Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и стимулирующее влияние на рост и развитие растений формальдегидутилизирующего штамма Pseudomonas sp. B-6798 и применение

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и стимулирующее влияние на рост и развитие растений формальдегидутилизирующего штамма Pseudomonas sp. B-6798 и применение"

На правах рукописи

llllllll IIIIIIIIIIIII

003068603

Ч—__._

Минаева Оксана Модестовна

АНТАГОНИСТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НА ФИТОПАТОГЕННЫЕ ГРИБЫ И СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ВЛИЯНИЕ НА РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ ФОРМАЛЬДЕГИДУТИЛИЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. В-6798

И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

03.00.23 - Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Томск - 2007

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Томского государственного университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Евгений Васильевич Евдокимов

Официальные оппонеиты:

доктор физико-математических наук Юрий Леонидович Гуревич

кандидат биологических наук Сергей Витальевич Хижняк

Ведущая организация:

Новосибирский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится « /О » 2007 г. в ^^ час. на засе-

дании диссертационного совета Д 003 007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу. 600036, г Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН Автореферат разослан « ^ » 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук Н С. Кудряшева

Актуальность работы. В связи с биологизацией и экологизацией сельскохозяйственного производства направление по созданию биопрепаратов по защите растений с полифункциональными свойствами становится все более актуальным ((Сожемяков, Тихонович, 1998; Кравченко и др , 2002, Смирнов, 2006; Надыкта, 2004) Одними из потенциальных объектов агробиотехнологии являются ризосферные PGPR (от Plant Growth-Promotion Rhizobacteria), широко используемые для разработки биологических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений Механизм действия этих микроорганизмов на фитонагогены включает конкуренцию за источник питания, эффективную колонизацию ризосферы, синтез антибиотических и рострегулирующих веществ (Воронин, Кочетков, 2000, Мордухова и др., 1998; Штерншис и др, 2000, Ellis ct al, 2000, Bemzn et al, 2001 и т д ) Над расширением ассортимента микробиологических препаратов, изысканием путей их эффективности работают многие научные учреждения России, при этом все отчетливее проявляется значение полифункционального действия биопрепаратов (Смирнов, 2006)

Среди ризосферных бактерий особое место занимают бактерии рода Pseudomonas О перспективах практического применения можно судить по списку уже разработанных на их основе биопрепаратов BlightBan А506, BioSave, Blue-Circle, Intersept, Vtclus, Планриз, Агат-25, Псевдобактерип-2, проявляющих высокую антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям, а также способность к стимуляции роста сельскохозяйственных культур (Воронин, 1998, Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, 2005) Несмотря на все видимые преимущества, применение биологических средств защиты растений сдерживается достаточно высокой стоимостью, которая складывается в первую очередь из стоимости углеводсодержащих питательных сред и затрат на мероприятия по обеспечению стерильности В связи с этим возникает необходимость поиска новых микроорганизмов, которые помимо комплекса положительных эффектов на рост и развитие сельскохозяйственных культур, могли бы использовать в качестве источника углерода и энергии менее дорогостоящие соединения, обеспечивающие одновременно стерильность процесса культивирования

Целью данной работы являлось изучение формальдегидрезистентных бактерий Pseudomonas sp В-6798 как агентов биологической борьбы с возбудителями корневых гнилей зерновых культур грибами родов Fusarium и Bipolaris, обладающего стимулирующими развитие и продуктивность растений свойствами как в монокультуре, так и при совместном применении с другими широко распространенными ризобактериями В задачи исследования входило

1 Изучение кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов родов Fusarium и Bipolaris на плотных питательных средах бактериями Pseudomonas sp В-6798, как в монокультуре, так и при соинокуляции с другими ризобактериями, разработка универсального параметра оценки антифунгальной активности бактериальных штаммов

.......

2 Определение фунгистатической активности бактерий Pseudomonas sp. В-6798 и других риюбактерий по отношению к возбудителям семенных инфекций при бактеризации семян

3 Выявление кинетических аспектов стимулирования роста и развития растений бактериями Pseudomonas sp В-6798 и другими ризосферными бактериями в лабораторных вегетационных тестах

4 Оценка эффективности обработки семян бактериями Pseudomonas sp В-6798 и другими ризобактериями в полевых экспериментах

5 Сравнительная оценка применения бактерий Pseudomonas sp В-6798 с официально рекомендованным к применению против возбудителей корневых гнилей зерновых культур биопрепаратом «Планриз» на основе бактерий Pseudomonas fluorescens АР 33

Научная новизна работы. В работе впервые показаны кинетические аспекты взаимоотношения бактерий Pseudomonas sp В-6798 с растением-хозяином и фитопатогенными грибами Отмечено, что кинетика ингибирования роста грибов родов Fusarium и Bipolaris риэосферпыми бактериями описывается модифицированным уравнением Н Д Иерусалимского Количественно антифунгальный эффект бактериальных штаммов при проведении лабораторных тестов может быть оценен с помощью константы ингибирования (К,) Для исследованных бактериальных штаммов К, обычно находится в пределах Ю'-Ю3 кл/мл

Впервые обнаружено, что зависимость параметров роста и развития растений от концентрации бактерий в инокуляте, выраженной в логарифмическом виде, в лабораторных тестах, как правило, принимает вид выпуклой кривой с экстремумом Экстремум выпуклой линии приходится на бактериальные концентрации, в которых параметры роста и раз-' вития растений максимальны Сравнение ростостимулирующей активности бактериальных штаммов должно проводиться с учетом наиболее эффективных для растения концентраций (для исследуемых бактерий 104-107 кл/мл)

В полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития пшеницы, овса и кукурузы под действием бактерий Pseudomonas sp В-6798 как в монокультуре, так при применении в микробной паре, которая наиболее отчетливо проявляется на начальных этапах развития растений Бактеризация семян пшеницы штаммом Pseudomonas sp В-6798 позволяет уменьшить развитие корневых гнилей в фазу формирования колоса-цветения на 14-50 %, проявление листовых инфекций - в 2,0-3,5 раза

Практическая значимость. Проведенные лабораторные тесты и полевые испытания позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp. В-6798 к применению в качестве биофунгицида против возбудителей корневых гнилей на зерновых культурах, обладающего одновременно стимулирующими рост и развитие растений свойствами, как в монокультуре, так и в совместном применении со штаммами, проявляющими ростостимулирующие свойства При выращивании бактерий на среде содержащей формальдегид, стоимость препарата снижается на 25-30 % по сравнению с аналоговыми биопрепаратами за счет

уменьшения затрат, направленных на достижение стерильности процесса культивирования При этом биологическая эффективность применения препарата на основе формальде-гидрезистентных бактерий Pseudomonas sp В-6798 на 10-60 % выше аналогового биопрепарата «Планриз», причем положительный эффект от применения опытного штамма является достаточно стабильным, что показали полевые испытания, проведенные на протяжении трех лет.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на VI международной конференции «Регуляторы роста растений в биотехнологии» (Москва, 2001), городской конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 1999), VI Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002), XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2005), IX Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005)

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертации было сделано 12 публикаций, из них 2 в изданиях, рецензируемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 136 страницах с приложениями, содержит 33 рисунка, 15 таблиц в основной работе и 18 таблиц вынесено в приложение Список литературы включает 170 источников, из них 65 - на иностранном языке

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 2. Объекты и методы исследования

Обгьектом исследования являлись формальдегидрезистентные бакгерии Pseudomonas sp ВКПМ В-6798 Бактерии выделены из активного ила очистных сооружений Томского Нефтехимического Комбината Штамм непатогенных факультативно метилотрофных бактерий способен использовать формальдегид в составе минеральных сред в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации 267 М (8 г/л)

В качестве микробной пары, а также дополнительного контроля использовались бактерии Azotobacter chroococcum ВКМ В-2272 Д Для оценки эффективности применения использовались бактерии Pseudomonas fluorescens ВКПМ АР 33, являющиеся активным началом биопрепарата «Планриз» Для оценки антагонистической активности бактерий в качестве тест-объектов рассматривались грибы разновидностей Fusarium oxysporum f sp Iini и F. oxysporum f sp gladioli, а также штамм фитопатогенного гриба F, oxysporum выделенный сотрудниками лаборатории биокинетики и биотехнологии с зерен пшеницы в 1996 году Культура гриба Bipolaris sorokmiana была предоставлена НН Терещенко из коллекции лаборатории микробиологии СО РАСХН НИИ СХ и Торфа (Томск) Для оценки ростстимулирующей активности использовались семена кукурузы сорта Молдавская-215 (средняя масса семени 0,5 г, общая всхожесть - 75 %), пшеницы сорта Тулунская-12 (0,03 г, 97 %), овса сорта Нарымский-943 (0,05 г, 93 %).

Питательные среды и культивирование. Культивирование бактерий Pseudomonas sp В-6798 проводилось на минимальной среде М9 (Миллер, 1976) с формальдегидом (2 г/л) Для кулыивлрования бактерий А chroococcum В-2272 Д использовалась среда Эшби (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1995) Культивирование бактерий осуществлялось в колбе объемом 250 мл с 50 мл среды Культуры термостатировались (30±0,5 °С) до достижения численности 1—9* 109 кл/мл Контроль численности осуществлялся прямым подсчетом клеток в камере Горяева и посевом методом предельных разведений на плотную среду с дальнейшим подсчетом КОЕ (Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 1995). Бактерии Р. fluorescens АР 33 (биопрепарат «Планриз») были предоставлены ФГУ «Томская станция защиты растений». Для выращивания грибов использовался 20 % сусло-агар (Методы экспериментальной микологии, 1982)

Технология культивирования бактерий Pseudomonas sp В-6798. Использование в качестве единственного источника углерода и энергии ингибитора роста микробных клеток (формальдегид) в концентрациях свыше 2 г/л возможно только при его дробном введении в культивируемую биомассу клеток Для чего колбы на 250 мл со 50 мл минеральной среды М9 засеваюг посевной культурой бактерий Pseudomonas sp В-6798 (5-10 %), добавляют формальдегид в количестве 1 г/л, помещают на микробиологические качалки при аэрации 200 оборотов/мин В процессе культивирования осуществляют дополнительное введение формальдегида, культивирование считается оконченным при достижении титра бактериачьных клеток 1-2* 10® на мл

В процессе жизнедеятельности бактерии окисляют формальдегид до муравьиной кислоты, при этом наблюдается снижение значения pH, однако снижение значения ниже рН=6,0 может снизить жизнеспособность микробных клеток вплоть до гибели, поэтому

количество формальдегида устанавливают экспериментальным путем. После окисления бактерии начинают потребление муравьиной кислоты, при этом значение pH возрастает Достижение начального значения pH (рН=6,7) служит сигналом для следующего введения порции формальдегида Ускорение процесса окисления служит сигналом для увеличения порции формальдегида (рис 1) Таким образом, достигается необходимая концентрация бактериальных клеток. По нашнм данным, при культивировании бактерий в

Время, мин

Рисунок 1 - Схема дробного введения порций формальдегида и изменение значений pH при культивировании бактерий Pseudomonas sp В-6798

Примечание Стрелками обозначено введение в среду формальде! ида

колбах на микробных качалках при указанном режиме аэрации для достижения численности 1-2*10'кл/мл достаточно введения общего количества формальдегида 4 г/л

