Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Биологическое обоснование использования хитинолитической бактерии SERRATIA MARCESCENS в защите растений огурца от почвенной фузариозной инфекции

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Биологическое обоснование использования хитинолитической бактерии SERRATIA MARCESCENS в защите растений огурца от почвенной фузариозной инфекции"

2 i* ФЕВ Ю97

На правах рукописи

Соколова Марина Владимировна

БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ХИТШГОЛИТИЧЕСКОЙ БАКТЕРИИ SERRATIA MARCESCENS В ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ ОГУРЦА ОТ ПОЧВЕННОЙ ФУЗАРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

Специальность : 06.01.11 - Защита растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1097

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений (г. Санкт-Петербург)

Научный руководитель - кандидат биологических наук

С.Л. Тютерев

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор.

член-корреспондент РАСХН М.М. Левитин

кандидат биологических наук П.С. Григорьев

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский

институт сельскохозяйственной микробиологии

:та диссертации состоится ./¿¿¿ttf/f/St- 1997 г.

^ часов на заседании Диссертационного совета Д.020.О1.01

во Всероссийском научно-исследовательском институт? защиты растений по адресу:

189620, г. Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений

Автореферат разослан " У " Фр^Я&'/У 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, /¿уГа кандидат биологических наук --- г.А. Наседкина

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В настоящее время в силу сложившихся неблагоприятных экономических условий сильно возросла заболеваемость культур в тепличник хозяйствах налей страны. Одной из наиоояее вредо'ноопых болезнен огурца в закрытом грунте являются увядание и корневые и прикорневые гнили, основные возбудители которых - гриоы рода Fusarium. Ha си ль иозаражеинык почвах к концу вегетации ги«5«ль оасташй мижет достигать (Беляева, 1990; Твердюков и др., JOOai. Яла тепличной культуры огурца отмечается наиболее высокая патогенность и частота встречаемости гриба Fusarium окузротт

Набор биологических средств для борьбы с Фузариозными поражениями отой культуры достаточно ограничен и включает препараты, механизм действия которых основан главным образом на высокой антибиотической активности tоактофит, триходермин, алирины В и С, arpo-•{■ил, микостоц i. Спектр биопрепаратов может быть расширен за счет использования микроорагниомов - микопаразитов, cnocoomix с помошм» синтезируемых ими гидролитических Ферментов, в первую очередь хи-тиназ, деградировать клеточные стенки Фитопатогенов. Перспективным миколитическим агентом является бактерия Serratia m-ircescens, для которой по характерно образование токсинов и антибиотиков. Показана ее высокая эффективность в подавлении Sclerotium rolfsíl и Rhizoctonia dolosa (Grient Lieh et ai., 1987). Б навей стране работы по изучению возможности использования бактерий рода Serratia для зашиты культур закрытого грунта от почвенных фитопатогенов не проводились .

С другой стороны, в связи с активным развитием в мировой практике зашиты растений новых, генно-инженерных подходов, направленных на генетическую модификацию микроорганисмоБ-антагонистов с цельи усиления их антнгркбкой активности, возникает необходимость г. создании банков генов, контролирующих синтез антигрибних белков. Источником таких генов, в частности генов синтеза хитиназ с антигрибной активностью, может служить дачная бактерия.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Цель работы - дать научное обоснование возможности использования хитинолитическсй бактерии S. irav-o~scens для зашиты растений огурца от почвенной фузариозной инфекции (возбудитель - Fusarium oxysporum).

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи: отобрать штамм бактерии S. mrcescerts с выраженными мигсолитическими и антигсибными свойствами и изучить роль хитинолитического фер- -

меатного 1-;смплекса штамма ез механизме его антигрибной активности: изучить биологическую активность живой культуры штамма-антагониста в подавлении почвенной фузариозной инфекции на растениях, огурца г, вегетационных и тепличных опытах; сконструировать генетически модифицированный штамм Escherichia coli с экспрессирующимся геном синтеза хитиназы S.mrcescens как модельную систему для изучения роли фермента в механизме антигрибной активности бактерии в отношении гриба Г.oxysporum.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучена антагонистическая активность штаммов бактерии S.maccescens по отношеншо к широкому кругу (18 видов) фитопатогенных грибов - возбудителей болезней сельскохозяйственных оасгений в опытах in vitro. Показано, что антигрибные свойства штаммов в значительной степени определяются их способностью к синтезу и секреции внеклеточной хитиназы.

Впервые установлена высокая биологическая активность живой культуры хитинолитического штамма S.flurcescens (218/221) в подавлении почвенной фузариозной инфекции (F. oxysporum.), вызывающей прикорневые гнили и увядание растений огурца.

В клетках Escherichia coli клонировал ген хитиназы из S.nurcos-ccns 218/221, продукт которого обладает антигрибными свойствами в отношении F.oxysporum.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Обоснована перспективность'использования микологического штамма S.marcescens 218/221 для создания почвенного биофунгицида, аффективного против фузариозной прикорневой гнили растений огурца (возбудитель F. oxysporum). Предложена схема внесения живой культуры бактерии, позволяющая поддерживать почвенную популяцию антагониста на биологически эффективном уровне.

Сконструированная в клетках E.coli библиотека хромосомальных фрагментов S.warcesccns 218/221 является источником генов лптичес-ких ферментов, перспективных для генетической модификации микроорганизмов-антагонистов и хозяйственно-значимых растений, в т.ч. растений огурца.

Разработанная нами схема клонирования гена хитиназы из З.рпг-ccscens может бить применена в экспериментах по клонированию разнообразных бактериальных генов.'

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлялись на конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1904); на Международной конференции "Biotechnology St.Petersburg:"94" с.-.-Пе-.

