Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней"

На правах рукописи

КОЛОМБЕТ Любовь Васильевна

НАУЧНОЕ ОБОСНОВАНИЕ И ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ ГРИБНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЗАЩИТЫ

РАСТЕНИЙ ОТ БОЛЕЗНЕЙ

Специальность: 03.00.24 — Микология, 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2006

1м

-

Работа выполнена в Государственном Научном Центре Прикладной микробиологии и биотехнологии, п. Оболенск, Московская обл.

о Аг^Л-^ РОС . 57^ -А

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: Академик РАСХН Соколов 1Л.С.

XI ,, С. ц . с^ Л^Л ч^Л^-Ч

^ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: а ?

. ! Доктор биологических наук,

А I С \juuia_ - профессор, Заслуженный деятель науки РФ

* I Феофилова Е. П.

оА

£

Доктор биологических наук Лихачев А. Н.

Доктор биологических наук, профессор Джапилов Ф. С.-У.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР), Санкт-Петербург

Зашита диссертации состоится 12 мая 2006 г. в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, ауд. М-1, тел/факс: (495) 939- 43-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета, Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.А.Гусаковская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуцльцость исследований. Одним из перспективных продуцентов биопрепаратов являются почвенные грибы рода Trichoderma Pers.: Fr. Они способны подавлять развитие широкого спектра фитопатогенных грибов, синтезировать активные метаболиты, в качестве препаратов для растениеводства, медицины и ветеринарии (Backman, Rodriges-Kabana, 1975; Harman et al., 1981, Гаузе и др., 1983; Великанов, Сидорова, 1988; Егоров и др., 1999). Грибы рода Trichoderma обладают рострегули-рующей активностью, способствуют увеличению поглощения растением микро- и макроэлементов, стимулируют развитие на корнях растений азотфиксирующих бактерий (Harman, 2004). Эти уникальные свойства грибов рода Trichoderma обусловили внимание к ним, как к продуцентам биопрепаратов для растениеводства. Исходя из биологических особенностей гриба, первые препараты для коммерческого использования готовили на твердом носителе - торфе, соломе, зерне, либо выращивали гриб на поверхности жидкой питательной среды (Тулемисова, 1990; Твердюков и др., 1993; Тюльпанова и др. 1997, Новикова, 2005). Предложены также способы, совмещающие поверхностное и погруженное культивирование (Громовых, 2002). Однако такие способы производства малотехнологичны, трудоемки, имеется опасность аллергизации для работающего персонала.

Попытки создания препаратов на основе биомассы гриба, полученной при глубинном (погруженном) культивировании, способных к длительному хранению до последнего времени не имели успеха. В качестве препарата практически повсеместно используется культуральная жидкость (Tabachnik, 1989; Apsite et al, 1989; San Martin et al., 1997). Запатентована только одна жидкая форма биофунгицида на основе мицелия грибов (Третьяков и др., 1995). Такой препарат сохранял активность до трех месяцев при температуре не выше +10°С, что явно недостаточно для успешного коммерческого применения. Проблема разработки методологических подходов к процессам глубинного культивирования мицелиальных грибов и создания рецептуры препаратов для обеспечения стабильности и эффективности биомассы в процессе хранения и применения требовала серьезного научного исследования, которое проведено нами в период с 1991 по 2005 год.

Цель работы: Выбор и изучение штамма микромицета, обладающего высокой специфической активностью в отношении фитопатогенных грибов, и создание на его основе промышленного биопрепарата.

Задачи исследований:

1. Провести скрининг коллекции штаммов микромицетов различного происхождения на наборе тест-культур фитопатогенных грибов с целью выбора штамма, обладающего наибольшей антагонистической активностью к широкому кругу фитопатоге-нов.

2. Изучить биохимические, физиологические и технологические особенности штамма, особенности конидйогенеза при глубинном культивировании для обоснования оптимальной технологии производства.

3. Разработать технологию глубинного культивирования и товарную форму препарата на основе выбранного штамма.

4. Провести испытания экспериментальных образцов и опытных партий препарата против болезней растений на естественном и искусственном инфекционном фонах.

5. Изучить экологические аспекты применения нового препарата: совместимость с фунгицидами, влияние на биоразнообразие микромицетов при предпосевной обработке семян пшеницы, зависимость эффективности препарата от типа почвы и ее увлажненности.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые достигнут успех в создании технологии глубинного культивирования мицелиальных грибов, позволяющий получать их биомассу в виде мицелия, хлами-доспор и фиалоконидий на уровне коммерческой формы препарата.

Реализована инновационная методология ступенчатого скрининга перспективных штаммов-продуцентов антигрибных биопрепаратов с учетом физиологических особенностей микромицетов в условиях глубинного культивирования, требований к длительному хранению биопрепарата и особенностей технологий применения.

Практическая значимость работы

Созданы новые, экологичные средства защиты растений и агрохимикаты: антигрибной биопрепарат микол (на основе гриба T.asperellum Samuels, Lieckfeit et Niren-berg - Патент России, N 2170511, 2001) в двух товарных формах - для предпосевной обработки семян и для обработки растений, а также комбинированное удобрение (на основе биогумуса и Т. asperellum - Патент России N 97122342/13, 1997), обладающее почвоудобрительным, ростстимулирующим и фунгицидным действием.

Разработана нормативно-техническая документация для производства микола (опытно-промышленный регламент, технические условия, инструкция по применению), получены санитарно-гигиенические заключения на штамм-продуцент, и его товарную форму. Проведена оценка российского рынка антигрибных биопрепаратов, показана перспективность коммерческого использования микола в технологиях растениеводства.

Полевые испытания экспериментальных образцов и опытных партий в хозяйствах Краснодарского Края, Вологодской, Ленинградской, Тамбовской, Пензенской, Новгородской областях, в Крыму и Белоруссии показали высокую рострегулирующую и фунгицидную активность нового препарата.

Основные положения» выносимые на защиту

1. Научно-обоснованная методология получения биопрепаратов на основе биомассы мицелиальных грибов, нарабатываемых при глубинном культивировании, сохраняющих биологическую активность в течение заданных сроков хранения, обеспечивающих их коммерческую значимость и возможность круглогодичной реализации.

2. Алгоритм управления условиями культивирования мицелиальных грибов для оптимального получения биомассы необходимого состава (мицелия, хламидоспор или фиалоконидий).

3. Две новые рецептурные формы препарата на основе биомассы гриба T.asperellum: микол С - для предпосевной обработки семян и микол В - для обработки растений, полученные глубинным культивированием и сохраняющие биологическую активность в течение шести месяцев.

4. Методология комплексной оценки фитокомпетентности биопрепаратов с учетом не только их антигрибной, но и фиторегуляторной активности для обоснования оптимальных дозы применения препаратов.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всесоюзной конференции «Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений» (Велегож, 1989); Международной научно-практической конференции «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» (Одесса, Украина, 1994); XIII и XIV Международных Конгрессах по защите растений (Гаага, Нидерланды, 1995; Иерусалим, Израиль, 1999); Конференции «Биотех-95» (Днепропетровск, Украина, 1995); 1-й Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии» (С.-Петербург, 1995); Первом и Втором Всероссийских съездах по защите растений (С.-Петербург, 1995, 2005); Симпозиуме «Экологические проблемы защиты растений современного сельского хозяйства» (Словакия, 1995); Рабочей встрече «Ростстимулирующие Rhizo-bacteria. Состояние и перспективы» (Саппоро, Япония, 1997); 32 Ежегодной встрече Общества Беспозвоночных (Ирвин, Калифорния, США, 1999); Юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999); Юбилейной научной конференции «Современные исследования в биологической защите растений» (Харбин, Китай, 2000); Международных научно-практических конференциях «Биологизация защиты растений: состояние и перспективы» (Краснодар, 2000,2004); 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002); 2-ой, 3-ей и 4-ой Международных Конференциях «Биотехнология и бизнес» (Москва, 2002, 2003, 2004); I и II Международных Конгрессах «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003); Международном Симпозиуме «Интегрированные системы защиты садов и виноградников (Венгрия, 2002); 1-ой Международной конференции «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2002); 8-м Международном Конгрессе по фитопатологии (Крайсчерч, Новая Зеландия, 2003); Международном совещании «Современные проблемы биологической защиты леса и сельскохозяйственных культур» (Звенигород, 2003); Международной конференции по интеграции науки и технологии в сельское хозяйство (Бангкок, 2004); Восьмой Международной рабочей

встрече по Trichoderma и Gliocladium (Ханжоу, Китай, 2004); 2-ом Международном Симпозиуме по фузариозу колоса (Орландо, Флорида, 2004); Третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005).

Публикация результатов исследования. Основные материалы диссертации опубликованы в журналах «Микология и Фитопатология», «Агрохимия», «Прикладная биохимия и микробиология», в «Российском химическом журнале», «Arpo XXI», «Биотехнология», материалах российских и международных конгрессов, симпозиумах и рабочих встреч. По теме диссертации опубликовано 63 печатных работы, 10 из которых в рецензируемых изданиях (3 в печати). Получено 3 авторских свидетельства на изобретения и 3 патента РФ. За разработку и организацию промышленного производства реагентов для синтеза генетических структур в 1987 году присуждена Премия Совета министров СССР.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 3S3 страницах, содержит <?■? рисунков и ЮЬтаблиц, состоит из введения, обзора литературы, б глав экспериментального материала, содержащих описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка цитированной литературы, включающего éA? работ отечественных и зарубежных авторов, а также приложений.

Место проведения работы. Основная часть НИР выполнена в отделе разработки микробиологических средств защиты растений Государственного Научного Центра прикладной микробиологии (ГНЦ ПМ, п. Оболенск, Московской обл.) за счет бюджетного финансирования по Научно-технической программе развития производства микробиологических средств защиты растений на 1987-1999 г.г. и до 2000 г., а также в рамках Договора о научно-технических связях между Министерством науки, промышленности и технологий РФ и Королевским Технологическим институтом (Таиланд, с 1996 г.) и партнерского проекта МНТЦ 2336п в сотрудничестве с Национальным Центром Обслуживания Сельского хозяйства (ARS/USDA, США, с 2002 г.).

Экспериментальные результаты получены автором лично, а также совместно с коллегами из ГНЦ ПМ и других институтов. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, схемы основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Грибы рода Trichoderma — продуценты биопрепаратов для растениеводства

Первая глава посвящена аналитическому обзору литературы по исследованиям грибов р. Trichoderma. Изложены современные представления о классификации грибов этого рода, описаны биологические особенности грибов р. Trichoderma, обеспечивающие их активность в качестве эффективных средств борьбы с болезнями растений. Проведен анализ исследований по взаимоотношениям грибов этого рода с высшими

растениями и почвенной микрофлорой, расширяющий наши представления о сложности механизмов биологического действия грибов p. Trichoderma. Особое внимание уделено биотехнологическим проблемам создания препаратов на основе грибов р. Trichoderma для растениеводства.

Критический анализ данных, имеющихся в доступной литературе, свидетельствует о том, что попытки создания промышленных препаратов на основе мицелиальной массы Trichoderma в виде пасты, которая хранится, по крайней мере, в течение нескольких месяцев, и не требует «активации» до сих пор не имели успеха.

Глава 2. Объекты и методы исследований

Выделение и идентификацию фитопатогенных культур грибов осуществляли стандартными методами (Литвинов, 1967; Билай, 1977; Ellis, 1985; Методы почвенной микробиологии и ■ биохимии, 1991; Dringra, Sinclair, 1994; Watanabe, 1994). Часть штаммов фитопатогенов получена из рабочих коллекций ВНИИ фитопатологии (Го-лицыно, Московская область), Института виноградарства и виноделия (Кишинев, Молдова), НИИ сельского хозяйства Молдавии (Кишинев), ВИЗР (С-Петербург), ВНИИБЗР и НИИСХ им. Лукьяненко (Краснодар), а также из Всесоюзной коллекции микроорганизмов, Королевского Технологического Института (Таиланд).

Природные изоляту грибов p. Trichoderma выделяли на селективной среде (Elad et al., 1981) в модификации Green и Jensen (1995). Моноклоновые изоляты получали путем высева серийных разведений исходных культур на селективную среду с целью получения отдельных колоний из одной клетки.

Первичный скрининг перспективных изолятов микромицетов осуществляли методом «встречных» культур на плотной питательной среде (Chet, Inbar, 1995).

Физиолого-биохимические и культурально-морфологические свойства отобранных изолятов Trichoderma изучали стандартными методами в модификации (Колом-бет и др., 2001). Жизнеспособность конидий после различных воздействий (температура, облучение, фунгициды) оценивали по их прорастанию на «голодном» агаре. .

Электронно-микроскопические исследования культуры T.asperellum выполнены в лаборатории электронной микроскопии ГНЦПМ с использованием просвечивающего Н-500 и сканирующего (СЭМ) S-450 электронных микроскопов ("Хитачи", Япония) при увеличениях от хЗООО - х50 ООО по опубликованным методикам (Шарова, Высоцкий, 1983).

Морфологические исследования культур грибов в процессе культивирования, рецептурных форм при хранении, а также изучение механизма взаимодействия грибов-антагонистов с фитопатогенами изучали на бинокулярном микроскопе ("Axiostar+'\ Karl Zeiss Yena, Goettingen, Germany).

Оценку совместимости штамма №16 T.asperellum с химическими пестицидами изучали, оценивая рост гриба на плотной питательной среде, содержащей пестицид, либо при совместной обработке семян. Испытали совместимость T.asperellum с 9 фунгицидами и 5 инсектицидами. Пестициды использовали в дозах, рекомендуемых для предпосевной обработки семян озимой пшеницы в сочетании с двумя концентрациями препарата - 0.5 кг/т и 1.0 кг/т.

Выделение почвенных грибов осуществляли методом высева из почвекных разведений на агаризованную минимальную среду. Выросшие колонии подсчитывали и выделяли в чистую культуру для идентификации, которую проводили совместно с A.B. Александровой (кафедра микологии и альгологии биологического факультета МГУ). Использовали определители и атласы почвенных грибов (Simmons, 1967; Thorn et al., 1968; Ellis, 1971; Ramirez, 1982; Лугаускас и др., 1987; Билай, Курбацкая, 1990; Pitt, 1991; Domsch, 1993). Титр грибов определяли в расчете на абсолютно сухую массу почвы. Определение массовой доли влаги проводили по ГОСТу 26712-85 высушиванием образцов (почвы, биомассы) при 105-110 °С с последующим взвешиванием до постоянного веса.

Содержание основных биофильных элементов в почвенных образцах (подвижную форму фосфора и обменный калий, аммонийный и нитратный азот, содержание органического вещества) определяли в аналитической лаборатории Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (Пущино) по стандартным методам (Кудеяров, 1969; Аринушкина, 1970). Там же определяли гранулометрический (механический) состав образцов почвы пирофосфатным методом (Агрофизические методы исследования почв, 1966).

Приготовление экспериментальных и опытных образцов рецептур препарата микола на основе Т. asperellum описано в экспериментальных главах. Метод приготовления экспериментального дрожжевого препарата (ЭДП) на основе дрожжей Cryptococcus nodaensis ОН 182.9 описан ранее (Коломбет и др., 2005).

. Физические свойства рабочих суспензий препаратов (стабильность, адгезив-ность) определяли по ГОСТ 16484-79. При исследовании термо-, фото-, УФ- стабильности, а также при изучении влияния УФ протекторов на сохранение мицелия в составе рецептурной формы микола 1% суспензии образцов подвергали соответствующим обработкам, после которых оценивали жизнеспособность гриба и его антигрибную активность с тест-культурой Fusarium graminearum var. graminearum Schwabe (теле-оморфа Gibberella zeae (Schwein.) Petch)* — возбудителем фузариоза колоса пшеницы, любезно предоставленной сотрудниками ВНИИ БЗР (г. Краснодар).

В условиях теплицы опыты выполняли с яровой пшеницей сорта Иволга. Растения выращивали в соответствии с общепринятыми приемами (Посыпанов и др., 1997). При описании фаз онтогенеза пшеницы использовали международную шкалу Еукар-пия. В полевых условиях эффективность опытных рецептурных форм препарата и его совместного применения с ЭДП против фузариоза колоса проводили в течение 3-х сезонов на восприимчивой к фузариоза колоса озимой пшенице сорта Купава.

Биологическую эффективность в отношении комплекса возбудителей гнилей корней и основания стебля оценивали в полевых опытах на сортах пшеницы Купава и Краснодарская-99. Семена пшеницы перед посевом обрабатывали миколом С в различной концентрации (0.1; 0.5; 1.0 и 2.0 кг/т), в фазу массового цветения (ф. 61-69) растения опрыскивали ЭДП (2.0x107-6.0x108 КОЕ/мл) и миколом В (0.1% раствор).

♦) Классификация видов приведена в соответствии с последним изданием словаря (9th edition of the Dictionary of the Fungi. CABI Bioscience Databases http://www.indexfungorum.org/Index.htm').

Через 4 ч после обработки биопрепаратами растения инфицировали опрыскиванием суспензией F. graminearum с титром 3.75x105 КОЕ/мл и нормой расхода рабочей суспензии 2 Мл на растение.

Токсигенность штаммов F. graminearum определяли методом инструментальной ТСХ-фдуориметрии (Леонов и др., 1989). Из колосьев пшеницы с ярко выраженными признаками фузариоза был выделен штамм F. graminearum, продуцирующий ДОН в повышенных концентрациях — 2300 мг/кг и триацетил ДОН (3-АС-ДОН)- 1.0мг/кг.

Рострегулирующее действие микола оценивали по биометрическим показателям растений. В случае пшеницы учеты проводили в основные фазы онтогенеза: в фазе 1-го настоящего листа (ф. 11-13), 3-х настоящих листьев (ф. 21), кущения (ф. 25), начала выхода в трубку (ф. 31), при массовом колошении и цветении (ф. 51-59). Оценивали также развитие корневой системы растений.

Биологическую эффективность обработок определяли по интенсивности развития болезни (R), распространенности болезни (Р), урожайности (продуктивность колоса, масса 1000 зерен, общий урожай), содержанию микотоксинов (ДОН) в зерне и колосковых чешуйках. Учет степени поражения фузариозом колоса (согласно международной шкале учета, в %) проводили на 16-й день по интенсивности развития и распространенности болезни (Рекомендации..., 2002).

Содержание фузариотоксинов в зерне и колосовых чешуйках определяли флуо-рометрическим методом (Леонов и др., 1989). Некоторые образцы зерна были подвергнуты твердофазному конкурентному иммуноферментному анализу, выполненному сотрудниками ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии д.б.н. Г.П. Ко-ноненко и А.А. Буркиным (Кононенко, 1999).

Испытания микола против болезней земляники проводили в лабораторно-полевых опытах ОПХ ВНИИС им. И.В.Мичурина. Оценивали эффективность препарата против возбудителей белой пятнистости Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau (Ramularia tuiasnei Sacc.*), мучнистой росы Sphaerotheca humuli (DC.) Burrill (Sphaero-theca macularis Mag. f. fragariae Jacz.), а также серой гнили Botrytis cinerea Pers. Вычисляли распространение (P) и развитие (R) болезней, техническую (ТЭ) и хозяйственную эффективность (ХЭ).

Действие различных концентраций микола (0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 и 10.0 кг/т семян) на проростки пшеницы изучали методом «рулонов» согласно ГОСТ 12044-93 (п. 10.3) по следующим параметрам: всхожесть семян, развитие болезней проростков длина колеоптиля, семядольного листа, длина и количество корней.

Статистическую обработку результатов всех данных проводили по стандартным общепринятым методам (Ашмарин, Воробьев, 1962; Доспехов, 1973). При оценке разброса данных внутри каждого эксперимента проводили подсчет средних величин и среднего'квадратичного отклонения для определения доверительного интервала при 95%-ном уровне значимости. Расчеты вели с использованием пакета программы STATISTÎCA и программы Excel из пакета Microsoft Office. Индексы разнообразия Шеннона и Бриллюэна рассчитывали согласно Мегарран (1992), Куракову (2001).

*) Здесь и далее по тексту в скобках приведено обозначение видов, использовавшееся до выхода 9 издания микологического словаря.

Глава 3. Выбор и изучение продуцента биопрепарата - гийерпардзита фи-топатогенны* грибов

Скрининг штаммов микромицетов, обладающих антигрибной активностью осуществили на созданной коллекции, содержащей 53 штамма фитопатогенных грибов, поражающих основные сельскохозяйственные культуры. Скринингу была подвергнута коллекция микромицетов, в том числе содержащая 25 культур грибов рода Тпско-йегта, различного происхождения (таблица 1).

Таблица 1 - Коллекция штаммов р. ; rrichoderma

Видовое название Источник получения, коллекционный номер Индекс штамма в коллекции

Т. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ГНЦ ПМ1, Г-104 8

Г. viride Pers.: Fr. ГНЦ ПМ, Г-105 9

T. pseudokoningit Rifai вкмтги^г-ш 10

Г. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ВКМ Р-1135, Г-120 И

T. hamatum (Bon.) Bainer В КМ Р-2028, Эстония 12

T. lignorum (Tode) Harz, Bull.« T. viride Pers.: Fr. ГНЦ ПМ, №119, Г-102 13

T. viride Pers.: Fr. ВКМ Р-1131, Япония 14

T. viride Pers.: Fr. ВКМ Р-426, Москва 15

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ГНЦ ПМ, выделен из почвы 16=*GLS 03-35

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ГНЦ ПМ, выделен из почвы 17

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ГНЦ ПМ, выделен из почвы 18

Trichoderma sp.(Gliocladium) ВНИИ «Биотехнология» 19

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ВНИИ «Биотехнология» 20

T. longibrachiatum Rifai ВИЗР3 ТК889, (ИМБ4) 29

T. viride Pers.: Fr. ВИЗР (ВНИИ БЗР5) 30

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg 81417, СТАЗР6 37

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg Л-17, СТАЗР 38

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg ТК-13, СТАЗР 39

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg «Истокский», СТАЗР РМ-8

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg 119\80, СТАЗР 41

T. harztanum Rifai «Белорусский», СТАЗР 42

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg «Белорусский», СТАЗР 43

T. reesei E.G. Simmons 25.04.94 из Колумбии СЮМ

T. asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg Таиланд7 PC 01

T. hamatum (Bon.) Bainer Таиланд PC 02

Обозначения: 1- ГНЦ ПМ - Государственный научный центр прикладной микробиологии, 2 - В КМ - Всесоюзная коллекция микроорганизмов, 3 - ВИЗР - Всероссийский институт защиты

растений, С-Петербург; 4 - ИМВ - Институт микробиологии и вирусологии АН Казахстана, Алма-Ата, 5 - НИИ БМЗР - Научно-исследовательский институт биологических методов зашиты растений, Кишинев, б - СТАЗР - Вологодская Станция защиты растений; 7- Таиланд - любезно предоставлены проф. К. Сайтонгом из Королевского Технологического института (Бангкок)

Исследования антигрибной активности 25 штаммов различных видов грибов рода ТНскойегта выявили широкую вариабельность их по этому признаку. В таблице 2 представлены результаты тестирования б наиболее активных штаммов.

Таблица 2 - Антигрибная активность наиболее перспективных штаммов грибов рода ТпсИоЛегта в отношении возбудителей болезней растений

Тест-объект Индекс тест-объекта в коллекции Индекс штамма гриба рода Trichoderma

РМ-8 30 20 16 13 29

Gibberella pulicaris (Fr.) Sacc. (F.oxysporum) 6 ++* ++А + ++ +-Н-А +

1 ++ -НА ++ ++ - +

22 ++ ++А +++А ++ +++А

25 ++ ++А ++А ++ + +

F. culmorum (W.G. Sm.) Sacc. 4 +++ ++ ++ ++ ++ ++

23 ++ + ++ +

26 ++ ++А ++ ++ + +

34 ++ - ++ +++ +

35 ++ ++ + +++ +

36 ++А + - +++

F. graminearum van graminearum Schwabe. 31 +++А - - +++ +

32 ++ ++А - +++ +

33 ++ - - +++ -

28 +- ++А ++А +++ -

Gibberella gordonii C. Booth (F. heterosporum Nees et T. Nees) 2 +++ + ++ ++ ++

F. sporotrichioides Sherb. (F.sporotrichiella Bilai) 3 +++ ++ ++А +++ -

24 ++ ++ - ++ - +

Fusarium sp. 21 ++ +++ - +++ ++ ++

**) Антигрибную активность оценивали по следующей шкале: +++ = высокая гиперпаразитическая активность, ++ = средняя гиперпаразитическая активность, и + 13 низкая гиперпаразитическая активность, - = антигрибная активность отсутствует, А - наличие зоны лизиса между штаммами.

В результате скрининга был выбран штамм 16 Г. asperellum, активный в отношении природных изолятов фитопатогенов из родов Fusarium, Alternaria, Pyrenophora, Bipolaris, Pleospora (Phoma betae), Phytophthora, Botrytis, Glomerella (Colletotrichum), Thanatephorus (Rhizoctonia solani), Pénicillium и Aspergillus.

Исследования по механизму действия выбранного штамма Т. asperellum показали, что он является гиперпаразигом фитопатогенных грибов. При совместном культивировании с фитопатогенами зона лизиса между штаммами отсутствует, мицелий T.asperellum растет на мицелии тестируемого гриба, КЖ после отделения биомассы гиперпаразита не обладает антигрибной активностью.

Перспективный штамм-продуцент препарата помимо основной активности -биологической, должен обладать подходящими технологическими характеристиками. Оптимальной температурой для роста продуцента следует считать ту, поддержание которой в процессе ферментации будет наиболее экономично и которая является оптимальной для роста и развития гриба в условиях его применения. Рост штаммов рода Trichoderma изучили при 9 различных режимах от 5°С до 40°С. Температурный диапазон активного роста штамма составляет 20-35°С. Он растет в широком диапазоне значений рН от 2.5 до 9.5. Однако скорость роста также зависит от рН среды: при 2.5 и 9.5 культура растет более медленно по сравнению с оптимумом кислотности среды, т.е. оптимум находится в пределах рН = 5.5 - 7.5.

Исследование потребностей в углеводном и азотном питании показало, что штамм 16 T.asperellum хорошо усваивает крахмал, сахарозу, глюкозу, мальтозу. Он может расти также на средах, содержащих целлюлозу, арабинозу, лактозу. Гриб усваивает аммонийную и амидную формы азота (азот аминокислот), он способен к восстановлению нитратов.

При изучении прорастаемости спор оказалось, что глубинные фиалоконидии начинают прорастать раньше, чем поверхностные - через 12 ч, к 21 ч практически все проросли. Поверхностные конидии, так же как и хламидоспоры, начинают прорастать позже - только через 16 ч. Поверхностные конидии устойчивы к повышенной температуре: при кратковременной обработке (60°С) отдельные конидии сохраняют ростовые свойства. Прргрев суспензии при более низких температурах и в течение более длительного времени не влияет на их жизнеспособность.

Глубинные конидии гриба менее устойчивы к повышенной температуре. Они не выдерживают нагревание при 60°С даже в течение 5 мин. При 50°С в течение 10 мин сохраняют жизнеспособность лишь отдельные конидии. При 40°С жизнеспособность конидий зависит от времени обработки: чем дольше, тем более гибельно воздействие температуры. . .

Оценка стабильности свойств штамма показала, что при пересевах на искусственных средах (Чапека, картофельно-декстрозном агаре, сусло-агаре) он сохраняет свои основные свойства. Метод контактно-сорбционного обезвоживания на ионно-обменной смоле КБ-4П-2 позволяет хранить культуру гриба в течение длительного (до 10 лет) периода, без изменения биологических и культурально-морфологических свойств.

Первичная оценка совместимости штамма №16 T.asperellum с некрторыми химическими пестицидами показала, что ТМТД, апплауд, байлетон, байтан, карбофос, висметрин и тал стар в рекомендованных для применения дозах не подавляют рост гриба. Лишь в некоторых случаях они задерживают скорость роста в первые сутки.

Считается, что грибы p. Trichoderma — антагонисты и гиперпаразиты фитопато-генов - при использовании в качестве активных ингредиентов микробиопрепаратов не фитотаксичны, стимулируют рост и, в конечном счете, повышают продуктивность растений (Baker et al., 1984; Harman, 2000). Тем не менее, в результате обработки некоторых растений штаммами Trichoderma spp. не только отсутствовал ростстимули-рующий эффект, но и обнаруживалось их фитотоксическое действие (Baker, 1989). Предположили, что рострегулирующее действие микромицета определяется комплек-

сом параметров: свойствами.штамма, концентрацией его рабочего раствора, видом.и < возрастом тест-культуры (Оиз1еу е1 аЦ 1994). С учетом вышеизложенного* оценили,, фиторегуляторное действие на пшеницу разработанного антигрибного биопрепарата. микол в наиболее чувствительную фазу ее онтогенеза - в период прорастания семян (таблица 3).

Таблица 3 — Влияние микола и фунгицидов на всхожесть семян, инфицирован-ность микромицетами и морфометрические показатели проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 99 (абсолютные значения)

Вариант' Распростр анение грибной инфеции, % Всхожесть семян, % Длина колеоптиля, см Длина корневой системы, см Число корней, шт. Длина семядольного листа, см

К 24.1±10.0 97.5±1.9 4.25±0.10 12.99±0.34 3.58±0.11 5.75±0.27

М0.1 11.5±6.8 97.5±1.0 4.14±0.14 13.53±0.51 3.63±0.14 5.96±0.38

М 0.5 12.0±5.3 95.5±4.1 4.47±0.16 12.65±0.47 3.68±0.11 5.27±0.32

М 1.0 11.8±4.2 97.0±2.5 4.35±0.15 13.23±0.50 3.46±0.14 ■ 5.87±0.38

М 2.0 12.0±4.9 98.0±1.6 4.49±0.09 13.54±0.44 3.87±0.12 5.94±0.32

М 5.0 12.4±5.1 87.5±9.0 4.05±0.23 11.52±0.68 3.37±0.15 5.49±0.46

М 10.0 6.0±4.7 91.0±3.4 4.29±0.17 13.45±0.49 3.29±0.13 5.55±0.42

Р 3.4±3.4 88.0±5.5 2.89±0.08 12JC±0.34 3.49±0.10 5.08±0.25

В 5.1±5.1 92.0±5.6 4.38±0.17 11.97±0.43 3.39±0.12 5.73±0.37

} Обозначения вариантов: К - контроль, МОЛ, М0.5, М1.0, М2.0. М5.0, МЮ.О - микол в концентрациях 0.1,0.5,1.0,2.0,5.0 и 10.0 кг/т, Р - раксил (1.5 кг/т), В - вигарос (2.5 кг/т). :

Установлено, что распространение семенной инфекции (Fusarium spp., Alteré naria spp., Rhyzipus spp.) в контроле (на семенах, обработанных дистиллированной во-' дой) составляло 24%. Все испытанные препараты подавляли развитие этих фитопато- ' генов. Раксил и витарос, а также микол в повышенных дозах (5.0 и 10.0 кг/т} уменьшили поражение проростков примерно в 4 раза. При этих концентрациях'микола на отдельных проростках обнаружен микромицет Т. asperellum. Антигрибное действие' миколавдозах 0.1-2 кг/т не приводило к росту Т. asperellum на проростках. ! :

Для комплексной оценки изученных показателей мы ввели обобщающий ¡усредненный параметр оценки действия протравителей - показатель «относительного рост-регулирующего эффекта» (ОРЭ) (рисунок 1). Его рассчитали как среднее значение ве-1 личин всхожести семян (В), длины колеоптиля (С), семядольного листа (L), корней (R) и' количества корней (N) в % к соответствующим контрольным показателям:

ОРЭ] = ^Г^ ^ , где Aij A5j - вклад каждого из пяти показателей в величину ОРЭ, '

Aij=(Bj/Bi-l)xl00, где Bj и Bj - всхожесть семян в опыте и контроле, %; A2j=(Cj/Ci-^ 1)х100,

где Cj и Cj — длина колеоптиля в опыте и контроле, см; A3j—(Lj/L i -1 )х 100, где

Ц и Ь1 — длина семядольного листа в опыте и контроле, см; А^=(К/111-1)х100, где К^ и — длина корней в опыте и контроле, см; А5;=(М/М1-1)х100, где ^ и N1 - количество корней в опыте и контроле, шт.

10 5

I 0 а ~5 £

-10 -15

Рисунок 1 - «Относительный рострегулирующий эффект» протравителей семян пшеницы (обозначение вариантов как в таблице 3).

Из приведенных данных значения параметра ОРЭ следует, что протравливание семян, как правило, индуцирует изменение ростовых процессов у растений. Так, при высоких концентрациях микола (5.0 и 10.0 кг/т), а также под действием раксила отмечено фитотоксическое действие протравителей на пшеницу.

Микол в высоких дозах (5.0 и 10.0 кг/т), а также раксил (1.5 кг/т) и витарос (2.5 кг/т) существенно (в 4-7 раз) снижают инфицированность семян пшеницы. При более низких концентрациях микола семенная инфекция подавляется также, но в меньшей степени. При этом, в отличие от раксила, микол в дозах 0.5-2.0 кг/т не снижает всхожести семян пшеницы и достоверно увеличивает длину ее колеоптиля. Подобное ро-стстимулирующее действие биопрепарата позволяет (в случае дефицита влаги в почве во время посева) заделывать семена пшеницы на оптимальную глубину. Комплексная оценка действия биопрепарата на проростках свидетельствует о том, что протравливание пшеницы миколом в дозах 1.0-2.0 кг/т семян оптимально для применения.

Последующие вегетационные и полевые опыты на пшенице, ячмене, льне показали четко выраженную ростстимулирующую активность микола именно в этих концентрациях.

Экспериментальные образцы препарата на основе культуры Т.шрегеИит испытали против болезней ячменя, льна, овощных и лекарственных культур, земляники в полевых условиях на естественном инфекционном фоне в теплицах Серпуховского и Чеховского районов Московской области, Вологодской, Пензенской, Тамбовской областях, во ВНИИ садоводства им. И.В.Мичурина, во ВНИИ с/х использования мелиоративных земель и Белорусского института защиты растений, во ВНИИ биологической защиты растений (Краснодар), в Московском государственном университете ле-

К Мй1 Мй5 М1.0 М2.0 М5.0 МЮ.О Р Вариант

са. Микол снижал заболеваемость ячменя гельминтослориозом (возбудители: Ругепо-phora teres Drechsler {Drechslera teres (Sacc.) Shoem.), Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem., Pyrenophora graminea S. Ito et Kurib. (Drechslera graminea (Raben.) Shoem.) в 1.5-2 раза, обеспечивая сохранение урожая на 13 - 30%. Обработка препаратом (2%-ной концентрации) вегетирующих растений льна вдвое снизила заболеваемость расте-. ний фузариозным увяданием (Fusarium oxysporum Schl.), ржавчиной (Melampsora lini var. lini (Ehrenb.) Liv.) и бактериозами (Clostridium macerans Schard.). На землянике 5%-ая суспензия биомассы гриба (в дозе 15 кг/га) эффективно (на 70-90%) снижала заболеваемость мучнистой росой (Sphaerotheca humuli), белой пятнистостью листьев (Mycosphaerella fragariae) и серой гнилью {Botrytis cinerea). Первичные испытания экспериментальных образцов препарата на основе штамма 16 T.asperellum подтвердили его антигрибную активность против фитопатогенов в полевых условиях, а также наличие фиторегуляторной активности, приводящей к увеличению урожайности на 10-30%.

Многоступенчатый скрининг и многолетние полевые испытания экспериментальных образцов позволили выбрать в качестве продуцента высокоэффективного антигрибного препарата штамм 16 Trichoderma asperellum и приступить к разработке технологии его производства.

Глава 4. Разработка технологии глубинного культивирования Trichoderma asperellum, обеспечивающей максимальный выход активной биомассы

Несмотря на то, что различные штаммы микроорганизмов интенсивно изучаются в качестве перспективных продуцентов биопрепаратов, коммерческое применение имеют в течение последних десятилетий только несколько штаммов-антагонистов из родов Bacillus, Penicillium, Pseudomonas, Streptomyces, Chaetonfium и Trichoderma (Fravel, Larkin, 1996; Estrella, Chet, I. 1998; Hebar, 1999; Soytong, 2003; Справочник пестицидов и агрохимикатов......2005). Одной из причин ограниченного числа зарегистрированных коммерческих биопрепаратов является недостаточность исследований по оптимизации процессов культивирования штаммов-продуцентов.

Наиболее разработанными являются технологии получения ферментов на основе различных штаммов вида Т. reesei E.G. Simmons (Holtzapple et al., 1990; Margolles-Clark et al., 1997; Andreaus et al., 1999; Dominigues et al., 2001; Olsson et al., 2003). Особенность этих технологических решений в том, что конечным продуктом является метаболит, синтезируемый штаммом-продуцентом. Главной задачей в этом случае является получение фермента (или антибиотика); культура гриба является как бы «биореактором», синтезирующим нужный продукт. По окончании процесса культивирования биомасса штамма-продуцента подлежит утилизации.

При разработке технологии получения биопрепаратов на основе биомассы грибов p. Trichoderma стоит принципиально другая задача: при наименьших затратах (сырьевых и энергетических ресурсов) получить максимально возможное количество биологически активной биомассы, способной к длительному хранению. Экономическая составляющая этой задачи сформулирована не напрасно, т.к. стоимость готового препарата должна быть конкурентоспособной на рынке пестицидов.

/'

Технологии производства препаратов на основе мицелиальных грибов можно разделить на два принципиально различающихся типа культивирования: поверхностное (или твердофазное) на твердом носителе и глубинное (погруженное) в жидкой среде. Предложены также технологии, сочетающие оба способа культивирования, например иммерсионное, при котором растущая биомасса периодически выдерживается то в жидкой фазе, то на воздухе (Громовых, 2002).

В случае традиционной твердофазной технологии выращивания продуцента на сыпучих питательных средах готовый препарат представляет собой смесь относительно небольшого количества конидий гриба и его метаболитов и достаточно большого количества субстрата, используемого для ферментации.

Технологии, комбинирующие оба типа культивирования, как правило, трудоемки или требуют специального оборудования, больших площадей и ручного труда.

Что касается глубинного культивирования мицелиальных грибов, этот подход считается более технологичным, т.к. контролируемые условия процесса ферментации позволяют получать стандартизированный конечный продукт (Mendelsohn, et al., 1994). Кроме того, культивирование в закрытых аппаратах является более экологичным процессом, исключающим попадание штамма-продуцента (и его метаболитов) в воздух рабочей зоны.

Разработкой глубинных технологий производства препаратов на основе грибов p.Trichoderma занимались различные группы исследователей в разных странах, начиная с середины 80-х годов. Исследования российских (советских) ученых в этой области начались в ВИЗР Н.С. Федоринчиком и М.Т. ПетрухиноЙ в 80-х годах, затем были продолжены Н.Н. Гринько, Т.А. Нугмановой и И.И. Новиковой (2005).

, . Проведенные нами исследования продуктивности штамма Т. asperellum (по накоплению биомассы) на средах, содержащих различные источники питания, позволило выбрать состац среды, которая была включена в разработанный Лабораторный регламент на производство грибного биологического препарата «Микофунгицид» (ЛР 00001927-15-43-93). Среда . содержала: сернокислотный гидролизат белково-витаминного концентрата кормовых дрожжей (ГБВК) - 70 мл; глицерин - 30 мл; сернокислый аммоний (NH4)2xS04 - 3.0 г; калий фосфорнокислый двузамещенный (К2НР04хЗН20) - 0.5 г; магний сернокислый 7-водный (MgS04x7H20) — 0.2 г; воду водопроводную до 1.0 л; рН среды 6.5 ±0,1 (среда - прототип). Максимальное накопление биомассы T.asperellum (20 г/л) при выращивании на этой среде наблюдается через 18-24 ч; биомасса представляет собой мицелий и хламидоспоры (рисунок 2). Однако свободные конидии получить на этой среде не удалось (Коломбет и др., 2002). При поверхностном культивировании грибов p. Trichoderma в полной мере реализуется программа конидиогенеза и созревание фиалоконидий, при глубинном - гриб образует в основном мицелий и хламидоспоры (интеркалярные и терминальные). Исследованиями, проведенными на кафедре микологии и альгологии МГУ, показано, что различные штаммы по-разному реагируют на необычные для этих грибов условия культивирования. В ряде случаев культура гриба не проходит всех стадий онтогенеза (фиалоконидии не образуются), но даже при наличии конидиогенеза, клеточная стенка фиалоконидиий при глубинном культивировании морфологически отличается от кле-

точной стенки конидий при поверхностно^ культивировании (Шарова, 1981; Горлен-

С одной стороны высокая вариабельность штаммов даже одного вида грибов р. Trichoderma, с другой стороны, высокая коммерческая значимость этих продуцентов, благодаря многообразию их биологических свойств, привело к тому, что в доступной литературе сведения о конкретных дешевых и оптимальных методах глубинного культивирования практически отсутствуют. Вместе с тем, показано, что условия культивирования микроорганизмов в жидкой среде влияют не только на количество получаемой биомассы, но и на биологическую активность получаемого препарата (Schisler et al., 1991; Jackson, Schisler, 1995). Использование микробной биомассы в виде пасты в качестве биопрепарата предусматривает необходимость разработки методов стабилизации биопродукта для обеспечения сохранности его в течение необходимого периода времени. Преимущестт вом концентрированных пастообразных препаратов является то, что отсутствие стадии сушки существенно снижает затраты на их приготовление, однако обезвоживание биомассы, полученной при культивировании в жидкой среде, может повлиять на жизнеспособность биоматериала и его эффективность как антагониста. Для создания пастообразных препаратов необходимо разработать питательную среду, позволяющую получить максимальное количество биомассы при оптимальных параметрах культивирования и подобрать стабилизаторы и консерванты, которые позволяют сохранить жизнеспособность биомассы в процессе хранения.

Стадия ферментации является основной стадией технологического процесса получения продуктов микробиологического синтеза. Сложный характер процессов на этой стадии общеизвестен (Перт, 1978; Матвеев, 1983).

Учитывая питательную ценность мелассы, с одной стороны и низкую цену с другой стороны, мы изучили возможность создания на ее основе питательной полусинтетической среды (ППС), на которой гриб T.asperellum, во-первых, проходит все стадии онтогенеза, во-вторых, накапливает биомассу в значительных количествах. В экспериментах в качестве дополнительных (к мелассе) источников азота исследовали мочевину (карбамид) и сульфат аммония. Для увеличения соотношения C:N в среду с мелассой в некоторых опытах добавляли сахарозу. T.asperellum выращивали в колбах объемом 750 мл (75 мл среды) при 200-240 об/мин и скорости массопередачи по кислороду (Кь,), равной 1,0 ммоль02/лхмин. Засев колб проводили 5% 18 ч инокулюма (на среде ППС). Температура культивирования (26-28)°С. Динамика накопления биомассы, рН представлена в таблице 4.

ко и др., 1982; Шарова, Высоцкий, 1983).

Рисунок 2 - Морфология биомассы Т.азрегеИит через 24 ч на среде прототипе (А). Увеличение: *400. Обозначения: 1 - гифы мицелия; 2 - терминальные хла-мидоспоры.

Таблица 4 - Динамика роста Т.аярегеИит на среде-прототипе и ППС

т,ч рЬ Биомасса, г/л

П* ППС** П ППС

0 6.5±0.1*** 5.99±0.03

24 6.14±0.19 6.96±0.07 22.5±7.0 28.0±1.4

36 2.62±0.10 7.24±0.08 20.4±0.3 21.3±0.4

42 2.08±0.08 » 7.28±0.06 15.9±0.1 13.6±1.0

48 2.10 ±0.08 7.25±0.05 14.6±0.3 12.4±0.6

Обозначения: т, ч - время культивирования, * - среда прототип, ** - полусинтетическая питательная среда, *** - даны средние значения и 95% - ный доверительный интервал.

Через 48 ч культивирования на среде- прототипе (ГБВК, глицерин) получены пропагулы только двух типов - мицелий и хламидоспоры (рисунок 2А), на опытной ППС - пропагулы 3 типов, в том числе фиалоконидии (рисунок ЗА, Б).

Рисунок 3 - Морфология биомассы Т.азрегеИит через 24 ч полусинтетической питательной среде (А). Свободные конидии в глубинной 48-часовой культуре Т.аярегеИит на ППС (Б). Увеличение: *400. Обозначения: 1 - гифы мицелия; 2- терминальные хламидоспоры, 3 - интеркалярные хламидоспоры, 4 — лизированные гифы мицелия; 5 — фиалоконидии.

Таким образом, для культивирования ТмярегеИит разработана сбалансированная полусинтетическая питательная среда, на которой гриб осуществляет полный цикл онтогенеза, образуя хламидоспоры и фиалоконидии.

Поскольку эти структуры обеспечивают выживание грибов при неблагоприятных условиях, биопрепараты создают, как правило, на их основе, что позволяет обеспечить эффективное хранение препарата до его применения.

Следующей задачей было изучение влияния компонентов питательной среды на образование конидий и хламидоспор в условиях глубинной культуры.

Известно, что азот играет важную роль в процессе созревания конидий у эука-риотных микроорганизмов (дрожжей Neurospora crassa, мицелиальных грибов -T.viride, аскомицетав - Coletotrichum truncatum Schw. (Andrus et Moore) (Jackson, Schisler, 1992; Pokorny et al., 2004). Кроме того, оптимальное соотношение основных компонентов среды, в частности, углерода и азота (C:N) обеспечивает максимальное накопление биомассы при наиболее рациональном использовании субстратов. Важна также роль соотношения субстратов в формировании клеточных стенок мицелия и спор (Jackson, Schisler, 1992).

Исследования по оптимизации среды для получения фиалоконидий T.asperellum проводили методами математического планирования эксперимента с использованием ортогональных планов второго порядка, позволяющих определить не только коэффициенты для линейной модели, но и коэффициенты при квадратичных членах (Лысенкйв, 1979).

Исследовали влияние источников азота (мочевина, азотнокислый аммоний), а также дополнительных факторов питания — микроэлементов (МЭ) на образование фиалоконидий и хламидоспор в глубинных культурах (таблица 5). Штамм T.asperellum выращивали 5-6 сут в колбах на средах, основным компонентом которой является меласса (25 мл/л).

Таблица 5 - Накопление фиалоконидий и хламидоспор T.asperellum в глубинной культуре на полусинтетической среде разного состава ..

Компонент, характеристика продуктивности культуры Вариант

1 2 3 4

Меласса, мл/л 25.0 25.0 25.0 25.0

КН2Р04, г/л 4.0 4.0 . 4.0 4.0

MgS04x7H20, г/л 0.5 0.5 0.5 0.5

Мочевина, г/л 0.4 - - "-

Азотнокислый аммоний, г/л - 0.4 0.4 0.4

МЭ* (Ре, Ъл, Си, Мп, Мо, В) по Хоттингеру — — + —

СаС12 + МЭ (Ре, Ъп, Мп, Си) - - - +

Тигр фиалоконидий, 1х10б КОЕ/мл 70.0 42.5 14.5 29.5

Титр хламидоспор, 1х106 КОЕ/мл 2.0 4.8 3.0 4.8

Обозначения: МЭ* - микроэлементы.

Концентрация фиалоконидий в культуре на среде с мочевиной была более чем в 1,5 раза выше, чем на среде с азотнокислым аммонием. Обогащение микроэлементами и хлористым кальцием среды, содержащей азотнокислый аммоний, не привело к увеличению выхода фиалоконидий. Концентрация хламидоспор во всех вариантах опыта была на порядок ниже, чем концентрация фиалоконидий.

В таблице 6 представлены результаты исследования влияния фосфата калия и сульфата магния на накопление фиалоконидий и хламидоспор при исследовании в многофакторных экспериментах по плану ПФЭ22.

Таблица 6 - Влияние различных концентраций фосфатов калия и сульфата магния на накопление фиалоконидий и хламидоспор дри глубинном культивировании Т.а$реге11ит

Факторы: КН2Р04 Ме804х7Н20 Титр хЮ6КОЕ/мл

Переменные XI, г/л х2, г/л

Ед. измерения, %

Нижний уровень 0.50 0.2 Фиалоконидий Хламидоспор

Средний уровень 2.25 0.35

Верхний уровень 4.00 0.5

Опыт 1 - 1 - 1 6.2 9.0

Опыт 2 + 1 - 1 160.0 45.0

ОпытЗ - 1 + 1 0 9.3

Опыт 4 + 1 + 1 150.0 0

Опыт 5 0 0 106.0 8.7

При исследовании влияния фосфата калия (XI = 2.25 ± 1,75 г/л) и сернокислого магния (Х2= 0.35 ±0.15 г/л) на накопление конидий и хламидоспор в многофакторных экспериментах по плану ПФЭ22 выявлены следующие закономерности: Титр фиалоконидий = 80.0 + 76.0 XI - 4.0 х2 (1)

Титр хламидоспор =15.8 + 6.7 XI - 11.2 х2 - 11.3 XI х2 (2) Анализ уравнений (1) и (2) показывает, что увеличение концентрации фосфора в среде способствует увеличению накопления и конидий, и хламидоспор. Дополнительное введение сернокислого магния в концентрации 0.5 г/л практически не влияет на накопление конидий, но заметно снижает титр хламидоспор на среде 4.

Таким образом, показано преимущество мочевины в сравнении с азотнокислым аммонием, а также положительный эффект фосфорнокислого калия на накопление фиалоконидий.

Оптимизацию ППС по фосфору (фосфат калия) и азоту (мочевина) с целью получения максимального количества фиалоконидий исследовали в многофакторных экспериментах (полнофакторных и ортогональных II порядка). Концентрация сернокислого магния составила 0.3 г/л, мелассы (М>- 30 и 60 мл/л (таблица 7).

Титр конвдий (М - 30 мл/л) = - 6.3 + 14.4 N + 22.67 Р - 16.00 №,• 106/мл (3) Титр конвдий (М - 60 мл/л) = - 3.0 + N + 28.0 Р - 13.0 10б/мл (4)

Данные таблицы 7 и уравнений (3) и (4) показывают, что увеличение содержания фосфатов в среде приводит к увеличению концентрации конидий при глубинном культивировании. В среде, содержащей 30 мл/л мелассы, мочевина практически не влияла на этот показатель. В среде, содержащей 60 мл/л мелассы, мочевина в концентрации 2.0 г/л снижала титр конидий.

Таблица 7 - Накопление фиалоконидий Т.азрегеИит на ППС с мелассой (М) при различньк концентрациях мочевины (И) и фосфата калия (Р) (5-6 сут культивирования)

Концентрация, г/л х106 КОЕ/мл Затраты субстратов на синтез одной конидии (а я), Ю^мг/конидия

М Н (х.) Р,(х2) М N Р

30 0.5 0.3 5.5 5.48 0.090 0.055

1.0 10.0 3.00 0.100 0.030

0.5 1.5 23.0 1.30 0.022 0.065

1.0 18.0 1.67 0.532 0.083

60 1.0 0.6 7.0 .8.57 0.143 0.086

2.0 0.1 600.0 20.0 6.00

1.0 3.0 43.0 1.40 0.023 0.070

2.0 5.0 12.00 0.400 0.600

Анализ затрат субстрата на синтез единицы продукта (а$) позволяет определить коэффициенты конверсии субстратов, которые отражают содержание субстратов в биомассе. В условиях ограничения роста по какому-либо из субстратов он практически полностью убывает из среды и переходит в биомассу.

Минимальные затраты мелассы и мочевины на синтез 1 конвдии, которые составили 1.35-10"6 и 0.0225*10"6 мг, соответственно, являются коэффициентами их конверсии. В отличие от азота содержание фосфора в клетках колеблется в довольно широком диапазоне от 10 до 80 мг на 1 г биомассы. По этой причине зона лимита по фосфору характеризуется плавным (медленным) увеличением содержания этого элемента в биомассе и, следовательно, коэффициента конверсии по фосфору. Однако при превышении максимального значения лимитирующей концентрации доля фосфора в клетках стабилизируется. Показатель использования субстрата с этого момента скачкообразно возрастает.

Таким образом, плавное увеличение затрат фосфата калия на синтез 1 конидии с минимального значения 0.030x10"6 мг до значения 0.086x10"6 мг приходится на область ограничения выхода по фосфору и поэтому значение затрат в этой области совпадают со значениями коэффициентов конверсии. Учитывая большую значимость фосфора для формирования конидий, для оценки сбалансированности среды было принято максимальное значение этого коэффициента, соответствующее 0.086x10"6 мг на конидию.

Таким образом, соотношения содержания мелассы и мочевины, мелассы и фосфатов калия равны 60 (1.35х10'6: 0.0225x10"6) и 15.7 (1.35x10-* : 0.086х10б), соответственно. Следовательно, в среде концентрация мочевины должна быть в 60 раз меньше концентрации мелассы, а фосфатов калия - в 16 раз. Такие же результаты были получены в эксперименте по ортогональному плану II порядка. Титр фиалоконидий на оптимизированных вариантах среды составил (3.0-3.5)хЮ8КОЕ/мл.

Далее изучили влияние концентрации субстратов и скорости массопередачи по кислороду (Кьа) на рост культуры Т.айрегеИит и накопление конидий. По результатам исследования 19 вариантов среды культивирования определено уравнение регрессии

(5), описывающее влияние на накопление конидий К^, и концентрации мелассы (М) в среде, содержащей мочевину (N) и фосфаты калия (Р) в оптимальной концентрации:

У = 1026.5 + 971 Ки + 6.1 M + 23.2 N/ - 7884 Кы/М, х Ю7/мл (5) Установлено, что с увеличением концентрации мелассы в среде выход конидий увеличивается, однако, эффективность использования мелассы выше при более низких концентрациях. При выращивании T.asperellum на среде ППС, сбалансированной по основным компонентам, влияние Kl» на накопление фиалоконидий было незначительным.

Следует отметить, что оптимизация среды культивирования позволила получить через 6 сут продукцию фиалоконидий T.asperellum, сопоставимую с продукцией в исследованиях других авторов. Так, американские исследователи (Tronsmo, Harman, 1992) на полностью синтетической среде получили на 6 сут культивирования фиало-конидии T.harzianum Pic титром 0.5x108 КОЕ/мл.

Таким образом, разработана и оптимизирована полусинтетическая питательная среда, содержащая мелассу (30±7.5) мл/л и сернокислый магний (0.2 - 0.3) г/л, на которой накопление фиалоконидий T.asperellum достигает (3.0 - 3.5)* 108 КОЕ/мл. Показано, что для достижения такой продуктивности среды (по конидиям) концентрация мочевины должна быть в 60 раз меньше концентрации мелассы, а фосфатов калия - в 16 раз.

Дальнейшие исследования по хранению показали невозможность длительного хранения препарата, приготовленного на основе биомассы в виде глубинных фиалоконидий. Электронно-микроскопические исследования ультратонких срезов поверхностных и глубинных фиалоконидий демонстрируют значительные различия в структуре их клеточных стенок (рисунок 4).

А Б В Г

Рисунок 4 - Ультраструктура фиалоконидий штамма 16 Г. asperellum, образующихся при поверхностном (А и Б) и глубинном (В и Г) культивировании. А - сканирующая электронная микроскопия, х6800. Б — просвечивающая электронная микроскопия ультратонких срезов, х21000. В - Конидиеносцы с фиалидами, из которых выходят конидии. 48 ч культивирования. х2100. Г - Ультратонкий срез фиалоконидии, дающий представление о тонкой клеточной оболочке. 72 ч культивирования; х 18000.

Мицелиальные грибы, попадая в необычные для них условия глубинного культивирования по - разному реагируют на эти условия. В ряде случаев культура гриба не проходит всех стадий онтогенеза, но даже при наличии конидиогенеза, клеточная стенка фиалоконидий при глубинном культивировании морфологически отличается от клеточной стенки конидий при поверхностном культивировании. Эти отличия не только морфологические, но и, по-видимому, физиологические. «Аномальные» фиа-локонидии не могут выполнять функцию сохранения в неблагоприятных условиях.

Альтернативной стратегией создания препаратов на основе мицелиальных грибов является использование в качестве основы препарата биомассы, состоящей из мицелия и хламидоспор.

Образцы препарата, полученные на среде с ГБВК и глицерином (приготовленные в соответствии с Лабораторным регламентом), состоящие в основном из мицелия и хламидоспор и содержащие 5% хлористого магния и 10% карбоксиметилцеллюло-зы (в качестве компонентов рецептуры), сохраняли биологическую активность в течение 3 месяцев.

Эксперименты по хранению биомассы Тм$реге11ит, полученной через '24 ч культивирования на ППС, показали что биомасса, состоящая из молодого мицелия с незначительным количеством хламидоспор, не может храниться.

Дальнейшие исследования были направлены на оптимизацию компонентного состава ППС, а также параметров культивирования (продолжительность и обеспечение кислородом), позволяющих получить максимальное накопление биомассы Т.шрегеИит в виде мицелия и хламидоспор, способной храниться в форме препарата значительное время.

Исследования по оптимизации среды для получения мицелиальной биомассы Т.аярегеПит проводили методами математического планирования эксперимента с использованием ортогональных планов второго порядка (Лысенков, 1979).

В качестве переменных факторов исследовали мочевину (И), однозамещенный фосфорнокислый калий (Р) и мелассу (М). Концентрация сернокислого магния во всех вариантах сред составила 0.3 г/л. Исследования выполнены в колбах при скорости массопередачи по кислороду (К^а), равной 1.0 ммоль02/лхмин.

На основании данных по накоплению биомассы Т.аярегеНит, полученных в 15 опытах, в которых варьировали факторы среды, определены коэффициенты регрессии и оценена их значимость. Переход от кодированных к натуральным единицам позволил получить уравнение 6, описывающее влияние исследованных факторов на выход биомассы.

Биомасса = 14.97+0.42Р+0.27М - 10.95Ы+1.89ЫР+1.78К2-0.57Р2, г/л, (6)

где Р, М и N - концентрации КН2Р04, мелассы и мочевины.

Из уравнения 6 можно, приравняв частные производные по N и Р к нулю, получить также и абсолютные значения и Ртах, они соответствуют: Мтах = 1.53, Ртах -2.91. В натуральном выражении оптимальное содержание мочевины в среде составляет 1.53 г/л, при содержании фосфорнокислого калия (КН2Р04 ) - 2.91 г/л.

В таблице 8 представлена сводная информация по продуктивности сред, содержащих оптимальные концентрации азота (мочевина) и фосфора (КН2Р04) при пяти

различных концентрациях мелассы. При этом рассчитаны затраты мелассы на синтез 1 г биомассы.

Таблица 8 - Накопление биомассы Т.шрегеИит на средах с точками оптимума концентраций по азоту (мочевина) и фосфору (КН2Р04) при пяти различных концентрациях мелассы

Показатель Значения показателей на среде с мелассой, мл/л

20 30 45 60 75

Биомасса (мах) 12.59 15.29 19.34 23.39 27.44

Затраты мелассы на синтез 1 г сухой биомассы, мл/г 1.589 1.962 2.327 2.656 2.733

Исследования показали, что при оптимальном соотношении в среде культивирования мочевины и фосфата калия накопление биомассы Т.шрегеИит зависит от концентрации мелассы. Зона оптимума для источников азота и фосфора составляет (1.5±0.5) г/л и (3.0±1.0) г/л, соответственно. Накопление биомассы на среде, содержащей 60 мл/л мелассы, достигает 23-24 г/л и может быть повышено до 27-28 г/л при увеличении концентрации мелассы в среде до 75 мл/л. Однако затраты мелассы на синтез единицы биомассы при этом увеличивается. Это соображение целесообразно иметь в виду при выборе среды культивирования, чтобы достичь максимальной эффективности использования субстратов при ферментации.

Влияние скорости массопередачи по кислороду (К^) и запаса субстрата на выход биомассы гриба Т.азрегеИит изучали на 3 вариантах сред, содержащих кроме мелассы, фосфата калия и сульфата магния, цитрат натрия и углекислый кальций, а также сахарозу (рисунок 4). В качестве источника азота использовали аммоний сернокислый. Скорость массопередачи по кислороду задавали объемом питательной среды в колбах. Соответствие Ки объему питательной среды при определенных оборотах вращения качалки установлено в предварительных экспериментах.

Динамика накопления биомассы свидетельствует, что на первые сутки роста Т.аярегеИит быстрее развивалась при скорости массопередачи 1,0 ммоль02/лхмин. Увеличение Кц до 2 ммоль02/лхмин значительно тормозило рост гриба. В целом, чем выше концентрация мелассы в среде, тем больше накопление биомассы. Однако, накопление биомассы через 24 ч при Кц, равном 0.5 ммоль02/лхмин, не зависело от исходного содержания мелассы в среде. Через 2 сут накопление биомассы было наибольшим при самом низком значении (0.5 ммоль02/лхмин). Т.е. в первом описанном опыте, где оптимизировали субстраты при 60 мл/л мелассы, получили 23-28 г/л биомассы, т.к. Кц соответствовало 1.0 ммоль02/лхмин. Оказалось, что это значение К^в избыточно; при снижении К^, до 0.5 ммоль02/лхмин получили выход почти в 2.5 раза больше.

т/п

100

К_ п к ИМОЛЬ О, V в 4 П ММ»'» о» к ж 1 к ммояь Од

и * °'5 я тт 1 К/.а я-ыт * Ча 1-5 -«.«и

§ • М 20 □ - М 40

К1.-2.0 «О, О - М60

80 ■

60 -

Рисунок 5 - Влияние скорости массопередачи по кислороду (К^) и запаса субстрата на накопление биомассы Т.аярегеИит

Таким образом, скорость массопередачи по кислороду является значимым фактором в первые сутки культивирования Т.азрегеЦит (оптимум 0.5 ммоль 02/лхмин) и малозначимым через 2 сут. Максимальное накопление биомассы через двое суток зависит только от запаса субстрата в среде. В целом очевидно, что невысокое значение К^,, равное 0.5 ммоль02/лхмин (при запасе субстрата 60 мл/л по мелассе) позволяет получить максимальное количество биомассы (до 70 г/л).

Масштабирование процесса культивирования Т. аярегеИит осуществили на ферментерах емкостью 25, 60 и 100 дм3, и на ферментационном оборудовании объемом 1000 дм3 на базе Краснодарского экспериментального Центра биологической защиты растений» по программе воспроизведения ОПР 00001927-15-140-2004.

Глава 5. Разработка товарных форм биопрепаратов, получаемых глубинным культивированием, обеспечивающих сохраняемость биомассы антагониста и его биологическую активность

Разработка товарной (рецептурной) формы препарата является одним из важнейших этапов его создания. Товарная форма должна удовлетворять трем основным условиям: сохранить биологическую активность действующего начала от момента производства до применения; обеспечить создание плотного и однородного покрытия обрабатываемых объектов биоагентом, а также сохранить и, если возможно, усилить биологическую активность в полевых условиях. Компоненты товарной формы , и их количество не должны при этом существенно увеличивать стоимость препарата. Эти задачи можно решать как с помощью введения в препарат различных ингредиентов, так и применяя определенные технологические приемы.

При решении этой задачи мы придерживались обычной схемы, принятой при разработке микробиологических средств защиты растений (МСЗР). Основными проблемами при создании жидкой формы МСЗР являются концентрирование биомассы, обеспечение сохранности биологического начала и физической стабильности препарата. Поэтому исследования по созданию жидкой формы препарата проводили в двух основных направлениях: 1) поиск стабилизаторов биологической активности; 2) обеспечение оптимальных физико-химических характеристик: физической стабильности, хорошей смачиваемости и прилипаемости к обрабатываемым частям растений за счет введения загустителей и прилипателей. В связи с особенностями условий действия биоагента были разработаны две товарные формы на основе мицелия T.asperellum: для предпосевной обработки семян (микол С) и для обработки растений (микол В).

Одновременно с оптимизацией среды культивирования для T.asperellum проводили отработку режима концентрирования получаемой КЖ. Биомассу сепарировали на сепараторе Вестфалия SА-1," центрифугировали на центрифуге G-21 и фильтровали через сита с размером пор 500,100 и 60 мкм.

Лучший результат обеспечили сепарация и фильтрование через сито с размером пор 100 мкм. Оба эти способа дают возможность получить в течение короткого времени достаточно густую, не текучую пасту. В лабораторных условиях при наработке небольших количеств биомассы наиболее быстро и удобно концентрировать ее пропусканием через сито с размером пор 100 мкм. При этом КЖ можно сконцентрировать в 3-5 раз и получить пасту с желаемым содержанием сухих веществ (6-10%).

Для оценки влияния режимов обработки биомассы и различных ингредиентов на сохранение биологической активности препарата необходимо определять динамику ее снижения при разных температурах в течение длительного времени. Для интенсификации процесса инактивации анализируемых образцов с целью более быстрого получения результатов обычно используют повышение температуры хранения, поскольку по известному правилу Вант-Гоффа повышение температуры на 10°С вызывает ускорение химических реакций в 2-4 раза. При этом нужно подобрать такую температуру, при которой заметное снижение активности контрольных образцов биомассы происходило бы за желаемый период времени. В данном случае - от нескольких дней до 1-2 недель, поскольку такой срок обычно требуется для наработки и анализа новой партии биомарсы.

Для определения оптимальной температуры ускоренного хранения образцы концентрированной биомассы хранили при 20°, 30°, 35° и 45°С. Биологическую активность заложенных образцов определяли каждые 5 дней. Полная инактивация образцов, хранившихся при 20°С, наступила через 1 мес., при 30°С - через 1-2 недели, при 35 °С - через несколько дней, а при 45 °С - менее чем за 5 сут.

Таким образом, оптимальной температурой ускоренного хранения для оценки сохраняемости препарата является температура 30°С.

Образцы пасты на основе биомассы гриба Т. asperellum, полученной на ППС, практически полностью теряли фунгицидную активность в течение 2-3 недель при комнатной температуре. Это свидетельствовало о том, что мицелий гриба погибает в образцах пасты. По крайней мере, две причины могут привести к гибели мицелия: а) воздействие продуктов метаболизма (литические ферменты), накапливающиеся в КЖ

в процессе культивирования, б) недостаток питательных веществ и условий, необходимых для поддержания жизнеспособности мицелия.

Для оценки роли продуктов метаболизма в инактивации препарата, биомассу гриба после концентрирования на сите «отмывали», разбавляя равным объемом стерильной водопроводной воды, и снова концентрировали. Вегетативные формы (мицелий гриба), как правило, утилизируют питательные вещества гораздо быстрее, чем покоящиеся (споровые) формы, поэтому снизить скорость инактивации препарата можно путем снижения интенсивности процессов метаболизма, например, за счет «закис-ления» пасты (снижение рН до 3,0). В этом же опыте в биомассу вводили крахмал в качестве дополнительного источника питания. Влияние этих факторов на сохранение биологической активности оценивали методом ускоренного хранения при +30°С (рисунок 6).

17 23 0

17 23 О Время, дни

17 23 О

17 23

А Б В Г

Рисунок 6 - Влияние отмывки (А), снижение рН до 3.0 (Б, Г) и добавления крахмала (В, Г) на сохранение биологической активности мицелиальной пасты Г. регеИит. Обозначения: сплошные линии - биомасса без отмывания, пунктирные линии - биомасса отмытая

Как видно из рисунка, «отмывка» биомассы гриба после концентрирования не только не способствует сохранению биологической активности, а наоборот, ускоряет ее потерю. Это связано, очевидно, с тем, что при «отмывке» биомассы происходит не только удаление продуктов метаболизма, но и остатков растворенных питательных веществ. По-видимому, накопление в КЖ продуктов метаболизма в меньшей степени влияет на снижение биологической активности препарата, чем недостаток питательных веществ.

Снижение рН и введение питательного субстрата по отдельности увеличивали срок хранения пасты. Наилучший эффект получен при добавлении крахмала; снижение рН уменьшало скорость потребления крахмала. Хорошо известно, что расщепле-

ние глюкозы происходит в несколько стадий, и промежуточными соединениями являются, в том числе и различные органические кислоты (Шлегель, 1987). Поэтому добавление кислоты в препарат сдвигает равновесие в сторону исходных углеводов (глюкозы, крахмала), тем самым, снижая интенсивность потребления питательного субстрата.

Таким образом, показано, что для сохранения биологической активности мице-лиальной пасты на основе Т. азрегеИит необходимо снизить интенсивность процессов метаболизма гриба и обеспечить запас питательных веществ, который должен определяться, исходя рз предполагаемых сроков и условий хранения.

Вещества, необходимые для поддержания жизнеспособности культуры в процессе хранения, могут присутствовать в биомассе в качестве остатков питательной среды, а также могут быть введены в препарат при его приготовлении. Чтобы выяснить, как основные питательные вещества влияют на сохранение биологической активности препарата, гриб ТмярегеИит культивировали на 8 различных средах, содержащих основные компоненты: мелассу, сернокислый магний и однозамещенный фосфорнокислый калий. Мочевина, цитрат натрия, углекислый кальций, сульфат аммония и сахароза в разных сочетаниях добавлены к основным компонентам.

В процессе ферментации каждые 24 ч отбирали пробы, культуру микроскопиро-вали, определяли рН, вес сухой биомассы, концентрацию конидий и хламвдоспор (по камере Горяева). Отобранные пробы закладывали на хранение. После 24 ч культивирования биомассу концентрировали на сите, после 96 ч на центрифуге, образцы хранили без добавок. После 48 и 72 ч биомассу всех вариантов после концентрирования закисляли до рН 3.5 (20% НС1) и добавляли 5% (м/м) крахмала. Все образцы хранили в неплотно закрытых банках при +30°С. В процессе хранения определяли содержание общих Сахаров, аминного и аммонийного азота, фосфатов и крахмала (если он был добавлен), а также фунгицидную активность.

Полностью потеряли активность препараты, заложенные на хранение после 24 ч культивирования. Культура быстро утилизировала остатки питательных веществ, которых не хватило даже для того, чтобы перейти в покоящиеся формы. Мочевина и цитрат натрия снижали сохраняемость образцов, приготовленных из культур 1-2 суточного возраста.

Препараты, заложенные на хранение после 96 ч культивирования и содержащие уже в основном конидии и хламидоспоры, хранились лучше мицелиальных (после 24 ч культивирования) в отсутствии дополнительно введенных субстратов. Очевидно, это связано с тем, что покоящиеся формы потребляют питательные вещества менее интенсивно, чем молодой мицелий. Это позволяет культуре дольше существовать на остатках питательных веществ, хотя их в целом и меньше.

Гораздо лучше хранились препараты со сниженным рН и введенным крахмалом, заложенные на хранение после культивирования в течение 48 и 72 ч. Исходно биомасса в этих образцах была представлена мицелием с большим количеством хламидоспор (до 40%).

Образцы, полученные на 3-4 сут культивирования, хранились лучше, если среда культивирования не была обогащена азотом. Факторы, способствующие интенсивному образованию конидий - сахароза и сернокислый аммоний отрицательно влияли на

сохраняемость БА. Все образцы, содержащие глубинные фиалоконидии, плохо сохраняли БА.

Анализ влияния факторов среды культивирования на сохраняемость грибной биомассы показывает нецелесообразность обогащения среды азотом. В нее рекомендуется вводить фосфаты калия И кальций углекислый. Эффективность обогащения среды другими компонентами зависит от физиологического состояния культуры ТмБрегеНит.

Биохимические анализы показали, что в процессе хранения культура Т. аяреге!-1ит активно потребляет углеводы (сахара и крахмал), особенно в первые несколько суток. Наиболее активно сахара потреблялись в вариантах пасты, приготовленной из КЖ после 24 ч культивирования, это предсказуемо, поскольку биомасса Г. азрегеНит через 24 ч роста в жидкой среде представляет собой молодой мицелий, активно развивающийся и нуждающейся в углеводном питании. В процессе хранения продолжалось развитие мицелия, о чем свидетельствовало активное потребление Сахаров. В образцах пасты, приготовленных после 96 ч культивирования, исходное значение содержания сахара было на уровне 0.5-0.8 г/л. В процессе хранения в течение 20 сут при +30°С содержание сахара уменьшилось незначительно: до 0.2-0.7 г/л.

Снижение содержания крахмала в образцах при хранении было практически одинаковым в пастах, приготовленных из биомассы Т. сърегеИит после 48 и 72 ч роста, и не зависело от среды культивирования. К 20 сут хранения крахмал почти полностью утилизировался во всех образцах.

В то же время, количество аминного и аммонийного азота и фосфатов в процессе хранения не только не уменьшалось, но даже возрастало. Особенно интенсивно этот процесс происходил в первые несколько суток на всех изученных средах. По-видимому, увеличение содержания азота (аммонийного и аминного) и фосфатов обусловлено частичным лизисом клеток мицелия в первые сутки хранения. Разрушение клеток, вероятно, связано, прежде всего, с недостатком кислорода.

Тенденция увеличения содержания азота и фосфатов в образцах пасты в процессе хранения одинакова на различных средах и не зависела от возраста культуры, заложенной на хранение. Однако характер динамики содержания этих компонентов различается в некоторых образцах и зависит, по-видимому, от физиологического состояния мицелия, переходящего в покоящиеся формы (хламидоспоры). Тем не менее, совершенно очевидно, что в целом количество азота и фосфора в межклеточном пространстве в биомассе в процессе хранения возрастает, поэтому дополнительного введения этих компонентов для поддержания жизнеспособности культуры при хранении не требуется.

Таким образом, из полученных результатов ясно, что на сохранение биологической активности биомассы решающее влияние оказывало наличие необходимых питательных веществ в препарате, а не вариации в исходном составе использованных для культивирования сред. Для поддержания жизнеспособности культуры и ее биологической активности в процессе хранения в пастообразном виде в препарат на основе концентрированной биомассы достаточно вводить только источники углерода и энергии.

Однако кроме запаса питательных веществ живой грибной культуре необходим кислород. Поэтому исследовали влияние доступа кислорода на сохранение биологи-

ческой активности Т. азрегеИит. Образцы пасты хранили при +30°С в плотно и неплотно закрытых емкостях, а также в пробирках длиной 40 см, закрытых ватными пробками. Биологическую активность образцов оценили через 17 и 23 дня хранения в пробах, взятых на разной глубине (рисунок 7).

100 80 ■ 60 40 20Н

■ * Бмомоса о -рНЭ,9

• - pH 3,5 фахмал 5%

20

Глубина, см

100 I ^

I 60

1 40 £

20 ■

* -Биоуасоа

□ -PH3.S

• - pH 3,5 фаямал 9*

-----^V}-

20

Глубина, см

40

Рисунок 7 - Влияние доступа кислорода на сохранение биологической гцстцвно-сти мицелиальной пасты Т. asperellum при +30°С в течение 17 (А) и 23 (Б) сут. Биологическая активность всех исходных образцов составляла 100%

Оказалось, что образцы пасты нельзя хранить плотно закрытыми более недели при 19-21°С. Нежелательно более двух недель хранить образцы и в глубокой таре. Несмотря на свободный доступ кислорода к поверхности образцов (ватные пробки в длинных пробирках), уже на глубине 15-20 см происходила инактивация препарата (гибель культуры гриба).

Таким образом, для сохранения биологической активности жидкого мицелиаль-ного препарата в течение длительного времени необходимо хранить его в неглубокой таре при доступе кислорода.

Поскольку при отсутствии принудительной аэрации в жидкой среде уже на глубине нескольких сантиметров мицелий гриба испытывает недостаток кислорода, для продления срока хранения попытались снизить интенсивность дыхания гриба за счет введения в препарат небольших количеств ионов меди. В относительно больщих количествах (0.01% и выше) медь используется как фунгицид. Известно, что ионы меди действуют как ферментный яд прежде всего для цитохромов (Russell et al., 1997). В присутствии небольших количеств ионов меди клетке не хватает кислорода, развитие ее замедляется, однако жизнеспособность сохраняется (Rodin, 2005). <

Для проверки этого предположения в следующих опытах заложили на хранение препараты с разной степенью закисления (pH 3.0 и 4.0), с разным количестйом крахмала (5.0, 7.5 и 10%) и медного купороса CuS04x5H20 (20 и 60 ррм). Все образцы хранили в неплотно закрытых банках вместимостью 50 мл при +30°С. Составы образцов и данные по хранению приведены в таблице 9.

Оказалось, что после почти 4 мес. хранения при +30°С, что эквивалентно примерно году хранения при +20°С, высокую активность сохранили все препараты с рН=3.0 и большинство препаратов с более высоким значением pH в присутствии

крахмала и меди. Мйкроскопирование образцов показало, что в сохранивших активность образцах мицелий в основном лизирован, а вместо него образовались хламидос-поры и конидии.

Таблица 9 - Изменение биологической активности мицелиальной биомассы Т. ахрегеИит в процессе хранения при +30°С с различными компонентами рецептуры

№ Ингредиенты Биологическая активность, %*

рн крахмал, % Си804х5Н20, ррш 75 сут 110 сут

1/1 3.0 5.0 - 80 ав 40 ьо

'/2 3.0 7.5 - 80 "в 50 00

1/3 3.0 10.0 - 80 ае 60"

'/4 3.0 5.0 20 90 < 50 са

1/5 3.0 7.5 20 80 09 50 м

1/6 3.0 10.0 20 70 в 60 е

1/7 3.0 5.0 60 65 ' 0 4

1/8 3.0 7.5 60 75 "е 55 в

1/9 3.0 10.0 60 75 ае 50 са

2/1 4.0 5.0 - 0 в 0 •

2/2 4.0 7.5 - 30 6 0 «

2/3 4.0 10.0 - 40 60 0 *

2/4 4.0 5.0 20 50 с 0 •

2/5 4.0 7.5 20 80 "е 50 м

2/6 4.0 10.0 20 90 е 85 е

2/7 4.0 5.0 60 40 00 0 •

2/8 4.0 7.5 60 65 а 30 "

2/9 4.0 10.0 60 85 • 50 м

*) Значения в колонках, имеющие одинаковые буквенные комбинации, не имеют статистически значимых (при Р=0,05) различий.

Таким образом, препараты, приготовленные по приведенным выше прописям, сохранили биологическую активность в течение длительного времени благодаря переходу мицелия в покоящиеся формы непосредственно в процессе хранения.

После определения ключевых факторов, определяющих сохранение биологической активности товарной формы препарата на основе грибного мицелия, определили оптимальные величины этих факторов в зависимости от состава среды культивирования.

Оказалось, что в образцы, приготовленные на ППС, содержащей 30 мл/л мелассы, введение больших количеств крахмала нецелесообразно; оптимальным является 5-' 10%. Введение только ионов меди продлевает срок хранения, но не столь значительно, как введение крахмала.

Если биомасса гриба получена на ППС, содержащей 60 мл/л мелассы, введение крахмала в течение первь1х трех недель хранения при 30°С незначительно увеличивает сохраняемость биомассы. При более длительном хранении крахмал в концентрации 5 -10% способствует сохранению препарата.

При введении больших количеств крахмала, который в этом случае является не только питательным субстратом, но и сорбентом-носителем, в отсутствие закисления наблюдается возрастание активности в начале хранения, затем ее резкий спад. В этом случае в процессе хранения образуются поверхностные конидии, которые в дальнейшем прорастают, ц из-за нехватки питания проросший мицелий гибнет. Введение в биомассу 40-60 ррш меди усиливает консервирующее действие крахмала.

Мицелий в течение длительного времени (до полугода и более) в форме пасты без добавления питательных веществ и доступа кислорода сохранить не представляется возможным. Такие условия хранения обеспечить невозможно, т.к. они несовместимы с требованиями по хранению готовой продукции.

Для обеспечения длительного хранения биомассе гриба, содержащей в основном мицелий, необходимо создать условия для плавного перехода грибного мицелия в покоящиеся формы непосредственно в процессе хранения, т. е. перевести клетки в «переживающее» состояние - криптобиоз (Феофилова, 2003). Закисление биомассы, введение ионов меди или других ингибиторов метаболизма, или добавление источника энергии, способствует постепенному образованию конидий и хламидоспор в процессе хранения при доступе кислорода.

Очевидно, что в данном исследовании рассмотрены далеко не все факторы, влияющие на сохранение биологической активности мицелия в жидкой фазе. Тем не менее, полученные результаты показывают, что введение в жидкий мицелиальный препарат источника энергии и веществ, замедляющих процессы метаболизма, при обеспечении доступа кислорода позволяет значительно продлить срок хранения препарата - до одного года при обычных условиях хранения.

Таким образом, для сохранения биологической активности биомассы Т.азрегеНит в составе препарата необходимо снизить рН до 2.5-3.0, ввести 5-10% крахмала и 40-60 ррш Си804х5Н20.

Кроме биологической активности, антигрибной биопрепарат должен сохранять свои физико-химические свойства Он не должен расслаиваться в процессе хранения, должен иметь стабильность суспензии не менее 80% и обладать достаточно высокими адгезивными свойствами. Поэтому компоненты разрабатываемой товарной формы оценили также с точки зрения их влияния на физико-химические свойства препарата.

Показано, что паста, состоящая из мицелиальной биомассы, обладает низкими физико-химическими свойствами, из которых в процессе хранения улучшается только стабильность суспензии за счет лизиса мицелия и, соответственно, уменьшения размера частиц. При введении крахмала и меди физико-химические свойства улучшаются. Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), улучшая адгезивные свойства препарата, снижает биологическую активность препарата через 2 месяца хранения при 30°С, поэтому ее введение в препарат может быть рекомендовано только непосредственно перед его применением.

Известно, что одним из «слабых мест» микробиологических препаратов является их низкая устойчивость к таким факторам окружающей среды, как температура и свет различных длин волн. В связи с этим была проведена оценка термо-, свето- и УФ чувствительности мицелия Т. азрегеИит.

Выявлено, что при 40°С культура начинает терять биологическую активность только через «утки, при 50°С это происходит менее чем за 4 ч. Очевидно, что препарат на основе Т. азрегеНит для обработки вегетирующих растений может эффективно использоваться в основном в умеренном климате.

Фотостабильность мицелия Т. аврегеПит зависит от времени экспозиции. После двух суток (48 ч) непрерывного облучения лампами накаливания его активность начинает снижаться. Это неудивительно, поскольку Т. аврегеИит является почвенным 1рибом. Поэтому и УФ стабильность его также низкая: мицелий 71 азреге11ит полностью терял жизнеспособность через 2 ч облучения, независимо от расстояния до источника УФ облучения.

При создании препарата для применения на вегетирующих растениях, в него необходимо вводить фотопротекторы. Были испытаны двуокись титана, древесный уголь и растворимый лигнин, которые повышали устойчивость мицелия Т. аьрегеНит к УФ-облучению уже в концентрации 10%. Увеличение их концентрации в препарате не увеличивало защитный эффект. Однако лигнин снижал биологическую активность препарата, мицелий которого был перед этим фрагментирован. Поэтому в качестве фотопротектора его можно вводить только в рабочую суспензию непосредственно перед применением.

При масштабировании технологии получения жидкого препарата на основе мицелия ТмврегеНит были приготовлены и заложены на храпение 45 вариантов рецептурных форм препарата. Анализ результатов по хранению свидетельствует о том, что состав исходной питательной среды слабо повлиял на сохранение биологической активности (БА).

В целом, препараты на основе пасты, приготовленной из биомассы, выращенной с 30 мл/л мелассы, хранились несколько лучше, чем на среде с 60 мл/л мелассы. При кратковременном хранении (до 1-2 недель) среда с 60 мл/л мелассы предпочтительнее.

Способ концентрирования оказывает большее влияние на сохранение БА, чем состав среды, но меньшее, чем компоненты рецептуры, вводимые в пасту после концентрирования. После концентрирования на центрифуге препараты хранились значительно хуже, чем после концентрирования на сите при прочих равных условиях. Очевидно, это связано с удалением из биомассы части необходимых питательных веществ и травмировании мицелия при использовании производственной центрифуги.

Как было показано ранее, закисление является ключевым фактором, определяющим сохранение БА препарата. Однако снижение рН не должно быть слишком сильным, оптимальное значение рН - 3.0. Если планируется длительное хранение препарата, то в него необходимо вводить не менее 10% крахмала.

Образцы, содержавшие двуокись титана и активированный уголь, лучше сохраняли БА. Двуокись титана сама по себе, по-видимому, нейтральна с точки зрения сохранения БА. Однако за счет высоко развитой поверхности она способна абсорбировать вредные для гриба вещества, что и способствует сохранению БА.

Активированный уголь способствует сохранению БА по той же причине, что и двуокись титана. За счет более высоко развитой поверхности он в большей степени понижает активность воды, что, соответственно, в большей степени способствует сохранению БА. Однозначного вывода по влиянию ионов меди на сохранение БА при масштабировании технологии сделать не удалось. Положительное влияние ингибитора наблюдалось, в основном, в препаратах, полученных с меньшим количеством мелассы. При большом количестве мелассы наличие ионов меди практически не повлияло на сохранении БА.

На основании полученных результатов предложена следующая рецептура препарата на основе биомассы Т. asperellum для обработки семян: закисление до pH 3.0 и добавление крахмала 5-10%. Если планируется длительное хранение препарата, его предпочтительнее нарабатывать на среде с меньшим количеством мелассы (30 мл/л), вводить не менее 10% крахмала и 0.005% сульфата меди. Если хранить длительно не планируется, биомассу можно нарабатывать на среде с 60 мл/л мелассы и вводить только 5% крахмала. Рецептурная форма препарата для обработки вегетирующих растений должна содержать около 10% фотопротектора (активированный уголь или двуокись титана).

Глава 6. Эффективность экспериментальных образцов ми кол а в подавлении возбудителей болезней зерновых и овощных культур

Разработка систем интегрированной защиты требует оценки возможностей применения агентов биологического контроля в сочетании с другими методами, в первую очередь химическими (Великанов, Сидорова, 1988; Дьяков, 1998; Рудаков, 1986; Elad et al., 1994).

Виды грибов р. Trichoderma обладают генетически детерминированной устойчивостью к большинству пестицидов, включая фунгициды, тем не менее, отдельные штаммы микромицета различаются по устойчивости. Исследования по совместимости • микола с химическими фунгицидами показали, что при протравливании семян озимой пшеницы препарат совместим с витаросом, премисом-200 и раксилом. В то же время, в смеси с фундазолом, колфуго дуплет и феразимом микол С не совместим, поскольку эти фунгициды подавляют рост T.asperellum — активного ингредиента биопрепарата. Наши исследования подтверждают необходимость проверки возможности сочетания препаратов на основе грибов р. Trichoderma с конкретными фунгицидами в различных технологиях применения.

В странах с развитым зерновым хозяйством существенно расширился ареал и усилилась вредоносность фузариозов - заболеваний злаковых культур, вызываемых грибами рода Fusarium (Шевелуха и др., 1994; Fusarium, 2002). Возбудителями фуза-риоза колоса (ФК) и зерна пшеницы являются более 20 видов грибов р. Fusarium (Левитин и др., 1998; Levitin et al., 2000; Logrieco, Visconti, 2004).

Потери урожая от фузариозов могут достигать 20-40% и более в зависимости от природно-климатических условий {Fusarium, 2002). Вредоносность ФК проявляется не только в снижении урожая, но и в загрязнении зерна и сопутствующей продукции фузариотоксинами (ФТ), такими как дезоксиниваленол (ДОН) и его производные (3-

Ас-ДОН, 15-Ас-ДОН), а также Т-2 токсин и зеараленон (ЬеуШп, 2004). Фузариоток-сины представляют серьезную опасность для теплокровных животных и человека (Ту-тельян, 1995).

Традиционные меры борьбы с фузариозными гнилями малоэффективны и практически не препятствуют накоплению ФТ в урожае, поэтому продолжается поиск эффективных средств и приемов защиты зерновых культур от ФК (Левитин, 2002).

Испытание препарата микол против фузариоза колоса провели в условиях тепличного эксперимента на искусственном инфекционном фоне. Одновременно оценили эффективность защиты яровой пшеницы (сорт Иволга) от ФК посредством последовательного применения двух защитных средств: предпосевной обработки семян мико-лом С и обработкой растений в фазу колошения-цветения препаратом ЭДП (на основе дрожжей СгурШоссш посЬегии} ОН 182.9), либо вторично — Миколом В. Предпосевная обработка миколом С, так и в сочетании с обработкой в фазу цветения (ЭДП либо 0.1%-й раствор микола В) достоверно снижала развитие болезни (рисунок 8).

Рисунок 8 - Интенсивность развития фузариоза колоса яровой пшеницы при различных способах применения препаратов на фоне искусственного инфицирования (вегетационный эксперимент, обозначение вариантов: 1 — контроль; 1,2- инфицирование F.graminearum; 3 - ЭДП (оп.); 4 - микол С (оп.); 5 - Агат-25К (п/п); 6 - Агат-25К (п/п) + ЭДП (оп.); 7 - микол С (n/n); 8 - микол С (п/п) + ЭДП (оп.); 9 - микол С (п/п) + микол В(оп.); 10 - ТМТД (п/п); 11 - ТМТД (п/п) + ЭДП (оп.); (п/п - предпосевная обработка, оп. — опрыскивание в фазу цветения)

Экономически значимым показателем эффективности обработки семян является продуктивность растений, коррелирующая с массой 1000 зерен (рисунок 9). Наибольшее увеличение продуктивности колоса отмечено при применении микола (варианты 4 и 9). Качество полученного урожая также характеризовали по содержанию микотоксинов в зерне (рисунок 10).

| 50

а

I 40

¡5 30

20

t 10

I о

1 2 34567 8 9 10 11 Вариант

1.2 •

1.0

§ 3 0,8

0,0

» "" V — I

12345878» 10 11

Вариант

23456789 10 11 Вариант

Рисунок 9 - Масса 1000 зерен

Рисунок 10 - Содержание дезокси ниваленола (ДОН) в зерне

Обозначение вариантов на рисунках 9 и 10 как на рисунке 8.

В образцах зерна обнаружен только ДОН; другие микотоксины отсутствовали. Под действием препаратов содержание ДОН в зерне снижалось в 6 - 10 раз во всех вариантах опыта. В вариантах, где применяли ЭДП (вариант 3), Агат-25К (вариант 5) и микол (вариант 10) ДОН отсутствовал.

Через 2 месяца после уборки урожая оценили влияние различных способов обработки на распространенность и интенсивность развития фузариоза в апробационных снопах. В растениях, зараженных К graminearum, в послеуборочный период продолжалось накопление инфекции во всех вариантах за исключением варианта 9, где применили двойную обработку миколом - предпосевную обработку и опрыскивание во время цветения. Именно в этом варианте проявляется наибольшее защитное действие микола от фузариоза. У семян пшеницы, полученных в эксперименте, обнаружено повышение посевных свойств в вариантах с миколом и ЭДП, как при раздельном, так и при совместном применении.

Таким образом, в вегетационном эксперименте на яровой пшенице сорта Иволга показано, что Т.ахрегеИит (микол) является эффективным средством для борьбы с ФК пшеницы. Как предпосевная обработка семян миколом С в дозе 0.5 кг/т, так и опрыскивание растений в фазе цветения 0.1%-ой суспензией микола В снижали интенсивность развития и распространенность заболевания. Сочетание предпосевной обработки и опрыскивания растений усиливали защитный эффект против ФК.

В течение трех полевых сезонов опытные образцы микола испытывали на фоне искусственного заражения озимой пшеницы восприимчивого сорта Купава возбудителем ФК {JF.grаттеагит). Оказалось, что эффективность микола в защите пшеницы от ФК зависит от уровня созданного инфекционного фона и климатических условий. При низком инфекционном фоне (10-15%), а также, при высоком - (85-90%) защитное действие микола обнаружить не удалось. В случае 40-50% распространения болезни эффективность предпосевной обработки семян миколом особенно в сочетании с обработкой во время цветения выявлена с достоверностью (рисунок 11).

221814 10

7 11 2 10 Вариант

5 в 11 7 . в 2 3 в 10 4 12 Вариант

А Б ,

Рисунок 11 - Степень заражения растений пшеницы фузариозом (А) и распространенность заболевания (Б). Средние значения и доверительные интервалы даны с вероятностью 95%. Обозначения вариантов: 1 - Контроль, 2 - Fusarium graminearum, 3

— F. graminearunt + M0.1, 4 - F. graminearum + M0.1 + ЭДП, 5 - F. graminearum + M0.5, 6 - F. graminearum + М0.5+ЭДП, 7 - F. graminearum + M1.0, 8 - F. graminearum + M 1.0 + ЭДП, 9 —F. graminearum + Агат-25, 10 - F. graminearum + Агат-25 + ЭДП, 11

— F. graminearum + раксил, \2 — F. graminearum + раксил + ЭДП.

» . . .

Действие микола С на комплекс возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывали в полевых опытах на сортах Купава и Краснодарская-99 на опытном поле КНИИХС, г.Краснодар. В патокомплексе возбудителей гнилей на сорте Купава на контрольных растениях (19.04.05г.) определены: Fusarium spp. - 58% Bipolaris so-rokiniana (Saçc.) Shoemaker - 10%, Rhizoctonia sp. - 10%, Hymenula cerealis Ellis et Everh. (Cephalosporium gramineum Y. Nisik. et Ikata) - 1.0%, Alternaría spp. - 7%, прочие - 14% (Mucor sp., Aspergillus spp., Pénicillium spp., a также бактерии). Через два месяца (20. 06. 05 г.) спектр фитопатогенов был представлен: Fusarium spp. — 55%, Gaeumannomyces graminis var. tritici J. Walker (Ophiobolus graminis var. tritici ,(J. Walker)) - 27%, Rhizoctonia sp. - 10%, др. - 8% (Acremonium spp., Alternaría sp., Bipolaris sorokiniana, Mucor sp., Aspergillus spp., Pénicillium spp.).

В патокомплексе возбудителей гнилей на сорте Краснодарская-99 в контрольном варианте (19.04.05г.) преобладали: Fusarium sp. - 38%, Bipolaris sorokiniana -9.0%, Rhizoctonia sp. - 20%, Hymenula cerealis - 5.0%, Alternaría sp. - 15.0%, прочие -15.0% (Mucor sp., Aspergillus spp., Pénicillium spp.). Через два месяца (20.06.05 г.): Fusarium sp. - 35%, Gaeumannomyces graminis var. tritici - 28%, Rhizoctonia sp. - 22%, Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron) Deighton (Cercosporella herpotrichoides Fron)

— 5.0%, прочие - 10% (Acremonium spp., Alternaría sp., Bipolaris sorokiniana, Mucor sp., Aspergillus spp., Pénicillium spp./

На этом фоне на обоих сортах пшеницы эффективность микола С оказалась на 11 - 13 % выше, чем раксила, используемого с полной нормой расхода. Совместное применение этих двух препаратов (микол С + раксил), но со сниженной на 40% нормой расхода обеспечивало более эффективное снижение распространения гнилей (на 14-21 %), в сравнении с полной нормой расхода раксила.

/

На йскусственном фоне заражения озимой пшеницы сорта Купава распространение ФК составило 80-68%. На таком высоком инфекционном фоне в варианте, где проводилась обработка вегетирующих растений в фазе колошения 1%-ноЙ суспензией препарата микол В, снижение распространения и развития фузариоза колоса составило 49 и 53%, соответственно. На сорте Краснодарская-99 на более низком фоне развития ФК эти показатели были выше - соответственно 52 и 66%.

На основе биогумуса и Т.азрегеИит разработано комбинированное удобрение, обладающее почвоудобрительным, ростстимулирующим и фунгицидным действием. Предложенная форма биоудобрения способствовала хорошей приживаемости рассады овощных культур, увеличению доли ранней, стандартной продукции и общего урожая. Использование этого комбинированного биоудобрения перспективно в первую очередь на низкоплодородных почвах, в которых микробиопрепараты не проявляют высокой активности либо действуют медленно из-за недостатка питания.

Глава 7. Экологические аспекты применения микола на различны* типах почвы Северо-Кавказского региона

Независимо от способа применения препаратов на основе грибов р. Тг1сИо<^егта (обработка семян, корневой системы, внесение в почву, обработка наземных частей растений) гриб, попадая в почву, вступает в сложные взаимодействия с ее нативной микрофлорой. Характер этого взаимодействия зависит, по крайней мере, от четырех основных факторов: от штамма-интродуцента, типа почвы, природно-климатических условий и растения-хозяина. Вопрос о способности антагониста вписываться в экологические ниши новой среды обитания в каждом конкретном случае требует отдельного исследования. При разработке препаратов на основе микромицетов и рекомендаций по их применению необходимо учитывать, на каких почвах будет применяться препарат, каковы основные систематические группы грибов и бактерий, населяющих ее, каким образом интродукция микромицета повлияет на аборигенную микрофлору.

Учитывая вышесказанное, изучили влияние гриба Т.азрегеИит (в составе препарата микол) на структуру почвенного микробоценоза при выращивании мягкой яровой пшеницы сорта Прохоровка в условиях климатической камеры. Опыт провели на четырех типах почвы, являющихся типичными для Северо-Кавказского региона (Сима-кин, 1988): тип 1 - чернозем малогумусный (карбонатный), мощный и сверхмощный; тип 2 — чернозем типичный, слабо выщелоченный; тип 3 - чернозем выщелоченный, слабогумусный, сверхмощны^; тип 4 - чернозем лугово-болотный. Поскольку в южных районах России при возделывании озимой пшеницы одним из критических параметров является недостаток влаги во время вегетации, эксперимент проводили при нормальной (60-80%) от полной полевой влагоемкости (ППВ) и пониженной (40-60% ППВ) влажности почвы (Посыпанов, 1997).

Семена пшеницы обрабатывали миколом, содержащим мицелий и хламидоспо-ры гриба Т.азрегеИит. Естественную сукцессию микроскопических грибов в почвах оценивали в варианте без растений (К1). В варианте К2 выращивали растения пшеницы без обработки семян, в варианте М1.0 семена обрабатывали миколом С из расчета 1.0 кг/т, в варианте М2.0 — из расчета 2.0 кг/т. В процессе вегетации в образцах почвы анализировали состав микроскопических грибов на стадии всходов (ф. 11), трех ли-

стьев (ф. 13), кущения (ф. 21), выхода в трубку (ф. 30) и колошения (ф. 51-59). Перед, Постановкой опыта определили структуру комплекса почвенных микромицетов во. всех 4-х типах почвы (ф. 0).

Показано, что , эффективность микола С в качестве ростстимулятора пшеницы зависит от типа почвы и ее влажности в период вегетации культуры. Препарат стимулирует рост растений на испытанных типах почвы, особенно на ранних этапах органогенеза пшеницы и в условиях оптимальной влагообеспеченности. Увеличение массы корневой системы пшеницы статистически достоверно при обработке миколом С в дозе 2.0 кг/т на черноземе лугово-болотном, причем в условиях оптимального влаго-обеспечения. Предпосевная обработка препаратом снижает отрицательное действие дефицита влажности на растения на всех типах почвы.

Далее оценили влияние T.asperellum на состав микромицетов разных типов почв в ходе вегетации пшеницы в условиях нормального и пониженного увлажнения.

В ходе исследования было выделено 48 видов почвенных грибов, относящихся к, двум отделам: Zygomycota - 4 и Ascomycota - 3, а также формальной группе несо-. вершенных грибов Anamorphic fungi — 41.

Наибольшее разнообразие микромицетов обнаружено в черноземе лугово-болотном. На всех типах почвы наиболее представленными оказались виды родов Fusarium, Pénicillium и Aspergillus, а также темноокрашенные гифомицеты.

Исходное количество почвенных микромицетов в образцах первых трех типов почвы практически одинаково и составило около 0.9x105 КОЕ/г а.с.п. В черноземе лугово-болотном содержание грибов несколько выше: 1.2х 105 КОЕ/г а.с.п.

В ходе опыта отмечены сложные закономерности изменения содержания мик-; ромицетов на различных почвах, в зависимости от этапа органогенеза и обработки семян миколом С в условиях нормальной и пониженной влажности. Видовое разнообразия микромицетов в ходе всего эксперимента оценивали по индексу Шеннона.

Показана зависимость биоразнообразия микромицетов от типа почвы, ее влаго-обеспечения и дозы применения микола С. В условиях нормального увлажнения пре* парат {1.0 и 2.0 кг/т) не только не снижает их биоразнообразие, но как бы стабилизи-, рует его на черноземе лугово-болотном. В тоже время в концентрации (2.0 кг/т) микол С проявил тенденцию к снижению разнообразия микромицетов на обыкновенном ма-логумусном (карбонатном) черноземе. В условиях пониженной влагообеспеченности под действием биопрепарата проявляется тенденция к снижению биоразнообразия микромицетов на трех из четырех типов почвы за исключением чернозема выщелоченного, слабогумусного.

Влияние микола С на микробобиоценоз почвы изучили также в корнеобитаемом слое почвы опытного поля и в ризосфере пшеницы при проведении полевых испытав ний на пшенице сорта Купава. Во всех почвенных образцах обнаружены микромице-ты, относящиеся К родам Fusarium, Mucor, Pénicillium и Aspergillum, а также бактерии, Ранней весной в почвенных образцах всех вариантов опыта численность микромицетов составляла (0.4-0.9х104 КОЕ/г), бактерий - Cl.2-l.5xl06 КОЕ/г). В конце вегетации пшеницы помимо микромицетов (1.2-1.0х104 КОЕ/г) и бактерий (1.9-2.9х10б КОЕ/г), в образцах корнеобитаемого слоя почвы обнаружены актиномицеты (1.1-2.4x105 КОЕ/г). Таким образом, не выявлено существенных различий между вариан-

тами опыта по количеству микроорганизмов и встречаемости представителей отдельных родов микромицетов в корнеобитаемом слое почвы пшеницы, семена которой были обработаны миколом С в концентрациях от 0.1 до 2.0 кг/т семян.

Изучение динамики изменения микрофлоры в почвенных образцах из ризосферы растений пшеницы показало, что предпосевная обработка её семян миколом С (в концентрации 2.0 кг/т), а также раксилом привела к снижению содержания ризосфер-ных микромицетов. Более низкие дозы микола (0.1 и 1.0 кг/т) не повлияли на содержание микромицетов в ризосфере пшеницы ни в один из периодов наблюдений.

Таким образом, предпосевная обработка семян пшеницы миколом С не влияет на разнообразие и численность микромицетов в почвенных образцах, отобранных с опытных участков из корнеобитаемого слоя почвы. Тем не менее, в ризосфере пшеницы отмечено снижение содержания микромицетов под действием предпосевной обработки семян миколом С в максимальной дозе (2.0 кг/т) и раксилом. В предуборочный период развития пшеницы в её ризосфере во всех вариантах опыта численность микроскопических грибов и их структура практически одинаковы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе проведенного цикла аналитических и многолетних экспериментальных исследований — от скрининга эффективного штамма-продуцента до товарной формы препарата и технологии его применения в производственных условиях - предложена методология получения антигрибных биопрепаратов на основе мицелиальных грибов- антагонистов фитопатогенов. Методология включает 5 основных блоков: многоуровневый скрининг штаммов, процесс культивирования штамма-продуцента, разработка рецептуры препарата, технологии применения и Государственная регистрация. По окончании скрининга перспективный штамм-продуцент биопрепарата должен обладать активностью против выбранных экономически значимых фитопатогенов, не должен быть фитотоксичным по отношению к растениям, на которых планируется его применение, должен быть безвреден для теплокровных животных, охарактеризован по способности к культивированию в жидкой питательной среде. Экспериментальные образцы должны показать биологическую эффективность в вегетационных экспериментах на искусственном и естественном инфекционном фоне. Выбор компонентов питательной среды, их оптимизация, а также определение параметров культивирования осуществляется в многофакторных экспериментах. Целью этого блока исследований является получение максимально возможного количества биомассы при минимальных затратах сырьевых ресурсов. На этапе создания рецептуры препарата необходимо выбрать форму биомассы (конидии, мицелий, хламидоспоры) и путем варьирования ингредиентов обеспечить ее стабильность при определенных условиях хранения и применения. При разработке технологий применения необходимо учитывать также физиологические свойства штамма-продуцента, чтобы сохранить его жизнеспособность. Завершающим этапом является прохождение Государственной регистрации и включение нового препарата в Государственный Каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Методом ступенчатого скрининга коллекции микромицетов родов Penicillium Qliocladium, Trichoderma в системах in vitro и in vivo с использованием коллекции фи-топатогенных микроорганизмов, отобран штамм 16 Т. asperellum как перспективный продуцент биопрепарата для защиты растений от болезней. При тестировании in vitro штамм 16 T.asperellum проявил гиперпаразитическую активность в отношении фито-патогенов из родов Fusarium, Alternaría, Pyrenophora, Bipolaris, Pleospora (Phoma be-tae), Phytophthora, Botrytis, Glomerella (Colletotrichum), Thanatephorus (Rhizoctonia sotaní), Penicillium и Aspergillus. Изучены культурально-морфологические и биохимические свойства штамма, особенности конидиогенеза при культивировании в глубинной культуре, свойства фиалоконидий различного происхождения.,

2. Показана биологическая эффективность опытных образцов препарата (на основе штамма 16 Г. asperellum) при предпосевной обработке семян ячменя, овощных культур, льна-долгунца, лекарственных растений, хвойных пород деревьев. Препарат снижал заболеваемость ячменя гельминтоспориозом (возбудители: Pyrenophora teres Drechsler, Bipolaris sorokiniana (Sacc.) ShoemPyrenophora gramínea S. Ito et Kurib.) в 1.5-2 раза, обеспечивая сохранение урожая на 13 - 30%. Обработка препаратом (2%-ной концентрации) вегетирующих растений льна вдвое снизила заболеваемость растений фузариозным увяданием {Fusarium oxysporum Schl.), ржавчиной (Melampsora lini var. lini (Ehrenb.) Lév.) и бактериозами (Clostridium macerans Schard.). На землянике 5%-ая суспензия биомассы гриба (в дозе 15 кг/га) эффективно (на 70-90%) снижала заболеваемость мучнистой росой (Sphaerotheca humuli (DC.) Burrill), белой пятнистостью листьев (Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau) и серой гнилью (Botrytis cinerea Pers.).

3. Разработана сбалансированная полусинтетическая питательная среда на основе мелассы, позволяющая грибу T.asperellum реализовать полный цикл онтогенеза. Среда оптимизирована по основным технологическим параметрам культивирования (источники питания, скорость массопередачи по кислороду, время культивирования и др.), она обеспечивает получение биомассы гриба в виде мицелия и хламидоспор или фиалоконидий. В оптимизированных условиях культивирования в течение 48 - 96 ч накопление биомассы в виде мицелия составляет 70 г/л, либо фиалоконидий (через 96 ч) в титре 3.8x10® КОЕ/мл.

4. Впервые создана рецептурная форма препарата Т. asperellum на основе его мицелиальной биомассы. Показано, что длительное сохранение биологической активности препарата обусловлено наличием запаса питательных веществ в хранящейся готовой рецептурной форме и доступом кислорода. Процессы метаболизма в мицелии Т. asperellum могут быть существенно замедлены при снижении рН и введении ингибиторов дыхания. Длительное (до 1 года) сохранение биологической активности препарата, приготовленного на основе мицелиальной пасты, может быть достигнуто за счет перевода мицелия (путем снижения рН биомассы, введения крахмала и солей меди) в покоящиеся формы - фиалоконидии и хламидоспоры.

5. Разработаны две рецептурные формы препарата на основе штамма 16 T.asperellum - для предпосевной обработки семян и для обработки вегетирующих рас-

тений. Обе товарные формы состоят из закисленной (до pH 2.5-3.0) концентрированной мицелиальной биомассы гриба, крахмала (5-10%) и 40-100ppm CuS04x5H20 (в зависимости от среды культивирования и планируемых сроков хранения). Для лучшей адгезии в товарную форму перед протравливанием семян рекомендуется вводить натриевую соль КМЦ (3-5%). В рецептурную форму для обработки вегетирующих растений необходимо вводить фотопротекторы (активированный уголь, двуокись титана). Необходимое уменьшение дисперсности препарата достигается механическим размельчением готового мицелия перед использованием.

6. Проведено масштабирование процесса ферментации культуры T.asperellum на ферментерах объемом 25 дм3, 60дм3,100 дм3 и промышленных ферментерах (объемом 1000 дм3) в условиях Краснодарского экспериментального Центра биологической защиты растений. Составлен проект опытно-промышленного регламента производства препарата микол (в форме пасты) на основе гриба T.asperellum (ОПР 00001927-15-1402004).

7. В вегетационных экспериментах на яровой пшенице и в полевых опытах на озимой пшенице показано, что микол является перспективным средством для борьбы с фузариозом колоса пшеницы. Как предпосевная обработка семян, так и опрыскивание растений в фазе цветения снижали интенсивность развития и распространенность заболевания. Распространение и развитие болезни в отдельных опытах снизилось на 56%, сохраненный урожай оценен в 10 - 12%, при этом содержание в зерне фузарио-токсина дезоксиниваленола снизилось в 6 - 10 раз.

8. При выращивании пшеницы на разных типах почвы показано, что рострегу-лирующая активность микола особенно на ранних этапах органогенеза пшеницы существенно зависит от типа почвы и ее влажности. Микол снижает негативное действие дефицита влаги на пшеницу.

9. Выявлено, что предпосевная обработка семян озимой пшеницы биопрепаратом, содержащим живую культуру T.asperellum, не влияет на структуру и численность микроорганизмов корнеобитаемого слоя на участках, где возделывалась пшеница из семян, обработанных миколом и/или обработанная им в период вегетации. Продемонстрировано, что в условиях достаточного увлажнения почвы микол (в дозах 1.0 и 2.0 кг/т семян) либо не снижает биоразнообразие почвенных микромицетов либо «стабилизирует» его. В условиях пониженной влагообеспеченности под действием микола проявляется тенденция к снижению биоразнообразия микромицетов на трех из четырех изученных типов почвы.

10. Определен спектр химических протравителей, совместимых с биопрепаратом. Установлено, что микол можно совмещать с такими фунгицидами, как витарос, премис-200 и раксил, используемыми для предпосевной обработки семян озимой пшеницы, в том числе и зараженных головневыми грибами (Tilletia laevis Kuehn., Т. controversa Kuehn.). Показано, что при преобладании в патокомплексе озимой пшеницы возбудителей корневых и прикорневых гнилей (Fusarium spp., Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, Rhizoctonia sp., Hymenula cerealis Ellis et Everh.) наиболее эффективно для предпосевной обработки семян пшеницы совместное применение микола С (1.0 л/т) и раксила со сниженной на 40% нормой расхода протравителя (0.3 л/т). С

фундазалом, колфуго дуплет и феразимоМ микол не совместим, поскольку эти фунгициды депрессируют рост T. asperellum.

Список основных научных трудов по теме диссертации

I. Статьи в изданиях, в которых рекомендуется публикация основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук

1. Коломбет, Л.В. Биологическая эффективность Tríchoderma asperellum GJS 03-35 и дрожжей Cryptococcus nodaensis ОН 182.9 против возбудителя фузариоза колоса пшеницы / Л.В. Коломбет, A.A. Старшов, Д. Шислер // Микология и Фитопатология. - 2005. - Т. 39, вып 5. - С. 80-88.

2. Колесова, Д. А. Диагностика инфицирования сельскохозяйственных растений фитопатогенами - необходимое условие оптимизации применения современных фунгицидов / Д.А. Колесова, П.Г. Чмырь, Л.В. Коломбет // Агрохимия. - 2004. - № 11.-С. 87-93.

. 3, ■ Сойтонг, К. Применение препарата Кетомиума для защиты растений от болезней / К. Сойтонг, Л.В. Коломбет // Агрохимия. - 2003. - № 9. - С. 57-62.

4. Коломбет, Л.В. Изучение Микофунгицида — препарата для борьбы с болезнями растений на основе Tríchoderma viride / Л.В. Коломбет, C.K. Жиглецова, B.B. Дербышев, Д.В. Ежов, Н.И. Косарева, Е.В. Быстрова// Прикладная биохимия и микробиология. - 2001. -Т. 37, № 1. - С. 98-102.

5. Добрица, А.П. Разработка биопестицидов против колорадского жука / А.П. Добрица, Н.Г. Корецкая, В.И. Гайтан, Л.В. Коломбет, В.В. Дербышев, С.К. Жиглецова // Российский химический журнал. - 2001. - T. XLV, № 5-6. - С. 174-184.

6. Коломбет, JÏ.B. Защита растений в третьем тысячелетии: где химия встречается с экологией // Arpo XXI. -1999. - № 10. - С. 3-5.

7. Ремнев, Ю.В. Использование микрофильтрации при очистке и концентрировании вируса миелобластоза птиц / Ю.В. Ремнев, А.К. Ажермачев,В.П. Чупрунов, В.В Стариков, Г.В. Чернявская, А.Б. Кошкин, Е.В. Новиков, Л.В. Коломбет, В.А. Чугунов, П.В. Бабаева // Биотехнология. -1986. - № 2. - С. 86-88.

8. Kolombet, L.V. Development of an extended shelf-life, liquid formulation of the biofiingicide Tríchoderma asperellum / L.V. Kolombet, S.K. Zhigletsova, N.I. Kosareva, E.V. Bystrova, V.V. Derbyshev, S.P. Krasnova, D. Schisler // World Journal of Microbiology & Biotechnology. - 2006 (в печати).

9. Коломбет, Л.В. Обоснование оптимальных доз биопрепарата Микол (на основе Tríchoderma asperellum) для озимой пшеницы / Л.В. Коломбет // Arpo XXI. -2006. № 1-3. (в печати).

10. Коломбет Л.В, Экспресс-оценка антигрибного, рострегулирующего и фито-токсического действия протравителей семян / Л.В. Коломбет, М.С. Соколов // Агрохимия. — 2006. -№ 8. (в печати).

II. Статьи в аналитических сборниках и материалах конференций

11. Зиновье&а, Л.В. Технико-экономическая оценка перспективности промышленного производства глубинного препарата вертициллина глубинным способом / Л.В. Зиновьева, Е.О. Потапова, Е.В. Власова, Л.В. Коломбет, А.Г. Чигалейчик // Тез. докл. Всесоюзной науч. конф. «Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений», 16-18 мая 1989 г., Велегож. - 1989. - С. 223.

12. Третьяков, В.А. Технико-экономическая оценка внедрения препарата «Бак-толарвицвд-паста» / В.А. Третьяков, Л.В. Коломбет, В.В. Маринкевич, Э.И. Соколова, Н.М. Кулиева И Тез. докл. Всесоюзной науч. конф. «Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений», 16-18 мая 1989 г., Велегож.-1989.-С. 306.

13. Лабораторный регламент на производство грибного биологического препарата «Микофунгицид» ЛР 00001927 -15-43-93. - 1993.- 54 С.

14. Коломбет, Л.В. Глубинная технология производства микофунгицида на основе грибов Trichoderma viride / Л.В. Коломбет, В.В. Дербьппев, Р.А. Степанова, Д.В. Ежов, О.В. Дианова // Материалы международной науч.-практ. конф. «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», 1216 сент. 1994 г., Одесса. - 1994. - С. 139.

15. Коломбет, Л.В. Поиск штамма гриба рода Trichoderma, эффективного против болезней зерновых культур / Л.В. Коломбет, О.В. Дианова // Материалы международной науч.-практ. конф. «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», 12-16 сент. 1994 г., Одесса. - 1994. — С. 141.

16. Жиглецова, С.К. Разработка товарной формы микофунгицида на основе мицелия гриба Trichoderma viride / С.К. Жиглецова, Л.В. Коломбет, О.В. Дианова. // Материалы международной науч.-практ. конф. «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», 12-16 сент. 1994 г., Одесса. - 1994. - С. 147.

17. Дербьппев, В.В. Принципы масштабирования при разработке малотоннажных технологий производства микробиологических средств защиты растений / В.В. Дербышев, В.Е. Лиховидов, Л.В. Коломбет, О.В. Дианова // Материалы международной науч.-практ. конф. «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», 12-16 сент. 1994 г., Одесса - 1994. — С. 234.

18. Коломбет, Л.В. Испытания микофунгицида против гельминтоспорИоза ячменя / Л.В. Коломбет, Н.Н. Труканавичене // Материалы международной науч.-практ. конф. «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней», 12-16 сент. 1994 г., Одесса. - 1994. - С. 316.

19. Kolombet, L.V. Conception of régional small-scale production of biopesticides / L.V. Kolombet, V.E. Lickhovidov // Proc. of the VIII International Plant Protection Congress, 2-7 July 1995, The Hague, The Netherlands. - 1995. - P. 0143.

20. Жариков, Г.A. Опыт использования фунгицидного биогумуса против болезней растений / Г.А. Жариков, Л.В. Коломбет, Н.И. Киселева, Н.Н. Галкина, Р.В. Боровик, Н.Р. Дядищев II Материалы науч. конф. «Биотех-95», 18-20 октября 1995, Днепропетровск. -1995. - С.

21. Жариков, Г.А. 1995. Получение комбинированных форм биогумуса, обладающих фунгицидной активностью против болезней растений / Г.А. Жариков, Н.Н. Галкина, Л.В. Коломбет, Н.И. Киселева, Р.В. Боровик // Тез. докл. I Всероссийской конф. токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсиколог гии», СПб. - С. 3-19.

22. Лиховидов, В.Е. Сравнительная физиолого-биохимическая и биотехнологическая оценка географически отдаленных штаммов энтомопатогенных и микофиль-ных грибов / В.Е. Лиховидов, Л.В. Коломбет, Р.А. Степанова // Тез. докл. Всероссийского съезда по защите растений «Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность», декабрь, СПб.-1995.-С. 333.

23. Жариков, Г.А. Новое поколение биоудобрений комплексного действия / Г.А. Жариков, Н.Р. Дядшцев, RH-. Галкина, Л.В. Коломбет, Н.И. Киселева, Р.В. Боровик // Ргос. of a Symposium Ecological Problems of Plant Protection and Contemporary Agriculture, 25-29 September 1995, Slovakia. - 1995. - P. 133-134.

24. Dobritsa, A.P. Construction of new biological control agents combining insecti-cidal activity and the ability to suppress phytopathogens / A.P. Dobritsa, L.V. Kolombet, N.N. Galkina, N.G. Koretskaya, V.V. Kochetkov. // Proc. of the Fourth International workshop on Plant Growth-promoting Rhizobacteria. Japan-OECD Joint Workshop «Plant Growth-promoting Rhizobacteria. Present Status and Future Prospects», 5-10 October 1997, Sapporo, Japan. - 1997. - P. 217-220.

25. Kolombet, L. Biological control of phytopathogens using Trichoderma viride isolate 16 / L. Kolombet, K. Soytong // Journal of King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang. - 1998. - Vol. 6, N 2.-P. 17-21.

26. Kolombet, L. A new Russian strain of Trichoderma viride as effective biological control agent against phytopathogens and plant growth stimulant in Thailand / L. Kolombet, K. Soytong // Materialy VIII Ogolnopolskiego Zjazdu Naukowego «Hodowia Roslin Ogrodniczych u progu XXI wieku» Akademia Rolnicza, Lublin. — 1999.

27. Soytong, K. Evaluation of Ketomium and Trichoderma for biological control of tomato and cucumber wilt in Russia / K. Soytong, L. Kolombet // Materialy VIII Ogolnopolskiego Zjazdu Naukowego «Hodowia Roslin Ogrodniczych u progu XXI wieku» Akademia Rolnicza, Lublin. -1999.

28. Kolombet, L. Joint evaluation of a new Russian strain of Trichoderma viride and Thai bio-preparations Ketomium and Trichoderma as effective biological control agents in Thailand and in Russia / L. Kolombet, K. Soytong // XlVth International Plant Protection Congress Plant Protection Towards The Third Millennium -Where Chemistry Meets Ecology Jerusalem, 25-30 July 1999. - 1999. - P. 72.

29. Kolombet, L. Micofungicide as biological agent for wheat protection against root rot // XlVth International Plant Protection Congress Plant Protection Towards The Third Millennium -Where Chemistry Meets Ecology Jerusalem, 25-30 July 1999. - 1999. - P. 107.

30. Soytong, K. 1999. Biological products of Chaetomium for controlling tomato and cucumber wilt in Russa / K. Soytong, L. Kolombet // XlVth International Plant Protection Congress Plant Protection Towards The Third Millennium -Where Chemistry Meets Ecology Jerusalem, 25-30 July 1999. - 1999.

31. Lichovidov, V.E. System of microbiological protection of plants in the zones of high ecological risk of use of chemically synthesized pesticides / V.E. Lichovidov, L.V. Kolombet, N.N. Galkina, F.Sh. Isangallin // 32nd Annual Meeting of Society for Invertebrate Pathology, 23-27 August 1999, Irvine, California, USA. - 1999. - P. 53.

32. Коломбет, Л.В. Препарат микофуницид на основе микофильного гриба Trichoderma viride для борьбы с болезнями растений. Проблемы медицинской и экологической биотехнологии / Л.В. Коломбет, С.К. Жиглецова, В.В. Дербышев, Д.В. Ежов, Н.И. Косарева, Е.В. Быстрова// Сб. тез. докл. юбилейной науч. конф., 14-15 дек.

1999, Оболенск, Россия. - 1999. - С. 184.

33. Киселева, Н.И. Получение комбинированного биоудобрения. Проблемы медицинской и экологической биотехнологии / Н.И. Киселева, Г.А. Жариков, Л.В. Коломбет, Н.И. Галкина, Р.В. Боровик, Н.Р. Дядищев И Сборник тезисов докладов юбилейной научной конференции, 14-15 дек. 1999, Оболенск, Россия. —1999 - С. 183.

34. Лиховидов, В.Е. Система микробиологической защиты растений для зон повышенного. экологического риска использования пестицидов химического синтеза. Проблемы медицинской и экологической биотехнологии / В.Е. Лиховидов, Л.В. Коломбет, Н.Н. Галкина, Ф.Ш. Исангалин И Сб. тез. докл. юбилейной науч. конф., 14-15 декабря 1999, Оболенск, Россия. -1999. - С.187.

35. Коломбет, Л.В. Вероятность возникновения резистентности к энтомопато-генным эндотоксинам Bt у колорадского жука и других насекомых. Современные системы защиты и новые направления в повышении устойчивости картофеля к колорадскому жуку; Под ред. Г. Скрябина и К.В. Новожилова // Генетическая инженерия и экология.-М., 2000.-Т. 1.- С. 59-62.

36. Kolombet, L. Biological control of insect pests using Bacillus thuringiettsis in a future perspectives. Advanced study on plant pest biological control // Heilongjiang Science and Technology Press, China, Harbin. - 2000. - C. 40-52.

37. Kolombet, L. A new Russian strain of Trichoderma viride as effective biological control agent against phytopathogens and plant growth stimulant in Thailand. Advanced study on plant pest biological control / L. Kolombet, K. Soytong // Heilongjiang Science and Technology Press, China, Harbin. - 2000. - C. 121-122.

38. Soytong, K. Evaluation of Ketomium and Trichoderma for biological control of tomato and cucumber wilt in Russia. Advanced study on plant pest biological control / K. Soytong, L. Kolombet // Heilongjiang Science and Technology Press, China, Harbin. -

2000, —C. 123-124.

39. Коломбет, Л.В. Разработка биопрепарата на основе микофильного гриба Trichoderma viride для предпосевной обработки семян зерновых культур. Биологиза-ция защиты растений: состояние и перспективы // Материалы докл. международной науч.-практ. конф., 18-22 сент. 2000 г., Краснодар. - 2000. - С. 19-20.

40. Коломбет, Л.В. Грибы рода Trichoderma как продуценты биофунгицидов: прошлое, настоящее, будущее // I съезд микологов России, апр. 2002 г., Москва. -2002.-С. 229.

41. Коломбет, Л.В. Микофильные грибы как продуценты биофунгицидов: прошлое, настоящее, будущее / Л.В. Коломбет, Н.И. Косарева, Е.В. Быстрова // II между-

народная конференция «Биотехнология и бизнес», 16-17 мая 2002 г., Москва. - 2002. -С. 82-83.

42. коломбет, Л.В, Разработка технологии производства биологического препарата Микофунгицида для борьбы с болезнями сельскохозяйственных культур // Международный Симпозиум «Интегрированные системы защиты садов и виноградников. Создание новых агротехнологий и техники для применения средств защиты растений с минимальными экологически рациональными нормами расхода», сент. 2002 г., Венгрия. -2002.

43. Коломбет, Л.В. Микофунгицид — биологический препарат для борьбы с болезнями растений / Л.В. Коломбет, Н.И. Косарева, С.К. Жиглецова, В.В. Дербышев, Е.В. Быстрова, Д.В. Ежов //1 Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития», 14-18 окт. 2002 г., Москва. — 2002. - С. 142.

44. Киселева, Н.И., Жариков Г.А., Дядшцев Н.Р., Коломбет Л.В., Галкина H.H. Получение комбинированного биоудобрения с фунгицидными свойствами / Н.И. Киселева, Г. А. Жариков, Н.Р. Дядищев, Л.В. Коломбет, H.H. Галкина //1 международная конференция «Дождевые черви и плодородие почв», 21-23 ноябр. 2002 г., Владимир. -2002.-С. 100-101.

45. Kolombet, L.V. Mycofungicid — a preparation based on Trichoderma viride for plant disease control / L.V. Kolombet, S.K. Jigletsova, V.V. Derbishev, N.I. Kosareva, E.V. Bistrova // 8th International Congress of Plant Pathology, 2-7 February 2003, Chiscthurch, New Zealand. - 2003. - P. 46.

46. Коломбет, Л.В. Микофильные грибы как продуценты биофунгицидов. Теория и практика // Постоянная Комиссия по биологической защите леса «Современные проблемы биологической защиты леса и сельскохозяйственных культур»: Бюллетень Ка 3. - Звенигород. -2003. - С. 59-64.

47. Коломбет, Л.В. Исследование факторов стабилизации пастообразных биопрепаратов на осрове мицелиальных грибов / Л.В. Коломбет, С.К. Жиглецова, В.В. Дербышев, Н.И. Косарева, Е.В. Быстрова // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», ноябрь 2003 г., Москва. - 2003.- С. 201.

48. Borisov, Y. The New Russian Bioproducts for Biological Agriculture Proceedings of the first KMITL / Y. Borisov, L. Kolombet // International conference on integration of science and technology for sustainable development, August 25-26, Bangkok, Thailand. -2004.

49. Опытно - промышленный регламент на производство препарата Микола для борьбы с болезнями растений ОПР 00001927-15-140-2004.- Оболенск. - 2004. - 65 С.

50. Коломбет, Л.В. Комбинация биопрепаратов для борьбы с фузариозом колоса пшеницы. Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем / Л.В. Коломбет, М.С. Соколов, В.П. Чупрйна, Д.А. Шислер, Г.Дж. Самуелс // Материалы международной науч.-практ. конф., 29 ceirr.-l окт. 2004 г., Краснодар. - 2004. - С. 217-218.

51. Соколов, М.С. Биологическая защита растений в агроландшафте: состояние, проблемы и пути решения. Биологическая защита растений — основа стабилизации аг-

роэкосистем / М.С. Соколов, JI.B. Коломбет // Материалы международной науч.-практ. конф., 29 сент.-1 окт. 2004 г., Краснодар. - 2004.

52. Kolombet, L.V. Preparation on the basis of Trichoderma asperellum in the system of biological protection of what from Fusarium ear scab / L.V. Kolombet, M.S. Sokolov, V.P. Chuprina, D.A. Schisler, G.J. Samuels // J. of Zhejiang University Agreeculture and life sciences Proceedings of Eighth International Workshop on Trichoderma and Gliocladium-2004. - Vol. 30, N 4. - P. 394-395.

53. Sokolov, M.S. Biological protection of plants in agricultural landscape - state od the art, problems and ways of their decision / M.S. Sokolov, L.V. Kolombet // J. of Zhejiang University Agreeculture and life sciences Proceedings of Eighth International Workshop on Trichoderma and Gliocladium.- 2004. - Vol. 30, N 4. - P. 398-400.

54. Kolombet, L.V. The Use of Trichoderma asperellum and the Yeast Cryptococcus nodaensis in Russia to Reduce Fusarium Head Blight / L.V. Kolombet, M.S. Sokolov, T.V. Pavlova, D.A. Schisler, G.J.Samuels // Proceedings of the II International Symposium on Fusarium Head Blight, 11-15 December 2004, Orlando, Florida, USA. - 2004. - P. 342.

55. Микол (Триходермин) Технические условия ТУ 9291- 029- 00479327-2005. - Оболенск. - 2005. - 15 С.

56. Технологическая инструкция по применению Микола. - Оболенск. - 2005. -

8 С.

57. Коломбет, JI.B. Влияние гриба Trichoderma asperellum на биоразнообразие микроскопических грибов в различных типах почв Краснодарского края / Л.В. Коломбет, В.А. Говорунова, С.Г. Бесаева, А.В. Александрова // Материалы второго Всероссийского съезда по защите растений «Фитосанитарное оздоровление экосистем», 5-10 декабря 2005, Санкт- Петербург. - 2005.- том 2, стр. 165-166.

III. Авторские свидетельства

58. A.C. Способ получения иммобилизованных нуклеиновых кислот / А.Н. Бай-дусь, П.В. Бабаева, Ю.В. Ремнев, Л.В. Коломбет, Р.В. Боровик. 1230187; 1983.

59. А.с. Способ активации гена / В.И. Киселев, В.Н. Верясов, И.К. Зубашев, Е.И. Асташкин, Л.В. Коломбет. - № 1258078; 1985.

60. А.с. Способ получения РНК-зависимой ДНК-полимеразы / Е.В. Новиков, А.Б. Кошкин, В.П. Чупрунов, Г.М. Дряхлова, Ю.В. Ремнев, А.К. Ажермачев, А.Н. Байдусь, Л.В. Коломбет, П.В. Бабаева, Б.Д. Огорельцев. - № 1342021; 1986.

IV. Патенты

61. Пат. Российская Федерация, МПК С 057F 11/08, 11/00 (023506). Способ получения биоудобрения / Киселева Н.И., Жариков Г.А., Галкина Н.Н., Коломбет Л.В., Боровик Р.В., Дядищев Н.Р.-№ 97122342/13; 1997.

62. Пат. Российская Федерация. Препарат для защиты растений от болезней / Коломбет Л.В., Ежов Д.М., Жиглецова С.К., Быстрова Е.В., Косарева Н.И. — № 2170511; 20.07.2001.

63. Пат. Российская Федерация. Штамм бактерий Pseudomonas ßuorescens Р469 для получения препарата против брлезней растений, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями /Асланян Е.М., Галкина H.H., Добрица А.П., Коломбет Л.В., Корецкая Н.Г., Кочетков В.В. -№ 2235771; 10.09.2004.

64. Премия Совета министров СССР за разработку и организацию промышленного производства реагентов для синтеза генетических структур. Диплом № 06424, 15 апреля 1987 года.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность академику РАСХН Левитину М.М. за внимание и ценные рекомендации при обобщении основных результатов работы. Глубокую признательность коллегам и сотрудникам ГНЦ ПМ, принимавшим участие в работе: к.х.н. С.К. Жиглецовой, к.м.н. В.В. Дербышеву, Н.И. Косаревой, Е.В. Быстровой, С.П. Красновой, к.б.н. Н.И. Киселевой, С.Г. Бесаевой, В.А. к.б.н. Говоруйовай, A.B. Старшову. Моя искренняя благодарность к.б.н. A.B. Александровой (кафедра микологии и альгологии МГУ) за высокопрофессиональные консультации и неоценимую помощь в таксономических исследованиях.

Сотрудникам ВНИИ БЗР и КНИИХС им. Лукьяненко (г. Краснодар) за проведение полевых испытаний опытных образцов и партий препарата микол. Сотрудникам ВНИИ садоводства им. И.В.Мичурина, испытавшим микол против болезней садовой земляники, заведующей биолабораторией Вологодской СТАЗР H.H. Труканавичене за многолетнее плодотворное сотрудничество по испытанию препарата на ячмене и льне, к.б.н. Ю.И. Гниненко (Московский государственный университет леса) за оценку фунгицидной и ростстимулирующей активности препарата на хвойных породах в лабораторных и вегетационных опытах.

Особая благодарность В.А. Ярошенко (ГУ «Краснодарский экспериментальный центр биологической защиты растений») и его сотрудникам в течение многих лет проводивших испытания препарата в хозяйствах Краснодарского края, а также участвовавших в масштабировании технологии производства препарата.

Профессорам Боровику Р.В. (НИЦ ТБП, г. Серпухов) и Волкову В.Я. (ГНЦ ПМ, п. Оболенск) благодарна за творческий импульс, способствовавший многолетнему исследованию*

Моих зарубежных коллег проф. К. Сойтонга (Королевский Технологический Институт, Бангкок, Таиланд), проф. Д. Шислера (Институт научного обслуживания сельского хозяйства, Пеория, США) за сотрудничество в области биологической защиты растений.

Благодарю за поддержку и помощь моих друзей и родных, помогавших на всех этапах выполнения работы.

V. Профессиональные награды

Отпечатано: ИП А. А. Кулаков, г. Серпухов, Борисовское шоссе, 18, тел.: 75-37-05 Подписано в печать: 05.04.2006 г. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Коломбет, Любовь Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ГРИБЫ РОДА ТШСНОВЕКМА - ПРОДУЦЕНТЫ

БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ РАСТЕНИЕВОДСТВА

1.1 Современные представления о классификации 15 грибов рода Тпскос1егта

1.2 Биологические особенности грибов р.ТпсНос^егта, 19 обеспечивающие их активность в качестве биоконтрольных агентов

1.3 Взаимоотношения грибов р. Тпско(1егта с высшими 49 растениями и почвенной микрофлорой

1.4 Биотехнологические проблемы создания препаратов 66 на основе грибов р. ТпсИос1ета для растениеводства

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Штаммы микроорганизмов, питательные среды

1.2 Методы скрининга перспективных штаммов- 78 продуцентов

1.3 Физиолого-биохимические и электронно-микроскопи- 79 ческие исследования штамма

Тпско<1егта аярегеНит

2.4 Микробиологические, микологические и химические 82 методы анализа (почвенных образцов, семян)

2.5 Технология и рецептура экспериментальных образцов 83 препаратов

2.6 Схемы вегетационных и полевых опытов с тест- 85 культурами

2.7 Оценка действия микола на проростки пшеницы

2.8 Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. ВЫБОР И ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОДУЦЕНТА БИО- 97 ПРЕПАРАТА - ГИПЕРПАРАЗИТА ФИТОПАТОГЕН-НЫХ ГРИБОВ

3.1 Скрининг штаммов микромицетов, обладающих анти- 97 грибной активностью

3.2 Физиолого-биохимические свойства активных штаммов 105 р .Trichoderma

3.3 Фиторегуляторная активность штамма и обоснование 113 оптимальных доз для защиты пшеницы от болезней

3.4 Первичная оценка биологической эффективности опыт- 122 ных образцов препарата

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЛУБИННОГО КУЛЬ- 136 ТИВИРОВАНИЯ TRICHODERMA ASPERELLUM, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЙ МАКСИМАЛЬНЫЙ ВЫХОД АКТИВНОЙ БИОМАССЫ ГРИБА

4.1 Разработка питательной среды, способствующей фор- 141 мированию разных микроморфологических форм T.asperellum (мицелий, хламидоспоры, фиалоконидии)

4.2 Оптимизация питательной среды (по источникам азота 144 и углерода, отношению C:N и др.) и сроков культивирования, обеспечивающих максимальный выход биомассы

4.3 Изучение факторов, влияющих на формирование хла- 153 мидоспор и фиалоконидий при глубинном выращивании Т. asperellum

4.4 Факторы культивирования, влияющие на жизнеспособ- 161 ность при хранении мицелия, конидий и хламидоспор гриба

4.5 Масштабирование процесса ферментации на ферменте- 165 pax емкостью 25, 60 и 100 дм

4.6 Масштабирование процесса культивирования Т. 177 asperellum на базе Краснодарского экспериментального Центра биологической защиты растений по программе воспроизведения ОПР 00001927-15-140

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА ТОВАРНЫХ ФОРМ БИОПРЕПАРА- 184 TOB, ПОЛУЧАЕМЫХ ГЛУБИННЫМ КУЛЬТИВИРОВАНИЕМ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ СОХРАНЯЕМОСТЬ БИОМАССЫ АНТАГОНИСТА И ЕГО БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ

5.1 Выбор режимов концентрирования биомассы и метода 185 ускоренного хранения экспериментальных образцов

5.2 Определение факторов, влияющих на сохранение био- 187 логической активности препаратов на основе грибного мицелия

5.3 Физико-химические свойства различных форм 201 мицелиальных препаратов

5.4 Разработка товарной формы препарата для обработки 203 вегетирующих растений

5.5 Сохраняемость свойств биомассы в составе разработан- 209 ной рецептуры при масштабировании процесса приготовления препаратов

ГЛАВА 6. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБ- 212 РАЗЦОВ МИКОЛА В ПОДАВЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНЕЙ ЗЕРНОВЫХ И ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

6.1 Эффективность микола совместно с химическими фун- 212 гицидами

6.2 Эффективность микола в подавлении фузариоза колоса 215 пшеницы

6.2.1 Тепличные эксперименты с яровой пшеницей

6.2.2 Эффективность биопрепаратов на посевах озимой пше- 222 ницы в условиях Краснодарского края

6.3 Действие микола на комплекс возбудителей корневых 231 гнилей пшеницы

6.4 Новое комбинированное биоудобрение, оценка его био- 245 логической и экологической эффективности

ГЛАВА 7. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ МИ- 250 КОЛА НА РАЗЛИЧНЫХ ТИПАХ ПОЧВЫ СЕВЕРОКАВКАЗСКОГО РЕГИОНА

7.1 Зависимость рострегулирующего эффекта биопрепарата 253 от типа почвы и ее увлажения

7.2 Динамика биоразнообразия микроскопических грибов в 262 присутствии T.asperellum

7.3 Влияние препарата на численность микробобиоты в полевых экспериментах

Введение Диссертация по биологии, на тему "Научное обоснование и практическая реализация технологии создания грибных препаратов для защиты растений от болезней"

Одним из перспективных продуцентов биопрепаратов являются почвенные грибы рода Trichoderma Pers.: Fr. Они способны подавлять развитие широкого спектра фитопатогенных грибов, синтезировать активные метаболиты, в качестве препаратов для растениеводства, медицины и ветеринарии (Backman, Rod-riges-Kabana, 1975; Harman et al,, 1981, Гаузе и др., 1983; Великанов, Сидорова, 1988; Егоров и др., 1999). Грибы рода Trichoderma обладают рострегулирую-щей активностью, способствуют увеличению поглощения растением микро- и макроэлементов, стимулируют развитие на корнях растений азотфиксирующих бактерий (Harman, 2004). Эти уникальные свойства грибов рода Trichoderma обусловили внимание к ним, как к продуцентам биопрепаратов для растениеводства. Исходя из биологических особенностей гриба, первые препараты для коммерческого использования готовили на твердом носителе - торфе, соломе, зерне, либо выращивали гриб на поверхности жидкой питательной среды (Ту-лемисова, 1990; Твердюков и др., 1993; Тюльпанова и др. 1997, Новикова, 2005). Предложены также способы, совмещающие поверхностное и погруженное культивирование (Громовых, 2002). Однако такие способы производства малотехнологичны, трудоемки, имеется опасность аллергизации для работающего персонала.

Попытки создания препаратов на основе биомассы гриба, полученной при глубинном (погруженном) культивировании, способных к длительному хранению до последнего времени не имели успеха. В качестве препарата практически повсеместно используется культуральная жидкость (Tabachnik, 1989; Apsite et al, 1989; San Martin et al., 1997). Запатентована только одна жидкая форма биофунгицида на основе мицелия грибов (Третьяков и др., 1995). Такой препарат сохранял активность до трех месяцев при температуре не выше +10°С, что явно недостаточно для успешного коммерческого применения. Проблема разработки методологических подходов к процессам глубинного культивирования мицелиальных грибов и создания рецептуры препаратов для обеспечения стабильности и эффективности биомассы в процессе хранения и применения требовала серьезного научного исследования, которое проведено нами в период с 1991 по 2005 год.

Цель работы.

Выбор и изучение штамма микромицета, обладающего высокой специфической активностью в отношении фитопатогенных грибов, и создание на его основе промышленного биопрепарата.

Задачи исследований.

1. Провести скрининг коллекции штаммов микромицетов различного происхождения на наборе тест-культур фитопатогенных грибов с целью выбора штамма, обладающего наибольшей антагонистической активностью к широкому кругу фитопатогенов.

2. Изучить биохимические, физиологические и технологические особенности штамма, особенности конидиогенеза при глубинном культивировании для обоснования оптимальной технологии производства.

3. Разработать технологию глубинного культивирования и товарную форму препарата на основе выбранного штамма.

4. Провести испытания экспериментальных образцов и опытных партий препарата против болезней растений на естественном и искусственном инфекционном фонах.

5. Изучить экологические аспекты применения нового препарата: совместимость с фунгицидами, влияние на биоразнообразие микромицетов при предпосевной обработке семян пшеницы, зависимость эффективности препарата от типа почвы и ее увлажненности.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Впервые достигнут успех в создании технологии глубинного культивирования мицелиальных грибов, позволяющий получать их биомассу в виде мицелия, хламидоспор и фиалоконидий на уровне коммерческой формы препарата.

Реализована инновационная методология ступенчатого скрининга перспективных штаммов-продуцентов антигрибных биопрепаратов с учетом физиологических особенностей микромицетов в условиях глубинного культивирования, требований к джтельному хранению биопрепарата и особенностей технологий применения.

Практическая значимость работы.

Созданы новые, экологичные средства защиты растений и агрохимикаты: антигрибной биопрепарат микол (на основе гриба T.asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg - Патент России, N 2170511, 2001) в двух товарных формах -для предпосевной обработки семян и для обработки растений, а также комбинированное удобрение (на основе биогумуса и Т. asperellum - Патент России N 97122342/13, 1997), обладающее почвоудобрительным, ростстимулирующим и фунгицидным действием.

Разработана нормативно-техническая документация для производства мико-ла (опытно-промышленный регламент, технические условия, инструкция по применению), получены санитарно-гигиенические заключения на штамм-продуцент и его товарную форму. Проведена оценка российского рынка антигрибных биопрепаратов, показана перспективность коммерческого использования микола в технологиях растениеводства.

Полевые испытания экспериментальных образцов и опытных партий в хозяйствах Краснодарского Края, Вологодской, Ленинградской, Тамбовской, Пензенской, Новгородской областях, в Крыму и Белоруссии показали высокую рострегулирующую и фунгицидную активность нового препарата.

Основные положения, выносимые на защиту.

1Научно-обоснованная методология получения биопрепаратов на основе биомассы мицелиальных грибов, нарабатываемых при глубинном культивировании, сохраняющих биологическую активность в течение заданных сроков хранения, обеспечивающих их коммерческую значимость и возможность круглогодичной реализации.

2. Алгоритм управления условиями культивирования мицелиальных грибов для оптимального получения биомассы необходимого состава (мицелия, хла-мидоспор или фиалоконидий).

3. Две новые рецептурные формы препарата на основе биомассы гриба Т.азрегеНит: микол С - для предпосевной обработки семян и микол В - для обработки растений, полученные глубинным культивированием и сохраняющие биологическую активность в течение шести месяцев.

4. Методология комплексной оценки фитокомпетентности биопрепаратов с учетом не только их антигрибной, но и фиторегуляторной активности для обоснования оптимальных дозы применения препаратов.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на Всесоюзной конференции «Проблемы создания и применения микробиологических средств защиты растений» (Велегож, 1989); Международной научно-практической конференции «Производство и применение биологических средств защиты растений от вредителей и болезней» (Одесса, Украина, 1994); XIII и XIV Международных Конгрессах по защите растений (Гаага, Нидерланды, 1995; Иерусалим, Израиль, 1999); Конференции «Биотех-95» (Днепропетровск, Украина, 1995); 1-й Всероссийской конференции токсикологов «Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии» (С.-Петербург, 1995); Первом и Втором Всероссийских съездах по защите растений (С.-Петербург, 1995, 2005); Симпозиуме «Экологические проблемы защиты растений современного сельского хозяйства» (Словакия, 1995); Рабочей встрече «Ростстимулирующие ШЬоЪааепа. Состояние и перспективы» (Саппоро, Япония, 1997); 32 Ежегодной встрече Общества Беспозвоночных (Ирвин, Калифорния, США, 1999); Юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999); Юбилейной научной конференции «Современные исследования в биологической защите растений» (Харбин, Китай, 2000); Международных научно-практических конференциях «Биологизация защиты растений: состояние и перспективы» (Краснодар, 2000, 2004); 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002); 2-ой, 3-ей и 4-ой Международных Конференциях «Биотехнология и бизнес» (Москва, 2002, 2003, 2004); I и II Международных Конгрессах «Биотехнология-состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003); Международном Симпозиуме «Интегрированные системы защиты садов и виноградников (Венгрия, 2002); 1-ой Международной конференции «Дождевые черви и плодородие почв» (Владимир, 2002); 8-м Международном Конгрессе по фитопатологии (Крайсчерч, Новая Зеландия, 2003); Международном совещании «Современные проблемы биологической защиты леса и сельскохозяйственных культур» (Звенигород, 2003); Международной конференции по интеграции науки и технологии в сельское хозяйство (Бангкок, 2004); Восьмой Международной рабочей встрече по Trichoderma и Gliocladium (Ханжоу, Китай, 2004); 2-ом Международном Симпозиуме по фузариозу колоса (Орландо, Флорида, 2004); Третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005).

Публикация результатов исследования.

Основные материалы диссертации опубликованы в журналах «Микология и Фитопатология», «Агрохимия», «Прикладная биохимия и микробиология», в «Российском химическом журнале», «Arpo XXI», «Биотехнология», материалах российских и международных конгрессов, симпозиумах и рабочих встреч. По теме диссертации опубликовано 63 печатных работы, 10 из которых в рецензируемых изданиях (3 в печати). Получено 3 авторских свидетельства на изобретения и 3 патента РФ. За разработку и организацию промышленного производства реагентов для синтеза генетических структур в 1987 году присуждена Премия Совета министров СССР.

Структура и объем диссертации.

Работа изложена на 370 страницах, содержит 87 рисунков и 106 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментального материала, содержащих описание материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитированной литературы, включающего 618 работ отечественных и зарубежных авторов, а также 7 приложений.

Место проведения работы.

Основная часть НИР выполнена в отделе разработки микробиологических средств защиты растений Государственного Научного Центра прикладной микробиологии (ГНЦ ПМ, п.Оболенск, Московской обл.). Экспериментальные результаты получены автором лично, а также совместно с коллегами из ГНЦ ПМ и других институтов. Соискателю принадлежит разработка программы исследования, схемы основных экспериментов, теоретическое обобщение полученных результатов.

Благодарности.

Автор выражает искреннюю благодарность академику РАСХН Левитину М.М. за внимание и ценные рекомендации при обобщении основных результатов работы. Глубокую признательность коллегам и сотрудникам ГИД ПМ, принимавшим участие в работе: к.х.н. С.К. Жиглецовой, к.м.н. В.В. Дербышеву, Н.И. Косаревой, Е.В. Быстровой, С.П. Красновой, к.б.н. Н.И. Киселевой, С.Г. Бесаевой, В.А. к.б.н. Говоруновой, A.B. Старшову. Моя искренняя благодарность к.б.н. A.B. Александровой (кафедра микологии и альгологии МГУ) за высокопрофессиональные консультации и неоценимую помощь в таксономических исследованиях.

Сотрудникам ВНИИ БЗР и КНИИХС им. Лукьяненко (г. Краснодар) за проведение полевых испытаний опытных образцов и партий препарата микол. Сотрудникам ВНИИ садоводства им. И.В.Мичурина, испытавшим микол против болезней садовой земляники, заведующей биолабораторией Вологодской СТАЗР H.H. Труканавичене за многолетнее плодотворное сотрудничество по испытанию препарата на ячмене и льне, к.б.н. Ю.И. Гниненко (Московский государственный университет леса) за оценку фунгицидной и ростстимулирую-щей активности препарата на хвойных породах в лабораторных и вегетационных опытах.

Особая благодарность В.А. Ярошенко (ГУ «Краснодарский экспериментальный центр биологической защиты растений») и его сотрудникам в течение многих лет проводивших испытания препарата в хозяйствах Краснодарского края, а также участвовавших в масштабировании технологии производства препарата. Профессорам Боровику Р.В. (НИЦ ТБП, г. Серпухов) и Волкову В.Я. (ГНЦ ПМ, п.Оболенск) благодарна за творческий импульс, способствовавший начать и завершить многолетнее исследование.

Моих зарубежных коллег проф. К. Сойтонга (Королевский Технологический Институт, Бангкок, Таиланд), проф. Д. Шислера (Институт научного обслуживания сельского хозяйства, Пеория, США) за сотрудничество в области биологической защиты растений.

Благодарю за поддержку и помощь моих друзей и родных, помогавших на всех этапах выполнения работы.

Заключение Диссертация по теме "Микология", Коломбет, Любовь Васильевна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Методом ступенчатого скрининга коллекции микромицетов родов Pénicillium Gliocladium, Trichoderma в системах in vitro и iri vivo с использованием коллекции фитопатогенных микроорганизмов, отобран штамм 16 T.asperellum Samuels, Lieckfeit et Nirenberg, как перспективный продуцент биопрепарата для защиты растений от болезней. При тестировании in vitro штамм 16 T.asperellum проявил гиперпаразитическую активность в отношении фитопатогенов из родов Fusarium, Altemaria, Pyrenophora, Bipolaris, Pleospora (Phoma betae), Phy-tophthora, Botrytis, Glomerella (Colletotrichum), Thanatephorus (Rhizoctonia solani), Pénicillium и Aspergillus. Изучены культурально-морфологические и биохимические свойства штамма, особенности конидиогенеза при культивировании в глубинной культуре, свойства фиалоконидий различного происхождения.

2. Показана биологическая эффективность опытных образцов препарата (на основе штамма 16 T. asperellum) при предпосевной обработке семян ячменя, овощных культур, льна-долгунца, лекарственных растений, хвойных пород деревьев. Препарат снижал заболеваемость ячменя гельминтоспориозом (возбудители: Pyrenophora teres Drechsler, Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoem., Pyrenophora gramínea S. Ito et Kurib.) в 1.5-2 раза, обеспечивая сохранение урожая на 13 - 30%. Обработка препаратом (2%-ной концентрации) вегетирующих растений льна вдвое снизила заболеваемость растений фузариозным увяданием {Fusarium oxysporum Sehl.), ржавчиной (Melampsora lini var. Uni (Ehrenb.) Lév.) и бактериозами (Clostridium macérons Schard.). На землянике 5%-ая суспензия биомассы гриба (в дозе 15 кг/га) эффективно (на 70-90%) снижала заболеваемость мучнистой росой (Sphaerotheca humuli (DC.) Burrill), белой пятнистостью листьев (Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau) и серой гнилью (Botrytis cinerea Pers.).

3. Разработана сбалансированная полусинтетическая питательная среда на основе мелассы, позволяющая грибу T.asperellum реализовать полный цикл онтогенеза. Среда оптимизирована по основным технологическим параметрам культивирования (источники питания, скорость массопередачи по кислороду, время культивирования и др.), она обеспечивает получение биомассы гриба в виде мицелия и хламидоспор или фиалоконидий. В оптимизированных условиях культивирования в течение 48 - 96 ч накопление биомассы в виде мицелия составляет 70 г/л, либо фиалоконидий (через 96 ч) в титре 3.8x108 КОЕ/мл.

4. Впервые создана рецептурная форма препарата Т. аярегеЦит на основе его мицелиальной биомассы. Показано, что длительное сохранение биологической активности препарата обусловлено наличием запаса питательных веществ в хранящейся готовой рецептурной форме и доступом кислорода. Процессы метаболизма в мицелии Т. аярегеИит могут быть существенно замедлены при снижении рН и введении ингибиторов дыхания. Длительное (до 1 года) сохранение биологической активности препарата, приготовленного на основе мицелиальной пасты, может быть достигнуто за счет перевода мицелия (путем снижения рН биомассы, введения крахмала и солей меди) в покоящиеся формы -фиалоконидии и хламидоспоры.

5. Разработаны две рецептурные формы препарата на основе штамма 16 Т.аярггеИит - для предпосевной обработки семян и для обработки вегетирую-щих растений. Обе товарные формы состоят из закисленной (до рН 2.5-3.0) концентрированной мицелиальной биомассы гриба, крахмала (5-10%) и 40-ЮОррш Си804х5Н20 (в зависимости от среды культивирования и планируемых сроков хранения). Для лучшей адгезии в товарную форму перед протравливанием семян рекомендуется вводить натриевую соль КМЦ (3-5%). В рецептурную форму для обработки вегетирующих растений необходимо вводить фотопротекторы (активированный уголь, двуокись титана). Необходимое уменьшение дисперсности препарата достигается механическим размельчением готового мицелия перед использованием.

6. Проведено масштабирование процесса ферментации культуры

3 3 3

ТшрегеИит на ферментерах объемом 25 дм , 60дм , 100 дм и промышленных ферментерах (объемом 1000 дм ) в условиях Краснодарского экспериментального Центра биологической защиты растений. Составлен проект опытно-промышленного регламента производства препарата микол (в форме пасты) на основе гриба Т.сюрегеПит (ОПР 00001927-15-140-2004).

7. В вегетационных экспериментах на яровой пшенице и в полевых опытах на озимой пшенице показано, что микол является перспективным средством для борьбы с фузариозом колоса пшеницы. Как предпосевная обработка семян, так и опрыскивание растений в фазе цветения снижали интенсивность развития и распространенность заболевания. Распространение и развитие болезни в отдельных опытах снизилось на 56%, сохраненный урожай оценен в 10 -12%, при этом содержание в зерне фузариотоксина дезоксиниваленола снизилось в 6 - 10 раз.

8. При выращивании пшеницы на разных типах почвы показано, что рост-регулирующая активность микола особенно на ранних этапах органогенеза пшеницы существенно зависит от типа почвы и ее влажности. Микол снижает негативное действие дефицита влаги на пшеницу.

9. Выявлено, что предпосевная обработка семян озимой пшеницы биопрепаратом, содержащим живую культуру Т.аярегеИит, не влияет на структуру и численность микроорганизмов корнеобитаемого слоя на участках, где возделы-валась пшеница из семян, обработанных миколом и/или обработанная им в период вегетации. Продемонстрировано, что в условиях достаточного увлажнения почвы микол (в дозах 1.0 и 2.0 кг/т семян) либо не снижает биоразнообразие почвенных микромицетов либо «стабилизирует» его. В условиях пониженной влагообеспеченности под действием микола проявляется тенденция к снижению биоразнообразия микромицетов на трех из четырех изученных типов почвы.

10. Определен спектр химических протравителей, совместимых с биопрепаратом. Установлено, что микол можно совмещать с такими фунгицидами, как витарос, премис-200 и раксил, используемыми для предпосевной обработки семян озимой пшеницы, в том числе и зараженных головневыми грибами (ТШеНа laevis Kuehn., Т. controversa Kuehn.). Показано, что при преобладании в пато-комплексе озимой пшеницы возбудителей корневых и прикорневых гнилей (Fusarium spp., Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, Rhizoctonia sp., Hy-menula cerealis Ellis et Everh.) наиболее эффективно для предпосевной обработки семян пшеницы совместное применение микола С (1.0 л/т) и раксила со сниженной на 40% нормой расхода протравителя (0.3 л/т). С фундазолом, кол-фуго дуплет и феразимом микол не совместим, поскольку эти фунгициды де-прессируют рост Т. asperellum.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе проведенного цикла аналитических и многолетних экспериментальных исследований - от скрининга эффективного штамма-продуцента до товарной формы препарата и технологии его применения в производственных условиях - предложена методология получения антигрибных биопрепаратов на основе мицелиальных грибов- антагонистов фитопатогенов. Методология включает 5 основных блоков: многоуровневый скрининг штаммов, процесс культивирования штамма-продуцента, разработка рецептуры препарата, технологии применения и Государственная регистрация. По окончании скрининга перспективный штамм-продуцент биопрепарата должен обладать активностью против выбранных экономически значимых фитопатогенов, не должен быть фитотоксичным по отношению к растениям, на которых планируется его применение, должен быть безвреден для теплокровных животных, охарактеризован по способности к культивированию в жидкой питательной среде. Экспериментальные образцы должны показать биологическую эффективность в вегетационных экспериментах на искусственном и естественном инфекционном фоне. Выбор компонентов питательной среды, их оптимизация, а также определение параметров культивирования осуществляется в многофакторных экспериментах. Целью этого блока исследований является получение максимально возможного количества биомассы при минимальных затратах сырьевых ресурсов. На этапе создания рецептуры препарата необходимо выбрать форму биомассы (конидии, мицелий, хламидоспоры) и путем варьирования ингредиентов обеспечить ее стабильность при определенных условиях хранения и применения. При разработке технологий применения необходимо учитывать также физиологические свойства штамма-продуцента, чтобы сохранить его жизнеспособность. Завершающим этапом является прохождение Государственной регистрации и включение нового препарата в Государственный Каталог пестицидов и агрохи-микатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации.

Скрининг

Культивирование Рецептурирование

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Коломбет, Любовь Васильевна, Москва

1. Агрофизические методы исследования почв М. : Наука, 1966. - С. 14-29.

2. Агрохимические методы исследования почв М.: Наука, 1975. - С.56-62.

3. Аринушкин Е.В. Руководство по химическому анализу почв. М.: Изд-во МГУ, 1970. - C.327-328.

4. Александрова, A.B. Грибы рода Trichoderma Pers.: Fr. Таксономия, географическое распространение и экологические особенности: автореферат дис. канд. биол. наук. М.: Изд-во МГУ, 2000а. - 20 с,

5. Александрова, А. В. Влияние гриба Trichoderma harzianum на почвенные микромицеты / A.B. Александрова, Л. Л. Великанов, И. И. Сидорова, Т.П. Сизова // Микология и фитопатология. 20006. - Т. 34, вып. 3. - С. 68-77.

6. Александрова, A.B. Род Trichoderma Pers.: Fr. II Новое в систематике и номенклатуре грибов: сборник; под ред. Ю.Т. Дьякова, Ю.В.Сергеева. -М.: Национальная академия микологии. 2003. - С. 219-276.

7. Александрова, A.B. Исторический обзор и современная система рода Trichoderma Pers.: Fr. (Eumycota, Deuteromycotina, Hyphomycetes) / A.B. Александрова, Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Микология и фитопатология - 2004. - Т. 38, вып.1- С. 3-19.

8. Аспите, А.Ф. Использование триходермина для защиты растений от фитопатогенных микромицетов / А.Ф. Аспите, Ю.Э. Швинка, C.B. Стрикаускас // Вестник с.-х. науки. 1981.- № 9. - С. 114-118.

9. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - 180 с.

10. Билай, В.И. Микроскопические грибы-продуценты антибиотиков. Киев: Изд-во АН УССР, 1961а. - 184 с.

11. Билай В.И. Фузарии.- Киев: Наукова Думка, 1977. С.15-35.

12. Билай, В.И. Биологически активные вещества микроскопических грибов и их применение. Киев: Наукова думка, 1977. - С. 15-35.

13. Билай В.И. Микромицеты почв. Киев: Наукова думка. 1984. 263 с.

14. Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель токсинобразующих микромицетов. Киев. Наукова думка, 1990. 236 с.

15. Биопестициды: использование и способы применения; под ред. Ф.Р. Холл, Д.Д. Менн. Тотова, - Нью-Джерси. Хуман Пресс Инк. - 1999, - 626 р. -Рецензия // Агрохимия. - 2000. - №5. - С. 85 - 91.

16. Бондаренко, Н.В. Биологическая защита растений М.: Агропромиздат, 1986.-278 с.

17. Буймистру, Л.Д. Использование триходермина в комплексной защите рассады овощных культур от вредителей, болезней и сорняков / Л.Д. Буймистру, Н.И. Леонтян, П.И. Леонтян // Естественные враги насекомых-фитофагов: сборник. Киев: Штиинца, 1986. - С. 48-52.

18. Великанов, ЛЛ. Микробиологические средства защиты растений Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1988а.-Т.6.-С. 75-83.

19. Великанов, Л Л. Экологические проблемы защиты растений от болезней / Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Итоги науки и техники. Сер. Защита растений. М.: ВИНИТИ, 19886. - Т.6. - 143 с.

20. Великанов, Л.Д. Роль грибов в формировании мико и микробиоты почв естественных и нарушенных биоценозов и агроценозов: дис. д-ра биол. наук. ~М.: 1997.-547 с.

21. Великанов, Л.Л. Пространственное распространение грибов рода Trichoderma в почвах биологической станции МГУ / Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Микология и фитопатология. 1999. - Т. 33, вып. 2. - С. 101106.

22. Воронкова, Е.И. Разработка технологии производства триходермина / Е.И. Воронкова, Н.Т. Петрухина, Г.А. Савицкая // В сб. науч. тр.: "Препараты микробиологического синтеза сельскому хозяйству", 1981. С. 38-41.

23. Ганнибал, Ф.Б. Альтернариозы зерновых культур на Северо-западе России и в Северной Европе / Ф.Б. Ганнибал // Конференция по защите растений.

24. Вопросы менеджмента в защите растений и устойчивом земледелии: исследования, развитие и информационные системы. Тезисы докладов. С. Петербург - Пушкин. - 2005. - С.25-26.

25. Гаузе, Г.Ф. Изыскание новых антибиотиков из группы циклоспоринов / Г.Ф. Гаузе, JI.H. Терехова, Т.С. Максимова // Антибиотики. 1983. - Т. 28, вып. 4. - С. 243-245.

26. Горленко М.В. Эволюция фитопаразитизма фитопатогенных грибов. Микол. и фитопатол., 1976. т. 10, вып. 1.-С. 5-10.

27. Горленко М.В., Шарова М.Б., Воронкова Е.И. Онтогенез грибов рода Trichoderma Fr. в различных условиях культивирования // Микол. и фитопатол., 1982.-Т. 16.-Вып. 4. С. 305-311.

28. ГОСТ 12044-93. Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями. Введ. 95-01-01. - М.: Изд-во стандартов, 1995. - 89 с.

29. ГОСТ 26107-84. Почвы. Методы определения общего азота. М.: Изд-во стандартов, 1984. - 8 с.

30. ГОСТ 26483-85, Почвы. Приготовление солевой вытяжки и определение ее pH по методу ЦИНАО. М.: Изд-во стандартов, 1985. - 4 с.

31. ГОСТ 26715-85. Удобрения органические. Метод определения общего азота. М.: Изд-во стандартов, 1986. - 12 с.

32. ГОСТ 26713-85. Удобрения органические. Метод определения влаги и сухого остатка. М.: Изд-во стандартов, 1986. - 2 с.

33. Губкин, В.Н. Предпосевная обработка семян моркови биопрепаратами / В.Н. Губкин, З.Н. Дудина, Г.Ф. Першина // Использование грибов рода Триходерма: сб. науч. тр. / Всерос. НИИ селекции и семеноводства овощных культур. -1998, вып.36. С. 94-98.

34. Гузеев В. С. Кураков A.B., Мирчинк Е.Г. Минеральные удобрения и микробный токсикоз почвы // Экологическая роль микробных метаболитов/ под ред Д.Г. Звягинцева. М.- 1986. С. 65-82.

35. Громовых, Т.И. Фитопатогенные микромицеты сеянцев хвойных в Средней Сибири: видовой состав, экология, биологический контроль: дис. на соискание ученой степени д-ра биол. наук. Красноярск. - 2002 - 334 с.

36. Гринько, H.H. Биотехнологические аспекты культивирования штамма Trichoderma harzianum Rifai ВКМ Б-2477Д // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. -2004. № 1. - С. 57-61.

37. Деянова, O.A. Роль отдельных компонентов комплекса почвенных грибов в разложении органических веществ / O.A. Деянова, Т.Г. Мирчинк, K.M. Запрометова // Микология и фитопатология 1985. - Т. 19, вып. 1. - С. 1215.

38. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). Третье издание, переработанное и дополненное. -М.: Колос, 1973. - 336 с.

39. Дьяков Ю.Т. Популяционная биология фитопатогенных грибов. Изд. дом. "Муравей", Научная редакция. 1998. - 382 с.

40. Ермекова, Б.Д. Почвенные грибы и обыкновенная корневая гниль колосовых зерновых. Алма-Ата: Наука, 1988. - 144 с.

41. Егоров, Н.С. Микробные ингибиторы ферментов биосинтеза и этерефикации холестерина / Н.С. Егоров, H.A. Баранова, И.Г. Крейер // Антибиотики и химиотерапия. 1999 - № 5. - С.38-44.

42. Жариков Г.А. Методическое руководство по биотестированию почвы / Г. А. Жариков, В Л. Дядищева // НИЦ ТБП. Серпухов, 1985. - 13 с.

43. Зазимко, М.И. Новые биопрепараты для защиты колосовых культур / М.И. Зазимко, Л.Д. Жалиева, Л.В. Маслиенко // Защита и карантин растений. -1999,-№2.-С. 27.

44. Завелишко, И.А. Оценка антибиотической активности мицелиальных грибов в отношении грибных патогенов / И.А. Завелишко, С.И. Николаева // Микробиологический журнал. -1999. -Т. 52, № 3. С. 89-91.

45. Звягинцев, Д.Г. Некоторые концепции строения и функционирования комплекса микроорганизмов // Вестник МГУ. Серия 17. Почвоведение. -1978.-№4.-С. 48-56.

46. Иващенко В.Г. Фузариоз колоса пшеницы и початков кукурузы: устойчивость как базисная стратегия защиты, фитосанитарное оздоровление экосистем. Матер. 2 Веер, съезда по защите растений, С.-Пб., -2005,-Т. 1.-С. 454-456.

47. Илларионова, И.А. Микромицеты рода Trichoderma как средство биозащиты белокачанной капусты в республике Татарстан: автореферат дис. на соискание ученой степени канд. биол. наук. 2002. - Казань. - 20 с.

48. Ишкова Т.И., Берестецкая Л.И., Гасич Е.Л., Власов Д.Ю. Учебно-методическое пособие по диагностике грибных болезней хлебных злаков, СПб.,-2001.-76 с.

49. Клыков СЛ., Дербышев В.В. Связь возрастной структуры биомассы микроорганизмов с клеточными синтезами. М:Спутник, 2003,- 48 с.

50. Кураков, A.B. Структура комплексов сапротропных микроскопических грибов при окультуривании типичного серозема / A.B. Кураков, Т.Г. Мирчинк // Микология и фитопатология. 1985. - Т. 19, вып. 3. - С. 207211.

51. Коломникова, В.И. Влияние триходермина на численность возбудителей корневых гнилей в почве / В.И. Коломникова, М.М, Трушко, Н.И. Рыжова // Защита растений. -1995. № 3. - С. 19.

52. Кононенко, Т.П. Иммуноферментный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне / Г.П. Кононенко, A.A. Буркин, H.A. Соболева, Е.В. Зотова // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35, № 4. - С. 457-462.

53. Кудеяров, В.Н. Агрохимия. 1969. - № 1. - С. 102-106.

54. Кураков, A.B. Методы выделения и характеристики комплексов микроскопических грибов наземных экосистем. М.: МАКС Пресс. 2001. -91с.

55. Кривощекова, Т.Г. Эффективность триходермина / Т.Г. Кривощекова, B.C. Мищенко // Защита растений. 1990. - № 11. - С. 22.

56. Левитин, М.М. Фузариоз колоса зерновых культур // Защита и карантин растений,-2002. № 1,- С. 16-17.

57. Левитин, М.М. Виды и подвиды грибов рода Fusarium на зерновых культурах / М.М. Левитин, В.Г. Иващенко, Н.П. Шипилова, Т.Ю. Гагкаева // Международная конференция, посвященная 80-летию кафедры микологии и альгологии МГУ. ~ 1998. С. 64-66.

58. Лернер, Л.Е. Биологическая активность микофильных грибов и их взаимодействие с грибами в культуре: автореф. дис. канд. биол. наук. -М.: Изд-во МГУ, 1977. 22 с.

59. Леонов, А.Н., Флуориметрическое определение дезоксиниваленола в контаминированном зерне / А.Н. Леонов, H.A. Соболева, Г.П. Кононенко // Докл. ВАСХНИЛ. 1989. - №7,- С. 12 - 15.

60. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. М.: Наука, 1967. - С. 140-185.

61. Лугаускас А.Ю.; Микульскене А.И.; Шляужене Д.Ю. Каталог микромицетов-биодеструкторов полимерных материалов. Отв. ред. М.В.Горленко. М.: Наука, 1987. 340 с.

62. Лысенков А.Н. и др. Математические методы планирования многофакторных медико-биологических экспериментов. М: Медицина. -1979.

63. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования экспериментам: Из-во МГУ, 1969. 123 с.

64. Маркович H.A., Кононова Г.Л. Литические ферменты Trichoderma и их роль при защите растений от грибных болезней (обзор). 2003. Прикл биохимия и микробиология, том 39.№4. стр. 389-400.

65. Маслиенко Л.В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями подсолнечника // автореф. дис. на соискание ученой степени д-ра биол. наук. Краснодар. - 2005 - 48 с.

66. Матвеев В.Е. Научные основы микробиологической технологии // М: Агропромиздат, 1985. 224 с.

67. Мегарран, Э. Экологическое разнообразие и его измерение. М.: Мир, 1992. 181 с.

68. Методы определения болезней и вредителей сельскохозяйственных растений. Пер с немецкого, М., Агропромиздат, 1987. с.224.

69. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учебное пособие под ред. Д.Г. Звягинцева-Из-во МГУ, 1991,- 304 с.

70. Микроорганизмы и охрана почв. 1989. Москва: Из-во МГУ. 206 с. Глава 7: Сравнительный анализ состава микромицетов окультуренных почв. С. 179192.

71. Мирчинк, Т.Г. Методические подходы к изучению грибов-микромицетов в почве // Методы выделения и идентификации почвенных микроорганизмов-биодеструкторов. Вильнюс, 1982.

72. Мирчинк, Т.Г. Почвенные грибы как компонент биогеоценоза // Почвенные микроорганизмы как компонент биогеоценоза. М.: Наука, 1984.-С. 114-131.

73. Мирчинк, Т.Г. Почвенная микология. М.: Изд-во МГУ, 1988. - 220 с.

74. Мишустин, E.H. Ассоциации почвенных микроорганизмов. М.: Наука, 1975.-105 с.

75. Николаева, С.И. Антагонистическая и антибиотическая активность Trichoderma viride Pers: Fr. и Gliocladium virens Miller, Giddens et Foster no отношению к Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) D By / С.И. Николаева, М.Е.

76. Штейнберг, И.А. Завелишко, М.В. Харбур, Л.С. Андронаки // Микология и фитопатология. 1989. - Т. 23, вып. 2. - С.167-172.

77. Новикова, И.И. Испытание новых биопрепаратов в борьбе с фузариозом колоса / И.И. Новикова, В.Г. Иващенко, Г.В. Калько, И.В. Бойкова, Л.А. Назаровская, А.И. Литвиненко // Микология и фитопатология. 1994. - Т. 28, вып. 1.-С. 70-75.

78. Новикова, И.И. Биологическое обоснование создания и применения полифункциональных биопрепаратов на основе микробов-антагонистов для фитосанитарной лптимизации агроэкосистем: автореф. дис. на соискание ученой степени д-ра биол. наук. СПб. - 2005 - 45 с.

79. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. Под ред. И.Л. Работновой. М;Мир, 1978. 331с.

80. Петрухина, М.Т. Производство и применение микробиологических препаратов для борьбы с болезнями растений // Препараты микробиологического синтеза сельскому хозяйству. М.Т981. - С. 3-11.

81. Посыпанов, Г. Н. Растениеводство / Г. Н. Посыпанов, В. Е. Долгодворов, Г.В. Коренев и др. М.: Колос, 1997. - 448 с.

82. Пидопличко, Н.М. Грибная флора грубых кормов. Киев: Наукова думка, 1953. - С. 181-183.

83. Прудникова, C.B. Эколого-биологическая роль грибов рода Trichoderma в различных биоценозах Средней Сибири: дис. канд. биол. наук / Институт леса Сибирского отделения РАН 2000. - 168 с.

84. Рекомендации по фитосанитарной экспертизе зерновых культур. Под ред. С. С. Санина. М.: ФГНУ Росинформагротех, 2002. -140 с.

85. Рудаков, O.JI. Микофильные грибы, их биология и практическое значение. -М.: Наука, 1981.-158 с.

86. Рудаков, O.JI. Проблемы и перспективы использования гиперпаразитов и антагонистов в защите растений от инфекционных заболеваний. Микробиологические средства защиты растений. Кишинев, Штиинца, 1986, С. 29-33.

87. Рудаков, В.О. Физиологическая вариабельность штаммов триходермы / В.О. Рудаков, И.В. Макаренкова // Гавриш. 2002. - № 5. - С. 17-19.

88. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. 2-е изд. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1983. - 215 с.

89. Салина, O.A. Виды грибов рода Trichoderma в почвах Литовской ССР // Микология и фитопатология. 1981. - Т. 15, № 2. - С. 101-105.

90. Салина, O.A. Влияние грибов рода Trichoderma на некоторые почвенные микроорганизмы O.A. Салина, А.Ю. Лугаускас // Микробные сообщества и их функционирование в почве. Киев: Наукова думка, 1981. - С. 155-158.

91. Сейкетов, Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике. -Алма-Ата: Наука, 1982. 248 с.

92. Сизова, Т.П. Некоторые закономерности распространения почвенных грибов // Микология и фитопатология. 1977. Т. 11, № 5. - С. 377-381.

93. Симакин, А.И. Удобрения, плодородие почв и урожай в условиях интенсивного земледелия. Краснодар. - 1988. - С. 7-16.

94. Соколов, М.С. Экологизация защиты растений / М.С. Соколов, O.A. Монастырский, Э.А. Пикушова; под ред. В.А. Захаренко. Пущино: ПНЦ РАН, 1994.

95. ИЗ. Соколов, М.С. Современная концепция биологической защиты растений / М.С. Соколов, В.И. Терехов // Агрохимия. 1995. - № 4. - С. 90-98.

96. Сойтонг, К. Применение препарата Кетомиума для защиты растений от болезней / К. Сойтонг, JI.B. Коломбет // Агрохимия. 2003. - №9. - С. 5762.

97. Спайк, Г. Rhizobiaceae. Молекулярная биология растений, взаимодействующих с растениями / Г. Спайк, Ф. Кондроши, П. Хукас-СПб. -2002. 567 с.

98. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации / Выпуск 9. М: Агрорус. - 2005. - С. 589.

99. Сидорова, И.И. Биологические методы борьбы с фитопатогенными грибами // Итоги науки и техники. Защита растений. М.: ВИНИТИ, 1980. -№ 2. - С. 116-157.

100. Симочкина, В.И. Использование гриба триходермы в борьбе с корневой гнилью огурцов в закрытом грунте / В.И. Симочкина, А.К. Успанов, Н.Е. Бекмаханова // Известия АН Казах. ССР. Алма-Ата: Наука, 1988. - № 15. -С.149.

101. Смирнова, И.П. Триходерма продуцент ингибитора вируса иммунодефицита человека / И.П. Смирнова, С.Б. Алексеев, Д.А. Мошков // Вопросы медицинской химии. - 2000. - № 4.

102. Стройков, Ю.М. Значение микроорганизмов почвы и семян в развитии корнееда кормовой свеклы / Ю.М. Стройков, В.В. Антонов // АГРО XXI 1998. №9, С. 17.

103. Сычев, П.А. Антагонистические свойства Trichoderma viride по отношению к некоторым патогенам Cucumis sativum L / П.А. Сычев, Ю.А. Шапошник // Микология и фитопатология. 1982. - Т. 16, вып. 2. - С. 151-159.

104. Тарунина, Т.А. Влияние Trichoderma lignorum Tode ex Harz, на Fusarium oxysporum Schlecht, и Fusarium culmorum (W.G.Sm.) Sacc. в стерильной почве // Микология и фитапатология. 1982. - Т. 16, вып. 6. - С. 536-538.

105. Тарчевский, И.А. Патоген-индуцируемые белки растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. -Т. 37, № 5. - С. 517-532.

106. Твердюков А.П., Никонов П.В., Ющенко Н.П. Триходермин // Защита раст., 1993,-№6.-С. 40.

107. Твердюков, А.П. Биологическая защита томатов в закрытом грунте // Защита и карантин растений. 1998. - № 1. - С. 41.

108. Тешабаева, Р. Применение грибов-антагонистов в борьбе с вилтом хлопчатника // Перспективные методы защиты хлопчатника, предотвращающие загрязнения внешней среды / Труды САНИИЗР. -Ташкент. -1981. Вып. 15. - С. 79-82.

109. Третьяков А.П. 1995. Способ получения триходермина. Патент РФ № 93000542/13.

110. Торопова Е.Ю. Экологические основы защиты растений от болезней в Сибири. Под ред. В. А. Чулкиной. Из-во Новосибирского государственного аграрного университета. Новосибирск, 2005. - 370с.

111. Титова, Ю.А. Триходермин на основе вторичной биоконверсии отходов и его эффективность против болезней огурца / Ю.А. Титова, И.И.Новикова, Л.Б. Хлопунова, Д.В Коршунов // Микология и фитопатология. 2002. -Т.36, вып. 4. - С. 76-80.

112. Тулемисова, К.А. Антагонизм и гиперпаразитизм Trichoderma lignorum к фитопатогенным грибам / К.А. Тулемисова, А.К. Успанов // Вестник АН Казах. ССР. 1986. - № 12. - С. 47-51.

113. Тулемисова, К.А. Микробиологические методы защиты растении // Вестник АН Казах. ССР. 1990. - № 6. - С. 29-36.

114. Торопова, Е.Г. Микофильные грибы-продуценты некоторых биологически активных веществ / Е.Г. Торопова, Е.С. Ландау, И.И. Сидорова, Н.С. Егоров, Г.Г. Береснева // Микология и фитопатология. 1983. - Т. 17, вып. З.-С. 195-199.

115. Тиунова, H.A. Биосинтез ß-глюканаз и хитиназы в культуре микофильного штамма Trichoderma viride / H.A. Тиунова, Н.М. Жлоба, И.И. Сидорова // Микробиология. 1983. - Т. 52, вып. 5. - С. 723-728.

116. Тутельян В .А. Микотоксины. АМН СССР. - М.: Медицина, 1985 - 221 с.

117. Тюльпанова, В.А. Биотехнология новых форм грибных фунгицидов для защиты растений / В.А. Тюльпанова, Т.И. Громовых, А.Л. Малиновский, Т.Л. Козлова, И.А. Арефьева, И.А. Шипилова // Сибирский экологический журнал, 1997. № 5. - С. 495-500.

118. Федоринчик, Н.С. Глубинный способ выращивания гриба Trichoderma lignorum Harz / Н.С. Федоринчик, Т.А Тарунина., Л .Я. Рунковская // Тр. ВИЗР. 1975. - № 2. - С. 151-160.

119. Феофилова, Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям. (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. -Т. 39. -№1. -С. 5-24.

120. Фитосанитарная экспертиза зерновых культур (болезни растений) М; ФГНУ «Росинформагротех» 2002,139с.

121. Хакимов, А.Х. Итоги исследований САНИИЗР по применению триходермы против вертициллеза // Перспективные методы защиты хлопчатника, предотвращающие загрязнения внешней среды / Труды САНИИЗР. Ташкент. - 1981. - Вып. 15. - С. 91-94.

122. Чулкина, В.А. Борьба с болезнями сельскохозяйственных культур в Сибири / В. А. Чулкина, Н.М. Коняева, Т.Т. Кузнецова- М.: Россельхозиздат, 1987. 252 с.

123. Шарова, М.Б., К сравнительно-морфологическому изучению спор гриба Trichoderma. растений // Препараты микробиологического синтеза -сельскому хозяйству. М:1981, с. 133-136.

124. Шарова, М.Б., Высоцкий В.В. Электронно-микроскопическое изучение Trichoderma viride Fr. // Микол. и фитопатол., 1983. Т. 17. - Вып. 4. - С. 296-301.

125. Шкляр, Т.Н. К вопросу о систематике и физиологических функциях грибов из рода Trichoderma // Доклад ТСХА. 1957. - Т. 29. - С.68-77.

126. Штейнберг, М.Е. Сравнительная характеристика некоторых изолятов Gliocladium биологических агентов в борьбе с белой гнилью подсолнечника / М.Е. Штейнберг, И.А. Завелишко // Микробиологический журнал. - 1988. - Т. 50. -№ 6. - С. 63-64.

127. Шемщура, О.Н. Структурные и метаболические особенности аспорогенной культуры гриба триходерма: автореферат дис. канд. биол. наук / Ин-т микробиологии и вирусологии АН Казах. ССР. Алма-Ата. - 1991. - 20 с.

128. Шлегель, Г. Общая микробиология. М.: Мир. 1987. - 566 с.

129. Якименко, Е.Е. Влияние грибов рода Trichoderma на почвенные микромицеты, вызывающие инфекционное полегание сеянцев хвойных в лесных питомниках Сибири / Е.Е. Якименко, И. Д. Гродницкая // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 6. - С. 850-854.

130. Якименко, Е.Е. Микромицеты почв лесных питомников и их роль в патогенезе сеянцев хвойных: автореферат дис. канд. биол. наук. -Красноярск. 1994. - 20 с.

131. Abbott, E.V. Taxonomic studies on soil fungi. Iowa: St. Coll // J. Sci. 1926. -P.15-36.

132. Abd-El-Moity Т.Н. Effect of single and mixture of Trichoderma harzianum isolates on controlling three different soil-borne pathogens // Egypt. J. Microbiol. 1985 (86), Spec. Issue. P. 111-120.

133. Adler, T. Discovering the sexy side of valued fungi // Science News. 1996. -Vol.149,N. 8.-P. 118.

134. Andreaus, J. Effects of temperature on the cellulose binding ability of cellulose enzymes / J. Andreaus, H. Azevedo, A. Cavaco-Paulo // J. Molecular Catalysis B: Enzymatic. 1999. - Vol. 7. - P. 233-239.

135. Antal, Z. Colony growth, in vitro antagonism and secretion of extracellular enzymes in cold-tolerant strains of Trichoderma species / Z. Antal, L. Manczinger, G. Szakas, R.P.Tengerdy, L. Ferencczy I I Mycol. Res. 2000. -Vol. 104.-P. 545-549.

136. Antal, Z. Complete DNA sequence and analysis of a mitochondrial plasmid in the mycoparasitic Trichoderma harzianum strain T95 / Z. Antal, L. Manczinger, L. Kredics, F. Kevei, E. Nagy // Plasmid. 2002. ~ Vol. 47. - P. 148-152.

137. Al-Heeti, M.B. Antagonism between Gliocladium roseum, Trichoderma harzianum or Trichothecium roseum and Phytophthora megasperma f. sp. glycinea / M.B. Al-Heeti, J.B. Sinclair // Mycopathologia. 1988. - Vol. 103, N 3.-P. 135-140.

138. Allan, R.E. F2 monosomic analysis of coleoptile and firstecal development in two series of wheat crosses / R.E. Allan, O.A. Vogel // Crop. Sci. 1964. - N 4. -P. 338-339.

139. Apsite, A. Morphology and antifungal action of the genus Trichoderma cultivated in geometrically dissimilar bioreactors / A. Apsite, U. Viesturs, V. Steinberga, M. Toma // World journal of microbiology and biotechnology. -1998.-Vol. 14.-P. 23-29.

140. Bae, Y.S. Soil biomass influence on growth and biological efficacy of Trichoderma harzianum / Y.S. Bae, G.R. Knudsen // Biological Control. 2005. -Vol. 32,N2.-P. 236-242.

141. Baek, J.M. The role of an extracellular chitinase from T. virens Gv29-8 in the biocontrol of Rhizoctonia solani / J.M. Baek, C.R.Howell, C.M. Kenerley // Curr. Genet. 1999. - Vol. 35, N 1. - P. 41-50.

142. Bai, G. Scab of wheat: prospects for control / G. Bai, G. Shaner // Plant Dis. -1994. Vol. 78. - P. 760 - 766.

143. Bankole S.A. and Adebanjo A. Biocontrol of brown blotch of cowpea caused by Colletotrichum truncation with Trichoderma viride / S.A. Bankole, A. Adebanjo //Crop protection. 1996. - Vol. 15. - N 7. - P. 663-636.

144. Barak, R. Lectins: a possible basis for specific recognition in the interaction of Trichoderma and Sclerotium rolfsii / R.Barak, Y. Elad, D. Mirelman, I. Chet // Phytopathology. 1985. - Vol. 75. - P. 458-462.

145. Baker, R. The controlled experiment in the scientific method with special emphasis on biological control. / R. Baker, Y. Elad, I. Chet // Phytopathology. -1984.-Vol. 74.- P. 1019-1021.

146. Baker, R. Improved Trichoderma spp. for promoting crop productivity // TIBTCH. 1989. - Vol. 7. - P. 34-38.

147. Baker, B. Signaling in plant-microbe interactions / B. Baker, P.Zambriski, B. Staskawicz, S.P.Dinosh-Kumar // Science. 1997. - Vol. 276. - P. 725-733.

148. Bakker, P.A.H.M. Understanding the involvement of rhizobacteria mediated induction of systemic resistance in biocontrol of plant diseases / P.A.H.M. Bakker, L.X. Ran, C.M.J. Pieterse, L.C. van Loon // Can. J. Plant Pathol. -2003. -Vol. 25.-P. 5-9.

149. Becker, H. Sexual Trichoderma discovered // Agricultural Research. 1996. -Vol. 44, N.2.-P. 22.

150. Bai, G., Shaner, G. Scab of wheat: prospects for control // Plant Disease. 1994. -Vol. 78.-P. 760-766.

151. Bailey, B.A. Ethylene biosynthesis inducing endoxylanase is translocated through the xylem of Nicotiana tabacum ov. xanthi plants / B.A.Bailey, R.Taylor, J.F.D.Doan, J.D. Anderson // Plant Physiol. 1991 - Vol. 97. - P. 1181-1185.

152. Bailey, B.A. Название статьи / B.A. Bailey, R.D. Lumsden // Trichoderma and Gliocladium. 1996. - Vol. 2. - P. 185-204.

153. Bakker, A.W. Microbial cyanide production in the rizhosphere in relation to potato yield reduction and Pseudomonas spp. -mediated plant growth-stimulation / A.W. Bakker, B. Schippers // Sci. Biol. Biochem. 1987. - Vol. 19.-P. 451-457.

154. Beckman P.A., Rodriguez-Kabana R. A system for the Growth and Delivery of Biocontrol Agents to the Soil // Phytopathology. 1975. - Vol. 65, - P. 819-821.

155. Benhamou, N. Hyphal interactions between Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani ultrastructrure and gold cytochemistry of the mycoparasitis process / N. Benhamou, I. Chet // Phytopathology. 1993. - Vol. 83, N 10 - P. 1062-1071.

156. Benhamou, N. Parasitism of sclerotia of Sclerotium rolfsii by Trichoderma harzianum ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction / N.Benhamou, I. Chet. // Phytopathology. 1996. - Vol. 86, N 4. - P. 405-416.

157. Benhamou, N. Ability of nonpathogenic Fusarium oxysporum strain Fo47 to induce resistance against Pythium ultimum infection in cucumber / N. Benhamou, C.Garand, A.Goulet // Appl. Environ. Microbiol. 2002. ~ Vol. 68. N 8. - P. 4044-4060.

158. Biopesticides: use and delivery / Ed. F.R. Hall, J.J. Menn. Totowa. - New Jersey. Human Press Inc. - 1999. - 626 p.

159. Bisby, G.R. Trichoderma viride Pers. et Fr. and notes on Hypocrea // Trans. Br. Mycol. Soc. -1939. Vol. 23, N. 2. - P. 149-168.

160. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (III). Section Pachybasium I I Can. J. Bot. 1991b. - Vol. 69. - P. 2373-2417.

161. Bissett, J. A revision of the genus Trichoderma. (IV). Additional notes on section Longibrachiatum II Can. J. Bot. 1991c. - Vol. 69. - P. 2418-2420.

162. Bissett, J. Trichoderma atroviride II Can. J. Bot. 1992. - Vol. 70, N. 3. - P. 639-641.

163. Bottalico, A., Logrieco, A., and Visconti, A. Fusarium species and their mycotoxins in infected cereals in the field and in stored grains, p. 85-119. In: Fusarium Mycotoxins, Taxonomy, and Pathogenicity. J. Chelkowski (ed.). Elsevier. New York, 1989.

164. Bostock, R.M. Signal interactions in induced resistance to pathogens and insect herbivores / R.M. Bostock, R. Karban, J.S. Thaler, P.D. Weyman, D. Gilchrist. // Eur. J. Plant Pathol.-2001.-Vol. 107,N1.-P. 103-111.

165. Bowling, A.J. Rotation of cellulose ribbons during degradation with fungal cellulase / A.J. Bowling , Y. Amato, R. Lindstrom, Jr. R. Brown // Cellulose. -2001.-Vol. 8.-P. 91-97.

166. Brunner, K. Improvement of the fungal biocontrol agent Trichoderma atroviride to enhance both antagonism and induction of plant systemic disease resistance / K. Brunner, S. Zeilinger, Ciliento, S.L. Woo, M. Lorito, C.P.

167. Kubicek, R.L. Mach // Applied and Environmental Microbiology. 2005. -Vol. 71,N 7. -P. 3959-3965.

168. Blakeman, J.P. Ecological succession of leaf surface microorganisms in relation to biological control. In: Biological control on the phylloplane. Edited by C E. Windeis and S. E. Lindow // The American Phytopathological Society. 1985. -P. 6-30.

169. Broglie, K.E. Transgenic plants with enhanced resistance to the fungal pathogen Rhizoctonia solanii / K.E. Broglie, I. Chet, M. Holliday, R. Cressman, P. Biddle, S. Knowlton, C.J. Mauvals, R. Broglie // Science. 1991. - Vol. 254. -P. 1194-1197.

170. Bigrimana, J. Induction of systemic resistance on bean (Phaseolus vulgaris) by Trichoderma harzianum II Med. Fac. Landbouww Univ Gent 1997. - N 62. -P. 1007-1007.

171. Burgess L.W., Backouse D., Summerell B. A., Swan L. J. Crown rot of wheat // Fusarium Paul E. Nelson Memorial Symposium /Ed. B. A. Summerell et al. St. Paul, Minnesota: APS PRESS. 2002. P. 271 294.

172. Butt, T.M. Fungal Biological control agents. Pesticide Outlook / T.M. Butt, L. Copping.-2001.-Nil.-P. 186-191.

173. Brückner, H. Trichotoxin A40. Purification by counter-current distribution and sequencing of isolated fragments / H. Brückner, W.A. König, M. Aydin, G. Jung // Biochim Biophys Acta. 1985. - Vol. 827. - P. 51-62.

174. Brückner, H. Solution phase synthesis of the 14-residue peptaibol antibiotic trichovirin / H. Briickner, A. Koza //1. Amino Acids. 2003. - Vol. 24. - P. 311-323.

175. Bliss, D.E. The destruction of Armillaria in citrus soils // Phytopathology. -1951. Vol. 41.-P. 665

176. Bulat, S.A. Up-PCR analysis and ITS1 ribotyping of strains of Trichoderma and Gliocladium / S.A. Bulat, M. Lübeck, N. Mironenko, D.F. Jensen, P.S. Lübeck // Mycol. Res. 1998. - Vol. 102. - P. 933-943.

177. Burr, T.J. Increased potato yields by treatment of seedpieces with specific strains of Pseudomonas fluorescence and P. putida / T.J. Burr, M.N. Schroth, T. Susiow // Phytopathology. 1978. - Vol. 68. - P. 1377-1383.

178. Carson, R. Silent spring. Houghton Miffin Company. 1962. - 304 p.

179. Caesar-TonThut, T.C. Mechanisms of inhibition of Cercospora beticola by antagonistic Trichoderma species / T.C.Caesar-TonThut, R. T. Lartay // 8th International Congress of Plant Patholog. Christchurch, New Zealand, 2-7 February 2003. - 2003. - P. 44.

180. Carisse, O. Effect of fall application of fungal antagonists on spring ascospore production of the apple scab pathogen, Venturia inaequalis / O. Carisse, V. Philion, D. Rolland, J. Bernier I I Phytopathology. 2000. - Vol. 90, N 1. - P. 31-37.

181. Carsolio, C. Characterization of ech42, a Trichoderma harzianum endochitinase gene expressed during mycoparasitism / C. Carsolio, A. Gutierrez, B. Jimenez, M.Van Montagu, A. Herrera-Estrella // Proc. Natl. Acad. Sci- 1994.-Vol. 91,N23.-P. 10903-10907.

182. Carsolio, C. Role of the T harzianum endochitinase gene, ech42, in mycoparasitism / C. Carsolio, N. Benhamou, S. Haran, C. Cortes, A. Gutierrez, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65, N 3. -P. 929-935.

183. Castle, A. Morphological and Molecular Identification of Trichoderma Isolates on North-American Mushroom Forms / A. Castle, D. Speranzini, N. Rghei, G. Aim, D. Rinken // Appl. and Environ. Micr. 1998. - Vol. 64, N 1. - P. 133137.

184. Cavalo-Paulo, A. Processing textile fibers with enzymes // ACS Symp. Series 687.- 1998.-P. 180.

185. Chang, Y.C. Increased growtn of plants in the presence of biological control agent Trichoderma harzianum / Y.C. Chang, R. Baker, O. Kledeid, I. Chet // Plant Dis. 1986. - Vol. 70. - P. 145-148.

186. Chen, C. Role of salicylic acid in systemic resistance induced by Pseudomonas spp against Pythium aphanidermatum in cucumber roots / C. Chen, R.R. Belanger, N. Benhamou, T.C. Paulitz // European J. of Plant Pathology. 1999. -Vol. 105.-P. 477-486.

187. Chet, I, Chemical composition of hyphal and sclerotial walls of Sclerotium rolfsii Sacc. /1. Chet, J. Henis, R. Mitchell // Can. J. Microbiol. 1967. - Vol. 13.-P. 137-141.

188. Chet, I. Isolation and biocontrol potential of Trichoderma hamatum from soil naturally suppressive to Rhizoctonia solani /1. Chet, R. Baker // Phytopathology. -1981.-Vol. 71.-P. 286-290.

189. Chet, I. Trichoderma hamatum: Its hyphal interactions with Rhizoctonia solani and Pythium spp. /1. Chet, G.E. Harman, R. Baker // Microbial Ecology. 1981. -Vol. 7.-P. 29-38.

190. Chet, I. Trichoderma Application, mode of action, and potential as a biocontrol agent of soil-borne plant pathogenic fungi // Innovative Approaches to Plant Disease Control. - New York. - 1987. - P. 137-160.

191. Chet, I. Mycoparasitism recognition, physiology and ecology // New directions in biological control. Alternatives for suppressing agricultural pests and diseases. - New York. - 1990. - P. 725-733.

192. Chet, I. Electrophoretic characterization of chitinases as a tool for the identification of Trichoderma harzianum strains / I. Chet, B.C. Daningehali, S. Haran, H. Schickler // Mycological Research. 1998. - Vol. 102. - P. 373-377.

193. Chet, I. Induction of the Trichoderma harzianum chitinolytic system is triggered by the chitin monomer, n-acetylglucosamine /1. Chet, S. Haran, A. Oppenheim, H. Schickler //Mycological Research. -1998. Vol. 102. - P. 1224-1226.

194. Chet, I. Mycoparasitism and lytic enzymes /1. Chet, N. Benhamou, S. Haran // Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis, London. - 1998. - Vol. 2.-P. 153-172.

195. Chet, I. The role of recognition in the induction of specific chitinases during mycoparasitism by Trichodenna-harzianum /1. Chet, J. Inbar. // Microbiology-UK. 1995. - Vol. 141. - P. 2823-2829.

196. Christensen M. Species diversity and dominance in fungal communities / Ed. D.T. Wiscklow, G.C. Carrol // The fungal community. New York: Marcll Dekker, 1981. P.201-232.

197. Clarkson, J.P. Biological control of Allium white rot by sclerotial degrading fungi / J.P. Clarkson, T. Paune, A. Meal, J.M. Whipps // 8th International Congress of Plant Pathology. Chiscthurch, New Zealand, 2-7 February 2003. -2003.-P. 34.

198. Cliquet, S. Influence of Culture Conditions on Growth and Survival of Conidia of Trichoderma spp. Coated on Seeds / S. Cliquet, R.J. Scheffer // Biocontrol science and technology. 1997. - Vol. 7. - P. 171-181.

199. Cohen-Kupiec, R. Molecular characterization of a novel (3-1,3-exoglucanase related to mycoparasitism of Trichoderma harzianum / R. Cohen-Kupiec, K.E. Broglie, D. Frisem, R.M. Broglie, I. Chet // Gene. 1999. - Vol. 226. - P. 147-154.

200. Collins, R.P. Characterisation of the major aroma constituent of the fungus Trichoderma viride (Pers) / R.P. Collins, A.F. Halim // J. Agricultural and Food Chemistry. 1972. - Vol. 20. - P. 437-438.

201. Conway, W.S. Trichoderma harzianum: a possible cause of apple decay in storage // Plant Disease. 1983. - Vol. 67. - P. 916-917.

202. Cook, R. S. The Nature and Practice of Biological Control of Plant Pathogens / R. S.Cook, K.F. Baker // St. Paul, MN. The American Phytopathological Society.-1983.-539 p.

203. Cook, R.J., Veseth, R.J. Wheat health management. St. Paul, Minnesota. ARS Press. 1991.-152 p.

204. Corke, A.T.K. Biocontrol of Nectria galligena infection of pruning wounds on apple shoots / A.T.K. Corke, T. Hunter // Journal of Horticultural Science. -1979. Vol. 54. - P. 47-55.

205. Corke, A.T.K. Use of microorganisms to control plant diseases. In Microbial control of insects, mites, and plant diseases / A.T.K. Corke, J. Rishbeth // Academic Press. London. 1981. - P. 717-735.

206. Dana, M.M. Regulation of chitinase 33 (chit33) gene expression in Trichoderma harzianum / M.M. Dana, M.C. Limón, R. Mejias, R.L. Mach, T. Benitez, J.A. Pintor-Toro, C.P. Kubicek // Curr. Genet 2001. - Vol. 38, N 6. -P. 335-342.

207. Danielson, R.M. Effect of nutrients anf acifity on phialospore germination of Trichoderma in vitro / R.M. Danielson, C.B. Davey // Soil Biology and Biochemistry 1973. - Vol. 5. - P. 517-524.

208. Datnoff, L.E. Biological control of Fusarium crown and root rot of tomato in Florida using Trichoderma harzianum and Glomus intraradices Biol. Control / L.E. Datnoff, S. Nemec, K. Pamazny- 1995. Vol. 5. - P. 427-431.

209. Daphnia // Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater / Managing Ed. M.A.H. Franson. Washington: American Public Health Association, 1995. - P. 8-57 - 8-61.

210. Deane, E.E. Transformation of Trichoderma reesei with a constitutively expressed heterologous fungal chitinase gene / E.E. Deane, J.M. Whipps, J.M.1.nch, J.F. Peberty // Enzyme and Microbial Technology. 1999. - Vol. 24. -P. 419424.

211. Deane, E.E. The purification and characterization of a Trichoderma harzianum exochitinase BBA Protein Struct / E.E. Deane, J.M. Whipps, J.M. Lynch, J.F. Peberty//Mol. Enzym. 1998. - Vol. 1383. - P. 101-110.

212. Deb, P.R. Trichoderma as a biocontrolling agent against Sclerotium rolfsii / P.R. Deb, B.K. Dutta//Microbiol. Letters. 1988. -N37. -P. 107-113.

213. Delgardo-Jarana, J. Overproduction of /?-l,6- glucanase in T. harzianum is controlled by extracellular acidic proteases and pH / J. Delgardo-Jarana, J.A. Pintor-Toro, T. Benitez // Biochim.Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1481. - P. 289-296.

214. De Meyer, G. Induced systemic resistance in Trichoderma harzianum T39 biocontrol of Botrytis cinerea / G. De Meyer, J. Bigirimana, Y. Elad, M. Hofte II Eur. J. Plant Pathol. 1998. - Vol. 104. - P. 279-286.

215. De La Cruz, J. Isolation and characterization of the three chitinases from Trichoderma harzianum / J.De La Cruz, A. Hidalgo-Gallego, T. Lora, J.M. Benitez, J.A. Pintor-Toro, A. Llobell // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 206, N 3.-P. 859-867.

216. De La Cruz, J. Purification and properties of a basic endo-l,6-glucanase (BGN16.1) from the antagonistic fungus Trichoderma harzianum / J. De La Cruz, A. Llobell //Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 265. - P. 145-151.

217. Delaney, T.P. Acentral role of salicylic acid in plant disease resistance / T.P. Delaney, S.Uknes // Science. 1994. - Vol. 266, N 5188. - P. 1247-1250.

218. De Marco, J.L. Characterization of a protease produced by a Trichoderma harzianum isolate, which controls cocoa plant witches' broom disease / J.L. De Marco, C.R. Felix // BMS Biochemistry. 2002. - Vol. 3.

219. De Bach, P. Biological control of insect pests and weeds Reinhold. New York. -1964. 844 p.

220. Dringra O.D., Sinclair J.B. 1994. Basic Plant Pathology Methods/ Academic Press. USA. P. 465.

221. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. I. Production of non-volatile antibiotics. 1971a. - Vol. 57. - P. 25-39.

222. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. II. Production of volatile antibiotics. 1971b. - Vol. 57. - P. 41-48.

223. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. III. Hyphal interaction / C. Dennis, J. Webster // Transactions of the British Mycological Society. 1971c. - Vol. 57, N 3. - P. 363-369.

224. De Wit, P.J.G.M. The molecular bases Sivasithamparam // Plant and Soil. Co-evolution between Cladosporium lulvum and tomato. Antonio van Lesuwenhoek. 2002. - Vol. 81. - P. 409-412.

225. Dik, A.J. Evaluation of microbial antagonists for biological control of Botrytis cinerea stem infection in cucumber and tomato / A.J. Dik, G. Koning, J. Kohl // Europ. J. Plant Pathol. 1999. - Vol. 105, N 2. - P. 115-122.

226. Draborg, H. Molecular cloning and expression in S.cerevisiae of two exochitinases from T. harzianum / H. Draborg, S. Kauppinen, H. Dalboge, S. Christgau // Biochem. Molec. Biol. Int. 1995. - Vol. 36, N 4. - P. 781-791.

227. Dringra O.D., Sinclair J.B. 1994. Basic Plant Pathology Methods / Academic Press. USA. P. 465.

228. Dodd, S.L. Control of Athelia rolfsii disease on lentil seedlings using 6-pentil-a-pyrone / S.L. Dodd, R.A. Hill, A. Stewart // Soil. Biol. Biochem. 2000. - Vol. 32.-P. 1033-1034.

229. Dodd, S. L. Taxonomy and phylogenetic relationships of two species of Hypocrea with Trichoderma anamorphs / S.L. Dodd, E. Lieckfeldt, P. Chaverri, B.E. Overton, G.J. Samuels // Mycol. Progr. 2002 -N 1. - P. 409-426.

230. Dominigues, F.C. Production of cellulases in batch culture using a mutant strain of Trichoderma reesei growing on soluble carbon source / F.C. Dominigues, J.A. Queiroz, J.M.S. Cabral, L.P. Fonseca // Biotechnology Letters. 2001. -Vol. 23.-P. 771-775.

231. Domsch K.H., Gams W., Pilze aus Agrarboden. Stuttgart. 1970. 222s.

232. Domsch K.H., Gams W., Anderson T.H. Compendium of soil fungi, (sec. ed.) London: Academic Press, 1993. 859 p.

233. Donzelli, B.G.G. Cloning, sequence and structure of a gene encoding an antifungal glucan 1,3-p-glucosidase from Trichoderma atroviride (T. harzianum) / B.G.G. Donzelli, M. Lorito, F. Scala, G.E. Harman // Gene. -2001.-Vol. 277.-P. 199-208.

234. Donzelli, B.G.G. Enhanced enzymatic hydrolysis of langostino shell chitin with modures of enzymes from bacterial and fungal sources / B.G.G. Donzelli, G. Ostroff, G.E. Harman // Carbohydr. Res. 2003. - Vol. 338. - P. 1823-1833.

235. Dubos, B. In Innovate Approaches To Plant Disease Control. New York. -1987.-P. 107-135

236. Dunlop, R.W. An antibiotic from Trichoderma koningii active against soilborne plant pathogens / R.W. Dunlop, A. Simon, K. Sivasithamparam // Journal of Natural Product. -1989. Vol. 52, N1. - P. 67-74.

237. Duqff, B.J. Implication of systemic induced resistance in the suppression of Fusarium wilt of tomato by Pseudomonas fluorescence WCS417r and by nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47 // Eur. J. Plant Pathol. 1998. - Vol. 104.-P. 903-910.

238. Earsburn D.M., Bulter E.E. Microhabitant characterization of Trichoderma harzianum in natural soil: evaluation of factor affecting distribution // Soil. Boil. Biochem., 1988a. V. 20. -N. 4. - P. 547-553.

239. Earsburn D.M., Bulter E.E. Microhabitant characterization of Trichoderma harzianum in natural soil: evaluation of factor population density // Soil. Boil. Biochem., 19886. -V. 20. -N. 4. P. 541-545.

240. Elad Y. A selective medium for improving quantative isolation of Trichoderma sp. from soil / Y. Elad, I. Chet, Y. Henis // Phytoparasitica. 1981. - № 9. - P. 59-67.

241. Elad, Y. Degradation of plant pathogenic fungi by Trichoderma harzianum / Y.Elad, I. Chet, Y. Henis // Canadian Journal of Microbiology. 1982. - Vol. 28.-P. 719-725.

242. Elad, Y. Possible role of lectins in mycoparasitism / Y. Elad, R. Barak, I. Chet // Journal of Bacteriology. 1983a - Vol. 154. - P. 1431-1435.

243. Elad, Y. Ultrastructural studies of the interaction between Trichoderma spp. and plant pathogenic fungi / Y. Elad, R. Barak, I. Chet, Y. Henis // Phytopathologische Zeitschrift 1983b. - Vol. 107. - P. 168-175.

244. Elad, Y. Parasitism of Trichoderma spp. on Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii scanning electron microscopy and fluorescence microscopy / Y. Elad, I. Chet, P. Boyle, Y. Henis //Phytopathology. 1983c. - Vol. 73. - P. 85-88.

245. Elad Y. Improved selective medium for isolation of Trichoderma spp. or Fusarium spp. / Y. Elad, I. Chet // Phytoparasitica. -1983. № 11. - P. 55.

246. Elad, Y. Scanning electron microscopical observations of early stages of interactions of Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani / Y. Elad, Z. Sadowsky, I. Chet // Transactions of British Mycological Society. 1987. - Vol. 88,N2.-P. 259-263.

247. Elad, Y. Biological control of grey grape mould by Trichoderma harzianum II Crop Protect. 1994. - Vol. 13. - P. 35-38.

248. Elad, Y. Mechanisms involved in biological control of Botrytis cinerea incited diseases // Eur J. Plant Pathol. 1996. - Vol. 102. - P. 719-732.

249. Elad, Y. Название статьи // In Modern Fungicides and Antifungal Compounds. -1999.-P. 459-487.

250. Elad, Y. The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrytis cinerea / Y. Elad, A. Kapat // European J. of Plant Pathology. 1999. -Vol.105.-P. 177-189.

251. Elad, Y. Biological control of foliar pathogens by means of Trichoderma harzianum and potential modes of action I I Crop Protection. 2000. - Vol.19. -P.709-714.

252. Ellis M.B. Dematiaceous Hyphomycetes. Commonwealth Mycological Institute Kew., Kew: Surrey, 1971. 609 p.

253. Ellis M.B., Ellis J.P.Microfimgi on Land Plants. Croom Helm. 1985. - 818 p.

254. English, H. Notes on apple rots in Washington // Plant Disease Reporter. 1944. -Vol. 28.-P. 610-622.

255. Ennis, W.B., jr. Crop protection to increase food supplies / W.B.Ennis jr., W.M. Dowler, W. Klassen // Science. 1975. - Vol. 188. - P. 593-598.

256. Errasquin, E.L. Tolerance and uptake of heavy metals by Trichoderma atroviride isilated from sludge / E.L. Errasquin, C.T. Vazquez. 2003. - Vol. 50.-P. 137-143.

257. Esposito, E. Systematics and environmental application of the genus Trichoderma / E. Esposito, N. Dasilva // Critical Reviews in Microbiology. -1998. Vol. 24, N. 2. - P. 89-98.

258. Esterbauer, H. Production of Trichoderma cellulose in laboratory and pilot scale / H. Esterbauer, J. Steiner, I. Labudova, A. Hermann, M. Hayn // Bioresource Technol.-1991.-P. 51-65.

259. Estrella, A.H., Chet, I. Biocontrol of bacteria and phytopathogenic fungi. In Agricultural biotechnology, Altman A. (Ed). New York: Marcel Dekker, Inc. 1998.-P. 263-282.

260. Evans H.C., Mycobiota of an indigenous Thiobroma species (Sterculiaceae) in Ecuador assessing its potential for biological control of cocoa diseases / H.C.Evans, K.A.Holmes, S.E. Thomas // Mycol.Prog. 2003. - Vol. 2. - P. 149160.

261. Ezzi, M.I. Cyanide catabolizing enzymes in Trichoderma spp. / M.I. Ezzi, J.M. Lynch // Enzymol Microbial Technol. 2002. - Vol. 31. - P. 1042-1047.

262. Ezzi, M.I. Characterisation of the rhodanese enzyme in Trichoderma spp. / M.I. Ezzi, J.A. Pascual, B.J Gould, J.M. Lynch // Enzymol Microbial Technol. -2003.-Vol. 32.-P. 629-634.

263. Farr, D.F. Fungi on Plants and Plant Products in the United States / D.F. Fair, G F. Bills, G.P. Chamuris, A.Y. Rossman // St. Paul, Minnesota: APS Press. -1989.-999 p.

264. Fisher, C.G., Fluid drilling a potential delivery system for fluid biocontrol agents with small seeded vegetables / C.G. Fisher, K.E. Conway, J.E. Motes // Proc. Okla. Acad. Sci., 1983. - Vol. 63, - 100 p.

265. Flores A. Improved biocontrol activity of Trichoderma harzianum strains by over-expression of the proteinase encoding gene prbl. / A. Flores, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Curr. Genet. 1997. - Vol. 31, N1. - P. 30-37.

266. Forsyth, O. M. Emetic and refusal activity of deoxynivalenol to swine / O. M. Forsyth, T. Yoshizawa, N. Morooka, J. Tuite // Appl. Environ. Microbiol. -1977.-Vol. 34.-P. 547-552.

267. Fox, R.O. A voltage-gated oin channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at l,5-'resolution / R.O. Fox, F.M. Richards // Nature. 1982. -Vol. 300.-P. 325.

268. Flyu, C.M. Bacterial volátiles promote growth in Arabidopsis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. Vol. 100. - P. 4927-4932.

269. Fravel, D.R. Availability and application of biocontrol products / D.R. Fravel, R.P. Larkin // Biological and Cultural Tests. 1996. - Vol. 11. - P. 1-7.

270. Garret, S.D. Pathogenic root-infecting fungi // Cambridge University Press. London. -1970. -294 p.

271. Garcia, I. Cloning and characterization of a chitinase (CHIT42) cDNA from the mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum / I. Garcia, J.M. Lora, J. De La Cruz, T. Benitez, A. Llobell, J.A. Pintor-Toro // Curr. Genet. 1994. -Vol. 27, N1.-P. 83-89.

272. Gastoria, Transferring of an endochitinase-encoding gene from Trichoderma spp. to antagonistic yeasts // 5th Congress of the European Foundation for Plant Pathology. -Taormina. Italy. 2000. - P. 83.

273. Gepp, V. Biological control of Sclerotinia sclerotiorum in Uruguayan vegetable crops / V. Gepp, A.S. Silveria, E. Perez // 8th International Congress of Plant Pathology. Chriscthurch, New Zealand, 2-7 February 2003. - 2003. - P. 33.

274. Godtfredsen, W.O. Trichodertnin, a new sesquiterpene antibiotic / W. O. Godtfredsen, S. Vangedal //Acta Chem. Sci. 1965. - Vol. 19. - P. 1088.

275. Gomez, I. Genetic diversity and vegetative compatibility among Trichoderma harzianum isolates /1. Gomez, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Mol. Gen. Genet. -1997.-Vol. 256.-P. 127-135

276. Ghisalberti, E.L. Antifungal antibiotics produced by Trichoderma spp / E.L. Ghisalberti, K. Sivasithamparam // Soil Biol. Biochem. 1991a. - Vol. 23, N 11.-P. 1011-1020.

277. Ghisalberti, E.L. The role of secondary metabolites produced by Trichoderma species in biological control (abstract) / E.L. Ghisalberti, K. Sivasithamparam // Petria. 1991b, N 1. - P. 130-131.

278. Ghisalberti, E.L. Antufungal metabolites from Trichoderma harzianum / E.L. Ghisalberti, C.Y. Rowland I I Journal of Natural Products. 1993. - N 56. - P. 1799-1804.

279. Ghisalberti, E.L. Variability among strains of Trichoderma harzianum in their ability to reduce take-all and to produce pyrones / E.L. Ghisalberti, M,J. Narbey, M.M. Dewan, K. Sivasinthamparam // Plant Soil. 1990. - Vol. 121. - P. 287291.

280. Gilman, J.C. A summary of the soil fungi / J.C. Gilman, E.V. Abbott // J. Sci. -1927.-Vol. l.-P. 225.

281. Green H, Jensen D.F, A tool for monitoring Trichoderma harzianum: II. The use of a GUS transgormant for ecological stufies in the rhizosphere. Phytopathology, v. 85, N 11. p. 1436-1440.1995.

282. Guarro J. Fatal Case of Trichoderma harzianum Infection in Renal Transplant Recipient / J. Guarro, M. I. Antolin-Ayala, J. Gene, J. Gutierrez-Calzada, C. Nieves-Diez, M. Ortoneda // J. Clinical Microbiology. -1999. P.3751-3755.

283. Gusakov, A.V. A product inhibition study of cellulases from Trichoderma longibrachiatum using dyed cellulose / A.V.Gusakov, A.P. Sinitsyn, V.B. Gerasimas, R.Yu. Savitskene, Yu.Yu. Stepanovichus // J. Biotechnology 1985. -Vol. 3, N 3. -P. 167-174.

284. Haab, D. Formation of the extracellular protease from T. resei QM 9414 involved in cellulose degradation / D. Haab, K. Hagspiel, K. Szakmary, C.P. Kubicek // J. Biotechnol. 1990. - Vol. 16. - P. 187-198.

285. Hadar, Y. Biological control of Rhizoctortia solani damping-off with wheat bran culture of Trichoderma harzianum / Y. Hadar, I. Chet, Y. Henis // Phytopathology. -1979. Vol. 69. - P. 64-68.

286. Hammond-Kosack, K.E. Functional Expression of a fungal avirulence gene from a modified potato virus X genome / K.E. Hammond-Kosack, B.J. Staskawicz, J.D.G. Jones, D.C. Baulcombe // Mol. Plant Microbe Interact. 1995. - Vol. 8. -P. 181-185.

287. Hanson, L.E. Biocontrol efficacy and other characteristics of protoplast fusants between Trichoderma koningii and T. virens / L.E. Hanson, C.R. Howell // Mycological Research. 2002. - Vol. 106, N 3. - P. 321-328.

288. Hanson, L.E. Elicitors of plant defense responses from biological control strains of Trichoderma virens / L.E. Hanson, C.R. Howell I I Phytopathology. 2004. -Vol. 94, N2.-P. 171-175.

289. Haran, S. New components of the chitinolytic system of Trichoderma harzianum / S. Haran, H. Schickler, A. Oppenheim, I. Chet//Micol. Res. 1995. -Vol. 99,N 9. -P. 441-446.

290. Haran, S. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biocontrol activity of Trichoderma harzianum / S. Haran, H. Schickler, I. Chet // Microbiology. 1996a. - Vol. 142, N 9. - P. 2321-2331.

291. Haran, S. Differencial expression of Trichoderma harzianum chitinases during mycoparasitism / S. Haran, H. Schickler, A. Oppenheim, I. Chet // Phytopathology. 1996b. - Vol. 86. - P. 980-985.

292. Harman, G.E. Factors affecting Trichoderma hamatum applied to seeds as a biocontrol agent / G.E. Harman, I. Chet, R. Baker // Phytopathology. 1981. -Vol. 71.-P. 569- 572.

293. Harman G.E. Biological fungi in plant pathology / G.E Harman, Y. Hadar // In: New Directions in Biological Control, R.R. Baker et P.E. Dunn (ed.), 1990. P. 779-792.

294. Harman, G.E. Production of conidial biomass of Trichoderma harzianum for biological control / G.E. Harman, X. Jin, T.E. Stasz, G. Peruzzotti, A.C. Leopold, A.G. Taylor // Biological control. 1991. - Vol. - 1.- P. 23-28.

295. Harman, G.E. Chitinolytic enzymes of Trichoderma harzianum: Purification of chitobiosidase and endochitinase / G.E. Harman, C.K. Hayes, M. Lorito, R.M. Broadway, A. DiPietro, C. Peterbauer, A. Tronsmo // Phytopathology. 1993. -Vol. 83, N3.-P. 313-318.

296. Harman, G.E. Myths and dogmas of biocontrol. Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22 I I Plant Dis. 2000. - Vol. 84. -P. 337-393.

297. Harman, G. E. Controlling plant pathogens and improving plant growth and productivity with biologicals. // Predicting Field Performance in Crop Protection: British Crop Protection Council Symposium Proceeding 2000. - N 74.-P. 101-110.

298. Harman, G.E. Enhancing Crop Performance and Pest Resistance with genes from biocontrol agents / G.E. Harman, B.G.GDonzelli // In Enhancing Biocontrol Agents and Handling Risks. IOC Press Amsterdam. - 2001. - P. 114-125.

299. Harman, G.E. Trichodema species opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Review / G.E. Harman, C.R. Howell, A. Viterbo, I. Chet, M. Lorito // Microbiology. - 2004a. - Vol. 2. - P. 43-55.

300. Hayes, C.K. Isolation and sequence of an endochitinase gene from a cDNA library of Trichoderma harzianum / C.K. Hayes, S. Klemsdal, M. Lorito, A. Di Pietro, C. Peterbauer, J.P. Nakas, A. Tronsmo, G.E. Harman // Gene. 1994. -Vol. 138, N1-2.-P. 143-148.

301. Hebar, P.K. 1999. Control of plant diseases by biofungicides. Proc. of the XlVth International Plant Protection Congress "Plant Protection towards the third millenium-where chemistry meets ecology" July 25-30, Jerusalem, Israel. P. 7.

302. Hererra-Estrella, A. Biocontrol of bacteria and phytopathogenic fungi. / A Hererra-Estrella, I. Chet // Agricultural Biotechnology. Inc. New York, Basel, Hong Kong. -1998.-P. 263-282.

303. Hermosa M.R., E. Keck, I. Chamoiro, B. Rubio, L.Sanz, J.A. Vizcaino, I. Grondona, E. Monte. Genetic diversity shown Trichoderma biocontrol isolates. Mycological Research. 2004. - Vol. 108. - P. 897-906.

304. Holker, U. Solid substrate fermentation of lignite by the coal-solubilizing mould Trichoderma atroviride, in a new type of bioreactor / U. Holker, M. Hofer I I Biotechnology letters. 2002. - Vol. 24. P. 1643-1645.

305. Holtzapple, M. Inhibition of Trichoderma reesei cellulose by sugars and solvents / M. Holtzapple, M. C. Hendrickson, Cognata, Y. Shu I I Biotechnology and Bioengineering. 1990. - Vol. 36. - P. 275-287.

306. Hotlnik, H.A.J. Effects of compost in container media on diseases caused by soil plant pathogens / H. A J. Hotlnik, G.A.Kuter // Acta. Hortic. 1985. - Vol. 172. P. 191.

307. Howell, J.A. Kinetics of Solka Floe Cellulase Hydrolysis by Trichoderma viride cellulose / J.A. Howell, J.D. Stuck // Biotechnology and Bioengineering. 1975. - Vol. 17. - P. 873-893.

308. Howell, C.R. Mechanisms in the biocontrol of Rhizoctonia solani induced cotton seedling disease by Gliocladium virens - antibiosis / C.R. Howell, R.D. Stipanovic // Phytopathology. - 1995. -Vol. 85, N. 4. - P. 469-472.

309. Howell, C.R. Puckhabor L.S. Induction of terpenoid synthesis in cotton roots and control of Rhizoctonia solani by seed treatment with Trichoderma virens / C.R. Howell, L.E. Hanson, R.D. Stipanovic // Phytopathology. 2000. - Vol. 90.-P. 248-252.

310. Howell, C.R. Cotton seedling preemergence damping-off incited by Rhizopus oryzae and Pythium spp. and its biological control with Trichoderma spp. II Phytopathology. 2002. - Vol. 92. - P. 177-180.

311. Howell, C.R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases. The histoiy and evolution of current concepts 11 Plant Dis.- 2003. -Vol. 87.-P. 4-10.

312. Hunt J.S., Gale D.S.J. Control of dead arm disease in grapes with injects able Trichoderma. Fifth International Gliocladium and Trichoderma workshop. Beltsville, MD, April 1995, abstract.

313. Hwang, J. Expression of induced resistance in ponsietta cuttings against Rhizoctonia stem rot by treatment of stock plants with binucleate Rhizoctonia / J. Hwang, D.M. Benson I I Biol. Control. 2003. - Vol. 27. - P. 73-80.

314. Iida, A. Fungal metabolites. IV. Synthesis of an antibiotic peptide, trichosporin B-V, from Trichoderma polysporum II Chem Pharm Bull (Tokyo). 1990. -Vol. 38, N 11. - P. 2997-3003.

315. Inbar, J. Biomimics of fungal cell wall recognition by use of lectin coated nylon fibers / J. Inbar, I. Chet // Journal of Bacteriology. 1992. - Vol. 174. - P. 1055-1059.

316. Inbar, J. Chet. Biomimics of fungal cell-cell recognition by use of lectin-coated nylon / J. Inbar, I. Chet // Journal of Bacteriology. 1992. - Vol. 174. - P. 10551059.

317. Inbar, J. A newly isolated lectin from the plant pathogenic fungus Sclerotium rolfsii: purification, characterization and role in mycoparasitism / J. Inbar, I. Chet//Microbiology. 1994. - Vol. 140. - P. 651-657.

318. Inbar, J. The role of recognition in the induction of specific chitinases during mycoparasitism by Trichoderma harzianum / J. Inbar, I. Chet // Microbiology. -1995.-Vol. 141,N 11. -P. 2823-2833.

319. Inbar, J. Hyphal interaction between Trichoderma harzianum and Sclerotinia sclerotiorum and its role in biological control / J. Inbar, A.N.A. Menendes, I. Chet // Soil Biol. Biochem. 1996. - Vol. 28, N 6. - P. 757-763.

320. Ikotun, T. Inhibition of growth of some plants pathogenic fungi by some antagonistic microorganisms isolated from soil / T. Ikotun, F. Adekunle // Journal of Basic Microbiology. 1990. - Vol. 30, N 2. - P. 95-98.

321. Jackisch-Matsuura, A.B. Efeito de Trichoderma spp. no controle de Pythium aphanidermatum em fumo (Nicotiana tabacum) / A.B. Jackisch-Matsuura, M. Menezes // Summa phytopathol. 1999. - Vol. 25, N 2. - P. 161-164.

322. Jackson, M.A. The composition and attributes of Colletotrichum truncatum spores are altered by the nutritional environment / M.A. Jackson, D,A. Schisler // Applied and environmental microbiology. 1992. - Vol. 58. - P. 2260-2265.

323. Jackson, M.A. Liquid culture production of microsclerotia of Colletotrichum truncatum for use as bioherbicidal propagules / M.A. Jackson, D.A. Schisler // Mycol Res. 1995. - Vol. 99. - P. 879-884.

324. Jackson, M.A. Biopesticides, microbial // Encyclopedia of Microbiology. J. Lederberg (Ed). Academic Press Sn Diego CA 2000. -P. 169-183.

325. John, S. Towards biological control of eutypa dieback of grapevines / S. John, E.S. Scott, T.J. Wicks, J.S. Hunt // 8th International Congress of Plant Pathology. Christchurch, New Zealand, 2-7 February 2003. - 2003. - P. 43.

326. Jtoh, Y. A new sesquiterpene antibiotic, heptelidic acid producing organisms, fermentation, isolation and characterization / Y. Jtoh, K. Kodama, K. Furuya, S.

327. Takahashi, T. Haneishi, Y. Takiguchi, M. Arai // J. Antibiotics. 1980. - Vol. 33.-P. 468-473.

328. Kenerley, C.M. Pathogen interactions with microbes on the phylloplane / C.M. Kenerley, J.H. Andrews // 197th ACS National Meeting, Dallas, Texas, 9-14 Apr. 1989. 1989.

329. Kitamoto, Y. Purification and some properties of an exo-J3-l,3-glucanase from Trichoderma harzianum / Y. Kitamoto, R. Kono, A. Shimotori, Y. Ichikawa // Agric. Biol. Chem. 1987. - Vol. 51, N 12. - P. 3385-3386.

330. Kloepper, J.W. In Pest Management. Biologically Based Technologies / J.W. Kloepper, S. Tuzun, L. Lu, G. Wei // Proceeding of the Beltswill Symposium XVn. (American Chemical Society). -1993. P. 10-20.

331. Kleifeld, O. Trichoderma harzianum interaction with plants and effect on growth response / O. Kleifeld, I. Chet // Plant and Soil. - 1992. - Vol. 144. - P. 267-272.

332. Knosel, D. Temperaturanspruche und extracellulare enzymatiche Aktivitat einiger aus Citrus-importen isolierte Pilze / D. Knosel, F. Schickedanz // Phytopathologishe Zeitschrift. -1976. Vol. 85. - P. 217-226.

333. Knudsen, G. R. Potential for biocontrol of Sclerotinia sclerotiorum through colonization of sclerotia by Trichoderma harzianum / G.R. Knudsen, D.J. Eschen // Plant Disease. 1991. - Vol. 75. - P, 466-480.

334. Koike, N. Induction of systemic resistance in cucumber against several diseases by plant growth-promoting fungal lignification and superoxide generation // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 107.-P. 523-533.

335. Koch, E. Evaluation of commercial products for microbial control of soil-borne plant diseases // Crop Protection. 1999. - Vol. 18. - P. 119-125.

336. Kommedahl, Т. Variability in performance of biological and fungicidal seed treatments in corn, peas and soybeans / T. Kommedahl, C.E. Windels, G. Sarbini, H.B. Wiley // Protection Ecology. 1981. - Vol. 3. - P. 55-61.

337. Kubicek, C.P. The cellulose proteins of Trichoderma reseei: structure, multiplicity, mode of action and regulation of formation // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1992. - Vol. 45. - P. 1-27.

338. Kubicek, C.P. Trichoderma and Gliocladium / C.P. Kubicek, G.E. Harman // Basic Biology, Taxonomy and Genetics. Taylor and Francis, London. - 1998. -Vol. 1.-278 p.

339. Kubicek, C.P. Trichoderma from genes to biocontrol / C.P. Kubicek, R.L. Mach, C.K. Petebauer, M. Lonto // J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 83. - P. 11-23.

340. Kubota T. Trichoderma harzianum SK-55 fungus, fungicide containing it, and method of manufacture of the same and its use: Patent 5422107 USA, MKU6 A 01N 63/00, A 01N1/00. Hokkaido Green Kosan, Inc. № 172273; 23.12.1993; № 4-359484.

341. Kuc, J. Concepts and direction of induced systemic resistance in plants and its application // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 107. - P. 7-12.

342. Kuhls, K. Molecular reidentification of human pathogenic Trichoderma isolates as Trichoderma longibrachiatum and Trichoderma citrinoviride / K. Kuhls, E. Lieckfeldt, T. Borner, E. Gueho // Med. Mycol. 1999. - Vol. 37. - P. 25-33.

343. Kuhls, K. PCR-fingerprinting used for comparison of ex type strains of Trichoderma species deposited in different culture collections / K. Kuhls, E. Lieckfeldt, T. Borner // Microbiol. 1995. - Vol. 150. - P. 363-371.

344. Labudova I., Gogorova L. Biological control of phytopathogenic fungi through lytic action of Trichoderma species. FEMS Microbiol Letters, 1988. V. 52. -№ 3. - P. 193-198.

345. Lanzusa, S. Cloning of ABC transporte-encoding genes in Trichoderma spp. to determine their involvement in biocontrol // J. Plant Pathol. 2002. - Vol. 84. -P. 184.

346. Leuchtmann, A. Isozyme subgroups in Trichoderma section Longibrachiatum / A. Leuchtmann, O. Petrini, G.J. Samuels // Mycologia. 1996. - Vol. 88, N. 3 -P. 384-394.

347. Levitin M. Toxigenic fungi and mycotoxins in cereals grain and food in Russia // An Overview on Toxigenic Fungi and Mycotoxins in Europe. Ed. A. Logrieco, A.Visconti. Dordrecht; Boston; London: Kluwer Acad. Publ. 2004. P. 195 199.

348. Lewis, J.A. Integrated control of Rhizoctonia fruit rot of cucumber / J.A. Lewis, G.C. Papavizas //Phytopathology. 1980. - Vol. 70. - P. 85-89.

349. Lewis, J.A., Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp. in liquid and solid growth media / J A Levis, G.C. Papavizas // Soil Biology and Biochemistry. 1983,- Vol. 15. - P. 351-357.

350. Lewis, J.A. Effect of mycelial preparation of Trichoderma and Gliocladium on populations of Rhizoctonia solani and the incidence of damping-off / J.A. Levis, G.C. Papavizas//Phytopathology. 1985a. - Vol. 75. - P. 812.

351. Lewis, J.A. Characteristics of alginate pellets formulated with Trichoderma and Gliocladium and their effect on the proliferation of the fungi in soil / J.A Levis, G.C. Papavizas // Plant Pathology. 1985b. - Vol. 34. - P. 571-577.

352. Lewis J.A., Reduction of inoculum of Rhizoctonia solani in soil by germlings of Trichoderma hamatum / J.A Levis, G.C. Papavizas // Soil Biol. Biochem. -1987-Vol. 19.-P. 195-201.

353. Lewis, J.A. A new formulation system for the application of biocontrol fungi to soil / J.A. Lewis, G.C. Papavizas, R.D. Lumsden // Biocontrol Science and Technology. 1991. - Vol. 1. - P. 59-69.

354. Lewis, J. A. Biocontrol of damping-of of greenhouse-grown crops caused by Rhizoctonia solani with a formulation of Trichoderma spp. / J.A. Lewis, R.D. Lumsden I I Crop Protection. 2001. - Vol. 20. - P. 49-56.

355. Lieckfeld, E., G. J. Samuels, and H.I. Nirenberg. 1999. A morphological and molecular perspective of Trichoderma viride: is it one or two species? Appl. Environ. Microbiol. Vol. -65. -P. 2418-2428.

356. Lifshitz, R. Decrease in incidence of Rhizoctonia preemergence damping-ofF by the use of integrated and chemical controls / R. Lifshitz, S. Lifshitz, R. Baker // Plant Disease. 1985. - Vol. 69. - P. 4341- 4344.

357. Lim, H.-S. The role and characterization of 1,3-glucanase in biocontrol of Fusarium solani by Pseudomonas stutzeri YEL-1 / H.-S. Lim, S.-D. Kim // J. Microbiol. 1995. - Vol. 33, N 4. - P. 295-301.

358. Limon, M.C. Increased antifungal activity of Trichoderma harzianum transformants that overexpress a 33-kDa chitinase / M.C. Limon, J.A. Pintor-Toro, T. Benitez I I Phytopathology. 1999. - Vol. 89, N 3. - P. 254-261.

359. Lo, C.T. Ecological studies of transformed Trichoderma harzianum strain 129522 in the rhizosphere and on the phytoplane of creeping benigrass / C.T. Lo, E.B. Nelson, C.K. Hayes, G.E. Harman // Phytopathology. 1998. - Vol. 88. -P. 129-136.

360. Lo, C.T. Induction of systemic resistance of cucumber to cucumber green mosaic virus by the root-colonizing Trichoderma spp. / C.T. Lo, T.F. Liao, T.C. Deng // Phytopathology. 2000. - Vol. 90. - P. 47-52.

361. Lorito, M. Antifungal, synergistic intereaction between chitinolytic enzymes from Trichoderma harzianum and Enterobacter cloacae / M. Lorito, C.K. Hayes, S.L Woo, A. Di Pietro, G.E. Harman // Phytopathology. 1993b. - Vol. 73.-P. 721-728.

362. Lorito, M. Chitinolytic enzymes and their genes / M. Lorito, G.E. Harman, C.P. Kubicek // Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis. London. -1998.-Vol. 2.-P. 73-99.

363. Lorito, M. Synergistic combination of cell wall-degrading enzymes anddifferent antifungal compounds enhances inhibition of spore germination / M. Lorito, C. Peterbauer, C.K. Hayes, G.E. Harman // Microbiology. 1994. - Vol. 140,N3.-P. 623-629.

364. Lorito, M. Microbial genes expressed in transgenic plants to improve disease resistance / M. Lorito, F. Scala // J. Plant Pathology. 1999. - P. 73-88.

365. Lorito, M. Pseudomonas lipodepsipeptides (LPDs) and Trichoderma cell wall-degrading enzymes are synergistic in the inhibition of fungal growth // 5th Congress of the European Foundation for Plant Pathology, Taormina. Italy. -2000.-P. 91.

366. Lotan, T. Xylanase, a novel elicitor of pathogenesis-related proteins in tobacco, uses a non-ethylene pathway for induction / T. Lotan, R. Flutz // Plant Physiol. -1989.-Vol. 89.-P. 138-143

367. Lumsden, R. D. Approval of Gliocladium virens by the U.S. Environmental Protection Agency for biological control of Pythium and Rhizoctonia damping-off/R. D. Lumsden, J.C. Locke, J.F. Walter//Petria. 1991 Vol. 21. -138 p.

368. Lumsden, R. D. and Vaughn, J. L. Pest Management: Biologically Based Technologies. Am. Chem. Soc. 1993. - 435 p.

369. Lynch, J.M. Response of lettuce to Trichoderma treatment / J.M. Lynch, K.L. Wilson, M.A. Ousley, J.M. Wipps I I Letters of Applied Microbiology. 1991. -Vol. 12.-P. 59-61.

370. Margolles-Clark, E. Improved production of Trichoderma harzianum endochitinase by expression in Trichoderma reesei / E. Margolles-Clark, C.K.

371. Hayes, G E. Harraan, M. Penttila // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62, N6.-P. 2145-2151.

372. Margolles-Clarc, E. Expression patterns of the hemicellulase genes of the filamentous fungus Trichoderma reesei on various carbon sources / E. Margolles-Clarc, M. limen, M. Penttilla I I J, of Biotechnology. 1997. - Vol. 57.-P.167-179.

373. McMullen M., Jones R., Gallenberg D. Scab of wheat and barley: a re-emerging disease of devastating impact // Plant Dis. 1997. Vol. 81. P. 1340 1348.

374. McBeath; J. H. Cold tolerant Trichoderma, 1995. Patent.

375. Menzies, J.G. A strain of Trichoderma viride pathogenic to germinating seedlings of cucumber, pepper and tomato I I Plant Pathology. 1993. - Vol. 42. -P. 784-791.

376. Mehrotra, R.S. Fungi-agents of Biological control / R.S. Mehrotra, K.R. Aneja, A.K. Gupta A. Aggarwal. Biocontrol of Plant Diseases. 1993. - V.l. - P. 3752.

377. Messina, J. The use of beneficial Trichoderma in grapevine propagation // Comb. Proc. Intern. Plant Propagators 'Soc.~ 2000. Vol. 49. - P. 145-148.

378. Metcalf, D.A. The process of antagonism of Sclerotium cepivorum in white rot affected onion roots by Trichoderma koningii / D.A, Metcalf, C.R. Wilson // Plant Pathology. 2001. - Vol. 50, N 2. - P. 249-257.

379. Meyer, C.E. A polypeptyde anti-bacterial agent isolated from Trichoderma viride / C.E. Meyer, F. Reusser // Experimenta. 1967. - Vol. 23. - P. 85.

380. Migheli, Q. Fate of transformed Thchoderma harzianum in the phylloplane of tomato plants / Q. Migheli, A. Herrera-Estrella, M. Avataneo, M.L. Gullino // Molecular Ecology. 1994. - Vol. 3. - P. 153-159.

381. Millard, W.A. Antagonism of micro-organisms as the controlling factor in the inhibition of scab by green-manuring / W.A. Millard, C.B. Taylor // Annals of Applied Biology. 1927. - Vol. 14. - P. 202-216.

382. Mischke, S. Evaluation of chromogenic substrates for measurement of protease production by biocontrol strains of Trichoderma // Microbios. 1996. - Vol. 87. - P. 175-183.

383. Monaco, C.I. Incremonto en el crecimiento de las plantas inducido por Trichoderma harzianum // La Planta. 1990. -P. 75-77.

384. Monte E. Trichoderma in organic agriculture / E. Monte, A.Llobell // Proc. V World Avocado Congress. -2003 P.725-733.

385. Montero, M. BGN16.3, a novel acidic {beta}-l,6-glucanase from mycoparasitic fungus Trichoderma harzianum CECT 2413 / M. Montero, L. Sanz, M. Rey, E. Monte, A. Llobell // FEBS J. 2005. - Vol. 272, N13. - P. 3441-3448.

386. Mora, A. Combination of T. harzianum endochitinase and membrane-affecting fungicide on control of Alternaría leaf spot in transgenic broccoli plants / A. Mora, E.D. Earle // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - Vol. 55, N3.-P. 306-310.

387. Morris, E., O. Doyle, and K. Clancy. A profile of Trichoderma species. I. Mushroom compost production. Mushroom Sci. 1995a. - Vol.14. - P. 611618.

388. Morris, E., O. Doyle, and K. Clancy. A profile of Trichoderma species. II. Mushroom growing units. Mushroom Sci. 1995b. Vol.14. - P. 619-625.

389. Mukhopadhyay, A.N. Trichoderma harzianum a potential biocontrol agent for tobacco damping-off / A.N. Mukhopadhyay, A. Brahmbahtt, G.J. Patel // Tobacco Research. - 1986. - Vol. 12, N 1. - P. 26-35.

390. Mukhopadhyay, A.N. Biological seed treatment with Gliocladium and Trichoderma for control of chickpea and lentil wilt complex. Fifth International Gliocladium and Thchoderma workshop. Beltsville, MD. Abstract. 1995.

391. Muthumeenakshi, S. Intraspecific molecular variation among Trichoderma harzianum isolates colonizing mushroom compost in the British Isles / S. Muthumeenakshi, P.P. Mills, A.E. Brown, D.A. Seaby // Microbiology. 1994. -Vol. 140.-P. 769-777.

392. Mukherjee, P.K. Comparative antagonistic properties of Gliocladium virens and Trichoderma harzianum on Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani its relevance to understanding the mechanisms of biocontrol / P.K. Mukherjee, A.N.

393. Mukhopadhyay, D.K. Saraiah, S.M. Shrestha // J. Phytopathol. 1995. - Vol. 143, N 5. - P. 275-279.

394. Mukherjee, P.K. Trichoderma sp. as a microbial suppressive agent of Sclerotium rolfsii on vegetables / P.K. Mukherjee, K. Radhu // World journal of Microbiolog and Biotechnology. 1997a. - Vol. 13. - P. 497-499.

395. Mukherjee, P.K. Effect of temperature on antagonistic and biocontrol potential of Trichoderma sp. on Sclerotium rolfsii / P.K. Mukherjee, K. Radhu // Mycopathologia. 1997b. - Vol. 139. - P. 151-155.

396. Muñoz, F.M. Trichoderma longibrachiatum infection in a pediatric patient with aplastic anemia / F.M. Muñoz, G.J. Demmler, W.R. Travis, A.K. Ogden, S.N. Rossmann, M.G. Rinaldi // J. of Clinical Microbiology. 1997. - Vol. 35, N. 2. -P. 499-503.

397. Nejad, P. Endophytic Bacteria induce growth promotion and wilt disease suppression on oilseed rape and tomato / P. Nejad, P.A. Jonson // Biological Control. 2000. - Vol. 18. - P. 208-215.

398. Nelson, M.E. Biological control of gray mold of snap beans by Trichoderma hamatum / M.E. Nelson, M.L. Powelson // Plant Diseases. 1988. - Vol. 72. -P. 727-729.

399. Nemec, S. Efficacy of biocontrol agents in planting mixes to colonize plant roots and control root diseases of vegetables and citrus / S. Nemec, L.E. Datnoff, J. Strandberg // Crop Protect. 1998. - Vol. 15. - P. 735-742.

400. Noronha E.F., Purification and characterization of an endo-p-l,3-glucanase from Trichoderma harzianum. / E.F.Noronha, C.J. Ulhoa // Can. J. Microbiol -1996. V.42. № 10. P. 1039-1044.

401. Noronha E.F., Characterization of a 29-kDa p-l,3-glucanase from Trichoderma harzianum. / E.F.Noronha, C.J. Ulhoa // FEMS Microbiol. Lett. -2000.-Vol. 183.-P. 119-123.

402. Ooka, T. A new antibacterial peptide «Suzukacillin» / T. Ooka, Y. Shimojima, T. Akimoto, S. Senoh, J. Abe // Agrie. Biol. Chem. 1966. - Vol. 30. - P. 700.

403. Omero, C. G protein activators and camp promote mycoparasitic behaviour in Trichoderma harzianum / C. Omero, J. Inbar, V. Rocha-Ramirez, A. Herrera-Estrella, I. Chet, B.A. Horwitz // Mycological Research. 1999. - Vol. 103, N 12.-P. 1637-1642.

404. Ousley, M.A. Potential of Trichoderma spp. as consistent plant growth stimulators / M.A. Ousley, J. M. Lynch, J M. Whipps // Biol. Fértil. Soil. -1994.-Vol.17.-P. 85-90.

405. Oostendort, M. Induce disease resistance in plants by chemicals / M, Oostendort, W. Kunz, B. Dietrich, T. Stauo // Eur. J. Plant Pathol. 2001. - Vol. 107. - P. 19-28.

406. Paau, A.S. Formulations useful in applying beneficial microorganisms to seeds // Trends ofBiotechnology. 1988. - Vol.6, N II. - P. 276-279.

407. Park K.S. Activation of PR1 a promoter by rhizibacteria that induce systemic resictance in tobacco against Pseudomonas syringae pv. tabaci / K.S. Park, J.W. Kloepper // Biol.Control. 2000. - Vol. 18. - P. 2-9.

408. Papavizas, G.C. Biological control of soilborne fungal propagules / G.C. Papavizas, R.D. Lumsden // Annual Review Phytopathology. 1980. - Vol. 18. -P. 389-413.

409. Papavizas, G.C. Liquid fermentation technology for experimental production of biocontrol fungi /G.C. Papavizas, M.T.Dunn, J.A.Lewis, J. Beagle-Ristaino // Phytopathology. -1984. Vol. 74. - P. 1171-1175.

410. Papavizas, G.C. Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology and potential for biocontrol // Annual Review of Phytopathology. 1985. - Vol. 23. - P. 2354.

411. Papavizas, G.C. Biotechnology and soilborne plant diseases / G.C. Papavizas, J.E. Loper // Res. Tomorrow. Yearb. Agr. 1986. - Vol. 1. - P. 62-65.

412. Patent USA # 4900348. C05F 11/08. 1987. Production of disease suppressive compost and container media, and microorganism culture for use therein / Harry A. J. Hoitink. Feb. 6. - 16 p.

413. Patil, I.S. Antagonistic action of species of Trichoderma, Bacillus and Streptomyces on Drechslera sorokiniana (Sacc) subran and jain / I.S. Patil, K. Srikant, R.K. Hegde // Pesticides. 1987. - Vol. 21, N 12. - P. 22.

414. Paulitz, T.C. Biochemical and ecological aspects of competition in biological control // New directions in biological control. Alternatives for suppressing agricultural pests and diseases. Alan R. Liss, Inc. New York. - 1990. - P. 713724.

415. Paulitz T., Seaman W. L., Dutilleul P. Disease and infection gradients of Fusarium head blight (Gibberella zeae) in wheat // Phytopathology. 1994. Vol. 84. P. 1142.

416. Pearce R. B., Strange R. N., Smith H. Glycinebetaine and choline in wheat; distribution and relation to infection by Fusarium graminearum II Phytochemistry. 1976. Vol. 15. P. 953 954.

417. Peberdy, J.F. Fungal cell walls a review. Biochemistry of Cell Walls andbranes in Fungi //Biochemistry of cell walls and membranes in fungi. -Springer-Verlag. Berlin. - 1990. - P. 5-30.

418. Pieterse, C.M.J. Salicylic acid independent plant defense pathways / C.M.J. Pieterse, L.C. van Loon // Trends Plant Sci. - 1999. - Vol. 4. - P. 52-58.

419. Pieta, D. The efficiency of microbiological dressing of pea (Pisum sativum L.) against pathogenic soilborne fungi / D. Pieta, E. Patkowska, A. Pastucha I I Ann. agr. Sc. Ser. E-Plant Protect. 1998a. -Vol. 27, N1/2. - P. 81-89.

420. Pieta, D. The efficiency of microbiological dressing of soybean seed (Glycine max (L.) Merrill) against root and stem base diseases / D. Pieta, A. Pastucha, E. Patkowska I I Ann. Agr. Sc. Ser. E-Plant Protect. 19986. - Vol. 27, N 1/2. - P. 103-109.

421. Picard, K. Cytological Effects of Cellulases in the Parasitism of Phytophthora parasitica by Pythium oligandrum / K. Picard, Y. Tirilly, N. Benhamou // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - Vol. 66, N 10. - P. 43054314.

422. Pitt, J.I. A laboratory guide to common Penicillium species, (sec. ed.). North Ryde,N.S.W., Australia: CSIRO, Division of Food Processing. 1991. - 188 p.

423. Pozo, M.J. Localized versus systemic effect of arbuscular mycorhyzal fungi on defense responses of Phytophthora infection in tomato plants // J. Exp. Bot. -2002.-Vol. 53.-P. 525-534.

424. Pyke, T.R. U-21,963, a new antibiotic. I. Discovery and biological activity / T.R. Pyke, A. Dietz //Appl. Microbiol. 1966. - Vol. 14. - P. 506-510.

425. Ramot, 0. Regulation of P-l,3-glucanase by carbon starvation in the mycoparasite T.harzianum / O. Ramot, R. Cohen-Kupiec, I. Chet // Mol. Res. -2000. Vol. 104. - P. 415-420.

426. Ramot, O. Regulation of two homodimer hexosaminidases in the mycoparasitic fungus Trichoderma asperellum by glucosamine / O. Ramot, A. Viterbo, D. Friesem, A. Oppenheim, I. Chet // Curr. Genet. 2004. - Vol. 45. - P. 205-213.

427. Ramirez, C. Manual and Atlas of the Penicillia. Elsiveier Biomedical Press. -1982,- 874 p.

428. Reese, E.T. Stability of the cellulose of Trichoderma reesei under use conditions / E.T. Reese, M. Mandéis // Biotechnology and Bioengineering. 1980. - Vol. 22. -P. 323-335.

429. Reusser, F. Biosynthesis of antibiotic U-22, 324. A cyclic polypeptide // J. Biol. Chem.- 1967. -P. 242-243.

430. Ridout, C.J. Fractionation of extracellular enzymes from a mycoparasitic strain of Trichoderma harzianum / C.J. Ridout, J.R. Coley-Smith, J.M. Lynch // Enzyme Microbiology and Technology. 1988. - Vol. 10. - P. 180-187.

431. Ricard J.L. Commercialization of a Trichoderma based mycofungicide - some problems and solutions // Biocontrol News and Information, 1981. - V. 2. - P. 95-98.

432. Rifai M.A. A revision of the genus Trichoderma. II Mycol. Papers, Imp. Mycol. Inst.-1969.-Vol. l.-P. 1-56.

433. Rocha-Ramirez, V. Trichoderma atroviride G-Protein {alpha}-Subunit Gene tgal Is Involved in Mycoparasitic Coiling and Conidiation / V. Rocha-Ramirez, C. Omero, I. Chet, B.A. Horwitz, A. Herrera-Estrella // Eukaryotic Cell. 2002. -Vol. l.-P. 594-605.

434. Rodin, V.B. Efficacy of individual biocides and synergistic combinations / V.B. Rodin, S.K. Zhigletsova, V.S. Kobelev, N.A. Akimova, V.P. Kholodenko // Intern. Biodeterioration &Biodegradation. 2005. - P. 239-317.

435. Rossman, A.Y. Morphological and molecular perspectives on systematics of the Hypocreales // Mycología. 1996. - Vol. 88, N 1. - P. 1-19.

436. Rossman, A.Y. Genera of Bionectriaceae, Hypocreaceae and Nectriaceae (Hypocreales, Ascomycetes) / A.Y. Rossman, G.J. Samuels, C.T. Rogerson, R. Lowen // Stud. Mycol. 1999. - Vol. 42. - P. 1-248.

437. Roulston, S. Observations on the interactions between Trichoderma viride and three Botrytis species / S. Roulston, S.D. Lane I I Mycologist. 1988. - Vol. 2, N 4. - P. 176-177.

438. Ruocco, M. ABC transporters in Trichoderma harzianum II The 7th International Mycological Congress, Book of Abstracts. Oslo, Norway, 11-17 August 2002. -2002.-P. 354.

439. Russell, A.D., Furr, J.R., Maillard, J.Y., 1997. Microbial susceptibility and resistance to biocides. ASM News 63, 481-486.

440. Saccardo, P.A. Fungi Algeruensis, Tahitensis et Gallici // Rev. Mycol. ~ 1885. -Vol. 7.-P. 158-161.

441. Saccardo, P.A. Sylloge iungoruin omnium hucusquecognitorum. Paris. - 1901. -455 p.

442. Schisler, D.A., Jackson, M.A., Bothast, R.J. 1991. Influence of nutrition during conidiation of Colletotrichum truncatum on conidial germination and efficacy in inciting disease in Sesbania exaltata. Phytopathology 81:587-590.

443. Schisler D. A., Slininger P. J., Bothast R. J. Effects of antagonist cell concentration and two-strain mixtures on biological control of Fusarium dry rot of potatoes //Phytopathology. 1997. Vol. 87. P. 177 183.

444. Schisler D. A., Khan N. I., Boehm M. J., Slininger P. J. Greenhouse and field evaluation of biological control of Fusarium head blight on durum wheat // Plant Dis. 2002. Vol. 86. P. 1350 1356.

445. Sahai, A.S. Chitinases of fungi and plants: their infolvment in morphogenesis and host-parasite interaction / A.S. Sahai, M.S. Manocha // FEMS Microbiol. Rev.- 1993.-Vol. 11,N4.-P. 317-338.

446. Samuels, G.J. Trichoderma a review of biology and systematic of the genus // Mycological Research. - 1996. - Vol. 100, N 8. - P. 923-935.

447. Samuels G. J., Lieckfeldt E., Nirenberg H. I. Trichoderma asperellum, a new species with waited conodia, and redescription of T. viride II Sydowia. 1999. -Vol. 51.-P. 71-88.

448. Samuels G.J., Padro-Schultheiss R., Hebbar K.P., Lumsden R.D., Baston C.N., Costa J.C. and Bezerra J.L. Trichoderma stromaticum sp.nov., a parasit of thecacao witches broom pathogen // Mycol. Res. 2000. - V. 104. ~N 6. - P. 760764.

449. Samuels, G.J. Trichoderma species associated with the green mold epidemic of commercially grown Agaricus bisporus / G.J. Samuels, W. Gams, L.A. Castlebury, O. Petrini // Mycologia. 2002. - Vol. 94, N 1. - P. 146-170.

450. Samson, R.A. Constraints associated with taxonomy of biocontrol fungi // Can. J. Bot. (Supplementary). 1995. - Vol. 73. - P. 583-588.

451. Sandford, G.B. Some factors affecting the pathogenicity of Actinomyces scabies //Phytopathology. 1926. - Vol. 16. - P. 525-547.

452. San Martin R., B.A. Latorre, E. Agosin, G.S. Vasquez. Effectiveness of conidia of Trichoderma harzianum produced by liquid fermentation against Botrytis bunch rot of table grape in Chile. Crop Protection, 1997,16, №3, p.209-214.

453. Schickler, H. Heterologous chitinase gene expression to improve plant defense against phytopathogenic fungi / H. Schickler, I. Chet // J. Industrial Microbiology and Biotechnology. 1997. - Vol. 19. -P. 196-201.

454. Schippers, B. Plant growth control by fluorescent pseudomonas / B. Schippers, B. Lugtenberg, P.J. Weisbeek // In Innovative Approaches to Plant Disease Control.-1987.-P. 19-39.

455. Seaby, D. Differentiation of Trichoderma taxa associated with mushroom production. Plant Pathology. 1996. Vol. 45. - P. 905-912.

456. Shoresh, M. Involvement of jasmonic acide\ethylene signaling pathway in the systemic resistance induced in cucumber by Trichoderma asperellum strain T-203 / M. Shoresh, I. Yedidia, I. Chet // Phytopathology. 2005. - Vol. 95. - P. 76-84.

457. Seaman A. Efficacy of OMRI-approved products for tomato foliar disease control. // New York State Integrated Pest Management Program. New York. -2003.

458. Scott, J.H. Lyticase: endoglucanase and protease activities that act together in yeast cell lysis / J.H. Scott, R. Schekman // J. Bacteriol. 1980. - Vol. 142, N2. -P. 414-423.

459. Sid Ahmed, A. Evaluation of Trichoderma harzianum for controlling root rot caused by Phytophthora capsici in pepper plants / A. Sid Ahmed, C. Perez-Sanchez, C. Egea, M.E. Candela // Plant Pathol. 1999. -Vol. 48, N 1. - P. 5865.

460. Sivasithamparam, K. Secondary metabolism in Trichoderma and Gliocladium / K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti // Trichoderma and Gliocladium. Taylor and Francis, London. - 1998. - Vol. 2. - P. 139-191.

461. Simmons, C.R. Physiology and molecular biology of plant 1,3-p-D-glucanases and 1,3; 1,4-P-D-glucanases // Crit. Rev. Plant Sci. 1994. - Vol. 13, N 4. - P. 325-387.

462. Sivan, A. The possible role of comprtition between Trichoderma harzianum and Fusarium oxysporum on rhizosphere colonization / A. Sivan, I. Chet // Phytopathology. 1989. - Vol. 79, N 2. - P. 198-203.

463. Sivan, A. Biological control effects of a new isolate of Trichoderma harzianum on Pythium aphanidermatum / A. Sivan, Y. Elad, I. Chet I I Phytopathology. -1984.-Vol. 74.-P. 498-501.

464. Silvan, A. Degradation of fungal cell walls by lytic enzymes from Trichoderma harzianum / A. Silvan, I. Chet // J. Gen. Microbiol. -1989b. Vol. 135. - P. 675-682.

465. Simmons E.G. Typification of Alternaria, Stemphylium and Ulocladium II Mycologia. 1967. Vol. 59. P. 67-92.

466. Smith, V.L. Potential for biological control of Phytophthora root and crown rots of apple by Trichoderma and Gliocladium spp. / V.L. Smith, W.F. Wilcox, G.E. Hartnan // Phytopathology. 1990. - Vol. 80. - P. 880-885.

467. Soytong, K. Antagonism of Chaetomium globosum to the rice blast pathogen, Pyricularia oryzae. / K. Soytong, T.H. Quimio // Kasetsart J. (Nat. Sci.). 1989. -Vol. 23.-P. 198-203.

468. Sperry, S. Vertinoid polyketides from the saltwater culture of the fungus Trichoderma longibrachiatum separated from a Haliclona marine sponge / S. Sperry, G.J. Samuels, P. Crews // J. Org. Chem. 1998. ~ Vol. 63. - P. 1001110013.

469. Spiegel, Y. Evaluation of Trichoderma spp. as biocontrol agent against soilborne fungi and plant parasitic nematodes in Israel / Y. Spiegel, I. Chet // Integrated Pest Management Reviews. -1998. Vol. 3. - P. 169-1.75.

470. Tabachnik, M. Method of growing trichoderma. US patent № 4837155. June 6, 1989.

471. Tagger, S. Phenoloxidases of the white-rot fungus Marasmius quercophilus isolated from an evergreen oak litter (Quercus ilex L.) / S. Tagger, C. Perissol, G. Gill, G. Vogt, J. Le Petit // Enzyme and Microbial Technology. 1998. -Vol. 23.-P. 372-379.

472. Takahashi, H. Four new species of Crinipellis and Marasmius in eastern Honshu, Japan //Mycoscience. 2002. -Vol. 43. - P. 343-350.

473. Tang, Ya-J. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid / Ya-J. Tang, J.-J. Zhong // Enzyme and Microbial Technology. -2002. -Vol. 31. P. 20-28.

474. Tang, P. Allergic Fungal Sinusitis Associated with Trichoderma longibrachiatum / P. Tang, S. Mohan, L. Sigler, I. Witterick, R. Summerbell, I. Campbell, T. Mazzulli// J. Clinical Microbiology. -2003. P. 5333-5336.

475. Tashpulatov, Zh. Amino-acid composition of protein fractions from fermented feed / Zh. Tashpulatov, B.G. Baibaev, T.S. Shul'man // Chemistry of natural compounds. 2000. - Vol. 36, N 5. - P. 516-517.

476. Thorn C. A., Raper K.B. Manual of the Penicillia. New York: Heftier Publishing Co., 1968. 875 p.

477. Thrane, C. A tool for monitoring Trichoderma harzianum: I. Transformation with the GUS gene by protoplast technology / C. Thrane, M. Liibeck, H. Green, Y. Degefu, S. Allerup, U. Thrane, D.F. Jensen // Phytopathology. 1995. - Vol. 85.-P. 1428-1435.

478. Tribe, H.T. Use of autoclavable plastic bags in fungus culture work / H.T. Tribe, A.H.M. Ahmed // Transactions of the British Mycological Society. 1975. -Vol. 64. - P. 362-363.

479. Tokimoto, K. Lysis of the mycelium of Lentinus edodes caused by mycolytic enzymes of Trichoderma harzianum when the two fungi were in antagonists state // Transactions of the Mycological Society of Japan 1982. - Vol. 23. - P. 13-20.

480. Tolan, J.S. Cellulase from submerged fermentation / J.S. Tolan, B. Foody // Adv Biochem Eng Biotechnol. 1999. - Vol. 65. - P. 41-67.

481. Toyama, H. Intraspecific karyoduction in Trichoderma reesei QM 9414 using the "smaller nuclei" / H. Toyama, N. Toyama // Journal of biotechnology. -1995.-Vol. 39.-P. 35-40.

482. Tronsmo, A. Effect of temperature on antagonistic properties of Trichoderma species / A. Tronsmo, C. Dennis // Transactions of the British Mycological Society. 1978. - Vol. 71. - P. 469-474.

483. Tronsmo, A. Use of Trichoderma spp. in biological control of necrotropic pathogens // Microbiology of the phyllosphere. Fokkema N.J., J. van den Heuvel. 1986. - P. 348-362.

484. Tronsmo, A. Trichoderma harzianum used for biocontrol agent of storage rot on carrots // Norwegian Journal of Agricultural Sciences. 1989. - Vol. 3. - P.151-156.

485. Tronsmo, A. Biological and integrated controls of Botrytis cinerea on apple with Trichoderma harzianum II Biological Control.-1991. Vol. 1. - P. 59-62.

486. Tronsmo, A. Coproduction of chininolytic enzymes and biomass for biological control by Trichoderma harzianum on media containing chitin / A. Tronsmo, G.E. Harman // Biological control. 1992. - Vol. 2. - P. 272-277.

487. Tronsmo, A. Biological Control with Trichoderma harzianum. Potential and Characterization of Chitinolytic enzymes. 1995. - P. 168.

488. Tronsmo, A. Trichoderma harzianum used in biological control of diseases on apples in Norway / A. Tronsmo, L.G. Hjeljord // Fifth International Gliocladium and Trichoderma workshop. Beltsville. MD, April 1995. Abstract. - 1995.

489. Tu, J.C. The effect of the hyperparasite (Gliocladium virens) on Rhizoctonia solani and on Rhizoctonia root rot of white beans / J.C. Tu, O. Vaartja // Canadian Journal of Botany. 1981. - Vol. 59. - P. 22-27.

490. Ulhoa, C.J. Purification and characterization of an extracellular chitobiase from Trichoderma harzianum / C.J. Ulhoa, J.F. Peberdy // Curr. Microbiology. 1991. - Vol. 23. - P. 285-289.

491. Ulhoa, C.J. Purification and some properties of the extracellular chitinase produced by Trichoderma harzianum / C.J. Ulhoa, J.F. Peberdy // Enzyme Microb. Technol. 1992. - Vol. 14. - P. 236-240.

492. Undser, D.L. Effect of certain fungi on dwarf tomatoes grown under gnotobiotic conditions / D.L. Undser, F.L. Byker // Phytopathology. 1967. - Vol. 57. - P. 1262-1263.

493. Vannacci, G. Biocontrol of Sclerotinia lettuce drop. Abstract / G. Vannacci, S. Pecchia, C. Mallegni, W. Cortellini, F. Faccini // Petria. 1991. - Vol. 1. - P. 140-141.

494. Vanachter, A. In vitro evaluation of the antagonistic properties of Trichoderma spp. against Pyrenochaeta lycopersici and Phomopsis sclerotioides / A. Vanachter, E. Wambeke, C. Assche I I Bull. OEPP. 1988. - V. 18, N 1. - P. 17.

495. Vazquez-Garciduenas, S. Analysis of the p-l,3-glucanolytic system of the biocontrol agent Trichoderma harzianum / S. Vazquez-Garciduenas, C.A. Leal-Morales, A. Herrera-Estrella // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N 4. -P. 1442-1446.

496. Viterbo, A. Antifungasl activity of a novel endochitinase gene (chit36) from Trichoderma harzianum Rifai TM / A. Viterbo, S. Haran, D. Friesem, O. Ramot, I. Chet //FEMS Letters. 2001. - Vol. 200. - P. 169-174.

497. Viterbo, A. Significance of lytic enzymes from Trichoderma spp. / A. Viterbo, O. Ramot, L. Chernin, I. Chet // In the biocontrol of fungal plant pathogens. Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - Vol. 81. - P. 549-556.

498. Wao, S.L. Identifying biocontrol genes in Trichoderma spp. and mechanisms activating biocontrol processes // 8 International Congress of Plant Pathology. -Christchurch, New Zealand Abstracts. 2003. - P. 268.

499. Wao, S.L. Mycoparasitic Trichoderma strains are activated by host-derived molecules // 6th European Conference on Fungal Genetics. Abstract Book, 6-9 April 2002, Pisa, Italy. 2002. - P. 306.

500. Wardle D.A., Parkinson D., Waller J.E. Interspecific competitive interactions between pairs of fungal species in natural substrates // Ecology, 1993. V. 94. -P. 165-172.

501. Watanabe D.A. Pictorial Atlases of soil and seed fungi (morphologies and cultured fungi and key to species) Tokyo: Soft. Science Publication. 1994. 41 lp.

502. Webster J., Does Trichoderma produce gliotoxin and viridin? II Transaction of the British mycological Society / J. Webster, Lomas N. 1964. Vol. 47. - P. 535-540.

503. Weller, D.M. Biological control of soilborne plant pathogens in the rhizosphere with bacteria // Annu. Rev. Phytopathol. 1988. - Vol. 26. - P. 379-407.

504. Wells H.D., Bell D.K., Jaworski C.A. Efficacy of Trichoderma harzianum as a biocontrol Sclerotium rolfsii, Phytopathology, 62, 442,1972.

505. Wells, H.D. Trichoderma as biological agent I I In. Biocontrol of plant diseases. -1988.-Vol. 1.-P. 71-82.

506. Whipps, J.M. Effect of media on growth and interactions between a range of soilborne glasshouse pathogens and antagonistic fungi // New Phytol. 1987. -Vol. 107, N 1. - P. 1259-1264.

507. Wessels, J.G.H. Cell wall synthesis in apical hyphal growth // Int. Rev.Cytol. -1986.-Vol. 104. -P.37-79.

508. Windham, M.T. A mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp. / M.T. Windham, Y. Elad, R. Baker // Phytopathology. -1986.-Vol. 76.-P. 518-521.

509. Whipps, J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // Journal of Experimental Botany. 2001. - Vol. 52, N 90001. - P. 487-511.

510. Weidling, R. Trichoderma lignorum as a parasite of soil fungi I I Phytopath. -1932. Vol. 22, N 7. - P. 837-845.

511. Woo, S.L. Synergism between fungal enzymes and bacterial antibiotics may enhance biocontrol / S.L.Woo, V. Fogliano, F. Scala, M. Lorito // Antonie van Leeuwenhoek. 2002. - Vol. 81. - P. 353-356.

512. Wuest, P.J., L.A. Anton, and D.M. Beyer. Mushroom crop losses associated with Trichoderma green mold when compost was infested prior to casing and the casing was CAC'd or deep-scratched. Mushroom Green Mold Round Table. PSU. 1996. P.43.

513. Yamano, T. Trichoviridin, a new antibiotic / T. Yamano, S. Hemmi, I. Yamamoto, K. Tsubaki // Japanese Kokai. 1970. - Vol. 76. - P. 15435.

514. Yedidia, I. Induction of defence responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the control agent Trichoderma harzianum /1. Yedidia, N. Benhamou, I. Chet//Appl. Environ, Microbiol. 1999. - Vol. 65, N 3. - P. 1061-1070.

515. Yedidia, I. Effect of Trichoderma harzianum on microelement concentrations and increased growth of cucumber plants / I. Yedidia, A.K. Srivastva, Y. Kapulnik, I. Chet //Plant Soil. 2001. - Vol. 235. - P. 235-242.

516. Yedidia, I. Concomitant induction of systemic resistance to Pseudomonas syringae pv. lachrymans in cucumber by Trichoderma asperelum (T-203) and the accumulation of phytoalexins // Appl. Environ. Microbiol, (in the press).

517. Zerra, J. Variability in the production of volatile metabolites by Trichoderma viride / J. Zerra, G.A. Uegrone, M. Barbeni, P.A. Guarda // Ann. Microbiol. -1990. Vol. 40, N 2. - P. 171-176.

518. Zeilinger, S. Signal transduction by Tga3, a novel G protein {alpha} subunit of Trichoderma atroviride / S. Zeilinger, B. Reithner, V. Scala, I. Peissl, M. Lorito, R.L. Mach // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - Vol. 71. - P. 1591-1597.