Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения

Акимова, Елена Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения"

На правах рукописи

Акимова Елена Евгеньевна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. В-6798 НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ И ВЫСШИЕ РАСТЕНИЯ

03 00 16 - Экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2007

003162291

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии ГОУ ВПО «Томский государственный университет»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Евгений Васильевич Евдокий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Большаков Михаил Алексеевич, кафедра физиологии человека и животных, ГОУ ВПО «Томский государственный университет»

доктор биологических наук, профессор Штерншис Маргарита Владимировна, кафедра биологической защиты растений, ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Ведущая организация Институт биофизики СО РАН

Защита диссертации состоится «2» ноября 2007 г в 12 час на заседании диссертационного совета Д 212 267 10 при ГОУ ВПО «Томский государственный университет» по адресу 634050. г Томск, пр Ленина, 36

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Томский государственный университет»

Автореферат разослан октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е Ю. Просекина

Актуальность работы. В последнее время большое внимание уделяется развитию экологических методов борьбы с заболеваниями культурных растений, которые рассматриваются как альтернатива химическим (Сорокина и др , 1999, Штерншис и др , 2000) По сравнению с химическими средствами защиты биопрепараты отличаются экологической безопасностью, избирательностью действия, их применение не нарушает взаимосвязи между элементами агроэкосистемы и не вызывает резистентности у фитопатоген-ных микроорганизмов. В связи с этим проблема поиска высокоактивных, конкурентоспособных, технологичных штаммов микроорганизмов-антагонистов и разработки на их основе биопрепаратов с широким спектром полезного действия является весьма актуальной (Соколов, 1990, Воронин, 1998, Романовская и др , 2002)

Бактерии Pseudomonas sp В-6798 обладают выраженным ризосферным эффектом, несмотря на то, что были получены с помощью автоселекции и скрининга к повышенным концентрациям формальдегида, который является одним из наиболее токсичных отходов ряда химических производств Благодаря возможности использования формальдегида в качестве единственного источника углерода и энергии, являющегося одновременно стерилизатором питательной среды, производство биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas sp. В-6798 по сравнению с известными аналогами будет отличаться высокой технологичностью, уменьшением энергоемкости, соответственно уменьшением загрязнения окружающей среды (например, выбросами углекислого газа в атмосферу) и рядом других положительных аспектов Однако неясными остаются механизмы взаимоотношения данных бактерий с высшими растениями и их патогенами и поведение ин-тродуцированной популяции, исходно чужеродной почвенной микрофлоре, в ризосфере сельскохозяйственных растений

Целью данной работы являлось изучение взаимодействия формальдегидутилизи-рующих бактерий Pseudomonas sp В-6798 с фитопатогенными грибами и высшими растениями

В задачи исследования входило

1 Изучение влияния качественного состава среды на фунгистатические и ростстиму-лирующие свойства бактерий Pseudomonas sp В-6798, их культивирования и утилизации формальдегида

2 Исследование кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов рода Fusarium бактериями Pseudomonas sp В-6798 в зависимости от концентрации в среде ионов железа (FeJ+)

3 Изучение влияния формальдегидутилизирующих бактерий на рост и развитие картофеля в лабораторных и полевых экспериментах и их выживаемость в ризосфере

4 Изучение взаимоотношений бактерий Pseudomonas sp В-6798 с фитопатогенами картофеля в полевых экспериментах

5 Сравнительная оценка эффективности применения бактерий Pseudomonas sp. В-6798, с официально рекомендованным к применению биопрепаратом «Планриз» на основе бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33

Научная новизна работы Показано, что среда М9 с формальдегидом положительно влияет на фунгистатическую и ростстимулирующую активность исследуемых бактерий, по сравнению с богатыми средами, рекомендуемыми для культивирования бактерий данного семейства Построена и экспериментально подтверждена математическая модель кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp В-6798 in vitro посредством сидерофорного механизма Полученные результаты моделирования могут служить основой селекции бактерий-антагонистов, способных более эффективно конкурировать с фигопатогенами за железо при его высоких концентрациях в почве, за счет увеличения активности сидерофорной системы

В лабораторных и полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития картофеля под действием бактерий Pseudomonas sp В-6798 Полезная продуктивность картофеля при бактеризации увеличивается на 10-40 % Бактеризация клубней бактериями Pseudomonas sp В-6798 позволяет уменьшить развитие ризоктониоза и парши обыкновенной на 40-70 % и фитофтороза в вегетационный период на 45-50 %

Практическая значимость. Проведенные лабораторные и полевые эксперименты позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp В-6798 к применению в качестве биопрепарата, повышающего продуктивность картофеля, а также в защите растений против комплекса возбудителей его заболеваний При выращивании бактерий на среде, содержащей формальдегид, стоимость препарата снижается за счет уменьшения затрат, направленных на достижение стерильности процесса культивирования При этом биологическая эффективность применения препарата на основе формальдегидутилизирующих бактерий Pseudomonas sp В-6798 на 20-30 % выше аналогового биопрепарата «Планриз»

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на городской конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 2003), VII и VIII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003, 2004), XLI и XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2003. 2004), Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии (Томск, 2004), П1 российско-монгольской конференции молодых ученых и студентов (Бийск, 2004), XI молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2004)

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертации было сделано 9 публикаций, из них 2 в изданиях, рецензируемых ВАК

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 134 страницах, содержит 29 рисунков, 5 таблиц Список литературы включает 223 источника, из них 104 - иностранных источников

Работа не состоялась бы без идейного вдохновителя - научного руководителя д б н ,

профессора [Евгения Васильевича Евдокимова за что ему особая благодарность Автор

выражает глубоую признательность и благодарность А В Евдокимову за методическую помощь при культивировании, ст преп кафедры с/х биотехнологии Ю Е Якимову за методическую помощь в постановке полевых экспериментов и оформлении работы, ст преп кафедры с/х биотехнологии О М Минаевой за ценные советы, без помощи и поддержки которой работа не была бы закончена, к б н , доценту А В Куровскому и к с-х н , доценту Н Н Терещенко за методическую помощь, и о зав кафедры с/х биотехнологии, к б н , доценту С Ю Семенову за постоянное внимание и большую помощь в работе и обсуждении результатов

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 2. Объекты и методы исследований

Объектом исследования являлись формальдегидрезистентные бактерии Pseudomonas sp ВКПМ В-6798 Штамм получен методами направленной автоселекции и скрининга на устойчивость к формальдегиду из активного ила очистных сооружений Томского нефтехимического комбината (ТНХК) в лаборатории биокинетики и биотехнологии НИИ ББ

В качестве эталонного контроля для оценки эффективности применения формальде-гидрезистентных псевдомонад использовались бактерии Pseudomonas fluorescens ВКПМ АР 33, являющиеся активным началом биопрепарата «Планриз» Для оценки антагонистической активности исследуемых бактерий в качестве тест-объекта взят гриб Fusarium oxysporum f sp gladioli, ростстимулирующей - семена пшеницы сорта Новосибирская-15, клубни картофеля сортов Фреско, Невский, Луговскои, Жуковский ранний, колонизирующей способности - семена кукурузы сорта Молдавская-215 АМВ, овса - сорта На-рымский

Питательные среды и культивирование Культивирование бактерий Pseudomonas sp В-6798 осуществлялось на минимальной среде М9 (Миллер, 1976) с формальдегидом (4 г/л) путем каскадного пересева культуры В процессе роста культуры происходило за-кисление среды до рН=4 5-5 0, поэтому в среду добавлялся аммиак Контроль численности клеток осуществляли согласно общепринятой методике (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1995) Бактерии Р fluorescens АР-33 (биопрепарат «Планриз») в 2002 г культивировали на ферментационной установке, в 2004 г были предоставлены ФГУ «Томская станция защиты растений» Для выращивания фитопато-генных грибов использовался 20 % сусло-агар, крепостью 4-6 ° по Баллингу

Изучение влияния сред различного состава В ходе экспериментов семена пшеницы замачивались на 30 мин в суспензии бактерий Pseudomonas sp В-6798 выращенных на различных средах в концентрации 106-107 клеток/мл минеральной среде М9 с глюкозой, среде М9 с формальдегидом (4 г/л), богатой питательной среде, содержащей пептон, глицерин, свекловичную мелассу и кукурузный экстракт В качестве контроля использовалась дистиллированная вода Эксперимент проводился в пяти повторностях, по 100 семян на каждый вариант Влияние сред на активность бактериальной культуры оценивали с помощью фитопатологического анализа одновременно с замером длины молодого растения

Изучение кинетики ингибирования бактериями роста Фитопатогенных грибов в зависимости от концентрации ионов железа (Fe34! в среде В питательную среду добавлялось необходимое количество железа (Fe'5+), на чашки Петри со средой газоном высевались бактериальные суспензии (0 1 мл) После появления видимого бактериального роста для предотвращения физического контакта бактериальных и грибных колоний посевы заливали тонким слоем агаризованной среды На поверхность помещались агаровые блоки с мицелием гриба диаметром 1 мм равномерно по шаблону Блоки вырезались из сплошного шестисуточного газона мицелия гриба цилиндрическим пробкорезом Чашки инкубировались в термостате (24±1 О °С) В качестве измеряемого параметра, отражающего рост гриба, использован диаметр колоний Единым параметром оценки степени анти-фунгального влияния предложено использование константы ингибирования Описанным способом без нанесения бактериальной суспензии поставлена серия экспериментов для изучения влияния ионов железа (Fe3+) на рост фитопатогенных грибов

Исследование влияния формальдегидутилизируюших псевдомонад на рост и развитие картофеля в лабораторных условиях В экспериментах была создана экосистема, состоящая из трех звеньев почвогрунт - растение-хозяин - опытный бактериальный штамм в концентрации 1*106-107 клеток/мл В качестве растения-хозяина - проростки картофеля сорта Луговской длиной 1 см, которые отделялись от клубня, замачивались на 30 мин в суспензии бактерий, в контроле - в воде с минеральными солями Растения выращивали в фитокамерах при 12-ти часовом освещении и температуре 22±1 0 °С Спустя 30 дней после посадки, растения повторно проливались бактериальной культурой в указанной концентрации Эксперимент был проведен в трех повторностях, по 35-40 растений на каждый вариант С момента появления ростков замерялась высота побега, по окончанию эксперимента у каждого растения измерялась сырая вегетационная масса, количество листьев, учитывались количество и масса клубней

Изучение влияния бактерий Pseudomonas sp штамм В-6798 на рост, развитие и урожайность картофетя в полевых условиях Полевые эксперименты были заложены в вегетационные периоды 2002, 2004-2005 гг на клубнях картофеля сортов Невский, Луговской, Жуковский ранний, Фреско В ходе экспериментов клубни, а затем и растения кар-

тофеля обрабатывали бактериальной суспензией изучаемого штамма из расчета 1-3* 106 клеток на клубень или растение В контроле клубни картофеля обрабатывались водой с минеральными солями В качестве эталонного контроля использован биопрепарат «Планриз» Растения высаживались из расчета 42 ООО клубней/га