тероург, 1094), на сессии Ученого Совета ВИЗР (liJ95 г.), на 1-им Всероссийском съезде по защите растений (С-Петербург, декабрь J995), «а XI¡I Международном конгрессе по защите растений (The Нл-iTue - The Motherlands - F-У July, 1995); на научно-производственном конференции, [[освященной ;-Х'-летию ВелНИИЗР (Минск-Прилукп, 14--IG Фелрадя 1096).

ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения н результаты диссертации опубликованы в 1" печатных работах.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Материалы диссертации изложит на страницах, включают сведение, обзор литературы (глава 1), ^писание объекта, материалов и методов исследований »глава £), результаты шжпорименташюй работи и их обсуждение (главы 3,4,0), заключение, выводи, практические рекомендации, список оптируемой литературы и приложение. В работе имеется ff таблиц, я-3 рисунков. Список литературы содержит г JX? наименовании, в том числе /22 иностранных,

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ГЛАВА 1. "М11К0ЛИТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ - АНТАГОНИСТЫ ПОЧВЕННЫХ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ: ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ЗАЩИТЕ РАСТЕНИЙ" <Обзор литературы). Посвящен проблемам использования лнтическнх микроорганизмов в защит* растений от почве-шшх фитопатогенов и состоит из трех разделов. В первом приводятся сведения об основных групнак микроорганизмов-антагонистов и механизмах их действия на почвенные фитопптогешшо грибы, со втором Рассмотрены свойства и механизмы действия ферментных чнтинолитичоскнх комплексов различных микроорганизмов, а также способы клонирования »адднруодих их генов. Б заключительном ра-зделс рассмотрен!,! возможности и Р'-рспектиш применения клонированных генов синтеза микробных хптиназ в современных стратегиях зашты растений.

РЛДРА ОВЬЕКТ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ. Обг-ектом исследований яг-лячнсь: гриб F.oxysporum, возбудитель прикорневой гнили и увядлпия растений огурца; штаммы бактерии S.mrcoscors (В1-22t. h? (коллекция типовых культур ВНИИОЮД) и Зт (кол-локцил Fi ЮР''; в г<-нно - инженерных экспериментах иснояъеовали штаммы E'.eoii (коллекция микроорганизмов кафедри биофизики С Ш'ТУ i: с. '-О I i Kl" ОН ¿м (roc Al diaez, X-, (Amps)), E.coli KU HE ¡01 (leoAie. Л- , íí!ti(r i), E'.coli KV7: HB101, лнзогеннык по Фагу \f M^'f}?, a лактериоФаг \01вС57'. Для клонирования гена хитнчазы

S.marcescens применяли плазмиду pBluescript KS(+). Для тестов на антигрибную активность использовали 18 видов фитопатогенных грибов.

Определение ферментативной (амилазной, ДНК-азиой, протеазной и хитиназной) активности штаммов S.marcescens проводили посредством их культивирования па агаризовашшх средах с соответствующими субстратами с последующим измерением зон их гидролиза (Прист, 1987'). Хитиназпую активность штаммов при культивировании в жидкой среде оценивали по количеству образовавшегося N-ацетилглюкозамина - продукта гидролиза хитина (Monreal, Reese, 1962; Попова и др., 1993). Кинетику синтеза хитиназы штаммами S.marcescens исследовали путем определения активности фермента в ходе их культивировния в жидкой среде с коллоидным хитином и убитым автоклавированием измельченном мицелием F.OKysporum. Изучение антигрибной активности штаммов S. ütarcesceris и их бесклеточных метаболитов проводили методом агаровых блоков (Билай, 1982) в нашей модификации (Соколова, 1995).

Биологическую активность живой культуры S.marcescens 218/221 против почвенной фузариозной инфекции изучали в вегетационных опытах в теплицах БИЗР на растениях огурца сорта Сюрприз, и в мелко-деляночном опыте на посадках огурца (гибрид Аэлита, АО "Лето", сезон 1993-1994 гг.). Вегетационные опыты проводили на искусственном инфекционном фойе в нестерильной почве (инокулюм F.oxysporum, изо-лят "J1C" на зерне вносили в почву в количестве 5 г на 1 кг почвы. Бактерию вносили путем пролива почвы одновременно или за две недели до высева семян. Растения выращивали до фазы 3-4 настоящих листьев, фиксировали биометрические показатели их развития и определяли распространение болезни (Методические указания БИЗР, 193D). Тепличные опыты проводили в очаге многолетней фузариозной инфекции (в среднем свыше 1000 пропагул F. oxysporum на 1 г почвы). Живую культуру штаги;,(а 218/221 нарабатывали полупромышленным способом в технологической лаборатории БНИИСХМ. Культуральную жидкость вносили проливом при посадке семян в торфсблоки, высадке рассады па постоянное место п в период начала плодоношения. В качестве эталона сравнения использовали препарат бактофит (норма внесения 1 г/м'"'-). В течение всего вегетационного периода проводили фитопато-логические наблюдения за развитием и распространением корневой и прикорневой гнили, проводили отбор почвенных проб и определяли со-

держание пропагул F.oxysporutn и сапротрофных микроорганизмов (Бн-лай, 1982; Сидорова, Попов, 19803, фиксировали биометрические показатели развития растений и вели учет урожая.

Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Манниатис и др.. 1984). Хромосомальную ДНК S.marcescens выделяли методом Мармура (Marmur ,1901) в нашей модификации (Соколова, 199Г)). Электрофорез препаратов ДНК осуществляли в 0,о%-пом агароз-ном геле. Рестрикцию плаемидной и хромосомальной ДНК проводили рестриктазой EcoRi. Лигирование EcoRI-реотриктов хромосомальной и векторной ДНК проводили ДНК-лигагсй фага Т4 (Манниатис и др., !984). Трансформацию клеток-реципиентов Е.соЛ DH 5ес осуществляли методом электропорации на установке ГВИ-1. Рекомбинантные клоны с фенотипом AmpRLacZ~ отбирали по результатам культивирования трансформированных проб на селективной индикаторной среде (Соколова, 1990). Идентификацию Ree" фенотипа транс-формантов проводили с помощью 303-хромотеста. Экспрессию в трансформгштал с фенотипом Агпрг< LacZ~Rec~ гена хитиназы S.marcescens выявляли по появлению зон просветления коллоидного хитина вокруг колоний при их культивировании на двухслойной агаризованней среде. Размер клонированного фрагмента хромосомы S.marcescens S18/ES1 определяли методом наименьших квадратов (Вейр, 1995) по данным электрофоретического разделения. Анатиз белков, зкспрессируемых полученными трансформакта-.ш, - осуществляли методом электрофореза в 10%-ном подиакриламщцюм "еле в^ативных и денатурирующих условиях. Внеклеточные белки экстрагировали из агара фосфатным буфером с oil 6,6, осаждали 10%-ной ррихлоруксусной кислотой (LaemmJ.i, 1970; Остерман, 1981). Гюлуче-ше лизата фага \CI857 проводили стандартным методом (Манниатис и тр., 10841.

ГЛАВА 3. ПРИРОДА АНТИГРИВНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ БАКТЕРИИ S.M4R-

IFSCENS. Известно, что бактерии рода Serratia обладаю? мощным на-юром литических ферментов (хитиназа, глкжаназа, амилаза, ДНК-аза, фотеаза/, которые могут принимать участие в процессах лизиса •рибшх мицелнев. Одним из возможных подходов к изучению участия ■идролитических ферментов, и в первую очередь хитиназы, б сложных дагашениях между почвенными микроорганизмами является сравиитель-юе изучение антигрибной активности штаммов бактерии S.marcescens, ;онтрастных по уровню синтеза внеклеточных литических сСерментов. В езультате исследования хитиназной, амилазной, протеазной и ДНК-.

аз ной активностей у 10- ти коллекционных штаммов бактерии S.mrœt cens в опытах In vitro нами были отобраны 3 штамма бактерии,- наиболее контрастно различавшиеся по способности к продуцированию ли-гических ферментов (табл.1): шташ 218/221, являвшийся наиболее активным продуцентом внеклеточной хитиназы, а также характеризо-

Таблица 1

Активность внеклеточных литичесгагх ферментов штаммов бактерш S.marcescens при культивировании In vitro на средах с соответствующими субстратами

Штамм S.marcescens * Активность фермента : (M + m)

Амилаза Хитиназа ДНК-аза Протеаза

218/221 28,6 + 1,6 38,0 ± 3,3 25,9. ± 3,5 26,5 + 0,8

Sma 27,7 ± 1,3 27,0 ± 2,8 23,2 ± 3,5 27,5 + 4,0

Lg 32,7 +1,2 0,0 0,0 0,0

* Ферментативную активность выратали в условных единицах в виде диаметра зон гидролиза непрозрачных субстратов или окрашенных зон, мм.

вавшийся высокими уровнями активностей протеазы, ДНК-азы и амилазы; ' штамм способный продуцировать только амилазу; а также штамм 5/га, занимавший промежуточное положение по уровню литической активности.

Било установлено, что и при культивировании в жидкой среде с коллоидным хитином в качестве субстрата наиболее активным продуцентом фермента являлся штамм 218/221 (рис.1).

Сравнительное изучение антигрибной активности штаммов против 18 видов фитопатогенных грибов показало, что имеет место положительная корреляция между их антагонистическими свойствами и уровнем хитиназной активности (табл.2). Так, активный хитииолнтический штамм 213''221 вызывал полный лизис мицелия более чем у половины тестировавшихся патогенов и ингибировал рост остальных грибов более чем на 70Х. Штамм Зт, занимавший промежуточное положение по

сутки культивирования

Рис.1 Хитиназная активность штаммов бактерии S.mrceseens при культивировании в жидкой среде с коллоидным хитином. Обозначения: Лс1'и-хитиназная активность (иг/мл Н-ацетилглюкозамшга/2 ч инкубирования) : О -штамм 218/221; О-штэмм Sma. Б -прирост биомассы (оптическая плотность культуралыюй жидкости при 540 нм, разведение 1:10): А-штамм £18/221; А-штамм Siria; А-штанм Lg.

уровню хитиназной активности, полностью лидировал мицелий 5 грибов, а ингибирование роста мицелия других видов зарьировало в интервале 34-89%. Для штамма 218/221 было характерно усиление антигрибного действия во времени, а антагонистическая способность штамма Sma ослабевала к 21-ым суткам сокультивирования. Нехитшголити-ческий штамм Lg значительно уступал по величине своей антагонистической активности вышеописанным штаммам, ингибируя полностью рост только F.moni 11 forme. Положительная зависимость между уровнем хи-•тинолитнческой активности штаммов и их антагонистическими свойствами прослеживалась и на примере различных штаммов и изолятов гриба F.oxysporun.