Изучение кинетики ингибирования бактериями роста Фитопатогенных грибов Использованная методика исследования позволяет проследить зависимость роста грибов от титра бактерий в инокуляте (Минаева, Акимова, 2006) В качестве измеряемого параметра, отражающего рост гиф гриба, использован диаметр колоний, образующихся на плотных средах на чашках Петри при стандартизованной процедуре инокуляции. Для чего на чашки Петри с сусло-агаром газоном высевались бактериальные суспензии (0,1 мл) В случае соинокуляции бактерий количество наносимой суспензии каждого вида было уменьшено до 0,05 мм (50 % от применения монокультуры) После появления видимого бактериального роста для предотвращения физического контакта бактериальных и грибных колоний посевы заливали тонким слоем агаризованной среды. После чего на поверхность помещались агаровые блоки с мицелием гриба диаметром I мм равномерно по шаблону. Блоки вырезались из сплошного шестисуточного газона мицелия цилиндрическим пробкорезом Чашки инкубировались в термостате (24±1,0 °С) Единым параметром оценки степени ан-тифунгального влияния предложено использование константы ингибирования

Изучение влияния бактеризации на зараженность семян возбудителями семенных инфекций В ходе экспериментов предварительно обеззараженные семена, замачивались на 30 мин в бактериальных суспензиях с концентрацией 1-6* 106 кл/мл. Выбор концентрации определялся рекомендованной дозой для применения бактериальных препаратов, указанной в Государственном каталоге пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории РФ (2005) В варианте с соинокуляцией количество суспензии каждого вида бактерии уменьшено вдвое. Семена чистого контроля замочены в стерильной воде Снижение пораженное™ семян возбудителями семенных инфекций оценивали при проведении фитопатологического анализа в рулонах стерильной фильтровальной бумаги через 7 дней с момента закладки (Чулкина, Коняева, Кузнецова, 1987)

Исследование влияния бактериальной концентрации на рост и развитие растений в вегетационных лабораторных экспериментах В экспериментах была создана модель малых наземных искусственных систем (Сомова, 1999), состоящая из трех звеньев, стерильный песок, которым заполнялись вегетационные сосуды, - растение-хозяин - бактериальные штаммы в концентрациях Ю'-Ю' кл/мл. Предварительно обеззараженные и проращенные семена помещались в пробирки с песком (12,5 см3) и равномерно увлажнялись стерильным раствором Кнопа (Баславская, Трубецкова, 1964) Инокуляция проводилась 0,1 мл бактериальных суспензий в концентрациях, при соинокуляции количество суспетии каждого вида бактерии уменьшено вдвое (по 0,05 мл). Растения выращивали в фиюкамерах при 12-ти часовом освещении и температуре 24±0,5 "С

Проведение полевых экспериментов В ходе экспериментов бактеризованные семена высевались на пробные площадки. Семена кукурузы высаживались на расстоянии 1015 см друг от друга, пшеница и овес высевалась из расчета 600 семян на м2 В ходе жспс-

римента снопиками проводили отбор растений равномерно по всей площади Далее измерялась длина растений, сухая биомасса, определялась пораженность возбудителями корневых гнилей и листовых инфекций (Методологические указания по проведению производственных испытаний средств и методов защиты зерновых культур от болезней, 2004) Полевые эксперименты с кукурузой и овсом были проведены в вегетационный период 2004 года, с пшеницей - в сезоны 2003 и 2005 годов

Статистическая обработка материала Данные, полученные в ходе экспериментов, обрабатывались с помощью пакета STATISTIC for Windows, версия 6.0 Данные в работе представлены в виде средней с доверительным интервалом с учетом критерия Стьюдента для 95 % уровня значимости Оценка достоверности полученных результатов фитоанализа семян, распространенности корневых гнилей и листовых инфекций в полевых экспериментах проводилась сравнением выборочных долей с учетом критерия Стьюдента для вероятностей 25-75 % включительно, с учетом критерия Фишера для других значений вероятностей Сравнение данных параметров роста и развития растений в полевых экспериментах - по непараметрическому критерию Mann-Whitney (р<0,05). Определение скоростей рост а грибных колоний на твердой питательной среде проводилось с использованием линейного регрессионного анализа Параметры уравнений для исследования кинетики ин-гибировамия бактериями роста грибов и параметров роста растений вычислялись с использованием нелинейного регрессионного анализа (Лакин, 1990) Глава 3. Результаты и обсуждение 3.1. Селекция формальдегид резистентного штамма Pseudomonas sp. В-6798 Проблема получения устойчивых к различным ингибиторам штаммов микроорганизмов является одной из центральных в биотехнологии. Одним из экспериментальных путей получения является управляемая автоселекция бактерий в /астате к повышенным концентрациям ингибиторов роста. В основу инструментальной реализации д-стата был положен турбидосгат с оптическим измерением концентрации клеток непосредственно в ферментере и дополнительным контуром регулирования удельной скорости роста путем изменения концентрации ингибитора (Евдокимов, Шарубин 2002) В процессе автоселекции заданное значение fi для регуляции составляло 0,1 час'1. На первом этапе культивирования с ростом концентрации формальдегида удельная скорость роста бактерий возрастает, достигая очень высоких для этой группы микроорганизмов значений (д=1,15 час"'), и резко падает из-за наступления ингибирующего эффекта формальдегида Далее начинают отбираться штаммы бактерий, устойчивые к возрастающим концентрациям формальдегида, при этом концентрация их в ферментере непрерывно возрастает В результате получена популяция бактерий, способная активно расти при концентрации формальдегида не менее 950 мг/л (Евдокимов, Печеркин, 1982) Дальнейшая селекция бактерий велась на градиен-тостате Для чего два параллельно соединенных ферментера, один из которых - «базовый», а второй - «разведочный». Через каждый ферментер организован проток с подачей питательной среды с определенной концентрацией ингибитора и отъемом избытка био-

массы, значение протоков одинаково Между ферментерами осуществлялся обмен культу-ральной средой и клетками, при этом удельная скорость потока была существенно меньше величины протока В «базовом» ферментере концентрация ингибитора соответствовала достигнутому уровню резистентности, популяция росла в устойчивом хемостатном режиме. В «разведочном» - концентрация ингибитора устанавливалась на уровне, обеспечивающем снижение скорости роста клеток ниже значения протока, в результате популяция вымывалась При появлении мутантных клеток с более высоким уровнем резистентности «разведочный» ферментер заселялся Управляющая система отслеживала заселение «разведочного» ферментера по увеличению оптической плотности и выполняла следующие операции, устанавливала в «базовом» ферментере такую же концентрацию ингибитора, что и в «разведочном». Затем дожидались установления в нем нового стационарного режима за счет вытеснения исходного штамма мутантным, и плавно повышали концентрацию ингибитора в «разведочном» ферментере до тех пор, пока не устанавливалось новое состояние «разведки» Далее весь цикл отбора повторялся на более высокой концентрации ингибитора Таким образом, удалось повысить устойчивость культуры псевдомонад к формальдегиду в 10 раз, не теряя при этом кинетических характеристик роста Полученный в ходе управляемой автоселекции штамм бактерий Pseudomonas sp В-6798 обладает аномально высокой резистентностью к формальдегиду: 8-10 г/л в условиях периодического культивирования (д=0,3 час"1) и 60 г/л при пиковых нагрузках (Патент РФ № 2102474)

Проведенные нами длительные эксперименты с использованием полученного штамма псевдомонад показали высокую стабильность штамма В процессе экспериментов нами не было отмечено никакой реверсии бактериальных признаков Полученный штамм в дальнейшем был исследован на предмет возможности создания на его основе биофунгицида и стимулятора роста растений.

3.2. Кинетика ингибировання роста фитопатогенных грибов ризосферными бактериями in vitro

Фунгистатическая активность является достаточно распространенным признаком среди бактерий различных таксономических групп Практическое значение эта бактериальная черта нашла как в медицине (Kerr, 1991), так и в сельском хозяйстве в борьбе с различными фитопатогенными грибами (агенты защиты растений) (Штерншис, 2000) В своих работах исследователи отмечают, что антифунгальная активность бактерий, обнаруженная т vitro, как правило, положительно коррелирует со способностями бактерий ингибировать рост фитопатогенов т vivo (Georgakopoulos et al, 2002; Berg et al, 2001; Kerr, 1991), поэтому проведение лабораторных экспериментов является неотъемлемой частью и эффективным способом изучения взаимоотношений грибов с ризосферными бактериями Однако большинство из известных методик позволяют лишь оценить наличие фунгистагического эффекта, не давая четкого представления о его степени Нами была предложена и апробирована методика, позволяющая численно оценить эффект подавления роста грибных колоний бактериальными штаммами на твердых питательных средах в чашках Петри В ходе

экспериментов каждые 24 часа проводили измерение диаметра грибных колоний, образующихся на питательных средах с различными концентрациями бактерий в инокуляте. На рис 2 на примере колоний гриба F oxysporum f sp lim на среде с бактериями Pseudomonas sp В-6798 показаны увеличения диаметров колоний гриба с течением времени

Из литературных данных известно, что рост филаментозных организмов, не подчиняется экспоненциальному закону Зависимость роста гиф гриба от времени линейна (Перт, 60 г-————.......—^- 1978, Бейли, Оллис, 1989) В наших экспериментах рост колоний гриба являлся линейным как в контроле, так и в присутствии бактерий, причем, с увеличением бактериальной концентрации происходило замедление роста гриба В качестве количественной оценки скорости роста использовался тангенс угла наклона пря-

80 100 120 140

Время ч мых' отражающих изменение

Рисунок 2 - Рост колоний гриба F oxysporum f sp hm при раз- Диаметра колоний с течением личных концентрациях клеток Pseudomonas sp штамм В-6798 времени Анализ полученных Примечание I - рост колоний в контроле (ложный посев), 2

при концентрации бактерий в инокулюме 10 кл/мл, 3 -

данных показал, что скорость

10" кл/мл, 4-10' кл/мл роста грибов с увеличением кон-

центраций бактерий стремится к предельному значению, не равному нулю, т е. не наблюдается полного абсолютного ингибирования. В рассмотренных моделях достаточно концентрации 107-108 кл/мл для достижения предельного значения скорости роста

Согласно литературным данным, эффект ингибирования роста грибов бактериями рода Pseudomonas связан, с выделением различных антибиотиков и сидерофор (желто-зеленый пигмент, осуществляющий транспорт железа) (Berg et al, 2001, Meena et al, 2002, Воронин, 1998, Рубан 1986 и т д ) Связывая ноны трехвалентного железа и образуя с ним стабильные комплексы, сидерофоры лишают грибов необходимого элемента питания (Штерншис идр 2000, Воронин, 1998, Соколов, 1990) Известно, что бактерии Pseudomonas sp В-6798 синтезирует желто-зеленый пигмент (Патент РФ №21022474), а эффект ингибирования роста грибов уменьшается добавлением в среду соединений трехвалентного железа (Гущина, Евдокимов, 1999), поэтому нам представляется возможным, что в эффекте ингибирования наибольшую роль занимает сидерофорный механизм

Для описания кинетики ингибирования роста грибных колоний исследуемыми бактериями, нами было использовано модифицированное уравнение Н Д Иерусалимского.

ПС) = г.

