Влияние Trichoderma почв Египта и Республики Татарстан на отдельные параметры живых систем

Атеф Абдельмохсен Абдельрахман Ахмед

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние Trichoderma почв Египта и Республики Татарстан на отдельные параметры живых систем
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние Trichoderma почв Египта и Республики Татарстан на отдельные параметры живых систем"

На правах рукописи А§дем/рл&ллА'Н'

АТЕФ АБДЕЛЬМОХСЕН АБДЕЛЬРАХМАН АХМЕД

ВЛИЯНИЕ ТЮСНОПЕША почв ЕГИПТА И РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН НА ОТДЕЛЬНЫЕ ПАРАМЕТРЫ ЖИВЫХ СИСТЕМ

03.01.04.-биохимия

- 8 ДЕК 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2011

005006605

Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кавдифовна

доктор биологических наук» профессор Багаева Татьяна Вадимовна,

доктор биологических наук, профессор Умаров Марат Мутагарович

Казанский институт биохимии и биофизики КИББНЦРАН

Защита диссертации состоится <<?2» декабре 2011 года в Д часов на заседании Диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, аудитория 211.

Факс 8(843)238-76-01,Е-таП: atefiiagi2000@yahoo.com,

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета

Автореферат разослан ноября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук — З.й Абрамова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Грибы рода Trichodcrma являются продуцентами метаболитов с высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Показана способность к выделению различных фнтогормонов, органических кислот, аминокислот, витаминов и свыше 100 антибиотиков (Benitez et al, 2004, 2008; Druzhinina et al,2011). Изоляты рода Trichoderma являются активными продуцентами гидролаз и способны к глубокой деструкции, как клеточных стенок растений, так и отдельных трудно расщепляемых растительных полисахаридов: целлюлозы, гемццеллюлозы, пектина до мономерных форм и других полимеров (Claus, 2004; Щппап et al, 2004; 2010; Harman, 2011).

Как известно, Trichoderma может продуцировать ряд микотоксцнов: харзианум Д, трихотецены, трихотоксины, триховиридин и виридин и др. (Uraguchi, Yamazaki, 1978; Anthony et al, 2009; 2010; Drizhimna et el., 2011). Выявлены виды Trichoderma, продущфующие токсичные метаболиты, приводящие к летальному исходу мышей (Anthony et al, 2010). С другой стороны выделены новые вещества - циклотетрапептид и триходермине А, продуцируемые Т.reesei обнаружили цитотоксическим эффектом против литот клеток человеческой меланомы A375-S2 (Sun et al, 2006).

Таким образом, в литературе по сельскохозяйственной и в меньшей степени медицинской биохимии накоплен обширный материал по влиянию метаболитов Trichoderma на микроорганизмы, растения, теплокровные организмы, возбудителей заболеваний, раковые клетки. Практически нет материала по влиянию на комплекс биохимических показателей на теплокровных животных.

По ГОСТу, принятому в России биопрепараты проверяются на онкогешгостц генотоксичность, вирулентность, фитопатогены, растения и целый ряд других биологических параметров.

Вследствие этого каждый биопрепарат должен проходить такую же длительную проверку экологической безопасности, как и химические препараты.

В последние 30 лет биопрепараты на основе Trichoderma являются одним из наиболее востребованных в Республике Татарстан. Однако спектр областей возможного применения метаболитов этого вида неуклонно расширяется и. это требует дополнительных исследований.

Цель работы: Оценка биобезопасности и биологической активности метаболитов грибов рода Trichoderma из почв Египта и РГ к растениям, микроорганизмам, клеткам и животным. Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать тип взаимодействия T. qspcrellum 551из РТ и Tharziamim 3 из Египта с микромицетами рода Fusarium, Aspergillus flaws, Aspergillus awamorl

2. Определить влияние мшфомицетов рода 'Гrichodema на таксинообразование Aspergillus/lavus.

3. Выявить эффективность действия фармацевтического фунгицида амфотерицина И метаболитов Trichoderma на некоторые физиологические параметры модельного bW#,Aspergttlm mcmiort.

4. Оценить влияние метаболитов Trtçhadema на жизнеспособность клеток линии HeLa.

5. Исследовать биохимические, гематологические, гистологические,

Иммунологические показатели мышей стока CD-I на фоне метаболитов

Trichoderma и индуктора опухолеобразованил пирена

6. Показать влияние метаболитов Trichoderma на рост и продуктивность

некоторых сортов кукурузы.

Научная новизна. Впервые проведено сравнение влияния метаболитов Trichoderma cfsperellum 551 и Trichoderma harziattum 3 на рост и продуктивность районированных сортов кукурузы РТ и Египта на различных типах почв.

Впервые показано, что метаболиты Trichoderma asperelhim 551 и Trichoderma harziattum 3 не обладают онкогенным действием и подавляют образование опухолей, индуцированных пиреном.

Метаболиты Trichoderma asperellum 551 и Trichoderma harzianum 3 оказывают антагонистическое действие на патогенные грибы и регулируют синтез охратоксина А и афлотоксина A. flavus.

Практическая значимость. Полученные результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и могут быть использованы для дальнейшей сертификации биопрепаратов на основе исследуемых штаммов T.asperelhim 551 на базе биозавода ООО НПИ Биопрепараты в РТ, а на основе T.harzianum 3 на биозаводе в Египте.

Разнонаправленное действие метаболитов Trichoderma на токсинообразование A. flavits указывает на необходимость введения нового пункта контроля биопрепаратов на основе микромицетов.

Результаты могут быть использованы в учебном процессе в рамках дисциплин «Биотехнология», «биологически активные вещества микробного происхождения».

Связь работы с научными программами в собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ "Выявление взаимосвязи сукцессий живых организмов и эволюционных изменений биосферы" раздел №1 Темплана КФУ на период с 1.01.2011 по 31.12.2013 г. Девиз - РНП-23,Гранты РФФИ 11-04-00805-а «Микробные сообщества почв древних ландшафтов лесостепи Поволжья» 2011 -2013,11 -04-01731-а «Влияние тяжелых металлов на экологическое состояние почв при синергетическом эффекте загрязнения антропогенных ландшафтов 2011-2012». Все эксперименты проводились в лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии, кафедры биохимии, биолого-цочвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета, Казань. Полевые испытания проводились на серой лесной почве Лаишевского района 2008 году и черноземе Черемшанского района в 2009 году РТ. Личное участие заключалось в разработке темы исследований, выборе объектов для изучения, проведении экспериментов, обработке полученных результатов, их анализ и интерпретация, подготовка статей к публикации (написание и редактирование), а также их обсуждение с рецензентами, Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора, М»сс - спектроскопию проводили в лаборатории к.ф.-м.н,я. Волошина А.В., отдела аналитической спектроскопии Федерального центра коллективного пользования физика - химических

исследований веществ и материалов Приволжского федерального округа. Получены положительные отзывы от предприятий по предварительным опытам использования опытных партий биопрепаратов на основе штаммов Trichoderma в сельскохозяйственной биотехнологии РТ. Положения« выносимы© на защиту,

1. Метаболиты грибов рода Trichoderma, выделенные из почв Египта и РТ, оказывают разнонаправленное действие на выработку охратоксина А н афлатоксинаВ1 патогеном A. flaws в зависимости от вида микромицета

2. Метаболиты T.asperellum 551 ингибируют индуцированное пцреном образование опухолей в печени и коже у мышей и оказывают цитотоксическое действие на клетки HeLa в опытах in vitro.

3. Наибольшую антагонистическую активность в отношении фитопатогена рода Fusarium oxysporum оказывает миромицет, выделенный из почв Республики Татарстан

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

1. «Становление и достижения биохимической школы казанского университета» (Казань, КФУ, ноябрь 2009),

2. «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, МГУ, декабрь 2009),

3. Ежегодная конференция Казанского федерального университета (Казань, КФУ, февраль 2010),

4. «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», I научно-практическая интернет-конференция (ноябрь 2010),

5. Ежегодная конференция Казанского федерального университета (Казань, КФУ, февраль 2011),

6. «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», П научно-практическая интернет-конференция (Казань, КФУ, ноябрь 2011),

7. «Международная конференция» по вопросам сельского хозяйства и ирригации я странах бассейна Нила», (факультет сельского хозяйства, Университет Минья, г.Эль-Минья, Египет, 26-29 марта, 2012).

Публикации. По данной теме опубликовано 8 работ в сборниках международных и всероссийских конференций, опубликованы 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Основное содержание работы изложено на 167 страницах машинописного текста, диссертация иллюстрирована 11 таблицами, 62 рисунком. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 50 отечественных и 202 зарубежных публикаций.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 1.1.Биологические образцы.

1,11,Использованные микроорганизмы. Trichoderma aspercllum 551, выделенный из почв Республики Татарстан, Trichoderma harzianum 3, выделенный из почв Египта, Aspergillus awamori 66 А, предоставленный лабораторией Эдинбургского университета, Aspergillus flavus, предоставленный музеем кафедры микробиологии МГУ, Fusarium oxysporu, выделенный из семян кукурузы и почв

РТ. Промышленный биопрепарат «Мизорин», созданный на основе бактерий рода Bacillus, был получен от ООО «НПИ «Биопрепараты», Казань, Россия.

1.1.2.Клетки HeLa. 1*105 клеток/мл поддерживались на минимальной среде (MEM), при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО*

1.1.3.Подопытные животные. Взрослые самцы белых мышей стока CD-I с массой тела 21 г (Питомник лабораторных животных «Пущино» ФИБХ РАН).

1.1.4.Семена кукурузы. 8 сортов семян отечественной кукурузы (Россия): Краснодарский 2007, Краснодарский 2008, Поволжский, Росс 145, Российская-1, Россбелая-1, Молдавский 218 н 1 сорт зарубежной - Gizabaladi (Египет).

1.2.Методы исследования.

1.2.1.Морфолого-кулътуральные свойства изучали на картофельно-глюкозном агаре (КГА), на среде Чапека-Докса с низким содержанием сахарозы, на специальном питательном агаре (SNA) (по Samuels et al-, 1998). Для выращивания использовали как авизованные, так и жидкие среды,

1.2.2,Размеры объектов замеряли с помощыо окуляр-микрометра, так же с помощью программы Paint.

1.2.3Антагонистическую активность и конкурентоспособность изолятов Trichoderma определяли методом встречных культур на средах Чапека и КГА (Семонян и Мамиконян, 1982).

1.2.4. Определение катаназной, протеазной и целлюлозной активностей изолятов Trichoderma проводили по методу окрашивания редуцирующих Сахаров (Konig, 2002).

1.2.5. Определение фитотоксичности культуральной жидкости проводили на 8 сортах кукурузы (Samuels, 1999).

1.2.6. Полевые опыты, по оценке влияния исследуемых биопрепаратов, произведённых на основе штаммов Г.551 и Т.3 и промышленного биофунгицида Мизорин, проводили на серой лесной почве Ланшевского района и черноземе Черемшанского района РТ.

1.2.7. ИФА методом осуществлялась оценка влияния действия метаболитов Т. 551 и Т.Ъ на выработку афлатоксина В1 и охратоксина А, которые синтезируются токсинобразующим микромицетом Aspergillus flavus. Оптическую плотность измеряли при 450 нм на спектрофотометре.

1.2.8.Воздействие амфотсрщипа на клеточный ответ A. awamori оценивали после культивирования A. awamori при 30°С в жидкой среде Фогеля с добавлением сахарозы (среда ВС) и на плотной среде (2% агар) того же состава, обогащенной глюкозой (среда ОСГ) (Nelson et al, ¿004).

1.2.9.Цитотоксическую активность метаболитов Trichoderma оценивали in vitro на клетках линии HeLa. Проводилось совместное культивирование в течение 30 и 60 мин при 37°С. После инкубации клетки окрашивали трипановым синим. Жизнеспособность клеток HeLa рассчитывали в процентах жиэых клеток по отношению к общему числу.

1.2.10. Количественное определение элементарного состава в клетках и культуральной жидкости микромицетов проводили в соответствии со стандартами РФ согласно методическим указаниям (МУК 4.1.1483-03). Измерения осуществляли на масс-спектрометре Elan DRC Ц (PerkinElmer), образцы предварительно подвергали микроволновой подготовке и системе MWS-3

(Berghof) при температуре 150°С, в присутствие азотной кислоты (1мл) и бидистиллировакной воды (4 мл),

12. II. Определение онкогенности метаболитов Trichoderma in vivo проводили нд фоне стимуляции опухолеобрззоэания пиреном по комплексу: гематологических, гистологических, иммунологических и биохимических показателей. Животные содержалась согласно международным этическим нормам. Животные получали воду и корм ad libitum. Макрогруппа ад 25 мышей была разделена на 5 групп, которым вводили культуральную жидкость Т- щкгеПит (1.25мл / 100 г рее тела) и пирен (5мг / 100 г вес тела). В контрольной группе мышей инъецировали внутрибрющинно каждые 24 ч в течение 14 сут стерильной водой для инъекций. Мышам второй группы сначала вводили каждые 24 ч в течение 7 сут культуральную жидкость Trichoderma, затем каждые 24 ч в течение 7 сут пирен. Третей группе сначала каждые 24 часа в течение 7 суток вводили пирен, затем каждые 24 часа в течение следующих 7 суток - культуральную жидкость. Четвертая группа была подвергнута действию лирена в течение 7 суток. И пятую группу инъецировали только культуральной жидкостью в течение 7 суток. Общий вес мышей определяли в течение 14" дней ежедневным взвешиванием до принятия пищи, После окончания эксперимента определяли вес отдельных органов мышей (печени, почек, селезёнки, яичек). Затем определяли отношение массы органов к общей массе мышей.

1.2.12-Гематологическое исследование проводит методом подсчета количества красных кровяных телец, уровня гемоглобина, гематокрнт (объём форменных элементов крови), среднего объёма эритроцита (MCV), гемоглобина (МСН) и гемоглобина в эритроците (МСНС), используя ЭДТА-содержащне пробирки. Подсчёт красных кроэяных телец осуществляли с помощью камеры Горяева в физиологическом растворе (0,9% NaCl) (Dacie., Lewis, 1991), Процент гемоглобина определяли в соответствии с рекомендациями Международного Комитета Стандартизации в Гематологии (ICSH.1967), используя коммерческий набор Randox Company (Великобритания). Гематокрит определяли центрифугированием клеток в гепаринизированных гематокритных пробирках (капиллярные пробирки с внутренним диаметром ) мм и 7,5см длиной) в течение 5 минут 150Q0rpm (Dacie, Lewis, 1991). MCV, МСН и МСНС рассчитывались, исходя из формул:

MCV(FQ* Hct(mM) xlO

k ; RBCs (million/ml)

MCH(pg) =

^ RBCs (million/ml)

где F1 - фешолитр = 10'15, Pg - пикограмм = 10'",

1.2. 1 ¿.Иммунологическое исследование проводили методом подсчета белых кровяных телец с помощью камеры Горяева, используя специальный раствор Тюрка, а также дифференциальный подсчёт лейкоцитов, число которых рассчитывали согласно рекомендациям Dacie и Lewis (Dacie, Lewis, 1991).