В ходе исследования механизма антагонистического действия штам-

Таблица 2

Антигрибная активность штаммов бактерии S.marcescens (in vitro)

Ингибирование роста грибных колоний

(Z к контролю)

¡J Фитопатогеннш Штамм i Штамм | Штамм

п/п гриб 218/221 Sm | i Lg

сутки сокультивирования

5-ые 21-ые 5-ые i 21-ые¡ i 5-ые| i ?1-ые

i Fusarium oxysporum 88,5 88,9 Qo Q CJO t О 39,81 1 5,6| 0,0

2 Fusarium oxysporum "Ж" 72,6 85,3 72,7 49,8| 75,01 28,7

3 Fusarium oxysporum "ЛС" 83,9 85,3 71,5 61,8| 63,51 41,1

4 Fusarluift oxysporum "M" 68,5 70,5 67,8 51,81 50,01 25,6

5 Fusarium culmorum 89,4 89,7 87,3 89,7! 40,8! £6,7

6 Fusarium graminearum 100,0 100,0 72,7 65,5| 53,8| 29,3

7 Fusarium moniliforme 100,0 100,0 100,0 100,01 100,0! 100,0

8 Rhizoctonia aderholdii 100,0 100,0 88,0 86,7| 82,41 86,4

9 Rhizoctonia colanl 87,5 87,5 70,0 70,01 79,31 32,1

10 Sclerotinia sclerotiorum 100,0 100,0 78,5 100,01 60,7| 89,8

11 Sclerotinia batatIcola 90,2 100,0 90,0 69,7| 80,9| 89,5

12 Phoma exigua 100,0 100,0 85,7 70,У| 82,91 32,4

13 ' Phcma tracheiphila 68,4 86,8 68,4 68,4| 6S,4| 68,4

14 Colletotrlhum lagenarium 100,0 100,0 77,6 81,8| 81,8| 72,4

15 Blpoiaris sorokiniana 100,0 100,0 100,0 100,0! 68,3| 25,0

16 Vertlcilllum dahiiae 89,1 89,8 53,7 66,7| 36,01 25,0

17 Ascohifca boitshauseri 79,3 87,5 46,2 34,11 52,7) 34,6

13 Myrotheclurri verrucaria 100,0 100,0 48,1 100,0! 48,11 44,7

19 Alternarla solanl 81,2 83,4 76,5 57,7| 33,2| 30,4

20 Ulocladium eonscrtiale 100,0 100,0 90,0 54,3¡ 48,7| 34,3

21 Botrytis cinerea 100,0 •100,0 100,0 100,01 t 88,9| 81,4

HCP0. i = 4,5

mob s.mrcesccns оыло установлено, что при культивировании в жидкой среде с vohtum мицелием F.o?:ysporum хитннолнтич-:ские штаммы SiS/SSl и Sm продуцировали внеклеточную хитияазу и с ее помощью утилизировали грибной мицелий в качестве субстрата, о чс-м свидетельствовал.'! кривые динамики прироста биомассы штаммов и их хити-назной активности, представленные па рис.2. Кривые роста их культур имели ступенчатую Форму, указывавшую на пересечение клеток на дополнительный источник питания - мицелий гриба в момент наиболее активного синтеза внеклеточной хптиназы - фермента, ответственного за утилизацию зтого субстрата.

сутки сокультивйрования Рис." Динамика прироста роста биомассы и хитиназной активности штаммов бактерии S.imrcescens при культивировании в среде с убитым мицелием F.oxysporum (из. ".1С"). Обозначения: ЛсЬ'-лЧ]<7?иг/азная активность i иг/мл Ы-ацетлглюкоззтна/В ч инкубироваяия): |-ивш £18/221:0-штамм Sm. Б -прирост биомассы Гопшческая плстость нульшуреьльнои жидкосии при 540 ш): А-штамм 218/221; Л-штамм Sm; А -штгмм Lg.

Было установлено также, что выраженным антигрибным действием обладают и бесклеточные фильтраты культураяьных жидкостей штаммов £18/221 и Snu, содержаще хитиназу. При 50%-ной концентрации в агаризованной среде они подавляли вегетативный рост мицелия F.oxysporum на С8% и 36% соответственно, по сравнению с контролем.

Следующим этапом иссдедоьаиий было изучение биологической активности наиболее активного антагониста гриба F.oxysporum - штамма 218/221 S.marcescens против почвенной фузариозной инфекции в опытах In vivo.

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЖИВОЙ КУЛЬТУРЫ S.MARCESCENS 218/221 ПО ОТНОШЕНИЮ К ПОЧВЕННОЙ ФУЗАРИОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ. В вегетационных опытах на искусственном инфекционном фоне (F.oxysporum, изо-лят "ЛС") было установлено, что наибольшее защитное действие бактерии проявляется при концентрации клеток lOVr почвы. Внесение живой бактериальной культуры в почву перед высевом семян приводило к трехкратному уменьшению общего количества погибших от фузариозной инфекции растений. Причем более чем четырехкратное уменьшение количества пораженных растений отмечалось на стадии трех настоящих листьев, когда имела место максимальная гибель контрольных растений в инфицированной почве (табл.3). Установлено положительное влияние бактериальной культуры на рост растений огурца (табл.З).

При проведении исследований в условиях производственных теплиц было установлено, что в период вегетации растений огурца имели место два этапа в развитии болезней, вызываемых почвенными фитопа-тогенными грибами. Первое массовое поражение растений корневой гиилыо было отмечено через 1-2 недели после высадки рассады на постоянное место. Количество выпадов растений в течение первых нести недель вегетации в контроле достигало 86%. Оно было вызвано комплексом грибов рода Fusarium и частично - Rhizoctonia. Внесение живой 1стльтуры S.mrcescens 218/221 приводило к снижению гибели растений от смешанной инфекции в 2,6 раза.

В ходе дальнейшей вегетации растения огурца поражались главным образом прикорневыми гнилями фузариозной этиологии (возбудитель F.oxysporum, в 83,2% случаев). Симптомы заболевания выражаяись в побурении и отмирании корневой шейки и нижней части стебля. Распространение болезни во второй половине вегетационного периода достигало в контроле 64%, а степень развития - 30%. Обработка почвы под опытными растениями бактериальной культурой обеспечила сниже-

ние количества болышх растений на £0%, а степени развития болезни - в 1,5 раса по сравнению с контролем (рис.3).

Таблица 3

Влияние живой культуры 5.пагсевсепз 218/221 на проявление болезни (возбудитель Г.охуврогит) и рост растений огурца сорта Сюрприз (вегетационный опыт, теплицы ВИЗР)

Вариант опыта ■ Кол-во погибши растений (%), в фазу Общее кол-во погибших растений (%) Высота растений, см Площадь 1 наст, люта, см2

семядоли 11 наст лист III наст лист

Контроль (нестер. почва! 3,5 0,0 0,0 > £ 15,3 27,1

3.тагсозсепз 218/221 0,0 0,0 0,0 0,0 24,9 52,9

Р.ох'/грогит изолят "ЛС" 1С,? 7,2 42,8 69, '1 10,2 18,7

Р.охугрогшп + + З.тагсез-сепз £18/221 3,6 7,2 10,7 21,5 13,9 26,5

НСРо.1 3,2 3,6 со 5,6 1,2 2,7

Существенно, что под влиянием бактериальной культуры резко уменьшалось количество погибших растений, которое к концу Еегета-ции было в 2,3 раза ниже, чем в контроле (табл.4).

Установлено, что живая культура З.тгсеасепз 218/221 оказывает значительное стимулирующее действие на рост и развитие растений огурца. К моменту высадки рассады на постоянное место опытные растения огурца были в среднем на 23 см выше контрольных. В дальнейшем у них на 1,5-2 недели ускорялось наступление фаз бутонизации и цветения, а затем и плодоношения, что обеспечило получение более ранней товарной продукции. В среднем же в.ходе всей вегетации уро-,

жай с обработанных бактерией растений просшюл контрольные показатели на 16.4% (табл. 4;.

Развитие

Распространение Iболезни,X I

ссЯ

40-)

2СН

È

01-

оояевни. :

-10

11.03 22.03 0.04 29.04 27.05 Даты учетов Рис. 3 Влияние живой культуры штамма 218/221 бактерии 3.marees-cens на поражаемость растений огурцов прикорневыми гнилями (гибрид Аэлита, АО "Лето", 1993-1994 гг.). Обозначения:С ЩИ - контроль: ЬУ/Х//Л - обработка бактофитом; - обработка живой культурой

S.marcescens 218/221.

Таблица 4

Влияние живой культуры S.marcescens 218/221 на гибель растений огурца от фузариозной прикорневой гнили (F.oxysporum) и урожай огурцов (гибрид Аэлита, АО "Лето", 1993-1994 гг.)

1 1 Вариант 1 опыта ¡ i Погибшие от прикорневой гнили растения, % (M ± m) i 1 Суммарный урожай I за вегетацию 1

1 i I кг/м2 (M ± m) ( i i 7= к контролю!

i 1 Контроль 1 40,0 + 4,6 1 1 1 20,1 + 0,2 i i i 100,0 1

1 iЕактофит i 34,4 +2,2 1 1 1 16,1+0,3 1 1 1 eo,i i

! !S.marcescens ! 218/221 17,2 ± 3,6 1 1 1 23,4+0,1 1 i i 116,4 1 t

При изучении слияния живой культуры S.mrcescens £18/231 на почвенную Фузариозную инфекцию (F.oxysporum) было установлено, что иод воздействием интродуцированных клеток S.mrcescens происходило резкое снижение (в 76-£С раз) содержания пропагул патогена в почве под растениями на протяжении 20 дней после заключительного внесения бактериальной культуры. Сдерживающий эффект сохранялся на протяжении 2 месяцев после обработки. Отмечалось положительное влияние антагониста на сапретрофную почвенную микрофлору (.табл. 0).

ГЛАВА Я. КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА ХНТИНАЗЫ ИЗ S.MARCtSCENS 218/281 В КЛЕТКАХ К. COLI ДО/ Ли И ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ЕГО ЭКСПРЕССИИ. Заключительным этапом исследований было проведение экспериментов го клонированию в клетках E.coll гена синтеза хитиназы из хромосомы бактерии $.marcescens Sld/SSt, обладающей высот-сой хитинасней ак тивпостью, которая определяет ее выраженные антигрибные свойства. Схема экспериментов. представлена на рис. 4.

Подобранные нами условия позволили получить препарат ДНК бактерии S.mrcescens 21S--221, практически полностью депротеинизирован-ный и свободный от примесей РНК. Концентрация ДНК з пробе составляла 370 мг/мл. Как показали результаты экспериментов, клонирование в клетках E.ccli HB 101 K-i2 Ват HI и Sall-рестриктов бактериальной хромосомы не позволило получить положительных результатов при скрининге трапсФормантов на хитиназную активность. Поэтому мы осуществили клонирование EcoRI-рестриктов ДНК S.narcescens в векторной плазмиде pBluescript KS(+) (pBs). Гидролизат ДНК, полученный в результате инкубации хромосомы с ферментом EcoRI в течение 2,5 часов, содержал набор фрагментов различной длины - от 1 до IS т.п.о. Посредством дотирования ДНК-лигазой фага Т4 полученных Есо-RI-рестриктов хромосомной ДНК S.mrcescens 218/221 и ДНК вектора мы получили смесь рекомбииантных ДНК, в которой ожидали наличия рекомбинантных плазмид pBs со вставками рестриктов хромосомы самых различных размеров, а также дотированных на "себя" векторных плазмид. После трансформации клеток-реципиентов E.coll DH 5сс полученной дотированной смесью с последующим инкубированием на селективной индикаторной среде мы получали колонии, окрашенные либо в голубой, либо в белый цвет в зависимости от наличия или отсутствия вставок фрагментов хромосомы штамма-донора ДНК. Эффективность трансформации составляла 4Q-5QX. В общей сложности было отобрано 1500 трансформантов с фенотипом AmpRLacZ~, после культивирования

Таблица 5

Влияние живой культуры Б .гиагсевсеПЕ 218/221 на почвенную сапротрсфную и фитопатогенную (Р.охуБро-гигп) гшкрофлору в ризосфере растений огурца .(гибрид Аэлита, АО "Лето", 1993-94 гг.)

Вариант опыта ■ Количество микроорганизмов в 1 г воздушно-сухой почвы (М + т)

пропагулы Р.охуерогит сапротрофны'е микроорганизмы

Бактерии (*10б) Грибы (*10б) в том числе (*105)

р.Тг1с1ю<3егта р.Репхс!111шп

Сроки отбора почвенных проб *

7 суток 20 суток 2 месяца 4 месяца 20 суток

Контроль 1150±210 2010+270 1640+240 2070+220 7,5±0,4 1,2+0,4 1,7+0,3 1.8+0,4

Бактофит 20+5 1370+160 1380+190 2250+230 8,0+1,2 3,2+0,8 3 , 6 + 0,6 1,9+0,3

Э.шагсев-вепв 218/221 1515 80+15 650+80 1800+120 1+ оэ 3,6+0,2 6,9+0,6 3,1+0,3

Контроль - почва под растениями огурца, не подвергавшаяся обработке бактериальными культурами. * - сроки отбора почвенных образцов указаны после заключительной обработки живой культурой Б.гаагсев-сепв 218/221.

I Создание библиотеки EcoRI-фрагментов ДНК S.mrcescens 218/221 в клетках E.coli DH 5а

АИ/( S. marcescens

V Т7промотор

\ \ лаг/мгг/ял-ер

VI

/¿IГЗ промотор

pßtaescr/pt ЖГ/V

рестрикция /го fcoßl

4 TT

HofiT-pecm/x/ктг ДШ S. marcescens р

+

4M-jrvr<r3er <para Т4 ГГпротЩр $*

J I пат/м/тер y^rTJnpo/wmop

т +

pßtoescrrpt Щ+) трансформация

Т7 промотор

■ fco #7 73 промотор

Т7про.нотор £со#7-<рраг-■ мем/fi 4///С S. marcescens

ТЗ промо/пор

^ pexwfwammt? pßfrescnpt #$(+)

хяе/по/г-реце/лиемюоб £. ooft J>// So/.

отбор трансформантов, несущих рекомбинантные плазмиды pBluescnpt KS(+) со вставками EcoRI-реетриктоЕ хромосомы S.mrcescens с фенотипом AmpRRec~LacZ~

II Отбор трансформантов E.coli DH 5ос с экспрессирующимся геном хитиназы:

1. Скрининг трансформантов на хитиназную активность

2. Анализ выделенных из отобранных трансформантов рекомбинантных плазмид

3. Электрофоретическое изучение внеклеточных белков, диффундирующих в агаригованную среду с коллоидным хитином в ходе культивирования на ней отобранных трансформантов

4. Изучение биологической активности трансформантов, экспрессирую-щих белковый продукт с хитиназной активностью, в отношении F.oxys-porum

Рис.4 Схема экспериментов по клонированию гена хитиназы из бактерии S.marcescens 218/221

которых на среде с коллоидным хитином в течение 15 суток было выявлено 2 клона (44 и 40), образовывавшие зоны просветления субстрата вокруг колоний. Результаты 203-хромотеста показали, что фенотип AmpRRec~LacZ"* имел только хитинолитический трансформант 44. Из отобранного клона E.coli DH Пл - 44 была выделена рекомбинант-нзя плазмида и проведена ее рестрикция ферментом EcoRI. электрофо-ретичеекий анализ полученного материала погсазач наличие в генетически модифицированной плазмиде вставки рестрикта хромосомы 5.шг-cescens 218/221 по рс-стриктазе EcoRI (оис. 5, дорожка 3), длина которого составляла 2,52 т.п.о. Экспериментально подтверждено, что данная рекомбинантная плазмида.переносилась в неизменном виде при последующих трансформациях ею штамма-реципиента. Полученные вторичные трансфсрмаиты сохраняли способность к гидролизу коллоидного хитина.

Алина, фрагмента/?,

т. п. о.

m

£.0в. fJ5.

ISO —

Ь5/

цг

1,99' 170'

4 2 3 4 5 6 Т в S

Рио.5 Схема электрофореграмм рекомбинантных плазмидных ДНК и их EccRI-рестриктов в 0,8%-ном агарозном геле. 1- гидролизат ДНК фага л по рестриктазе Pst, 2- р40, рекомбинантнап плазмида, ■ выделенная из трансфори&нт E.coil DH foc, не способного к гидролизv коллоидного хитча, 3- р44, рекоыбшштая плазмида, виделенная из транс-■рормант E.coli DH 5л , образовывавшего зону просветления при культивировании на среде с коллоидним хитином, 4- р44, рекомбинантная плазмида, выделенная из лизогенного по фагу \ С1807 штамма E.coli ОН 5- pBluescript KS(+). 6- EcoRI-рестрикт плазмиды р40, 7-EcoRl-рестрикт плазмиды р44, 8- EcoRI-рестрикт плазмиди р44 из ли-зезеннего штамма, 9- EcoRI-рестрикт плазмиды pBluescript KSi+).

Результаты наших исследований, согласующиеся с данными других авторов (Fuchs et al., 198G), свидетельствовали о том. что наиболее пролонгированной во времени является стадия культивирования трансФсрмантов на селективной среде с коллоидным хитином для выявления экспрессии гена хитиназы. В натаем случае зто время составляло 14-10 суток. Для ускорения процесса отбора трансформантоз с экспрессирующимся геном бактериальной хитиназы мы испытали новый метод, основанный на использовании в качестве реципиента полученного нами в независимом эксперименте штамма E.coll DH йх, лизсген-ного по фагу АС 1857, подверженному термоиндукции. Индукция ирофага должна приводить к быстрому спонтанному лизису штамма-реципиента и высвобождению компонентов периплазмы, где происходит накопление окспрессируемого ферментного белка. Для реализации метода по стандартно',' процедуре (Манниатис и др., 1984) был получен дизогенный по Фагу \CÍ8!57 штамм E.coll DH эффективность трансформации которого не отличалась от исходного штамма, и подобраны оптимальные условия проведения процедуры теплового шока, индуцирующего профаг.

Для проверки эффективности разработанного нами метода мы провели трансформацию полученного лизогенного штамма E.coll DH ¿Ja (\CI857) рекомбинантной плазмидой р44. Полученные после электрспо-рации трансформанты при культивировании на згаризоьанной среде с коллоидным хитином образовывали заметные зоны просветления субстрата вокруг колоний уже через 36 часов инкубации. Выделенная из клеток лизогеиа плазмида (р44) при электрофорезе в нативной форме и после рестрикции по EcoRI, Ват HI и Sal I давала результаты, идентичные резудьт£етам, полученным при изучении исходной плазмиды р44 из нелизогенного штамма (рис.5).

Результаты сравнительного электрофореза в нативных и денатурирующих условиях очищенных экстрактов белков, диффундировавших в агар с коллоидным хитином при культивировании на нем бактериальных штаммов, показали., что в пуле белков рекомбинантного штамма E.coll DH í7oí - 44 имелась полоса, подвижность которой совпадала с подвижностью одного из белковых компонентов изоферментного спектра хити-наз штамма-донора ДНК (S.marcescens £18/221). В отличие от штамма E.coll DH 5<х - 44,- в спектре исходного штамма-реципиента E.coll DH 5л этот белковый компонент отсутствовал. Генетически модифицированный штамм E.coll DH - 44 отличался от штамма-реципиента только тем, что содержал рекомбиканткую плагмиду р44, несущую

, фрагмент ДНК бактерии Б.тагсезсепз 218/221, поэтому полученные результаты свидетельствовали о том, что данный компонент представляет собой белок, экспрессируемый с этого фрагмента. Электрофорети-ческое изучение изоферментного спектра хитиназ штамма 218/221 выя-

кА

13076 -

SO -

392717-

М 12 3

Рис.6 Схема электрофореграмм белков, диффундировавших в агари-зованную среду с коллоидным хитином в процессе культивирования бактериальных штаммов. М - набор белков-маркеров молекулярной массы; 1 - S.marcescens 218/221; 2 - E.coll DH 5л; 3 - E.coll DH 5&44.

било наличие в нем 4-х белков с с молекулярными массами 42, 48, 64 и 57 кД. Сравнительный анализ электрофореграмм показал, что белковый компонент, присутствующий в спектре у генетически модифицированного штамма и отсутствующий в спектре штамма-реципиента, соответствует хитиназе S.mrcescens 218/221 с молекулярной массой 57 кД (рис.С).

При сокультивировании на агаризованной среде генетически модифицированный штамм с хитиназной активностью оказывал значительное ингибирующее действие на вегетативный рост F.oxysporum "ЛС" , что выражалось в сильной изреженности мицелия патогена и угнетении его роста по сравнению с контролем и исходным штаммом-реципиентом. Таким образом, поскольку исходный штамм-реципиент и генетически модифицированный штамм отличались только тем, что последний экспрес-сировал белок с хитиназной активностью, то полученные нами.результаты свидетельствуют о том, что этот хитиназный белок обладает оп-

-57/сД

ределенной антигрибной активностью в отношении одного из наиболее опасных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур -F.oxysporum.

ВЫВОДЫ

1. Отобран штамм 218/221 бактерии S.marcesceris, подавляющий in vitro на 70-100% вегетативный рост 18 видов фитопатогенных грибов, включал различные штаммы и изоляты гриба F.oxysporum.

2. Выявлено наличие положительной корреляции между антигрибннми свойствами штаммов S.marcesceris и их хитиназной активностью; в модельной системе S.marcesceris - F.oxysporum установлено, что секре-тируемая бактерией хитиназа деградирует убитый и кивай мицелий патогена, что подтверждает ведущую роль фермента в механизме антагонистической активности бактерии S.mrcesceris.

3. Выявлена высокая биологическая активность штамма-антагониста 218/221 в вегетационных опытах на искусственном инфекционном фойе (F.oxysporum) : внесение в почву ливой культуры штамма приводило к трехкратному уменьшению количества погибших от корневой гнили растений огурца.

4. Установлено, что трехкратное внесение живой культуры S.mrces-cens 21S/221 в почву под растения огурца в ходе их вегетации в условиях закрытого грунта приводило к снижению распространения фу-зариозной прикорневой гнили (F.oxysporum) на 20%, развития заболевания - в 1,5 раза, общей гибели растений - в 2,3 раза и обеспечивало прибавку урожая в среднем на 16,4%.

5. Установлено, что внесение живой культуры S.marcesceris 218/221 в почву на производственных посадках огурца (АО "Лето") приводило к снижению в 75-25 раз содержания в ней пропагул F.oxysporum в течение 20 дней после заключительной обработки бактерией.

6. Получен клон E.coll DH бл - 44, несущий рекомбинантную плазмиду pBluescript KS(+) со вставкой EcoRI-рестрикта хромосомы S.marcesceris 213/221 длиной 2,52 т.п.н., содержащего ген, продукт которого представляет собой хитиназу S. iiarcescens с молекулярной массой 57 кД.

7. В модельной системе E.coll DH 5<х 44 - гриб F.oxysporum установлено, что рекомбинантная хитиназа, экспрессируеыая генетически модифицированным штаммом, ингибировала in vitro вегетативный рост патогена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Штамм £18/221 S.mrcescens депонирован в коллекции микроорганизмов Б'НИЙСХМ как продуцент для создания биопрепарата для защиты растений огурца от почвенной фузариозной инфекции в условиях закрытого грунта. Живая культура бактерии была испытана в теплицах АО "Лето" на растениях огурца (гибрид Аэлита) по предложенной нами схеме, заключавшейся в трехкратном проливе почвы под растениями в ходе вегетации, о чем получен соответствующий акт (см. Приложение к диссертации).

2. На основе клеток E.coll DH Бл и ИВ 101 К-12 создана клонотека фрагментов ДНК штамма 218/221 S.mrcescens, содержащая 11-500 траасформантов, несущих BamHi, Sali и EooRI-рестрикты донорной хромосомы длиной от 1,0 до £0,0 т.п.о., которая является источником генов литическкх ферментов (ДНК-аза, хитиназа, амилаза, проте-аза).

3. Клонированный гек хитиназы S.marcesceris 218/221, обладающей антигрибной активностью, может быть использован для создания векторных конструкций для генетической модификации микроорганизмов- антагонистов почвенных фитопатогенных грибов с целью, усиления их антигрибной активности, а также для получения трансгенных растений огурца с повышенной устойчивостью к грибным инфекциям.

4. Разработан метод обнаружения экспрессии клонированного гена хитиназы, основанный на использовании в качестве штамма-реципиента штамма E.coll DH Pix, лизогенного по термоиндуцибельному фагу X С1657. Применение этого метода позволяет сократить время, необходимое для выявления экспрессии клонированного гена с 15 суток до 30-48 часов.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Соколова М.Б., Попова Э.В., Тютерев С.Л., Хотянович A.B. / Изучение связи между хитинолитической и антигрибной активностью трех щташое бактерии Serratia marcescens // "Биосинтез ферментов микроорганизмами" - Тез. конф'., Москва, 1993. - M. - 1998. -С.115.

2. Попова Э.В., Тютерев С.Л., Соколова М.В., Колобкова Л.А. /Методические подходи к изучению активности хитиназы Serratia marcescens //Бел. БИЗР, N77, С-Пб., 1994, с.72-77

3. Tjuterev S.L.. PopovaE.V., Sokolova M.V., Shelegedln V.N.,

Chatckevich L.K. , Chotjanovich A.Y. /Strain of Serratia лœrcescens with high antifungal and induced chitinase activity //International conference "Biotechnology St.Petersburg'94", Abstr.. Zt-Petersburg1, Russia, September 21-28, 1994, p. 110 4. Попова Э.В., Соколова M.В., Шелегедин В.H., Тютерев С.Л./ Конструирование библиотеки рестриктов хромосомальиой ДНК бактерии Serratia marcescens как источника генов литических ферментов, перспективних для генетической модификации сельскохозяйственных растений и микроорганизмов //Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тез. докл. Всерос. съезда по защите растений ОС-Петербург, декабрь 1995 г.), С-Пб., 1995, с.234-235 Л. Шелегедин В.Н., Соколова М.В., Ибрагимова И.И.. Попова Э.В./ Разработка метода ускоренного обнаружения экспрессии гена хитиназы бактерии Serratia marcescens, клонированного в клетках E.coll '/Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тез. докл. Всерос. съезда по защите растений (С-Петербург, декабрь 199? г.), С-Пб., 1995, с."72

0. Соколова М.В., Хацкевич Л.К., Попова Э.В., Колобкова Л.А., Хотянос-ич A.B. / Применение хитинолитической бактерии Serratia marcescens для борьбы с почвенной фузарисзной инфекцией овощных культур закрытого грунта //-Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность. Тез. докл. Всерос. съезда по защите растений ÎC-Петербург, декабрь 1995 г.), С-Пб., 1995, с.370

7. Соколова М.В. / Хитинолитическая и антигрибная активность трех штаммов бактерии рода Serratia //Современная биотехнология в решении проблем защиты растений. Сб. научн. трудов ВИЗР, С-Пб., 1995, с.214-225

8. Соколова М.В. /Методические подходы к созданию клонотеки Фрагментов хромосомальиой ДНК бактерии Serratia marcescens как источника генов литических ферментов с антигрибной активностью .'/Современная биотехнология в решении проблем защиты растений. Сб. научн. трудов ВИЗР; С-Пб., 1995, с.225-231.

9. Тютерев С. Л., Хацкевич Л. К... Соколова М.В., Попова Э.В. Применение хитинолитической бактерии Serratia tmrcescens для

зашиты растений огурца от почвенной Фуззриозной инфекции //Доклады

PA CXI i, N2. 1&95, G. 22-24

10. Tjuterev S.L., Khatskevlch L.K., Sokoiova M.V..Popova E.V. / Use of the chltlnoiitic bacterium Serratia n&rcescens to protect cucumber plants from the soli-inhabiting Fusarlum rung! //Russian Agricultural Sciences, N3, 1995, pp.35-38

11. T.luterev S.L., Popova E.V., Sokoiova M.V.. Khatzkevich L.K., Khotianlvicr. A.V. / Mycolytlcal enzymes of barterlum Serratia mrcescens In mechanisms of biological control of f'Itopathogenlc fungi genus Fusarlum //.ЧШ International Plant Protection Congress, The Hague-The t¡etherlands-2-7 July 1У95, Abstr. In: European Journal of Plant Pathology, 1995,p.548

12. Попова Э.В., Соколова M.В., Хацкевич Л.К., Тютерев С.Л. / перспективы применения бактерии Serratia rmrcescens для подавления почвенной фузариозной инфекции // Эколого-экономические основы усовершенствования интегрированных систем защиты растений от вредителей, болезней и сорняков - Тез. докл. научи,- произв. кенф., посвящ. 25-летию БелНИИЗР, Минск-Прилуки, 14-16 февраля 1990. - МИНСК. - 1996. - С.104-165.

/