К"

(1)

где V(C) - скорость увеличения диаметра колоний фито-

К"+С" ' к / патогенных грибов (мм/час), У„-остаточная скорость роста гриба при "бесконечной" концентрации бактерий (мм/ч); Утт - кинетический пара-

метр, отражающий скорость роста гиф, в отсутствии бактерий, К( - константа ингибирования, численно равная концентрации бактерий, при которой достигаегся половина от максимального эффекта ингибироваяия (кл/мл), я - коэффициент нелинейности ингибирования; С - концентрация клеток бактерий (кл/мл)

Графическое отображение описанной модели представлено на рис 3 на примере с Р. охуврогши Г эр. 1пи на среде с различными концентрациями псевдомонад

Об эффективности фунгистати-ческого влияния изучаемых бактерий можно судить, прежде всего, по константе ингибирования (К,). Чем ниже данный параметр уравнения, тем чувствительней гриб к бактерии и наоборот, чем К, больше, тем менее чувствителен к влиянию бактерии гриб. Наибольшей чувствительностью к

0,6

0,5

§ 0,4

'S °-3

е

s

g 0.2

0.1

•

t

• • \ * t

¿xj

К, • 1 •

0,0

0,0005 0,5000 500,0000 5Е5 5Е8

Концентрация бактериальных клеток в инокуляте, кл /мл Рисунок 3 - Зависимость скорости роста колоний гриба F ох-ysporum f.sp. lini от концентраций бактериальных клеток Pseudomonas sp В-6798

присутствию бактерий обладал В. sorokiniana Значительный эффект ингибирования наблюдался на концентрациях бактерий в инокуляте около 10 кл/мл для варианта с использованием опытного штамма псевдомонад и смеси, и порядка 102 кл/мл для азотобактера. В ряду рассмотреппых разновидностей грибов рода Fusarium наибольшей чувствительностью к псевдомонадам обладал F. oxyspoium, выделенный с зерен пшеницы, концентрация клеток, выше которой не происходило заметного увеличения эффекта ингибирования роста гриба, составляло («10*/Г,) 175 кл/мл. Следует отметить, что наименьшие К, для всех грибов наблюдались в вариантах со смесью бактериальных культур, что указывает на присутствие синергического эффекта. Наблюдается приблизительно десятикратное уменьшение К, под действием смеси по сравнению с наиболее эффективной для гриба бактерией, что в практическом смысле означает уменьшение концентрации клеток, необходимых для подавления скорости роста гриба вдвое по отношению к контролю. В экономическом плане уменьшение концентрации антагониста при сохранении уровня контроля заболевания является достаточно выгодным Одной из возможностей такого уменьшения в рядах работ указывается создание «пар» ризобакгерий, которые дают эквивалентное подавление заболевания в концентрациях значительно меньших концентраций одиночного применения (Schisler, Slinger, Bothast, 1997; Georgakopoulos et al, 2002, Duffy, Weller, 1995).

О силе антифунгального действия бактерии на гриб также можно судить по остаточной скорости роста колоний гриба (К„) Анализ данного параметра показывает, насколько полно подавляют рост гриба изучаемые виды бактерий В наших экспериментах, рост ко-

лоний грибов рода Fusarium наиболее полно подавлялся бактериями А. chroococcum В-2272. Д, тогда как у В ¡polaris наибольшее подавление наблюдалось в варианте со смесью. Анализ данных, показывает, чго наблюдаются некоторые отличия в реакции грибов на присутствие бактериальных колоний Наиболее явными они представляются при анализе параметров ингибирования роста колоний грибов разных родов, хотя, в менее отчетливой форме, существуют даже внутри одного вида (рассмотренные разновидности рода Fusarium). Таким образом, можно предположить, что дая изучения параметров ингибирования роста гриба определенного рода, является недостаточным проведение эксперимента на одном из его видов, константа ингибирования варьирует, по нашим наблюдениям, даже в пределах вида. Однако, для оценки присутствия антифунгального эффекта в целом, проведение эксперимента на одной разновидности достаточно показательно для всего вида.

В доступной литературе нами не обнаружено данных о кинетике ингибирования роста грибных колоний бактериальными суспензиями. Как правило, применяемые дня обнаружения антагонистической активности методы, не подразумевают концентрационной зависимости. Большинство экспериментов по изучению антагонистической активности проходит с использованием трех-шести суточной бактериальной культуры, титр которой варьирует от 106-109 кл/мл (Моёппе-Loccoz et al, 1999; Russo et al, 2001; Сидоренко, 2001) Отмеченное в работе синергическое влияние исследуемых бактериальных культур неоднократно упоминалось в литературных источниках. Ряд авторов изучали и продемонстрировали успешные сочетания нескольких бактериальных штаммов (Dufiy, Simon, Weller, 1996; Leeman et al, 1996, Pierson, Weller, 1994; Georgakopoulos et al, 2002 ит.д) 3.3. Влияние бактерий на зараженность семян возбудителями корневых гнилей и других семенных инфекций в лабораторных условиях

Бактеризация семян с дальнейшим проведением фитопатологи-ческой экспертизы позволила выявить влияние бактерий опытного штамма на возбудители семенных инфекций. В качестве дополнительного контроля были рассмотрены варианты с инокуляцией бактериями Р. fluorescens АР 33 (биопрепарат «Планриз») с целью оценки эффективности действия опытного штамма по сравнению с имеющимся аналогом, а также вариант с монокультурой А. chroococcum В-2272 Д для оценки эффективности смеси. На рис. 4

Контроль Pseudomonas sp. Смесь

Планриз А. chroococcum

Рисунок 4 - Общая зараженность семян пшеницы возбудителями семенных инфекций при бактеризации семян

Примечание. * - данные достоверно отличаются от контрольного варианта (р<0,01), ** - от варианта с использованием биопрепарата «Планриз»

представлена общая зараженность семян ошеницы возбудителями семейных инфекций в различных вариантах бактеризации в виде средней с доверительным интервалом для 95 % уровня значимости Как видно из рисунка для опытных вариантов бактеризации семян, а также для варианта с бактеризацией монокультурой A. chroococcum В-2272 Д наблюдается статистически значимое снижение общей пораженносги пшеницы возбудителями семенных инфекций по сравнению с вариантом чистого контроля Наименьшая зараженность наблюдалась в вариантах с обработкой семян монокультурами рассмотренных бактерий, снижение по сравнению с контролем на 36 и 35 % соответственно. Для овса полу-ченпые данные также показывают снижение общей пораженности семян в указанных вариантах бактеризации. Значимое снижение общей зараженности семян наблюдается при бактеризации монокультурами рассмотренных бактерий (на 12 и 13 % соответственно), а также в варианте с использованием смеси, где зараженность была наименьшей (на 18 %) Как известно, среди возбудителей корневых гнилей наиболее вредоносными являются грибы родов Fusarium и Bipolaris (Пересыпкин, 1974; Райло, 1950 и т.д). Полученные в

ходе экспериментов данные достоверно показывают снижение пораженности семян овса и пшеницы (рис. 5) комплексом фузариозно-гельминтоспориозпой инфекции в опытных вариантах эксперимента. Статистически значимые отличия бактеризованных монокультурами А. chroococcum и псевдомонад, а также их смесью семян Рисунок 5 - Зараженность семян пшеницы фузариозно- пшеницы были получены как гельминтоспориозной инфекцией при бактеризации семян от контроля так и от варианта Примечание * - данные достоверно отличаются от кон- _

, ±» с использованием оиопрепа-

трольного варианта (р<0,01), ** - от варианта с использованием

биопрепарата «Планриз». рата «Планриз».

3.4. Влияние бактерий на рост и развитие растений в модельных условиях 3.4.1. Влияние бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на кинетические параметры роста проростков кукурузы, пшеницы и овса и роста корней кукурузы

В литературных источниках широко представлены сведения, описывающие положительное влияние на рост и развитие растений бактерий, отнесенных к ризосферным (Benizri et al, 2001, Geoffrey et al, 2001; Nelson, 2004; Воронин, Кочетков, 2000, Сидоренко, 2001 и т.д). Нами был поставлен ряд экспериментов с использованием метода малых наземных экосистем (Сомова, 1999), направленных на изучение влияния бактерий Pseu-

Контроль

Pseudomonas sp Смесь

Планриз A. chroococcum

domonas sp. B-6798 на рост и развитие растений в лабораторных условиях В ходе экспериментов каждые 24 часа проводились замеры длины наземной части растений.

Как известно из литературных источников, рост растения в целом описывается в виде S-образной (сигмоидальной) кривой Сакса, которая отражает неравномерность данного процесса и носит общебиолошческий характер Среди множестьа количественных моделей роста наибольшее распространение получила логистическая функция (Генгель, 1965). / ч _ А + £ где y(t) - величина признака, например, размер (масса) расте-

1 + 10°"' ' ^ ния или органа; А - окончательный размер (масса) растения или органа; a, b -константы, определяющие изгиб и наклон логистической кривой; t -время, прошедшее с начала роста; С - начальный размер (масса) растения или органа

Логистическая кривая носит симметричный характер, скорость роста на начальпом этапе увеличивается так же быстро, как и падает на заключительном этапе развития. Если рост на начальном этапе замедлен, то кривая приобретает экспоненциальный вид. Рост растений кукурузы происходил по экспоненциальному закону. Для описания и определения параметров использовалось экспоненциальное уравнение (Ризииченко, Рубин, 1993): £ _ • (з) где L - длина вегетативной части растения (мм), L0 - длина проростка кукурузы после активации зерна в течете 24 часов, «минимальная» длина (мм); г - скорость удлинения растения (мм/час); t - время (час).

Рост пшеницы и овса соответствовал S-образной кривой. Для ее описания было использовано логистическое уравнение (Ризниченко, Рубин, 1993):

где у соответствует длине проростка с течением времени (мм); i -

y(t) =-• (4)

В+xQe" ' время (ч); г-скорость удлинения проростка (мм/ч); ^-«минималь-

ная» длина, соответствующая длине проростка после активации зерна в течении 24 часов (мм); А - константа уравнения, численно соответствующая произведению минимальной длины на максимально возможную в условиях эксперимента (мм): A=Xo*xnai В - константа уравнения, численно соответствующая вычитанию минимальной длины из максимальной (мм). В= хттГ х0. Рост овса также соответствовал описанному уравнению. Кинетические параметры роста растений определялись методом нелинейного регрессионного анализа. Анализ полученных данных показал, что бактерии по-разному изменяют параметры экспоненциального и логистического роста растений.