Учет численности бактерий в ризосфере оценивался с помощью метода разведения и высева на плотные питательные среды (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1995)

Антагонистическую активность бактерий оценивали путем проведения фитопатоло-гических анализов клубней картофеля, полученных от бактеризованных и контрольных растений, в период хранения в соответствии с ГОСТ 11856-89 и ГОСТ 7194-81 В вегетационный период 2005 года был проведен ряд фитопатологических учетов фитофтороза Определение процента поражения и степени развития заболеваний проводилось по стандартной методике (Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков, 1989)

Статистическая обработка материала Данные, полученные в ходе экспериментов, обрабатывались с помощью пакета STATISTICA for Windows, версия 6 0 Данные в работе представлены в виде средней арифметической с доверительным интервалом с учетом критерия Стьюдента для 95 % уровня значимости Оценка достоверности полученных результатов фитоанализа семян проводилась сравнением выборочных долей с учетом критерия Стьюдента для вероятностей 25-75 % включительно, с учетом критерия Фишера для других значений вероятностей Сравнение данных параметров роста и развития растений в полевых экспериментах проводили по непараметрическому критерию Mann-Whitney (р<0 05) Определение скоростей роста грибных колоний на твердой питательной среде проводилось с использованием линейного регрессионного анализа Параметры уравнений для исследования кинетики ингибирования бактериями роста грибов и параметров роста растений вычислялись с использованием нелинейного регрессионно! о анализа

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Технология культивирования бактерий Pseudomonas sp. штамм В-6798 на ферментационной установке

Существует проблема утилизации формальдегида из его водных растворов, например, как побочного продукта ряда техноюгических процессов Известен способ аэробной биологической очистки промышленных сточных вод на очистных сооружениях типа аэротенков путем окисления формальдегида микроорганизмами активного ила Недостатком способа являются низкие (до 1 г/л) предельно допустимые концентрации формальдегида в сточных водах, которые могут быть поданы на очистные сооружения, что ограничивает применимость способа Учитывая аномально высокую устойчивость бактерий Pseudomonas sp В-6798 к значитепг.иым дозам формальдегида (8000 мг/л) целью

экспериментов данного раздела являлось получение большого количества биомассы формальдегидутилизирующих бактерий одновременно с утилизацией формальдегида на ферментационной установке «Bioengmeenng»

В соответствии с поставленной задачей предлагаемый способ культивирования микроорганизмов осуществляется с помощью реактора объемом 15 л с микробной популяцией в водно-минеральной среде, без соблюдения условий строгой стерильности, аэробным глубинным способом в периодическом режиме в течение трех суток до концентрации 3-6Х101 '"'2 и полной утилизации формальдегида Засев реактора осуществлялся культурой бактерий рода Pseudomonas sp В-6798 объемом 8-10 % от объема ферментера

Биологическую производительность микробной популяции в среде реактора развивали путем введения плавно увеличивающихся порций водного раствора формальдегида Для увеличения количества вводимых доз формальдегида на стадии падения pH (до 6 2) под действием ввода новой порции, в среду подавали порцию 25 % водного раствора аммиака в количестве, обеспечивающем увеличение кислотности до 90 % от диапазона его уменьшения По соотношению периода восстановления содержания кислорода и периода восстановления нейтрального значения pH в среде под воздействием формальдегида и аммиака судят о сохранении дееспособности микробной популяции, что позволяет оптимизировать величину порций формальдегида на наибольшем уровне

Порционное введение формальдегида в режиме рН-стата позволяет увеличить вводимую порцию формальдегида до 64000 мг/л. при этом максимальная удельная скорость роста бактерий В-6798 ц=0 3 час ', а концентрация биомассы 3 0-3 5 г АСБ/л соответствует скорости усвоения формальдегида 85 мг в минуту на 1 г АСБ

Проведенные в лаборатории длительные эксперименты с использованием селективного штамма формальдегидутилизирующих псевдомонад В-6798 показали высокую стабильность штамма В сравнении с известными способами биологического производства биомассы предлагаемый способ характеризуется простотой и дешевизной технологии и аппаратурного обеспечения Использование этого штамма позволит значительно удешевить процесс производства бакпрепаратов, по сравнению с традиционным, за счет уменьшения энерго- и ресурсозатрат и увеличить эффективность применения в различных областях биотехнологии, в частности для полной утилизации формальдегида из очистных вод промышленных предприятий

3.2 Влияние качественного состава среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства Pseudomonas sp. В-6798

Образование псевдомонадами антибиотиков и сидерофор в значительной степени зависят от углеродного и минерального питания бактерий (Кравченко и др , 2003, Штарк, 2003, Bellis, Ercolani, 2001, Nielsen et al, 1998)

Для всех вариантов с бактеризацией семян, наблюдается значимое снижение общей зараженности в среднем в 2 4 раза, о чем свидетельствует рисунок 1 Общая зараженность семян включала возбудителей корневых гнилей, альтельнариоза, бактериоза и плесневых грибов Варианты с использованием бактерий выращенных на разных средах отличались друг от друга статистически незначимо

Контроль

БПС

МС М9+глюкоза

МС М9+ФДГ

Рисунок 1 - Общая зараженность семян пшеницы сорта Новосибирская-15 возбудителями семенных инфекций в различных вариантах эксперимента

Примечание - Контроль - семена замоченные в воде, БПС — богатая питательная среда для культивирования бактерий МС М9+глкжоза - минеральная среда с глюкозой, МС М9+ФДГ- минеральная среда с формальдегидом (4 г/л), * - статистически значимое отличие от контрольного варианта (р<0 05)

. 82 '5:

£ 78

та

| 74 § 70 66 62

* с 1

:11

Контроль

БПС

МС М9 + глюкоза

МС М9 + ФДГ

Рисунок 2 - Длина растений пшеницы сорта Новосибирская-15 в зависимости от варианта эксперимента

Примечание -*- статистически значимое отличие от контрольного варианта, # — статистически значимое отличие от варианта с бактериями, выращенными на БПС (р<0 05)

Во всех вариантах с обработкой семян бактериальной культурой конечная длина молодого растения увеличилась по сравнению с контролем (рисунок 2) Однако наибольшее влияние оказали бактерии, выращенные на минеральной среде М9 с глюкозой и с формальдегидом Длина растений в этих вариантах статистически значимо отличалась как от контрольного варианта, так и от варианта с бактериями, выращенными на БПС

3.3 Построение математической модели кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 in vitro

3.3.1 Кинетика ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798

Подавление роста растений фитопатогенными микроорганизмами есть результат их выигрыша в конкуренции с другими видами микроорганизмов микрофлоры почвы Известно, что железо является одним из элементов питания, за который конкурируют микроорганизмы (Neüands, 1957, Шавловский, Логвиненко, 1988) В этой ситуации выигрывают те виды, которые более эффективно усваивают железо и делают его недоступным для конкурентов Предварительные эксперименты (Минаева, 2007) показали, что бактерии Pseudomonas sp В-6798 обладают преимуществом перед фитопатогенами Из литературы известно, что в основе этого лежит способность флуоресцирующих псевдомонад к повышенной продукции сидерофорных соединений (Воронин, 1998, Штерншис и др, 2000) Исследование антагонизма бактерий может также оказаться полезным для решения проблем их экологии и систематики, а также для использования в качестве средства биологической борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений (Соколов, 1990)

В работе О М Минаевой (2007) показано, что зависимость скорости роста колоний грибов на питательных средах с различными концентрациями бактерий подчиняется модифицированному уравнению Н Д Иерусалимского (Евдокимов, 2001)

к:

шах „а £-,¡7

[1]

где V(C) - скорость >величения диаметра колоний фитопатогенных грибов (мм/ч), V„ - остаточная скорость роста гриба при "бесконечной" концентрации бактерий (мм/ч), Vmax - кинетический параметр, отражающий скорость роста гифов в отсутствии бактерий и в сумме с численно равный максимальной скорости роста данного гриба (мм/ч), К, - константа ингибирования, численно равная концентрации бактерий, при которой достигается половина от максимального эффекта ингибирования (клеток/мл), а - коэффициент нелинейности ингибирования, С - концентрация клеток бактерий в инокулюме (клеток/мл)

Количественным показателем описанной модели при унифицированной методике постановки эксперимента предложено использование константы ингибирования (К,), которая отражает степень влияния бактерий на скорость роста гриба чем она выше, тем ниже антифунгальный эффект, и наоборот Например, К, для Fusarium oxysporum f sp hm

V(C) = V„ + Vm

и Fusarium oxysporum f sp gladioli составила порядка 103 клеток/мл, для Fusarium ох-ysporum f sp - 102 клеток/мл

Нами была предложена и апробирована методика, позволяющая численно оценить эффект подавления роста грибных колоний на плотных питательных средах в чашках Петри В ходе экспериментов каждые 24 часа проводили измерение диаметра грибных колоний, образующихся на агаризованных птшельных средах с различными концентрациями железа и бактерий в концентрации 106-107 клеток/мл в инокулкже На рисунке 3 представлена зависимость ингибирования скоростей роста диаметра гриба Fusarium oxysporum f sp gladioli бактериями Pseudomonas sp B-6798 от различных концентраций ионов железа Fe3+ в питательной среде

^ 0,55

ч 0 45

св

о 0 35

1 0 25

0,15

Контроль 0 028 0 56 10 0

0 0 056 5 6

Концентрация железа (Fe3*) в среде, мг/л

Рисунок 3 - Кинетика ингибирования скорости роста Fusarium oxysporum f sp gladioli бактериями Pseudomonas sp B-6798 при различных концентрациях ионов железа (Fe3f) в среде

Примечание — Контроль — рост гриба на стандартной среде (10 мг/л Fe3*) без бактерий, 0 - рост гриба с бактериями Pseudomonas sp В-6798 на среде без внесения ионов железа, 0 028, 0 056, 0 56, 5 6, 10 0 — рост гриба с бактериями Pseudomonas sp В-6798 при заданных концентрациях железа (мг/л Fe3+) в среде

С ростом концентрации ионов железа (Fe3+) в среде, степень ингибирования скорости роста Fusarium oxysporum f sp gladioli бактериями Pseudomonas sp B-6798 снижается, как продемонстрировано на рисунке 3 добавление в среду ионов железа даже в концентрации 0 028 мг/л частично снимает ингибирование роста грибных колоний, что связано со снижением конкуренции за этот элемент сидерофор бактерий с сидерофорами фито-патогенного гриба Следует отметить, что добавление ионов железа Fe3+ не полностью снимает фунгистатический эффект оказываемый бактериями В-6798 на развитие фито-патогена даже в концентрации 10 мг/л, что может быть связано со способностью исследуемого штамма продуцировать отличные от сидерофор антибиотические вещества

3 3.2 Влияние ионов железа (Fe3+) в среде на рост фитопатогенных грибов

Зависимость скорости роста грибных колоний можно описать с помощью классического уравнения Моно Скорость роста грибных колоний при отсутствии добавленного

