Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Направленный скрининг бактерий-антагонистов фитопатогенной микрофлоры

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Направленный скрининг бактерий-антагонистов фитопатогенной микрофлоры"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

РГ6 ОД

На правах рукбписи

2 * НОВ -о97 М

Козловская Наталия Владимировна

НАПРАВЛЕННЫЙ СКРИНИНГ БАКТЕРИЙ - АНТАГОНИСТОВ ФИТОПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санкт-Петербург« Государственной Химико-Фармацевтической Академии

Научный руководитель:

доктор биологических наук Е.П.Яко)

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор В.И.Суха|

кандидат биологических наук СКС.Кузш

Ведущее учреждение -

Санкт-Петербургская Государственная Академия Холода и Пищевых Технологий.

Защита состоится " 1997 г в^'^часов на заседа

специализированного совета iC084.63.0l при СПХФА (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СПХФА

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь специализированного cyeema.jp

кандидат биологических наук ' Н.В.Кирилл

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Борьбу с болезнями растений вели, до недавнего времени, с помощью химических препаратов - пестицидов. Но их длительное применение приводит к загрязнению окружающей среды, оказывает отрицательное действие на человека, теплокровных животных и связано с большими денежными затратами.

Повсеместное вынужденное снижение количества и частоты применения пестицидов заставляет искать альтернативные пути контроля развития патогенеза сельскохозяйственной продукции при ее выращивании и хранении.

В настоящее время исследователи во многих странах мира уделяют большое внимание поиску и изучению микроорганизмов с антагонистическими свойствами и созданию на их основе биопрепаратов как альтернативы применению химических средств защиты растений.

Поиск антагонистов фитопатогенов и синтезируемых ими активных метаболитов (в том числе и антибиотиков) ведется среди различных групп микроорганизмов - Bacillus, Enterobacter, Flavobacterium, Streptomyces и др. Многочисленными исследователями в области изучения антагонизма было отмечено, что одной из наиболее перспективных групп бактерий, подавляющих рост и развитие фитопатогенной микрофлоры являются бактерии рода Pseudomonas. Штаммы бактерий этого рода доступны, легко культивируются, не требуют специальных сложных сред, препараты на их основе дешевы и просты в изготовлении.

В то же время бактерии рода Mycobacterium в этом отношении остаются практически неизучеными. Хотя имеются единичные сведения об их способности к синтезу антибиотиков, проявляющих активность в отношении фитопатогенов. Поэтому микобактерии тоже могут представлять интерес в

1

плане создания на их основе препаратов для борьбы с вредителями растени и сельскохозяйственной продукции.

Псевдомонады используются для защиты растений и сельскохозяйственно продукции довольно давно, однако сведения об их применении для защит овощной продукции, и в частности картофеля, в послеуборочный период литературе крайне ограничены. В настоящее время практически не выделе! эффективных штаммов - антагонистов в отношении фитопатогенов картофел

В связи с этим, работа по поиску биологических средств защиты да снижения потерь картофеля от заболеваний микробного характера во вред длительного хранения является весьма актуальной.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена поиску бакгер! - антагонистов фитопатогенной микрофлоры среди неспорообразующ] бактерий родов Pseudomonas и Mycobacterium и выявлению среди hi продуцентов антифунгальных антибиотиков. В соответствии с цель исследования в работе были поставлены следующие задачи:

I

- выделить из природных субстратов при использовании селективш методов интересующие виды бактерий;

- провести первичную оценку принадлежности вновь выделенных культ к родам Pseudomonas и Mycobacterium;

- изучить антибиотические свойства выделенных штаммов бактери Отобрать наиболее активный продуцент ангифунгального антибиотика;

- оптимизировать условия культивирования отобранного продуцента;

- исследовать возможность применения отобранных активных штаммов д защиты картофеля, закладываемого на длительное хранение.

Научная новизна работы. Установлено, что быстрорастущие сапрофитш микобактерии проявляют высокую антагонистическую активность отношении фитопатогенной микрофлоры.

2

Среди них выявлен продуцент антифунгального антибиотика -Mycobacterium smegmatis игг. 12.

Показано, что культура М.smegmatis шт.12 обладает как противогрибковой, так и антибактериальной активностью с преимущественным действием в отношении фитопатогенных грибов.

Установлено, что культура показывает высокий защитный эффект при длительном хранении картофеля и не проникает через покровные ткани клубней.

Научно-практическая значимость работы. Выявлены активные штаммы бактерий антагонистов, принадлежащих к родам Pseudomonas и Mycobacterium, рекомендованные для приготовления биопрепаратов для защиты картофеля от поражения заболеваниями микробного характера при длительном хранении.

Показано, что перспективным источником новых продуцентов антифунгальных антибиотиков являются культуры рода Mycobacterium.

Изучены закономерности процесса культивирования продуцента антибиотика широкого спектра действия - M.smegmatis шт.12. В результате уровень его антибиотической активности увеличен в 2 раза по сравнению с активностью в исходных условиях выращивания.

Защитный эффект биопрепарата из культуры M.smegmatis шт.12 подтвержден в опытах in vivo.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи и тезисы.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на Всероссийской научной конференции "Химия и технология лекарственных веществ" (Санкт-Петербург, 1994 г.), Втором Всероссийском совещании "Техника и технология пищевых производств" (СПб, 1994 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора

з

литературы, экспериментальной части, выводов, списка литературы приложений. Работа изложена на 135 страницах машинописного текст содержит 29 таблиц и 10 рисунков. Библиография включает 163 источни: литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Направленный скрининг антагонистов фитопатогенной микрофло{ проводили среди неспорообразующих грамотрицательных бактерий рода Pse domonas и грамположительных - рода Mycobacterium, выделенных : природных субстратов, а также полученных из рабочей коллекции кафед{ биотехнологии СПХФА.

Для выделения бактерий использовали природные образцы, собранные различных экологических нишах (кожура картофеля и моркови, садовые полевые почвы).

Для направленного выделения бактерий из природных образцов и : культивирования использовали различные по составу агаризованные и жидк питательные среды.

В экспериментах использовали различные селективные агент полимиксин В, ампициллин, бензилпенициллин, эритромици амфоглюкамин, катапол, бриллиантовый зеленый, малахитовый зелены NaOH.

Таксономическую идентификацию почвенных бактерий проводили использованием методов и схем, предложенных в определителе бактерий Бер (1980) и в монографиях ОА.Нестеренко и В.В.Смирнова (1982,1985,1990),

Антибиотические свойства активных почвенных культур, выявленш методом агаровых блоков, затем анализировали после культивирования ю глубинных условиях на различных по составу жвдких ферментационных сред«

Антибиотическую активность бактерий определяли на 4 сутки сультивирования в нативных растворах и в ацетоновых экстрактах из биомассы i нативного раствора методами диффузии в агар и двукратных серийных разведений в отношении фитопатогенных тест-грибов: Botrytis cinerea, Alter-laria radicina, Fusarium solani, Rhizoctonia solani и фитопатогенной бактерии Siwinia carotovora.

При оптимизации ферментационной среды для биосинтеза антибиотика сультурой Mycobacterium smegmatis шт. 12 использовали схемы ортогональных гатинских прямоугольников, предложенные В.В.Бирюковым (1985). За основу 1ри оптимизации была принята минеральная среда, содержащая глюкозу.

Изучение хроматографической подвижности антибиотиков из клеток и ттивного раствора культуры M.smegmatis шт. 12 проводили методом ТСХ в ¡истеме метанол-хлороформ-аммиак.

Статистический анализ результатов проводили с помощью методов, федложснных И.П.Ашмариным и соавторами (1975), путем вычисления средней фифметичсской величины и доверительного интервала с достоверностью не тенее 95%.

Результаты, приведенные в работе, представляют собой среднестатистические [анные, полученные не менее чем из 3 - 5 параллельных экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выделение и первичная оценка принадлежности культур к родам Pseudomonas и Mycobacterium

Наиболее перспективными антагонистами фитопатогенов среди юевдомонад являются культуры видов P.aeruginosa, P.fluorescens, P.aurantiaca, '.au re о facie ns, Comamonas acidovorans, P.cepacia. Поиск антагонистов жтопатогенов среди бактерий рода Pseudomonas проводили, направленно

5

выделяя культуры, принадлежащие к перечисленным видам.

Способы выделения псевдомонад - антагонистов фитопатогенов основа} на различной чувствительности бактерий, а также сопутствующей микрофлор к селективным агентам и их сочетаниям. В таблице 1 суммированы данш по селективному выделению грамотрицательных культур различны;» способами.

ТаблицI

Выделение грамотрицательных бактерий из природных субстратов на агаризованных средах с различными селективными агентами

Сочетание селективных агентов Количество отобранных грамотрицательных культур

Всего Из них активных

кол-во в % кол-во в %

1 способ: Полимиксин+ бриллиантовый зеленый 42 31,3 16 38,1

II способ: Полимиксин+ бриллиантовый зеленый+ катапол 25 18,7 6 24,0

III способ: Бензилпенициллин+ эритромицинн- бриллиантовый зеленый 43 32,0 31 72,1

IV способ: Ампициллин+ бриллиантовый зеленый 24 18,0 5 20,8

Всего: 134 100 58 43,3

Из таблицы 1 видно, что наибольшее количество грамотрицательш культур изолировано при использовании 1 и 3 способов выделения (пример] по 32% от общего числа выделенных штаммов).

Наиболее результативным оказался способ с применением жидкой сред]

б

: бензилпенициллином, бриллиантовым зеленым и амфоглюкамином для 1редварительной инкубации почвенных образцов с последующим посевом к на ашризованную среду с эритромицином (3 способ). При этом выделялось 1аибольшее количество культур, активных в отношении фитопатогенов - 72%. Сочетание этих селективных агентов приводит к выделению наиболее герспекгивных видов псевдомонад - антагонистов флюоресцирующей группы, юзможно также выделение и нефлюоресцирующих видов - P.stutzeri, Domamonas acidovorans.

Всего в результате направленного выделения изолировано 134 штамма рамотрицательных аспорогенных бактерий, 43% из которых активны в ггношении фитопатогенной микрофлоры.

При проведении первичной оценки принадлежности выделенных культур 'становлено, что наиболее активные штаммы принадлежат к видам '.aeruginosa, P.aurantiaca, P.aureofaciens, P.fluorescens, С.acidovorans, \mendocina.

Сапрофитные быстрорастущие микобактерии наиболее эффективно ¡ыделяются при использовании щелочной обработки субстратов. При [рименении данного способа изолирования грампозитивные [еспорообразующие бактерии составили 56% от общего числа выделенных ультур.

Эти культуры обладали свойством кислотоустойчивости, у них выявлено [аличие полиморфизма, цикла развития "кокк - палочка - кокк". Все они |бладали признаками и свойствами, аналогичными свойствам штамма Му-obacterium smegmatis шт. 12, который был выделен ранее, идентифицирован ак микобактерия и был взят нами в качестве культуры сравнения. Все это озволило не проводить дальнейшую идентификацию бактерий и отнести

х, на основании вышеуказанных признаков, к роду Mycobacterium.

7

2. Выявление наиболее перспективных антагонистов фитопатогенов среди выделенных и коллекционных культур

С целью эффективного поиска антагонистов фитопатогенов был разработан комплексный подход к тестированию большого числа культур, который заключается в использовании оптимальных питательных сред для культивирования микроорганизмов, способа определения активности и рациональном выборе тест-культуры.

Для массового скрининга активных штаммов оказался наиболее эффективным метод агаровых блоков (для дальнейших исследований были выбраны методы диффузии в агар и двукратных серийных разведений).

Установлено, что из восьми исследованных сред только соево-глюкозная среда способствовала максимальному проявлению антагонизма у микобактерий, а кукурузная - у псевдомонад. Эти агаризованные среды мы использовали для первичного выявления антагонистической активности почвенных бактерий.

Для поиска антагонистов фитопатогенов картофеля нами был выбран в качестве тест-культуры гриб Fusarium solani, который дает четкие зоны задержки роста и возможность получения результатов на 2 сутки культивирования, тогда как грибы AJternaria radicina, Botrytis cinerea -на 4-5 сутки, а Rhizoctonia solani - только на 10-14 сутки. Тест-культура F.solani рекомендована нами для первичного скрининга антагонистических культур в качестве основной.

После проведения первичной проверки биологической активности у выделенных и коллекционных культур нами был отобран ряд наиболее

перспективных штаммов псевдомонад и микобактерий для дальнейшего

изучения их способности к проявлению антагонизма при глубинном культивировании.

3. Изучение активности отобранных штаммов при глубинном культивировании При культивировании в глубинных условиях все отобранные штаммы псевдомонад, за исключением штамма 8/3, проявили активность в отношении тест-гриба Р.зо1аш, но максимальная активность была отмечена у трех штаммов - 115/40, 35/67, 38/67 (таблица 2). Таблща 2

Антифунгальная активность исследуемых культур (метод диффузии в агар)

Штаммы Зоны подавления роста Р.5о1аш*, мм

Р.вресле.«; шт.8/3 0

шт.30/40 12,0+0,2

шт.73/40 15,0+0,2

шт.78/40 11,0+0,1

шт. 115/40 35,0+0,4

шт. 35/67 35,0+0,4

шт.38/67 35,0+0,3

М.БреаеБ шт.2/4 0

шт. 5/4 0

шт. 15/4 0

шт.67 11,0+0,8

шт.202 18,7+0,4

М^п^таШ шт.12 13,3+0,4

Примечание: * - зона задержки роста тест-гриба в случаи штаммов 35/67 и 38/67 была образована ростом клеток бактерий.

Культуры микобактерий М.ярссюз шт.67 и шт.202 и М-Бл^та^ шт. 12 также обладали антагонистическим действием в отношении Р.Бо]аш (таблица 2).

Наиболее существенным фактором, влияющим на способность образования антибиотиков, является состав посевной и ферментационной сред. Для

штаммов псевдомонад было установлено, что наибольшую антибиотичес, активность они проявляют при использовании в качестве посевной ферментационной кукурузной среды.

Штаммы микобактерий образовывали максимальное количест антибиотика при культивировании на ферментационной среде, содержащ кукурузный экстракт, глюкозу, крахмал, БВК и лактозу, и подращиван] на соево-глюкозной среде. Эти среды рекомендованы нами для глубинно культивирования отобранных активных штаммов.

Среди них интерес представляли штаммы, обладающие широким спектр< антагонистической активности в отношении фитопатогенов. Поэто1 дальнейшую проверку активности отобранных бактерий проводили ' отношении более широкого набора тест-организмов (таблица 3).

Таблиц,

Антибиотическая активность отобранных штаммов в отношении широкого спектра фитопатогенов (метод диффузии в агар)

Зоны подавления роста тест-организмов, мм

Штаммы Гиктиге 5о1аш Воиугк стегеа АИетапа гасЦста ЮйгосЮша БсЯаш Епшиа сагоижн

Р-Бреаеб1 шт.73/40 ' шт.115/40 шт.35/67 шт.38/67 16,0+0,5 16,0+0,1 8,0+0,1 8,3+0,4 12,7+0,4 12,7+0,3 0 10,3+0,4 0 24,0+0,4 0 0 14,2+0,2 22,0+0,1 0 0 10,0+0,{ 11,8+0,: 11,7+0,4 ю.з+о,:

М.феаез шт.67 цгг.202 М-Бт^тайк нгг.12 21,7+0,4 19,0+0,8 17,0+0,8 15,0+0,8 22,3+0,7 20,0+0,9 0 11,3+0,2 16,3+0,5 17,0+0,8 17,7+0,7 18,6+0,8 15,7+0,7 21,5+0,4 20,5+0,4

Культурами, обладающими антибиотическими свойствами в отношен! всех предложенных патогенов, оказались штаммы микобактерий 12 и 202 культура Р.Бреаез шт.115/40. Причем М-втевша^ шт.12, в отличие от друп

бактерий, показал активность примерно одного уровня для всех тест-организмов.

Известно, что многие бактериальные изоляты, обладавшие высокими показателями активности в опытах in vitro, теряли или, по каким-либо причинам, не проявляли активность в опытах in vivo.

Поэтому дальнейшие исследования активности отобранных штаммов провели в модельных опытах in vivo. С этой целью закладываемый на длительное холодильное хранение картофель был обработан культуральными жидкостями исследуемых культур. В результате установлено, что все штаммы проявили активность в отношении патогенов и сопутствовали лучшей сохранности картофеля. Наибольшая сохранность наблюдалась при обработке клубней культуральной жидкостью M.smegmatis шт. 12 - 93,4%, что на 20% больше, чем в контроле. Контролем служил необработанный картофель.

В связи с этим, дальнейшие исследования были посвящены более подробному изучению культуры M.smegmatis шт. 12 и синтезируемого ею антибиотика.

4, Изучение условий биосинтеза антибиотика культурой M.smegmatis шт. 12

Одним из наиболее существенных факторов, регулирующих процесс биосинтеза антибиотиков, является состав питательной среды. В связи с этим, оптимизацию процесса биосинтеза начали с определения оптимального состава и концентраций компонентов ферментационной среды. Новая среда должна содержать более дешевое сырье по сравнению с исходной, не должна уменьшать активность продуцируемого антибиотика, или увеличивать ее. В данном случае, антибиотик должен, в основном, находиться в нативном

и

растворе, так как в опытах in vivo используется культуральная жидкость ил нативный раствор продуцента (антибиотик из биомассы извлекается ацстоно? присутствие которого в препаратах, используемых для обработки пшцевь продуктов, недопустимо).

С целью интенсификации процесса биосинтеза антибиотика оптимизащ' ферментационной среды проведена с использованием метода математическо1 планирования эксперимента в три этапа по схемам: 5x5, 3x3 и отдельно для фактора на 5 уровнях.

Данные зависимости эффектов антибиотической активности нативно1 раствора от концентрации компонентов (таблица 4) позволили определю оптимальный состав ферментационной среды.

Таблица

Значения эффектов для заданных уровней факторов

Факторы Концентрация, эффект Уровни

1 2 3 4 5

I этап

Глюкоза % Э 1 -20,4 1,5 -3,6 2 -2,3 2,5 +3,1 3 +23,2

KNOj % э 0 -18,5 0,25 +2,5 0,5 +14,6 0,75 -1,0 1 +2,3

II этап

Молочная сыворотка % э 10 -30,2 12,5 +65,8 15 -33,8

Кукурузный экстракт % э 0,15 +17,8 0,2 +22,4 0,25 -39,1

111 этап

Кукурузная мука % э 4 -7,1 5 -3,6 6 +12,4 7 + 11,9 8 +12,8

Примечание: Э - эффект рассчитан по значениям активности нативного раствора штЛ 2.

Для развития инокулюма наиболее благоприятной оказалась кукурузна среда, на которой посевная культура отличалась наибольшей продуктивность» Внесение в ферментационную среду 1.0 об. % инокулюма позволяет достиг

максимального выхода антибиотика.

В следующей серии опытов было исследовано влияние на биосинтез эсновных технологических параметров процесса.

Показано, что оптимальными для биосинтеза являются: исходный pH ферментационной среды в пределах 6.3-6.7. культивирование продуцента в объеме среды 100 мл. обеспечивающем необходимую интенсивность аэрации, i течение 24 часов. Оптимизация условий культивирования позволила в четыре эаза сократить период ферментации, который в исходных условиях составлял )6 часов.

В результате оптимизации процесса биосинтеза антибиотическая наивность нативного раствора возросла в 2 раза в отношении грибной тест-сультуры Fusarium solani и в 32 раза - бактериальной тест-культуры Erwinia ¡arotovora; выход биомассы, увеличился в 2,6 раза (таблица 5).

Таблица 5

Эффективность оптимизации биосинтеза антибиотика штаммом 12

Показатели биосинтеза

Вариант Активность нативного раствора в отношении тест-культур, Ед.разв./мл Выход сухой биомассы, г/л

F.solani E.carotovora

Исходный 40 - 80 80 - 160 24,1 ±0,2

Оптимизированный 80 - 160 2560 - 5120 62,3+0,8

Сравнение ингибиторной активности нативных растворов в отношении аирокого набора тест-культур показало, что нативный раствор цгг.12 обладает нтибиотической активностью не только в отношении фитопатогенов, но и актерий кишечной группы. Причем, в оптимизированных условиях спектр нтибактериального действия шире (таблица 6).

Таблица 6

Антибиотическая активность нативного раствора шт.12, полученного при различных условиях ферментации в отношении широкого спектра тест-культур

Вариант Зоны задержки роста тест-культур, мм

Нватт гоШ ЯЫгоаогш 5о1аа1 АНетапа гайкта ВоИуй! сшегеа Егтта сапМотога ЕсЬепсЫа соЦ ап.60 Рпйеш пгг.247 ЮеЬ&еИа рпеишаше шт.122

Исходный 16,50 ±0,4 18,63 ±0,5 16,25 ±0,8 20,0 ±0,8 11,0 ±0,3 7,70 ±0,4 8,50 ±0,4 0

Оптимизированный 16,0 ±0,2 22,50 ±0,9 17,50 ±0,6 19,50 ±0,8 20,0 ±0,1 15,25 ±0,4 8,25 ±0,8 8,75 ±0,3

5. Изучение закономерностей процесса ферментации антибиотика в

оптимизированных условиях С целью определения основных закономерностей процесса образования антибиотика мы изучали динамику биохимических изменений при оптимизированных условиях биосинтеза (рис.1).

Максимальное количество биомассы продуцента наблюдали через 48 часов роста, после чего наступал быстрый лизис культуры. Возможно, лизис культуры происходит вследствие воздействия на клетки больших концентраций собственного антибиотика, так как лизис сопровождается значительным увеличением уровня активности в нативном растворе и понижением его в ацетоновом экстракте из биомассы. Эти изменения обусловлены выходом антибиотика из лизированных клеток в среду. По-видимому, антибиотики из ацетоновых экстрактов биомассы и нативного раствора очень близки по строению или идентичны.

Максимальное антибиотикообразование наблюдалось при рН равном 7,0. При уменьшении рН до 6,1 через 48 часов ферментации уровень

14

антибиотической активности в ацетоновом экстракте из нативного раствора резко снижался. Очевидно, при увеличении кислотности среды антибиотик переходит в менее активную форму.

Синтез антибиотика при культивировании продуцента в оптимизированных условиях происходит параллельно с ростом клеток культуры.

6. Оценка эффективности применения бактериальных препаратов из активных штаммов культур Pseudomonas и Mycobacterium в опытах in vivo

Завершающим этапом работы было исследование возможности применения отобранных активных штаммов Pseudomonas и Mycobacterium и синтезируемых ими антибиотических веществ в качестве агентов, контролирующих развитие грибной инфекции на картофеле в процессе его хранения.

Данные исследования проводили совместно с сотрудниками СПбГА холода и пищевых технологий.

С целью выбора оптимального способа обработки клубни картофеля, предварительно зараженные мицелием Fusarium solani, опрыскивали культуральной жидкостью, нативным раствором и спиртовым экстрактом из биомассы культуры M.smegmatis шт.12. Контролем служили клубни, зараженные F.solani, но необработанные препаратами из культуры Mycobacterium. Клубни хранили в течение месяца.

В результате эксперимента было установлено, что лучшим способом обработки картофеля является использование культуральной жидкости продуцента. Обработанный ею картофель полностью предохранялся от заболевания (таблица 7).

Таблица 7

Заболеваемость клубней картофеля в зависимости от обработки их препаратом из М^п^та^ шт.12

Пробы Количество заболевших клубней, %

Кущдуралыгая жидкость 0

Нагивный раствор 20

Экстракт антибиотика 40

Контроль 50

Таким образом, в промышленных масштабах для обработки картофеля лучше использовать культуральную жидкость антагониста.

Для определения числа клеток антагонистов на поверхности клубней в процессе хранения использовали модифицированный метод Коха. Количество клеток всех исследованных штаммов на поверхности картофеля в период его хранения постепенно снижается. Кроме того, было установлено, что культуры бактерий псевдомонад шт.73/40 и шт.115/40. микобакгерий шт.12 и шт.67 не проникают через покровные ткани клубня, а культуры P.species шт.35/67 и M.species шт.202 проникают внутрь клубня и, поэтому, не могут быть рекомендованы для практического использования.

При апробации активных штаммов Pseudomonas и Mycobacterium на опытной станции ВИРа культуры P.species шт.73/40 и шт. 115/40. M.species шт.67 и M.smegmatis шт.12 показали высокий защитный эффект при длительном хранении картофеля. При обработке препаратами из штаммов псевдомонад количество пораженных клубней после 8 месяцев хранения было меньше, чем в контроле на 18-22%.

Обработка картофеля культуральными жидкостями M.smegmatis шт.12

и M.species шт.67 увеличивает его сохранность на 24% по сравнению контролем.

Эти культуры могут быть рекомендованы для применения в промышленш масштабах для обработки картофеля при закладке его на длительн< холодильное хранение.

ВЫВОДЫ

1. С использованием селективных методов выделено из природш субстратов 134 штамма грамотрицательных неспорообразующих бактерий ро, Pseudomonas. Установлено, что из них 43,3% культур обладав антагонистической активностью в отношении фитопатогеннь

-/ микроорганизмов. Также выделено 9 штаммов грамположительнь неспорообразующих бактерий рода Mycobacterium, обладающ! антагонистической активностью.

2. Предложен комплексный подход к оценке противогрибковой активное бактериальных культур при массовом скрининге среди них продуцент« антибиотиков. Он заключается в использовании оптимальных питательш сред для выявления способности бактерий проявлять анташнистичесю свойства, способа определения биологической активности и рационально: набора тест-культур.

3. Установлено, что непатогенная культура Mycobacterium smegmatis шт. обладает как противогрибковой, так и антибактериальной активностью преимущественным действием в отношении фитопатогенных грибов. Культу] также обладает антибиотической активностью в отношении бактер*

кишечной группы.

4. Показано, что антифунгальной активностью обладает антибиотик, содержащийся как в биомассе продуцента, так и в нативном растворе при выращивании культуры M.smegmatis шт.12 на кукурузно-крахмальной среде. В результате оптимизации условий биосинтеза антибиотика удешевлена ферментационная среда и упрощен ее состав, а антибиотическая активность возросла в два раза по сравнению с исходным уровнем.

5. Показано, что культура M.smegmatis шт.12 проявляет антифунгальное действие в модельных опытах in vivo, обеспечивая защитный эффект от типичных возбудителей заболеваний картофеля и может быть рекомендована для применения в промышленных масштабах для обработки картофеля при закладке его на длительное хранение. Установлено, что при обработке клубней культуральной жидкостью M.smegmatis шт.12 бактерии не проникают через покровные ткани и количество клеток на поверхности картофеля в процессе его хранения снижается.

6. Показано, что при обработке картофеля на опытной станции ВЙРа биопрепаратами из активных штаммов Pseudomonas (шт.73/40 и 115/40) и Mycobacterium (шт.67 и шт.12) его сохранность при длительном холодильном хранении увеличивается на 20% по сравнению с контрольными условиями.

Автор выражает благодарность сотрудникам СПбГАХПТ Колодязной B.C., Смирновой Н.В., Кипрушкиной Е.И. за помощь во внедрении результатов исследований.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Козловская Н.В., Обгольцева И.О., Яковлева Е.П., Колодязная В Кипрушкина Е.И. Роль бактерий - антагонистов в устойчивости картофел) фитопатогенам при длительном хранении//Теория и практика применен искусственного холода в пищевых отраслях: Межвуз.сб.науч.тр.- СП СПбТИХП, 1993. - С.26-33.

2. Козловская Н.В., Обгольцева И.О., Яковлева Е.П. Скрининг антагонист фитопатогенов среди нокардиоформных бакгерий//Матсриалы Всероссийск науч.конф. "Химия и технология лекарственных веществ" СПб.: СПХФ 1994. - С.19.

3. Козловская Н.В., Обгольцева И.О., Яковлева Е.П., Смирнова Н. Колодязная В. С. Исследование антагонистических свойств нокардиоформн культур в отношении фитопатогенов картофеля в модельных опытах in vitix in у1уо//Перспективные технологии холодильной обработки и хранения галдев продуктов: Межвуз.сб.науч.тр.- СПб.: СПбГАХПТ, 1994. - С.77-83.