В экспериментах с кукурузой в присутствии бактерий наблюдается значимое увеличение L0, поэтому растения в опытных вариантах на момент окончания эксперимента обладают большей длиной, несмотря на скорость роста проростков статистически незначимо отличающейся от контроля. На рис. 6 на примере кукурузы, инокулированной монокультурой бактерий опытного штамма псевдомонад, представлено распределение L0 в зависимости от концентрации бактерий в инокуляте. Как видно из представленного рисунка, зависимость начальной длины растения (L0) от концентрации, представленной в логарифмическом виде, можно описать выпуклой кривой с экстремумом, который приходится на концентрации бактериальной, значение параметра в которых максимальны

0 101 102 103 10* 105 10е 107 10' Концентрация бактерий в инокуляте, кл/мл Рисунок 6 - Зависимость длины проростка кукурузы после трон активации зерна в течение 24 часов от концентрации бактерий Pseudomonas sp В-6798 в инокуляте

Рост и развитие растений проходят в конкретных условиях среды Взаимодействие генотипа и среды определяется, способностью организма реализовать определенное значение признака в различных условиях (нормой реакции генотипа) и силой действия на организм фактора среды Количественно реакция генотипа на один фактор среды вы-10з ражается кривой оптимума (Смиря-ев, Мартынов, Кильчевский, элек-изд, http //Iibrary.timacad ru) Кривые толерантности или кривые

оптимума, согласно закону толерантности, зависят от условии среды и оказывают влияние на скорость протекания биологических процессов Кривая оптимума имеет колоколооб-разный вид В зоне оптимума значение признака максимально, в зонах максимума или минимума - минимально Количественно кривую оптимума можно выразить формулой (Смиряев, Мартынов, Кильчевский, электрон изд http //library timacad ru)

X где у - значение признака, х - степень изменения фактора

среды, а0, ah а2 - коэффициенты уравнения

у=-

(5)

а0 +о,дг + а2х

В целом, полученная нами кривая соответствует закону толерантности и может быть описана кривой оптимума В зону оптимума попадают концентрации бактериальных клеток 104-107 в мл При инокуляции семян кукурузы бактериями Pseudomonas sp В-6798 на начальную длину (L0) наибольшее влияние оказала концентрация 106 кл/мл, где происходит увеличение данного признака в 5,8 раз Указанный тип кривой также соответствует кривой увеличения L0 под действием смеси изучаемых бактерий, в зоне оптимума находятся концентрации 104-107кл/мл с пиком в 106 кл/мл (в 7,7 раз выше контроля)

Анализ кинетических параметров логистического роста растений показал, что параметром, на котором можно проследить влияние бактериальной концентрации, является максимально возможная в условиях эксперимента длина проростка (хтт) Его распределение под действием бактериальной концентрации, представленной в логарифмическом виде, также имеет вид выпуклой кривой с экстремумом Проведя сравнение полученного хтт можно выявить оптимальные концентрации при применении бактерий для каждой культуры. Сравнивая наибольшие значения хшх в зоне оптимума, при учете его диапазона, для каждого вида бактерий можно количественно оценить силу влияния на рост и развитие растений При анализе удельной скорости роста (г) четкой кривой оптимума выявлено не было, хотя наблюдается тенденция к выделению пика в концентрации, обычно соответствующей зоне оптимума для бактериального штамма

Аналогичным образом была описана логистическая кривая роста корней кукурузы. Как и на кинетические параметры роста проростков, влияние бактеризации можно проследить на теоретическом параметре хтт. Полученная зависимость, как и в вегетационных экспериментах, может быть описана выпуклой кривой с экстремумом, который прихо-ю1 юг Ю3 ю4 Ю5 ю6 ю7 ю" ю9 дится на оптимальные для роста Концентация бактериального инокулята, кл/мл корней бактериальные концентра-Рисунок 7 - Зависимость максимальной длины корня от кон-цИИ (Ю4—106 кл/мл) (рис 7). центрации бактерий Pseudomonas sp В-6798

Наибольшее влияние на данный параметр оказала обработка семян смесью бактерий, увеличение х„„х в наиболее эффективных концентрациях в 1,6 раз превышает показатель, полученный при одиночном применении бактерий Pseudomonas sp. В-6798, и в 1,3 раза - А chroococcum В работе F Ciccilio и др (2002) показано влияние концентрации Burkholderia ambifaria MCI 7 на рост кукурузы при внесении бактерий в почву в концентрациях 106, 107, 108 кл/мл В приведенном диапазоне было отмечено уменьшение роста растений с увеличением бактериальной концентрации. В целом, полученные нами данные о снижение эффекта стимуляции роста растений при увеличении бактериальной концентрации соответствуют представленным в данной работе результатам 3.4.2. Влияние бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на развитие растений в лабораторных экспериментах

По окончанию описанных экспериментов были произведены замеры следующих параметров длина основного корня (для кукурузы), суммарная длина корневой системы (для овса и пшеницы) количество корней второго порядка, сухая биомасса растения Полученные зависимости исследуемых параметров от концентрации бактериальных культур, как правило, принимают вид кривой с перегибом Экстремум выпуклой линии соответствует концентрациям, в которых значение величины изучаемого параметра максимально Оптимальными концентрациями бактерий для развития кукурузы оказались 105, 106 кл/мл Наибольшие значения длины и количества корней наблюдались в вариантах с применением смеси бактериальных суспензий, что связано с усилением эффекта стимуляции роста растений одной бактерии под действием другой Эффективность комплексных микробных препаратов в настоящее время очевидна На их преимущества по сравнению с монокультурами указывает значительное количество работ, посвященных поиску и внедрению эффективных микробных сочетаний (Надыкта, 2004, Смирнов, 2006 и т д) Для пшеницы наибольший эффект оказала концентрация 104 кл/мл Для этой культуры наибольшее влияние на параметры развития имела бактеризация Pseudomonas sp. В-6798.

Положительное действие исследуемых бактерий на рост и развитие растений можно объяснить выделениями ими ряда веществ, стимулирующих рост и развитие растений Так, бактерии рода Pseudomonas образуют в зоне ризосферы ИУК, витамины и др вещества (Воронин, 1998; Hafeez et al, 2001; Lemanceau et al, 1995 и т д ) Бактерии A chroococ-cum способны выделять ауксины, гиббереллины, тиамин, пантотеновую, никотиновую кислоты, витамины группы В и т д (Блинков, 1959, Завалин, 1998 и т д)

Влияние концентраций бактерий в инокуляте на длину проростка, длину корней рассмотрено у Л А Сомовой (1999) В своей работе автор отмечает, что концентрация Р pulida численностью ]04-108 кл/мл для сорта пшеницы Канадская и 105-107 кл/мл - для сорта Красноярская-83, при проращивании во влажной камере, стимулирует прорастание семян, увеличивает длину проростка Численность бактерий свыше 10'кл/мл ингибирует прорастание. По данным того же автора, Р. fluorescens стимулируют прорастание в более узком диапазоне численностей 105-106 кл/мл для канадского и 106-107 кл/мл для красноярского сортов соответственно В работе М Lacher и др (2003) отмечено, что при проращивании семян рапса на питательной среде в чашках Петри с различными концентрациями Phyllobacterium (3*107-3*108 КОЕ/мл) происходило стимулирование длины корней, количества боковых корешков, причем с увеличением концентрации происходит увеличение эффекта стимуляции В остальных проанализированных источниках не рассмотрено концентрационное влияние бактерий на развитие растений Их применение, как правило, происходит в диапазоне численностей 105— 107 кл/мл, что в целом является достаточно благоприятным для растений Однако нами не было обнаружено убедительного обоснования концентрации применяемого инокулята. Иногда авторы в своих работах не предают значения титру бактериальных культур, используя одновременно концентрации, находящиеся, по нашим данным, в зоне оптимума, зоне максимума и зоне минимума на кривой оптимума Наиболее вероятным нам представляется, что концентрация PGPR, приходящаяся на зону оптимума для каждого вида бактерий может варьировать Кроме того, она в меньшей степени изменяется непосредственно для вида растения-хозяина 3.5. Влияние ризосферных бактерий на рост и развитие кукурузы, пшеницы и овса в

полевых экспериментах

Проведение полевых экспериментов позволило выявить влияние бактерий Pseudomonas sp В-6798 и их совместной культуры с A chroococcum В-2272 Д на рост и развитие растений в естественных условиях. В целом можно отметить положительное влияние бактеризации семян на развития растений За исключением полевого сезона 2005 года, наблюдается достоверное увеличение длины растений, сухой биомассы под действием ризосферных бактерий в среднем на 30-80 % по отношению к растениям без бактеризации Отсутствие значительного положительного эффекта в сезон 2005 года следует связать, прежде всего, с тем, что эксперименты проводились в разных почвенно-климатических зонах, поэтому не исключено, что более тяжелые почвы, на которых произрастала пшеница в 2005 году, не достаточно благоприятно повлияли на процесс корневой колонизации

Несмотря на то, что в данном сезоне не удалось достигнуть статистически значимого отличия длины и биомассы растений по окончанию эксперимента, рост бактеризованных растений до начала кущения значительно опережал контрольный (рис. 8) Это связано, прежде всего, со стимуляцией роста растений бактериями именно на ранних этапах развития последних, так как чис-

Контроль Планриз Pseudomonas sp А chrooc Смесь леННОСТЬ Примененных ДЛЯ обрЗ-

Рисунок 8-Длина пшеницы при бактеризации семян в поле- ботки семян бактерий в зоне ризо-вом эксперименте 2005 года сферы в этот период макс1Шальна В

Примечание I - длина растений в фазу 2-3 листа, 2 - в фазу начала кущения, * - статистически значимое отличие от ФазУ кушения в некоторых вариак-контрольного варианта по Mann-Whitney (р<0,05) тах бактеризации происходит отста-

вание в длине вегетативной части, что связано с образованием у данных растений большего количества стеблей, на что косвенным образом указывает увеличение биомассы растений по сравнению с вариантами с большей длиной По нашим данным, при бактеризации псевдомонадами растения быстрее проходят фазы развития, достигая цветения в более короткие сроки Так, начало цветения впервые отмечено в варианте с обработкой бактериями Pseudomonas sp В-6798, затем в варианте с планризом Несколько позднее контроля отмечено цветение пшеницы в вариантах с азотобактером, это связано с тем, что соединения азота, фиксируемого данной бактерией, продляют вегетационный период растения (Блинков, 1959).

Полевой эксперимент, проведенный с растениями овса в 2004 году, показал, что бактеризация семян привела к увеличению параметров развития растений, начиная с фазы проростков, и положительное действие бактерий отмечается до окончательного замера длины вегетативной части и сухой биомассы,

На основании данных, полученных в фазу полной спелости растений, была вычислена урожайность пшеницы с использованием следующей формулы (Ковалев, электрон, изд. http //library timacad ru)

У=Р*3*А/10000, (7) где У-урожайность зерна (ц/га), Р - среднее количество репродуктивных стеблей на м2 (шт.), 3- среднее число зерен в колосе (шт.), А — масса тысячи зерен (г) На рис 9 представлена урожайность пшеницы в различных вариантах полевого эксперимента 2005 года На увеличение урожайности при бактеризации в большей мере оказало влияние увеличение количества зерен в колосе и масса 1000 зерен Влияние бактеризации на рост и развитие растений в литературе является достаточно изученным вопросом Значительная часть работ посвящена испытанию бактериальных препаратов на

почвах различных агроклиматических зон (Семыкнна, 2006) Большинство авторов указывает на положительное влияние бактериальных препаратов на рост, развитие и урожайность сельскохозяйственных культур Так, бактеризация семян биопрепаратами «Агат-25К» и «Псевдобактерин-2» (активное начало - бактерии Р aureofaciens) приводит к увеличению всхожести Контроль планриР£eudomona5д^hrcoooccum Смесь семян пшеницы на 10 %, урожайно-

Рисунок 9 - Урожайность пшеницы при бактеризации семян в сти на 0,7-4,8 ц/га (Семыкнна, полевом эксперименте 2006)

Примечание * - статистически значимое отличие от контрольного варианта по Mann-Whitney (р<0,05) Таким образом, полученные результаты полевых испытаний подтверждают указанный в лабораторных экспериментах эффект стимуляции роста и развития пшеницы, овса и кукурузы бактериями Pseudomonas sp. В-6798, а также возможность применения совместно с другими бактериями, имеющими место в ризосфере сельскохозяйственных культур, такими как A chroococcum 3.6. Влияние бактерий на пораженность пшеннцы корневыми гнили ми н листовыми инфекциями в полевых экспериментах Корневые гнили широко распространены во всех районах возделывания зерновые культуры Их вызывают несколько видов фитопатогенных грибов, наиболее распространенными является фузариозная, гельминтоспорелезная и церкоспорелезная корневые гнили (Грибные болезни зерновых культур, 2003 и т.д ) Поскольку рассмотренные в работе бактериальные штаммы в лабораторных условия in vitro и in planta оказывали фунгистатиче-ское действие на фитопатогенные грибы родов Bipolaris и Fusarium, анализ пораженности растений пшеницы в полевом эксперименте позволил оценить эффективность антифун-гальной активности бактерий против грибов данных родов в естественных условия

Учет интенсивности поражения растений корневыми и прикорневыми гнилями проводился в полевом эксперименте с пшеницей в сезон 2005 года Оценка интенсивности поражения растений велась по степени побурения основания стебля и корневой системы Для определения степени пораженности растений пользовалась бальная шкала (Шкалы для оценки поражения болезнями сельскохозяйственных культур, 1981) Для описания пораженное™ растений использовали показатели распространенности заболевания, интенсивности поражения и развития болезни Следует отметить, что для эффективного применения бактерий против корневых гнилей имеется критерий зараженности семян возбудителями заболевания равный 10 %, бактеризация семян с зараженность свыше этого критерия не приводит к ожидаемому положительному эффекту (Семынина, 2006) В этом слу-

чае должны быть рекомендованы исключительно химические протравители. Фитоанализ партии семян показал, что высев осуществлялся пшеницей, пораженной фузариозно-гельминтоспориозной инфекцией на 24,6±3,8 %. Поэтому учет корневых гнилей на ранних этапах развития растений не показал достоверного снижения развития заболевания по сравнению с контрольным вариантом

1,5 г-------■- На рис 10 представлено развитие

—т— корневых гнилей в фазу формирова-

ло 1.3 ния колоса Именно в этот период

I наблюдаются значимые отличия в

1 1,1 * показателях учета корневых гнилей

1 бактеризованных и контрольных 09 растений Наименьшее развитие

корневые гнили получили в вариан-0,7 тс с бактеризацией Pseudomonas sp

В-6798, снижение развития заболе-0 5_________ вания по сравнению с контролем со-

Контроль Pseudomonas sp Смесь п/

Планриз А chroococcum ставляет 50 %

Рисунок 10 - Развитие корневых гнилей при бактеризации се- В фазу формирования колоса мян в фазу формирования колоса также бь[Ж) п лежено влияние

Примечание * - статистически значимое отличие от контрольного варианта, ** - статистически значимое отличие от бактеризации на распространен-варнакта с использованием биопрепарата «Планриз» кость и развитие листовых инфек-

ций Как известно, растение, находящееся в благоприятных условиях, на фоне сбалансированного поступления питательных веществ формирует иммунитет, способный противостоять внедрению патогенов и развитию заболевания (Павлюшин, 2002) Поэтому проведение учета листовых инфекций косвенным образом отражает способность растений противостоять поражению фитопатогенными грибами и свидетельствует об уровне их иммунитета Анализ полученных данных показал, чго наименьшее развитие и распространенность листовые инфекции получили в варианте бактеризации семян смесью бактериальных штаммов Для этого варианта отмечено статистически значимое уменьшение процента растений с признаками септориоза, мучнистой росы, ржавчины не только от контроля, но и от других вариантов бактеризации семян в два и более раз Также значительное влияние на уменьшение развития листовых инфекций оказала бактеризация семян Pseudomonas sp В-6798, однако, это снижение менее существенно по сравнению с влиянием бактериальной смеси Так, развитие септориоза в данном варианте по сравнению с контролем уменьшено в 2,3 раза, бактеризация смесью снижала развитие заболевания в 3,2 раза, уменьшение развития ржавчины составило 3 и 6 раз соответственно

Способность растений противостоять инфицированию фитопатогенами в вегетационный период отражают также данные фитопатологического анализа семян пшеницы, собранных с опытных и контрольного участков На рис. 11 представлена общая пораженность

семян пшеницы, собранных с контрольного и опытных вариантов полевого эксперимента Представленные данные показывают, что зерна, полученные с участков с бактеризацией семян, имеют несколько меньшую пораженность возбудителями семенных инфекций по сравнению с семенами с растений без бактеризации, однако значимость уменьшения пораженности была достигнута контроль p(iaHpl,3SeudomonasAs|?hroococcum Смесь лишь в варианте с бактеризацией

Рисунок 11 - Общая пораженность семян пшеницы, собран- Pseudomonas sp В-6798 (на 30% по ных с контрольного участка и с участков с бактеризованными сравнению с контролем) семенами в полевом эксперименте 2005 года

Примечание • - статистически значимое отличие от кон- Таким образом, антифунгальная трольного варианта, ** - от варианта с использованием био- активность бактерий может быть с препарата «Планриз»

успехом обнаружена в лабораторных экспериментах т vitro и т planta. Однако необходимо учитывать некоторую нестабильность положительных эффектов при применении бактериальных штаммов, связанную с типом почвы, культурой на которой происходит применение, и складывающихся погодных условий При учете данных почвенного плодородия, разработке конкретных регламентов применения биопрепаратов для каждой агроклиматической зоны и сельскохозяйственной культуры, бактеризация семян, несомненно, может оказать положительное влияние на оздоровление посевов зерновых

Бактерии Pseudomonas sp В-6798 оказывают достаточно стабильный аптифунгальный эффект как в лабораторных, так и полевых экспериментах, причем в присутствии клеток бактерий А chroococcum В-2272 Д зачастую проявляется взаимоусиление их биологической активности, т.е. отмечается синергический эффект При учете положительного влияния на параметры роста и развития растений данный штамм может быть рекомендован в качестве активного начала биофунгицида, обладающего свойством стимуляции параметров развития зерновых сельскохозяйственных культур

ВЫВОДЫ

1 Разработано количественное описание кинетики ингибирования роста фитопатоген-ных грибов родов Fusarium и Bipolaris бактериями Pseudomonas sp В-6798 и Azotobacter chroococcum В-2272 Д на плотных питательных средах в чашках Петри с помощью модифицированного уравнения Н Д Иерусалимского Измерение К, при унифицированности методики постановки эксперимента служит количественным показателем степени фунги-статического эффекта, оказываемого бактерией

2 Обработка семян бактериями Pseudomonas sp В-6798 и смесью с другими ризобакте-риями снижает общую пораженность возбудителями семенных инфекций на 12-36 % за

счет значимого (р<0,01) уменьшения количества семян пораженных гельминтоспориозпо-фузариозными возбудителями корневых гнилей

3 Найдено, что зависимость параметров роста и развития растений от концентрации бактерий в инокуляте, выраженной в логарифмическом виде, в лабораторных тесгах, ап-роксимируется выпуклой кривой с экстремумом, оптимальные для развития растений концентрации бактерий находятся в пределах IО4— IО7 кл/мл

4 Показано, что под действием бактерий Pseudomonas sp В-6798 в лабораторных тестах происходит увеличение длины проростка в зоне бактериального концентрационного оптимума в 1,5-3,5 раза, сухой биомассы - 1,5-5 раз, количества корней второго порядка (для кукурузы) и суммарной длины корневой системы (для пшеницы и овса) - 1,7-3,0 раза и 1,5-3,6 раза соответственно

5 В полевых экспериментах выявлена стимучяция роста и развития растений под действием бактерий Pseudomonas sp В-6798 как в монокультуре, так в смешанной культуре с другими ризобактериями в 1,1-2,9 раз относительно контроля, которая наиболее отчетливо проявляется на начальных этапах их развития

6 Обработка семян монокультурой бактерий Pseudomonas sp В-6798 и смесью с другими ризобактериями в полевых условиях уменьшает развитие корневых гнилей в фазу формирования колоса-цветения на 14-50%, проявление листовых инфекций - в 2,03,5 раза Наблюдается снижение общей пораженное™ семян, полученных с бактеризованных участков, на 30 % по сравнению с контролем, возбудителями семенных инфекций

7, Проведенные лабораторные тесты и полевые испытания позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp В-6798 к применению в качестве активного начала биофунги-цнда против возбудителей корневых гнилей на зерновых культурах, обладающего одновременно стимулирующими рост и развитие растений свойствам Биологическая эффективность данного штамма на 10-60 % выше эффективности бактерий аналогового биопрепарата «Планриз»

Работы, опубликованные по теме диссертации

1 Минаева О М Использование искусственных экосистем в качестве моделей для изучения и реализации устойчивого развития в агрофитоценнозах / Минаева О М , Акимова Е Е. // Вестник ТГУ Приложение Материалы международных, всероссийских и региональных научных конференций, симпозиумов, школ, проводимых в ТГУ -2005 -№13 -С. 107-109

2 Минаева О М Использование малых моделей искусственных экосистем для изучения взаимодействия ризобактерий с растением-хозяином и микроскопическими почвенными грибами / Минаева О М , Акимова Е.Е // Исследовано в России. - Электрон, журнал - 2006. - № 062 -С 617-623

3 Минаева О М Антагонистическое действие формальдегидрезистентных бактерий Pseudomonas на фитопатогенные грибы и перспективы их использования для биологической защиты и стимуляции растений / Гущина Ю А, Минаева О М., Шарубина О.В , Евдокимов ЕВ// Труды шестой международной конференции «Регуляторы роста растений в биотехнологии» -М Изд-во МСХА, 2001 -С 377-381

4 Минаева О М Бактерии Pseudomonas sp В-6798 как антагонисты роста фитопатогенных грибов и стимуляторы роста растений / Минаева О.М., Акимова Е Е., Гущнна Ю.А , Евдокимов Е.В. // Проблемы экологической безопасности и природопользования в Западной Сибири Труды ТГУ, серия биологическая. - Т. 266 - Томск- 2004 - С. 55-59

5 Минаева О М. Влияние бактерий Azotobacter chroococcum и Pseudomonas sp В-6798 на рост и развитие кукурузы / Минаева О.М., Бондаренко A.A. // Вопросы устойчивого бескризисного развития. - Новосибирск Изд-во ИДМИ, 2001 -С 57-66

6 Минаева ОМ Разработка биофунгицида но основе бактерий родов Azotobacter и Pseudomonas / Фатыхова Ю Н, Минаева О.М, Бондаренко А А И Региональные проблемы экологии и природопользования Материалы городской конф молодых ученых и специалистов.-Томск, 1999 - С 90-91.

7. Минаева О М Синергические эффекты бактериальных препаратов на рост и развитие кукурузы (Zea mays L) / Минаева О М., Евдокимов Е В., Бондаренко А А // Экология сегодня Сборник работ научной молодежи ТГУ -Вып 1.-Томск 2001 -С 14-16

8. Минаева О М. Ризосферные формальдегидутилизирующие бактерии Pseudomonas sp В-6798 как возможные биостимуляторы роста кукурузы, льна-долгунца и контроля фузариоза / Минаева О.М., Гущина Ю А // Биология - наука XXI века VI Путинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 20-24 мая 2002 г) Сборник тезисов. - Т. 3 - Тула Изд-во Тул гос пед. ун-та им JIH Толстого, 2002 - С 220-221

9 Минаева О.М. Влияние ризосферных бактерий Azotobacter chroococcum и Pseudomonas sp штамм В-6798 на рост и развитие пшеницы в полевых условиях / Карпушенко Н А , Минаева О.М // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии. Сборник научных работ. -Т. 3 - № 4. - Томск, 2004. - С. 34.

10 Минаева О.М. Использование искусственной экосистемы для изучения влияния корневых выделений растений на численность ризобактерий / Аксенова М В., Минаева О.М // Материалы XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология. - Новосибирск. Новосиб. гос ун-т , 2005 - С 36-36

11. Минаева О М. Биологические активаторы плодородия почв / Вайшля О Б , Ведерникова A.A., Кин А.И , Минаева О.М. // Наука и инновации XXI века: Материалы шестой окружной конференции молодых ученых - Сургут. СурГУ, 2006 - С. 175-177.

12. Минаева ОМ. Кинетика ингибирования роста Fusarium oxysporam бактериями Pseudomonas sp В-6798 / Кабакова В И , Минаева ОМ// Биология - наука XXI века XI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых - Пущино. Авторская редакция, 2005. - С. 348-348.

13 Минаева О.М. Метод исследования кинетики ингибирования роста грибов бактериями-антагонистами / Кабакова В.И., Минаева О.М. // Материалы XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс». Молекулярный дизайн и экологически безопасные технологии. - Новосибирск Новосиб гос ун-т , 2005 - С 46-46

Тираж 100. Заказ № 294. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Минаева, Оксана Модестовна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Ризобактерии и их взаимодействие с растениями.

1.2. Процесс корневой колонизации.

1.2.1. Миграция ризобактерий и заселение корней.

1.2.2. Биотические и абиотические факторы, влияющие на процесс корневой колонизации.

1.3. Антифунгальная активность ризобактерий.

1.3.1. Фунгистатические соединения, продуцируемые бактериями рода Pseudomonas.

1.4. Методы изучения фунгистатической активности и стимуляции роста растений ризобактериями. Изученность концентрационных зависимостей наблюдаемых эффектов.

1.5. Характеристика бактерий Pseudomonas sp. В-6798.

1.5.1. Влияние бактерий рода Pseudomonas на рост и развитие растений.

1.6. Использование ризосферных псевдомонад в качестве агентов защиты растений от фитопатогенов.

1.6.1. Комплексные микробные биопрепараты на основе псевдомонад.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Объекты исследований.

2.1.1. Формальдегидрезистентные псевдомонады штамма В

2.1.2. Бактерии, используемые в качестве дополнительного контроля.

2.1.4. Грибы рода Fusarium и Bipolaris sorokiniana.

2.1.5. Семена растений.

2.2. Культивирование микроорганизмов.

2.2.1. Технологическая карта культивирования бактерий Pseudomonas sp. В-6798.

2.2.2. Технология культивирования бактерий Pseudomonas sp. В

2.2.2. Характеристика культуры бактерий Pseudomonas sp. В-6798.

2.2.3. Технологическая карта культивирования бактерий Azotobater chroococcum В-2272 Д.

2.2.4. Культивирование бактерий дополнительного контроля.

2.2.5. Культивирование грибов.

2.3. Проращивание и обеззараживание семян.

2.4. Выращивание растений в стерильных лабораторных условиях.

2.5. Технология предпосевной обработки семян зерновых культур.

2.6. Оценка пораженности растений возбудителями корневых гнилей и листовых инфекций в полевых экспериментах.

2.7. Схемы экспериментов, представленных в работе.

2.7.1. Схема эксперимента по изучению кинетики ингибирования бактериями Pseudomonas sp. В-6798 роста фитопатогенных грибов родов Fusarium и Bipolaris.

2.7.2. Схема экспериментов по изучению влияние бактерий на зараженность семян возбудителями семенных инфекций в лабораторных условиях.

2.7.2.1. Фитопатологический анализ семян зерновых культур в рулонах фильтровальной бумаги.

2.7.3. Схема экспериментов по определению биостимулирующих свойств бактерий в вегетационных лабораторных экспериментах.

2.7.4. Проведение полевых экспериментов.

2.8. Статистическая обработка материала.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Селекция формальдегид резистентного штамма Pseudomonas sp. В

3.2. Кинетика ингибирования роста фитопатогенных грибов ризосферными бактериями in vitro.

3.3. Влияние бактерий на зараженность семян возбудителями корневых гнилей и других семенных инфекций в лабораторных условиях.

3.4. Влияние бактерий на рост и развитие растений в модельных условиях.

3.4.1. Влияние опытных бактериальных штаммов на кинетические параметры роста кукурузы сорта Молдавская-245, пшеницы сорта Тулунская-12, овса сорта Нарымский

3.4.2. Влияние опытных бактериальных штаммов на скорость роста корней кукурузы сорта Молдавская-215.

3.4.3. Влияние обработки бактериальных культур на развитие растений в лабораторных экспериментах.

3.5. Влияние ризосферных бактерий на рост и развитие кукурузы, пшеницы и овса в полевых экспериментах.

3.5.1. Краткая агроклиматическая характеристика вегетационных сезонов 2003-2005 годов.

3.5.2. Влияние ризосферных бактерий на параметры логистического роста кукурузы, пшеницы и овса в полевых экспериментах.

3.5.3. Влияние ризосферных бактерий на развитие растений в полевых экспериментах.

3.5.4. Влияние бактерий на пораженность пшеницы корневыми гнилями и листовыми инфекциями в полевых экспериментах.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Антагонистическое действие на фитопатогенные грибы и стимулирующее влияние на рост и развитие растений формальдегидутилизирующего штамма Pseudomonas sp. B-6798 и применение"

Актуальность работы. В связи с биологизацией и экологизацией сельскохозяйственного производства направление по созданию биопрепаратов по защите растений с полифункциональными свойствами становится все более актуальным (Кожемяков, Тихонович, 1998; Кравченко и др., 2002; Терещенко, 2004; Смирнов, 2006; Надыкта, 2004). Это основано на множестве биологических функций микроорганизмов, которые в состоянии осуществлять биосинтез метаболитов различного действия. Одними из потенциальных объектов агробиотех-нологии являются ризосферные PGPR (от Plant Growth-Promotion Rhizobacteria), широко используемые для разработки биологических средств защиты растений от фитопатогенов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений. Механизм действия этих микроорганизмов на фитопатогены включает конкуренцию за источник питания, эффективную колонизацию ризосферы, синтез антибиотических и рострегули-рующих веществ (Воронин, Кочетков, 2000; Мордухова и др., 1998; Штерншис и др., 2000; Ellis et al, 2000; Benizri et al, 2001 и т.д.). Над расширением ассортимента микробиологических препаратов, изысканием путей их эффективности работают многие научные учреждения России, при этом все отчетливее проявляется значение полифункционального действия биопрепаратов (Смирнов, 2006).

Среди ризосферных бактерий особое место занимают бактерии рода Pseudomonas. О перспективах практического применения можно судить по списку уже разработанных на их основе биопрепаратов: BlightBan А506, BioSave, Blue-Circle, Intersept, Victus, Планриз, Агат-25, Псевдобактерин-2, проявляющих высокую антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям, а также способность к стимуляции роста сельскохозяйственных культур (Воронин, 1998; Государственный каталог пестицидов и агрохимика-тов, разрешенных к применению на территории РФ, 2005).

Несмотря на все видимые преимущества, применение биологических средств защиты растений сдерживается их достаточно высокой стоимостью при учете нестабильности положительных эффектов, которая складывается в первую очередь из стоимости углеводсодержащих питательных сред и затрат на мероприятия по обеспечению стерильности. В связи с этим возникает необходимость поиска новых микроорганизмов, которые помимо комплекса достаточно стабильных положительных эффектов на рост и развитие сельскохозяйственных культур, могли бы использовать в качестве источника углерода и энергии менее дорогостоящие соединения, обеспечивающие одновременно стерильность процесса культивирования.

Целью данной работы являлось изучение формальдегидрезистентных бактерий Pseudomonas sp. В-6798 как агента биологической борьбы с возбудителями корневых гнилей зерновых культур грибами родов Fusarium и Bipolaris, обладающего стимулирующими развитие и продуктивность растений свойствами как в монокультуре, так и при совместном применении с другими широко распространенными ризобактериями.

В задачи исследования входило:

1. Изучение кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов родов Fusarium и Bipolaris на плотных питательных средах бактериями Pseudomonas sp. В-6798, как в монокультуре, так и при соинокуляции с другими ризобактериями, разработка универсального параметра оценки антифунгальной активности бактериальных штаммов.

2. Определение фунгистатической активности бактерий Pseudomonas sp. В-6798 и других ризобактерий по отношению к возбудителям семенных инфекций при бактеризации семян.

3. Выявление кинетических аспектов стимулирования роста и развития растений бактериями штамма Pseudomonas sp. В-6798 и другими ризосферными бактериями в лабораторных вегетационных тестах.

4. Оценка эффективности обработки семян бактериями Pseudomonas sp. В-6798 и другими ризобактериями в полевых экспериментах.

5. Сравнительная оценка применения бактерий штамма Pseudomonas sp. В-6798 как в монокультуре, так и при совместном применении с другими ризо-бактериями, с официально рекомендованным к применению против возбудителей корневых гнилей зерновых культур биопрепаратом «Планриз» на основе бактерий Pseudomonas fluorescens АР 33.

Научная новизна работы. В работе впервые показаны кинетические аспекты взаимоотношения бактерий Pseudomonas sp. В-6798 с растением-хозяином и фитопатогенными грибами. Отмечено, что кинетика ингибирования роста грибов родов Fusarium и Bipolaris ризосферными бактериями описывается модифицированным уравнением Н.Д. Иерусалимского. Количественно ан-тифунгальный эффект бактериальных штаммов при проведении лабораторных тестов может быть оценен с помощью константы ингибирования (Kj) и может стать основой для унифицированной методики. Для исследованных бактериальных штаммов К{ как правило находится в пределах 101—103 кл/мл.

Впервые обнаружено, что зависимость параметров роста и развития растений концентрации бактерий в инокуляте, выраженной в логарифмическом виде, в лабораторных тестах, принимает вид выпуклой кривой с экстремумом. Экстремум выпуклой линии приходится на бактериальные концентрации, в которых параметры роста и развития растений максимальны. Сравнение ростости-мулирующей активности бактериальных штаммов необходимо проводить с учетом наиболее эффективных для растения концентраций (для исследуемых

4 7 бактерий 10-10 кл/мл).

В полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития пшеницы, овса и кукурузы под действием бактерий Pseudomonas sp. В-6798 как в монокультуре, так при применении в микробной «паре», которая наиболее отчетливо проявляется на начальных этапах развития растений. Бактеризация семян пшеницы штаммом Pseudomonas sp. В-6798 позволяет уменьшить развитие корневых гнилей в фазу формирования колоса-цветения на 14-50 %, проявление листовых инфекций - в 2,0-3,5 раза по сравнению с небактеризованными растениями.

Практическая значимость. Проведенные лабораторные тесты и полевые испытания позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp. В-6798 к применению в качестве биофунгицида против возбудителей корневых гнилей на зерновых культурах, обладающего одновременно стимулирующими рост и развитие растений свойствами, как в монокультуре, так и в совместном применении с другими бактериальными штаммами ризобактерий. При выращивании бактерий данного штамма на среде содержащей формальдегид, стоимость препарата на его основе снижается на 25-30 % по сравнению с аналоговыми биопрепаратами за счет снижения затрат, направленных на достижение стерильности процесса культивирования. При этом биологическая эффективность от применения препарата на основе формальдегидрезистентных бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на 10-60 % выше аналогового биопрепарата «Планриз», причем положительный эффект от применения опытного штамма является достаточно стабильным, что показали полевые испытания, проведенные на протяжении трех лет.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на VI международной конференции «Регуляторы роста растений в биотехнологии» (Москва, 2001), городской конференции молодых ученых и специалистов (Томск, 1999), VI Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2002), XLIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2005), IX Международной Пу-щинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005).

Публикации по теме диссертации. Всего по теме диссертации было сделано 12 публикаций, из них 2 в изданиях, рецензируемых ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 136 страницах, содержит 33 рисунка, 15 таблиц в основной работе и 18 таблиц вынесено в приложение. Список литературы включает 170 источников, из них 65 - на иностранном языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Минаева, Оксана Модестовна

115 ВЫВОДЫ

1. Разработано количественное описание кинетики ингибирования роста фитопатогенных грибов родов Fusarium и Bipolaris бактериями Pseudomonas sp. В-6798 и Azotobacter chroococcum В-2272 Д на плотных питательных средах в чашках Петри с помощью модифицированного уравнения Н.Д. Иерусалимского. Измерение Kt при унифицированности методики постановки эксперимента служит количественным показателем степени фунгистатического эффекта, оказываемого бактерией.

2. Обработка семян бактериями Pseudomonas sp. В-6798 и смесью с другими ризобактериями снижает общую пораженность возбудителями семенных инфекций на 12-36 % за счет значимого (р<0,01) уменьшения количества семян пораженных гельминтоспориозно-фузариозными возбудителями корневых гнилей.

3. Найдено, что зависимость параметров роста и развития растений от концентрации бактерий в инокуляте, выраженной в логарифмическом виде, в лабораторных тестах, апроксимируется выпуклой кривой с экстремумом, оптимальные для развития растений концентрации бактерий находятся в пределах 104107 кл/мл.

4. Показано, что под действием бактерий Pseudomonas sp. В-6798 в лабораторных тестах происходит увеличение длины проростка в зоне бактериального концентрационного оптимума в 1,5-3,5 раза, сухой биомассы - 1,5-5 раз, количества корней второго порядка (для кукурузы) и суммарной длины корневой системы (для пшеницы и овса) - 1,7-3,0 раза и 1,5-3,6 раза соответственно.

5. В полевых экспериментах выявлена стимуляция роста и развития растений под действием бактерий Pseudomonas sp. В-6798 как в монокультуре, так в смешанной культуре с другими ризобактериями в 1,1-2,9 раз относительно контроля, которая наиболее отчетливо проявляется на начальных этапах их развития.

6. Обработка семян монокультурой бактерий Pseudomonas sp. В-6798 и смесью с другими ризобактериями в полевых условиях уменьшает развитие корневых гнилей в фазу формирования колоса-цветения на 14-50 %, проявление листовых инфекций - в 2,0-3,5 раза. Наблюдается снижение общей пораженности семян, полученных с бактеризованных участков, на 30 % по сравнению с контролем, возбудителями семенных инфекций.

7. Проведенные лабораторные тесты и полевые испытания позволяют рекомендовать бактерии Pseudomonas sp. В-6798 к применению в качестве активного начала биофунгицида против возбудителей корневых гнилей на зерновых культурах, обладающего одновременно стимулирующими рост и развитие растений свойствам. Биологическая эффективность данного штамма на 10-60 % выше эффективности бактерий аналогового биопрепарата «Планриз».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Минаева, Оксана Модестовна, Томск

1. Агроклиматические ресурсы Томской области // Под редакцией М.И. Черникова. Ленинград: Гидрометеоиздат, 1975. - 147 с.

2. Баславская С.С., Трубецкова О.Н. Практикум по физиологии растений. -М.: Изд-во МГУ, 1964. 228 с.

3. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М.: Мир, -1989.-692 с.

4. Березова Е.Ф. Микробы и жизнь растений. М.: Изд-во Знание, 1960. -40 с.

5. Березова Е.Ф., Подъяпольская В.П. Применение бактериальных удобрений. М.: Минсельхоз РСФСР, 1962. - 219 с.

6. Билай В.И. Основы общей микологии. Киев.: Выща шк., 1989. - 392 с.

7. Биология развития культурных растений: учебное пособие для студентов биологических специальностей / Ф.М. Куперман, Е.И. Джанова и др.; Под редакцией Куперман Ф.М. М.: Высшая школа, 1982. - 343 с.

8. Ю.Блинков Г.Н. Азотобактер и его значение для высших растений. Томск: Изд-во Томского университета, 1959. - 253 с.

9. Блинков Г.Н. Взаимоотношения между высшими растениями и азотобактером // Оттиск, работа выполнена во Всесоюзном институте с-хоз. микробиологии под руководством A.M. Шелумовой в 1935.

10. Болезни культурных растений / Под общей научной редакцией чл.-корр. РАСХН В.А. Павлюшина. С.-П.: Инновационный центр защиты растений, 2005.-288 с.

11. Воронин A.M. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский журнал. 1998. - № 10. - С. 25-31.

12. Воронин A.M., Кочетков В.В. Биологические препараты на основе псевдомонад//АГРО XXI.- 2000. -№ 1.-С. 140-145.

13. Вайшля О.Б., Ведерникова А.А., Кин А.И., Минаева О.М. Биологические активаторы плодородия почв // Наука и инновации XXI века: Материалы шестой окружной конференции молодых ученых. Сургут: СурГУ, 2006. - С. 175177.

14. Возняковская Ю.М. Микробиологические основы экологической системы земледелия//Агрохимия. 1995.-№ 5.-С. 115-125.

15. Волкогон В.В. Ассоциативные азотфиксирующие микроорганизмы // Мжробюлопчний журнал. 2000. - Т.62. - № 2. - С. 35-43.

16. Вопросы биологии, экологии и агротехники кукурузы. Харьков: Изд-во Харьковского гос. ун-та, 1955. - 140 с.

17. Гебгардт А.А. О сущности действия азотобактерина и путях повышения его эффективности. М., 1961. - 40 с.

18. Генгель П.А. Физиология растений с основами микробиологии. М.: Просвещение, 1965. - 584 с.

19. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Издание официальное. -Госхимкомиссия РФ Минсельхоза России, 2004. 589 с.

20. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Издание официальное.

21. Федеральное агентство по сельскому хозяйству (Россельхоз) Минсельхоза РФ, 2005.-420 с.

22. Грибные болезни зерновых культур // Приложение к защите и карантину растений. 2003. -№ 11 -48 с.

23. Гущина Ю.А., Гловацкая И.Ф. Формальдегидрезистентные псевдомонады как стимуляторы роста корней льна-долгунца // Вопросы устойчивого бескризисного развития. Новосибирск: Изд-во ИДМИ, 2001. - С. 67-70.

24. Гущина Ю.А., Евдокимов Е.В. Разработка биопрепарата против фузариоза льна // Региональные проблемы экологии и природопользования. Материалы городской конф. молодых ученых и специалистов. Томск, 1999. - С. 71-72.

25. Диагностика основных грибных болезней хлебных злаков / Под редакцией чл.-кор. РАСХН В.А. Павлюшина. С.-Петербург: Изд-во ВНИИЗР. - 2002. -76 с.

26. Диагностика основных грибных болезней хлебных злаков / Составители Т.И. Ишкова, Л.И. Берестецкая, Е.Л. Гасич и др. С.-П.: Всероссийский НИИ защиты растений, 2002. - 76 с.

27. Добровольская Т.Г. Структура бактериальных сообществ почв. М.: ИКЦ Академкнига, 2002. - 282 с.

28. Евдокимов Е.В. Динамика популяций в задачах и решениях: Учебное пособие. Томск: ТГУ, 2001. - 73 с.

29. Евдокимов Е.В., Бондаренко А.А., Минаева О.М. Синергические эффекты бактериальных препаратов на рост и развитие кукурузы (Zea mays L.) // Экология сегодня. Сборник работ научной молодежи ТГУ. Вып. 1. - Томск: 2001. -С. 14-16.

30. Евдокимов Е.В., Евдокимов А.В. Способы биологической утилизации формальдегида из его водных растворов // Патент РФ № 2102474.

31. Емцев В.Т. Микробы мастера плодородия. - М.: Изд-во Сельское хозяйство, 1963. - 32 с.

32. Ермакова Н.И., Штерншис М.В. Новый биопрепарат против болезней растений // Защита растений. 1994. -№ 12. - С. 18.

33. Ермолова Н.И., Иванова Н.И., Скворцова Н.П. и др. Биопрепараты на основе ризосферных псевдомонад // Защита и карантин растений. 1992. - № 9. -С.24-25.

34. Завалин А.А. Дополнительный источник азотного питания зерновых культур//АГРО XXI. 1998-№ 11.-С. 14-15.

35. Зайцева Г.Н. Биохимия азотобактера. М.: Мир. - 1965 - 304 с.

36. Иващенко В.Г., Шипилова Н.П. Грибы рода Fusarium на семенах хлебных злаков в основных зерновых регионах России (ареалы, частота встречаемости, соотношение). С.-П.: Всероссийский НИИ защиты растений, 2004. - 20 с.

37. Ишкова Т.И., Берестецкая Л.И., Гасич Е.Л., Власов Д.Ю. Диагностика основных грибных болезней хлебных злаков. Методическое пособие. С.-П.: Всероссийский НИИ защиты растений, 2001. - 76 с.

38. Кабакова В.И., Минаева О.М. Кинетика ингибирования роста Fusarium oxysporum бактериями Pseudomonas sp. В-6798 // Биология наука XXI века: XI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. - Пущино: Авторская редакция, 2005. - С. 348-348.

39. Калько Г.В., Воробьев Н.И., Лагутина Т.М., Новикова И.И. Ингибирование микробами-антагонистами фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum в тор-фогрунте // Микология и фитопатология. 2001. - Т. 35. - Вып. 3. - С. 66-73.

40. Кефели В.И. Методы определения фитогормонов, ингибиторов роста, дефолиантов, гербицидов. М.: Наука, 1973. - С. 7-22.

41. Климашевский Э.Л. Физиологические особенности корневого питания разных сортов кукурузы. М.: Наука, 1966. - 152 с.

42. Ковалев В.М. Теория урожая. Электрон, ресурс.: ЦНБ им. Н.И. Железно-ва/ МСХА им. К.А. Тимирязева. Электрон, издание. - Режим доступа: http://library.timacad.ru. свободный.

43. Кожемяков А.П., Тихонович И.А. Использование инокулянтов бобовых и биопрепаратов комплексного действия в сельском хозяйстве. М., 1998. -115 с.

44. Колешко О.И. Азотфиксирующие бактерии: физиология развития. -Минск: Изд-во Белорусского ун-та, 1981. 112 с.

45. Кравченко J1.B., Азарова Т.С., Леонова Е.И. и др. Корневые выделения томата и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas // Микробиология. 2003. - Т.71. - № 1. - С. 48-53.

46. Кузьмина Л.Ю., Меленьтьев А.И. Колонизация ризосферы яровой пшеницы бактериями рода Bacillus cohn при бактеризации семян // Микробиология. -2003. Т.72. - № 2. - С. 268-274.

47. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. Пособие для биол. спец. вузов М.: Высшая школа, 1990.-352 с.

48. Мерзаева О.В., Широких И.Г. Колонизация актиномицетами различных родов прикорневой зоны растений // Микробиология. 2006. - Т. 75. - № 2. -С. 271-276.

49. Методические указания по проведению производственных испытаний средств и методов защиты зерновых культур от болезней // Приложение к защите и карантину растений. 2004. - 23 с.

50. Методы оценки сельскохозяйственных культур на групповую устойчивость к вредителям / Под редакцией Н.А. Вилкова. С.-П.: Изд-во ВИЗР, 2003. -113 с.

51. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. профессора Звягинцева.-М.: МГУ, 1991.-304 с.

52. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка, 1982. -550 с.

53. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. -438 с.

54. Минаева О.М., Бондаренко А.А. Влияние бактерий Azotobacter chroococcum и Pseudomonas sp В-6798 на рост и развитие кукурузы // Вопросы устойчивого бескризисного развития. Новосибирск: Изд-во ИДМИ, 2001. - С. 57-66.

55. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1987. -387 с.

56. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я., Воронин A.M. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плаз-мид биодеградации нафталина // Прикладная биохимия и микробиология. -1998. Т.34. - № 3. - С.287-292.

57. Надыкта В.Д. Перспективы биологической защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов // Защита и карантин растений. 2004. - № 6. - С. 2628.

58. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ. / Под редакцией Дж. Хоулта, П. Снита и др. М.: Мир, 1997. - 432 с.

59. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: Пер. с англ. / Под редакцией Дж. Хоулта, П. Снита и др. М.: Мир, 1997. - 368 с.

60. Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Афанасенко О.С. Первая Всероссийская конференция по иммунитету растений к болезням и вредителям, посвященная 300-летию Санкт-Петербурга. Хроника // Вестник защиты растений. 2002. -№2.-С. 73-75.

61. Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. 2-е изд., пере-раб. и доп. - М.: Колос, 1974. - 560 с.

62. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: МИП, 1978.-331с.

63. Полянская J1.M., Ведина О.Т., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Стимуляция роста растений культурами Beijerinkia и Clostridium // Микробиология. 2002. -Т.71, - № 1.-С. 123-129.

64. Практическое руководство для определения болезней зерновых культур / Составитель О.И. Павлова. Новосибирск:, 1998. - 58 с.

65. Райло А.И. Грибы рода Фузариум. М.: Колос, 1950. - 416 с.

66. Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Математические модели биологических продукционных процессов. Изд-во МГУ, 1993. - 302 с.

67. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -М.: Наука, 1986.-200 с.

68. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1995. - 224 с.

69. Сандрак Н.А. Влияние внеклеточных выделений азотобактера на другие микроорганизмы // Микробиология. 1971. - Т. XL. - Вып. 4. - С. 691-695.

70. Семынина Т.В. Биопрепараты и регуляторы роста растений для обработки семян зерновых культур // Защита и карантин растений. 2006. - № 2. - С. 2425.

71. Сидоренко О.Д. Действие ризосферных псевдомонад на урожайность сельскохозяйственных культур // Агрохимия. 2001. - № 8. - С. 56-62.

72. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Нау-кова думка, 1990. - 264 с.

73. Смирнов О.В. Многоцелевое действие биопрепаратов // Защита и карантин растений. 2006. - № 2. - С. 20-21.

74. Смиряев А.В., Мартынов С.П., Кильчевский А.В. Биометрия в генетике и селекции растений Электрон, ресурс.: ЦНБ им. Н.И. Железнова / МСХА им. К.А. Тимирязева. Электрон. издание. - Режим доступа: http://librarv.timacad.ru, свободный.

75. Соколов М.С. Состояние, проблемы и перспективы применения экологически безопасных пестицидов в растениеводстве // Агрохимия. 1990. - № 10. -С. 124-145.

76. Сомова J1.A. Функциональная и индикаторная роль гетеротрофных микроорганизмов в искусственных экосистемах: Автореф. дисс. . доктор биол. наук Красноярск, 1999. - 86 с.

77. Терещенко Н.Н. Проблемы и перспективы применения бактериальных препаратов в сельскохозяйственной практике // Томский агровестник. 2004. -№ 2. - С. 39-46.

78. Фильченкова В.И., Самосова С.И. Отбор бактерий-стимуляторов и ингибиторов роста растений из ризосферы озимой пшеницы // Микроорганизмы почвы и их взаимоотношения с высшими растениями. Казань: Изд-во Казанского университета, 1971.-С. 13-26.

79. Фитосанитарная экспертиза зерновых культур (Болезни растений): Рекомендации / Под общей редакцией чл.-корр. Россельхозакадемии проф. С.С. Санина. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2002. - 140 с.

80. Чулкина В.А., Коняева Н.М., Кузнецова Т.Т. Борьба с болезнями сельскохозяйственных культур в Сибири. М.: Россельхозиздат, 1987. - 252 с.

81. Шабаев В.П. Бактерии могут заменить минеральные удобрения Электрон, ресурс.: Химия и жизнь XXI век. - Электрон, журн. - Пущино: Инт-т почвоведения и фотосинтеза РАН, 2000. - Режим доступа: http://www.inforiTmauka.ru, свободный.

82. Шильникова В.К., Серова Е.Я. Микроорганизмы-азотонакопители на службе растений. М.: Наука, 1983. - 150 с.

83. Широких И.Г., Мерзаева О.В. Комплекс актиномицетов в ризосфере озимой ржи на дерново-подзолистой почве // Микробиология. 2005. - Т. 74. -№2.-С. 271-277.

84. Шкалы для оценки поражения болезнями сельскохозяйственных культур. Методические рекомендации / Министерство СХ РСФСР. Составитель к.б.н. А.А. Эльчибаев. Воронеж: Изд-во ВНИИЗР. - 1981. - 83 с.

85. Ю2.Штарк О.Ю., Шапошников А.И., Кравченко J1.B. Продуцирование анти-фунгальных метаболитов Pseudomonas cliloloraphis при росте на различных источниках питания // Микробиология. 2003. -1.12. - № 5. - С. 645-650.

86. Штарк О.Ю., Шапошников А.И., Кравченко J1.B. Продуцирование анти-фунгальных метаболитов Pseudomonas cliloloraphis при росте на различных источниках питания // Микробиология. 2003. - том 72. - №5. - С. 645-650.

87. Ю4.Штерншис М.В., Джалилов Ф.С., Андреева И.В., Томилова О.Г. Биопрепараты в защите растений. Новосибирск, 2000. - 128 с.

88. Alstrom S. Characteristics of bacteria from oilseed rape in relation to their bio-control activity against Verticillium dahlia // J. Phytopathology. 2001. - № 149. -P. 57-64. - Режим доступа: http://www.blackwellpublishing.com, электрон, библиотека.

89. Becking J.-H. The family Azotobacteriaceae // The Prokaryotes. Berlin, Heidrlberg, New York: Springer-Verlag. - 1981. - Vol. 1. - P. 795-817.

90. Benizri E., Baudon E., Guckert A. Root colonization by inoculated plant growth-promoting rhizobacteria // Biocontrol science and technology. 2001. -№ 11. - P. 557-574. - Режим доступа: http://www.tandf.co.uk, электрон, библиотека.

91. Chabot R., Beauchamp C.J., Kloepper J.W., Antoun H. Effect of phosphorus on root colonization and growth promotion of maize by solubilizing Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli // Soil biology and biochemistry. № 30. - P. 16151618.

92. Gainliel A., Katan J. Chemotaxis of fluorescent pseudomonads towards seed exudates and germinated seeds in solarized soil // J. Phytopathology. 1992. - № 80.- P. 328-332. Режим доступа: http://www.blackwellpublishing.com, электрон, библиотека.

93. Janisiewicz W.J. Biocontrol of postharvest diseases of apples with antagonist mixtures // J. Phytopathology. 1988. - №78. - P. 194-198. - Режим доступа: http://www.blackwellpublishing.com. электрон, библиотека.

94. Kerr J.R. Bacterial inhibition of fungal growth and pathogenicity // Microbial ecology in health and disease. 1999. - № 11. - P. 129 - 142. - Режим доступа: http://www.blackwellpublishing.com. электрон, библиотека.

95. Koch Е. Evaluation of commercial products for soil-born plant disease // Crop protection. 1999. - №18. - P. 119-125. - Режим доступа: http://www.blackwellpublishing.com. электрон, библиотека.

96. Komor Е. Proton coupled hexose transport in Chlorella vulgaris // Federation of European biochemical societies. 1973. - Letters 38. - P. 16-18.

97. Krasil'nikov N.A. Soil microorganisms and higher plants Электрон, ресурс.- Moskow: Published by the Academy of Siences of the USSR, 1958. Режим доступа: http://www.soilandliealthe.org, свободный.

98. Microbial processes: Promising technologies for developing countries Электрон. ресурс.: The national academy press, 1979. Chapter 3: Soil microbes in plant health and nutrition. - P. 47-58. - Режим доступа: http://www.books.nap.edu. свободный.

99. Nelson L.M. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Prospects for new inoculants Электрон, ресурс.: Online. Crop Management. Электрон. База данных. - 2004. - Режим доступа: http://www.plantmanagementnetwork.org, свободный.

100. Palleroni N.I. Introduction to the Family Pseudomonaceae // The Prokaryotes.- Berlin, Heidrlberg, New York: Springer-Verlag, 1981. Vol.1. - P. 655-665.

101. Parmar N., Dadaral K.R. Stimulation of nitrogen Fixation and induction of fla-vonoid-likecompounds by rhizobacteria // Journal of applied microbiology. 1999. -№ 86. - P. 36-44. - Режим доступа: http://www.b1ackwellpublishing.com. электрон. библиотека.

102. Pierson E.A., Weller D.M. Use of mixture of fluorescent pseudomonads to suppers take-all and improve the growth of wheat // J. Phytopathology. 1994. -№ 84. - P. 940-947. - Режим доступа: http://www.blackwellpub1ishing.com, электрон. библиотека.

103. Weller D.M., Cook R.J. Suppression of take-all of wheat by seed treatments with fluorescent pseudomonads // J. Phytopathology. 1983. - № 73. - P. 463-469.- Режим доступа: http://www.blackwellpublishing.com, электрон, библиотека.

104. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphera Электрон. ресурс.: Journal of experimental botany. Электрон, журн. - Warwick, 2001.- Vol. 52. № 91. - P. 487-511. - Режим доступа: http://intlsoil.sciiournals.org. свободный.