железа в среде очень низка, но не равна нулю Поэтому, введем в уравнение дополнительный член /¿о

Ks + S

[2]

где цо - удельная скорость роста гифов при отсутствии ионов железа в среде, //,„ - максимальная удельная скорость роста гифов, 5- концентрация субстрата, Кз - константа насыщения

4 6 8 10

Концентрация ионов железа Fe3* нг/п

Рисунок 4 — Зависимость скорости роста диаметра гриба Fusarium oxysporum f sp gladioli от концентрации железа (Fe3*) в питательной среде

Примечание - В виде точек отображены практически полученные данные, в виде линии - теоретически рассчитанная кривая

С помощью метода нелинейного регрессионного анализа нами были рассчитаны коэффициенты для зависимости скоростей роста диаметра колоний гриба Fusarium oxysporum f sp gladioli от концентрации железа (Fe3+) в питательной среде (рисунок 4) В описанной модели цт составляла 0 45 мм/ч, Ks находилась на уровне 1 95, a /Jq не превышала 0 005 мм/ч

Таким образом, описанная нами модель является классической и универсальной для описания зависимости удельной скорости размножения от концентрации лимитирующего субстрата

3.3 3 Математическая модель кинетики ингибирования бактерий рода Pseudomonas sp. В-6798 при сидерофорном механизме

Для максимально эффективного использования популяции микробов-антагонистов в борьбе с фитопатогенами необходимо математическое описание кинетики конкурентного взаимодействия популяций (Печуркин, 1978). Биологический аспект применения микроорганизмов в защите растений основан на популяционных взаимодействиях конкурирующих видов с фитопатогенами При этом популяции антагонистических видов либо интродуцируются, либо активизируется деятельность уже существующих антагонистов

Методы эти популяционные, и для успешного их развития необходимо знать кинетические характеристики используемых природных популяций

Известно, что бактерии при росте в условиях недоступности ионов железа способны образовывать сидерофоры (Соколов, 1990, Воронин,1998) Для удобства обозначим количество выделяемых молекул сидерофор через S Концентрация молекул сидерофор, выделяемых в питательную среду, пропорциональна титру бактерий Следовательно, исходную концентрацию молекул сидерофор в культуре бактериальных клеток можно принять за 15'] (Варфоломеев, Гуревич, 1999)

[S] = С*к, [3]

где С - титр клеток псевдомонад, клеток/л, к - удельная продуктивность синтеза сидерофор клетками, моль/клеток

Как известно из литературных данных, связывание ионов 3-х валентного железа из питательной среды молекулами сидерофор как продуктов метаболизма при нейтральных pH происходит в реакциях комплексообразования (Neilands, 1957, Gill, Warren, 1988, Alexander, Zuberer, 1993)

S + n Fe3+ <-> SFe

к которым применимо классическое уравнение равновесия (Варфоломеев, Гуревич, 1999)

[SFe]

К=-

[л'Т И, [4]

где К- константа равновесия, [ ] - концентрация вещества

Из уравнения 4 выразим концентрацию свободных ионов железа Fe3+ в среде с сиде-рофор-образующими бактериальными клетками

где п - целое число стехиометрический коэффициент

Используя уравнение [2] и заменив из выражения [5] преобразуем его к сле-

дующему виду

К„ [К]* [Sf

+ 1

[SFe Y ; [6]

где К Fe - константа насыщения

KFe [К]" !

Обозначим " как а (коэффициент нелинейности), и lSFe У как '

а так-

ка Ка

же поделим числитель и знаменатель в дроби в выражении [6] на ' В результате

получаем

каКа

МИ) = Мо + М„

kaK?+[Sf [7]

Заменив [5] в соответствии с [3] на C*k и разделив числитель и знаменатель дроби в выражении [7] на ка получаем искомую формулу, описывающую зависимость удечьной скорости роста гифов /л от концентрации клеток ризобактерий [С]

MÜS}) = Мй +Ка\г,а

К> L J [8]

Из этого следует, что выражение [8] полностью совпадает с модифицированным уравнением Иерусалимского [1], при этом

' к К

Получив методом регрессионного анализа среднее значение а, можно узнать п, а именно, сколько ионов железа участвует в сидерофорном транспорте одной бактериальной клетки В работе О М Минаевой (2007) показано, что а (коэффициент нелинейности ингибирования) грибов рода Fusarium и Bipolaris бактериями Pseudomonas sp В-6798 в среднем равен 0 19±0 02, следовательно п"5, то есть столько ионов железа связываются сидерофорной системой одной бактериальной клетки Pseudomonas sp В-6798

Антагонизм псевдомонад в отношении фитопатогенов обусловленный конкуренцией за железо, эффективен только при низком содержании железа в почве (Воронин, 1998, Соколов, 1990) При высоких концентрациях железа в почве возможно два пути повышения эффективности применяемых бактерий Первый основан на увеличении плотности популяции агента, что практически реализовать достаточно сложно, второй - на применении агентов, имеющих более высокую активность сидерофорной системы транспорта Предложенная математическая модель кинетики сидерофорного механизма ингибирования позволяет численно оценить этот параметр по экспериментально полученному коэффициенту нелинейности ингибирования На основании этого возможна целенаправленная селекция бактерий-антагонистов по активности сидерофорной системы

3 4 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамм В-6798 на рост и

развитие картофеля

3.4.1 Влияние бактерий В-6798 на рост и развитие картофеля в лабораторных

условиях

Из литературы известно о положительном влиянии на рост, развитие и урожайность сельскохозяйственных растений при внесении ризосферных бактерий рода Pseudomonas Установлено, что бактерии Pseudomonas sp В-6798 эффективно влияют на рост и развитие овса, пшеницы, кукурузы, как в лабораторных, так и полевых условиях (Минаева, 2007), но неизвестно влияние данного штамма бактерий на параметры развития и урожайность картофеля

В ходе обработки данных установлено, что рост картофеля, соответствовал S-образной кривой Для описания данной кривой было использовано логистическое уравнение следующего вида (Ризниченко, Рубин, 1993)

Ае"

~ -7F

В + хпе

0 • [9]

где у соответствует длине проростка с течением времени (мм) I - время (сут ), г - скорость удлинения проростка (мм/сут), х„ - «минимальная» длина проростка, соответствующая длине проростка после активации семени в течение 24 часов (мм), А - константа уравнения, численно соответствующая произведению минимальной длины проростка на максимально возможную в условиях эксперимента (мм) А—ХоХтах, В — константа уравнения, численно соответствующая вычитанию минимальной длины проростка из максимальной (мм), В= хт„ -ха

В ходе эксперимента установлено, что обработка растений бактериальной культурой положительно повлияла как на кинетические параметры роста растений удельная скорость роста растений (г) статистически значимо увеличилась по сравнению с необработанными растениями, конечная длина растения (хтах) в варианте с обработкой бактериями увеличилась в I 3 раза, так и на все параметры развития растения увеличилась конечная длина растений, масса растений, количество листьев, количество и масса клубней Количество растений, обработанных бактериями, находящихся в фазе клубнеобра-зования, было выше в 2 раза, по сравнению с контрольным вариантом Масса клубней, собранных в вариантах с обработкой растений бактериями В-6798 по сравнению с необработанными, увеличилась в 3 6 раза

3 4.2 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамм В-6798 на рост и развитие картофеля в полевых условиях

3.4 2 1 Влияние бактерий на рост картофеля в полевых условиях

Рост растений картофеля в полевых условиях в зависимости от сезона описывался в 2002 и 2004 гг логистической, в 2005 экспоненциальной кривыми, что может быть связано с разными почвенно-климатическими условиями в период роста растений в течение вегетационных экспериментах Культура бактерий для эксперимента Pseudomonas sp В-6798 и Р fluorescens АР-33 были выращены на ферментационной установке «Bioengi-neenng» В ходе эксперимента в течение месяца от всходов растений измерялась длина максимального побега в каждом кусте во всех вариантах Также в эксперименте учитывалось количество стеблей в кусте, интенсивность цветения растении

Для описания начального участка кривой логистического роста растений было использовано экспоненциальное уравнение следующего вида (Ризниченко, Рубин, 1993)

где L - длина вегетативной части растения через время (i) (мм), х<> - первоначальная (исходная) длина проростка, при t=0 (мм), г — скорость удлинения растения (мм/час), I — время (час)

В ходе экспериментов установлено, что обработка клубней и растений бактериальными препаратами в целом положительно повлияла на все параметры развития растений отмечена тенденция, а в 2002 г статистически значимое увеличение конечной длины растений хтах в вариантах с применением бактериальных препаратов, увеличилось количество стеблей в кусте, цветение в вариантах с обработкой начиналось раньше и было более обильное, чем в контроле

Известно (Мишустин, 1972, Воронин, 1998), что стимулирующее влияние на рост и развитие вегетативной массы основано на том, что бактерии рода Pseudomonas способны к синтезу различных регуляторов роста (ИУК, гиббереллины), витаминов По данным Ю А Гущиной и И Ф Головацкой (2001) бактерии штамма В-6798 способны секретиро-вать в среду вещества ауксиновой природы, и, в частности, ИУК в количестве 0 8 мкг/мл Бактерии опытного штамма на протяжении полевых экспериментов 2002 и 2004 гт оказывали на рост и развитие растений больший положительный эффект, чем зарегистрированный и применяемый в России биопрепарат «Планриз»

3 4.2 4 Влияние бактеризации на урожайность картофеля

Для изучения влияния бактерий штамма В-6798 на полезную продуктивность картофеля в вегетационных экспериментах послы выкопки учитывалась масса (г/куст) и количество клубней в лунке, фракционный состав

2002 г Фреско Ж\ ковский ранний

Йй

2004 г Жуковский Невский Луговской ,

' * I РАННИЙ

К Пз К Пз В 6798 В-6798

К Пз К Пз К Пз В-6798 В-6798 В 6798

Рисунок 5 -Полезная продуктивность картофеля в полевых экспериментах 2002 и 2004 гг

Примечание - К — контроль, В-6798 - вариант с применением бактерий штамма В-6798, Пз — вариант с применением биопрепарата Планриз, * - статистически достоверное отличие от контроля, # - статистически достоверное отличие от Планриза (р<0 05)

В 2002 г полезная продуктивность от применения штамма В-6798 увеличилась в среднем на 26-31 % в зависимости от сорта (рисунок 5), от применения биопрепарата «Планриз» на 22-32 %, наблюдается тенденция к увеличению количества клубней в лунке от бактеризации В 2004 г полезная продуктивность растений в варианте с использованием бактерий В-6798 сорта Луговской увеличилась на 30-32 %, сорта Невский на 1315 %, сорта Жуковский ранний на 8-10 % по сравнению с контрольным вариантом, в то время как в варианте с применением биопрепарата Планриз она снизилась на всех сортах даже по сравнению с контролем На растениях сорта Жуковский и Луговской отмечена тенденция к увеличению количества клубней в лунке в вариантах с обработкой растений бактериями штамма В-6798

Известно, что стимулирование роста картофеля флуоресцирующими псевдомонадами эффективно только при коротком севообороте (1 1) и только для семенного картофеля (Ваккег и др , 1986, СсЫб и др , 1986) Поэтому, в полевом эксперименте 2005 г дважды за вегетацию проводился учет формирования урожая Отмечено, что именно на ранних этапах развития растений эффективность применения бактерий В-6798 выше на картофеле сорта Невский значимо увеличилась масса клубней (в 2 2 раза), сорта Луговской в 2 5 раза, а количество клубней с лунки увеличилось в 2 8 раза по сравнению с контролем, в дальнейшем отмеченное отличие сглаживается

Таким образом показано, что биологические препараты оказывают положительное влияние на урожайность клубней, но, в итоге, эффективность применения зависит от сорта, почвы, севооборота и погодных условий

3 4.3 Выживаемость бактерий Pseudomonas sp. В-6798 в ризосфере сельскохозяйственных растений

Успешная колонизация корней растений и дальнейшая способность бактерий поддерживать численность в зоне ризосферы на достаточно высоком уровне являются обязательными свойствами, предъявляемыми к штаммам-интродуцентам (Воронин, 1998, Benizn et al, 2001) Toilko при наличии данных условий бактерии способны проявлять весь комплекс положительных эффектов на рост и развитие растений

В наших экспериментах установлено, что бактерии Pseudomonas sp В-6798 в ризосфере кукурузы, овса, пшеницы и картофеля способны не только выживать, но и успешно размножаться, значительно увеличивая свою численность, как в лабораторных, так и полевых экспериментах Следует отметить, что период наибольшего увеличения численности бактерий в прикорневой зоне совпадает с периодом активного роста проростков

Динамика численности интродуцированного штамма в целом соответствует общему изменению количества бактериальной флоры в ризосфере кукурузы (рисунок 6) Максимальное количество бактерий в зоне ризосферы кукурузы наблюдалось приблизитетьно на 70 сутки с момента постановки экспериментов, соответствующие периоду цветения-образования початков, после чего наблюдается некоторое снижение общей бактериальной численности

J5T

Время, супси

Рисунок 6 - Рост кукурузы и динамика численности бактериальной флоры в зоне ризосферы в полевых экспериментах

Примечание - 1 - длина кукурузы, 2 - общая численность бактерий, 3 - численность бактерий Pseudomonas sp В-6798

Для эффективной работы биопрепарата необходимо поддерживать в ризоплане минимальную концентрацию бактериальных клеток (> 104 бактерий/см корня), этот порог зависит также от вида растения, его возраста (Соколов, 1990) В наших экспериментах численность бактерий- интродуцентов устанавливалась на уровне свыше 1*104 КОЕ/г почвы, примыкающей к растительному корню уже на 20 сутки эксперимента для всех исследованных видов растений (кукуруза, пшеница, овес), после чего численность бак-

терий в зоне ризосферы до окончания цветения нарастала После окончания вегетации бактерии полностью вытеснялись из бактериальной флоры почвы, сохраняя экологическое равновесие и не вызывая бактериального загрязнения почв Однако периода их наличия в ризосфере растений достаточно для оказания значительного ростостимулирую-щего эффекта (длина бактеризованных растений кукурузы в 1 6 раз превышала длину контрольных, пшеницы и овса - в 1 4 и 1 5 раза соответственно)

Таким образом бактерии Pseudomonas sp В-6798 способны поддерживать численность на достаточно высоком уровне в ризосфере сельскохозяйственных культур в вегетационный период в лабораторных и полевых условиях, используя в качестве источников углерода и энергии корневые выделения растений

3.4.3 Влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на зараженность картофеля возбудителями листовых инфекций в вегетационный период

Как известно из литературных источников, растение, находящееся в благоприятных условиях, при сбалансированном поступлении питательных веществ формирует иммунитет, способный противостоять внедрению патогенов и развитию заболевания Поэтому проведение учета пораженное™ растений фитофторозом в вегетационный период косвенным образом отражает их способность противостоять поражению фитопатогенными грибами и свидетельствует об уровне их иммунитета (Павлюшин и др , 2002)

Распространенность болезни отражает количество больных растений или отдельных органов, выраженное в процентах от общего числа обследованных растений на участке, в поле

где Р - распространенность болезней, %, п - число больных растений (клубней) в пробе, шт ,И— общее число растений (клубней) в пробе, шт

Степень развития болезни или интенсивность поражения служит качественным показателем болезни и рассчитывается по формуле

где Д - степень развития болезни, %, х Ь) - сумма произведений числа больных растений (клубней) (а) на соответствующий процент поражения (А), N - обшее число растений (клубней) в пробе

ИХ 100

[И]

[12]

Контроль

Pseudomonas sp B-6798

я 30

g 20

а.

I 1

III

I II III IV

Рисунок 7 — Развитие фитофтороза на посадках картофеля сорта Невский в полевом эксперименте 2005 г

Примечание — I, II, III, IV — фазы замеров * - достоверное отчичие от контрольного варианта (р<0,05)

Представленный рисунок демонстрирует, что с момента проявления на посадках картофеля фитофтороза на опытном участке болезнь получила значительно меньшее распространение К окончанию вегетации развитие фитофтороза на опытных участках на 45-50 % ниже, чем на участках контроля Процент пораженных растений при этом в контроле и опыте достигал 100 В связи с чем, уменьшение развития фитофтороза можно связать только со снижением интенсивности поражения

Как известно, урожай, а также интенсивность развития заболеваний клубней при хранении находятся в прямой зависимости от степени проявления болезней картофеля в период вегетации Приемы, снижающие развитие фитофтороза в вегетационный период позволяют получить большее число здоровых клубней с минимальным предрасположением к заражению гнилями и развитию их в период хранения

3 4 4 Влияние бактерий Pseudomonas sp. штамм В-6798 на устойчивость клубней картофеля к заболеваниям при хранении

Микробные сообщества, формирующиеся на поверхности корня растения и в прикорневой зоне почвы, оказывают существенное влияние на рост и развитие растений Так, значительная численность фитопатогенных микроорганизмов в прикорневой зоне создает повышенный риск заболевания, а усиленная конкуренция непатогенных популяций, напротив, снижает этот риск При биоконтроле происходит не полное уничтожение нежелательного микроорганизма, а ограничение его доминирования, безудержного размножения, приводящего к уничтожению растения-хозяина

Таким образом цель экспериментов данного раздела - оценить фунгистатический эффект формальдегидутилизирующих псевдомонад на клубнях картофеля нового урожая

в период хранения. Для этого картофель во всех экспериментах после выкопки закладывался на зимнее хранение

Для определения степени пораженности клубней картофеля использовалась бальная шкала (Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков, 1989) Распространенность болезни в партии клубней рассчитывается по формуле [11], степень развития болезней на клубняч по формуле [12] Данные о развитии болезней на клубнях картофеля представлены на рисунке 8

Контроль Плянриэ

Ps sp В-6798

Контроль Планриэ

Ь sp В 6798

Рисунок 8 - Развитие заболеваний на клубнях картофеля на примере сорта Жуковский ранний 2002 г

Примечание - * - статистически достоверное отличие от контрольного варианта, # - статистически достоверное отличие от варианта с бактеризацией планризом (р<0 05)

Следует отметить, что обработка клубней и растений в вегетационный период бактериями штамма В-6798 позволило значимо снизить развитие заболеваний образовавшихся клубней На приведенном рисунке в опытном варианте показано статистически значимое снижение развитие парши обыкновенной (в 2 раза) и ризоктониоза (в 4 раза) по сравнению с контролем. В среднем снижение развития парши и ризоктониоза при бактеризации опытным штаммом псевдомонад составило 40-50 % и 50-75 % соответственно На снижении развития заболеваний главным образом оказало влияние снижение интенсивности поражения, в меньшей степени - уменьшение количества больных клубней

Меньшее влияние на снижение развития заболеваний оказала бактеризация клубней планризом в среднем снижение достигало 30-40 % В некоторых случаях уменьшение развития заболеваний не отмечено и даже превысило контрольные показатели Таким образом в наших экспериментах наблюдался нестабильный эффект от применения биопрепарата «Планриз» препарат или не снижал развитие заболеваний, или снижал, но менее эффективно по сравнению со штаммом В-6798.

Известно, что предпосадочная обработка посевных клубней и последующее опрыскивание растении в ходе вегетации препаратами способствует снижению популяцион-

ной плотности на клубнях нового урожая возбудителей заболеваний как за счет снижения плотности популяции фитопатогенов в почве, так и за счет увеличения резистентности растений к данным возбудителям Отмечено, что применение биопрепаратов, как правило, способствует улучшению фитосанитарного состояния клубней нового урожая (Куликов и др , 2006)

Выводы

1 Установлено влияние качественного состава питательной среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства бактерий Pseudomonas sp В-6798 наибольший положительный эффект отмечен при культивировании бактерий на минеральной среде М 9 с глюкозой и минеральной среде М 9 с формальдегидом в качестве единственного источника углерода и энергии

2 Построена математическая модель кинетики ингибирования грибов бактериями Pseudomonas sp В-6798 посредством сидерофорного механизма, на основании которой возможна количественная оценка активности сидерофорной системы бактериальной клетки, что дает основание для целенаправленной селекции штаммов бактерий-антагонистов по увеличению способности связывания ионов железа (FeJ+)

3 Отмечено положительное влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на рост и продуктивность растений картофеля, при этом полезная продуктивность увенчивается как в лабораторных (в 2 5-3 раза), так и полевых условиях (на 10-40 % в зависимости от сорта)

4 Бактеризация клубней и растений Pseudomonas sp В-6798 положительно сказывается на снижении развития заболеваний картофеля фитофтороза в вегетационный период на 45-50 %, ризоктониоза и парши обыкновенной в период хранения на 40-70 %

5 Показано, что бактерии Pseudomonas sp В-6798 при интродукции в ризосферу пшеницы, овса, кукурузы, картофеля способны выживать и сохранять свою численность на уровне, достаточном для оказания значительного положительного эффекта (не менее 104 клеток/г почвы)

6 В полевых экспериментах показано, что биологическая эффективность бактерий Pseudomonas sp В-6798 на 20-30 % выше эффективности бактерий официально рекомендованного к применению биопрепарата «Планриз»

Работы, опубликованные по теме диссертации

1 Акимова Е.Е. Использование искусственных экосистем в качестве моделей для изучения и реализации устойчивого развития в агрофитоценнозах / Минаева О.М., Акимова Е.Е. // Вестник ТГУ. Приложение. Материалы международных, всероссийских и региональных научных конференций, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ - 2005. - № 13. - С. 107-109.

2. Акимова Б.Б. Использование малых моделей искусственных экосистем для изучения взаимодействия ризобактерий с растением-хозяином и микроскопическими почвенными грибами / Минаева О.М., Акимова Е.Е. // Исследовано в России. -Электрон, журнал - 2006. - № 062. - С. 617-623.

3 Акимова Е Е. Бактерии Pseudomonas sp В-6798 как антагонисты роста фитопатоген-ных грибов и стимуляторы роста растений / Минаева О M, Акимова Е Е, Гущина Ю А, Евдокимов ЕВ// Проблемы экологической безопасности и природопользования в Западной Сибири Труды ТГУ, серия биологическая - Т 266 - Томск 2004 - С 55-59

4 Акимова Е Е Влияние ризосферных псевдомонад на урожайность сельскохозяйственных культур // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии Сборник научных работ -Т 3 -№3 -Томск 2004 - С 400-401 СГМУ

5 Акимова Е Е Формальдегидутилизирующие псевдомонады, способствующие росту и развитию растений // Материалы XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» Молекулярный дизайн и экологически безопасные технологии -Новосибирск Новосиб гос ун-т ,2004 -52с -С 13-14

6 Акимова Е Е Действие формальдегидутилизирующих псевдомонад // Биология - наука XXI века VIII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых -Пущино Авторская редакция, 2004 - С 348-348.

7 Акимова Е Е Действие формальдегидутилизирующих псевдомонад на урожайность картофеля // Алтай экология и природопользование Материалы III российско-монгольской конференции молодых ученых и студентов - Бийск НИЦ БПГУ им В M Шукшина, 2004 - 431 - с 282-285

8 Акимова Е Е. Использование формальдегидутилизирующих псевдомонад для защиты картофеля от фитопатогенных микроорганизмов // Материалы докладов XV Коми республиканской молодежной научной конференции (в 2-х томах), Т 2 XI молодежная научная конференция Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» - Сыктывкар 2004 - 357 с - С 8-9

9 Акимова Е Е Действие формальдегидутилизирующих псевдомонад // Биология - наука XXI века VII Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов - Пущино Авторская редакция, 2003 - 452 с - С 83

Тираж 100 экз Отпечатано в КЦ «Позитив» 634050 г. Томск, пр Ленина 34а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Акимова, Елена Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1Л Влияние ризосферных бактерий на рост и развитие растений.

1.2 Факторы, влияющие на взаимодействие микроорганизмов с растениями

1.3 Влияние бактерий рода Pseudomonas на рост и развитие растений.

1.3 Л Антибиотическое влияние бактерий рода Pseudomonas.

1.3.1 Л Синтез пигментов.

1.3.1.2 Синтез антибиотиков.

1.3.2 Синтез регуляторов роста и витаминов.

1.4 Влияние различных факторов на клубнеобразование картофеля.

1.5 Экологические аспекты разработки биопрепаратов для защиты растений на основе бактерий рода Pseudomonas.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Объекты исследований.

2.1.1 Формальдегидрезистентные псевдомонады штамма В-6798.

2.1.2 Бактерии, используемые в качестве эталонного контроля.

2.1.3 Гриб Fusarium oxysporum f.sp. gladioli.

2.1.4 Семена растений пшеницы.

2.1.5 Картофель.

2.1.6 Почвы для эксперимента.

2.2 Культивирование микроорганизмов.

2.2.1 Культивирование бактерий Pseudomonas sp. В-6798.

2.2.2 Культивирование бактерий эталонного контроля.

2.2.3 Культивирование грибов.

2.3 Методика проращивания клубней.

2.4 Методика бактеризации ростков и клубней картофеля.

2.5 Проведение экспериментов.

2.5.1 Схема экспериментов по изучению влияния качественного состава среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства Pseudomonas sp. В-6798.

2.5.2 Схема экспериментов по изучению кинетики ингибирования бактериями Pseudomonas sp. В-6798 роста фитопатогенных грибов рода Fusarium.

2.5.2.1 Ингибирование роста фитопатогенных грибов бактериями в зависимости от концентрации железа в среде.

2.5.2.2 Влияние ионов железа (Fe3+) в среде на рост фитопатогенных грибов.

2.5.3 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий В-6798 на рост и развитие картофеля.

2.5.3.1 Схема экспериментов по определению биостимулирующих свойств бактерий в вегетационных лабораторных экспериментах.

2.5.3.2 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамма В-6798 на рост и развитие картофеля в полевых условиях.

2.5.3.3 Схема экспериментов учета численности микроорганизмов в ризосфере растений.

2.5.3.4 Влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на зараженность картофеля возбудителями листовых инфекций в вегетационный период.

2.5.3.5 Влияние бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на устойчивость клубней картофеля к заболеваниям при хранении.

2.6 Статистическая обработка материала.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Культивирование бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на ферментационной установке.

Особенности культивирования бактерий Pseudomonas fluorescence. штамм АР-33.

3.2 Влияние качественного состава среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства Pseudomonas sp. В-6798.

3.3 Построение математической модели кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 in vitro.

3.3.1 Кинетика ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798.

3.3.2 Влияние ионов железа (Fe3+) в среде на рост фитопатогенных грибов

3.3.3 Математическая модель кинетики ингибирования бактерий рода Pseudomonas sp. В-6798 при сидерофорном механизме.

3.4 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамма В-6798 на рост и развитие картофеля.

3.4.1 Влияние бактерий В-6798 на рост и развитие картофеля в лабораторных условиях.

3.4.2 Влияние формальдегидутилизирующих бактерий штамма В-6798 на рост, развитие и урожайность картофеля в полевых условиях.

3.4.2.1 Агроклиматическая характеристика вегетационных сезонов 2002 и 2004-2005 годов.

3.4.2.2 Влияние совместного применения бактериальных и минеральных удобрений на рост картофеля в полевых условиях.

3.4.2.3 Влияние совместного применения бактериальных и минеральных удобрений на полезную продуктивность картофеля в полевых условиях 2002г.

3.4.2.4 Влияние бактерий на рост картофеля в вегетационный период 2004-2005 гг.

3.4.2.5 Влияние бактеризации на урожайность картофеля в полевых экспериментах 2004-2005 гг.

3.4.3 Выживаемость бактерий Pseudomonas sp. В-6798 в ризосфере сельскохозяйственных растений.

3.4.4 Влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на зараженность картофеля возбудителями листовых инфекций в вегетационный период.

3.4.5 Влияние бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на устойчивость клубней картофеля к заболеваниям при хранении.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения"

Актуальность работы. В последнее время большое внимание уделяется развитию экологических методов борьбы с заболеваниями культурных растений, которые рассматриваются как альтернатива химическим (Сорокина и др., 1999; Штерншис и др., 2000). По сравнению с химическими средствами защиты биопрепараты отличаются экологической безопасностью, избирательностью действия; их применение не нарушает взаимосвязи между элементами агроэкосистемы и не вызывает резистентности у фитопатогенных микроорганизмов. В связи с этим проблема поиска высокоактивных, конкурентоспособных, технологичных штаммов микроорганизмов-антагонистов и разработки на их основе биопрепаратов с широким спектром полезного действия является весьма актуальной (Соколов, 1990; Воронин, 1998; Романовская и др., 2002).

Бактерии Pseudomonas sp. В-6798 обладают выраженным ризосферным эффектом, несмотря на то, что были получены с помощью автоселекции и скрининга к повышенным концентрациям формальдегида, который является одним из наиболее токсичных отходов ряда химических производств. Благодаря возможности использованию формальдегида в качестве единственного источника углерода и энергии, являющегося одновременно стерилизатором питательной среды, производство биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas sp. В-6798 по сравнению с известными аналогами будет отличаться высокой технологичностью, уменьшением энергоемкости, соответственно уменьшением загрязнения окружающей среды (например, выбросами углекислого газа в атмосферу) и рядом других положительных аспектов. Однако неясными остаются механизмы взаимоотношения данных бактерий с высшими растениями и их патогенами и поведение интродуцированной популяции, исходно чужеродной почвенной микрофлоре, в ризосфере сельскохозяйственных растений.

Целью данной работы являлось изучение взаимодействия формальдеги-дутилизирующих бактерий Pseudomonas sp. В-6798 с фитопатогенными грибами и высшими растениями.

В задачи исследования входило:

1. Изучение влияния качественного состава среды на фунгистатические и ростстимулирующие свойства бактерий Pseudomonas sp. В-6798, их культивирования и утилизации формальдегида.

2. Исследование кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов рода Fusarium бактериями Pseudomonas sp. В-6798 в зависимости от концентрации в среде (Fe3+).

3. Изучение влияния формальдегидутилизирующих бактерий на рост и развитие картофеля в лабораторных и полевых экспериментах и их выживаемость в ризосфере.

4. Изучение взаимоотношенийбактерий Pseudomonas sp. В-6798 с фитопа-тогенами картофеля в полевых экспериментах.

5. Сравнительная оценка эффективности применения бактерий Pseudomonas sp. В-6798, с официально рекомендованным к применению биопрепаратом «Планриз» на основе бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33.

Научная новизна работы. Показано, что среда М9 с формальдегидом положительно влияет на фунгистатическую и ростстимулирующую активность исследуемых бактерий, по сравнению с богатыми средами, рекомендуемыми для культивирования бактерий данного семейства. Построена и экспериментально подтверждена математическая модель кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 in vitro посредством сидерофорного механизма. Полученные результаты моделирования могут служить основой селекции бактерий-антагонистов, способных более эффективно конкурировать с фитопатогенами за железо при его высоких концентрациях в почве, за счет увеличения мощности сидерофорной системы.

В лабораторных и полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития картофеля под действием бактерий Pseudomonas sp. В-6798. Полезная продуктивность картофеля при бактеризации увеличивается на 10-40 %. Бактеризация клубней бактериями Pseudomonas sp. В-6798 позволяет уменьшить развитие ризоктониоза и парши обыкновенной на 40-70 % и фитофто-роза в вегетационный период на 45-50 %.

Теоретическая значимость. Проведенные лабораторные и полевые эксперименты позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp. В-6798 к применению в качестве биопрепарата, повышающего продуктивность картофеля, а также в защите растений против комплекса возбудителей его заболеваний. При выращивании бактерий на среде содержащей формальдегид, стоимость препарата снижается за счет уменьшения затрат, направленных на достижение стерильности процесса культивирования. При этом биологическая эффективность применения препарата на основе формальдегидутилизи-рующих бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на 20-30 % выше аналогового биопрепарата «Планриз».

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на городской конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 2003), VII и VIII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003, 2004), XLI и XLII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2003, 2004), «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (Томск, 2004), III российско-монгольской конференции молодых ученых и студентов (Бийск, 2004), XI молодежной научной конференции Института биологии Коми НЦ УрО РАН «Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2004).

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертации было сделано 9 публикаций, из них 2 в изданиях, рецензируемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах, содержит 31 рисунок, 5 таблиц. Список литературы включает 223 источника, из них 104 - иностранных источников.

Заключение Диссертация по теме "Экология", Акимова, Елена Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено влияние качественного состава питательной среды на фунги-статические и ростстимулирующие свойства бактерий Pseudomonas sp. В-6798: наибольший положительный эффект отмечен при культивировании бактерий на минеральной среде М 9 с глюкозой и минеральной среде М 9 с формальдегидом в качестве единственного источника углерода и энергии.

2. Построена математическая модель кинетики ингибирования грибов бактериями Pseudomonas sp. В-6798 посредством сидерофорного механизма, на основании которой возможна количественная оценка активности сидерофор-ной системы бактериальной клетки, что дает основание для целенаправленной селекции штаммов бактерий-антагонистов по увеличению способности связывания ионов железа (Fe3+).

3. Отмечено положительное влияние формальдегидутилизирующих псевдомонад на рост и продуктивность растений картофеля, при этом полезная продуктивность увеличивается как в лабораторных (в 2.5-3 раза), так и полевых условиях (на 10-40 % в зависимости от сорта).

4. Бактеризация клубней и растений Pseudomonas sp. В-6798 положительно сказывается на снижении развития заболеваний картофеля: фитофтороза в вегетационный период на 45-50 %, ризоктониоза и парши обыкновенной в период хранения на 40-70 %.

5. Показано, что бактерии Pseudomonas sp. В-6798 при интродукции в ризосферу пшеницы, овса, кукурузы, картофеля способны выживать и сохранять свою численность на уровне, достаточном для оказания значительного положительного эффекта (не менее 104 клеток/г почвы).

6. В полевых экспериментах показано, что биологическая эффективность бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на 20-30 % выше эффективности бактерий официально рекомендованного к применению биопрепарата «Планриз».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Акимова, Елена Евгеньевна, Томск

1. Абросов Н.С., Ковров Б.Г., Черепанов О.А. Экологические механизмы сосуществования и видовой регуляции. Новосибирск: Наука, 1982. - 301 с.

2. Африкян Э.К. Бактерии-антагонисты и их применение. Ереван: Изд-во Акад. наук Арм. ССР, 1959. - 120 с.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Гос. изд-во мед. литературы, 1962. - 182 с.

4. Бейли Н. Статистические методы в биологии. Л.: Мир, 1963. - 272 с.

5. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ. В 2-х частях. 4.1. -М.: Мир, 1989.-692 с.

6. Березова Е.Ф. Микробы и жизнь растений. М.: Знание, 1960. - 40 с.

7. Березова Е.Ф. Роль микроорганизмов в сельском хозяйстве. М.: Сельхоз-гиз, 1952.- 112 с.

8. Березова Е.Ф., Подъяпольская В.П. Применение бактериальных удобрений. М.: Минсельхоз РСФСР, 1962. - 66 с.

9. Билай В.И. Основы общей микологии. К.: Выща шк., 1989. - 392 с.

10. Боровая В.П., Иванова Т.С. Влияние биопрепаратов на продуктивность картофеля // Защита и карантин растений. 2001. - № 10. - С. 19.

11. Воронин A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Сорос, образов, журнал. 1998. - № 10. -С. 25-31.

12. Боронин A.M., Кочетков В.В. Биологические препараты на основе псевдомонад // АГРО XXI. 2000. - С. 5-14.1.l

13. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

14. Возняковская Ю.М. Микробиологические основы экологической системы земледелия // Агрохимия. 1995. -№ 5. - С. 115-125.

15. Возняковская Ю.М. Микрофлора растений и урожай. Л.: Колос, 1969. -240 с.

16. Галицын Г.Ю., Гашников С.Ю., Шалдяева Е.М., Чекуров В.М. Регуляторы роста в голландской технологии возделывания картофеля // Защита и карантин растений. 2006. - № 8. - С. 29-30.

17. Генкель П.А. Физиология растений с основами микробиологии. М.: Просвещение, 1965. - 584 с.

18. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий: Учеб. пособие. Л.: Изд-во ЛГУ, 1989.-248 с.

19. Гуревич Ю.Л. Устойчивость и регуляция размножения в микробных популяциях. Новосибирск: Изд-во «Наука», 1984. - 161 с.

20. Гусев М.В. Микробиология: Учебник для студ. биол. специальностей вузов / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. 4-е изд., стер. - М.: Издат.центр «Академия», 2003.-464 с.

21. Гущина Ю.А., Головацкая И.Ф. Формальдегидрезистентные псевдомонады как стимуляторы роста корней льна-долгунца // Вопросы устойчивого и бескризисного развития. Новосибирск: Изд-во ИДМИ, 2001. - № 4/2. -С. 67-70.

22. Доспехов Б.А. Основы методики полевого опыта. М.: Просвещение, 1967. -176 с.

23. Дьяченко B.C. Болезни и вредители овощей и картофеля при хранении. -М.: Колос, 1970.-200 с.

24. Дятлова К.Д. Микробные препараты в растениеводстве // Сорос, образов, журнал.-2001.-Т. 7.-№5.-С. 17-22.

25. Евдокимов Е.В. Динамика популяций в задачах и решениях: Учеб. пособие. Томск: ТГУ, 2001. - 73 с.

26. Евдокимов Е.В., Печеркии М.П. Направленная автоселекция бактерий при культивировании в турбидостате // Микробиология. 1992. - Т. 61. -Вып. 4. - С. 652-655.

27. Евсюнина А.С., Ляпкова Н.С., Платонова Т.А., Кораблева Н.П. Влияние амбиола на рост стеблей у регенерантов исходных и трансгенных растений картофеля // Прикл. биох. и микроб. 2002. - Т. 38. - № 2. - С. 203-207.

28. Евстратова Л.П., Николаева Е.В. Защита картофеля биопрепаратами // Защита и карантин растений. 2001. - № 10 - С. 29.

29. Емнова Е.Е., Меренюк Г.В., Сланина В.А., Татару Ю.М., Руснак Т.Н. Видовой состав сапротрофных флуоресцирующих псевдомонад в ризоплане различных видов сельскохозяйственных растений // Микробиология. 1995. -Т. 64.-№6.-С. 820-826.

30. Егоров Н.С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения биологической активности. М.: Высшая школа, 1965. - 212 с.

31. ЕмцевВ.Т. Микробиология: учебник для вузов / В.Т. Емцев, Е.Н. Мишустин. 6-е изд., испр. - М.: Дрофа, 2006. - 444 с.

32. Емцев В.Т. Микробы, почва, урожай. М.: Колос, 1980. - 126 с.

33. Ермолова Н.И., Иванова Н.И. Скворцова Н.П. и др. Биопрепараты на основе ризосферных псевдомонад // Защита растений. 1992. - № 9. - С. 24-25.

34. Каляева М.А., Захарченко Н.С., Доронина Н.В. и др. Стимуляция роста и морфогенеза растений in vitro ассоциативными метилотрофными бактериями // Физиология растений. 2001. - Т. 48. - № 4. - С. 596-599.

35. Камнев А.А. Перфильев Ю.Д. Физико-химические и экологические аспекты взаимодействия инлоли-3-уксусной кислоты с железом-(Ш) // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. - Химия. - 2000. - Т.41 - № 3. - С. 205-210.

36. Каталог (описание сортов): картофель. -М.: АО Сельская новь, 1992 64 с.

37. Кириллова Г.Б., Жуков Ю.П. Влияние расчетных доз удобрений на урожайность и качество картофеля // Агрохимия. 2005. - № 12. - С. 31-35.

38. Кравченко Л.В., Леонова Е.И. Использование триптофана корневых экзо-метаболитов при биосинтезе индолил-3-уксусной кислоты ассоциативными бактериями // Микробиология. 1993. - Т. 62. - Вып. 3. - С. 453-459.

39. Кравченко Л.В., Макарова Н.М. Кинетика колонизации корневой поверхности злаков при интродукции ассоциативных бактерий // Микробиология. 1993. - Т. 62. - Вып. 3. - С. 524-529.

40. Кравченко Л.В., Азарова Т.С., Макарова Н.М., Тихонович И.А. Роль триптофана в корневых экзометаболитах для фитостимулирующей активности ризобактерий // Микробиология. 2004. - Т. 73. - № 2. - С. 196-198.

41. Кравченко Л.В., Азарова Т.С., Леонова-Ерко Е.И. и др. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas II Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 1. - С. 48-53.

42. Красильников Н.А. Антагонизм микробов и антибиотические вещества. -М.: Советская наука, 1958. 340 с.

43. Красильников Н.А. Микробы активаторы и жизнь растений. - М.: Знание, 1958.-40 с.

44. Красильников Н.А. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.: Изд-во Акад. наук СССР, 1958. - 463 с.

45. Креслинь Д.Я., Мишин И.В. Влияние микроэлементов на количество эпи-фитных бактерий и их способность к биосинтезу физиологически активных веществ // Методы микробиологического стимулирования роста и развития растений. Рига: Зинатне, 1969. - С. 56.

46. Куликов С.Н., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев С.В., Варламов В.П. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибными болезнями картофеля // Прикл. биох. и микроб. 2006. - Т. 42. - № 1. - С. 8692.

47. Лабутова Н.М., Дудик О.А., Кочетков В.В., Белоусов B.C., Воронин A.M. Взаимоотношения бактерий рода Pseudomonas и эндомикоризного гриба Glomus intraradices в ризосфере сорго // Микология и фитопатология. -2006. Т. 40. - Вып. 1. - С. 66-73.

48. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Высш. школа, 1980. - 293 с.

49. Лапина В.В., Гордеева Л.В., Тостаева А.Г. Планриз протравитель и фунгицид // Защита и карантин растений. - 2003. - № 2. - С. 19.

50. Максимова Н.П., Блажевич О.В., Лысак В.В., Фомичев Ю.К. Характеристика флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм, продуцируемого бактериями Pseudomonas putida II Микробиология. 1994. - Т. 63. - Вып. 6. -С. 1038-1044.

51. Малюга А.А., Южаков А.И. Видовой состав, биологические особенности и патогенность возбудителя фомоза картофеля в Западной Сибири // Микология и фитопатология. 2003. - Т. 37. - Вып. 2. - С. 73-82.

52. Маркаров A.M., Головко, Т.К., Табаленкова Г.Н. Морфофизиология клуб-необразующих растений. СПб.: Наука, 2001. - 208 с.

53. Матевосян Г.Л., Шишов А.Д. Применение регуляторов роста, индукторов устойчивости и органического удобрения агровит-кора при выращивании картофеля // Агрохимия. 2006. - № 5. - С. 56-64.

54. Методика исследований по культуре картофель // Редкол.: Н.А. Андрюши-на. -М.: Сельхозиздат, 1967. С. 263.

55. Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учеб. пособие / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1991. - 304 с.

56. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике / Ред. С.И. Алиханя-на. М.: Изд-во Мир, 1976. - 438 с.

57. Минаева О.М. Антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и стимулирующее влияние на рост и развитие растений формальдегидутилизирующих бактерий Pseudomonas sp. В-6798 и их применение: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Красноярск: 2007. - 24 с.

58. Мирзабекян P.O. Микробы-активаторы и их антибиотические вещества в борьбе с фитопатогенными микробами // Изв. АНСССР. Серия биологическая. - 1953. - № 2. - С. 67-88.

59. Мишустин Е.Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. М.: Наука, 1972.-344 с.

60. Мордухова Е.А., Скворцова Н.П., Кочетков В.В. и др. Синтез фитогормона ин доли л-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas П Микробиология. 1991. - Т. 60. - Вып. 3. - С. 494-499.

61. Надыкта В.Д. Перспективы биологической защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Защита и карантин растений. 2004. - № 6. -С. 26-28.

62. Нетрусов А.И. Микробиология: учебник для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, И.Б. Котова. М.: Издат. центр «Академия», 2006. - 252 с.

63. Новикова И.И. Полифункциональные биопрепараты для защиты растений от болезней // Защита и карантин растений. 2005. - № 2. - С. 22-24.

64. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ. / Под редакцией Дж. Хоулта, П. Снита и др. М.: Мир, 1997. - 432 с.

65. Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Афанасенко О.С. Первая Всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям, посвященная 300-летию Санкт-Петербурга. Хроника // Вестник защиты растений. -2002.-№2.-С. 73-75.

66. Палладина Т.А., Первова Ю.А. Влияние стимуляторов прорастания на ана-томо-биохимические особенности ростков и клубней картофеля // Физиология растений. 1966. - Т. 13. - Вып. 2. - С. 283-289.

67. Пат. РФ 2094391. Способ биологической утилизации формальдегида из его водных растворов // Евдокимов Е.В., Евдокимов А.В., Миронов М.В.

68. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. 2-е изд., пере-раб. и доп. - М.: Колос, 1974. - 560 с.

69. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология. Новосибирск: Изд-во «Наука» Сиб. отд., 1978. - 280 с.

70. Печуркин Н.С., Брильков А.В., Марченкова Т.В. Популяционные аспекты биотехнологии. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1990. - 173 с.

71. Полянская J1.M., Ведина О.Т., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Стимуляция роста растений культурами Beijerinckia и Clostridium II Микробиология. 2002. -Т. 71.-№ 1.-С. 123-129.

72. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1976. - 397 с.

73. Лузина Т.И., Кириллова И.Г., Якушкина Н.И. Динамика индолилуксусной кислоты в органах картофеля на разных этапах онтогенеза и ее роль в регуляции роста клубня // Изв. АН. сер. биологич. 2000. - № 2. - С. 170-177.

74. Решновецкий С.Б., Климова Н.В., Склейнова М.И. Чем протравливать картофель // Защита и карантин растений. 2003. - № 2.- С. 47.

75. Романовская Т.В., Коломиец Э.И., Здор Н.А., Лобанок А.Г. Биопрепарат Энатин с широким спектром антимикробного действия // Прикл. биох. и микроб. 2002. - Т. 38. - № 1 о. - С. 669-676.

76. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -М.: Наука, 1986.-200 с.

77. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие / Под ред. Н.С. Егорова. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 1995. -224 с.

78. Сергиенко В.Г. Биостимуляторы на картофеле, огурце и томате // Защита и карантин растений. 2005. - № 10. - С. 26-27.

79. Сидоренко О.Д. Действие ризосферных псевдомонад на урожайность сельскохозяйственных культур // Агрохимия. 2001. - № 8. - С. 56-62.

80. Сидоренко О.Д. Перспективы использования бактериальных препаратов для повышения продуктивности лекарственных растений // Международный с/х журнал. 1994. - № 2. - С. 24.

81. Скилягина Т.С. О природе антагонистического действия {Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula) на фитопатогенные грибы. Микрофлора растений и почв // Сб. ст. отв. ред-р З.М. Яковлева. Новосибирск: Наука, 1973.-С. 237-252.

82. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas / Отв. ред Ай-зенман Б.Е.; АН УССР, Ин-т Киев: Наук. Думка, 1990. 264 с.

83. Соколов М.С. Состояние, проблемы и перспективы применения экологически безопасных пестицидов в растениеводстве // Агрохимия. 1990. -№ 10.-С. 124-143.

84. Сорокина Т.А., Липасова В.А., Андреева Н.Б., Хмель И.А. Использование бактерий-антагонистов для биологической защиты растений гвоздики от фузариоза в условиях гидропоники // Биотехнология. 1999. - № 4. - С. 7882.

85. Суховицкая Л.А., Мохова С.В., Сафронова Г.В. и др. Бактериальный препарат ризобактерин: штамм-продуцент, получение, итоги применения // Биотехнология. 2001. - № 2. - С. 57-63.

86. Терещенко Н.Н. Проблемы и перспективы применения бактериальных препаратов в сельскохозяйственной практике // Томский агровестник. -2004.-№2.-С. 39-46.

87. Томилова О.Г., Штерншис М.В. Влияние препарата на основе грибов рода Chaetomium на рост фитопатогенных грибов // Прикл. биох. и микроб. -2006. Т. 42. - № 1. - С. 76-80.

88. ТУ 9291-012-00494172-98. Технический регламент на производство план-риза (жидкий). Разработано: В.Г. Сычев, А.П. Твердюков, А.Н. Перебитюк. Министерство С/х и продовольствия России, РАСХН, ЦИНАО, 1998 г.

89. ЮЗ.Тупеневич С.М. Защита картофеля от главнейших болезней. JL: Колос, 1973. - 144 с.

90. Физиология растений с основами биохимии: Учеб. пособие / Под ред. картофеля // Международный с/х журнал. 2005. - № 4. - С. 50-51.

91. Филимонов П.Н. Действие витамина В.2 на рост, развитие и урожай некоторых сельскохозяйственных растений // Физиология растений. 1967. -1967.-Т. 14. - Вып. 1. - С. 84-88.

92. Юб.Хайбуллин М., Бураканова Э. Влияние применения минеральных удобрений на содержание нитратов в клубнях. Микрофлора корней пшеницы и некоторые ее свойства // Микробиология. 1956. - Т. 25. - Вып. 2. - С. 184 -189.

93. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Триглицеридпептиды псевдомонад новые агенты биологического контроля фитопатогенных грибов // Прикл. биох. и микробиол. - 2005. - Т. 41. - № 1. - С. 90-94.

94. Чулкина В.А., Коняева Н.М., Кузнецова Т.Т. Борьба с болезнями сельскохозяйственных культур в Сибири. М.: Россельхозиздат, 1987. - 225 с.

95. Чумак Н.Е., Степная О.А., Черменская Т.С., Кулаев И.С., Несмеянова М.А. Особенности секреции бактериолитических ферментов и полисахарида у бактерий из семейства Pseudomonadaceae // Микробиология. 1995. -Т. 64.-№ 1.-С. 55-62.

96. ПО.Шабаев В.П. Минеральное питание и продуктивность люцерны при инокуляции смешанными культурами бактерий // Агрохимия. 2006. - № 9. -С. 24-32.

97. Ш.Шабаев В.П., Олюнина JI.H., Смолин В.Ю. Функциональная активность корней кукурузы при инокуляции стимулирующими рост растений ризо-сферными бактериями рода Pseudomonas II Физиология растений. 1999. -№ 1.-С. 39-46.

98. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Роль железа в регуляции синтеза белков у микроорганизмов // Успехи микробиологии. Т. 22. - М.: Наука, 1988.-С. 108.-115.

99. Шкалы для оценки поражения болезнями сельскохозяйственных культур. Методические рекомендации / Министерство СХ РСФСР. Составитель к.б.н. А.А. Эльчибаев. Воронеж: Изд-во ВНИИЗР. - 1981. - 83 с.

100. Шмойлова Т., Федотов В., Столяров О. Урожайность и симбиотическая активность сои в зависимости от применения минеральных и бактериальных удобрений // Международный с/х журнал. 2006. - № 1. - С. 50-51.

101. Пб.Штарк O.IO., Шапошников А.И., Кравченко Л.В. Продуцирование анти-фунгальных метаболитов Pseudomonas chlororaphis при росте на различных источниках питания // Микробиология. 2003. - Т. 72. - № 5. - С. 645-650.

102. Штерншис М.В. Роль и возможности биологической защиты растений // Защита и карантин растений. 2006. - № 6. - С.14-17.

103. Штерншис М.В., Джалилов Ф.С., Андреева И.В., Томилова О.Г. Биопрепараты в защите растений. Новосибирск: 2000. - 128 с.

104. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ.вузов / А.И. Нетрусов, Е.А. Бонч-Осмоловская, В.М. Горленко и др.; Под ред. А И. Нетрусова. -М.: Изд. центр «Академия», 2004. 272 с.

105. Alexander D.B., Zuberer D.A. Responses by iron-efficient and inefficient oat cultivars to inoculation with siderophore-producing bacteria in a calcareous soil

106. I Biol. & Fert. of Soils. 1993. - Vol. 16. - № 2. - PP. 118-124. - Режим доступа: http://www.springerlink.com, электрон, библиотека.

107. Bagg A., Neilands J.B. Molecular mechanism of regulation of siderophore-mediated iron assimilation // Microb. Reviews. 1987. - Vol. 51. - №. 4. -PP. 509-518. - Режим доступа: http://mmbr.asm.org/, электрон, библиотека.

108. Bellis P.de, Ercolani G.L. Growth interactions during bacterial colonization of seedling rootlets // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 67 (4). - PP. 19451948. - Режим доступа: http://mmbr.asm.org/, электрон, библиотека.

109. Benizri Е., Baudoin Е. and Guckert A. Root colonization by Inoculated Plant Growth-Promoting Rhizobacteria // Biocontrol science and technology. 2001.- № 11. P. 557-574. - Режим доступа: http://www.tandf.co.uk, электрон, библиотека.

110. Brown J.A., Burch G., Saratchchandra S.U. Beneficial and deleterious rhizosphere bacteria in New Zealand pastures // New Zealand J. of Agricultural Research. 2000. - Vol. 43. - PP. 549-558. - Режим доступа: http://www.rsnz.org/, электрон, библиотека.

111. Buck J.W., Traquair J.A. Influence of iron depletion on interactions between peach bark fungi in vitro II Mycologia. 1998. - Vol. 90. - № 6. - PP. 947953. - Режим доступа: http://mmbr.asm.org/, электрон, библиотека.

112. Cook R.J., Baker K.F. The Nature and Practice of Biological Control of Plants Pathogens // St. Paul (Minn.): Amer. Phytopathol. Soc. 1989. - PP. 1-539. -Режим доступа: http://www.apsnet.org/, электрон, библиотека.

113. Crosa J.H. Genetics and Molecular Biology of Siderophore-Mediated Iron Transport in Bacteria //Amer. Soc. for Microbiol. 1989. - Vol. 53. - № - 4. -P. 517-530. - Режим доступа: http://www.apsnet.org/, электрон, библиотека.

114. Dekkers L.C., Phoelich C.C., Lugtenberg B.J.J. Bacterial traits and genes involved in rhizosphere colonization // Plant Microbe Interactions / Microbialth

115. Biosystems: New frontiers Proceeding of the 8 International symposium of Microbial Ecology. - 2000. - Режим доступа: http://plato.acadiau.ca/isme/ Symposium26/dekkers.PDF, электрон, ресурс.

116. Dexter H. H. Acquisition, Transport, and Storage of Iron by Pathogenic Fungi // Clin Microbiol Rev. /Amer. Society for Microbiol. 1999. - Vol. 12. - № 3. - PP. 394^104. - Режим доступа: http://www.cmr.asm.org/, электрон, библиотека.

117. Dijst G. Formation of sclerotia by Rhizoctonia solani on artificial media and potato tubers // Europ. J. of Plant Pathology. 1988. - Vol. 94. - № 5. - PP. 233-242. - Режим доступа: http://www.springerlink.com/, электрон, библиотека.

118. Dunbar С. Utilization of seaweed extract and plant growth-promoting rhizo-bacterium in greenhouse production of potato minitubers // 1997. Режим доступа: http://www.apsnet.org/ - электронный ресурс.

119. Dwivedi D., Johri B.N. Antifungals from fluorescent pseudomonads: biosynthesis and regulation // Current science. Электрон, журн. - 2003 - Vol. 85. -№ 12. - Режим доступа: http://www.ias.ac.in/, электрон, библиотека.

120. Emmert Е. А.В., Handelsman Jo Biocontrol of plant disease: a (Gram-) positive perspective. Minireview // FEMS Microbiology Letters. - Электрон, журн. - 1999. - Vol. 171. - PP. 1-9. - Режим доступа: http://www.plantpath.wisc.edu/, свободный.

121. Gamalero Е., Lingua G., Berta G., Lemanceau Ph. Methods for studying root colonization by introduced beneficial bacteria // Agronomie. 2003. - Vol. 23.- PP. 407-418. Режим доступа: http://www.mfn.unipmn.it/, электрон, библиотека.

122. Geels F.P., Lamers J.G., Hoekstra О., Schippers В. Potato plant response to seed tuber bacterization in the field in various rotations // Neth. J. PI. Path. -1986. Vol. 92 - PP. 257-272. - Режим доступа: http://mmbr.asm.org/, электрон. библиотека.

123. Grosch R., Lottmann J., Faltin F., Berg G. Use bacterial antagonists to control disease caused by Rhizoctonia solani И Gesunde Pflanzen. 2005. - Vol 57. -№. 8. - PP. 199-205. - Режим доступа: http://www.springerlink. com, электрон. библиотека.

124. Guerinot M.L. Microbial iron transport // Ann. Rev. Microbiol. 1994. - Vol. 48. - PP. 743-742. - Режим доступа: http://www.blackwell-synergv.com, электрон, библиотека.

125. Handelsman Jo, Stabb E.V. Biocontrol of soilborne plant pathogens // The Plant Cell. 1996. - Vol 8. - PP. 1855-1869. - Режим доступа: http://www.plantpath.wisc.edu, электрон, библиотека.

126. Horwath W.R., Elliott L.F., Lynch J.M. Influence of soil quality on the function of inhibitory rhizobacteria // The Society for Applied Microbiology. -1998. Vol. 26. - PP. 87-92. - Режим доступа: http://www.ingentaconnect. com/, электрон, библиотека.

127. Hopkins C.M., Lindow S.E., Loper J.E. Biological sensors for assessment of microbial activity and chemical constituents of natural habitats // Режим доступа: http://www.isb.vt.edu/ - электронный ресурс.

128. Huitema Е., Bos J.I.B., Tian M. etc. Linking sequence to phenotype in Phy-tophthora plant interactions // Trends in Microbiology. - 2004. - Vol. 12. -№ 4. - PP. 193-200. - Режим доступа: http://www.sciencedirect.com, электрон. библиотека.

129. Jurkevitch Е., Hadar Y., Chen Y. Differential siderophore utilization and iron uptake by soil and rhizosphere bacteria // Appl. and Envir. Microb. 1992.

130. Vol. 58. № 1. - PP. 119-124. - Режим доступа: http://www.ansinet.org/. электрон, библиотека.

131. Kerr J.R. Bacterial inhibition of fungal growth and pathogenicity // Microb. Ecol. in Health and Disease. 1999. - № 11. - P. 129-142. - Режим доступа: http://www.ansinet.org/, электрон, библиотека.

132. Kloepper J.W. A review of mechanisms for plant growth promotion by PGPR // 6-th International PGPR Workshop. 5-10 October 2003. - PP. 81-91. - Режим доступа: http://www.ag.auburn.edu/, электрон, библиотека.

133. Kosman D.J. Molecular mechanism of iron uptake in fungi. MicroReview // Molecular Microbiology. - 2003. - Vol. 47 (5). - PP. 1185-1197. - Режим доступа: http://www.apsnet.org/, электрон, библиотека.

134. Larkin R., Talbot M. Suppression of rhizoctonia disease of potato by biological control and a ryegrass rotation // Nat. Amer. Phytopathol. Meetings. 2002.- Режим доступа: http://www.apsnet.org/ электронный ресурс.

135. Loper J.E., Lindow S.E. A biological sensor for iron available to bacteria in their habitats on plant surfaces // Appl. and Environm. Microb. 1994. -Vol. 60. - № 6. - PP. 1934-1941. - Режим доступа: http://www.aem.asm.org/, электрон, библиотека.

136. Loper J.E., Schroth M.N. Influence of bacterial sources of indole-3-acetic acid on root elongation of sugar beet // J. Phytopathology. 1988. - Vol. 76. - № 4.- PP. 386-389. Режим доступа: http://mdl .csa.com/partners, электрон, библиотека.

137. Loper J.E., Suslow T.V., Schroth M.N. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere // J. Phytopathology. 1984. - Vol. 74. - № 12.- PP. 1454-1460. Режим доступа: http://mdl .csa.com/partners, электрон, библиотека.

138. Mohandass С. Bacterial siderophores and their biotechnological applications // Marine microbial.: Facets and opportunities, ed. by Ramaiah, N.NIO; Dona Paula, Goa; India. 2004. - PP. 241-249. - Режим доступа: www.ifremer.fr/- электронный ресурс.

139. Neilands J.B. Some aspects of microbial iron metabolism // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1957. - Vol. 2. - Iss. 2. - PP. 101-111. - Режим доступа: http://www.pubmedcentral.org, электрон, библиотека.

140. Nelson L. M. Plant growth promoting rhizobacteria (PGPR): prospects for new inoculants // Online. Crop Management doi: 10.1094 / CM-2004-0301-05

141. RV. 2004. - Plant Management Network - Режим доступа: http://www.plantmanagementnetwork.org/ - электронный ресурс.

142. Nowak J., Bensalim S., Smith C.D., et al. Behavior of plant material used from in vitro tuberization // Potato Research. 1999. - Vol. 42. - № 3-4. -PP. 505-519. - Режим доступа: http://www.springerlink.com, электрон, библиотека.

143. Palleroni N.I. Introduction to the Family Pseudomonaceae. Berlin heidelberg new York: Springer Verlag. V.L., 1981.-655 p.

144. Persello-Cartieaux F., Nussaume L., Robaglia C. Tales from the underground: molecular plant-rhizobacteria interactions // Plant, Cell & Environment. -2003. Vol. 26. - PP. 189. - Режим доступа: http://www.blackwell-synergy.com/, электрон, библиотека.

145. Press C.M., Loper J.E., Kloepper J.W. Role of iron in Rhizobacteria-mediated Induced Systemic Resistance of cucumber // The Amer. Phytopathol. society, 2001. Vol. 91. - № 6. - P. 593-598. - Режим доступа: http://www.apsnet.org, электрон, библиотека.

146. Schroth М. N., Hancock J. G. Disease Suppressive Soil and Root-Colonizing Bacteria // Science. - 1982. - Vol. 216. - PP. 1376-1381. - Режим доступа: http://www.aem.asm.org/, электрон, библиотека.

147. Slininger PJ., Behle R.W., Jackson M.A., Schisler D.A. Discovery and development of biological agents to control crop pests // Neotropical Entomology. -2003. 32 (2). - PP. 183-195. - Режим доступа: http://www.scielo.br/, электрон. библиотека.

148. Stewart Н. Suppression of verticillium wilt in potatoes with a plant growth promoting rhizobacterium // Academic Dissertation. 1997. - 112 p.- Режим доступа: http://www.apsnet.org/ - электронный ресурс.

149. Sturz A.V. The role of endophytic bacteria during seed piece decay and potato tuberization // PI. and Soil. 2004. - Vol. 175. - № 2. - PP. 257-263. - Режим доступа: http://www.springerlink.com, электрон, библиотека.

150. Sullivan Т. Interactions between soil microbial communities and plant roots: a minireview // April. 2005. - Режим доступа: http://www.aem.asm.org/-электронный ресурс.

151. Totter J.R., Moseley F.T. Influence of the concentration of iron on the production of fluorescin by Pseudomonas aeruginosa II Электрон, ресурс. 1952. -PP. 45-47. - Режим доступа: http://www.ib.asm.org/, свободный.

152. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M. Induced systemic resistance as a mechanism of disease suppression by rhizobacteria // PGPR: Biocontrol and Biofer-tilization. 2005. - 39-66. - Режим доступа: http://www.apsnet.org, электрон, библиотека.

153. Van Loon L.C., Bakker P.A.H.M. Signalling in rhizobacteria-plant interactions // Ecological Studies. Vol. 168. - Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2003. - Режим доступа: http://www.apsnet.org, электрон, библиотека.

154. Walker T.S., Pal Bais H., Grotewold E., Vivanco J.M. Root exudation and rhizosphere biology // Plant Physiol. 2003. - Vol. 132. - PP. 44-51. - Режим доступа: http://www.plantphysiol.org, электрон, библиотека.

155. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. of experimental botany. Электрон, журн. - Warwick, 2001. - Vol. 52. - № 90001. - P. 487-511. - Режим доступа: http-.//intlsoil.scijournals.org, свободный.

156. Wiebe M.G. Siderophore production by Fusarium venenatum A3/5 // Biochemical Society Transactions. 2002. - Vol. 30. - PP. 696-698. - Режим доступа: http://www.biochemistry.org/, электрон, библиотека.

157. Wilmar С. da LUZ Evaluation of plant growth-promoting and bioprotecting rhizobacteria on wheat crop // Fitopatol. bras. 2001. - Vol. 26. - № 3. - Режим доступа: http://www.scielo.br/, электрон, библиотека.

158. Zehnder G.W., Murphy J.F., Sikorra E.J., Kloepper J.W. Application of rhizobacteria for induced resistance // Europ. J. of Plant Pathol. 2001. -№ 107. - PP. 39-50. - Режим доступа: http://www.ag.auburn.edu/, электрон, библиотека.

159. Zidack N.K., Quimby Jr P.C. Formulation of bacteria for biological weed control using the stabilize method // Biocontrol Science and Technology. 2002. -№ 12. - PP. 67-74. - Режим доступа: http://www.apsnet.org, электрон, библиотека.

Информация о работе

Акимова, Елена Евгеньевна
кандидата биологических наук
Томск, 2007
ВАК 03.00.16

Диссертация

Исследование влияния бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на фитопатогенные грибы и высшие растения - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы