений выявило более 10 видов. На рис 2 представлены данные по идентификации отдельной группы видов, выделенных из могильников с использованием ITS праймеров (SR6R и LR1). Наибольшей частотой встречаемости характеризовались 3 вида: — Н. schweirtitzii, Т. longibrachiatum и Т. asperellum.

; :: Для?-исследования ^внутривидовой ^изменчивости нами ..был изучен феномен «консервативных» и «вариабельных» праймеров. ПЦР идентификация видов с использованием универсальных праймеров (НП ПЦР) позволяет путем сравнения ПЦР паттернов разных изолятов делать заключение об их родстве в рамках биологического вида. Однако, в связи с тем, что не все универсальные праймеры дают сходные или идентичные ПЦР паттерны в пределах биологического вида организма, возникают затруднения в таком сравнении.

Особенно это касается грибов, у которых НП ПЦР паттерны могут коррелировать с паттернами внутрипопуляционных клонов. Нами получены типичные спектры продуктов амплификации ДНК разных видов Trichoderma с использованием неспецифических праймеров. Основная зона распределения фрагментов располагается в диапазоне от 2 до 8000 п.н. и от 370 до 470 п.н.

Рис.2 Кластерная дендрограмма штаммов Trichoderma, построенная на основании сиквенсов ITS - областей с лраймерами SR6R и LR1: 1700 - Н. schwéinitzii, 1701 - Т. ■ longibrachiatum;-1701 Т. 'longibrachiatum; \7Ъ2 Н:^ schwéinitzii, 1703 т Яschweiniízii, 1704 - unclear species identification,' 1705 - Я schwéinitzii, 1706 - Я schwéinitzii, 1707 - Т. longibrachiatum, 1708 - Я schwéinitzii, 1710 - Т. asperellum, 1711 - Т. aspérellum, 1712 - Т. asperellum, 1713 - Т. asperellum, 1714 - Т. asperellum, 2127 - Т. asverellum, 2128 - Т. asperellum. (идоляты, выделенные из древних захоронений).

Нами обнаружена невысокая изменчивость между основными исследуемыми ДНК различных изолятов, относящихся к одному виду. Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК девяти изучаемых популяций, колеблется от 6 до 14. Каждая популяция имеет специфический спектр ПНР продуктов - фенотип, характеризующийся: 1) определенным количеством фрагментов; 2) их размерами и 3) степенью выраженности (мажорностью). Некоторые фрагменты являются общими для фенотипов всех или большинства исследуемых популяций, и выявляют, по-видимому,

консервативные участки генома, характеризующие принадлежность этих популяций Trichoderma к одному виду Т. harzianum. Число-таких фрагментов составило от 3 до 4 в области 370, 470 и 1650 и 2500 п.н. Неспецифические праймеры, используемые нами, це дали маркерных специфических фрагментов, которые были бы характерны только для одной популяции. В большинстве случаев одни и те же полиморфные фрагменты присутствовали в спектрах продуктов ПЦР ДНК 2 или 3 популяций. Использование 3 праймеров позволило выявить большую гетерогенность среди исследуемых популяций особенно в области от 200 до 400 п.н. Сравнительное исследование клонов изолятов с различным типом взаимоотношения с фитопатогенными почвенными микроорганизмами и растениями не позволило выявить принципиальных различий за исключением фрагментов ДНК в области 470 п.н. Изолят с наибольшей конкурентоспособностью, антагонистической и фитотоксической активностями дальше всех стоит от других изученных изолятов.

Исследование праймеров по отношению их к консервативному или вариабельному типам на примере Trichoderma asperellum показало, что праймер 2 может быть охарактеризован, как «консервативный», так как он не различает взятые в анализ популяции гриба, а праймеры 1 и 3, как «вариабельные». Отмеченная вариабельность фрагментов ПЦР паттернов при использовании «вариабельных» праймеров, вероятно, связана с разницей между клонами гетерогенной ■ популяции. Дальнейшие исследования изолятов подтвердили наблюдаемую нами разницу фингерпринтов с различной стратегией жизни. Исследуемые клоны отличались по скорости роста и конкурентоспособности. Таким образом, нами были подобраны «консервативный» праймер 2 для строго НП ПЦР видоидентификации и «вариабельные» праймеры 1, 2 - для клонйв выделенных из гетерогенной популяции. Нами использовался также «консервативный» праймер, который был сконструирован Тарасовым и Акберовой на основании ДНК последовательностей гена эндоглюканазы Trichoderma harzianum, как наиболее широко распространенного и - используемого вида ->в ^практике.; сельского . хозяйства - в • качестве. агента биозащиты. Сравнительный анализ фингерпринтов показал, что наибольшая гетерогенность ПЦР продуктов наблюдается при использовании праймеров к ITS («вариабельный») последовательности по сравненжо с праймером к гену эндглюканазы. Праймер к гену эндоклюганазы можно отнести к «консервативному» типу, так как он не позволяет выявить, клональную изменчивость. Специфичный праймер к гену эндоклюганазы был сконструирован на основании известных последовательностей, характерных для T.harzianum, так как, по мнению исследователей, это наиболее распространенный вид в почве и наиболее перспективный, как антагонист. Молекулярно-генетические исследования опровергли это мнение. Изоляты, которые мы относили на основании морфологических анализов к T.harzianum, после ПЦР анализов с использованием специфичных ITS фрагментов ядерной рибосомной ДНК (внутренних транскрибируемых

спейсеров) были отнесены к Т. asperellum. Использование сконструированных праймеров к ITS последовательности позволили нам выявить новые виды внутри Т. Лои/и^н-подобной группы, члены которой имеют сходные морфологические признаки, но различаются по данным ПЦР диагностики рис.3.

На микологическом сайте Самюэлем и Кубичеком с соавторами в середине 2006 года было опубликовано сообщение о том, что на основании молекулярно-генетического анализа с использованием праймеров к ITS локусам было доказано, что вид T.koningii является комплексом видов, сходных только по морфологическим признакам.

На рис. 3 видны полиморфизмы ПЦР продуктов изолятов, выделенных из защищенных грунтов и подстилки Раифского заповедника. Наблюдаемые различия по ITS локусу подтверждают различия на видовом уровне.

12000

5000

2000 1650

Рис. 3. ПЦР паттерны изолятов Trichoderma koningii с праймерами ITS 1 и 2. Дорожки 1-маркер, 2- .+Т+А, 3-Т.150,4 -Т.7, 5 - Т. 1,6 - Т. 183,7 - Т.65, 8 -Т.22,9 -Т.4,10 - T.Gk р/ф ,11- Х.+ТГ, «-» - контроль)

Последующий ПЦР анализ с более чем 20 изолятами других экологических ниш из группы T.koningii подтвердил их генетическую гетерогенность. Таким образом, морфологическое сходство этой группы не было подтверждено ПЦР анализом. Дальнейшие исследования, проведенные нами с использованием праймеров к ITS последовательности, позволили переидентифицировать такие виды, как T.viride и отнести его из 1руппы доминирующей в редкую, Т. asperellum — в часто встречающуюся. Наши исследования подтверждаются последними исследованиями в систематике Trichoderma. Так, Т. asperellum отнесен к группе наиболее распространенных в мире, тогда как «типичный» вид Т. viride - относят к редким видам. В отдельных случаях мы получили подтверждение морфологической идентификации генетическими методами. Так, результаты сиквенирования

ITS последовательности группы изолятов подтвердило принадлежность к виду T. longibrachiatum и T. citrinoviride. Также нами показано достоверное различие ПЦР паттернов изолятов T. spirale и T. longibrachiatum, подтверждающие принадлежность их к различным видам.

Построены дендрограммы, демонстрирующие сходства и различия ДНК паттернов изолятов, выделенных из заповедника, с использованием праймеров к ITS. Сходные фингерпринты Т. Лои/я^'-подобных видов попали в первую группу (изоляты T.koningii Т.22, Т. 65, Т. 183), а отличающиеся во вторую группу (Т.4 и Т.1). Изолят T. viride 6(з) повторно идентифицирован как T. asperellum 6 (з). По данным электрофореза были построены древа родства (рис. 4). На бинарном древе изоляты разделяются на две группы. В первую группу входит два изолята (Т. 67 и Т. 60). Вторая группа разделяется на две основные ветви: в первой - штаммы заповедника (Т.11(з) и Т.65) и выделенные из ризосферы культур (КЗриз. и Т.32 р/ф), во второй - штаммы заповедника (Т.35, Т.61, Т.62) и изоляты из тепличного хозяйства. Среди представленных штаммов КЗриз. и Т.32 р/ф входят в одну группу, что свидетельствует о том, что изоляты, выделенные из ризосфер, имеют общее или близкое происхождение. По бинарному построению мы видим, что в одну группу по степени сходства ПЦР паттернов входят штаммы T.oblongisporum 11(з), T.koningii 65 и изоляты, выделенные из ризосферы растений КЗриз и Т.32р/ф). По-видимому, данные изоляты имеют общее или близкое происхождение. Нами обнаружена невысокая изменчивость между основными исследуемыми ДНК различных изолятов при использовании праймеров к гену эндоглюканазы. Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК 9 изучаемых популяций, колеблется от 10 до 14. Некоторые фрагменты являлись общими для фенотипов всех или большинства исследуемых популяций, хи выявляли, по-видимому, консервативные участки генома, характеризующие принадлежность этих популяций Trichoderma к одному виду T. harzianum.

Таким образом, нами выделены и повторно идентифицированы изоляты из эталонных и антропогенных ландшафтов. Были сконструированы «консервативные» и . «вариабельные» праймеры, ... регистрирующие межвидовые и внутрипопуляционные ' изменения. Использование специальной программы Тарасова позволило определить вид Trichoderma asperellum, как наиболее распространенный и занимающий центральное положение среди изученных нами видов. С помощью молекулярно-генетического подхода повторно идентифицирован ряд изолятов и уточнена их видовая принадлежность. Сиквенирование ITS последовательностей рибосомной ДНК изолятов, выделенных из эталонных почв, позволило выявить не только известные виды, но и новые, имеющие необычные сиквенсы.

По данным морфологического анализа изоляты Trichoderma из тепличного грунта в зависимости от сроков эксплуатации грунта и времени после высокотемпературной обработки попадают по частоте встречаемости в доминирующую или часто встречающуюся группу.

0.20?

"изолят 67

0.1 S3

r.asperellum 60

Рис. 4. Бинарное древо родства изолятов рода Trichoderma по ITS - последовательности: 1-T.spp.62; 2- T.spp.61; 3-T.aspereUum35; 4- T.spp.Тг 32 Riz; 5-T.oblongisporum 11 з; 6-T.koningmS-, l-T.asperellumbO; 8- T.spp.Tr 5(2); 9- T.spp.К 3 Riz; 10- T.spp.67. Построено по фингенпринтам ПЦР анализа в 8% ПААГ изолятов, выделенные из Раифского заповедника РТ

ПЦР анализ изолятов из тепличного грунта подтвердил низкое видовое и высокое внутривидовое разнообразие. Вероятно, это связано с тем, что после ежегодной интродукции одного гетерогенного вида на высоком популяционном уровне происходит расщепление на клоны. Исследование изолятов из грунтов показало, что из гетерогенной популяции максимальное преимущество в -- экологической нише ^получают -наиболее конкурентоспособные клоны с высокой антагонистической активностью к фитопатогенным микромицетам и высоким уровнем фитотоксичности. Расщепление гетерогенной популяции на клоны было подтверждено ПЦР анализом с использованием праймеров к ITS последовательностям.

Природные популяции грибов, как правило, являются гетерогенными. Процесс выщепления клонов в популяции с последующим их обособлением, перегруппировкой и доминированием определенных форм способствует раскрытию адаптивных свойств вида (Чикин, Лихачев, 1997).

Популяционная гетерогенность изолятов Trichoderma, выделенных на территории РТ

Существование генетически гомогенных популяций в природных условиях проблематично. Известно, что в геноме одной клетки может быть

уже заложена способность расщепления на варианты. Известно, что на основании физиолого-биохимических критериев гетерогенность природных популяций может быть определена как возрастная, половая, морфологическая, генетическая и пространственная. Нами проводилось сравнение морфометрических параметров, кинетических и других параметров, определяющих стратегию жизни гетерогенных популяций Trichoderma.

Известно, что повышение гетерогенности является адаптивным фактором, способствующим распространению изолятов Trichoderma. Для оценки популяционных различий в пределах одного вида мы сравнивали размеры конидий изолятов из разных климатических зон и экологических ниш с помощью компьютерной программы Paint. Следуе^г отметить, что был возможен анализ зонального распространения достаточно изученных областей и доминирующих видов: 71 viride, T. koningii, T. harzianum, Т. asperellum, T. atroviride, T. citrinoviride, T. saturnisporum, T. spirale, Т. oblongisporum, T. longibrachiatum.

При сравнении выборок выяснили, что внутри популяций из разных климатических зон нет достоверных различий в размере конидий Минимальная вариабельность размеров конидий отмечена для видов T.citrinoviride и T. oblongiosporum (рис. 5). Мы провели сравнительный анализ размеров конидий видов, выделенных на территории РТ, видов, распространенных на территории России (описанных Александровой в 2000 г), и видов, распространенных на различных территориях, описанных Самюельсом (2002). Нами отмечена достоверная разница между конидиями только по ширине. Так, конидии изолятов группы T. koningii из РТ более крупные и более округлые, чем конидии, описанные Александровой (2000) и Самюэльсом (Samuels, 2002). Аналогичную картину наблюдали при анализе конидий изолятов других видов (рис./6). Известно, что в условиях почвы наибольшей выживаемостью обладают более мелкие формы, которые

1

0,5 0

представители видов

Рис.5 Морфологическая характеристика конидий видов Trichoderma, распространенных на территории РТ

обладают повышенной адаптационной способностью и летучестью, что способствует расширению ареала распространения. Вероятно, отмеченное нами снижение численности видового разнообразия видов ТгкИЫегта на территории РТ обусловлено селекцией изолятов с более крупными размерами конидий.

А Б В

Рис. 6. Сравнительный анализ размеров конидий Т. koningii (А - местные изоляты; Б - по Александровой, 2003; В - по Samuels, 2004)

Сравнительный анализ размеров конидий изолятов, выделенных из эталонных почв, антропогенных ландшафтов и современных горизонтов почв показал, что размеры конидий изолятов, полученных из современных почвенных горизонтов, уменьшаются. Таким образом, нами выявлена общая тенденция уменьшения размеров конидий изолятов, выделенных из современных горизонтов по сравнению с конидиями изолятов из погребенных почв. Установлено, что размеры конидий сапротрофных изолятов также . меньше по сравнению с размерами конидий ризосферокомпетентных изолятов. По-видимому, снижение размеров ; конидий <\ является адаптационным ^ механизмом. : Вероятно, повышение интенсивности прямого и косвенного антропогенного воздействия в современных горизонтах почв привело к селекции и выживаемости популяций Trichoderma с более мелкими конидиями. Аналогичная тенденция отмечена при исследовании степени удаления от зоны ризосферы. Удаление микромицета от растения-эдификатора (из зоны ризосферы) сопровождалось селекцией и преобладанием в микробиоценозе популяций с более мелкими и шиповатыми конидиями. Исследование морфометрических показателей видов с шиповатыми конидиями показало, что по мере созревания конидии проходят стадии от форм с гладкой поверхностью к формам с шиповатой поверхностью. Вероятно, повышение доли видов Trichoderma с гладкими конидиями в микромицетном сообществе связано с ранней стадией сукцессии экологической ниши, и может являться диагностическим признаком возраста почвенных горизонтов или использоваться для оценки

интенсивности антропогенного воздействия на популяции в природных условиях.

Вегетативная совместимость клонов в популяциях ТпскоЛегта и культурально-морфологические типы

Важным биотехнологическим свойством при промышленном использовании ТпсИойегта является стабильность признаков, характерная только для моноспоровых изолятов. Известно, что популяции грибов представляют собой мозаику клонов, одним из изолирующих механизмов которых являются различные культурально-морфологические типы колоний, реакции вегетативной совместимости и гетерокариоз. Мицелиальные грибы формируют анастомозы, что играет важную роль в адаптации хрибов. Установлено, что парасексуальная рекомбинация между тесно связанными видами и предположительно несовместимыми штаммами некоторых видов более выражена под влиянием стрессов среды. На самом деле, несовместимость штаммов между собой и даже между видами может быть преодолена мутацией единственного гена. Возможность горизонтального переноса генов (обмен неполовым путем между различными видами или несовместимыми родами) стала причиной появления новых генов в различных грибах. Мутации и стресс могли изменить половой процесс и межвидовую совместимость. Гетерокариоз играет большую роль в жизни грибов. Анастомозы между гифами с последующей миграцией ядер приводят к исчезновению внутрипопуляционных единиц — индивидуумов, клонов и интеграции их в единую сеть мицелия, что также резко усиливает адаптационные возможности. Нами были исследованы природные гетерогенные популяции ТпсИое^егта и их расщепление на клоны (табл. 7).

Сравнительный анализ колоний гетероспоровых популяций местных изолятов позволил выделить 2 стабильных культурально-морфологических типа из раннее описанных четырех. Гетероспоровые популяции в большей степени (54%) были представлены вторым культурально-морфолошческим типом, из них 20% приходилось на изоляты Т. кот^И, на изоляты Т. а&о\тс1е, по 6,6% пришлось на изоляты Т. 1оп%1ЬгаЫаШт, Т. \>тйе, Т.ахрегеИит, по 3,3% у изолятов Т, кагт.1апит ^Т.-яМитБрогит, и 43,3% у • неидентифицированных изолятов.

К четвертому типу принадлежат 46% из исследованных изолятов: 19,2% изолятов Т.котп&и 3,8% пришлось на изоляты Т.а&(МгШе, T.oЫongisporum, по 11,5% приходиться на изоляты Т.катапит, ТМгШе, 7% принадлежит изолятам Т.ахрегеИит, оставшиеся 38,5% пришлось на неидентифицированные штаммы. Наблюдаемая нами модель природных расщеплений гетерогенных популяций в лабораторных условиях на агаризованных средах была подтверждена регистрацией клонального расщепления в тепличных фунтах. Это природная модель ускоренного эволюционного развития аллохтонных гетерогенных популяций в оптимальных условиях молодой экологической ниши.

Таблица 7

Расщепление гетероспоровых популяций Тгккос1егта на моноспоровые

клоны _

Изоляты Изоляты клонов 1-го порядка Изоляты клонов 2-го порядка

Т.а$реге11шп (18) Т.ахрегеПит (18 м), Т.азрегеНит (18гн), Т.сирегеИит (18юн) Т.азрегеНит (1850) Т.азрегеПит (182м) нет дальнейшего расщепления

ТМпйе (23з) Т.уШе 23з(1), ТМгШ 23з(2), ТМгЫе (23з(4))

ТМНйе 23з(3) ТМгШ 23з(3)ь Т.уШе 23з(3)2, ТММе 23з(3)з, ТМтШ 23з(3)4

Т.котщп (183) Т.копт&1 183(1), Т.котп£н 183(4), Т.копЫ&1183(6) нет дальнейшего расщепления

Т.коптф 183(2) Т.копт^И 183(2)1 Т.котпёН 183(2)2, Т.котп&г 183(2)3

Т.котпф 183(3) Т.кот^Н 183(3)ь Т.кот^И 183(3)2

Т.копЫ&1183(5) Т.котпёП 183(5)ь Т.котщИ 183(5)2, Т.коптф 183(5)з

Тлрр 192 Тлрр 192(1) Тлрр 192(1)!, Т.зрр 192(1)2, Тлрр 192(1)з

Тлрр 192(2) Тлрр 192(2),, Тлрр 192(2)2, Тлрр 192(2)з

Т.а1гоУ1гШе (204) Т.мго\чгШ -204(1), Т.ШгоуШе 204(2) нет дальнейшего расщепления

Т.аСгоуШе 204(0) Т.а&0У1гМе 204(0)1

Тлрр 301 Тлрр 301(2) нет дальнейшего расщепления

Тлрр 306 Тлрр 306(1)

Т.ьррЗЮ Тлрр 310(2)

Тлрр 312 Тлрр 312(1), Тлрр 312(2)

Тлрр 316 Т.арр 316(1)

Тлрр Тлрр 317(2), Тлрр.ЗЩЗ)

Вегетативная совместимость автохтонных изолятов ТгкЬоёегта

При исследовании взаимодействия между гетероспоровыми популяциями и моноспоровыми клонами нами были обнаружены различные реакции вегетативной совместимости: образование мицелиалыгого валика из

гиф воздушного мицелия, взаимное проникновение мицелия (нейтральная или индифферентная реакция), а также реакции несовместимости барраж, бордюр и ограничение роста. Вегетативная совместимость типа валик выявлена у 14,3% исследованных изолятов: 3,6% у T.koningii, по 1,8% у изолятов T.atroviride, T.harzianum, T. saturnisporum, T.asperellum,. У 9% отмечена индифферентная реакция: 3,6% у изолятов T.koningii, по 1,8% у T.atroviride. Вегетативная совместимость типа мелдинг выявлена у 3,6% исследованных изолятов: по 1,8 % у неидентифицированных изолятов. Вегетативная несовместимость типа бордюр выявлена у 8,9% изолятов: по 1,8% у T.longibrahiatum, 3,6% у изолятов T.viride-, барраж - у 7,1% исследуемых изолятов: 5,3% у T.koningii, 9% у неидентифицированных изолятов. У оставшихся 50% исследованных изолятов выявлен смешанный тип реакций. При расщеплении гетероспоровых популяций на моноспоровые клоны преобладает тип вегетативной несовместимости бордюр — 48% барраж у 4% клонов. Среди типов вегетативной совместимости преобладает валик -24%, мелдинг-реакция обнаружена у 16% клонов, индифферентная реакция выявлена у 8% исследуемых клонов. Сравнительный анализ общих частот проявления типов реакций совместимости выявил тенденцию к увеличению у гетероспоровых популяций реакций смешанного типа (50%), на втором месте - реакции совместимости (26,9%) и реже всего отмечены реакции несовместимости.

Гетерокариоз изолятов Trichoderma, выделенных из почв РТ В связи с многоядерностью клеток и отсутствием препятствий на пути миграции ядер у грибов широкое развитие получило явление гетерокариоза. Нами отмечалась генетическая неоднородность ядер, внешним проявлением которого являлось скачкообразное возникновение сальтантов (неустойчивых или лабильных штаммов и гетеротипов). На поверхности колоний нами отмечалось образование секторов, отличающихся характером роста или окраской, внезапно проявляющихся в моноспоровых культурах на некотором расстоянии от центра колонии. Так, отмечалось образование светлоокрашенных секторов, которые называют аберрантными пятнами мицелия. - Интенсивность спороношения

Исследования интенсивности спороношения выявили как видовую дифференциацию, так и клональную изменчивость (рис. 7). Наибольшая интенсивность спороношения характерна для T. harzianum и T. spirale (110140*105 конидий/мл), во вторую группу были отнесены T.asperellum и T.atroviride (90-110*105 и 80-90*105 конидий/мл, соответственно), а в третью T.viride и T.koningii - 60-80 конидий/мл.

Взаимоотношения с фитопатогениыми микроорганизмами Известно более 100 разнообразных антибиотических веществ, активно продуцируемых грибами Trichoderma. Показана способность Trichoderma к регуляции жизнедеятельности почвенных микроорганизмов и эффективному ингибированию развития многих почвенных фитопатогенов даже при отсутствии непосредственного прямого контакта мицелиев. Эти свойства широко используются для отбора наиболее перспективных штаммов

биологического контроля in vitro при разработке биологических методов борьбы с различными возбудителями сельскохозяйственных культур, как в полевых, так и в условиях теплицы.

160 140

120

ВО ео 40 20

о-

Т, kírei T.iíidi

T.tjral

Í Í

Т. obtongeponjm Т. SHtumlei

£ Т. asFm-elum

Т. atrovfrHe

LT. bngit^chlatum

kids

виды Tnchodeme

Рис. 7 Интенсивность спороношения видов Trichoderma на КГА при 28°С.

Нами рассматривалась внутривидовая и видовая дифференциация по признаку взаимоотношения с отдельными группами почвенных микроорганизмов в опытах in vitro и in vivo. Показана способность к регуляции жизнедеятельности более 40 видов микромицетов-фитопатогенов и сапротрофов. Отмечен видовой и внутривидовой полиморфизм по признаку фунгистатичности. Для 34,1% исследуемых изолятов характерен В-тип антагонистической активности (обоюдное подавлении при контакте): по 9 % для изолятов T.koningii, T.asperellum; по 2,3% для T.viride, T.harzianum, 4,5% - для T.atroviride; С-тип антагонистической активности (обоюдное подавление на расстоянии) характерен для 11,4% исследованных штаммов: по 4,6% для изолятов T.koningii и T.harzianum. Вртип реакции (обоюдное подавление при контакте и дальнейшим переходом к паразитизму) выявлен у 9% изолятов: T.viride - 2,3%, T.harzianum - 4,6% и у T.atroviride - 2,3%.

Наиболее интенсивное проявление фунгистатичности в опытах in vivo отмечено в тепличных грунтах, где отмечено наиболее оптимальное сочетание "комплекса■• эдафических -факторов "для 'большинства "изолятов Trichoderma. По мере увеличения сроков эксплуатации грунтов увеличивается гетерогенность автохтонной популяции, и, как следствие усиления конкурентных взаимоотношений, возрастает доля изолятов с высокой фунгистатической активностью.

Стратегии жизни изолятов Trichoderma в экосистемах

Стратегия жизни определяется как способ выживания и поддержания стабильности популяции в сообществах и экосистемах. Всего выделено 3 типа стратегий, которые эволюционно закрепились в результате действия, соответственно, отбора эксплуатации (в условиях ненасыщенности среды микроорганизмами), насыщения (в климаксном сообществе при максимальной конкуренции) и в неблагоприятных условиях. Нами исследовались все типы сред.

Для решения вопроса о стратегиях, все члены изученной нами коллекции были расположены в пространстве КгЬ- континуума, где каждый изолят занял свое место. Изоляты в тепличных грунтах после термической обработке и в ризосфере растений , чаще реализуют г-отбор. В группе г-стратегов отмечена тенденция к специализации в условиях окружающей среды. Грибы используют в качестве основного механизма тропизм— векторизированный пронизывающий рост гиф. В твердофазных гетерогенных средах, подобных почве, тропизм имеет преимущество перед таксисом. Высокая колонизирующая способность грибов обусловлена гигантскими размерами периферической зоны и возможностью транслокации субстратов вдоль гиф. Количественной мерой успеха при первом приближении служит линейная скорость роста гиф. В ходе сукцессии по вегетации растений отмечен переход в популяционной структуре к преобладанию К-стратегов. Для ТпсЪаЛегта характерно расположение на гК-оси экологических стратегий КгЬ- континуума, благодаря высокой скорости роста. Все выделенные нами изоляты по скорости роста в условиях КгЬ делятся на 3 группы: с низкой и высокой удельной скоростью и промежуточная группа. Для • ТпсИоЛегта чаще отмечались высокие значения максимальной скорости роста, поиск субстрата с низкой эффективностью, но на больших расстояниях. Активная миграционная способность оправдана только при г-типе стратегии, когда энергоемкий процесс механического движения повышает вероятность попадания в благоприятную микрозону, и приводит к взрывному росту популяции. В прикорневой зоне растений прижизненные выделения подчинены суточным ритмам, а положение локусов экссудации меняется из-за роста корня. Ризосфера, в связи с этим, служит характерным примером оазиса жизни для микробов с г-стратегией жизни, где условия нелимитированного роста и пионерские стадии микросукцессии создаются ежедневно, но не в одной точке пространства, а в разных микрозонах. Среди выделенных нами изолятов современных и антропогенных ландшафтов преобладали виды с г-типом стратегии, а в погребенных почвах и могильниках с гК — типом стратегии. В зоогенных местообитаниях--- миграции; способствуют -»насекомые - и 4 - нами ... отмечены транзитные изоляты ТНскоскгта. В других местообитаниях рост г-стратегов возобновляется со значительно меньшей частотой, чем в ризофере. На свежем опаде отмечена вспышка роста изолятов с г-стратегией. Способность к использованию микроорганизмами труднодоступных и полимерных соединений рассматривается как проявление Ь-отбора., Выработка способности усваивать труднодоступные соединения есть один из способов избежать прямой конкурентной борьбы за предпочтительные субстраты, но дефицитные, следовательно это не К-стратегия. Приобретение данной способности энергетически затратно, поскольку утяжеляет метаболическую машину новыми блоками (также как в случае приспособления к неблагоприятным условиям — влажности, солености температуры и др.) и замедляет рост популяции. Следовательно, это не г-стратегия. Признаки использования полимеров и синтеза гидролаз (высокая активность у бацилл и

грибов-гидролитиков) можно рассматривать как проявление биоценотической патиентности - переход на «менее ценный корм» из-за конкурентного давления. Отсюда становится понятным экологический смысл тесной корреляции признаков спорообразования, деполимеразной активности и антибитикообразования у обширной группы микроорганизмов, в том числе медленнорастущих грибов. Все они слабые конкуренты в прямой борьбе за дефицитные доступные субстраты, поэтому они приспособились сохранять свою жизнеспособность путем перехода в споры, атаки полимеров растительного опада и «отпугивания» конкурентов токсическими метаболитами. Перечисленные микроорганизмы тяготеют к Ь—полюсу ЬК— и Ьг-континуумов, на противоположном К-полюсе находятся простекобактрии, а на г-полюсе — грибы-сахаролитики, ризобии, псевдомонады и энтеробактерии. Нами было показано наличие изолятов, занимающих промежуточное положение, т.е. ЬКг-континиум.

Концепция стратегий жизни привлечена для объяснения происхождения различий в индивидуальных кинетических характеристиках изученных нами изолятов ТпсУюс1егта.

Нами обнаружены ризосферкомпетентные виды Тг1ско<1егта, жизнедеятельность которых приурочена к ризосфере. Они по комплексу характерных признаков отнесены в группу г-стратегов, для которых отмечена тенденция к специализации в условиях окружающей среды. Аналогичная группа выявлена нами в тепличных грунтах после пропаривания, где создаются максимально благоприятные условия для реализации г- стратегии жизни. Наблюдаемая нами в ризосфере и грунтах после пропарки активная миграционная способность грибов оправдана только при г-типе стратегии.

Анализ соотношения ТпсЬсиНегта по стратегии жизни показал, что 1,4% изолятов занимает среднее положение между г-, Ь- и К-стратегами. К этой группе стратегов были отнесены изоляты Т. citrinoviride, 51,39% -тяготеет к г-стратегам (все виды встречаются), 8,33% - переходные формы между г- и К- (Т.С11гтоут4е,Т.азреге11ит, ТЛоп&ЬгасЫаШт, Т.Натапит), ,20,83% ^тяготеет,, к- т К-стратегам«. у (Т.ЫгптзтгШе, ..Т.сирегеПгап, Т. 1оп%}ЪгасЫаЫт, Т. копт&г), 11,11% - тяготеет к Ъ-стратегам (Т.азрегеИит и группа Т.коп^и), 6,94% - переходные формы между г- и Ь- (Т-аярегеИит, Т.коп^И, Т.кагт.1агшгп) (рис. 8).

Обобщение доступных сведений о кинетике роста на средах с различным содержанием доступных субстратов, антагонистической активности, интенсивности спороношения, гидролазной активности и других изученных свойств позволило расположить их в поле треугольника гКЬ по координационному принципу. Выполненная координация носит чисто иллюстративный не количественный характер и может быть использована в целях прогноза эволюции популяций Тпскойегта (рис. 8).

Представляет интерес конструирование подобных схем для конкретных экосистем и проверка их адекватности по критерию согласия с наблюдаемой в природных средах динамикой.

г

Рис. 8. Стратегии жизни комплекса видов рода Тпскос/егта, распространенных на современной поверхности территории РТ и глубинных горизонтах могильников и древних поселений (обозначения: треугольник - измяты, выделенные из Ранфского заповедника; круг - из современных агроценозов; прямоугольник - из древних захоронений)

Ферментативная активность автохтонных изолятов грибов Тпскоёегта

Антагонистическая активность Тпс1юс1егта, перспективных для сельского хозяйства как биофунгициды, определяется активностью гидролаз, в частности, целлюлаз и протеаз. Известно, что грибы рода Тпс}юс1егта .^являются, -ч продуцентами ксиланаз, используемых - для ^повышения перевариваемости кормов для животных.

Нами исследовался гидролазный комплекс (ксиланазная, протеазная и целлюлазная активности) ТпсЪойегта при культивировании на растительных отходах.

Наибольший показатель протеазной активности характерен для изолятов, выделенных из погребенных почв и могильников. Так максимальная активность протеазной активности отмечена у изолята Т. 323, который равен 229,7508 Ш1-1, наименьший показатель протеазной активности у изолята Т. 306 и равен 6,8001 Ш1-1.

Наибольшей целлюлазной активностью обладают изоляты Т.328,' Т.кагггапит (18), Т.2, их показатели, соответственно, равны 1,1986 Шт1-1, 1.37 Шш1-1,1.31 ШтЫ.

Ксиланазная активность превышала активность промышленного продуцента ксиланаз и составила для изолятов Т.302, Т.ЗОЗ и Т.328 8,8172 Шт1-1,8,2469 Шт1-1 и 5,0275 Шт1-1, соответственно.

Кинетика изолятов ТпсНоёегта

Нами проводились исследования кинетических показателей при переходе с лабораторных на природные среды и в полевых условиях. В лабораторных микроэкосистемах строго контролируются экотопические условия (влажность, темепература, освещенность) и возможна точная регистрация параметров жизнедеятельности при сохранении близкого к естественному составу сообщества богатства межорганизменных взаимоотношений. Полевые исследования проводились в защищенных грунтах (закрытый тип экосистем) и открытых экосистемах - агроценозы по выращиванию зерновых и сеянцев сосны.

Отмечена зависимость амплитуды и емкости среды от исследуемого типа экосистем. Наибольший популяционный уровень сохраняется длительное время при интродукции в тепличный грунт и достигает 50*103 КОЕ/1г почвы и характеризуется более интенсивными колебаниями и короткими амплитудами (25-30 дней).

Физиологическое состояние почвенных микроорганизмов до субстратного обогащения отвечает умеренно низкой метаболической активности. В парующей почве (хранящейся во влажном состоянии в лаборатории) микроорганизмы не голодают и используют в качестве субстрата почвенные органические вещества. Важнейшими факторами элиминирования микроорганизмов в благоприятных зонах почвы является выедание их беспозвоночными - простейшими, микроартроподами и, в меньшей степени, многоклеточными животными. Другие факторы элиминирования, такие как лизис бактериофагами и бделловибрионами, действие хищных бактерий и антибиотиков, играют подчиненную роль.

Была рассматрена система - интродуциованный изолят ТпсЬойегта — красные калифорнийские черви. Отмечена регулирующая роль червей в регуляции количественного уровня интродуцируемых изолятов ТпсИос1егта -. и их распространении.

Сильные стороны кинетического метода заключается в обеспечении возможности дифференцированного учета количества конкретного микроорганизма, реально действующего в природной среде, что совершенно необходимо для изучения потоков веществ и энергии в экосистемах.

Отмечена достоверная зависимость типа динамики от жизненной формы, адсорбента, внешних экотопических и комплекса антропогенных факторов. В тепличных грунтах наибольшие максимальные значения интродуцента (КОЕ/1г почвы) отмечены при использовании в качестве адсорбента растительных отходов, 60% и 80% влажности в сочетании с фундазолом и комплексом минеральных удобрений. В микроэкосистемах с выщелоченным черноземом, приближающимся по содержанию органических веществ к защищенным грунтам, интродуцируемый изолят стабилизируется на значительно более низком популяционном уровне и значения,

сопоставимые с первым типом экологических ниш, отмечены только в случае интродукции изолята на минеральном сорбенте (цеолит). В полевых опытах на истощенной серой лесной почве в условиях экологической катастрофы была использована интродукция изолята в составе биоудобрения (компост на основе отходов очистных сооружений и изолят с высокой антагонистической активностью к комплексу фитопатогенов и фитотоксической активностью к семенам сорняков) (рис.9). Была отмечена стабилизация интродуцента на высоком популяционном уровне, что указывает на реализацию г-отбора. Максимальное увеличение отмечено в составе компоста при использовании в качестве адсорбента растительных отходов.

Влияние биоудобрений на основе компостов с изолятами ТпсНойегта, адсорбированными на различных носителях

В качестве основы коспостов использовали куриный помет — отход животноводческих ферм.

Многочисленные микроскопические исследования почв и поверхности растений, обнаружили факты частого обнаружения у культур грибов бактериальных спутников, что указывает на распространенность в природе ассоциированного развития этих организмов и несомненную важность данного экологического феномена. Крайне важными представляются взаимоотношения грибов с диазотрофными бактериями. Фиксация молекулярного азота крайне энергоемкий процесс и его активность в почве лимитирована недостатком мономерных субстратов.

У большинства растений улучшение азотного питания достигается секрецией значительной части продуктов фотосинтеза в фитоплану, что позволяет поддерживать жизнедеятельность ассоциативных азотфиксаторов (Умаров, 1983).

Грибы экскретируют большое количество высокоактивных гидролаз растительных полимеров, которые создают пул легкодоступных соединений для азотфиксирующих бактерий в гифосфере и почве.

0,14-

0,12 * Т.сйг|поу|гИв

0.1

ч 0,06

£ г * 0,06 X Т.<№

0,04 0,02 £ Т.Ьатг1апит _ .1 £ Т.копЬд«£ Т.зрмй! Т.ктдЬгасМаПшт 4 Т.оЫопа«1 £ контроль ¿Г*"

представители видов

Рис. 9. Влияние интродукции видов ТпскоЫегта на азотфиксацию

Это может быть одним из объяснений экологической целесообразности образования грибами при гидролизе целлюлозы значительных количеств не метаболизируемых ими самими мономеров и олигосахаров.

Показано, что одним из факторов повышения азотфиксации при известковании дерново-подзолистых почв, является не только оптимизация условий и увеличение биомассы бактерий, но и рост встречаемости бактериальных спутников с высокой нитрогеназной активностью в гифосфере микроскопических грибов, развивающихся на растительных остатках и в почве.

При исследовании интродукции видов ТпсЪойегта в выщелоченный чернозем было показано, что наибольшее достоверное влияние на азотфиксирующую активность почвы оказывают изоляты видов Т.а&о\т<1е и Т.сИгтсптйе (рис: 9 а).

Влияние экологической ниши и вида адсорбента на жизнеспособность Тпскойегта

В качестве адсорбентов для получения биопестицида исследовали: растительные отходы (опилки), органическое соединение (прокомпостированный отход птицеводческих фабрик), минеральное вещество (цеолит) и классический сорбент, используемый в Татарстане для получения биопестицида триходермина - шелуха семян ячменя (отход трихограмного производства).

Биопестицид для интродукции в чернозём использовался в виде спор адсорбированных на носителях. Количество в почве (КОЕ/1 г почвы). ТМаггхапит было максимальным при интродукции биопестицида на навозе и опилках. Меньшее значение обнаружено при использовании шелухи и цеолита в качестве носителя:

Интродукция биопестицида на различных носителях в чернозём сопровождалась флуктуациями численности микромицета с максимальными значениями для опилок и навоза на 5 и 7 сутки, что составило 260* 105 и 160* 105 КОЕ/1 г почвы, соответственно, и минимальными значениями 1,0*10 и 0,1б*103 КОЕ/ г почвы на 30 и 60 сутки, соответственно (рис.9).

-^^»сЛо^етйг. гна^-цеолите-- шелухе . причинродукции . в . чернозём количественно флуктуирует на более низком уровне в течение 60 дней. Так, ёмкость среды для Тг1с)ю(1егта, адсорбированной на цеолите, составила 2,6*Ю5КОЕ/1г почвы, а для шелухи 4,8*10 КОЕ/1г почвы, с минимальными значениями < 103 КОЕ/1 г почвы на 7 и 60 сутки.

При известковании чернозёма отмечена положительная корреляция возрастающих концентраций извести с количеством интродуцентов на шелухе и цеолите.

Взаимоотношения ТпсИое!егта с растениями

Биотический аспект изучения ТпсИос1егта предполагает обязательное изучение её взаимоотношения с эдификаторами, которыми являются фототрофные организмы.

70000

torn

50000 40000

j 30000 >

20000 10000 0

•кию

o*30

M

и О

to

Ц;

[uMd

Н'ЗО

вН)+30т;

Ф)

mi)

BVöj

в*н+30Г

Щ

Hi s)

чй

350000 300000 250000 200000 ¡5 150000

О '

100000

50000

о

-50000

Рис. 9 а (вверху, слева) - амплитуды колебаний показателей жизнедеятельности (КОЕЛг почвы) интродуцируемых в различных препаративных формах изолятов Тпско&гта в защищенные грунты при воздействии влажности, пестицидов и минеральных удобрений; (вверху, справа) - амплитуды колебаний показателей жизнедеятельности (КОЕЛг почвы) интродуцируемых в различных препаративных формах изолятов ТпсЫегта в микроэкосистемах с выщелоченным черноземом (буквами обозначены адсорбенты для Гг/сАоЛгшя: к - почва, контроль; н - навоз; ц - цеолит; ш - шелуха; о - опилки; цифрами обозначены варианты с возрастающими дозами СаС03: 2 - 2т/га, 3 - Зт/га и т.д.); (внизу, слева) - амплитуды колебаний показателей жизнедеятельности (КОЕ/1г почвы) интродуцируемых в различных препаративных формах изолятов Тпс/ихкгта в микроэкосистемах с истощенной серой лесной почвой на фоне компоста на основе отходов очистных сооружений г. Казани (буквами обозначены адсорбенты; ЗОт/га -количество компоста; (к) - варианты контроля; (о) - осень; (в) - весна)

Среди микромицетов нами выявлены виды биотрофы (паратрофы и симбиотрофы-эндофиты), ризосферокомпетентные, эккрисотрофные и сапротрофные формы. Показана способность к переходу от одного типа взаимоотношения к другому.

Главным регулирующим фактором типа взаимоотношений является спектр метаболитов, выделяемых растением, вид растения, стадия онтогенеза, физико-химические свойства почв. Отмечена зависимость типа воздействия от концентрации метаболитов Trichoderma. Эффект разведения вызывал разнонаправленный эффект на растения от стимуляции до ингибирования роста и развития. Нами отмечена индукция резистентности у растений (SAR) к фитопатогенным микроорганизмам после обработки семян метаболитами Trichoderma. Прикорневая зона растений характеризуется специфическими прижизненными выделениями с внутрисуточными ритмами, а положение локусов экссудации меняется из-за роста корня. Ризосфера, в связи с этим, служит характерным примером оазиса жизни для микробов с г-стратегией жизни, где условия нелимитированного роста и пионерские стадии микросукцессии создаются ежедневно, но не в одной точке пространства, а в разных микрозонах.

Выделение метаболитов-стимуляторов роста растений ризосферо-компетентными интродуцентами наблюдается на ранних этапах развития растений, при нейтральных pH почвы, на фоне определенных типов углеводов (например, для T.asperellum - сахарозы и маннита). Нами было показано, что более 30% изолятов из современных горизонтов можно отнести к фитотоксическим, а из древних захоронений — более 70%. Тип влияния изолятов Trichoderma на растения изучен на 10 видах растений: зерновых, зернобобовых, овощных, хвойных, декоративных культурах, а также на семенах сорняков (щерица, подмаренник, бадяг). Длительное отсутствие контакта с растениями в глубинных слоях почвы привело к селекции изолятов с K-стратегией жизни, мощным гидролазным комплексом и отрицательным типом взаимодействия с современными сортами растений.

Известно, что современные сорта по уровню сахаристости • - представляют •• наиболее ■-•> излюбленный > t объект: для фитоиатогенных микроорганизмов. Единственный растения, на которые выделенные нами изоляты Trichoderma оказывали чаще всего стимулирующее воздействие, это бобовые и зернобобовькг культуры. Стимуляция бобовых и зернобобовых культур связана с ассоциацией изолятов Trichoderma с диазотрофами. Были выделены и испытаны бактерии рода Azotobacter spp. и Azospirillum spp. -симбиотрофы Trichoderma.

Нами исследовались причины преобладания фитотоксических форм у наиболее распространенных . видов почвенных микромицетов рода Trichoderma, ответственных за супрессивность почв. Известно, что среди современных сортов зерновых и овощных культур нет здоровых. Отмечена высокая степень заспоренности семян и почв агроценозов фитопатогенными микроорганизмами. Обработка семян конидиями и физиологически активными метаболитами Trichoderma приводит к активации

антагонистических и токсинобразующих свойств фитопатогенных микроорганизмов, заселяющих внутренние ткани семян. Усиление токсинообразования фитопатогенным микроорганизмом Fusarium spp. при обработке семян микроорганизмами-антагонистами отмечал также Монастырский (2004).

Таким образом, фитотоксическое действие изолятов из древних захороненных почв, вероятно, связано с активацией токсинообразования у эндогенных фитопатогенных микроорганизмов семян и сортовыми особенностями современных зерновых культур и конкуренцией с растением за питательные вещества в почве.

Использование Trichoderma в сельском хозяйстве

Исследование фитосанитарного состояния почв РТ показало наличие высокого, порогового уровня семенных инфекций. Основной причиной увеличения инфекционного фона в современных агроценозах являются инфицированные семяна зерновых. Дополнительными причинами инфицирования почв и резервуарами возбудителей инфекций является пораженность семян сорняков (щерицы, подмаренника, бадяга) возбудителями корневых гнилей и плесневения. Показано влияние интродукции Trichoderma на различных сорбентах на уровень инфекционного фона почв и семян зерновых, зернобобовых, овощных культур, семян сорняков и сосны. Наибольший эффект снижения зараженности почв и восстановление супрессивности отмечено на серых лесных почвах и выщелоченном черноземе. Рассмотрена система применения изолятов Trichoderma с использованием биогеоценотического подхода, предполагающего применение природных механизмов восстановления супрессивности почв и регуляции жизнедеятельности растений за счет сукцессионных изменений в растительных сообществах (модель севооборота).

Использование изолятов Trichoderma для получения биофунгицидов, биогербицидов, биоудобрения, ферментных препаратов для животноводства

Биоудобрения на основе компостов и Trichoderma

Исследованы способы приготовления" биокомпостов на основе компостированных отходов очистных сооружений г.Казани (ОСВ), животноводческих комплексов (высушенный куриный помет) и изолятов Trichoderma, адсорбированных на растительных, органических и минеральных носителях. Предварительно было исследовано действие комплекса тяжелых металлов, содержащихся в отходах' очистных сооружений на кинетические, морфологические, генетические параметры и антагонистическую активность микромицета. Загрязнения окружающей среды, включая широкое употребление различных химических и биологических препаратов, может приводить к появлению или отбору генетических вариантов грибов с необычными для них свойствами, что дополнительно затрудняет их идентификацию.

ДНК штаммов Trichoderma, инкубировавшихся в полевом опыте с ОСВ в течении 6 и 12 месяцев, в микроэкосистемах с различным содержанием ТМ (5, 10 и 20 норм), а так же при культивировании на агаризованных средах с 1 и 10 нормами ТМ, анализировалась методом УП ПЦР с неспецифическими праймерами. Был получен специфический ПЦР-профиль для контрольного и экспериментальных изолятов.

В полевых и модельных опытах было показано достоверное влияние ТМ на морфологические, кинетические признаки, конкурентоспособность и антагонистическую активность Trichoderma при интродукции в виде водной суспензии без сорбента. В опытах in vitro отмечена положительная дозозависимая отрицательная корреляция изменения скорости роста, интенсивности спороношения и антагонистической активности. Методом УП ПЦР при использовании специально подобранных неспецифических праймеров отмечены отдельные точковые мутации и изменения в области 1650 п.н. Интенсивность изменений на генетическом уровне зависела от способа интродукции изолятов в экосистему с ТМ. Достоверные изменения в ПЦР паттернах отмечены при интродукции Trichoderma в виде водной суспензии конидий без сорбентов.и на агаризованных средах в лабораторных условиях и в полевых условиях в почве с 10 нормами ТМ. Мутагенное действие ТМ в случае водной суспензии и отсутствие - в случаях с адсорбентами можно объяснить хорошо известным адаптивным механизмом (Звягинцев, 1985).

В случае генетической изменчивости под влиянием ТМ более эффективно различались выщепляющиеся клоны с изменениями по отдельным локусам ДНК «консервативные» праймеры. Выявляемые нами по ряду праймеров полиморфизмы (измененные по отдельным фрагментам ПЦР паттерны) могут быть использованы в качестве генетических маркеров клонов при использовании в биоудобрениях.

Влияние биоудобреиий на биологическую активность почв

Изменение общей биологической активности выщелоченного чернозёма РТ

;v, -Для ч ¿-оценки v общей ^ биологической г. лактивности■ .л (БА) .почвы, рассматриваемой как суммарный результат сопряженно протекающих микробиологических и химических процессов, использовали метод относительных единиц (Карягина, 1982). В показатель Б А нами были включены следующие величины: общая и активная микробная биомасса, интенсивность дыхания и азотфиксации, протеазная активность, интенсивность разложения целлюлозы. При этом наибольший показатель принят за 100 единиц.

В черноземе уровень БА возрастает со временем с 48,3 относительных единиц (отн.ед.) до 234,05. Биоудобрение в динамике оказывает различное воздействие на БА - от индифферентного до стимуляции или ингибирования. При этом интенсивность и тип воздействия зависят от вида адсорбента и изменяется в динамике. Отмечена положительная зависимость в динамике

изменения БА почвы от количества жизнеспособных пропагул изолята Trichoderma, адсорбированного на опилках (г=0,92).

На фоне мелиорации отмечено усиление действия биоудобрений на уровень супрессивности и биологическую активность почв. Отмечено достоверное снижение уровня количества пропагул Bipolaris sorokiniana и возрастние азофиксирующей активности.

Использование растительных типов сорбентов для микромицета-интродуцента позволило пролонгировать стимуляцию БА почвы до 60 дней на фоне возрастающих концентраций извести (рис. 10).

Таким образом, уровень БА чернозема, определяющий супрессивность почвы, может быть увеличен на ранних этапах как раздельным, так и комплексным воздействием исследуемых факторов (мелиорация и биологическая защита). Эффект пролонгирования стимуляции БА чернозема может быть достигнут только при одновременном использовании биопестицида на растительных сорбентах и известкования.

Показана положительная корреляционная зависимость численности жизнеспособных пропагул микромицета от проводимых в черноземе агротехнических мероприятий (применение известкования в возрастающих дозах) лишь в случае адсорбции Trichoderma на цеолите и шелухе.

Следовательно, адаптивные свойства у микромицетов-интродуцентов в агроценозе на фоне антропогенной нагрузки можно увеличить при правильном экологически обоснованном применении адсорбента.

Отмечена стимуляция отдельных параметров активности микробного сообщества в зависимости от типа адсорбента , для Trichoderma в биоудобрении в динамике. Максимальная способность к стимуляции общей биологической активности показана для микромицета, адсорбированного на цеолите и шелухе. Это указывает на то, что тип адсорбента для микроорганизма в почве может оказывать влияние не только на жизнеспособность, но и увеличивать их метаболическую активность.

Отмечена положительная корреляция между уровнем биологической активности чернозёма и количеством Trichoderma, адсорбированной на

-' растительном л сорбенте, а . на к. фоне мелиорации ----- с... количеством

микромицета-интродуцента, адсорбированного на цеолите.

Наибольший положительный эффект на биологическую активность и супрессивность почв от применения биоудобрений показан в случае применения в качестве интродуцента изолята Trichoderma в ассоциации с Azotobacter spp. и Trichoderma в ассоциации с Rhizobium sрр. с использованием в качестве органических сорбентов навоза и соломы.

Использование Trichoderma как биофунгицида

Усиление положительного эффекта изолята Trichoderma получено при использовании в качестве рострегулятора препарата «Агрохит» под яровые зерновые культуры. Показано, что метаболиты изолята Trichoderma вызывают снижение пораженности семян пшеницы возбудителями фузариоза и гельминтоспориоза. Максимальная биологическая эффективность в отношении возбудителя Fusarium spp. отмечена в случае сочетания

- тиг.н.

- МР(С<Г| о.

- NРК+Тг.ц.

- крк»!1.:

-Тг.ц. ~ Тми.

~ I

- Тг.и.

- Тг.«.

- NРК +Тг.ш .

- ИРКои.! " НРКЩИ.З " NРК»«>«.4

1N РК |<|

1

И1В«СТЬ{|

I-

Рис. 10. Оценка относительного сходства биологической активности выщелоченного чернозема после различных типов антропогенного воздействия на 30-е сутки (к -контроль (почва), Тг.н. - Тг'1сИо(1егта (Т.) на навозе, Тг.о. — Т. на опилках, Тг.ц. - Т. на цеолите, Тг.ш. — Т. на шелухе, ОТК (к) - минеральные удобрения (контроль), КРК + Тгл. - мнн.удобрения + Т. на навозе, КРК + Тг.о. -мин.удобрения + Т. на опилках, №К + Тг.ц. - мин.удобрения + Т. на цеолите, КРК + Тг.ш. - ыин.удобрения + Т. на шелухе, известь (к) - контроль, КРК + шв.2т - ыин.удобрения + СаСОЗ (2т/га), №К + изв.2т -мин.удобрения + СаСОЗ (Зт/га), КРК + изв.2т - мин.удобрения + СаСОЗ (4т/га), ИРК + изв.2т -мин.удобрения + СаСОЗ (5т/га)

Рис. 11. Влияние биоудобрения на основе сообщества Т.азрегеНит с бактериями рода АююЬас1гг ¡рр., адсорбированных на высушенном стерильном курином помете (Т — ТмярегеПит, А - АююЪаМег ¡рр., Т+А - Т.аярегеНит + Аго1оЬас1ег)

метаболитов и конидий изолятов Trichoderma.

Изучение зараженности яровой пшеницы на стадии онтогенеза выявило пораженность сорта Лада возбудителями септориоза и мучнистой росой. Наибольшая биологическая эффективность биофунгицида показана против возбудителя септориоза при использовании биофунгицида с прилипателем (КМЦ), а против мучнистой росы в вариантах с метаболитами интродуцента

Применение биопестицида в сочетании с регуляторами роста способствовало повышению урожайности на 16%. Максимальная биологическая эффективность показана для биофунгицида на основе метаболитов и конидий. Биологическая эффективность биофунгицида на основе Trichoderma сопоставима со стандартными биопестицидами фитоспорином и планризом.

Предпосевная обработка семян сосны Pinus silvestris холодотолерантным видом Trichoderma приводит к снижению поражения семян возбудителями плесневений родов Fusarium spp., Alternaría spp. и Cladosporium spp.

Интродукция биопестицида на основе изолята Trichoderma, адсорбированного на цеолите, в почву снижает степень отпада сеянцев сосны в 2,5 раза, что свидетельствует о положительном влиянии интродуцента на супрессивность истощенной серой лесной почвы лесопитомника.

При использовании биоудобрений на основе ОСВ и изолятов Trichoderma отмечено увеличение выхода здоровых сеянцев более чем в 3 раза по сравнению с контролем, что свидетельствует о положительном влиянии использования в качестве сорбента компоста.

Жизнеспособность интродуцента Trichoderma достоверно зависит от используемого в компосте адсорбента. Оптимальный результат достигается при интродукции Trichoderma на опилках. Внесение органического удобрения достоверно влияет на жизнеспособность биопрепарата только при использовании минерального адсорбента.

ВЫВОДЫ

1. Грибы рода Trichoderma являются типичными представителями почв - на ^территории РТ. Выявлено .11.. аборигенных .видов,, в том числе ранее неописанных. Природными ^резервуарами * сохранения численности и видового разнообразия видов рода Trichoderma являются погребенные почвы древних поселений, могильники и почвы Раифского заповедника, где частота встречаемости составляет более 60%, а видовое разнообразие более 20 видов. Современные антропогенные ландшафты характеризуются резким снижением частоты встречаемости (0-7%) и видового разнообразия (менее 45 видов).

2. Высокий уровень полиморфизма и генетического разнообразия природных популяций и клонов Trichoderma поддерживается действием комплекса внешних факторов. Тяжелые металлы вызывают генные мутации у грибов рода Trichoderma. Природные популяции Trichoderma характеризуются высокой гетерогенностью. В состав аборигенных изолятов Trichoderma, выделенных на территории республики Татарстан, входят

гетерогенные и моноспоровые клоны, представленные двумя культурально — морфологическими типами (И, IV).

3. Видовое разнообразие микромицетов снижается в ряду от эталонных почв (могильники, древние поселения, Раифский заповедник) к современным антропогенным ландшафтам, от поверхности корней к почве. Максимальным разнообразием характеризуются комплексы эталонных почв.

4. С помощью молекулярно-генетических, морфологических, кинетических и физиологических критериев в популяционной структуре местных изолятов выявлены культурально-морфологические клоны, отличающиеся типом жизненных стратегий. Положение выделенных изолятов в системе стратегии жизни характеризуется тенденцией к расположению в области гК-континиума эталонных почв, а из современных горизонтов, подверженных антропогенному воздействию - на противоположном г-полюсе с распространением в сторону гЬ-континиума.

5. Качественная популяционная структура видов ТНсЬойегта представляет собой мозаику клонов с различным типом совместимости, скорости роста, интенсивности спороношения, отношения к субстрату и конкурентоспособности.

6. Тип взаимоотношения с растением изолятов Trich.od.erma — антагонистов к фитопатогенным грибам - определяется типом организма-эдификатора, инфицированностью эндогенными возбудителями заболеваний и физико-химическими характеристиками почв.

7. Преобладающим типом взаимоотношения местных изолятов Trichoderma является отрицательное воздействие на растения, связанное с активацией эндогенных фитопатогенных грибов при интродукции микромицетов-антагонистов. Роль природных изолятов Trichoderma заключается в сукцессионных изменениях структуры растительного сообщества. Определены экологические группы изолятов Trichoderma -сапротрофов, эккрисатрофов и биотрофов, определяемые растением-эдификатором. В почве преобладают ЬК-стратеги, а в ризосфере растений отмечены сукцессионные изменения в составе гетерогенной популяции в -зависимости от стадии-вегетации от г к гК- и Ь-.

8. Тип экологической ниши определяет морфометрические и кинетические параметры изолятов Trichoderma. Обнаружена взаимосвязь между уровнем азотфиксирующей активности бактерий, интенсивностью эмиссии С02 в почве и интродуцированным видом Trichoderma. Наибольшее достоверное воздействие на азотфиксирующие бактерии показано для видов Т. Мго\\^е и Т. citrinoviride.

9. Разработана концепция использования природных изолятов, основанная на экологических стратегиях и консортивном подходе.

Грибы рода Trichoderma являются индикаторами супрессивности почв и могут быть использованы для диагностики уровня инфекционного фона агроценозов. Использование в практике сельского хозяйства при интродукциив почву должно быть основано на получении биоудобрения с использованием отходов бытового, промышленного и сельскохозяйственного

производства с LK-стратегиями жизни изолятов рода Trichoderma в ассоциации с диазотрофами. Дана характеристика флуктуаций интродуцируемых популяций Trichoderma в различных типах почв.

10. Разработаны молекулярно-генетические маркеры для контроля жизнеспособности интродуцированных изолятов Trichoderma. С целью регуляции жизнедеятельности популяций Trichoderma и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов разработана технология комопостирования «под открытым небом» с использованием no-till технологий и применения холодостойких изолятов. С помощью совокупности избирательных характеристик определена безопасность интродукции микромицетов-антагонистов рода Trichoderma.

11. Интродукция Trichoderma на фоне компостов на основе осадков сточных вод с высоким содержанием тяжелых металлов, животноводческих комплексов, растительных остатков способствует снижению инфекционного фона, отпада всходов Pinus sylvestris в антропогенных ландшафтах и повышению всхожести семян.

12. Максимальным гидролитическим комплексом обладают изоляты Trichoderma, выделенные из эталонных почв, что позволило использовать их для повышения гидролизуемости фуражных культур.

Основные публикации по теме работы

Монографии:

1. Алимова Ф.К. Микробная битехнология. (Глава 5. Защита растений.) / Ф.К. Алимова, И.Б. Лещинская, Б.М. Куриненко, В.И. Вершинина, Т.В. Багаева, Л. И. Знаменская,- УНИПРЕСС:ДАС.: Казань, 2000. - 368 с.

2. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma! Ф.К. Алимова,- Казань.: УНИПРЕСС ДАС, 2006. - 268 с.

3. Алимова Ф.К. Trichoderma/Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение/ Ф.К. Алимова.- Казань.: УНИПРЕСС ДАС, 2006.-360 с.

Учебно — методические пособия:

4. Алимова Ф.К. Влияние условий культивирования на развитие • . микроорганизмов/Методические указания // Ф.К.Алимова, P.A. Сайманова.-

Казань.: Изд-во КГУ, 1986. - 31с.

5. Алимова Ф.К. Микроорганизмы и плодородие почв. Методические указания // Ф.К. Алимова, Н.Г.Захарова, P.A. Сайманова. - Казань.: Изд-во КГУ, 1987. - 36с.

6. Алимова Ф.К. Методы культивирования анаэробов. Методические указания //Ф.К. Алимова, Сайманова P.A. - Казань.: Изд-во КГУ,'1987. - 37с.

7. Алимова Ф.К. Современные методы в микробиологии. Учебно-методическое пособие //Ф.К. Алимова, Т.В. Багаева, P.A. Сайманова, И.Е. Черепнева. - Казань.: Изд-во КГУ, 1988. - 40с.

8. Алимова Ф.К. Методы определения токсичности почвы, количественного учета фитотоксических форм микроорганизмов и изучение их фитотоксических свойств / Учебно-методическое пособие //Ф.К. Алимова, Т.В. Багаева. - Казань.: Изд-во КГУ, 1990. - 40 с.

9. Алимова Ф.К. Биология почв. Методические указания к выполнению лабораторных работ /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова. - Казань.: Изд-во КГУ, 1990.-20с.

10. Алимова Ф.К. Периодическое культивирование микроорганизмов. Методические указания к выполнению лабораторных работ //Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, Н.Г. Захарова. - Казань.: Изд-во КГУ, 1991. - 21с.

11. Алимова Ф.К. Экология микроорганизмов. Методические указания к выполнению лабораторных работ //Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров. - Казань.: Изд-во КГУ, 1993. - 41с.

12. Алимова Ф.К. Биомониторинг почв. Учебное пособие //Ф.К. Алимова, А.В. Гарусов, Н.Г. Захарова, О.Н. Ильинская, И.М. Скипина. -Казань.: Изд-во КГУ, 1999. - 40с.

13. Алимова Ф.К. Методы микробиологических исследований. Культивирование микроорганизмов. Учебное пособие // Казань.: Изд-во КГУ, 2000. - 40с.

15. Алимова Ф.К. Методы микробиологических исследований. Охрана труда/ Казань.: Изд-во КГУ, 1998. - 35с.

16. Алимова Ф.К. Подходы к систематике царства Mycota. Учебное пособие // Казань.: Изд-во КГУ, 2004. - 71 с.

17. Алимова Ф.К. Микробиологический мониторинг почв. Учебное пособие //Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров. — Казань.: Изд-во КГУ, 2005.-81 с.

18. Алимова Ф.К. Газовая хроматография в биологическом мониторинге почвы. Учебное пособие// Ф.К. Алимова, А.В. Гарусов, С.Ю. Селивановская, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров. - Казань.: Изд-во КГУ, 2006. - 90 с.

Изобретения и патенты

1. Хабибуллин Р.Э., Райманов И.Т., Алимова Ф.К., Крылова Н.И., Зарипова G.K., Ожиганова Г.У., Наумова Р.П. Способ очистки почвы от нефтяных загрязнений. А №97102681/13.0публикован20.06.2000 в RUABRU DB

■ Захарова ; Н.Г,, Алимова Ф.К,, .Колпаков А.И., . Лещинская И.Б., ' "Куприянова Ф.Г., Муратова" С-С-Г Гайнутдинова-ПИ.- Способ* обработки семян растений. -А.с. N1743018. -Опубл. в Б.И. -1992, N 6.(патент)

3. Ильинская О.Н., Захарова Н.Г., Алимова Ф.К. и др. Штамм гриба Aspergillus 316 - продуцент целлюлозы. - А.с. №1440920. - Опубл. В БИ

4. Алимова Ф.К., Иммамутдинов Ф.Н., Ибрагимов Я.С. Штамм гриба Trichoderma harzianum и способ его применения. № 2005114113/13(016203). ( Принято к рассмотрению).

Статьи

1. Алимова Ф.К. Биологическая очистка жидкого навоза /Ф.К.

Алимова, М.Я. Сальникова // Информационный листок №344-76. - Изд-

во ЦНТИ. - Казань, 1976. - Зс.

2. Алимова Ф.К. Выявление фитотоксических форм

микромицетов и актиномицетов в тепличном грунте / Ф.К. Алимова,

Н.Г. Захарова // Рукоп. Депониров. В ВИНИТИ. - 30.12.86. - № 9035-В86. - 12с.

3. Алимова Ф.К. К вопросу о заселении тепличного грунта микроорганизмами / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, И.Б. Лещинская // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 09.01.87. - №223-В87. - 13с.

4. Алимова Ф.К. Микрофлора сточных вод производства нитроцеллюлозы /Ф.К. Алимова, И.Е. Черепнева, Н.Г. Захарова и др. // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 20.10.86. - №7882-В86. -11с.

5. Алимова Ф.К. Микрофлора ризосферы безвирусного картофеля в закрытом грунте /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, И.А. Чернов и др // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 21.04.87. - №2789-В87. - 24с

6. Алимова Ф.К. Влйяние бактериальной РНКазы на окоренение черенков ремонтантной гвоздики и роз / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров, И.Б. Лещинская И.Б. // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. -1990.-№ 393 8-В90.-Зс.

7. Алимова Ф.К. Азотфиксирующие бактерии защищенного грунта /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 1990.-№ 2795-В90. - 5с.

8. Алимова Ф.К. Повышение урожайности огурцов при помощи предпосевной бактеризации семян азотфиксирующими комплексами микроорганизмов / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, Я.С. Ибрагимов // Изд-во ЦНТИ. Информационный листок № 217-90. - Казань. -1990. - 4с.

9. Алимова Ф.К. Фосфатмобилизующие микроорганизмы прикорневой зоны огурца /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. -1990. - № 2793-В90. - 4с.

10. Алимова Ф.К. Повышение урожайности огурцов при помощи предпосевной бактеризации семян фосфатрастворяющими микроорганизмами / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, С.С. Муратова, Я.С. Ибрагимов // Изд-во ЦНТИ. Информационный листок № 216-90. Казань -1990. - 2с.

11. Алимова Ф.К. Способ повышения эффективности применения • биопестицида: триходермина ч-/Ф.К.' Алимова, ' Н.Г. Захарова, Я.С. Ибрагимов // Изд-во ЦНТИ. Информационный листок № 215-90. -Казань. - 1990. - 2с.

12. Алимова Ф.К. Влияние микромицета рода Тпскос!егта на микробиоценоз тепличного грунта /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 1990. - № 2794-В90. - Зс. .

13. Алимова Ф.К. Местные штаммы рода ТНскойегта -антагонисты возбудителей заболеваний растений /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 1990. - № 2683-В90. - 2с.

14. Алимова Ф.К. Использование триходермина для защиты гвоздики от заболеваний /Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, Л.И. Литвинова // Цветоводство. - 1991. - №5. - С.13.

15. Алимова Ф.К. Использование картолина в борьбе с мучнистой росой роз / Ф.К. Алимова, Л.П. Хохлова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров и др. // Изд-во ЦНТИ. - №380-91. - 1991. - Зс.

16. Алимова Ф.К. Использование микробной РНКазы для обработки семян Amarantus cruentus /Ф.К. Алимова, Г.У. Ожиганова, Н.Г. Захарова, И.А. Дегтярева, С.Ю. Егоров // Биологические науки-1992. - №2. - С.135-139.

17. Алимова Ф.К. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на способность Rhizobium meliloti продуцировать биологически активные соединения / Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, Э.С. Наумова, Н.Г. Захарова // Агрохимия. - 1995. - №3. - С.60-64.

18. Алимова Ф.К. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на способность Rhizobium meliloti продуцировать вторичные метаболиты / Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, Э.С.Наумова, Н.Г. Захарова, Ф.Г. Куприянова-Ашина // Микробиология. -1995. -Т.64, №3. -С.637-641.

19. Алимова Ф.К. Бактериальная рибонуклеаза — стимулятор роста овощных и декоративных культур / Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, Э.С. Наумова, Н.Г. Захарова, И.Б. Лещинская //Вестник Российской Академии наук - 1995, №2.- С.42-44.

20. Алимова Ф.К. Влияние РНКазы Bacillus intermedius на ростстимулирующие и антагонистические свойства Trichoderma harzianum / Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, Н.Г. Захарова, И.Б. Лещинская // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - №5. - С.554-556.

21. Алимова Ф.К. Изучение чувствительности фитофторы к ридомилу МЦ / Ф.К. Алимова, С. Ю. Егоров, О.В. Городецкая, Н.Г. Захарова, И.Б. Лещинская //Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук-1996. - №6. - С.45-47.

22. Алимова Ф.К. Влияние клубеньковых бактерий, подвергнутых воздействию рибонуклеаз, на эффективность бобово-ризобиального симбиоза и урожай люцерны / Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, Э.С. Наумова, О.В. Козлова, Н.Г. Захарова // Агрохимия- 1997. - №2. - С.37-40.

23. Алимова Ф.К. Микробиологические аспекты силосования кукурузы и амаранта / Ф.К. Алимова, И.В. Дегтярева, Л.П. Зарипова и др. // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 1998. - №2459-В98. - 17с.

24. Алимова Ф.К. Воздействие фосфатмобилизующих микроорганизмов на растения защищенного грунта / Ф.К. Алимова, С.Ю. Егоров, С.В. Улахович, Н.Г. Захарова //Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук - 1999. - №4. - С.41-44.

25. Алимова Ф.К. Кинетика Trichoderma harzianum Rifai Г-432 в тепличном грунте / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров, Л.И. Литвинова, И.Б. Лещинская //Микология и фитопатология. - 1996. - №3. - С.48-54.

26. Алимова Ф.К. Влияние ридомила МЦ на структуру микробного ценоза / Ф.К. Алимова, О.В. Городецкая, Н.Г. Захарова,

С.Ю. Егоров / Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук -1999. - №1. - С.47-49.

27. Алимова Ф.К. Активность почвенных ферментов под влиянием ридомила МЦ / Ф.К. Алимова, О.В. Городецкая, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров, А.В. Гарусов // Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук - 1999. - №4. - С.37-38.

28. Алимова Ф.К. Экологические аспекты Trichoderma harzianum в черноземах РТ / Ф.К. Алимова, Г. Мако, Г.М. Камалетдинова // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 1999. - №2297-В99. - 19с.

29. Алимова Ф.К. Влияние Trichoderma harzianum на дыхание и азотфиксирующую активность чернозема РТ / Ф.К. Алимова, Мако Г., Митрофанов Е.Г. // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 1999. - №2298-В99. - 18с.

30. Алимова Ф.К. Фунгицидные свойства афропротеинов / Ф.К. Алимова, Н.Н. Максютова, И.А. Тарчевский, В.Г. Яковлева, Н.Г. Захарова //Доклады академии наук,1999,том 366,№6,С.826-829.

31. Алимова Ф.К. Природные и антропогенные факторы формирования фитотоксичных осадков сточных вод / Ф.К. Алимова, С.Ю. Селивановская, В.З.' Латыпова // Токсикологический вестник. -

1999. - №5. - С.14-18.

32. Алимова Ф.К. Фитоэкспертиза семян различных сельскохозяйственных растений / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, А.В. Гарусов, Мако Г. И Нива Татарстана. - 2000. - №4. - С.24-25.

33.Alimova F.K. Biological control of micromycetes community in vegetable seeds of Tatarstan Republic / F.K. Alimova, A.N. Fattakhova // Environ.Radioecol.Appl.Ecol., 2000, - No.6, pp.3-10,

34. Alimova F.K. The microbial community in vegetable seeds // Environmental Radiology and Applied Ecology. - 2000. - No3. - P. 20 -25.

35. Alimova F.K Ecology and biotechnology of biopesticide trichodermin in greenhouse soil / F.K. Alimova, A.N. Fattakhova, A.V. Talantov // Environmental Radiology and Applied Ecology. - 2000. - №3. -•P.10-16.

36. Алимова Ф.К. Выделение ДНК из микромицета Trichoderma harzianum / Ф.К. Алимова, А.Н. Аскарова, С.Н. Киямова, Е.Ю. Кучмина // Рукоп. Депониров. в ВИНИТИ. - 02.11.2000. - №2783-В00. - 14с

37. Alimova F.K. Mutagenity of heavy metals polluted soil after Trichoderma harzianum introduction / F.K. Alimova, O.B- Ivanchenko, S.Yu. Selivanovskaya // Environmental Radiology and Applied Ecology. -

2000. - Vol. 7 №3. - P.3-7.

38. Алимова Ф.К. Опыт применения триходермина на основе местных штаммов микромицетов / Ф.К. Алимова, Г.А. Мако, Н.Г. Захарова // Нива Татарстана. - 2000. - №4.- С.22.

39. Алимова Ф.К. Исследование микрофлоры пивоваренного ячменя, используемого на АО « Красный восток» / Ф.К. Алимова, А.Р.

Маликова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров //Нива Татарстана №5-6 2000.-С.32-33.

40. Алимова Ф.К. Влияние известкования и биопестицида на биологическую активность чернозема РТ /Ф.К. Алимова, Е.И. Ломако и др. / Труды ТатНии агрохимии и почвоведения. Плодородие почв, удобрение и урожай.-Казань:Из-во"Даос", 2001, 201с.

41.Alimova F. К. Application PCR for agriculture needs / F.K. Alimova, A.N. Askarova, S.N. Kiyamova,. S.Yu. Selivanovskaya, A.N. Fattakhova / Fifteenth Forum for applied biotechnology Gent 24 - 25 Sept.

2001. Preceedings Part 11. P. 389 - 392.

42. Alimova F.K. Optimization of antagonistic effect of Trichoderma harzianum (g-432) using food waste / A.N. Fattakhova, G.A. Mako, N.G. Zakharova //Sindh.Univ.Res. Jour. (Sci.Ser.) Vol. 32(2):(2001) P. 10-15.

43. Alimova F.K. Use of microbial parameters to assess treatment methods of municipal sewage sludge applied to grey forest soils of Tatarstan / F.K. Alimova, S.Yu. Selivanovskaya,V.Z. Latipova, S.N. Kiyamova // Agriculture, Ecosystems and Environment 86 (2001) P.145-153.

44. Алимова Ф.К.. Микробная биомасса и биологическая активность почв серых лесных почв при внесении осадков городских сточных вод / Ф.К. Алимова, С.Ю. Селивановская, С.Н. Киямова, В.З. Латыпова // Почвоведение. - 2001. - № С.227 - 233.

45. Алимова Ф.К. Микробная биомасса и и биологическая активность серых лесных почв при внесении осадков городских сточных вод / Ф.К. Алимова, С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова // Почвоведение,- 2001.-№2.- 227-233.

46. Алимова Ф.К. Влияние осадков сточных вод, содержащих металлы, на микробные сообщества серой лесной почвы / Ф.К. Алимова, С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова, С.Н. Киямова //Почвоведение.- 2002.- №5.-С.588-594.

47. Алимова Ф.К. Культивирование гриба p. Trichoderma на. растительном сырье /Ф.К. Алимова, Е.В. Скворцов, Н.А. Соснина, В.Ф.

- t. ■ Миронов7/Химия и компьютерное, моделирование, №7,2002, с.57-60.

48. F.K. Almova. The quarantine control and the methods of disinfection of tomato and cucumber seeds in different regions of russian federation / F. K. Alimova, N. G. Zakharova, G. A. Mako, A.N. Fattakhova, A.V. Garusov // PCSIR (Pakistan Journal of scientific and industrial reseach)

2002, 45 (3). - P. 191-196.

49. Алимова Ф.К. Скрининг штаммов Trichoderma, активных против возбудителей "заболеваний капусты / Ф.К. Алимова, Н.Г. Захарова, И.А. Илларионова, С.Ю. Егоров // Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук - 2002.-№3.-С.38-40.

50. Алимова Ф.К. Фитосанитарное состояние семенного фонда и посевов белокочанной капусты Республики Татарстан / Ф.К. Алимова, И.А. Илларионова, Н.Г. Захарова, С.Ю. Егоров //Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук — 2002.-№1.-С.73-76.

51. Алимова Ф.К. Влияние типа обработки сточных вод на ферментативную активность серых лесных почв при использовании в качестве почвоулучшителя / Ф.К. Алимова, С.Н. Киямова, С.Ю. Селивановская, В.З. Латыпова //Нива Татарстана.- 2002.-№1.-С.9-11.

52. Алимова Ф.К. Влияние Trichoderma harzianum (Rifai) на гомеостаз микробиоценоза почвы //Труды объединенной международной научной конференции Т.2 Биология. Медицина.-Казань:КГУ, 2003.С. 17-22.

53. Алимова Ф.К: Микробиологический мониторинг черноземной почвы РТ на фоне различных системах удобрения и механической обработки / Ф.К. Алимова, М.А. Салем, С.К. Зарипова, И.А. Дегтярева // Защита растения и охрана природы в Татарстане. - 2003. - Вып.7. -С.72-77.

54. Алимова Ф.К. Комплексное применение средств химизации и биологическая активность серой — лесной почвы /Ф.К. Алимова, И.А. Дегтярева, Е.И. Ломако //Агрохимический вестник.№4 2003 С. 14-17.

55. Алимова Ф.К. Исследование ферментных препаратов грибов Trichoderma, гидролизующих пентозаны ржи / Ф.К. Алимова, Е.В. Скворцов, Д.М. Абузярова //Вестник Татарстанского отделения Российской Экологической Академии,2(20),-2004.-С.14-18.

56. Alimova F.K. Effect of adsorbed Trichoderma harzianum (G-18) and differend of lime on biological nitrogen fixation activity in black zone soil of Republic of Tatarstan (Russia) / F.K. Alimova, G A. Mako // Sinhd.Univ.Res.Jour.(Sci.Ser.),VoI.: 37(1) P.17-24 (2005).

57. Alimova F.K. Liming effect on biological activity of leached loamy chernozem / F.K. Alimova, M.A. Salem, S.K. Zaripova, E.I. Lomako, A.H. Yapparov //P Yemen. Uiversity Of Aden Journal of Nautral And Applied Sciences. - 2005.-V.9, № (2) - P.120-125.

58. Алимова Ф.К. Влияние удобрений на биологическую активность выщелоченного чернозема / Ф.К. Алимова, М.А. Салем, Н.1И. Гиниятов, Т.В. Багаева, С.К. Зарипова, А.Х. Яппаров //Ученые

-, записки Казанского университета. - Сер.естественные науки. -.2005.' Т.147,кн.2. - С. 172-180.

59. Алимова Ф.К. Влияние различных способов основной обработки почвы на биологические свойства выщелоченного чернозема РТ / Ф.К. Алимова, М.А. Салем, С.К. Зарипова, М.М. Ильясов, A.B. Гарусов, А.Х. Яппаров //Вестник ТО РЭА.-2005.- №2. - С.27-30.

60. Алимова Ф.К. Оценка силосуемости зеленой массы кукурузы, выращенной на выщелоченном черноземе при различных системах применения средств химизации / Ф.К. Алимова, М.А. Салем, В.И. Вершинина / Труды ТатНИИ агрохимии и почвоведения - 2005.- С. 204212.

61. Алимова Ф.К. Оценка последействия известкования на биологические свойства выщелоченного чернозема / Ф.К. Алимова,

М.А. Салем, Е.И. Ломако, A.B. Гарусов, CJK. Зарипова, А.Х. Яппаров // Вестник ТО РЭА. - 2005.- №2. - С.31-33.

62. Алимова Ф.К. Влияние цАМФ на биосинтез ксиланаз бактериями и грибами / Ф.К. Алимова, Е.В. Скворцов, А. Ф.Э. Кабрера, Ф.Г. Каримова // Вестник Казанского Технологического университета, -Казань: - №2. - 2005. - С. 251-255.

63. Алимова Ф.К. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma / Ф.К. Алимова, Е.В. Скворцов, Д.М. Абузярова // Вестник казанского технологического университета. — Казань: — №1. — 2005. — С. 251-255.

64. Алимова Ф.К. Применение ксиланаз при гидролизе ржи в кормовых рационах сельскохозяйственных животных / Ф.К. Алимова, Е.В. Скворцов, Ш.К. Шакиров //Вестник Казанского государственного университета. —№1 2006.-С.

65. Алимова Ф.К. Создание сортов картофеля, устойчивого к фитофторозу исходного материала / Ф.К. Алимова, Д.И. Тазетдинова, 3. Сташевски, 3. 3. Салихова //Вестник ТО РЭА. - 2005. - №2. - С 34-36.

66. Тарасов Д.С. Формат представления биологических описаний гриба и его применение на примере рода Trichoderma / Д.С.Тарасов, Р.И.Тухбатова, Н.И. Акберова, Ф.К.Алимова // Вестник ТО РЭА. — 2005. - №2. - С. 44-49.

67. Алимова Ф.К. Современная система Trichoderma/Hypocrea (обзор). //Ученые записки Казанского университета. Сер.биол. — 2005.Т. 147, кн.2 .Естественные науки. С.28 - 56..

68. Алимова Ф.К. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибными болезнями картофеля / Ф.К. Алимова, С.Н. Куликов, Н.Г. Захарова, C.B. Немцев, В.П. Варламов //Прикладная биохимия и микробиология, 2006, Т.42, № 1, с.86-92.

Лицензия ПД № 7 - 0157 от 21.05.01 Подписано к печати 20.05.06. Формат 60x90 1/16 Печать на RISO. Усл. печ. л. 3,25. Тираж 100 экз. Заказ № 05/470 Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО «Диалог Компьютере» г. Казань, ул. Космонавтов, д. 41, офис 3.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Алимова, Фарида Кашифовна

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Климат и почвы Республики Татарстан

2. Общая характеристика Trichoderma/Hypocrea

2.1. Положение Trichoderma/Hypocrea в системе Ascomycota

2.2. Морфологическая характеристика Trichoderma/Hypocrea

2.3. Современная система Trichoderma/Hypocrea

2.4. Генетическая вариабельность Trichoderma

2.5. Методы в систематике Trichoderma

2.6. Внутривидовая изменчивость Trichoderma

2.6.1. Гетерогенность Trichoderma

2.6.2. Культурально-морфологические типы

2.6.3. Типы взаимодействия грибных гиф

2.6.4. Исследование популяционной структуры грибов

2.6.5. Вегетативная совместимость

2.7. Литические ферменты Trichoderma

2.7.1. Характеристика целлюлаз Trichoderma

2.7.2. Характеристика ксиланазного комплекса Trichoderma

2.13. Характеристика протеаз Trichoderma

3. Экология Trichoderma

3.1. Распространение Trichoderma в природе

3.2. Влияние внешних факторов на Trichoderma

3.2.1. Влияние температуры на Trichoderma

3.2.2. Влияние водного потенциала на Trichoderma

3.2.3. Влияние рН-фактора на Trichoderma

3.2.4. Влияние ионов металлов на Trichoderma

3.2.5. Влияние доступного кислорода на Trichoderma

3.2.6. Влияние субстрата и других необходимых элементов на

Trichoderma

3.2.7. Влияние почвы на Trichoderma

3.2.8. Влияние антропогенных факторов на Trichoderma

3.3. Влияние Trichoderma на окружающую среду

3.3.1. Роль Trichoderma в круговороте веществ и преобразовании антропогенных загрязнений окружающей среды

3.3.2. Влияние Trichoderma на почву

3.3.3. Влияние Trichoderma на микробиоценоз

3.3.4. Взаимодействие Trichoderma с растениями

3.3.4.1. Отрицательные взаимодействия

3.3.4.2. Положительные взаимодействия

3.3.4.3. Индукция резистентности растений к патогенам

4. Применение Trichoderma в сельском хозяйстве

4.1. Производство и применение биофунгицидов на основе

Trichoderma

4.2. Применение ферментов Trichoderma

4.3. Применение Trichoderma для производства кормов

4.4. Применение Trichoderma для переработки отходов 4.4.1. Получение биокомпостов с применением Trichoderma

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Материалы

1.2. Характристика почв агроклиматических зон РТ

1.3. Схема отбора проб для выделения изолятов Trichoderma 3.Методы

3.1. Выделение Trichoderma из почвы

3.2. Получение моноспоровых культур

3.3. Среды для культивирования Trichoderma

3.4. Определение кинетических параметров, размеров объектов

3.5. Определение цвета

3.6. Идентификация

3.7. Вегетативная совместимость

3.8. Культурально-морфологические типы колоний

3.9. Определение физиологических параметров

3.10. Антагонистическая активность

3.11. Ферментативная активность изолятов Trichoderma

3.12. Определение фитотоксичности почвы и культуральной жидкости Trichoderma

3.13. Определение токсичности к микроорганизмам и мутагенного потенциала почвенных вытяжек и культуральной жидкости Trichoderma

3.14. Определение фунгистатического действия почвы

3.15. Молекулярно-генетический анализ Trichoderma

3.16. Наблюдение и учет микроорганизмов почвы

3.17. Определение «потенциальной» активности азотфиксации

3.18. Определение активности почвенного дыхания

3.19. Определение общей микробной биомассы в почве

3.20. Определение ферментативной активности почвы

3.21. Расчет коэффициента микробиологической активности

3.22. Фитоэкспертиза семенного материала

3.23. Получение культуры Trichoderma, устойчивой к антибиотикам и пестицидам

3.24. Получение биопрепарата триходермин (фитотрикс) на основе Trichoderma

3.25. Определение биологической эффективности биопрепаратов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан

2. Морфологические и молекулярно-генетические характеристики изолятов, выделенных на территории РТ

2.1 .Морфологическая характеристика видов Trichoderma, выделенных на территории Республики Татарстан

2.2. Молекулярно - генетическая характеристика аборигенных изолятов Trichoderma

3. Популяционная гетерогенность изолятов Trichoderma, выделенных на территории РТ

4. Гетерогенность природных популяций Trichoderma: вегетативная совместимость клонов в популяциях и культурально-морфологические типы колоний

5. Гетерокариоз изолятов Trichoderma, выделенных из почв РТ

6. Интенсивность спороношения

7. Внутривидовая конкурентоспособность и взаимоотношения с фитопатогенными микроорганизмами в опытах in vitro

8. Стратегии жизни изолятов Trichoderma в экосистемах

9. Ферментативная активность автохтонных изолятов грибов Trichoderma

10. Кинетика изолятов Trichoderma

11. Влияние экологической ниши и вида адсорбента на жизнеспособность T.harzianum

12. Взаимоотношение изолятов Trichoderma с растениями (фитотоксичность)

13.Токсичность, генотоксичность и мутагенный потенциал изолятов Trichoderma

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно-климатических зон на территории Республики Татарстан"

Актуальность работы. В современных условиях ведения земледелия особую актуальность приобретают две проблемы. Это постоянно растущие затраты на производственную продукцию, вызванные применением традиционных многооперационных технологий возделывания сельскохозяйственных культур, постоянным и значительным повышением цен на энергоносители, сельскохозяйственную технику, минеральные удобрения, средства защиты растений и другие виды промышленной продукции. Вторая проблема связана с потерей плодородных почвенных ресурсов, снижением видового разнообразия микроорганизмов и ухудшением экологической и фитосанитарной обстановки окружающей среды. В настоящее время идет быстрое и повсеместное сокращение площадей с естественной растительностью. В то же время известно, что только природные комплексы с условно коренной растительностью способны поддерживать состояние среды на приемлемом для жизни уровне. В связи с этим особый интерес при экологических исследованиях представляют ненарушенные леса, расположенные на территории заповедников, которые могут служить эталоном природных ландшафтов со всем видовым разнообразием, населяющих их организмов, а также почвы, не затронутые деятельностью человека.

Территория Республики Татарстан в настоящее время имеет около 19% территории, покрытой сильно нарушенными лесными природными системами. Исключение составляют отдельные хорошо сохранившиеся хвойные участки леса Раифского лесничества Волжско-Камского заповедника Национального парка «Нижняя Кама». Лесопитомники, используемые для восстановления лесов, характеризуются резким ухудшением агрохимических характеристик. В результате этого почти пятая часть всходов и сеянцев ежегодно погибает от болезней, а в отдельные годы отмечалась даже стопроцентная гибель сеянцев.

Современные технологии обеспечивают последовательную замену энергоемких минеральных удобрений и пестицидов биопрепаратами нового поколения, разработанными отечественными микробиологами, и препаратами, производимыми отечественными биологическими фабриками. В современных процессах используется микробиологический мониторинг почвенных угодий с целью своевременной оценки ухудшения экологической ситуации, безопасных технологий для сельскохозяйственной промышленности.

Одним из наиболее перспективных видов микроорганизмов для внедрения ресурсосберегающих технологий в сельское хозяйство являются грибы рода Trichoderma, которые представляют собой наиболее изучаемые грибы в настоящее время. Представителей рода Trichoderma можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере, частично ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенов и микотоксинов, выделяющихся в окружающую среду. б

Возможно, что Trichoderma - это единственный род грибов, для которого каждый вид представлен в GeneBank NCBI, по крайней мере, одним геном, и многие виды представлены последовательностью двух или более генов. В целом в Банке генов хранится информация о 427 видах Нуросгеа (телеоморф) и о 110 видах Trichoderma. Согласно последним данным, более 40% видов, представленных в GeneBank NCBI, (44 названия) являются синонимами или идентифицированы неверно.

Причиной возрастающего интереса к Trichoderma является большая практическая и экологическая значимость рода. Виды Trichoderma являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитиназ, пектиназ, ксиланаз, серинзависимых протеиназ и др.), используемых в целлюлозно-бумажной и пищевой промышленностях, в производстве моющих средств, в получении спирта, преобразовании отходов, содержащих целлюлозу и глюкозу, для получения кормовых добавок и в текстильной промышленности. На основе антибиотиков, токсинов и ферментов грибов этого рода получают препараты для биологического контроля болезней и стимуляции роста растений и получения трансгенных растений. Trichoderma также используется для биологической очистки почвы и для получения биокомпостов.

В рамках данного вопроса исследования биоразнообразия определяются как зондирование перспективности использования определенных природных источников с коммерческой целью. Именно такой подход определил разработку международной «Конвенции по биологическому разнообразию» в качестве законодательства по использованию ценных генетических ресурсов.

В настоящее время перед микологами, изучающими Trichoderma, стоит ряд вопросов: по систематическому положению вида, адекватным методам идентификации, по построению естественного филогенетического древа, географической распространенности, разнообразию и выявлению способности к антагонистической активности к фитопатогенам среди всех видов данного рода, по наличию в природе новых видов, в том числе промышленно значимых.

В связи с вышесказанным представляет большой практический интерес анализ распространенности и сохранения видового разнообразия грибов рода Trichoderma на территории Республики Татарстан и их роли в биогеоценозе и антропогенных ландшафтах, а также возможности использования в сельскохозяйственной промышленности.

Целью настоящего исследования явилась оценка биоразнообразия, динамики численности и характеристик структуры популяций Trichoderma в современных почвенных и антропогенных ландшафтах, в эталонных зонах (погребенных и заповедных) на территории РТ, а также выявление основных закономерностей изменения микробиологической активности агроценозов под влиянием антропогенных факторов и роль в этих процессах интродукции штаммов Trichoderma.

Задачи исследования

1. Исследование распространения грибов рода Trichoderma и идентификация аборигенных штаммов Trichoderma, выделенных на территории Республики Татарстан, с использованием морфологических, кинетических и молекулярно-генетических методов.

2. Исследование стратегии жизни, внутривидовой и популяционной гетерогенности местных штаммов Trichoderma, выделенных из различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан.

3. Исследование биохимических свойств штаммов видов Trichoderma: фитотоксичности культуральных жидкостей и некоторых ферментов гидролазного комплекса.

4. Оценка степени влияния различных экологических параметров на выживаемость штаммов Trichoderma.

5. Изучение взаимоотношения штаммов Trichoderma с растениями, фитопатогенными и сапротрофными почвенными микроорганизмами.

6. Отбор стабильных штаммов - продуцентов биопрепаратов по культурально - морфологическим признакам, антибиотической активности, вегетативной совместимости, устойчивости к фунгицидам, взаимодействию с регуляторами роста и бактериями.

7. Оценка биологической активности различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан по данным микробиологического мониторинга. Изучение влияния антропогенных факторов и биоудобрений с активными штаммами Trichoderma на микробиологическую активность почв Республики Татарстан.

8. Разработка способов применения местных штаммов Trichoderma в промышленности Республики Татарстан с целью получения кормовых добавок (ксиланазы Trichoderma) для животноводства, переработки растительных, животноводческих, а также городских отходов с целью получения биоудобрений, и для получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.

Научная новизна. Впервые определен видовой состав и географическое распространение грибов рода Trichoderma на территории РТ. Выделены типичные и случайные виды Trichoderma в современных, погребенных и затопляемых почвах. По данным молекулярно-генетического анализа выделены новые виды Trichoderma из погребенных почв и могильников на территории РТ. Установлена гетерогенность природных популяций Trichoderma и их структура. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma и теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов (например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз). Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений.

Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля применения биофунгицидов и биоудобрений. Впервые изучена эколого-биологическая значимость видов рода Trichoderma в почвенной биоте. Выявлена роль Trichoderma в регуляции супрессивности почв на территории Республики Татарстан. Описана структура популяций Trichoderma при взаимоотношении с растениями. Установлено, что доля фитотоксических видов зависит от типа стадии сукцессии и типа экологической ниши. Описан комплекс видов фитопатогенных микромицетов, вызывающих поражение сеянцев хвойных, овощных и зерновых культур. Впервые выявлены местные изоляты Trichoderma с высокой антагонистической активностью в отношении почво-обитающих патогенных микромицетов и семенных инфекций. Разработаны оптимальные условия культивирования активных штаммов в различных биотехнологических системах, и получен биопрепарат новой формы на основе микромицетно - бактериального сообщества с использованием природных регуляторов и промышленных и сельскохозяйственных отходов. Впервые показана целесообразность использования биопестицида на основе Trichoderma для ограничения численности возбудителей инфекционных заболеваний яровых и озимых зерновых культур, а также сеянцев сосны на территории Республики Татарстан. Впервые с позиций системного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных микробиологических и биохимических параметров различных природных - климатических зон на территории Республики Татарстан. Показано, что введение в агроэкосистему определенных видов и различных сочетаний удобрений, известкования и сочетания удобрений с известкованием, а также биоудобрений оказывает положительное фитотерапевтическое действие на растения и влияет на уровень супрессивности и плодородие почв. Установлены закономерности биосинтеза ксиланаз у представителей рода Trichoderma. Впервые проведено исследование влияния рН .и температуры, соответствующих параметрам желудка моногастричных сельскохозяйственных животных, а также воздействия гидротермической обработки на активность ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Запасы жизнеспособных пропагул Trichoderma изменяются в зависимости от расположения в почвенном профиле, от затопляемости почв, антропогенной нагрузки.

2. Распространение, морфологические, молекулярно-генетические, кинетические характеристики и экологические стратегии штаммов рода Trichoderma зависят от типа экологических ниш и почв.

3. Смена популяций штаммов Trichoderma с различной стратегией жизни зависит от стадий сукцессии экологической ниши.

4. Микробиологическая активность, биотический потенциал фитопатогенных грибов в агроценозах изменяются в широком диапазоне в зависимости от типа почвы, биологической активности, окультуренности, внесения удобрений, мелиорантов и фитосанитарного состояния культур в севообороте.

5. Минеральные, органические удобрения и известкование почвы оказывают разнонаправленное действие на биологическую активность и супрессивность агроценозов.

6. Отдельные изоляты рода Trichoderma могут использоваться для восстановления плодородия почв в виде биокомпостов на основе осадков сточных вод крупного промышленного города, отходов пищевых предприятий и сельскохозяйственных производств, а также для получения биопестицидов, биогербицидов для защиты растений от заболеваний, с целью восстановления супрессивности и регуляции биологической активности почв.

7. Стабильность культурально - морфологических признаков Trichoderma является критерием отбора антагонистов.

Практическая значимость работы. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma, теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов. Например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз. Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений. Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и биоудобрений. Предложен комплекс методов для проведения микробиологического мониторинга, адекватно отражающего состояние биоты и позволяющего прогнозировать возможные эпифитотии. Предложены способы получения биокомпостов на основе осадков сточных вод, отходов пищевых и сельскохозяйственных производств, с использованием штаммов Trichoderma с-высокой гидролазной, фунгицидной и гербицидной активностями с целью внедрения препаратов в практику лесного и сельского хозяйств Республики Татарстан для восстановления плодородия и супрессивности почв. Разработана технология получения биопестицида на основе отходов пищевых предприятий, которая была внедрена в практику производства биопрепаратов на базе биозавода на территории совхоза «Казанский тепличный». Показана возможность использования гидролазного комплекса Trichoderma для переработки отходов спиртовой промышленности в РТ. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз Trichoderma, что позволило правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащие пентозаны. Результаты исследований используются для подготовки лекций на биолого - почвенном факультете КГУ по курсам «Биология почв», «Сельскохозяйственная микробиология», «Экология микроорганизмов», «Микология», «Почвенная микробиология». Монография «Микробная биотехнология» Изд-во Казань УНИПРЕСС 2006г. рекомендована для обучения студентов и аспирантов биолого - почвенного факультета КГУ.

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзн. Конф. «Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных». - Ташкент. - 1989, Всесоюзн. Совещ.: Нуклеазы микроорганизмов и их практическое применение // Рига. - 1989, Всесоюзн. Конф.: Методы получения, анализа и применения ферментов. - Рига. -1990. -, 5 Междунар. Симп. Молодых Ученых. - Болгария, Варна. - 1990., Научн. Конфер. // Днепропетровск. - 1991. , Всесоюз. Симпозиуме: Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия. - Оренбург. - 1991, Всесоюзной Конфер. «Экологические проблемы фармакологии и токсикологии». - Москва. - 1991, Раб. Совещ.: Регуляторы роста и развития растений. - Москва. -1991,.5-ой Всероссийск. Конфер.: Новые направления в биотехнологии. - Пущино. - 1990, Всесоюз. Конфер.: Ферменты микроорганизмов. - Казань. - 1991, Всесоюзн. Конфер.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. - Пущино. - 1992., Научн. Конфер.: Эволюция почв и почвенного покрова в связи с изменением природной среды // Пущино. -1992, 6-ой Всероссийской Конфер.: Новые направления биотехнологии. -Пущино. - 1994, Конф.: Физиология и биохимия мицелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии. - М. - 1994., Конфер.: Генетика -народному хозяйству. - Москва. - 1994, Всесоюзная конфер.: Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. - М. - 1994, Forum for applied biotechnology. - Brugge. - 1995, Advanced Biotechnologies and Agriculture. -Ferrary-Itali. - 1995, 7th international symposium. - Santos-Brazil. - 1995, III Международн. Конфер.: Регуляторы роста и развития растений. - М. - 1995, Intern. Co-Conf. On ICEP95-ICONE95. - St.Peterburg, Russia. - 1995, Материалы 3-й международной конференции по химии нефти. - Томск. -1997, 3-й Республ. Научн. Конфер.: Актуальные экологические проблемы районов Татарстана. - Казань. - 1997, 3-й Научно-практич. Конфер.: Достижения и перспективы развития селекции семеноводства сельскохозяйственных культур. - Пенза. - 1999, Всероссийской Научной Конфер.: Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья. - Саранск. -1999, 9-th International Congress of Mycology. - Sydney. - 1999, Yl-th International Simposium: In suti and onside bioremedition. - San-Diego, California. - 1999, Междунар. Научн. Конфер. Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов русской равнины: - Пенза. - 1999, X-th International Soil Conservation Organisation Conferens. - 1999, Научной конфер.: - Новочеркасск. - 2000, Всероссийской научно-практич. Конфер.: Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно-нарушенных территорий. - Ульяновск. - 2000, Всероссийской конференции «сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках» 14-19 июня 2001 г, 1ом Съезде микологов России «Современная микология в России» М., 2002, Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. 7-ая международная конференция Санкт- Петербург 15-18 сент 2003, «8-ой, 9-ой Пущинской школах-конференциях молодых ученых. Биология - наука XXI века. 17-21 мая 2004, 2005,2006». - Пущино, 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»,Санкт-Петербург - Репино, 15-18 сентября 2003г.,Научно-практическая конференции * «Биотехнологии - на поля Татарстана». ОАО "Казанская ярмарка", Казань-2004, Международной научной конференции авг. 25 - сент. 5, 2003, 13-ая международная конференция «Ферменты микроорганизмов: структура, функция, применение». - Казань: КГУ, 2005, Международной научно- практической конференции «Перспективы и проблемы развития битехнологии в рамках единого экологического пространства стран содружества» 25-28мая, 2005, Минск-Нарочь, Республика Белорусь, Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 17-18 июня 2004, Втором съезде Общества биотехнологов: Москва, 13-15 октября 2004, Межд. научно-практ. конф. по развитию сотрудничества между Республикой Татарстан и Германией в рамках Президентской программы "Дни Германии в Татарстане и перспективы развития экологического сельского хозяйства и природопользования в Республике Татарстан", 5-6 ноября 2004, Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» 28 - 29 ноября, 2005, XX Congreso National Microbiologia Caceres, Espana. 19-22 septiembre 2005 Ponencias у Comunicaciones "Universidad de Extremadura" Sociedad Espanola de Microbiologia, Symposium of Biology Students in Europe" Finland 2005 University of Helsinki Department of Biology July 29th to August 7th 2005, Межд. Конф «Грибы и водоросли в биогеоценозах- Москва МГУ., 31янв. - 3 февраля 2006, 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium. Vienna, Austria, 5-8 April 2006.

Личный вклад автора. Основная работа по получению экспериментального материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. В выделении отдельных изолятов из тепличного грунта совхоза «Майский», фитоэкспертизе семян зерновых, испытаниях в тепличных грунтах принимали участие доцент кафедры микробиологии Захарова Н.Г. и старший инженер кафедры микробиологии Мочалова Н.К. В организации полевых исследований на базе ТатНИИСХ и ГУ «Татарский НИИ агрохимии и почвоведения РАСХН», принимали участие д.с.х. наук Шакиров Р.С., д.с.х.н. Яппаров А.Х. , зав. лаб. к.с.х.н. Ломако Е.И. Молекулярно-генетические исследования проводились при активной помощи доц. кафедры биохимии Аскаровой А.Н. и сотрудника Института химической инженерии в Вене д.б.н. Дружининой И.А., хроматографические исследования по азотфиксации и респираторной активности почв проводилось с помощью вед.н.с Гарусова А.В., консультации по методам анализа видов Trichoderma и гетерогенности популяций получены на кафедре микологии и альгологии МГУ у зав.каф. д.б.н. Дьякова Ю.Т., д.б.н. Лихачева А.В., к.б.н. Александровой А.В., микрофотосъемки конидий были сделаны с помощью д.б.н. Камзолкиной О.В., консультации по методам микологического анализа антропогенных ландшафтов были получены у д.б.н. проф. Марфениной О.Е., участие микроорганизмов в силосовании кормов исследовалось при участии к.б.н. Вершининой В.И., полевые испытания биоудобрений на основе компостов на основе отходов очистных сооружений г. Казани и Trichoderma для применения под сеянцы сосны проводили на базе лесопитомника Матюшинский при участии д.с.х.н. проф. Ведерникова Н.М., д.б.н. проф. Селивановской С.Ю., пробы из зон контакта площадей питания Pinus sylvectris L. Раифского заповедника получены от нач. отдела Росприроднадзора России к.б.н. Морозкина А.И., к.б.н. Каримуллиной С.Н., почвенные образцы из древних поселений получены с помощью доц. каф. почвоведения и агрохимии КГУ Мельникова Л.В., образцы черепов из древних захоронений и описания к ним получены с помощью сотрудников ин-та истории им. Марджани АНРТ Газимзянова И.Р., Чижевского А.А., к.б.н., конструирование праймеров и программные модели для морфологической и молекулярно - генетической идентификации Trichoderma сделаны при участии с.н.с. каф. биохимии к.б.н. Акберовой Н.И. и аспиранта каф. генетики Тарасова Д.С.

Публикации. По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 90 научных работ, в том числе 1 коллективная и 2 авторские монографии, 68 научных статей, 15 учебных пособий и методических руководств. Получено 4 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 436 стр. компьютерного текста, состоит из введения, 3 глав, включающих 8разделов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 159 наименований (из них 112 на иностранных языках), и приложения.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Алимова, Фарида Кашифовна

выводы

1. Грибы рода Trichoderma являются типичными представителями почв на территории РТ. Выявлено 11 аборигенных видов, в том числе ранее неописанных. Природными резервуарами сохранения численности и видового разнообразия видов рода Trichoderma являются погребенные почвы древних поселений, могильники и почвы Раифского заповедника, где частота встречаемости составляет более 60%, а видовое разнообразие более 20 видов. Современные антропогенные ландшафты характеризуются резким снижением частоты встречаемости (0-7%) и видового разнообразия (менее 45 видов).

2. Высокий уровень полиморфизма и генетического разнообразия природных популяций и клонов Trichoderma поддерживается действием комплекса внешних факторов. Тяжелые металлы вызывают генные мутации у грибов рода Trichoderma. Природные популяции Trichoderma характеризуются высокой гетерогенностью. В состав аборигенных изолятов Trichoderma, выделенных на территории республики Татарстан, входят гетерогенные и моноспоровые клоны, представленные двумя культурально -морфологическими типами (II, IV).

3. Видовое разнообразие микромицетов снижается в ряду от эталонных почв (могильники, древние поселения, Раифский заповедник) к современным антропогенным ландшафтам, от поверхности корней к почве. Максимальным разнообразием характеризуются комплексы эталонных почв.

4. С помощью молекулярно-генетических, морфологических, кинетических и физиологических критериев в популяционной структуре местных изолятов выявлены культурально-морфологические клоны, отличающиеся типом жизненных стратегий. Положение выделенных изолятов в системе стратегии жизни характеризуется тенденцией к расположению в области гК- континуума эталонных почв, а из современных горизонтов, подверженных антропогенному воздействию - на противоположном r-полюсе с распространением в сторону rL-континуума.

5. Качественная популяционная структура видов Trichoderma представляет собой мозаику клонов с различным типом совместимости, скорости роста, интенсивности спороношения, отношения к субстрату и конкурентоспособности.

6. Тип взаимоотношения с растением изолятов Trichoderma -антагонистов к фитопатогенным грибам - определяется типом организма-эдификатора, инфицированностью эндогенными возбудителями заболеваний и физико-химическими характеристиками почв.

7. Преобладающим типом взаимоотношения местных изолятов Trichoderma является отрицательное воздействие на растения, связанное с активацией эндогенных фитопатогенных грибов при интродукции микромицетов-антагонистов. Роль природных изолятов Trichoderma заключается в сукцессионных изменениях структуры растительного сообщества. Определены экологические группы изолятов Trichoderma -сапротрофов, эккрисотрофов и биотрофов, определяемые растениемэдификатором. В почве преобладают LK-стратеги, а в ризосфере растений отмечены сукцессионные изменения в составе гетерогенной популяции в зависимости от стадии вегетации от г к гК- и L-.

8. Тип экологической ниши определяет морфометрические и кинетические параметры изолятов Trichoderma. Обнаружена взаимосвязь между уровнем азотфиксирующей активности бактерий, интенсивностью эмиссии СО2 в почве и интродуцированным видом Trichoderma. Наибольшее достоверное воздействие на азотфиксирующие бактерии показано для видов Т. atroviride и Т. citrinoviride.

9. Разработана концепция использования природных изолятов, 1 основанная на экологических стратегиях и консортивном подходе.

Грибы рода Trichoderma являются индикаторами супрессивности почв и могут быть использованы для диагностики уровня инфекционного фона агроценозов. Использование в практике сельского хозяйства при интродукции в почву должно быть основано на получении биоудобрения с использованием отходов бытового, промышленного и сельскохозяйственного производства с LK-стратегиями жизни изолятов рода Trichoderma в ассоциации с диазотрофами. Дана характеристика флуктуаций интродуцируемых популяций Trichoderma в различных типах почв. с

10. Разработаны молекулярно-генетические маркеры для контроля жизнеспособности интродуцированных изолятов Trichoderma. С целью регуляции жизнедеятельности популяций Trichoderma и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов разработана технология компостирования «под открытым небом» с использованием no-till технологий и применения холодостойких изолятов. С помощью совокупности избирательных характеристик определена безопасность интродукции микромицетов-антагонистов рода Trichoderma.

11. Интродукция Trichoderma на фоне компостов на основе осадков сточных вод с высоким содержанием тяжелых металлов, животноводческих комплексов, растительных остатков способствует снижению инфекционного фона отпада всходов Pinus sylvestris в антропогенных ландшафтах и повышению всхожести семян.

12. Максимальным гидролитическим комплексом обладают изоляты Trichoderma, выделенные из эталонных почв, что позволило использовать их для повышения гидролизуемости фуражных культур.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в РФ выделяют 500 климатических зон, требующих специальных подходов для восстановления плодородия почв. Однако существует практика разработки рекомендаций только для 3 зон: дерново-подзолистых, черноземных и каштановых почв.

Оценка биоразнообразия рода Trichoderma проводилась в 4 агроклиматических зонах: прохладном, умеренно-прохладном, умеренно-теплом и теплом, в 11 районах в 4 типах почв и тепличном грунте РТ. Нами было выделено свыше 700 изолятов Trichoderma из образцов почв и подстилок археологических раскопок, государственного Раифского ' заповедника, почв и агроценозов, антропогенных ландшафтов и затопляемых почв. В результате исследований была отмечена высокая частота встречаемости (КОЕ/г почвы) изолятов Trichoderma в эталонных почвах и защищенных грунтах. Нами было впервые показано, что антропогенные ландшафты характеризовались снижением популяционного уровня более, чем в 100 раз, снижением частоты встречаемости и видового разнообразия Trichoderma. Из комплекса исследованных антропогенных ландшафтов исключение составляли защищенные грунты в теплицах, что связано с ежегодной интродукцией популяций Trichoderma в составе биофунгицидов, с изготавливаемых на основе штаммов - антагонистов фитопатогенов.

При исследовании структуры микромицетного сообщества почв выявлено в 4 климатических зонах на территории Республики Татарстан 700 изолятов Trichoderma, среди которых идентифицировано более 11 видов с помощью морфологических и молекулярно-генетических методов. Для отдельных изолятов не обнаружено гомологичных сиквенсов, которые бы позволили их отнести хотя бы к одному из известных видов. Идентификация проводилась с помощью альфа - ,бета - и с помощью молекулярно-генетических подходов. Наиболее распространенным и часто встречающимся ( оказался вид Т. koningii (161 изолят). На втором месте по распространенности стоит T.hamatum (100 изолятов), а на третьем -T.longibrachiatum (92 изолята). Далее следуют Т. harzianum (87 изолятов), Т. asperellum (80 изолятов) и Т. citrinoviride (69 изолятов), Т. atroviride (22 изолята), T.viride (12 изолятов) и T.oblongisporum (10 изолятов). Последний вид встречается немного реже, но все-таки его также можно считать обычным видом. Редко встречались виды Т. saturnisporum (8 изолятов) и Т. spirale (2 изолята. Виды T.hamatum, T.asperellum, Т. harzianum и Т. citrinoviride имеют широкий диапазон распространения. Т. longibrachiatum и Т. atroviride чаще выделялись в умеренно-теплой и теплой зонах. Можно проследить некоторые закономерности распределения видов рода Trichoderma в зонах лесопосадок разных климатических областей на территории РТ. Виды группы Т. koningii чаще встречаются в прохладной климатической зоне, а в более южных областях количество пропагул (КОЕ/1 г почвы) этого вида сокращаются. Распространение видов Trichoderma зависело от типа почвы.

Все выделенные виды по типу колоний относятся к 2 и 4 типу из 4 описанных. Качественная популяционная структура видов Trichoderma представляет собой мозаику клонов с различным типом совместимости, скорости роста, интенсивности спороношения, отношения к субстрату и конкурентоспособности. Изучение гетерогенности популяций Trichoderma позволило предложить модель выщепления клонов внутри каждого вида. При исследовании взаимодействия между гетероспоровыми популяциями и моноспоровыми клонами нами были обнаружены различные реакции вегетативной совместимости: конкурентоспособность и ключевые кинетические и морфологические параметры. Интенсивность конидиогенеза выделенных клонов достоверно отличалась от свойств родительского изолята( во всех типах почв. Положение выделенных изолятов в системе стратегии жизни характеризовалось тенденцией к расположению в области гК-континуума для эталонных почв, а для современных горизонтов, подверженных антропогенному воздействию - на противоположном г-полюсе с распространением в сторону rL-континуума, что подтверждает явление когерентной эволюции, протекающей в стабильных экосистемах (палеопочвы и фоновые почвы), и не когерентной эволюции, протекающей в неустойчивых, нарушенных агроценозах. В результате не когерентной эволюции происходит вымирание доминантов (KL стратеги) за счет возрастании численности r-стратегов. о

В настоящее время в сельскохозяйственной биотехнологии биопрепараты на основе Trichoderma разрешены и используются только в тепличных грунтах с целью биозащиты и для улучшения питательных свойств кормов. Максимальным гидролитическим комплексом обладали изоляты Trichoderma, выделенные нами из эталонных почв, что позволило снизить вязкость ржаных экстрактов под воздействием ксиланаз грибов.

В нашу задачу входило расширение спектра использования этого вида для улучшения физико-химических свойств почвы, повышения плодородия и < супрессивности почв и защиты растений за счет использования биопрепаратов на основе Trichoderma. Скрининг видов по антагонистической активности, выживаемости в полевых условия в различных типах почв на фоне антропогенного воздействия позволил выделить виды и изоляты, способные регулировать численность фитопатогенных микроорганизмов, эндогенных для РТ. Выделенные изоляты Trichoderma из погребенных почв обладали более высокой антагонистической активностью по сравнению с изолятами, выделенными из современных почв. Впервые нами разработан способ регуляции численности и активности психротрофного вида Fusariumi с помощью нового изолята Trichoderma, функционирующего в общей с фитопатогеном экологической нише в условиях минимальной обработки почв («Ноу-тилл технология»). Недостатком ноу-тилл технологии является возрастание численности сорняков. Нами выделены новые штаммы Trichoderma, обладающие гербицидными свойствами против ширицы и подмаренника. Использование таких штаммов, в виде пропагул, адсорбированных на соломе, оставленной на стерне, позволит восстанавливать супрессивность почвй понижать всхожесть семян сорняков. Разработана модель регуляции уровня антагонистической активности изолятов Trichoderma на основе культивирования гриба на отходах пищевой промышленности.

Тип взаимоотношения с растением изолятов Trichoderma -антагонистов к фитопатогенным грибам - определяется типом организма -эдификатора, инфицированностью эндогенными возбудителями заболеваний и физико-химическими характеристиками почв. Для изучения взаимоотношений с зерновыми, зернобобовыми и овощными культурами были использованы местные районированные сорта, инфицированные эндогенными возбудителями заболеваний. Преобладающим типом взаимоотношения местных изолятов Trichoderma является отрицательное воздействие на растения, связанное с активацией эндогенных фитопатогенных грибов при интродукции микромицетов-антагонистов. Тип взаимоотношений с растением определяется стадией жизненного цикла, концентрацией фитотоксичных метаболитов, индукторами синтеза метаболитов и условиями взаимоотношений, в зависимости от сорбента, внешним антропогенным фактором (минеральное удобрение или известкование) и гетерогенностью популяции.

Разработана концепция регуляции типов взаимоотношений Trichoderma с растениями с целью (а) стимуляции сельскохозяйственный культур (б) снижения почвоутомления и, (в) подавления развития сорняков в почвах разного типа. Роль выделенных природных изолятов Trichoderma заключается в сукцессионных изменениях структуры растительного сообщества.

Для разработки биопрепарата необходимо соблюдение условия стабильности культурально-морфологических признаков Trichoderma. Установлено, что тип экологической ниши определяет морфометрические и кинетические параметры изолятов Trichoderma. Сравнительный анализ ( размеров конидий изолятов, выделенных из эталонных почв, антропогенных ландшафтов и современных горизонтов почв показал, что тенденция уменьшения размеров конидий изолятов является адаптационным механизмом Trichoderma. Предлагается методология регуляции популяционной кинетики интродуцированных видов Trichoderma в различных типах экологических ниш: тепличных грунтах, выщелоченном черноземе и серой истощенной лесной почве.

Использование биоудобрений на основе разных видов и изолятов Trichoderma в различных типах почв приводит к изменению биологической активности почвы. Уровень азотфиксации в почве зависел от вида и типа клонального расщепления Trichoderma. Аналогическая зависимость показана для респираторной активности почв.

Мониторинг общей биологической активности почвы на фоне биоудобрения на основе Trichoderma показал, что биологическая активность зависела от стадии сукцессии, типа антропогенного воздействия и типа почвы. Последействие биоудобрения зависело от типа севооборота и типа компостов на основе ООС города Казани, отходов животноводческих комплексов. Созданный нами комплексный препарат, представляющий собой микромицетное-бактериальное сообщество из изолята Trichoderma и бактерий рода Rhizobium, снижал инфекционный фон почвы и снижал поражённость семенными инфекциями. Препарат индуцировал резистентность растений к листово-стебельным инфекциям.

Разработан молекулярно-генетический протокол для регистрации и контроля интродуцированного вида Trichoderma в составе биокомпоста. Использование данного протокола позволило доказать стабильность интродуцированного изолята Trichoderma в различных условиях экологической ниши под давлением различных доз тяжелых металлов. Автор выражает признательность за участие в выполнении ряда разделов работы аспирантам КГУ Тухбатовой Р.И., Халлилуллиной А.К., Тазетдиновой Д.И., Тарасову Д.В., доцентам кафедры биохимии КГУ Аскаровой А.Н. и Фаттаховой А.Н., заведующей лабораторией Института микробиологии РАН им. С.Н.Виноградского, заслуженному деятелю науки РФ Феофиловой Е.П.; заведующему кафедрой микологии и альгологии д.б.н. Дьякову Ю.Т., д.б.н. Лихачеву А.В., к.б.н. Александровой А.В., д.б.н. Марфениной О.Е., сотруднику Института химической инженерии в Вене д.б.н. Дружининой И.А. и д.с.-х. н. Ведерникову Н.М. и сотруднику лаборатории ботаники и микологии Научного Центра сельскохозяйственный исследований, Мэриленд (США) доктору Самуэльсу Г. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.00 1.04.98 «Биосинтез, биогенез, классификации, физиологических функций новых микробных ферментов и возможные области их практического применения и при поддержке АН РТ в рамках грантов: «Возможности получения экологически чистого корма для животноводства Республики Татарстан на фоне техногенного загрязнения агроландшафтов» ( 2000-2001 гг., № 04-4, 5-83/2000-2002(ф)); «Разработка ( микробиологических методов снижения содержания токсинов в кормовых культурах, культивируемых в РТ» (2002 г., № 04-4, 4-195/2003(ф)); «Экологически безопасные препараты - регуляторы роста микроорганизмов и растений» (№ Е02-6, 0-140); Издание книги «Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение» (2004 г., № 03-3, 7-250/2004(ф)); «Микробиологический мониторинг заповедных и антропогенных ландшафтов РТ и определение эффективной, экологически безопасной нормы биопестицида для восстановления бедных, нарушенных почв» , (2005 г., №09-9.3-231 / 2004 (ф); и в рамках Программы развитие приоритетных направлений науки РТ на 2001-2005 годы № 8470 - 22-19 «Система почвенно-экологического мониторинга лесных питомников РТ» № 187. Выделены и задепонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН штаммы, обладающие рост стимулирующей активностью по отношению к растениям и антагонистической активностью к возбудителям заболеваний огурца: Trichoderma harzianum F-437, Trichoderma harzianum F-438, Trichoderma harzianum F-432.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Алимова, Фарида Кашифовна, Казань

1. Александрова А.В. Грибы рода Trichoderma Автореф. дис.канд.биол.наук. - М.: МГУ, 2000. - 20с.

2. Александрова А.В. Первая находка Trichoderma saturnisporum в России / А.В. Александрова, JI.JI. Великанов // Микол. и фитопатол. -1999. Т. 33, вып. 5.-С. 304-306.

3. Александрова А.А. Исторический обзор и современная система рода Trichoderma!к А. Александрова, Л.Л.Великанов И.И. Сидоров // ,, Микология и фитопатология. — 2004. — Том 38, вып.1.— С. 3-23.

4. Алимова Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma. -Казань: Унипресс:ДАС, 2006. С.268.

5. Борисов А.В. Развитие почв пустынно-степной зоны Волго-Донского междуречья за последние 5000 лет. Автореф. Дисс. . канд.биол.наук. -М., 2002.-23 с.

6. Великанов Л.Л. Роль грибов в формировании мико- и микробиоты почвестественных и нарушенных биоценозов и агроценозов. Дисс. д.б.н.-М., 1997.-547 с.

7. Галстян А.Ш. Ферментативная активность почв Армении. Ереван: Айастан, 1974. - 275 с.

8. Глушко Е.В. Историко-географические исследования ландшафтов Западного Ирака по космическим снимкам // Известия ВГО. 1990. - Т. 122.-Вып.З.-С. 255-262.

9. Ю.Горленко М.В. Все о грибах / Л.В. Гарибова, И.М. Сидорова, Г.Л. Сизова, ГД. Успенская М.: Лесная промышленность, 1985. - С.280.

10. П.Гринько Н.Н. Биотехнологические аспекты культивирования штамма Thrichoderma harzianum. Rifai ВКМ Б-2477Д // Вестник Российской Академии сельскохозяйственных наук. 2004. - №1. - С. 57-61.

11. Гринько Н.Н. Влияние фунгицидов на филлоплану огурца / Н.Н. Гринько, Г.Д. Успенская // Защита растений. -1987. №8. - С. 37.

12. Гришкан И.Б. Почвенные микромицеты ольховников в бассейнео верховий Колымы // Микология и фитопатология, 1995. -Т.29. Вып.2. -С.1-6.

13. Громовых Т.Н. Фитопатогенные микромицеты сеянцев хвойных в Средней Сибири: видовой состав, экология, биологический контроль // Автореф. диссертации. доктора биологических наук. Москва, 2002.

14. Демкин В.А. Палеопочвоведение и археология: интеграция в изучении истории природы и общества. Пущино: НТИ ПНЦ РАН. -1997. 213 с.

15. Демкина ТС. Микробные сообщества палеопочв археологических памятников пустынно-степной зоны / ТС. Демкина, А.В. Борисов, В.А. Демкин // Почвоведение. 2000. - № 9. - С. 1117-1126.

16. Демкина ТС. Палеопочвы и природная среда Северных Ергеней в эпохи энеодита и бронзы (IV-II тыс. до н.э.) / ТС. Демкина, А.В.Борисов, В .А. Демкин // Почвоведение. 2003. - № 6. - С. 655-669

17. Добровольская Т.Г. Бактериальное разнообразие почв: оценка методов и возможностей, перспектив / Т.Г. Добровольская, JI.B. Лысак, Г.М. Зенова, Д.Г. Звягинцев // Микробиология. 2001. - Т. 40. - №2. - С. 149-167.

18. Добровольский Г.В. Почва, микробы и азот в биосфере / Г.В. Добровольский, М.М. Умаров // Природа. 2004. - № 6. - С. 15-22.

19. Дунаевский Я.Е. Секретируемые ферменты мицелиальных грибов: регуляция секреции и очистка внеклеточной протеиназы Trichoderma harzianum / Я.Е. Дунаевский, Т.Н. Грубань, Г.А. Белякова, М.А. Белозерский // Биохимия. -2000. Т. 65. - Вып. 6. - С. 848-853.

20. Дьяков Ю.Т. Вегетативная несовместимость у фитопатогенных грибов / Ю.Т. Дьяков, А.В. Долгова. М.: МГУ, 1995. - С.5 - 14.

21. Звягинцев Д.Г. (ред.) Методы почвенной микробиологии и биохимии. М.: Из-во МГУ, 1980.

22. Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ. Прикладная биохимия и микробиология. -1971. Т. 7. - №2. - С.225-228.

23. Квасенков О.И. Способ приготовления углеводсодержащего 0 желирующего концентрата для кондитерских изделий / О.И. Квасенков, Р.И. Шаззо. 2001. Патент РФ (19) RU(ll) 2 254 026 (13) С2 (51) МПК 7

24. А 23 L 1/0524,1/06, А 21 D 2/36, С 12 Р 1/02 СПб.: ГИОРД. С. 204-205.

25. Коломбет Л.Б. Биологическая эффективность Trichoderma asperellum GJS 03-35 и дрожжей Criptococcus nadoensis ОН 182.9 // Микология и фитопатология. 2005. - Т. 39. - Вып.5. - С. 80-88.

26. Коломбет Л.В. Микофунгицид препарат на основе Т. viride для борьбы с болезнями растений / Л.В. Коломбет, С.К. Жиглецова, В.В. Дербышев, Д.В. Ежов, Н.И. Косарева, Е.В. Быстрова // Прикладная биохимия ио микробиология. - 2001. - Т.37. - №1. - С. 110-114.

27. Коломникова В.И. Влияние триходермина на численность возбудителей корневых гнилей в почве / В.И. Коломникова, М.М.Трушко, Н.И. Рыжова // Защита раст. -1995. №3. - С.19.

28. Курини С. Грибы рода Trichoderma, их биотические связи и проблемы интродукции в почвы. Автореф. дис. .канд. биол. наук. -М., 1991. 26 с.

29. Курицина Д.С. Новые виды грибов из рода Sporotrichum Fr. и Trichoderma Fr., изолированных с произведений изобразительногоискусства / Д.С. Курицина, Т.П. Сизова // Микология и фитопатология. -1967. Т.1. - № 4. - С.342-344.

30. Лугаускас А.Ю. Почвенные грибы в микробных сообществах в разных экологических условиях // Микробные сообщества и их функционирование в почве. Киев: Наукова думка, 1981. - С.187-191.

31. Маркович Н.А. Литические ферменты Trichoderma и их роль при защите растений от грибных болезней (обзор) / Н.А. Маркович, Г.Л. Кононова // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. - Т. 39. - № 4. - С. 389400.

32. Марфенина О.Е. Антропогенная экология почвенных грибов. М.: Медицина для всех, 2005. - 196 с.

33. Марьин Г.С. Защита растений и сохранение экологического равновесия в экосистемах / Г.С. Марьин, Г.В. Глазырина// АПК: пробл., поиски, решения. Йошкар-Ола: Map. гос. ун-т, 1996. - С.79-81. о

34. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учебное пособие / Под ред.Д.Г.Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 312 с.

35. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. М.: Изд-во МГУ, 1988. - 220 с.

36. Мирчинк Т.Г. Характеристика комплексов грибов некоторых почвенных типов Советского Союза / Т.Г. Мирчинк, Л.Н.Степанова, О.Е.Марфенина, С.М.Озерская//Вест. МГУ. Почвоведение.- 1981.-№1 -С.19-41.

37. Мишустин Е.Н. Микрофлора почв Севера СССР / Е.Н. Мишустин, Мирзуева В.А. // В кн.: Микрофлора почв северной части СССР. М., 0 1966.-С.55-65.

38. Мишустин Е.Н. Эколого-географические закономерности в распространении почвенных микроскопических грибов / Е.Н. Мишустин, Пушкинская О.П. // Изв. АН СССР, сер.биол. -1960. № 5 - С.87-92.

39. Новикова И.И. Влияние новых биопрепаратов, созданных на основе штаммов микробов-антагонистов, на комплекс возбудителей корневых гнилей огурца / И.И. Новикова, А.И.Литвиненко, Г.В. Калько // Микол. и фитопатол. -1995. № 5-6. - С. 46-53.

40. Панников Н.С. Кинетика роста микроорганизмов: общие закономерности^, и экологические приложения. М.: Наука, 1991. - 311 с.

41. Перельман В.И. Краткий справочник химика М.: Изд-во химич. литер., 1963.-620 с.

42. Пивкин М.В. Микобиота тиса остроконечного (Taxus cuspidata Siebold et Zucc.) в Приморском крае / М.В. Пивкин, Л.Н. Егорова// Микология и фитопатология, 1998. Т.32. Вып.2. - С.34-39.

43. Сазонов С.Н. Оценка микробиологического сотояния дерново-подзолистой почвы, выведенной из сельскохозяйственного использования

44. С.Н. Сазонов, Н.А. Манучарова, М.В. Горленко, А.В. Терехов, М.М. Умаров // Почвоведение. 2004. - № 3. - С. 373-377.

45. Салина О.А. Виды грибов рода Trichoderma в почвах Литовской ССР // Микология и фитопатология, 1981. Т.15. -Вып.2. - С. 101-105.

46. Салина О.А. Грибы рода Trichoderma Pers.:Fr. в окультуренных почвах Литовской ССР. Дис. .канд. биол. наук, М., 1988. -С.269.

47. Сейкетов Г. Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике. Алма-Ата: Наука, 1982. - 248 с.

48. Селивановская СЛО. Микробная биомасса и и биологическая активность серых лесных почв при внесении осадков городских сточных вод / С.Ю. Селивановская, В.З.Латыпова, Ф.К. Алимова // Почвоведение. 2001.-№2.-С. 227-233.

49. Сидорова И.И. Биологические методы борьбы с фитопатогенными грибами // Итоги науки и техники. Сер. Защита раст. М.: ВИНИТИ, о 1980.-Т. 2.-С. 116-157.

50. Сизова Т.П. Некоторые закономерности распространения почвенных грибов // Микология и фитопатология, 1977. Т.Н. - №5. - С.377-381.

51. Скворцов Е.В. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma / Е.В. Скворцов, Ф.К. Алимова, Д.М. Абузярова // Вестник казанского технологического университета. Казань: Отечество. - №1. - 2005. - С. 251-255.

52. Сорокин Н.Д. Количественная оценка микробиологической активности почв // Почвоведение.-1993.- №8. -С.99-102.

53. Ташпулатов Ж. Грибы рода Trichoderma Pers.: Fr. и их использование при переработке отходов растениеводства // Автореферат дис. д.б.н. М.,0 1987.-С.45.

54. Титова Ю.А. Двухэтапная биоконверсия отходов с помощью Pleurotus ostreatus и Trichoderma harzianum / Ю.А. Титова, Л.Б. Хлопунова,

55. Д.В. Коршунов // Микология и фитопатология. 2002. -Т. 36. - Вып.5. - С. 64-70.

56. Филипчук О.Д. Использование супрессивности почвы в защите растений от возбудителей инфекций / О.Д. Филипчук, М.С. Соколов, Т.В. Павлова //Агрохимия. -1997. № 8.- С. 81 -92.

57. Шишлина Н.И. Потенциальный сезонно-хозяйственный цикл носителей катакомбной культуры северо-западного Прикаспия: проблема реконструкции // Труды Государственного Исторического музея. 2000. -Вып.120.-С.54-71.

58. Штерниш М.В. Грибные препараты / М.В. Штерниш, Ф.С. Джалилов, И.В. Андреева, О.Г. Томилова // Биологическая защита растений. М: Колос, 2004.-С. 195-198.

59. Яблоков В.Н. Ядовитая приправа. М.: Мысль, 1990. - 125с.

60. Agut М. Keratinophilic Fungi from Soil of Brittany, France / M. Agut, M. Bayo, J. Larrondo, M.A. Calvo // Mycopathologia. 1995. - Vol. 129. -№2.- P. 81-82.

61. Ahmad I. Interaction of Soil Microflora with the Bioherbicide Phosphinothricin / I. Ahmad, D. Malloch // Agriculture Ecosystems and Environment. -1995. Vol. 54. - № 3. - P. 165-174. о

62. Ahmed S. Molecular Cloning of Cellulase Genes from Trichoderma harzianum / S. Ahmed, N. Aslam, F. Latif, M.I. Rajoka, A. Jamil // Frontiers in Natural Product Chemistry. 2005. - Vol. 1. - № 1, January. - P. 73-75.

63. Ait-Lahsen H. An antifungal Exo-a-l,3-glucanase (AGN13.1) from the biocontrol fungus Trichoderma harzianum / H. Ait-Lahsen, A. Soler, M. Rey, J. De La Cruz, E. Monte, A. Llobell I I Appl. Environ. Microbiol. 2001. -Vol. 67.-P. 5833-5869.

64. AntaI Z. Complete DNA Sequence and analysis of a mitochondrial plasmid in the mycoparasitic strain Trichoderma harzianum T95 / Z. Antal, L.0 Manczinger, L. Kredics, F. Kevei, E. Nagy // Plasmid. 2002. - Vol. 47. - P. 148-152.

65. Anusuya D. Solubilization of Phosphorus by Trichoderma-Viride / D. Anusuya, R. Jayarajan // Current Science 1998. - Vol. 74, № 5. - P. 464466.

66. Aranguren M. Evaluation in vitro de tres aislados de Trichodema spp. Como antagonistas de patogenos post-cosecha de los frutos citricas / M. Aranguren, A. Gracia, H.Grillo // Cent. Agr: Rev. Min educ. Super. Rep. Cuba. -1994. -Vol.1. -P.42-46.

67. Arst J.H.N. pH regulation in Aspergillus and parallels with higher eukaryotic regulatory systems / J.H.N. Arst, M.A. Penalva // Trends Genet. 2003. - № 19.-P. 224-231.

68. Baker E.N. Crystals of family 11 xylanase II from Trichoderma longibrachiatum that diffract to atomic resolution / E.N. Baker, Z. Dauter I I Acta Cryst. 2004. -Vol. D60.-P. 1275-1277.

69. Benftez T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains / T. Benitez, AM. Rincon, M.C. Limon, A.C. Codon // International Microbiology. 2004. - № 7. -P. 249-260.

70. Biely P. Enzymology of hemicellulose degradation / P. Biely, M. Tenkanen // Harman G.E., Kubicek C.P. (eds.). Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. London: Taylor and Francis Ltd., 1998. P. 25-47.

71. Bissett J. Trichoderma atroviride // Can. J. Bot. -1992. №70. - P. 639-641.

72. Bissett J. Seven new taxa of Trichoderma from Asia / J.Bissett, G.Szakacs, C.A.Nolan, I.S.Druzhinina, C.M.Kullnig-Gradinger, C.P.Kubicek // Can. J. Bot. 2003.- № 81. - P. 570 -586.

73. Bissett J. A revision of the genus Trichoderma. II. Infrageneric classification. I I Can. J. Bot. 1991a - № 69. - P. 2357-2372.

74. Brownold E. The effect of Trichoderma harzianum on honey bee survival / E. Brownold, S.Flanders //http://www.nysipm.comell.edu/ publications/trich/trich.html

75. Castle A. Morphological and molecular identification of Trichoderma isolates0 on North American mushroom farms / A. Castle, D. Speranzini, N. Rghei, G. Aim, D. Rinker // Appl. Environ. Microbiol. -1998. Vol. 64. - № 1. - P. 133137.

76. Chaverri P. Hypocrea / Trichoderma (Ascomycota, Hypocreales, Hypocreaceae): Species with green ascospores / P. Chaverri, G.J. Samuels // Stud. Mycol. 2004. - V. 48. - P. 1-116.

77. Chaverri P. Hypocrea phyllostachydis and its Trichoderma anamorph, a new bambusicolous species from France / P. Chaverri, F. Candoussau, G.J. Samuels // Mycol. Progr.- 2004.- No 3. P. 29 -35.

78. Chaverri P. Hypocrea/Trichoderma (Ascomycota, Hypocreales, Hypocreaceae): Species with green ascospores / P. Chaverri, G.J. Samuels // Stud. Mycol. -2004. V. 48. - P. 1-116.

79. Chaverri P. Hypocrea/Trichoderma: species with conidiophore elongations and green conidia / P. Chaverri, L.A. Castlebury, B.E. Overton, G.J. Samuels // Mycologia. 2003. -№ 95. - P. 1100-1140.

80. Chet F. Ecology and Management Soilborne plant pathogens / F. Chet, Y.Henis.-1985.-P. 110-112.

81. Cobos A. Effect of polyhydroxylic cosolvents on the thermostability and activity of xylanase from Trichoderma reesei QM9414 / A. Cobos, P. Estrada // Enzyme and Microbial Technology. 2003. - V. 33. - P. 810-818.

82. Cotxarrera L. Use of sewage sluge compost and Trichoderma asperellum isolates to supress Fusarium wilt of tomato / L. Cotxarrera, M.I. Trillas-Gay, C. Steinberg, C. Alabouvette // Soil Biol, and Biochem. 2002. - № 34. - P. 467-476.

83. Сидорова И.И. Макросистема грибов: методология и изменения последнего десятилетия. В сб.: Новое в систематике и номенклатуре грибов / Под ред. Ю.Т.Дьякова, Ю.В. Сергеева М.: Изд-во «Национальная академия микологии. Медицина для всех», 2003. - С.3-15. о

84. Danielson R.M. Carbon and nitrogen nutrition of Trichoderma / R.M. Danielson, C.B. Daney // Soil Biol. Biochem. 1973c. - Vol. 5. -№ 5. P. 505-515.

85. Danielson R.M. The abundance of Trichoderma propagules and the distribution of species in forest soils / R.M. Danielson, C.B. Daney // Soil Biol. Biochem. -1973 a. Vol. 5. - № 5. - P. 485 - 494.

86. Danielson R.M. Effects of nutrients and activity on phialospore germination Trichoderma. / R.M. Danielson, C.B. Daney // Soil Biol. a.Biochem., 1973 d. - Vol.5.-№ 5.-P. 517-524.

87. Danielson R.M. Non nutritional factors affecting the growth of Trichoderma in culture / R.M. Danielson, C.B. Daney // Soil Biol. a.Biochem. -1973 b. Vol. 5.-№5.-P. 495-504.

88. Delgado-Jarana J. Glucose uptake in Trichoderma harzianum: role of gttl / J. Delgado-Jarana, M.A. Moreno-Mateos, T. Benitez // Euk Cell. 2003. -№2.-P. 708-717.

89. Dingley J.M. Life history studies in the genus Hypocrea Fr. // Transactions and Proceedings of the Royal Sociandy of New Zealan 1957. - № 84. -0 P. 689-693.

90. Dodd S.L. Examination of Trichoderma phylogenies derived from ribosomal DNA sequence data / S.L. Dodd, R.N. Crowhurst, A.G. Rodrigo, G.J. Samuels, R.A. Hill, A. Stewart // Mycol. Res. 2000. - Vol. 104. - P. 23-34.

91. Dodd S.L. Taxonomy and phylogenetic relationships of two species of Hypocrea with Trichoderma anamorphs / S.L. Dodd, L.Sarah, E.Lieckfeldt, P. Chaverri, B.E.Overton, G.J. Samuels // Mycol. Progr. 2002. - № 1. - P. 409428.

92. Doi N. Note on Trichoderma and its allies 1. A list of teleomorphic species with Trichoderma or its allied anamorphs hitherto known / N. Doi, Y. Doi // Bull. Natl. Sci. Mus. Tokyo, Ser. B, (Bot.). 1979. - Vol. 5, -№ 4. - P. 117123.

93. Doi N. Note on Trichoderma and its allies 4. A list of species names proposed for the genus Trichoderma / N. Doi, Y. Doi // II Bull. Natl. Sci. Mus. Tokyo, Ser. B, (Bot.). -1986. Vol. 12. - № 1. - P. 1-15.

94. Doi Y. Notes on Trichoderma and its allies 3. Comparison of three strains of Trichoderma viride aggr. and their teleomorphs / Y. Doi, N. Doi, K. Toyozawa// Bull. Natl. Sci. Mus. Tokyo, Ser. B, (Bot.). 1984. - Vol. 10.-P. 73-85.

95. Druzhinina I. Нуросгеа flavoconidia, a new species with yellow conidia from Costa Rica / I. Druzhinina, P.Chaverri, P.Fallah, C.P.Kubicek, G.J. Samuels // Stud. Mycol 2004. - № 50. - P. 401- 407.

96. Druzhinina I. A DNA-barcode for strain identification in Trichoderma 1° I. Druzhinina, A. Koptchinski, M. Komon, J. Bisset, G. Szakacs, C.P. Kubicek // J. Zhejiang Univ. SCI 2005. - V. 6B. - № 2. - P.100-112.

97. Elad Y. Biological control of grape grey mould by Trichoderma harzianum // Crop. Protec. -1994.- № 13. P.35-38.

98. Elad Y. Mechanisms involved in the biological control of Botrytis cinerea incited diseases. Eur J Plant Pathol. -1996. № 102. - P.719-732.

99. Elmholt S. Fungi in Danish soils organic and conventional farming / S. Elmholt, R. Labouriau//Agriculture, Ecosystem and Environment. 2005.- 0 Vol. 107.-P. 65-73.

100. Ezzi M.I. Biodegradation of cyanide by Trichoderma spp. and Fusarium spp. / M.I. Ezzi, J.M. Lynch // Enzyme and Microbial Technology. 2005. - Vol. 36.-P. 849-854.

101. Franco P.F. Production and characterization of hemicellulase activities from Trichoderma harzianum Strain T4. / P.F. Franco, H.M. Ferreira, E.X. Filho // Biotechnol Appl Biochem. 2004 - V. 6. - P. 32-40.

102. Gams W. Morphology and identification of Trichoderma / W. Gams, J. Bissett // Trichoderma and Gliocladium. Vol. 1. Basic Biology, Taxonomy and Genetics (C. P. Kubicek and G. E. Harman eds). London: Taylor and Francis. 1998.-P. 3-34.

103. Gams W. What exactly is Trichoderma harzianum / W. Gams, J. Bissett // Mycologia. -1998. Vol. 90. - № 5. - P. 901-913.

104. Ghisalberti E.L. Antifungal Antibiotics Produced by Trichoderma spp. / E.L. Ghisalberti, K. Sivasithamparam //Soil Biol. Biochem. 1991. - Vol. 23. - № 11.-P. 1011-1020.

105. Gomez I. Genetic diversity and vegetative compatibility among Trichoderma harzianum isolates / I. Gomez, I. Chet, A. Herreraestrela // Molecular and General Genetics. -1997. Vol. 256. - P. 127-135.

106. Harman G.E. Combination of fungul cell degrading enzyme and fungul cell membrane affecting compound / G.E. Harman, M. Lorito, A. Di Pietro, C.K. Hayes, F. Scala, C.P. Kubicek // US Patent 6,512,166, issued Jan.28,2003.

107. Harman G.E. Myths and dogmas of biocontrol. Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T22 // Plant Dis. 2000. -Vol. 84.-P. 377-393.

108. Harman G.E. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts j / G.E. Harman, C.R. Howell, A. Viterbo, I. Chet, M. Lorito // Nature Reviews. -2004.-Vol. 2.-P. 43-56.

109. Heraux F.M.G. Combining Trichoderma v/raw-inoculated compost and a rye cover crop for weed control in transplanted vegetables / F.M.G. Heraux , S.G. Hallett, S.C. Weller // Biological Control. 2005. - Vol. 34. - P. 21-26.

110. Hofmann K. Oxidation of triphenylarsine to triphenylarsineoxide by Trichoderma harzianum and other fungi // K. Hofmann, E. Hammer, M. Kohler, V. Bruser I I Chemosphere. 2001. - Vol. 44. - P. 697-700.

111. Howell C.R. Induction of terpenoid synthesis in cotton roots and control of Rhizoctonia solani by seed treatment with Trichoderma virens / C.R. Howell, L.E. Hanson, R.D. Stipanovic, L.S. Puckhaber // Phytopathology. 2000. -Vol. 90.-P. 248-151.

112. Iyengar S.R. In-vessel composting of household wastes / S.R. Iyengar, P.P. Bhave // Waste Management. 2005.

113. Kindermann J. Phylogeny of the genus Trichoderma based on sequence analysis of the internal transcribed / J. Kindermann, Y.El-Ayouti, G.J. Samuels,

114. C.P. Kubicek // Fungal Genet. Biol. -1998. Vol.24. - P.298-309.

115. Knudsen G.R. Potential for biocontrol of Sclerotinia Sclerotiorum Through colonization of sclerotinia by Trichoderma harzianum / G.R. Knudsen,

116. D.I.Eschen, L.M.Danduranol // Plant. Disease. 1991. - V.75, No5. - P.446-470.

117. Konig J. Determination of xylanase, glucanase, and cellulase activity / R.Grasser, H.Pikor, K.Vogel // Anal Bioanal Chem. 2002.- 374.-P.80-87.

118. Krantzrulcker C. Adsorption of lib-Metals by 3 Common Soil Fungi-Comparison and Assessment of Importance for Metal Distribution in Natural о Soil Systems / C. Krantzrulcker, B.Allard, J.Schnurer // Soil Biol Biochem 1996. Vol. 28. - № 7. - P. 967-975.

119. Krantzrulcker C. Interactions Between a Soil Fungus, Trichoderma-Harzianum, and lib Metals Adsorption to Mycelium and Production of Complexing Metabolites / C. Krantzrulcker, B.Allard, J.Schnurer // Biometals 1993. - Vol. 6. - №4. - P. 223-230.

120. Kredics L. Trichoderma Strains with Biocontrol Potential / L. Kredics, Z. Anta, L. Manczinger, A. Szekeres, F. Kevei, E. Nagy // Food Technol. Biotechnol. 2003. -№ 1. - Vol. 41. - P. 37-42.

121. Krishna S.H. Studies on the production and application of cellulose from Trichoderma reesei QM-9414 / S.H. Krishna, K.C.S. Rao, J.S. Babu, D.S. Reddy // Bioprocess Engineering. 2000. - № 22. - P. 467-470.

122. Kubicek C.P. Trichoderma: from genes to biocontrol / C.P. Kubicek, R.L. Mach, C.K. Peterbauer, M. Lorito // J. of Plant Pathology. 2001. - Vol. 83. - № 2.-P. 11-23.

123. Kubota Terumasa, Hokkaido Green Kosan Inc. Trichoderma harzianum SK-55 fungus, fungicide containin it, and method of manufacture of the same and its use // Пат. 5422107 США, МКИ A01N 63/00, A01N 1/00 № 172273; Заявл. 23.12.93; Опубл. 06.06.95.

124. KuIInig C.C. Molecular identification of Trichoderma species from Russia, Siberia and the Himalaya / C.Kulling, G.Szakacs, C.P.Kubicek // Mycol. Res. -2000.-V. 104.-P. 1117-1125.

125. Kullnig-Gradinger G.M. Phylogeny and evolution of the genus Trichoderma a multisene approach / G.M. Kullnig-Gradinger, G.Szakacs, C.P. Kubicek //Mycol Res. 2002. - № 106. - P.757-767.

126. Lieckfeldt E. A morphological and molecular perspective of Trichoderma о viride: is it one or two species / E. Lieckfeldt, G.J.Samuels, H.I. Nirenberg, O.Petrini //. Appl Environ Microbiol. -1999, № 65. - P.2418-2428.

127. Lieckfeldt E. An evaluation of the use of ITS sequences in the taxonomy of the Hypocreales / E. Lieckfeldt, K.A. Seifert // Stud Mycol. 2000. - № 45. -P.35-44.

128. Limon M.C. Increased antifungal and chitinase specific activities of Trichoderma harzianum CECT 2413 by addition of a cellulose binding-domain

129. M.C. Limon, M.R. Chacon, R. Mejias, J. Delgado-Jarana, A.M. Rincon, A.C. 0 Codon, T. Benitez// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. - № 64. - P. 675-685.

130. Lynd L.R. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology / L.R. Lynd, P.J. Weimer, W.H. van Zyl, I.S. Pretorius // Microbiol. Mol. Biol. Rev.-2002.-Vol. 66. P. 506-577.

131. Mach R.L. Regulation of gene expression in industrial fungi: Trichoderma / R.L. Mach, S. Zeilinger I I Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - Vol.60. - P. 515-522.

132. Mantyla A. Industrial mutants and recombinant strains of Trichoderma reesei

133. A. Mantyla, M. Paloheimo, P. Suominen // Harman G.E., Kubicek C.P. (eds.). ^ Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Enzymes, biological control and commercial application. Taylor and Francis Ltd., London, 1998. P. 291-309.

134. MoIIa A.H. Evaluation of solid-state bioconversion of domestic wastewater sludge as a promising environmental-friendly disposal technique / A.H. Molla, A.FakhruT-Razi, Md.Z. Alam // Water Res. 2004. - Vol. 38. - P. 4143-4152.

135. Muthumeenakshi S. Intraspecific molecular variation among Trichoderma harzianum isolates colonizing mushroom compost in British Isles / S. Muthumeenakshi, P.R. Mills, A.E.Brown, D.A. Seaby // Microbiology. -1994. -№140.- P. 769-777.

136. Ordaz-Ortiz J.J. Structural variability of arabinoxylans from wheat flour. Comparison of water-extractable and xylanase-extractable arabinoxylans / J.J. Ordaz-Ortiz, L. Saulnier // Journal of Cereal Science. 2005. № 42. - P. 119-125.

137. Papavizas G.C. Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology and potential for biocontrol. Annu Rev Phytopathol. -1985. № 23. - P.23-54. G

138. Parshikov I.A. Formation of conjugates from ciprofloxacin and norfloxacin in cultures of Trichoderma viride / I.A. Parshikov, J.D. Moody, J.P. Freeman, J.O. Lay Jr., A.J. Williams, T.M. Heinze, J.B. Sutherland // Mycologia. 2002. -Vol. 94.-P. 1-5.

139. Rehner S.A. Molecular sytematics of the Hypocreales: a teleomorph gene phylogeny and the status of their anamorphs / S.A. Rehner, GJ.Samuels // Canadia J. of Botany -1995. V.73, № l. p. 816-823.

140. Rifai M.A. A revision of the genus Trichoderma // Mycol. Pap. 1969. -Vol. 116.-P. 1-56.

141. Rossman A.Y. Genera of Bionectriaceae, Hypocreaceae and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycandes) / A.Y. Rossman, GJ.Samuels, C.T. Rogerson, R.Lowen // Studies in Mycolog. -1999. №42. - P. 1-248.

142. Samuels G.J. The Hypocrea schweinitzii complex and Trichoderma sect. Longibrachiatum. / GJ. Samuels, O. Petrini, K. Kuhls, E. Lieckfeldt,

143. C.P. Kubicek I I Studies in Mycology -1998. -№ 41. P.l-54.

144. Samuels G.J. Trichoderma ovalisporum: a new endophytic species with potential to control frosty pod rot of cocoa // Mycol. Prog. 2004. - V.3, №3. -P. 257-263.

145. Samuels G.J. Trichoderma species associated with the green mold epidemic о of commercially grown Agaricus bisporus / G.J. Samuels, S.L. Dodd, W. Gams, L.A. Castlebury, 0. Petrini // Mycologia. 2002. - № 94. - P.146-170.

146. Samuels G.J. Trichoderma: a review of biology and systematics of the genus // Mycol. Res. -1996. Vol. 100. - P. 923-935.

147. Singh A. Composting of a crop residue through treatment with microorganisms and subsequent vermicomposting / A. Singh, S. Sharma // Bioresource Technology. 2002. - Vol. 85. - P. 107411.

148. Smith W.H. Forest occurrence of Trichoderma species emphasis on potential organochlori-ne (xenobiotic) degradation// Ecotoxicol. Environ. Safety. -1995. - Vol. 32. - № 2. - P. 179-183.

149. Strieker A.R. The cellulolytic and xylanolytic enzyme system of Trichoderma reesei is governed by Xyrl / A.R. Strieker, K. Grobtebner-Hain,0 R.L. Mach // 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium, Vienna, Austria. 2006.

150. Taylor J.W. Phylogenandic species recognition and species concepts in fungi / J.W. Taylor, DJ.Jacobson, S.Kroken, T.Kasuga, D.M.Geiser,

151. D.S.Hibbandt, M.C.Fisher //Fungal Genand. Biol. 2002-№ 31. - P. 21-32.

152. Thrane С. A tool for monitoring Trichoderma harzianum. I. Transformation with the GUS gene by protoplast technology / C. Thrane, M. Lubeck, H. Green, Y. Degefu, S. Allerup, U. Thrane, D.F. Jensen // Phytopathology. -1995. Vol. 85. - P.1428-1435.

153. Tiedje J.M. Opening the black box of soil microbal diversity / J.M. Tiedje, S. Asuming-Brempong, K. Nuesslein. T.L. Marsh, S.J. Flynn // Appl. Soil Ecol. -1999.-Vol. 13.-P. 109-133.

154. Torsvik V. Cell extraction method // Molecular Ecol. Manual. 1995. -Vol. 1.- №31. -P. 1-15.

155. Vargas-Garcfa M.C. Laboratory study of inocula production for composting processes / M.C. Vargas-Garcia, M.J. Lopez, F. Suarez, J. Moreno // Bioresource Technology. 2005. - Vol.- 96. - P. 797-803.

156. Veerkamp J. Los Hongos de Colombia. VIII. Some new species of soil fungi from Colombia / J. Veerkamp, W.Gams // Caldasia. 1983. - Vol. 13. -P. 709-717.

157. Vikineswary S. Growth of Trichoderma harzianum and Myceliophthora thermophila in palm oil sludge / S. Vikineswary, A.J. Kuthubutheen, A.A. Ravoof // W. J. of Microbiol. Biotechnol. 1997. - Vol. 13. - № 2. - P. 189-194. о

158. Viterbo A. Antifungal activity of a novel endochitinase gene (chit36) from Trichoderma harzianum Rifai TM / A. Viterbo, S. Haran, D. Friesem, O. Ramot,I. Chet // FEMS Microbiol. Lett. 2001. - Vol. 200. - P. 169-174.

159. Viterbo A. Significance of lytic enzymes from Trichoderma spp. in the biocontrol of fungal plant pathogens / A. Viterbo, O. Ramot, L. Chemin, I. Chet // Ant. van Leeuw. 2002. - Vol. 81. - P. 549-556.

160. Weaver M. Fitness, persistence, and responsiveness of a genetically engineered strain of Trichoderma virens in soil mesocosms / M. Weaver, ^

161. E. Vedenyapina, C.M. Kenerley // Applied Soil Ecology. 2005.

162. Weber J. Microbubble fermentation of Trichoderma reesei for cellulase production / J. Weber, F.A. Agblevor / Process Biochemistry. 2005. - Vol. 40.-P. 669-676.

163. Weiss T.J. The genesis and collapse of third millennium North Mesopotamia civilization / T.J. Weiss, M.-A. Courty // Science. 1993. - Vol.261. - P.995-1004.

164. Widden P. Fungal populations from forest soils in Southern Quebeck // Can. J. Bot, -1979. Vol.57. P.1324-1331. 0

165. Widden P. Seasonality of Trichoderma species in spruce forest soil / P. Widden, J.J. Abitbol // Mycologia. -1980. Vol. 72. - P.775-784.

166. Wildman H.G. Lithium-Chloride as a Selective Inhibitor of Trichoderma Species on Soil J Isolation Plates // Mycol. Res. 1991. - Vol. 95, DEC. - P. 1364-1368.

167. Woo S.L. Disruption of the ech42 (endochitinase-encoding) gene affects biocontrol activity in Trichoderma harzianum PI / S.L. Woo, B. Donzelli,

168. F. Scala, R. Mach, G.E. Harman, C.P. Kubicek, G. Del Sorbo, M. Lorito // Plant-Microb Interact. -1999. Vol. 12. - P. 419-429.

169. Xi В. Process kinetics of inoculation composting of municipal solid waste / B. Xi, G. Zhang, H. Liu // J. of Hazardous Materials. 2005. - V. B124. - P. 165172.

170. Xiong H. Xylanase production by Trichoderma reesei Rut C-30 grown on L-arabinose-rich plant hydrolysates / H. Xiong, N. von Weymarn, 0. Turunen, M. Leisola, 0. Pastinen // Bioresource Technology. 2005. - Vol. 96. - P. 753-759.

171. Yedidia I. Effect of Trichoderma harzianum on microelement concentrations and increased growth of cucumber plants / I. Yedidia, A.K. Srivastva, Y. Kapulnik, I. Chet // Plant Soil. 2001. - Vol. 235. - P. 235-242.

172. Zayed G. Bio-active composts from rice straw enriched with rock phosphate and their effect on the phosphorous nutrition and microbial community in rhizosphere of cowpea / G. Zayed, H. Abdel-Motaal // Bioresource Technology. -2005.-Vol. 96.-P. 929-935.

173. Zimand G. Use of -the RAPD Procedure for the Identification of Trichoderma Strains / G. Zimand, L.Valinsky, Y.Elad, I. Chet, S.M anu 1 i s // Mycol. Res. 1994. - Vol. 98. - P. 531-534.j

174. R141G158BI32 Q RI69G178B155 UR126G156BI22 i1. Ж Ш L j 12 R73G84B103

175. JMi ^ ШТ bw и I? ® 15 ^BfflW^ 4 i й 1 ' V<2 4 Я

176. Q v щШ&р КШ RM2GI55BI23 Jilongibrachiatutt Шш 21 R63G63B27 <jfli> J ,T. 1 o»ibrach iajpra \ 23 R66G59B2J

177. Изолят выделен на территории РТ)

178. Фото 5. Trichoderma asperellum FKAXT60. 1. Колония на PDA при T=28UC. 2. Конидиофоры на SNA. 3. Пустулы на семенах. 4. Конидиофора. 5. Фиалиды. 6. Конидии. (Изолят выделен на территории РТ).t