1.2.14 Qijcima биохимических показателей включала в себя тест на функционирование: печени (активность трансаминаэы и кол-во общего

билирубина) и почек (содержание мочевины и креатининз)- Активность аланинаминотрансферазы сьшоротки крови мышей определяли согласно методике (Reitman, Frankel 1957). Сыворотка крови была получена на 14 день эксперимента перед эвтаназией мышей. Для определения активности использовали коммерческий набор BioMerieux Chemical Company (Франция), Калибровочная кривая была построена по аланину.

Активность сывороточной аспартатаминотрансферазы измеряли аналогично аланинаминотраисферазе, используя коммерческий набор Randox Company (Великобритания). Концентрации общего билирубина определяли, используя коммерческий набор BioMerieux Chemical Company (Франция). Количество общего билирубина определялось в реакции конъюгации с диазотированной сульфаниловой кислотой в присутствии кофеина (Tietz, 1983). Концентрация мочевины в сыворотке крови мышей определяли по реакции с мочевиноглутаматдегидрогеназой по методике Eisenweiner, 1976. Содержание общего креатинина измеряли в реакции с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием окрашенного комплекса, поглощаюшего при длине 510нм (Barties et al., 1972; Larsen, 1972). Ткани фиксировали в растворе формалииа и метанола, обезвоживали и пропитывали парафином. Из парафиновых блоков делали срезы толщиной 4-6 мкм.

1.2.15. Гистологические препараты готовили по стандартной схеме. Готовили парафиновые блоки, затем срезы толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином-эозином. Срезы заключали в полистирол,

1.2.16. Определение элсктрокинептческого потенциала конидий антагониста и фитопатогенов измеряли на анализаторе Zeta Sizer.

1.2.17. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программы SPSS 17. Все эксперименты обрабатывались по методу F-теста Фишера с коэффициентом значимости р = 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

С учетом того, что используемые в практике биопрепараты должны соответствовать Гесту России и проверяться на различных системах живых организмов, нами было проведёно исследование влияния метаболитов плесневых грибов рода Trichoderma на микроорганизмы, теплокровные животные, растения, клетки Heal и на онкогенность,

2.1Антибиотическая активность грибов рода Trichoderma к фитопатогенрм растений и почве в опытах in vitro.

2.1.1 .Влияние гибов рода Trichoderma на рост фитопатогенных микромицетов Fusarium oxysportim и Asperegithisflavus,

Проводилось исследование влияния T.asperellum 551 № фитопатоген F.oxysporum и токсинобразукэдий патоген Aflcwus в соотношении конидий антагонист: фитопатоген Iii, j ;2 и 1:3. Наибольшая антагонистическая активность выявлена при соотношении конидий 1:З.Удальная скорость роста. T.asperetlum 551 в течение первых 24 часов резко возрастала и ингибировала рост Eoxysporum (А) и A.flavus (В) (pi0,05) (рисунок S)

Рис. 1. Изменение удельной скорости роста T.aspcrdhmi 551 при совместим культивировании с F.oxysporum (А) и с A.flavus (Б) на плотной среде КГ А Цифрами указано соотношение количества конидий аитогонист : фигопатоген (1:3) Сплошной линией обозначена уд.скорость роста, штрихом - log численности.

По типу антагонизма взаимоотношения T.asperellum с F.oxysporum можно отнести к паразитизму - Е типа, т.к. наблюдалось нарастание колонии антагониста на колонию фитопатогена, а в случае с Aspergillus - паразитизм В-типа - остановка роста при взаимодействии антогониста и патогена.

Во всех случаях нами отмечено увеличение размера конидий антагониста при контакте с фитопатогеном, Наибольшее увеличение размера конидий отмечено при контакте с F.oxysporum (рис-2А). Ранее отмечалось, что увеличение размера конидий грибов рода Trichoderma происходит только под влиянием комплекса внешних факторов (Алимова,2006).

Q.S О

Г, *ip«f#iJwm контроль • Q Т^р^аШнп 3 — ir- f!,pHY»POrWW *окгроп* ■ »«J'— f.Dnytpamm 1

s '

a s о

5 ^

S 3

• +» f.WliNtlkir" HMWk

A-ftfHft кскгро/* -p—A-H**« I

Время,4

551

Рис.2, Диндмика изменения размера спор T.asperellum 551 ври оовиесгиом культивировании е F.oxyspoivm (Д) и с A.flavus (Б) на плотной среде КГА Цифрами указана соотношение количества конидий Trichoderma с опытными микромшдетами (1:3),

2.1.2.Влияние грибов рода TricJioderma на выработку афлатокснна В1 н охратоксина А, грибами рода Aflavus.

Нами выявлена способность исследуемых видов Aflayus к образованию афлатоксвда и охратоксина А. При взаимодействии Т. asperellum 551 и Т. harzianum 3 с Л. flavus, отмечено увеличение синтеза охратоксина А (рисунок ЗА), что указывает на фунгистзтическое действие антагониста, приводящее к угнетению роста A.flavus.

Наблюдаемый эффект можно объяснить тем, что присутствие антагонистов в среде усиливает "агрессивное" поведение A, flavus и вызывает продукцию

вторичных метаболитов с антибиотической активностью и оказывает ингибирующее действие на рост и развитие других микроорганизмов на уровне транскрипции генов, созревании белка или разрушении структуры клетки, например, клеточной стенки. Возможно, увеличение выработки охратоксина А также связано со стрессовыми условиями для данного патогена. Предыдущие результаты показали, что грибы рода Trichoderm ингибируют рост A. flavus, поэтому в условиях конкуреншш и в присутствии комплекса литических ферментов Trlchoderma может происходить, запуск данных биохимических реакций, приводящих к выработке охратоксина А.

В следующей серии экспериментов нами было изучено влияние исследуемых штаммов Triahoderma на синтез афлатоксина В1 (рисунок ЗБ) микромицетом А. flavus. Культивирование A. flavus с Т. harzianum3 приводило к увеличению продукции афлатоксина В1, как и в случае выработки охратоксина А. При совместном культивировании Т- asperellum 551 и A, flavus афлатоксин не

синтезировался, что вероятно указывает на фунгицидное действие антагониста,

_ «

х » 6

§ 30 л

t* £

X JO

A. ffcty* T. MP«r«Ri«n » A, f[*vu» T. harxianum *-A. fl*VU4

Рио. 3. Влияние Т. harzlanum 3 и Т.asperellum 551 на выработку охратоксина А (А) и афлатоксин« BJ (Б) микромидетом Л,flaws при совместном культивировании на среде Чацека В опытах in vitro.

Таким образом, обработка фитопатогена отдельными штаммами Trichodentia может быть использована для подавления токсинообразования плесневыми грибами при контаминации растительного материала грибами. Штаммы, приводящие к увеличению токсянообразования, могут быть использованы, как биосенсоры, определяющие наличие следовых количеств токсинов.

2.1Л.Влияние Trichoderma на микромицетн рода A.awamari.

Взаимодействие Trichoderma с микромицетами рода Aawamori рассматривалось нами, как модель влияния метаболитов антагониста на возбудителей микозов у теплокровных животных, на плесневение семян и почвоутомление. В качестве альтернативного препарата медицинского и ветеринарного назначения рассматривался амфотерицин, аналог некоторых фунгицидов, используемых и в почвенной биотехнологии.

В случае ингибироввюде роста A.awamori наибольшая удедьная скорость роста антагониста отмечена только на 48 час роста, что указывает, вероятно, на интенсивное токсинообрачов&ние и высокую антагонистичеркую активно« ь Т.asperellum 55).Нами бьщо доказано что, T.asperellum 551 подавляло рост Л.

сматон возможно это обусловлено проявлением антибиотической активности исследуемого изолята ТпсЪоЛегт. При совместном культивировании удельная скорость роста Т.аэрегеПит возрастала на 70 % по сравнению с контролем (рисунок 4А). При этом удельная скорость роста А. аттоп снижалась на 60 % (с 0.01 до 0.009 в соотношение 3:1). Радиус конвдий возбудителей микозов зависел также от концентрации метаболитов антагониста в культуральной жидкости. С увеличением соотношения антагонист - патоген с 1:1 до 1:2 и 1:3 размер крнндий патогена уменьшился на 40% (с 2 до1.2 см), что указывало на фунпщидный эффект воздействия антагониста, Также, нами отмечено увеличение размера конидий антагониста при контакте с А. сматоп (рисунок 4Б).

Рис. 4, Изменение удеяыюй скорости роста T.aspmlhtm 551 (А) и размера скор (Б) вря совместном культивировании с A.avamori на плотной сред» КГА. Цифрами^ указано соотношение количества конидий Trtehoderma о опытными микромицегвми (1:3). Сплошной линией обозначена уд.скорость роста, штрихом - log численности,

Таким образом, наибольший антагонистический эффект Trkhoderma проявлялся при соотношении конидий T.asperelhm 551 и A, awamori 3;! соответственно. В связи с этим представляло интерес изучить влияние промышленного аналога - антибиотика микробного происхождения амфотеридан» с фунгицидным типом действия на рост и развитие A. awamori. Эта модель может быть также использована также для изучения действия фунгицидов т опасные плесневые грибы рода Aspergillus niger, которые в лабораторных опытах, как правило, заменяются безопасным видом А. av/ЩюН-

Было установлено, что на протяжении б часовой инкубации в среде с амфотерицином (опыт) изменение размера спор зависело от концентрации фунгицида. В отличие от контроля (среда без фунгицида) амфотерццин й дозах 2,5 и 5.0 мкМ через 2 ч инкубации стимулировал увеличений диаметра спор на 40% и 20% соответственно. Вместе с тем более высокое содержание фунгицида в среде (10, 2Q мкМ) подавляло процесс набухания спор (рисунок 5), Таким образом» найдена пороговая концентрация фунгицида, которая вызывает набухание конвдий. Дальнейшее увеличение концентрации снижает реакцию до его полного отсутствия.

Рис.5, Динамика изменения размера спор A. av/amori при инкубации в среде Вогепя, содержащей разные концентрации амфотерицина, К - вреда без фунгицид»; ОП- варианты опыта е фунгицидом в дозах 20. 10, 5.0, 2.5 мкМ, соответственно, (Ä), (Б), (В), (Г). Наиболее четко ивгабврующрй эффект амфотерицина в дозе 20 мкМ был выражен через 2 ч инкубации, который составлял 91,5% от контроля, принятого за 100%. К концу периода исследования (б ч) эффект ингабировадая нивелировал. При инкубации спор в среде с амфотерицияом в дозе 10 мкМ шгибирукщее действие фунгицида сохранялось до конца эксперимента,

Сравнительный анализ действия амфотерицина и Trichoderma на изменение скорости роста и размер спор A. awamori показали что, под влиянием Trichoderma удельная скорость роста A. awamori уменьшилась с 0.02 до -0,01 и размер спор уменьшился на 60 % по сравнению с контролем, С другой стороны под влиянием амфотерицина удельная скорость роста снизилась с 0.01 до -0.0 и размер спор уменьшился на 40 % по сравнению с контролем. На оснований наших экспериментов, можно рассматривать метаболиты Trichoderma, как фунгициднае средство против A. awamori, не уступающее по отдельным параметрам фунгициду - амфотерицин. Возможна экстраполяция данных эксперимент? по влиянию МЕТАБОЛИТОВ Trichoderma, как фунгицидного средства против А■ awamori, как модель для изучения влияния пестицидов для контроля содержания в почве токсинобразующих грибов Aspergillus niger, Таким образом, использование метаболитов Trichoderma можно рассматривать, как эффективную альтернативу амфотерицина, как фунгицида медицинского назначения, WW лечения микозов, и также пестицидов для контроля токсинообразуюодей плесени в почве. Таким образом, ингибирующее действие метаболитов антагониста на набухание конидий, возбудителей микозов в соотношении ЗЦсопоставимо с концентрацией фунгицида амфотерицина 10,20 мкМ.

2.2. Изучение электрокинетического потенциала конидий микромицетоа Trichoderma, Fusarium, Aspergillus.

Различные штаммы Trichoderma имеют разную активность по отношению к патогенным грибам; их взаимное влияние друг на друга может варьировать. Поэтому одним из перспективных аспектов биологии является изучение механизмов, участвующих в подавлении заболеваний биоконтрольными агентами. Возможные механизмы антагонизма видов Trichoderma включают такие процессы как конкуренция за питательный субстрат и экологическую нишу, антибиоз за счет выделения летучих компонентов и нелетучих антибиотиков (Haraifin, Hadar, 1983; Dennis, Webster, 1971), которые ингибируют развитие ряда почвенных грибов, а также паразитизм (Dennis, Webster, 1971а), Нами сделано предположение, что одним из возможных механизмов антагонизма является изменении электрокинетического потенциала поверхностных структур конидий.

Электрокинетический потенциал или поверхностный заряд является важной характеристикой живой клетки, которая часто определяет способность клетки взаимодействовать с веществами разной природы и другими клетками, В связи с этим предложено определять заряд клеток Т. asperelhm 551 и Т. harzkwwn 3, культивируемых на средах Чапек» и КГ А. Как видно из данных таблицы 1, разные виды грибов рода Trichoderma отличаются по уровню электрокинетическош потенциала. При этом уровень электрокинетического потенциала не зависел от среды культивирования, а только от вида Trichoderma (таблица 1).

Таблица 1

Род электрокинетический потенциала (мВ) Среда

Т. asperelhm 551 - 40.80 ЮГА

Т. aspereüum 551 - 38.80 Чапека

Т. harzianum 3 -60.00 ЮГА

Т. harzianum 3 - 55.30 Чапека

2.2.1, Изучение поверхностного заряда спор при взаимодействии различных видов Trichoderma с фитопатогенями.

Было протестировано изменение поверхностного заряда спор при взаимодействии культур фитопатогенных микромицетов и их антагонистов методом динамического светорассеяния. В качестве фитопатогенов рассмотрены грибы Fusarium oxysporum, Aspergillus awamori и Aspergillus flftvus. В наших экспериментах отбирались споры антагонистов Т. aspercllum 551 и Tr harzianum 3 после совместного культивирования с фитопатогеном в зоне непосредственной близости к колониям. Изменение поверхностного заряда спор регистрировали на анализаторе Zeta Sizer (Malvern), было показано достоверное изменение поверхностного заряда спор как у T.harzianum при совместном культивировании их с F. weysporum и A. flavus, так и у фитопатогенов, причем клетки после взаимодействия приобретали положительный суммарный заряд.

Аналогичная тенденция к изменению поверхностного заряда спор отмечена и у T.asperelfum при культивировании а патогенными грибами рода А, Длад н Л Awamori. Однако T.asperellum вызывает в большей степени изменения! поверхностного заряда, чем Т. harzianum. Поверхностный заряд спор грибов

зависит от химической структуру и состава их клеточной стенки, По видимому стрессовые воздействия, к которым относится антагонизм, способствуют изменению метаболической активности грибов и состояния и возможно состава их клеточной стенки. Однако этот вывод является нашим предположением, и требует дополнительных подтверждений. Тем не менее, тарученные результаты позволяют нам утверждать, что метод динамического светорассеяния является перспективным методом изучения клеточной стенки грибов и влияния на ее свойства различных факторов среды, в том числе негативного влияния культур друг на друга (таблица 2).

Изменение поверхностного заряда спор

Таблица 2.

При взаимодействии культур

Род электрокннетичсскгнн потенциала (мВ)

опыт контроль

1. Т. asperellum 551 F.oxysporum -36.66 -40.80

Ал Awafnori -31.16

A. flavtis -36.66

2. TJtqrzlanum 3 F.oxysporum -44.83 -60.00

A. fnvamori - 52.10

A.flavus - 44.86

3. F.oxysporum T.asperellum 551 - *43.Q0 -35.83

T. barzianum3 - 29.63

4. A.awamori T.asperellum 551 -38.36 -50.26

T. harzianum3 -42.20

5. A, flavus t.asperellum 551 - *41.10 -32.75

T. fiarzianum3 -27.70

Таким образом, показано, что изучение поверхностного заряда спор грибов методом динамического светорассеяния является дополнительным и перспективным способом изучения антагонистических отношений.

2.3.Влиянне T.asperellum и Т. harzianum на опухолевые «легки HeLa.

В наших экспериментах различные разведения культурадьного фильтрата грибов ТмзрегсЧит и Г. harzianum приводили к уменьшению числа жизнеспособных клеток HeLa, через 30 и 60 минут (рисунок б). Повышение концентрации культуральноЙ жидкости антагониста и времени контакта с 30 мин до 60 мин снижает численность жизнеспособных клеток HeLa. Максимальный цитотоксический эффект (50 %) да» T.asperellum 551 отмечен при 40% концентрации метаболитов через 60 минут инкубации (30°С).

1в

Í 79

1 W

5 м

V (О

I 39

X »

I»

КомцвНфацИИ ьультуральноЯ ж|едноеш Т. *sp«retlum %

U JO 40 50 рО

КоищиТ3^»1 нулмурарьноЯ жидкрсгч Г. hactlmm %

Рис. б. Влияние концентрации метаболитов T.asperellm 551 (А) и Т.ЫШащт 3 (Б) на клетки HeLa (в % живых клеток),

Микромицет T.harzianum 3 обладал менее выраженным цнтотоксическнм эффектом в отношении клеток HeLa Максимальное (LDso) на клетках HeLa регистрируется при экспозиции 60 мин и концентрации метаболитов 50%. Таким образом, T.asperelhim 551 обладает, более выраженным цитртоксическим эффектом по отношению к клетка HeLa, чем T.harzianum 3,

2.4.Влияние культуральиой жидкости Trichoderma и пирена иа гематологические, гистологические, иммунологические и биохимические показатели мышей CD-I.

Обязательным пунктом исследования биопрепаратов является определение на онкогенность, Как средство оценки статусу здоровья животных, WHO (1963) рекомендовано изучение гематологических параметров, играющих жизненно важную роль в физиологическом и патологическом состоянии организма.

В связи с этим нами изучались гематологические, биохимические иммунологические и гистологические показатели мышей при воздействии на них метаболитами Trichoderma, а также индуктора опухолей вещества химической природы - пирена Нами было показано, что пирен способствовал достоверному (Р<0,05) уменьшению количества эритроцитов в крови опытных мышей по сравнению с контролем (рисунок 7А). Данный факт свидетельствует о возможном разрушении эритроцитов. Обработка мышей культуральиой жидкостью до иди после пирена нивелировала действие последнего.

Нами в опытах in vivo на мышах CD-I была показано влияние культуральиой ¡жидкости гриба Т. aspereUmt на содержание гемоглобина и гематокрита, которые являются показателем гематологического статуса организма На рисунке 7Б показано, что пирен достоверно (Р<О,05) повышает уровень гемоглобина мышей относительно контроля. Влияние культуральиой жидкости Trichoderma близко к контрольному значению, Важно отметить, что предварительная обработка культуральиой жидкостью приводит к снижению действия пирена на уровень гемоглобина относительна контроля, т.е. нивелирование проявления онкогенности.

а. *

12 s 3«

3 o.s * о

гЬ

гЬ rh гЬ

2.»

J 12 R S

I 4

u 2

1+1

Конгроль ИЖ + Пмр«н

Пир«н +

КЖ

з. i.5 х

е t

| «'5 О

Л*М|| Группы мыщей В

rf"1

Кодарода К1*+ Пирен+ Пире« ПИР» КЖ Группы мышей

КЖ

Г-Ь

НентроАЬ КЖ+ Пирем Лирен НЖ

Пир*м

Группы мышей

Рис.7. Влияние метаболитов Т. asperellum 551 на количество красных клеток (А), содержание гемоглобина (Б) и гемйтокрит (В) в крови мыдаей.

Далее приведены данные, указывающие на то, что все значения гематокрита мышей после инъецирования их исследуемыми веществами ниже контрольных значений ( рис,7В). Но при предобработке мышей метаболитами Trichoderma до введения им пирена также происходит снижение гематокрита относительно контрольных значений, Отмечено, что проявляется противоположный эффект между уровнем гемоглобина и гематокритом в действии пирена,

Было протестировано действие пирена и метаболитов Т. asperellum на основные показатели функционирования печени, а именно, активность аспартатаминотрансферазы (Рис, 8А) и аланинтрансаминазы (Рис- 8Б), а также концентрацию билирубина (Рис- 8В) в сыворотке крови. Обнаружили, что инъецирование мышей культуральным фильтратом микромицета Т. asperellum 551 во всех случаях не приводило к каким-либо отличиям относительно контролем. Продолжительное инъецирование пиреном вызывало достоверном (р<0,03) увеличению активности данных трансаминаз, а также концентрации билирубина, что свидетельствует об интоксикации организма. Следует отметить, что инъецирование мышей метаболитами Т. asperellum 551 в целом оказывает положительное влияние. Отмечена тенденция к улучшению состояния мышей при инъекции фильтрата Т. asperellum 551 до обработки пиреном, по сравнению С вариантом иньеиирования мышей метаболитами КЖ после введения им пирена, что является, по всей видимости! показателем защитных функций метаболитов Т. asperellum 551, предотвращающих действие пирена эффективнее, чем после действия самого пирена.

г £ I

К rt> x S x га

KpHTpO/w КЖ * Пирен

Пирен+ Пирен КЖ

Группы мыш^й

i I

КОНТ&ОА* НЖ +

ПНРРИ

Группы мышей

4,3

Рис.8, Влияние метаболитов Т. aspenlhm на основные показатели функционирования шгчеци. (А) адшшн транеамщшы, (Б) аснартат «шгоо трансферазы, (В) общий билирубин.

Коьтрс/t» КЖ+ Пирен+ Пирен Пирен «Ж

Группы мышей

Уровень креатинина в сыворотке крови помогает оценить функционирование печени во время протекания болезни, в то время как мочевина -функционирование почек (Tambuwal et al., 2002).

На рис. 7 представлено влияние метаболитов 'Г, asperellum 551 на функцию почек, концентрацию мочевины (Рис. 9А) и креатинина (Рис, 9Б) в сыворотке крови. Наблюдается достоверное (р<0,05) увеличение концентрации мочевины при обработке пиреном, что указывает на дисфункцию почек, которая при инъекциях метаболитами гриба Т. asperelhim 551 восстанавливается. В случае с креатинином достоверных различий при обработке пиреном или метаболитами по сравнению с контролем не было обнаружено.

0.9

Б г

70 •

а! 50 ■

40 -

8 30 ■

S ?l> •

го ■

0 -

0.9

0.8

X 0.7

S 0,6

I т 0.S

X г 0.4

0.1

§ о.г

0.1

0.45

0.7

КОНПЗР/А И>* + Пирен

Лкрен *■ КЖ

Пире» КЖ

КомгрОЛ» КЖ * Пив«« Группы мышей

Пирен+ Пирен Ш

КЖ

Группы мышей

Рис.9, Влшдаие метаболитов Т. азрегейыт на основные показатели функционировании почек (А- моченищ, Б-креатинвд).

В литературе мало данных относительно иммунных механизмов, запускаемых биоконтрольными агентами после взаимодействия с компонентами врождённого и адаптивного иммунного ответов. Как представлено на рис. 10, пирен способствовал увеличению лейкоцитов по сравнению с контролем Это значит, что пирен индуцирует иммунный ответ. Из данных также видно, что

инъецирование мышей культуральной жидкостью до и (или) после введения пирена ослабляло действие пирена.

5 2,5

* 1.5 3 £ 1 =Г

? 0.5

? о

1.5

Контроль

КЖ + Пирен

Пирен+ кж

Пирен

КЖ

Группы мышей

Рис.10. Влияние метаболитов Г. аярегеИшп н« общее количество лейкоцитов в крори мышей.

Инъецирование мышей культуральной жидкостью и пиреном показали различные эффекты на различные клетки иммунной системы, Обработка мышей пиреном достоверно (р<0,05) увеличила процент лимфоцитов, базофилов и эозинофилов и уменьшила процент нейтрофилов в сравнений с контролем (рисунок 11) , Следовательно, пирен провоцирует иммунный ответ. Это происходит, потому что пирен имеет различное действие на каждый тип клеток иммунной системы, После инъецированной культуральной жидкостью, происходит уменьшение процента моноцитов и нейтрофилов в сравнении с контролем (рисунок 11). Это доказывает, что метаболиты ТпсЬос1етш ингибируют

2 78

§•77 5 75

1+ +1 во А + +

Контроль КЖ Пирен + Пируй Пире« КЖ

Группы мышей

0.7 0.6 ж о.5 I 0.4

Я 03

1л 0.2 0.1

гЬ

Котроль КЖ+ Пирен + Пирен КЖ

Пиреи КЖ

Группы мышей

КЖ+ ПИр*н+ Пиреи КЖ

П^рем КЖ

Группы мьццей

гЕп * О 3.6 •

76 о 2 3.1 ■

КЖ 3.2

[+1

»■9

3.«

гЬ

Контроль

КЖ + Пирен

Группы мышей

Пир*н + КЖ

га

I—|

Пирен КЖ

ни Г-*-.

13 11 14 10

КЖ + Пнрск + Пирен КЖ Пирен КЖ

Группы ммшеЯ

рис. 11. Влияние метаболитов Г. азрегеИит на разные типы лейкоциты крори дашгей, (А) на лимфодиты%. (В) на моноциты % (В) на базофилы %. (Г) т яейтрофили %. (Д) ад

эозщофилы %,

На следующем этапе работы мы наблюдали влияние метаболитов Т аэрегеНыт 551 на гистопатологию печени и кожи. Показано влияние метаболитов и пирена на ткани печени. Введение пирена вызывало дистрофию и некроз (в ответ на интоксикацию), а введение метаболитов после обработки пиреном тормозило развитие некротических и дистрофических процессов. Это означает, что культуральная жидкость предотвращает развитие данных процессов.

(А) (Б)

Рис. 12.Влияние метаболитов Т. азрегеНит и пирена (А) инъекция пирена, (Б) инъекция культуральной жидкости после пирена.

Контроль Цирен

Пира« + Т. сярегеИит Т.ахрегЫЫт + Пирам

Рис. 13.Влияние метаболитов Т. а.чрегеНит на гистопатологию кожи.1- роговой слой Ь 2-волосяные фолликулы.

На рис. 14 среза печени контрольной (интактной) мыши хорошо видна дольчатая структура органа, гепатоциты имеют неправильную многоугольную форму. Однако воздействие метаболитов приводит к формированию баночной формы клеток, что также свидетельствует о восстановлении ткани. Гепатоциты располагаются друг к другу рядом, образуя при этом печеночные балки или так называемые трабекулы. Клетки и печеночные балки ровные, симметричны

относительно кровеносных капилляров. Щелеаидные пространства равномерные, хорошо просматриваются.

Через 7 дней после воздействия гепатоксина можно отметить, что баночное строение печеночной ткани слабо выражено, обнаружены полностью разрушенные участки. Гепатоциты отличаются небольшими размерами ядер и цитоплазмы. Большая часть цитоплазмы светло окрашена, мелкая, частично - угловатой формы, обеднена хроматином. Ядра мелкие, плохо обозначены, располагаются эксцентрично (по периферии), мелкие ядрышки. Отмечено небольшое содержание двухъядерныхгепатоцитов (22,20%). Клетки ретикулоэндотелия малочисленны и имеют мелкие ядра. Также в сосудистой системе выявлены признаки застойной венозной гиперемии, которая проявляется расширением и полнокровием синусоидальных капилляров (преимущественно вокруг центральных вен).

Рис.14- Влияние метаболитов Т. аарегеНит на гистопатологию печени.

В печени мышей, получавшей жидкий препарат Т.аьрегеНит, сохранено баночное строение. Гепатоциты, формирующие печеночные балки, различаются по объему и форме, Гепатоциты среднего размера нмеют круглоовальную форму с умеренным количеством хроматина, с одним, реже двумя мелкими ядрышками близи кариолемы. Большинство - двухядерные метатические активированные клетки (-30,22 %).

Таким образом, при применении жидкого препарата ТпсУюдегта в течение 7 дней после воздействия гепатоксина выявлена тенденция к восстановлению печеночной ткани: дольчатая структура органа восстанавливается; вокруг кровеносных сосудов заметны обширные участки пролиферирующих ярко окрашенных гепатоцитов, имеющих более плотную структуру.

Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили экологическую безопасность и перспективность интродукции биопрепаратов на основе штаммов супрессоров рода ТгкЫн1ета для повышения урожайности кукурузы.

Метаболиты Trwhoderma ингибируют жизнеспособность раковых клеток, многих 1 итопатогенных грибов и способствует снижению действия пирена на организм ышей, проявляя иммуномодулирующую активность. Таким образом, показана гимулирующая активность метаболитов по отношению к растениям, п-ибиотическая к фитопатогенным грибам, цитотоксичность к опухолевым леткам, иммуностимулирующее и регенерирующее действие на организм мышей >сле интоксикации. Однако требуется дополнительные исследования, зобходимые для проверки биологической активности, различных потенциальных еханизмов воздействия и снижения затрат данного подхода,

2.5.Влияние метаболитов на растения в опытах in vitro и in vim 2.5.1,Влияние метаболитов на растения в опытах in vitn> мтотоксичность) Т. asperellum, Т. harzianum и Aspergillus awamora . гноснтельно проростков кукурузы.

Обработка семян культуральной жидкостью Т. asperellum и Т. harzianum ,. >стоверно (р ¿0,05) увеличивала длину проростков и их корней после 168 часов «субации при 28°С на 40% и 60% соответственно относительно контроля. Наблюдалась достоверная разница (р ¿0,05) между сортами кукурузы и жсимальный эффект обработки фильтратом бьш показан для сорта Гиза балади ( ic. 15А,Б). Таким образом, можно заключить, что Т. asperellum и Т. harzianum сазывают одинаковое действие на проростки кукурузы - увеличивают их длину.

(амоитвоп!, 0*г

ЯТ.МОДпот

til

PwtHfeWtM MofWK.*«* Рв««едли-]1 г

я»

Сортов KYWPW

РмшНсчАЛ'! Pociiwwl Гимбаладм

211 Сортов *укуюу}ы

Рис.15. Влияние культуральцого фильтрата T.aspmllum 551 и Т. harzkmum 3 яа дану (А) и проросггков (Б) кукурузы. Также наблюдалось влияние метаболитов 'Prichoderma на высоту» растений исЛбА) и количество початков (Рис. 16Б) кукурузы. Обработка зёрен кукурузы ;ред посадкой культуральной жидкостью Т. asperellum, Т. harzianum, Мнзормвом культуральной жидкостью Trkhodema с пестицидом привела к увеличению »ста растений на 10%, 9%, 3 и 4% соответственно по отношению к контролю и зависимо от сорта кукурузы. На основе полученных данных можно заключить, о наилучшей стимулируюшей рост растений способностью обладают зтаболиты Т. asperellum и Т. harzianum. Кроме того, результаты показали, что шло початков колебалось в диапазоне от 2 до 4 во всех экспериментальных и |Цтрольных вариантах (Рис. 14Б). но наибольшее число початков наблюдалось ¡и обработке культуральным фильтратом Т. asperellum 551 и Т. harzianum по ь авнению с контролем.

1.35

2 1.9 ¡1.85

¡5 1.75

3 1.7 m

1.65 1,6

аНраснодлрский aoo?

П Краснодарский 2QOH

Контроль Пестициды Т.4»р*1-фПит T.hart|«mtm Мн«©рни с T.wpereHum T,h»rzl*<num Миэорин с к, п«стицна<*м

пестицидом пестицидом

л О-

£ |

о Краснодарский 20Q7 D Краснодарский 2008

U ПОООЯЖСНИ й

ftí

л л

Коиггро-пь п»стиц>у\ы r.i»kp«Mllumc T.h*f?l«nuiii Мндорммс ^

НУ ttíH^WOM < п^тицкдом

Рис.16. Влияние биопрепаратов на высоту растений (А) к количество початков (Б) кукурузы.

Таким образом, метаболиты Т. asperelhtm и Т. harzianum способствуют увеличению урожайности кукурузы, что, вероятно, обусловлено высокой конкурентной активностью использованных в работе штаммов Trihoderma.

Выводы

1. По морфолого-кинетическим и электрокинетическим параметрам установлена антибиотическая активность Trichoderma в отношении патогенных видов F. oxysporum, A. awamori, A, flavus,Наибольшая эффективность в подавлении F. oxysporum выявлена у Т. asperelhtm 551 из почв рТ.

2. Определена зависимость токсинообразовани* плесневым грибом A. flavus от вида антагониста при совместном культивировании. Т. asperellum 551 из почв РТ стимулирует синтез охратоксина А и полностью идоибирует синтез афлатоксина, а Т. harzianum 3 из почв Египта стимулирует продукцию охратоксина А и афлатоксина В1

3. Выявлен дрзозависимый эффект амфотерицина на A .awamori. Фунгицидное действие метаболитов Trichoderma сопоставимо с действием высоких доз амфотерицина.

4. Метаболиты T.asperetlum 551 и Т. haniamm 3 оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки линии Не1,а в опытах /и «/«/.Наибольшая эффективность подавления выявлена у T.asperellum 551 из почв РТ.

5. Установлено, что метаболиты T.aspemllum 551 не вызывают опухолеобразование и нивелирует токсическое действие пирена по восстановлению тканей, нормализации обмена веадеств, комплексу биохимических показателей и восстановлению иммунной системы,

6. Метаболиты T.asperellum 551 и 71 harzíanum 3 не фитотоксичны. увеличивают урожайность кукурузы. Наибольшая биологическая активность показана на сорте Гиза баладе из Египта,

Публикации по теме диссертации в изданиях рекомендованных ВАК

1. Абдельрахман A.A., Козлова Q.B., Тазетдинова Д.И., Алимова Ф.К., Куприянова-Ашина Ф.Г. Изменения роста Aspergillus awamori и содержание внутриклеточного кальция в ответ на воздействие амфотерицина / Учёные записки Казанского Университета- 2011,- Т. 153,- Книга 1С,97-1 Ю-

2. СахабиевИА, РябичкоСС., Иванова В В., Абдельрахман АЛ., ГригорьянБ.Р., Алимова Ф.К. Мониторинг микромицетов выщелоченного чернозема агроценозов Черемшанского района Республики Татарстан / Учёные записки Казанского Университета.- 2011,- Т. 153,- Книга 2,- С.250-261.

3. Хоанг Л.Т., Абдельрахман A.A., Иванова В,В., Тхи Т.Н., Рябичко С.С., Фаттахова А.Н., Алимова Ф,К, Биологическая активность жидкого препарата Trichoáerma в опытах in vitro и in vivo I Журнал "Фундаментальные исследования",-2011.-№ 11.-часть2. (впечати).

Другие публикации по теме диссертации

1. Абдельрахман A.A., Тазетдинова Д.И., Алимова Ф.К., Куприянов аАшина Ф.Г.влияние амфотерицина В на рост Aspergillus awamori, Материалы научнопракти ческой конференции становление и достижения биохимической школы Казанского университета Научнопрактическая конференция биохимиков, посвященная памяти проф. В.Г, Винтера (1939-2005) 12 ноября 2009. С.9

2. Козлова OB., Абдельрахман A.A., Тазетдинова Д.И., КуприяноваАшина Ф.Г., Алимова Ф К. Влияние противогрибковых препаратов на уровень кальция в цитозоле Aspergillus awamori Материалы научнопрактической конференции Становление и достижения биохимической школы Казанского университета Научнопрактическая конференция биохимиков, посвященная памяти проф. В.Г, Винтера (1939-2005) 12 ноября 2009. с. 67.

3. Абдельрахман АЛ., Тазетдинова Д.И., Алимова Ф,К., Куприянова-Ашина Ф.Г. Влияние амфотерицина В на рост микромицетов рода Aspergillus материалы всероссийского симпозиума с международным участием, современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов, Московский государственный университет, биологический факультет 24-27 декабря 2009. с,13

4. Козлова О,В., Куприянова-Ашина Ф.Г,, Алимова Ф.К., Абдельрахман АЛ., Тазетдинова Д,И. Влияние противогрибковых препаратов на уровень кальция в цитозоле Aspergillus awamori методом рекомбинантного звдорина материалы всероссийского симпозиума с международным участием, современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов, Московский государственный университет, биологический факультет 24-27 декабря 2Q09. с.81

5. Абдельрахман АЛ.» Козлова О.В., Тазетдинова ДИ„ Алимова Ф.К.. Куприянова-Ашина Ф.Г Изменения ррста Aspergillus awamori и содержание внутриклеточного кальция в ответ на воздействие амфотерицина / Сборник трудов

I Всероссийской Интернет-конференции "Современные проблемы биохимии И бионанотехнологии" 17-22.11.201Q. Казанский Университет С,4-7.

6. Абдельрадман А.А.,Эльвдафей С.М.А., Рябичко С.С„ Иванова В.В„ Морозова Ю.А,, Алимова ф,К, Влияние Trichoderma почв Египта и Республики Татарстан на растения, фитопатогены и жизнеспособность линии раковых клеток. / Сборник трудог П Международная конференция: "Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологяй" 15-18.11.2011. Казанский федеральный Университет

7. Morozoya, J.A.; Pankova, AV.; Skvortsov, E-V. and Abd El-Rahman, AA. (2009). Screening of micromycetes the genus Trichoderma with high xylanase activity, In the proceeding of the 13tb annual symposium for Biology Students of Europe (SymBioSE 2009) Biology; Expansion of Borders. Organized by Kazan State University, Kazan, Republic of Tatarstan, Russian Federation, 30 July - 8 August 2009.

8. Abd El-Rahman, AA.,' Sally M.A. El-Shafei; Diana I. Tazetdinova; Reseda I. Tukhbatova; Flaira G. Kuriyanova-Ashina and Farida K. Alimova. Effect of treatment maize grains before planting with Trichoderma Spp as bioagents on the yield In the proceeding of the Minia International Conference for Agriculture and Irrigation in the Nile Basin Countries, organized by faculty of agriculture, Minia university, El-Mini Egypt, 26th -29th March 2012, In press

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д-б.ц. проф. Алимовой Ф.К. за внимательное отношение к работе; д.б.н., проф. Абрамовой 3,И. за советы в процессе выполнения диссертационной работы; к.б.н,, доц. Фаттаховой А.Н. за помощь при приведении исследований на животных; д.б.н. проф. Купряяновой-Ашиной Ф.Г. за помощь в работе над диссертацией; к.б.н. Абдуллину ТД. за помощь в проведении исследований электрокинетического потенциала конвдий микромицетов; к б.н.Тазетдиновой Д.И. и к б н.Тухбатовон РЛ, за консультации в процессе выполнения работы; Хоанг Л.Т.и Тхи Т.Н. за помощь при проведении гистологических исследований; Рябичко С.С и Ивановой В.В., Морозовой ЮЛ. за помощь в работе над диссертацией; д,б.н. проф. Элыцафей МЛ и Эльморсей Э.А. за ценные идеи в процессе выполнения работы, Автор выражает глубокую благодарность родителям за консультации и поощрение в процессе выполнения работы. Благодарность выражается Салли Эльшафей за помощь и советы в процессе выполнения работы. Благодарность выражается; аспирантам и студентам лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии кафедры биохимии.

Отзывы на автореферат просим высылать по адресу: Казань, 420008, уд. Кремлевская, 18, Казанский университет, отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне. Факс 8(843)238-76-01 E-mail: atefnagi2000@yahoo.com, Тел: Россия:+79518922596.

Форщт eo.Ml б. Уся..шч 1,0, .Бумага офсетам ЦвчвТь рШографичвеищ. Тир»ж Ш да. Заш № Опдаатшга с готовых оригинад-йакегов 420029 г.Кашгь ул. Сибирски« tp.34

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Атеф Абдельмохсен Абдельрахман Ахмед

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Производство и применение биофунгицидов на основе Trichoderma.

1.1.1. Наиболее активный биоконтрольный штамм.

1.1.2. Требования к биопрепаратам.

1.1.3. Системы внесения препарата.

1.2. Географическое распространение грибов рода Trichoderma.

1.2.1. Географическое распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан.

1.2.2. Географическое распространение грибов рода Trichoderma на территории Египта.

1.3. Антибиозис и вторичные метаболиты Trichoderma.

1.4. Взаимодействие между грибами рода Trichoderma и растениями.

1.4.1. Положительные взаимодействия между грибами рода Trichoderma и растениями.

1.4.2. Отрицательные взаимодействия между грибами рода Trichoderma и растениями.

1.4.2.1. Ингибирование роста растений (Фитотоксические вещества).

1.5. Взаимодействие между Trichoderma и фитопатогенами.

1.5.1. Двойное взаимодействие между Trichoderma и фитопатогенами.

1.5.2. Тройное взаимодействие между Trichoderma, фитопатогенами и растениями.

1.6. Распространение и вредоносность плесневых грибов рода Fusarium и

Aspergillus.

1.6.1. Распространение и вредоносность грибов рода Fusarium.

1.6.2. Распространение и вредоносность грибов рода Aspergillus.

1.7. Влияние грибов рода Trichoderma на человека.

1.8. Промышленное применение грибов рода Trichoderma.

1.8.1. Использование Trichoderma в сельском хозяйстве в РТ.

1.8.2. Использование Trichoderma как биофунгицида в РТ.

1.8.3. Метаболитов и конидий изолятов Trichoderma.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Использованные микроорганизмы.

2.1.2. Фунгицид амфотерицин В.

2.1.3. Клетки HeLa.

2.1.4. Подопытные животные (сток мышей CD-I).

2.1.5. Раствор пирена.

2.1.6. Семена кукурузы.

2.1.7. Микробиологический препарат "Мизорин".

2.2. Методы, использованные в работе.

2.2.1. Культивирование микромицетов на средах Чапека и КГА для определения морфологических характеристик.

2.2.2. Определение ферментативной активности (ксиланаза, целлюлаза и амилаза) микромицетов Trichoderma.

2.2.2.1. Определение ксиланазной активности.

2.2.2.2. Определение целлюлазной активности.

2.2.2.3. Определение амилазной активности.

2.2.3. Определение липидного состава гриба Trichoderma.

2.2.3.1. Экстракция фосфолипидов.

2.2.3.2. Тонкослойная хроматография фосфолипидов.

2.2.4. Определение элементарного состава спорово - мицелиального материала микромицетов Т. asperellum 551, T.harzianum 3, и влияние условий их выращивания на элементарный состав культуральной жидкости.

2.2.5. Определение влияния метаболитов грибов рода Trichoderma на рост фитопатогенных микромицетов F. oxysporum, A. awamori и А. flavus.

2.2.6. Оценка влияния Т. asperellum 551 и Т. harzianum 3 на выработку афлатоксина В1 и охратоксина А грбом A. flavus при совместном культивировании.

2.2.7. Определение клеточного ответа A. awamori на воздействие амфотерицином.

2.2.8. Изучение влияния метаболитов КЖ грибов рода Trichoderma на изменение поверхностного потенциала спор фитопатогенных микромицетов.

2.2.9. Влияние метаболитов КЖ Trichoderma на клетки HeLa.

2.2.10. Изучение влияния КЖ грибов рода Trichoderma и пирена на массу тела, относительный вес некоторых органов, гематологические, иммунологические, биохимические и гистологические показатели мышей CD-I.

2.2.11. Фитотоксичность метаболитов Т. asperellum 551, Т. harzianum 3 и

A. awamori.

2.2.12. Биологическая обработка зёрен кукурузы и схема эксперимента сезона 2009 года.

2.2.13. Биологическая обработка зёрен кукурузы и схема эксперимента сезона 2010 года.

2.2.14. Статистическая обработка данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Морфологическая характеристика Trichoderma.

3.1.1. Описания видов T.asperellum 551.

3.1.2. Описание Анаморфа штамма Т. harzianum 3.

3.2.Характеристика биологической активности метаболитов КЖ штаммов

Т. asperellum 551 и Т. harzianum 3.

3.2.1. Ферментативная активность штаммов рода Trichoderma.

3.2.2. Изучение липидного состава мицелия грибов рода Trichoderma.

3.3. Характеристика элементарного состава культурального фильтрата и спорово-мицелиального материала T.asperellum 551 и Т. harzianum 3 в зависимости от среды их выращивания.

3.4.Антибиотическая активность грибов Trichoderma к фитопатогенам растений и почвы в опытах in vitro.

3.4.1. Влияние Trichoderma на рост фитопатогенных микромицетов рода Fusarium.

3.4.2. Влияние Trichoderma на микромицеты рода Aspergillus.

3.4.2.1.Влияние Trichoderma на микромицеты рода A.flavus.

3.4.2.2.Влияние Trichoderma на выработку афлатоксина В1 и охратоксина

А грибами рода A.flavus.

3.4.2.3.Влияние Trichoderma на микромицеты рода A.awamori.

3.5.Исследование клеточных ответов A. awamori на воздействие фунгицидом (амфотерицин).

3.6. Изучение электрокинетического потенциала конидий микромицетов Trichoderma, Fusarium, Aspergillus.

3.6.1.Изучение поверхностного заряда спор при взаимодействии различных видов Trichoderma с фитопатогенами.

3.7. Взаимоотношение Trichoderma с клетками Hela.

3.8.Влияние КЖ Trichoderma и пирена на гематологические, гистологические, иммунологические и биохимические показатели мышей стока CD-1.

3.9. Влияние метаболитов Trichoderma на растения в опытах in vitro и в опытах in vivo.

3.9.1.Влияние метаболитов на растения в опытах in vitro (фитотоксичность) Т. asperellum 551, Т. harzianum 3 и A. awamori относительно проростков кукурузы.

3.9.1.1. Микрофлора семян кукурузы до обработки Trichoderma.

3.9.1.2. Микрофлора ризосферы растений после обработки Trichoderma.

3.9.2.Исследование биологической активности КЖ Trichoderma на рост и продуктивность некоторых сортов кукурузы in vivo. j

3.9.2.1. Влияние метаболитов грибов рода Trichoderma на высоту и сухую массу растений.

3.9.2.2. Влияние метаболитов грибов рода Trichoderma на продуктивность кукурузы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние Trichoderma почв Египта и Республики Татарстан на отдельные параметры живых систем"

Актуальность проблемы. Грибы рода Trichoderma являются продуцентами метаболитов с высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Показана способность к выделению различных фитогормонов, органических кислот, аминокислот, витаминов и свыше 100 антибиотиков [Benitez et al., 2004; Алимова, 2005; Druzhinina et al., 2011]. Изоляты рода Trichoderma являются активными продуцентами гидролаз и способны к глубокой деструкции, как клеточных стенок растений, так и отдельных трудно расщепляемых растительных полисахаридов: целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина до мономерных форм и других полимеров [Claus, 2004; Harman et al., 2004; 2010; Harman, 2011].

Как известно, Trichoderma может продуцировать ряд микотоксинов: харзианум А, трихотецены, трихотоксины, триховиридин и виридин и др. [Uraguchi, Yamazaki, 1978; Anthony et al., 2009; 2010; Drizhinina et al., 2011]. Выявлены виды Trichoderma, продуцирующие токсичные метаболиты, приводящие к летальному исходу мышей [Anthony et al., 2010]. С другой стороны выделены новые вещества - циклотетрапептид и триходермине А, продуцируемые Trichoderma reesei обнаружили цитотоксическим эффектом против линии клеток человеческой меланомы A375-S2 [Sun et al., 2006].

По ГОСТу, принятому в России биопрепараты проверяются на онкогенность, генотоксичность, вирулентность, фитопатогены, растения и целый ряд других биологических параметров.

В последние 30 лет биопрепараты на основе Trichoderma являются одним из наиболее востребованных в Республике Татарстан. Однако спектр областей возможного применения метаболитов этого вида неуклонно расширяется и это требует дополнительных исследований.

Цель работы: Оценка биобезопасности и биологической активности метаболитов грибов рода Trichoderma из почв Египта и РТ к растениям, микроорганизмам, клеткам и животным.

Основные задачи исследования:

1. Охарактеризовать тип взаимодействия Т. asperellum 551 из РТ и Trichoderma harzianum 3 из Египта с микромицетами рода Fusarium, Aspergillus flavus, Aspergillus awamori.

2. Определить влияние микромицетов рода Trichoderma на токсинообразование Aspergillus flavus.

3. Выявить эффективность действия фармацевтического фунгицида амфотерицина и метаболитов Trichoderma на некоторые физиологические параметры модельного вида A. awamori.

4. Оценить влияние метаболитов Trichoderma на жизнеспособность клеток линии HeLa.

5. Исследовать биохимические, гематологические, гистологические, иммунологические показатели мышей стока CD-1 на фоне метаболитов Trichoderma и индуктора опухолеобразования пирена.

6. Показать влияние метаболитов Trichoderma на рост и продуктивность некоторых сортов кукурузы.

Научная новизна. Впервые проведено сравнение влияния метаболитов T.asperellum 551 и Т. harzianum 3 на рост и продуктивность районированных сортов кукурузы РТ и Египта на различных типах почв.

Впервые показано, что метаболиты T.asperellum 551 и Т.harzianum 3 не обладают онкогенным действием и подавляют образование опухолей, индуцированных пиреном.

Метаболиты T.asperellum 551 и T.harzianum 3 оказывают антагонистическое действие на патогенные грибы и регулируют синтез охратоксина А и афлотоксина A.flavus.

Практическая значимость. Полученные результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и могут быть использованы для дальнейшей сертификации биопрепаратов на основе исследуемых штаммов Т. asperellum 551 на базе биозавода ООО НПИ Биопрепараты в РТ, а на основе Т. harzianum 3 на биозаводе в Египте.

Разнонаправленное действие метаболитов Trichoderma на токсинообразование A. flavus указывает на необходимость введения нового пункта контроля биопрепаратов на основе микромицетов.

Результаты могут быть использованы в учебном процессе в рамках дисциплин «Биотехнология», «Биологически активные вещества микробного происхождения».

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в соответствии с тематическим планом КФУ "Выявление взаимосвязи сукцессий живых организмов и эволюционных изменений биосферы" раздел № 1 Темплана КФУ на период с

1.01.2011 по 31.12.2013 г. Девиз - РНП-23. Гранты РФФИ 11-04-00805-а

Микробные сообщества почв древних ландшафтов лесостепи Поволжья»

2011-2013,11-04-01731-а «Влияние тяжелых металлов на экологическое состояние почв при синергетическом эффекте загрязнения антропогенных 8 ландшафтов 2011-2012». Все эксперименты проводились в лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии, кафедры биохимии, биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета, Казань. Полевые испытания проводились на серой лесной почве Лаишевского района 2008 году и черноземе Черемшанского района в 2009 году РТ. Личное участие заключалось в разработке темы исследований, выборе объектов для изучения, проведении экспериментов, обработке полученных результатов, их анализ и интерпретация, подготовка статей к публикации (написание и редактирование), а также их обсуждение с рецензентами. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Масс - спектроскопию проводили в лаборатории к.ф.-м.н.я. Волошина A.B., отдела аналитической спектроскопии Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов Приволжского федерального округа. Получены положительные отзывы от предприятий по предварительным опытам использования опытных партий биопрепаратов на основе штаммов Trichoderma в сельскохозяйственной биотехнологии РТ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Метаболиты грибов рода Trichoderma, выделенные из почв Египта и РТ, оказывают разнонаправленное действие на выработку охратоксина А и афлатоксина В1 патогеном A.flavus в зависимости от вида микромицета.

2. Метаболиты T.asperellum 551 ингибируют индуцированное пиреном образование опухолей в печени и коже у мышей и оказывают цитотоксическое действие на клетки HeLa в опытах in vitro.

3. Наибольшую антагонистическую активность в отношении фитопатогена рода Fusarium oxysporum оказывает миромицет, выделенный из почв Республики Татарстан.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

1. «Становление и достижения биохимической школы казанского университета» (Казань, КФУ, ноябрь 2009],

2. «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, МГУ, декабрь 2009),

3. Ежегодная конференция Казанского федерального университета (Казань, КФУ, февраль 2010),

5. Ежегодная конференция Казанского федерального университета (Казань, КФУ, февраль 2011),

6. «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий», II научно-практическая интернет-конференция (Казань, КФУ, ноябрь 2011),

7. «Международная конференция» по вопросам сельского хозяйства и ирригации в странах бассейна Нила», (факультет сельского хозяйства, Университет Минья, г.Эль-Минья, Египет, 26-29 марта, 2012).

Структура и объем диссертации. Основное содержание работы изложено на 158 страницах машинописного текста, диссертация иллюстрирована 11 таблицами, 62 рисунком. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 39 отечественных и 158 зарубежных публикаций.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Атеф Абдельмохсен Абдельрахман Ахмед

выводы

1. По морфолого-кинетическим и электрокинетическим параметрам установлена антибиотическая активность ТНскос1егта в отношении патогенных видов К охузрогит , А. амгатоп, А. Наибольшая эффективность в подавлении К охуБрогит выявлена у Т. аБрегеНит 551 из почв РТ.

2. Определена зависимость токсинообразования плесневым грибом А. /1аут от вида антагониста при совместном культивировании. Т. аБрегеНит 551 из почв РТ стимулирует синтез охратоксина А и полностью ингибирует синтез афлатоксина, а Т. катапит 3 из почв Египта стимулирует продукцию охратоксина А и афлатоксина В1.

3. Выявлен дозозависимый эффект амфотерицина на А. сматоп. Фунгицидное действие метаболитов Тпскос1егта сопоставимо с действием высоких доз амфотерицина.

4. Метаболиты Т.азрегеНит 551 и Т. Иатапит 3 оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки линии НеЬа в опытах т угУго.Наибольшая эффективность подавления выявлена у Т.аБрегеНит 551 из почв РТ.

5. Установлено, что метаболиты Т.азрегеНит 551 не вызывают опухолеобразование и нивелируют токсическое действие пирена по восстановлению тканей, нормализации обмена веществ, комплексу биохимических показателей и восстановлению иммунной системы.

6. Метаболиты ТаэрегеНит 551 и Т. катапит 3 не фитотоксичны, увеличивают урожайность кукурузы. Наибольшая биологическая активность показана на сорте Гиза привезенной из Египта.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Грибы рода Тпскос1егта являются типичными представителями влажных лесов всех типов. Эти грибы легко определяются благодаря их яркой окраске. Виды Тпс}юс1егта часто встречаются не только во влажных тропических и субтропических лесах, но также в аридных умеренных и северных зонах и даже в более экстремальных нишах - на крайнем севере и крайнем юге. Образуют 8 аскоспор с одной перетяжкой, находящихся в одной оболочке на ранних этапах развития. Аскоспоры бесцветные или зелёные. Обычно виды ТпскснЗегта выделяют из почвы, хотя они часто спорулируют на древесине, на шляпках культурных грибов, на лесных грибах, где их можно определить с легкостью по массе конидий, окрашенных в зеленый цвет, реже в белый и желтый цвета. Тпскос1егта составляет значительную часть от общей биомассы грибов почвы [Нагшап е/ а!., 2010; Нагтап, 2011; ОпгЫтпа е/а/., 2011].

Представителей рода ТпсИос1егта можно найти практически во всех типах почв. Их считают, по крайней мере, частично, ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах. На данных супрессивных почвах зерновые и деревья не подвергаются действию патогенов и выделяемых в окружающую среду микотоксинов [Вае а1., 2011].

Вторичные метаболиты - гетерогенная группа веществ, которые, как полагают, помогают организму в выживании и основных функциях, таких как конкуренция с другими микро - и макроорганизмами, симбиоз, транспорт металлов, дифференцирование и т.д. Химические и биологические свойства таких веществ широко используются в медицинских, фармацевтических или сельскохозяйственных целях. Вторичные метаболиты имеют огромное значение в биотехнологии, однако механизм их синтеза в некоторых случаях не совсем ясен. Включенные в эту группу антибиотики являются естественными продуктами, способными задерживать микробный рост и продуцируются различными микробами во время процессов развития и споруляции [Schuster, Schmoll, 2010].

Впервые антибиотическую активность у грибов рода Trichoderma описали Dennis и Webster (1971a,b). Они показали, что грибы рода Trichoderma синтезируют стабильные и нестабильные антибиотические компоненты, способные ингибировать мицелиальный рост различных грибов. Позднее было показано, что многие виды рода Trichoderma являются известными продуцентами вторичных метаболитов с антибиотической активностью [Reino et al, 2008, Harman et al., 2010; Mishra et al., 2011].

Продукция антибиотиков является одним из механизмов биологического контроля и, таким образом, определение антибиотиков считается одним из необходимых критериев при селекции штаммов. Существуют данные, подтверждающие синергизм действия между гидролитическими ферментами, разлагающими клеточную стенку и различными классами антибиотиков у штаммов, проявляющих микопаразитизм. Применение чистых антибиотиков показало такую же эффективность против патогена, как и при использовании самих агентов биоконтроля [Harman, 2011].

В связи с выше сказанным в настоящей работе изучено влияние культуральной жидкости грибов рода Trichoderma на отдельные параметры живых систем. Обнаружено, что метаболиты Trichoderma стимулируют рост и продуктивность кукурузы, подавляют рост фитопатогенных грибов, подавляют рост грибов под действием амфотерицина, оказывают цитотоксичность в отношении опухолевых клеток, восстанавливают состояние мышей после интоксикации, стимулируя их иммунную систему и нормализуя обмен веществ.

Известно, что грибы рода Trichoderma являются корневыми симбионтами и увеличивают рост растений. Данный эффект наблюдался при использовании кукурузы в качестве тест-объекта. Ниже приведены некоторые заключения по опубликованным результатам [Harman, 2006;

132

Harman et al., 2010; Harman, 2011] позитивного влияния данных микромицетов на кукурузу за последние 5-10 лет, включающие следующие положения:

- контроль корневых и лиственных патогенов;

- спонтанная устойчивость;

- биоконтроль прямой атакой фитопатогенов;

- изменение в микрофлоре корневой зоны;

- увеличение поглощения источников питания, включающие, но не ограничивающиеся азотом;

- увеличение растворимости почвенных веществ;

- увеличение развития корня;

- увеличение ветвистости корня;

- рост корня вглубь.

В связи с этим, нами изучено влияние КЖ Т. harzianum 3 и Т. asperellum 551 на рост и продуктивность некоторых сортов кукурузы. Показано, что метаболиты кж Т.asperellum 551 и Т. harzianum 3 способствуют увеличению высоты и веса растения по сравнению с контролем. Было подсчитано количество початков каждого растения. Результаты показали, что число початков колебалось в диапазоне от 2 до 4 во всех экспериментальных и контрольных вариантах, но наибольшее число початков наблюдалось при обработке семян кукурузы культуральным фильтратом T.asperellum 551 и Т. harzianum 3 в отличие от контроля. Кроме того, культуральный фильтрат T.asperellum 551 и Т. harzianum 3 способствует увеличению длины корней и проростков кукурузной рассады по сравнению с контролями, в том числе и при обработке картофельно-глюкозной средой. Однако, культуральный фильтрат фитопатогена A.awamori ингибирует рост длины корней и проростков кукурузной рассады по сравнению с контролем и при обработке средой Вогеля.

Известно, что грибы рода Trichoderma выделяют антибиотические компоненты, способные ингибировать мицелиальный рост различных грибов

133

Dennis, Webster, 1971a, b; Harman, 2006; Mishra et al., 2011]. Поэтому было изучено влияние метаболитов Т. asperellum 551 на рост и развитие фитопатогенных микромицетов (F. oxysporum, A. awamori, A. flavus). Отмечено, что Т. asperellum 551 проявляет антагонистическую активность в течение всего периода культивирования (7 дней) в отношении F. oxysporum, A. awamori и A. flavus и самая максимальная активность выявлена в соотношении спор 3:1. Кроме того, установлено изменение поверхностного потенциала спор Т. harzianum 3 при культивировании с F. oxysporum и А. flavus. При этом клетки приобретают более положительный суммарный заряд. T.asperellum 551 также изменяет поверхностный потенциал спор при культивировании с патогенными грибами A. flavus и A. awamori.

Имеющиеся данные в литературе [Choudhary, 1992; Calistru et al., 1997] относительно способности штаммов Т. harzianum и Т. viride подавлять рост A. flavus и вырабатывать афлатоксин коррелируют с результатами наших исследований, показавших что Т. harzianum 3 и Г. asperellum 551 приводят к увеличению выработки охратоксина А грибом A. flavus. Кроме того, найдено, что в зависимости от вида, Trichoderma может как ингибировать выработку афлатоксина, так и приводить к его увеличению. Культивирование A. flavus с Т. harzianum 3 приводило к увеличению продукции афлатоксина В1. С другой стороны, при культивировании Т. asperellum 551 с фитопатогеном A. flavus, последний абсолютно не производил афлатоксин.

Высокая токсичность грибов рода Aspergillus и выраженная устойчивость их к обработке различными противогрибковыми препаратами обуславливает поиск новых биологически активных веществ, способных полностью подавлять развитие аспергилл, например, таких как препараты на основе метаболитов грибов рода Trichoderma.

Особый интерес в этом плане представляет амфотерицин В. Этот препарат, являясь представителем полиеновых антибиотиков, эффективный в отношении многих патогенных грибов, возбудителей различных

134 заболеваний, в том числе не поддающихся лечению другими противогрибковыми препаратами [Медведев, 2004], может оказаться перспективным в качестве противогрибкового средства в отношении аспергилл. Как любое воздействие на клетку, эффект амфотерицина на микромицет A. awamori является стрессорным. Наим обнаружено, что в опытных вариантах набухание и прорастание спор зависело от концентрации фунгицида. Если высокие дозы амфотерицин (20, 10 мкМ) оказывали ингибирующее действие в сравнении с контролем, то в меньших концентрациях (5-2,5 мкМ) амфотерицин стимулировал этот процесс.

В медицинских и фармацевтических целях, в том числе, для лечения онкологических заболеваний широко используются химические и биологические свойства вторичных метаболитов грибов рода Trichoderma [Смирнова и др., 2005; Schuster, Schmoll, 2010].

Учитывая, что для исследования раковых заболеваний часто используют линию клеток HeLa, нами изучено влияние метаболитов КЖ Т. harzianum 3 и Т. asperellum 551 на жизнеспособность опухолевых клеток HeLa in vitro. Показано, что оба культуральных фильтрата T.asperellum 551 и Т. harzianum 3 уменьшают процент живых HeLa клеток в течение 30 и 60 минутного их контакта. Кроме того, повышение концентрации метаболитов снижает жизнеспособность HeLa клеток. В настоящее время поиск средств для лечения наиболее опасных заболеваний человека, в том числе онкологических, является первоочередной задачей многих исследований. В связи с этим, представляет интерес исследование влияния метаболитов Т. asperellum 551 и их способность регенерировать организм после воздействия вредных веществ, таких как пирен. Проводили гематологическое, иммунологическое и биохимическое обследование и гистопатологию мышей. Выявлено, что мыши, получавшие пирен, имели массу тела больше, чем в контроле в конце эксперимента. Однако масса тела мышей, получавших культуральную жидкость после пирена не отличалась от таковой контрольной группы. Кроме того, инъекция мышей пиреном способствовала

135 увеличению веса печени и селезенки, одновременно снизив вес почек и яичек. Однако инъекция культуральной жидкости до или после пирена не приводило к изменению веса печени и почек относительно контроля в течение 14 суток.

Согласно гематологическому и иммунологическому обследованию, пирен способствовал увеличению количества лейкоцитов и уменьшению эритроцитов по сравнению с контролем. Инъекция мышам культуральной жидкости до или после пирена ослабляла его действие. С другой стороны инъецирование мышей пиреном увеличило процент лимфоцитов, базофилов и эозинофилов и уменьшило количество нейтрофилов в сравнении с контролем. Кроме того, инъекция культуральной жидкости, приводит к уменьшению процента моноцитов и нейтрофилов в сравнении с контролем. Это свидетельствует о том, что КЖ ингибирует действие пирена. При исследовании основных показателей функционирования печени, а именно, активности аспартатаминотрансферазы и аланинтрансаминазы, а также концентрации билирубина в сыворотке крови, обнаружено, что инъецирование мышей культуральным фильтратом указанного микромицета во всех случаях не имеет каких-либо отличий от контроля. Продолжительное инъецирование пиреном приводит к достоверному увеличению активности данных трансаминазы, а также - концентрации билирубина, что свидетельствует об интоксикации организма. Кроме того, при обработке пиреном наблюдается достоверное увеличение концентрации мочевины, что указывает на дисфункцию почек, которая при инъекциях метаболитов гриба Т. asperellum 551 восстанавливается.

При исследовании влияния метаболитов грибов рода Т. asperellum 551 и пирена на ткани печени и кожи мышей оказалось, что введение пирена вызывало дистрофию и некроз тканей. Однако введение культуральной жидкости после многократной инъекции пиреном подавляло развитие некротических и дистрофических процессов. Кроме того, инъекция мышам пирена под кожу вызывала хроническое воспаление, Т-клеточную реакцию,

136 преобладание дендритных клеток в жировой клетчатке, атрофию волосяных фолликул. КЖ ТпскоЛегта снижала действие пирена, предотвращая развитие изучаемых процессов.

Таким образом, результаты наших экспериментов подтвердили экологическую безопасность метаболитов культуральной жидкости ТпскосЛегта и перспективность интродукции биопрепаратов на основе штаммов супрессоров рода Тпскойегта для повышения урожайности кукурузы. Как нами показано, метаболиты ТпскоЛегта ингибируют жизнеспособность раковых клеток, способствуют снижению действия пирена на организм мышей, проявляя иммуномодулирующую активность, а также подавляют развитие многих фитопатогенных грибов. Итак, нами установлена стимулирующая активность метаболитов по отношению к растениям, антибиотическая - к фитопатогенным грибам, - цитотоксичная к опухолевым клеткам, - иммуностимулирующая и регенерирующая организм мышей после интоксикации. Однако требуется дополнительные исследования, необходимые для определения действия конкретных метаболитов культуральной жидкости грибов ТпсИос1егта, проверки их биологической активности и различных потенциальных механизмов воздействия и снижения затрат данного подхода.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Атеф Абдельмохсен Абдельрахман Ахмед, Казань

1. Алимова Ф.К. Trichoderma / Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) таксономия и распространение. / Ф.К. Алимова // Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина.-2005.-263с.

2. Алимова, Ф.К. Биотехнология. Промышленное применение грибов рода Trichoderma: учебно методическое пособие / Ф.К. Алимова, Д.И. Тазетдинова, Р.И. Тухбатова.- Казань: Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина.-2007.-230с. + 4 фотогр.

3. Алимова, Ф.К. Промышленное применение грибов рода Trichoderma / Ф.К. Алимова // Казань : Казанский государственный университет, 20066.-208с.

4. Билай, В.И. Определение роста и биосинтетической активности грибов / В.И. Билай // Методы экспериментальной микологии, справочник. Наукова думка.-1982.-С. 138-152.

5. Великанов, Л.Л. Экологические проблемы защиты растений от болезней / Л.Л. Великанов, И.И. Сидорова // Итоги науки и техники. Защита растений.-1988.-Т.6.-С.58-141.

6. Виликанов, Л.Л. Роль грибов в формировании мико и микробиоты в почвоестественных и нарушенных биоценозах и агроценозах Дисс.д.б.н.-М., 1997.-547с.

7. Голиков, H.H. Клещевина, устойчивая к фузариозу / H.H. Голиков // Защита и карантин растений.-2003.-№ 3.-С.44.

8. Дьяков, Ю.Т. Вегетативная несовместимость у фитопатогенных грибов / Ю.Т. Дьяков, A.B. Долгова// М.:МГУ.-1995.-С.5-14.

9. Иващенко, В.Г. Географическое распространение и особенности биоэкологии Fusarium graminearum Schwabe / В.Г. Иващенко, J1.A. Назаровская//Микология и фитопатология-1998 -Т. 32, Вып. 5.-С.1-10.

10. Левитин, М.М. Фузариоз колоса зерновых культур / М.М. Левитин // Защита и карантинрастений-2002 -№ 1.-С. 16-17.

11. Малюга, A.A. Видовой состав и патогенность грибов рода Fusarium, вызывающих сухую гниль клубней картофеля в Западной Сибири / A.A. Малюга // Микология и фитопатология.-2003.-Т.37, Вып.4.- С. 84-91.

12. Марфенина, O.E. Антропогенная экология почвенных грибов / O.E. Марфенина.-М.: Медицина для всех, 2005.-196с.

13. Медведев, С.С. Кальциевая сигнальная система у растений / С.С. Медведев // Физиология растений.-2004.-Т.52, № 1.- С. 1-24.

14. Монастырский, O.A. Токсины фитопатогенных грибов /O.A. Монастырский // Защита растений.-1996.-№ 8.С.12-14.

15. Сейкетов, Г.Ш. Грибы рода Trichoderma и их использование в практике / Г.Ш.Сейкетов // Алма-Ата: Наука.-1982.-248с.

16. Сидорова, И.И. Биологические методы борьбы с фитопатогенными грибами / И.И. Сидорова // Итоги науки и техники. Сер. защита раст.-М.: ВИНИТИ.-1980.-Т.2.-С. 116-157.

17. Скворцов Е.В. Биосинтез ксиланаз аборигенными изолятами Trichoderma / Е.В. Скворцов, Ф.К. Алимова, Д.М. Абузярова // Вестник казанского технологического университета. Казань: Отечество. — №1. — 2005. - С. 251255.

18. Смирнова И.П. Триходерма продуцент ингибитора вируса иммунодефицита человека / И.П. Смирнова, С.Б. Алексеев, Д.А. Мошков // мед. химии.-2005.-№ 51.С. 133-136.

19. Тазетдинова Д.И. Биологическая активность выщелоченных черноземов Юго-Востока республики Татарстан. Автореферат диссертации кандидат биологических наук. КФУ. Казань-2008.

20. Тухбатова Р.И. Микробиологическая характеристика археологических памятников на территории Республики Татарстан. Автореферат диссертации кандидат биологических наук. КФУ. Казань-2008.

21. Чулкина, В.А. Борьба с болезнями сельскохозяйственных культур в Сибири / В.А. Чулкина.// М.: Россельхозиздат, 1987. - 252 с. ЗО.Чулкина, В.А. Защита зерновых культур от обыкновенной гнили / В.А. Чулкина // М.: Россельхоз-издат, 1979. - 72 с.

22. Шариков, A.M. Изучение антибиотической активности метаболитов грибов рода Trichoderma в отношении штаммв Bacillussubtilis / A.M. Шариков // Вестник Алтайского государственного аграрного университета-2011.-№ 2. С. 57-59.

23. Шариков, A.M. Исследование антибактериальной активности метаболитов некоторых высших грибов Средней Сибири / A.M. Шариков // Современные наукоёмкие технологии 2010-№ 6.-С.128-129.

24. Шеховцев, А.Г. Фузарии в почвах лесных фитоценозов Украины и некоторых регионов России / А.Г. Шеховцев, И.А. Элланская, Д. Диголь // Микология и фитопатология-1998.-Т. 32, Вып. 5.-С.79 84.

25. Шешегова, Т.К. Фузариоз колоса и зерна озимой ржи / Т.К. Шешегова // Защита и карантин растений-2003.-№ 4.-С.50-51.

26. Шигаева, М.Х. Стимуляция жизнедеятельности микроорганизмов и вирусов / М.Х. Шигаева, Н.Б. Ахматуллина, Н.К. Джангалина, К.Г. Мустафин // Алма-Ата, Наука.-1986.-184с.

27. Штерниш М.В. Грибные препараты / М.В. Штерниш, Ф.С. Джалилов, И.В. Андреева, О.Г. Томилова // Биологическая защита растений. М: Колос, 2004.-С. 195-198.

28. Яковлев, В.П. Перспективы создания и внедрения новых антимикробных препаратов / В.П. Яковлев, С.В. Яковлев // Инфекции и антимикроб. химиотерапия-2002.-№4. С. 1-5.

29. Abarca, M.L. Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger var. niger. / M.L. Abarca, M.R. Bragulat, G. Castella, F.J. Cabanes // Appl. Environ. Microbiol.-1994.-Vol.60.-P. 2650-2652.

30. Ahmad, J.S. Rhizosphere competence of Trichoderma harzianum / J.S. Ahmad, R. Baker // Phytopathology.-1987.-Vol.77-P.182-189.

31. Ainsworth, G.C. Fungal diseases of animals, 2nd ed. (Commonwealth Agricultural Bureau) / G.C. Ainsworth, P.K. Austwick //Slough, U.K., 1973.

32. Akrami M. Evaluation of different combinations of Trichodermaspec'ies for controlling Fusarium rot of lentil / M. Akrami, H. Golzary, Ahmadzadeh M // African J.Biotechnol.-2011.-Vol.1 O.P. 2653-2658.

33. Alfano, G. Systemic modulation of gene expression in tomato by Trichoderma hamatum 382 / M.L. Lewis Ivey,C. Cakir, J.I.P. Bos, S.A. Miller, L.V. Madden, S. Kamoun, H.A. Hoitink // Phytopathology.-2007.-Vol.97.-P.429-437.

34. Anthony, M.H. Health implications of toxigenic fungi found in two Nigerian staples: guinea corn and rice / M.H. Anthony, G.T. Ayinla, A.O. Helmina, S.A. Ezekiel, O.G. Haruna // African J.Food Science.-2009.-Vol.3.-P.250-256.

35. Archer, D.B. The molecular biology of secreted enzyme production by fungi / D.B. Archer, J.F.Peberdy // Crit. Rev. Biotechnol.-1997.-Vol,17.-P.273-306.

36. ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Public Health Statement, Polycyclic Aromatic Hydrocarbons. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services.-1990.

37. Babeendean, N. Inconsistent growth promotion of Cabbage and Lettuce from Trichoderma isolates / N. Babeendean, D.J. Moot, E.E. Jones, A.Stewart // New Zealand Plant Prot.-2000-Vol.53.-P. 143-146.

38. Bacon, C.W. Biological control of Fusarium moniliforme in maize / C.W. Bacon, I.E. Yates, D.M. Hinton, F. Meredith // Health Perspe.-2001.-Vol.109.-P. 325-332.

39. Baker, R. Improved Trichoderma spp. for promoting crop productivity / R. Baker // Trends Biotechnol.-1989.-Vol.7.-P.34-38.

40. Baker, R. Trichoderma spp. as plant stimulants / R. Baker // CRC Crit. Rev. Biotechnol-1988.-Vol.7.-P.97-106.

41. Bartles, H. Serum creatinine determination without protein precipitation / H. Bartles, M. Bohmer, C. Heirli // Clin.Chem.Acta.-1972.-Vol.37.-P.193-197.

42. Belewu, M.A. Effects of Trichoderma-treated cassava waste in the diets of West African dwarf goat on blood, reproductive and urinary parameters / M.A. Belewu, K.Y. Belewu, I.O. Bello // African J.Biotechnolo.-2006.-Vol.5.-P.2037-2040.

43. Belewu, M.A. Haematological and serum indices of goat fed fungi treated Jatropha curcas kernel cake in a mixed ration / M.A. Belewu, F.O. Ogunsola // J. Agri. Biotechnol. Sustain. Dev.-2010.Vol.2.-P.35-38.

44. Benford, D. Ochratoxin A / D. Benford, C. Boyle, W. Dekant, R. Fuchs, D.W. Gaylor, G. Hard, D.B. McGregor, J.I. Pitt, R. Plestina, G. Shephard, M. Solfrizzo, P.J.P.Verger, R. Walker//JECFA 47.-2001.

45. Benhamou, N. Hyphal interaction between Trichoderma harzianum and Rhizoctonia solani: ultrastructure and gold chemistry of the mycoparasitic process /N. Benhamon, I. Chet//Phytopathol.-1993.-Vol.83.-P. 1062-1071.

46. Benitez, T. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains/ T. Benitez, A.M. Rincon, M.C. Limon, A.C. Codon // International Microbiology-2004.-№ 7.-P.249-260.

47. Bernfeld P. Amylases, a and 6 / P.Bernfeld // Met/ Enzymology.-1955.-Vol. l.P. 149-158.

48. Bondy, G.S. Immunomodulation a by fungal toxins / G.S. Bondy, J. Pestka // Toxicol. Envir. Health.-2000.-Vol.3-P. 109-143.

49. Campbell, R. Biological Control of Microbial Plant Pathogens / R. Campbell // New York, Cambridge University Press.-1989.

50. Castle, A. Morphological and molecular identification of Trichoderma isolates on North American mushroom farms / A. Castle, D. Speranzini, N. Rghei, G. Aim, D.Rinker // Apll. Enviroon. Microbiol.-1998.-Vol.64.-P.133-137.

51. Chet, I. Biological control of fungal pathogens / I. Chet, J. Inbar // J.Appl Biochem Biotechnol.-1994.-Vol.48.-P.37-43.

52. Chet, I. Fungal antagonists and mycoparasite / I. Chet, J. Inbar,I. Hadar//In: Wicklow, D.T., So" derstro" m, B. (Eds.), The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships. Springer, Berlin.-1997.-P. 165-184.

53. Chet, I. Isolation and biological potential of Trichoderma hamatum from soil naturally suppressive of Rhizoctonia solani / I. Chet, R. Baker // Phytopathology .-1981.-Vol.71.-P.268-290.

54. Choudhary, A.K. Influence of microbial co-inhabitants on aflatoxin synthesis of Aspergillus flavus on maize kernels / A.K. Choudhary // Lett. Appl. Microbiol.-1992.-Vol. 14.-P. 143-147.

55. Claus, H. Laceases structure reactions, distribution / H. Claus // Micron.-2004.-V.35.-P.93-95.

56. Cook, R.J. Safety of microorganisms intended for pest and plant disease control: A framework for scientific evaluation / R.J. Cook, W.L. Bruckart, J.R. Coulson, M.S. Goettel //Biol. Control.-1996.-Vol.7.-P.333-351.

57. Cortes, C.A. The expression of genes involved in parasitism by Trichoderma harzianum is triggered by a diffusible factor / C.A. Cortes, V. Gutierrez, J. Olmedo, I. Inbar, I. Chet, A. Herrera-Estrella // Mol. Gen. Genet.-1998.Vol.260-P. 218-225.

58. Cotxarrera L. Use of sewage sluge compost and Trichoderma asperellum isolates to supress Fusarium wilt of tomato / L. Cotxarrera, M.I. Trillas-Gay, C. Steinberg, C. Alabouvette // Soil Biol, and Biochem. 2002. - № 34. - P. 467476.

59. Cutler, H.G. Koninginin A: a novel plant growth regulator from Trichoderma koningii / H.G. Cutler, D.S. Himmellsbach, R.F. Arrendale, P.D. Cole, R.H. Cox // Agrie. Biol. Chem.-1989.-Vol.53.-P. 2605-2611.

60. Dacie, S.J. Practical Haematology, 7th Ed. / S.J. Dacie, S.M. Lewis // Churchill Livingstone. 1991.- 532c.

61. De Meyer, G. Induced systemic resistance in Trichoderma harzianum T39 biocontrol of Botrytis / G. De Meyer, J. Bigirimana, Y. Elad, M. Hofte, // European Journal of Plant Pathology.-1998.-Vol.l04.-P.279-286.

62. Dennis, C. Antagonist properties of species group of Trichoderma. 2. Production of volatile antibiotics / C. Dennis, J. Webster // Trans. Br. Mycol. Soc.-1971b.- Vol.57.-P.41-78.

63. Dennis, C. Antagonist properties of species group of Trichoderma. 3. Hyphal interaction / C. Dennis, J. Webster // Trans. Br. Mycol. Soc.-1971c.-Vol.57.-P.263-369.

64. Dennis, C. Antagonistic properties of species groups of Trichoderma III, hyphae interaction / C. Dennis, J. Webster // Trans. Br. Mycol. Soc.-1971a.-Vol.57.-P.363-369.

65. Dorner, J.W. Effect of application of nontoxigenic strains of Aspergillus flavus and A. parasiticus on subsequent aflatoxin contamination of peanuts in storage / J.W. Dorner, R.J. Cole // Journal of Stored Products Research.-2002.-Vol.38.-P. 329-339.

66. Druzhinina I.S. Trichoderma: the genomics of opportunistic success / V. Seidl-Seiboth, A. Herrera-Estrella, B.A.Horwitz, C.M. Kenerley, E.Monte, P.K. Mukherjee PK, S. Zeilinger, I.V. Grigoriev, C.P.Kubicek // Nat Rev MicrobioL-2011.-Vol. 10.-P.749-759.

67. Dubey, S.C. Evaluation of Trichoderma species against Fusarium oxysporum f. sp. ciceris for integrated management of chickpea wilt / S.C. Dubey, M. Suresh, B. Singh // Biol. Contl.-2007.Vol.40.-P. 118-127.

68. Dvorockova, I. Aflatoxins and human health /1. Dvorockova // (CRC Press, Boca Raton, Fla, 1990).

69. Edward, W. Fungal spores: A critical review of the toxicological and epidemiological evidence as a basis for occupational exposure limit setting / W. Edward // Crit. Rev.Toxicol.-2009.Vol.39.-P.799-764.

70. Eisenweine, H.G. Kinetishe Bestimung des Harnstottes mit dem LKB-System / H.G. Eisen weine //J. Clin. Chem. Clin. Biochem.-1976.-Vol.14.-P.261-264.

71. Elad, Y. Biological control of foliar pathogens by means of Trichoderma harzianum and potential modes of action / Y. Elad // Crop Prot.Vol. 19.-P.709-714.

72. Friedrich, J. Mixed culture of Aspergillus awamori and Trichoderma reesei for bioconverstion of apple distillery waste / J. Friedrich, A. Cimerman, A. Perdin // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1987.-Vol.26.-P.299-303.

73. Ghisalberti, E.I. Antifungal Antibiotics produced by Trichoderma spp. / E.L. Ghisalberti, K. Sivasithamparam // Soil Biol.Biochem.-1991.-Vol.23.-Vol. 11,-P.1011-1020.

74. Ghisalberti, E.L. Variability among strains of Trichoderma harzianum in their ability to reduce take all and to produce pyrones/ E.L. Ghisalberti, M.J. Narbey, M.M. Dewan, K. Sivasithamparam // K.Plant and Soil.-1990.-V.121.-P.287-291.

75. Gourama , H. Inhibition of growth and aflatoxin production of Aspergillus flavus by Lactobacillus species / H. Gourama, B. Lloye // Bullerman Food Prot.-1995.-Vol.58.-P. 1249-1256.

76. Greene, R.E. Imaging findings in acute invasive pulmonary aspergillosis: clinical significance of the halo sign / R.E. Greene, H.T. Schlamm, J.W. Oestmann // Clin. Infect. Dis.-2007.- V.44.-P. 373-379.

77. Guo-Hong, L. Three new acoranesesquiterpenes from Trichoderma sp. YMF 1.02647 / L. Guo-Hong, Z. Yang, P. Zhao, X. Zheng, S. Luo, R. Sun, X. Niu, K. Zhang // Phytochem.Lett.-2010.-Vol.-73.-P. 168-170.

78. Hajieghrari, B. Effects of some Iranian Trichoderma isolates on maize seed germination and seedling vigor / B. Hajieghrari // African J. Biotechnol.-2010.-Vol.9.-P.4342-4347.

79. Halpin, D.M.G. Extrinsic allergic alveolitis and asthma in sawmill workers case report and review of the literature / D.M.G. Halpin, B.J. Graneek, M. Turner-Warwic, A.J. Taylor// Occup. Environ. Med.-1994.-Vol.51.-P.160-164.

80. Hanson, L.E. Elicitors of plant defense responses from biocontrol strains of Trichoderma virens / L.E. Hanson, C.R. Howell // Phytopathology.- 2004.-Vol.94.-P. 171-176.

81. Harman G.E. Changing Models for Commercialization and Implementation of Biocontrol in the developing and the developed world / G.E. Harman, M.A.Obregon, G.J. Samuels, M. Lorito// Plant dis.-2010.-Vol.5.-P.928-939.

82. Harman G.E. Combination of fungul cell degrading enzyme and fungul cell membrane affecting compound / G.E. Harman, M. Lorito, A. Di Pietro, C.K. Hayes, F. Scala, C.P. Kubicek // US Patent 6,512,166, issued Jan.28, 2003.

83. Harman G.E. Multifunctional fungal plant symbionts: new tools to enhance plant growth andproductivity / G.E. Harman // New Phytologist.-2011.Vol.189.P.647-649.

84. Harman, G.E Trichoderma and Gliocladium. / G.E. Harman, C.P. Kubicek // Taylor & Francis, London.-1998-278pages.

85. Harman, G.E. Biological control of Pythium species / G.E. Harman, Y. Hadar // Seed Sci.Technol.-1983.-Vol. 11.-P.893-906.

86. Harman, G.E. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp / G.E. Harman // Phytopathology.-2006. Vol.96.-P.190-194.

87. Harman, G.E. Trichoderma species-opportunistic, avirulent plant symbionts / G.E. Harman, C.R. Howell, A. Viterbo, I. Chet, M. Lorito // Nat. Rev. Microbiol.-2004.- № 2.-P.43-56.

88. Hesseltine, C.W. A millennium of fungi, food and fermentation / C.W. Hesseltine // Mycologia.-1965 .-Vol.57.-P. 149-197.

89. O.Howell, C.R. Antibiotic production by strains of Gliocladium virens and its relation to the biocontrol of cotton seedling diseases / C.R. Howell, R.D. Stipanovic, R.D. Lumsden // Biocontrol Science and Technology.-1993.-Vol.3.-P. 435-441.

90. Howell, C.R. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: the history and evolution of current concepts / C.R. Howell // Plant Dis.-2003.-Vol.87.-P.4-10.

91. Howell, C.R. The role of antibiosis in biocontrol / C.R. Howell, G.E.Harman, C.P. Kubicek in: (Eds.), Trichoderma and Gliocladium. Enzymes, Biological Control and Commercial Application, vol. 2. Taylor and Francis Ltd'. London.-1998.-P.173-183.

92. Howell, C.R. Understanding the mechanisms employed by Trichoderma virens to effect biological control of cotton diseases / C.R. Howell // Phytopathology.- 2006.-Vol.96.-P. 178-180.

93. Inbar, J. The role of recognition in the induction of specific chitinases during mycoparasitism by Trichoderma harzianum / J. Inbar, I. Chet // Microbiology.-1995.-Vol.141.-P. 2823-2829.

94. ISCH International Committee for Standardization in Hematology. British Journal of Haematology.-1967.-Vol. 13.- P.71-75.

95. Jagadisha, N. Use dimension of silk worm excreta in irrigated seri agro ecosystem and value addition for commercialization / N. Jagadisha // M.Sc.(Seri.) thesis, University of Agricultural Sciences, Bangalore, India.-2004.

96. JECFA Joint F AO/WHO Expert Committee on Food Additives. Specifications for Identity and Purity of Certain Food Additives.-1989. 35th session. Rome.

97. Jelinek, C.F.Worldwide occurrence of mycotoxins in foods and feeds-an update / C.F. Jelinek, A.E. Pohland, G.E. Wood // J. Assoc. Off. Anal. Chem.-1989.Vol.72.-P.223-230.

98. Karnataka, J. Response of Stevia rebaudiana to Biofertilizers / J. Karnataka // Agric. Sci.-2007.-Vol.20.-P.616-617.

99. Kholif, S.M. Effect of biological treatments of low qulity roughages on milk yield and composition Ph. D (Agr.Sc.), thesis, Ain Shams Univ. Egypt.-2001.

100. Kleifeld, O. Trichoderma harzianum interaction with plants and effects on growth response / O. Klefeld, I. Chet 11 Plant Soil.-1992.-Vol.144.-P. 267-272.

101. Konig, H.J. Diversity and Lignocellulolytic activities of cultured microorganisms. In: Intestinal microorganisms of termites and other inverterbrates / H.J. Konig, H.J. Frochlich, H. Hertel //Springer-Verlag, Berlin.-2006.P. 271-301.

102. Kredics L. Trichoderma Strains with Biocontrol Potential / L. Kredics, Z. Anta, L. Manczinger, A. Szekeres, F. Kevei, E. Nagy // Food Technol. Biotechnol. -2003. -№ 1.-Vol. 41.-P. 37-42.

103. Kubicek, C.P.G. Properties of a conidial-bouna celluiase enzyme system from Trichoderma reesei / C.P. G. Kubicek, M. Muhlbauer, M. Klotz, E. John, E.M. Kubicek-Pranz // J.Gen.Microbiol.-1988.-Vol. 134.-P. 1215-122.

104. Kucuk, C. In vitro antifungal activity of strains of Trichoderma harzianum / C. Kucuk, M. Kivanc // Turk. J. Biol.-2004.-Vol.28.-P.l 11-115.

105. Kuo, K. Germination of Phyllosticta ampelicida pycnidiospores: prerequisite of adhesion to the substratum and the relationship of substratum wettability // K. Kuo, H.C. Hoch//Fungal Genet. Biol.- 1996.Vol.20.-P. 18-29.

106. Larsen,K. (1972). Creatinine assay by a reaction-kinetic principle Clin. Chem. Acta. 41:209-217.

107. Lee, H.B. A new Hypocrea strain producing harzianum A cytotoxic to tumour cell lines / H.B. Lee, Y. Kim, H.Z. Jin, J.J. Lee, C.J. Kim, J.Y. Park, H.S. Jung // Letters in Applied Microbiology.-2005.Vol.40.-P.497-503.

108. Lo, C.T. Screening strains of Trichoderma spp for plant growth enhancement in Taiwan / C.T. Lo, C.Y. Lin // Plant Pathol. Bull.-2002.-Vol.l 1.-P.215-220.

109. Lorito, M. Synergistic interaction between cell wall degrading enzymes and membrane affecting compounds / M. Lorito, S.L.Woo, D. Ambrosio, M. Harman, G.E. Hayes, C.K. Kubicek, C.P. Scala // Molecular Plant-Microbe Interaction.-1996.- Vol.9.-P.206-213.

110. Lotan, T. Xylanase, a novel elicitor of pathogenesisrelated proteins in tobacco, uses a nonethylene pathway for induction. / T. Lotan, R. Fluhr // Plant Physiology.-1990.-Vol.93 .-P.811-817.

111. Luo J. Application of bioorganic fertilizer significantly affected fungal diversity of soils / J. Luo, W. Ran, J.Hu, X.M. Yang, Y.C. Xu, Q.R. Shen // Soil. Sci. Soc. Amer. J.-2010.Vol.74.-P. 2039-2048.J

112. Luo, Y. Root colonization of soybean cultivars in the field by Fusarium solani f. sp. glycines / Y. Luo, O. Myers, D.A. Lightfoot, M.E. Schmidt // Plant Dis.-1999.-Vol.83.-P.l 155-1159.

113. Lynch, J.M. Biological control systems / J.M. Lynch, N.E. Crook // Chemistry in Britain.-1992.-Vol.28.-P.42-45.

114. Madsem, A. M. Human exposure to airborne fungi from genera used as biocontrol agents in plant production / A.M. Madsem,V.M. Hansen, N.V. Meyling, M. Eilenberg // Ann. Agric. Environ. Med.-2007.-Vol.14-P. 5-24.

115. Miller, J.D. Mycotoxins in Grain: Compounds Other Than Aflatoxin / J.D. Miller, H.L.Trenholm // Eagan Press, USA.-1994.-P. 3-541.

116. Mishra B.K. Biocontrol efficacy of Trichoderma viride isolates against fungal plant pathogens causing disease in Vigna radiata L / B.K. Mishra, R.K. Mishra, R.C. Mishra, A.K. Tiwari, R.Singh // Appl. Sci. Res.- 2011.-Vol. 3.-P. 361-369.

117. Munoz, F.M. Trichoderma longibrachiatum infection in a pediatric patient with aplastic anemia / F.M. Munoz, G.J. Demmler, W.R. Travis, A.K. Ogden, S.N. Rossman, M.G. Rinaldi // J. Clinical Microbio.-1997.-Vol.35.P.499-503.

118. Muthumeenakshi, S. Genetic comparision of aggressive weed mould strains of Trichoderma harzianum from mushroom compost in North America and the British Isles / S. Muthumeenakshi, A.E. Brown, P.R. Mills // Mycological Research.-1998.-Vol.4.-P.385-390.

119. Papavizas, G.C. Trichoderma and Glicladium: Biology, ecology and potential for biocontrol / G.C. Papavizas // Ann.Rev.Phytopathol.1985.-Vol.23.-P.23-54.

120. Phuwapraisirisan, P. 9-epi-Viridiol, a novel cytotoxic furanosteroid from soil fungus Trichoderma virens / P. Phuwapraisirisan, J.Rangsan, P. Siripong, S. Tip-Pyang // Natural Product Research.-2006.-V.20.-P.1321-1325.

121. Prelusky, D.B. Toxicology of mycotoxins / D.B. Prelusky, R. Rotter, J.D. Miller, H.L.Trenholm // Mycotoxins in grains: Compounds Other Than Aflatoxins. Eagan press U.S.A. 1994-P. 359-403.

122. Reino, J.L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma / J.L. Reino, M. Guerrero, R.F. Hernández, R. Galán, I.G. Collado // Phytochemistry Reviews.-2008.-V. 89.-P. 115-137.

123. Reitman, S. Colourimeteric of serum transaminases / S. Reitman, S. Frankel // Am.J.Clin.Pathol.-1957.Vol.28.-P.56-62.

124. Rini, C.R. Usefulness of Trichoderma and Pseudomonas against Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum infecting tomato / C.R. Rini, K.K. Sulochana // J.Tropical Agriculture.-2007.-Vol.45.-P.21-28.

125. Rosmarie, F.A. Oak Ridge National Laboratory, Chemical Hazard Evaluation Group. Toxicity Summary for Pyrene. Oak Ridge, TN:1993.

126. Samuels G.J. Trichoderma A review of biology and systematic of the genus / G.J. Samuels // Mycol. Res. 2000.-Vol.l00.-P.923-935.

127. Schuster A. Biology and biotechnology of Trichoderma / A. Schuster, M. Schmoll // Appl Microbiol Biotechnol.-2010.-Vol.87.-P.787-799. 163.Scott, P.M. Methods of analysis for ochratoxin A / P.M. Scott // Adv. Exp. Med. Biol.-2002.-Vol.504-P. 117-134.

128. Shoman, T.M. Studies on Cytogenetic Changes in Rats Fed Biologically Treated Diets / T.M. Shoman, M. Fadel // Global Veterinaria.-2011.-V0I.6.-P.IOI-105.

129. Siddiqui, Z.A. Effects of soil inoculants on the growth, transpiration and wilt disease of chickpea / Z.A. Siddiqui, L.P. Singh // J. Plant. Dis. Protect.-2004.-Vol. 111.-P.151—157.

130. Sivasithamparam, K. Secondary metabolism in Trichoderma and Gliocladium / K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti // In: Harman, G.E., Kubicek, C.P. (Eds.), Trichoderma and Gliocladium.-1998.- Vol. 1. Taylor and Francis Ltd., London,-P. 139-191.

131. Stacey, G. Plant Microbe Interactions / G.Stacey, N.T. Keen // APS.-1999.-Vol. 4. APS Press, St. Paul.

132. Sun, Y. A new cyclotetrapeptide from marine fungus Trichoderma reesei / Y. Sun, L.Tian, Y.F. Huang, Y. Sha, Y.H. Pei // Pharmazie.-2006.-Vol.61.-P. 809810.

133. TambuwaI, F.M. Haematological and biochemical values of apparently healthy red sokoto goats / F.M.Tambuwal, B.M. Agale,A. Bangana // Proceeding of the 27th Annual conference, Nigerian Society of Animal Production held at FUTA, Nigeria.-2002.-P.50-53.

134. Thanaboripat, D. Importance of aflatoxins / D. Thanaboripat // Science J.-2002.-Vol.2.-P. 38-45.

135. Tietz, N.M. Textbook of clinical chemistry / N.M. Tietz // W.B. saunders Co. 1983.-244c.

136. TiIak, K.V. Bacterial fertilizers / K.V. Tilak // Indian Council of Agricultural Research, New Delhi.-1991.

137. Tokimoto, K. Effect of the physical properties of Lentinula edodes bedlogs on fruiting body production / K. Tokimoto, M. Fukuda, M. Tsuboi // Mycoscience.-1998.-Vol.39.-P.217-219.

138. Uraguchi, K. Toxicology: biochemistry and pathology of mycotoxins / K. Uraguchi, M. Yamazaki // Halsted press, Japan.-1978.P. 1-278.

139. Van Loon, L.C. Systemic resistance induced by rhizobacteria / L.C. Van Loon, P.A. Bakker, C.M. Pieterse // Annual Review of Phytopathology.-1998.-Vol.36.P. 453—483.

140. Van Rensburg, S.J. Hepatocellular carcinoma and dietary aflatoxin in Mozambique and Transkei / S.J.Van Rensburg, P.Cook-Mozaffari, V.Schalkwyk // Br J. Cancer.-1985.-Vol.51.-P.713-726.

141. Verma, M. Antagonistic fungi Trichoderma spp: Panoply of biological control / M. Verma, S.K. Brar, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R.Valero // Biochem. Eng. J. -2007.-Vol.37.-P. 1-20.

142. Vinale, F. Trichoderma-p\ant-pa.thogQn interactions / F.Vinale, K. Sivasithamparam, E.L. Ghisalberti, R. Marra, M.J. Barbetti, H. Li, S.L. Woo, M. Lorito // Soil Boil. Biochem.-2008a.-№ 40.-P.1-10.

143. Vinale, F. Harzianic acid, an antifungal and plant growth promoting metabolite from Trichoderma harzianum / F. Vinale, G. Flematti, K. Sivasithamparam, M. Lorito, M. Marra, R.Skelton, E.L. Ghisalberti // J.Natural Product.2009.-Vol. 72.-P.2032-2035.

144. Vinutha, T. Biochemical Studies on Ocimum sp. inoculated with microbial inoculants / T. Vinutha // M.Sc,(Agri.) thesis, University of Agricultural Sciences, Bangalore, India.-2005.

145. Walker, R. Risk assessment of ochratoxin: current views of the European Scientific Committee on Food, the JECFA and the Codex Committee on Food Additives and Contaminants / R. Walker // Adv.Exp. Med. Biol.-2002.Vol.504.-P. 249-255.

146. Weaver M. Fitness, persistence, and responsiveness of a genetically engineered strain of Trichoderma virens in soil mesocosms / M. Weaver, E. Vedenyapina, C.M. Kenerley // Applied Soil Ecology. 2005.

147. WHO (world healt organization) Technical Report series 25S. Expert Committee on Medical Assessment of Nutritional Status. WHO Geneva. Church Hill Ltd. London, 1963.

148. Windham, M.T. A mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp / M.T. Windham, Y. Elad, R. Barker // Phytopathology.- 1986.-Vol.76.-P.518-521.

149. Woo, S.L.The molecular biology of the interactions between Trichoderma spp., phytopathogenic fungi, and plants / S.L. Woo, F. Scala, M. Ruocco, M. Lorito//Phytopathology.-2006.-Vol.96.-P. 181-185.

150. Yedidia, I. Induction of defence responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum / I. Yedidia, N. Benhamou, I. Chet // Applied Environmental Microbiology.-1999.-Vol.65.-P.1061-1070.

151. Y~i, S.Trichodermatides A-D, novel polyketides from the marine-derived fungus Trichodermareesei / S. Yi, L. Tian, J. Huang, H. Ma, Z. Zheng, A. Lavi, K. Yasukawa, Y. Pei // Org. Lett.-2008.-V.10.-P.393-396.

152. Zhang, B.Q. Pathogenicity of Pythium populations from cornesoybean rotation fields / B.Q. Zhang, X.B. Yang // Plant Dis.-2000.-Vol.84.-P.'

Информация о работе

Атеф Абдельмохсен Абдельрахман Ахмед
кандидата биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Влияние Trichoderma почв Египта и Республики Татарстан на отдельные параметры живых систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы