Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Литические ферменты Lysobacter sp.
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Литические ферменты Lysobacter sp."
На правах рукописи
СТЕПНАЯ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА
ЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ¡.УВОВАСТЕЯ ЯР.
03.01.04 Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Пущино-2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Инсппуге биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук
Научный консультант: член-корреспондент РАН,
доктор биологических наук, профессор Кулаев Игорь Степанович
Официальные оппоненты: Капрелъяпц Арсений Сумбатович
доктор биологических наук, профессор, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, заведующий лабораторией
Честухина Галина Георгиевна доктор биологических наук, профессор, Государственный научный центр РФ ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, заведующая лабораторией
Калебина Татьяна Сергеевна доктор биологических наук, профессор, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ведущий научный сотрудник
Ведущая организации: Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук
Защита состоится »2012 г. в час. ^ мин, на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при .Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, Проспект Науки, 5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak.ed.gov.ru и на сайте Института www.ibpm.ru.
Автореферат разослан « 2012 г.
Ученый секретарь -
Диссертационного совета
доктор биологических наук Доронина КВ.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Состояние вопроса и актуальность проблемы
Литические ферменты", разрушающие клеточные оболочки бактерий, были впервые обнаружены в слюне человека и описаны Александром Флемингом в 1922 году (Fleming, 1922). Вещество назвали лизоцимом. что означает «фермент, растворяющий бактерии». В 1929 г. Флеминг впервые описал антибактериальные свойства гриба Penicillum notatum - продуцента первого промышленного антибиотика пенициллина, за что в 1945 г. в соавторстве с Эрнестом Чейном и Говардом Флори был награжден Нобелевской премией. После выпуска пенициллина и до настоящего времени проводится постоянная работа по созданию и производству новых антибиотиков, что вызвано не только необходимостью получать вещества требуемой специфичности и лучшего качества, но также постоянным появлением патогенных микробов, устойчивых к любому, даже самому новому антибиотику (www.who.int). Сложившаяся в связи с этим неблагоприятная ситуация в терапии инфекционных заболеваний заставляет искать новые эффективные антимикробные средства. Многие исследователи указывают на перспективность использования в этих целях литических ферментов, так как способ их воздействия на микробы, а именно растворение микробной клетки, позволяет надеяться на отсутствие появления устойчивых к ним патогенов.
*Термином «литические ферменты» сейчас обозначают гидролазы, разрушающие структурные полимеры клеточных стенок различных микроорганизмов. В зависимости иг того, какие имении микроорганизмы они разрушают, литические ферменты разделяют на бактериолішпеские, дрожжелитические, миколитические. По субстратной специфичности они могут быть подразделены на хитииазы, протеазы, пептидогликангидролазы, глюканазы. Это зависит от того, какие полимеры, входящие в состав клеточных оболочек разных микроорганизмов, разрушают литические ферменты. В свою очередь, например, пегттидогликангидролазы, разрушающие пептндогликан - структурный компонент клеточных стенок бактерий, в зависимости от того, какую связь в молекуле петндогликана они гидролнзуют, раэделяклгя на гликозндазы (Ы-ацетилглюкозаминидазы и №ацетилмурамидазы (лизоцимы)). амноазы и эндопепгидазы. Следует особо отметить бактериолитические протеазы. Среди большого количества известных в настоящее время протеаз бактериологических совсем немного. Но именно эти ферменты в группе литических обладают самым широким спектром действия в отношении микроорганизмов. Они способны разрушать клеточные оболочки бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, простейших.
В зависимости от контекста в настоящей работе будут использованы термины «литические ферменты», «бактериолитические ферменты», «пептидогликангидролвзы», «дрожжелитические ферменты», «литические протеазы».
В период 50х - 70х годов 20 века проводилась интенсивная работа по поиску продуцентов таких ферментов, их выделению и изучению свойств. Сейчас известно, что многие живые организмы - от вирусов до человека - продуцируют литические ферменты. Среди бактерий обнаружены продуценты ферментов, активно лизирующих не только клетки бактерий-конкурентов, но и клетки микроорганизмов других систематических групп - дрожжей, мицелиапьных грибов, простейших. Для таких бактерий в 1978 году был сформирован порядок Lysobacterales, включающий семейство Lysobacteraceae и род Lysobacter, объединяющий четыре вида (Christensen and Cook, 1978). В эту систематическую группу были переведены бактерии, ранее относившиеся к другим родам, но по ряду свойств, а главное по литической способности, отличающиеся от их типичных представителей. В дальнейшем интерес к лизирующим бактериям несколько ослаб, однако сейчас они вновь стали интересовать исследователей. В период первого десятилетия 21 века выявлено одиннадцать новых видов рода Lysobacter. В результате постоянно ведущейся работы по систематизации известных микроорганизмов было скорректировано и систематическое положение рода Lysobacter. Сейчас он включен в семейство Xanthomonadaceae (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001). В литературе же до сих пор можно наблюдать очевидную путаницу в систематическом положении описываемых продуцентов литических ферментов. Например, продуцент ферментов, по всем свойствам аналогичных ферментам типового вида рода Lysobacter - Lysobacter eni)>mogenes - обозначается авторами как Achromobacter lyticus (Shiraki et al, 2002, Li et ai, 1997).
Для бактерий, продуцирующих внеклеточные литические ферменты, как для любой бактерии, жизненно необходимы внутриклеточные автолитические ферменты, разрушающие ковалентные связи в пептидогликане - основном структурном компоненте их клеточной стенки, и играющие таким образом главную роль в процессах роста и деления. В клетках бактерий-продуцентов внеклеточных литических ферментов идет параллельный синтез и передвижение через цитоплазматическую мембрану к месту своего действия как аатолитических ферментов, которые могут локализоваться в мембране, периплазме и клеточной стенке, так и внеклеточных бактериолитических ферментов, секретируемых в окружающую среду. В связи с этим логичен вопрос о механизме и регуляции процесса одновременного функционирования этих ферментов, о том могут ли автолитические ферменты являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов? К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных выделению и характеристике как внеклеточных, так и внутриклеточных бактериолитических ферментов бактерий. Однако до сих
пор нет сведений по сравнительному изучению у одной и той же бактерии вне- н внутриклеточных литических систем. Автолитические ферменты хорошо изучены у многих представителей грамположительных бактерий (Shockman, Holtje, 1994), у грамотрицательных, за исключением Escherichia coli (Holtje, Tuomanen, 1991), их подробно не изучали.
В 1973 году в ИБФМ АН СССР (ИБФМ РАН) по распоряжению Академии наук была начата работа по теме «Создание эффективных средств борьбы с патогенными множественно устойчивыми к антибиотикам микроорганизмами». Культуральная жидкость грамотрицательной бактерии, выделенной в 1976 году из воды реки Оки в районе очистных сооружений г. Пущино, Московской области, явилась основой препарата, названного лизоамидаза и обладающего бактериолитической и протеолитической активностями. Успешные клинические испытания лиэоамидаэы позволили зарегистрировать ее в качестве лекарственного средства для лечения наружных инфекций, вызванных грамположнтелытой микрофлорой. По ряду морфологических и биохимических признаков бактерия-продуцент была предположительно отнесена к роду Xanthomonas. Однако по ряду существенных свойств, например, по отсутствию подвижности, продуцент лизоамидазы отличался от бактерий этого рода.
Цель и задачи работы
Цель работы - исследование биохимических и генетических особенностей функционирования и взаимосвязи внутриклеточной и внеклеточной литических систем бактерии-продуцента препарата лизоамидаза для создания на основе полученной информации нового поколения антимикробных лекарственных средств.
Основные задачи:
• уточнение таксономического положения бактерии-продуцента;
• установление структуры пептидогликана бактерии-продуцента - субстрата автолитических ферментов;
• выделение и характеристика внеклеточных литических ферментов бактерии-продуцента;
• выделение и характеристика внутриклеточных (автолитических) ферментов продуцента;
• установление структуры генов внеклеточных литических ферментов
продуцента;
• исследование особенностей взаимодействия литических ферментов с различными микроорганизмами-мишенями;
• получение рекомбинантных литических ферментов продуцента и изучение их свойств для оценки возможности использования таких ферментов в качестве основы новых антимикробных препаратов;
• изучение возможности использования лизоамидазы и различных форм литических ферментов продуцента для лечения «внутренних» инфекций на примере сибирской язвы.
Научная новизна работы
На основании установленных морфологических, биохимических и генетических свойств бактерия-продуцент антимикробного препарата лизоамидаза отнесена к роду I\ysobacter. Исследуемый в настоящей работе штамм ЬухоЬааег ер. ХЫ был получен путем селекции из исходной культуры и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ В-2249Д). Установлено, что при длительном выращивании этого литически высокоактивного штамма на средах, способствующих секреции внеклеточных продуктов, в популяции возникают и накапливаются за счет большей скорости роста клетки литически ннзкоактивного штамма ЬухоЬааег 5р. ХЬ2.
Впервые охарактеризованы эндоклеточная и экзоклеточная литические системы одной и той же бактерии на примере ¡,узоЬас1ег ер. ХЫ и ХЬ2. В составе эндо клеточной системы обоих штаммов выявлено девять ферментов разной субстратной специфичности и локализации (глюкозидазы, амидазы, эндопептидазы). В составе внеклеточной литической системы ЬуяоЬааег эр. ХЫ обнаружено пять ферментов, среди которых мурамидаза (ЛЗ), амидаза (Л2), три эндопептидазы (Л1, Л4, Л5). Внеклеточная литическая система низкоактивного штамма ЬуюЬаМег ер. ХЬ2 состоит из мурамидазы и амидазы. Свойства ферментов разных литических систем значительно отличаются друг от друга: внутриклеточные ферменты являются кислыми белками, активными при 29°С -температуре оптимального роста бактерии, высоком значении ионной силы среды и щелочном значении рН; внеклеточные ферменты - щелочные белки, активные при низких значениях ионной силы, щелочном рН и высоких температурах (50°-80°С).
Впервые выявлено, что постсекреторное электростатическое взаимодействие высокомолекулярного кислого полисахарида и ферментов Lysobacter sp. XL1 приводит не только к значительной стабилизации ферментов, но и, в ряде случаев, к изменению их активности. Полисахарид усиливает действие мурамндазы на клетки золотистого стафилококка, а литичеекме ферменты, связанные с полисахаридом, становятся способными разрушать покоящиеся споры бактерии рода Bacillus. Полисахарид Lysobacter sp. XL1 полностью ингибирует активность ряда литических ферментов других продуцентов. Очевидно, что образование микроорганизмами таких внеклеточных комплексов является для них экологически значимым.
Впервые показано, что внеклеточные литические ферменты Л2 и Л5 Lysobacter sp. попадают в окружающее клетку пространство внутри образуемых бактерией внешнемембранных везикул. Ферменты, заключенные в везикулы, способны лизировать живые клетки представителей различных грулп микроорганизмов, например, грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas, Proteus, Erwinia, Alcaligenes, грамположительных бактерий, относящихся к родам Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Rothayibacter, дрожжей рода Candida. мицелиального гриба Sclerotinia sclerotiorum, в отличие от литических ферментов, находящихся вне везикул. Таким образом, подобный путь секреции литических ферментов имеет для клетки-продуцента важное биологическое значение, так как расширяет спектр микроорганизмов, с которыми она может конкурировать в природе.
Установлены важные особенности взаимодействия внеклеточных литических ферментов Lysobacter sp. с нативными клетками-мишенями. Для эффективного гидролиза клеток грамположительных бактерий ферментам необходим предварительный контакт с отрицательно заряженным полимером клеточной стенки (тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами), при этом химическая структура полимера не имеет решающего значения. Нативныс клетки грамотрицательных бактерий литические ферменты Lysobacter sp.(3a исключением JI5) разрушают только при условии предварительной дестабилизации внешней мембраны клетки-мишени подходящим способом (температура, полимиксин В, гентамицин, амикацин). Литический фермент Л5 разрушает клетки грамотрицательных бактерий без предварительной обработки.
Практические значение работы
На основании полученных данных разработан и масштабирован новый регламент получения препарата лизоамидаза с высоким выходом целевого продукта (до 80%).
Разработаны способы получения двух рекомбинантных литических эндопептидаз Lysobacter sp. XLI с использованием гетерологичных систем на основе Е. coli (рефолдинг из телец включения) и Pseudomonas fluorescens (очистка секретируемых белков).
Установлена возможность использования препарата лизоамидаза, а также везикул Lysobacter sp. XL I для лечения различных форм экспериментальной сибирской язвы.
На основе материалов диссертации получены патенты РФ: № 2139348 (1999), № 2193063 (2002), № 2296576 (2007), № 2407782 (2010), № 2408725 (2011), патент USA № 7,150,985 В2 (2006), патент Китая № 274608 (2006), Европейский патент № 1902719 В1 (2011).
Полученные в работе новые данные используются в курсах по биохимии на биологическом факультете МГУ им М.В. Ломоносова и биологических факультетах других высших учебных заведений.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на третьей и четвертой Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами», Кобулети, 1986; Ташкент, 1988; Второй Всесоюзной конференции «Раны и раневая инфекция», Москва, 1986; 14 International Congress of Biochemistry, Prague, CSSR, 1988; Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма», Пущино, 1989; Пятой международной конференции по химии и биотехнологии активных природных соединений, Варна, Болгария, 1989; 1 International symposium «Molecular organization of biological structures», Moscow, 1989; 5 European congress on Biotechnology, Copenhagen, 1990; International conference on antimicrobial activity of nonantibiotices, Copenhagen, 1990; Коференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты», Пущино, 1995; International Conferense «Microbial polysaccharide», Canada, 1995; First International Conference «Polysaccharide Engineering» Trondheim , Норвегия, 1995; Конференции хирургов, Калуга, 1996; IV симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», Москва, 1997; Втором съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997;
семинаре-презентации инновацнонных научно-технических проектов «Биотехнологии Подмосковья-97», Пущино, 1997; International symposium «Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology», Pushchino, 2000; международной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, 2001; 3 Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 2002; Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзнмологин. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия», Москва, 2002; Втором, Пятом, Шестом московских международных конгрессах «Биотехнология; состояние и перспективы развития», Москва, 2003, 2009, 2011; Первом Всероссийском конгрессе «Успехи медицинской микологии», Москва, 2003; III Conference «Biotechnology; Stale and Perspective of Investigation», Moscow. 2005; Третьей Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2004; Конференции «Фундаментальные науки-медиципе», Москва, 2005; конференции «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств», Москва, 2008; Всероссийской конференции «Экотоксикология-2010», Тула, 2010; Конференции «Фундаментальные науки - медицине», Москва, 2010, Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», Москва, 2011.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 84 работы: 1 обзор, 31 экспериментальная статья в рекомендуемых ВАК изданиях, 9 Российских и зарубежных патентов, тезисы 43 докладов.
Структура и объем работы
Работа состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 20 таблиц и 50 рисунков. Список цитируемой литературы включает 597 источников.
Место выполнения работы и личный вклад соискателя.
Основная часть работы выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН), часть результатов получена при выполнении совместных работ в Институте органической химии им.
II.Д. Зелинского РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова, Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии.
Личный вклад автора состоял в планировании и проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов, их оформлении для публикаций.
Автор выражает глубокую признательность всем коллегам, принимавшим участие в представленной работе на различных этапах ее выполнения: к.б.н. Цфасман И.М., к.б.н. Бегуновой Е.А., к.б.н. Ситкину Б.В., Ледовой Л.А., к.б.н. Васильевой Н.В., к.б.н. Чайка И.А., к.б.н. Рязановой Л.П., к.б.н. Сузиной Н.Е., д.б.н. Курочкину И.Н., д.б.н. Тульской Е.М., д.б.н. Наумовой И.Б., к.б.н. Стрешинской Г.М., Зубрицкой Л.Г., Барковой Н.Г., к.х.н. Красовской Л.А., к.х.н. Мурановой ТА., д.х.н. Книрелю Ю.А., к.х.н. Сенченковой CH., к.х.н. Лихошерстову Л.М., д х.н. Шашкову A.C., к.б.н. Шишковой H.A., к.м.н. Маринину Л И., к.м.н. Старицину H.A., к.б.н. Грановскому Н.Э., Лаптевой Ю.В, к.б.н. Латыпову O.P., к.б.н. Калинину А., д.б.н. Крупянко В.И., д.б.н. Северину А.И., к.б.и. Абрамочкину Г.В., д.б.н. Козловскому А.Г., Лысанской В.Я., к.ф.-м.н. Карпову A.B., к.ф.-м.н. Сидорову И.А., д.б.н. ВагабовуВ.М.
Автор искренне благодарен своему учителю и консультанту настоящей работы чл.-корр. РАН Кулаеву И.С.
Защищаемые положения:
1. На основе отдельных литических ферментов Lysobacter sp. (нативных и рекомбинантных), а таюке внешнемембранных везикул могут быть созданы новые антимикробные препараты широкого спектра действия, активные против множественно устойчивых к антибиотикам патогенных микроорганизмов.
2. Внеклеточная и внутриклеточная системы литических ферментов Lysobacter sp. (XLI, XL2) функционируют независимо, количество и свойства литических ферментов разных систем значительно отличаются друг от друга.
3. Полисахарид Lysobacter sp. XL1 удерживает, перемещает литические ферменты бактерии в околоклеточном пространстве, стабилизирует ферменты и регулирует их активность, защищает клетку бактерии-продуцента от чужеродных литических ферментов.
4. Внеклеточные литические ферменты Lysobacter sp. XL1 в сочетании с полисахаридом эффективно разрушают покоящиеся споры бактерий рода
Bacillus. Установленный факт имеет большое значение для разработки способов борьбы с сибиреязвенной инфекцией.
5. Разрушение клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий литическими ферментами имеет различные механизмы.
6. Везикулярный способ секреции бактериальных литнческих ферментов имеет важное биологическое значение для бактерии-продуцента, расширяя спектр потенциальных микроорганизмов-мишеней.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МЕТОДЫ
Основным объектом исследований являлась бактерия Lysobacler sp. (XLI, XL2). В работе использовали также микроорганизмы, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, г. Пущино); из Государственного института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (ГИСК, г. Москва).
В ходе выполнения работы использовались различные микробиологические, биохимические, молекулярно-биологические, физико-химические методы исследования.
Ферментный препарат лизоамидаза получали на опытно-технологической установке ИБФМ РАН из культуральной жидкости бактерии Lysobacler sp. XLI.
В ходе лабораторных исследований Lysobacler sp. XL I и Lysobacler sp. XL2 выращивали на средах различного состава, в том числе на модифицированной среде LB. В состав среды, способствующей продукции бактериолитических ферментов (среда 1), входили пептон (5 г/л), дрожжевой экстракт (5 г/л), NaCI (5 г/л), pH 7,5. В состав среды, блокирующей продукцию внеклеточных белков (среда 2), - пептон (10 г/л), дрожжевой экстракт (20 г/л), NaCI (5 г/л), pH 7,5. Агаризованные питательные среды содержали агар в концентрации 1,5 %.
Периплазматическую фракцию клеток Lysobacler sp. XLI и Lysobacler sp. XL2 получали осмотическим шоком по методу Носсала и Хэппела (Nossal, Heppel, 1966). После обработки осмотическим шоком замороженные при -70 °С клетки разрушали на прессе и разделяли центрифугированием при различных скоростях на клеточные стенки и мембраны (осадок) и цитозоль (надосадочная жидкость).
Разделение белков внешней и цитоплазматической мембран проводили по мето^ Шнайтмана (Schnaitman, 1971).
Солюбилизацию автолитических ферментов из фракции клеточных стенок и мембран проводили последовательно 5 M раствором LiCI и 1% тритоном Х-100 (Brown, 1973; Melt et al., 1980).
Чистоту и природу получаемых после фракционирования клеточных фракций определяли по активности маркерных ферментов. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по скорости восстановления NADP (Kornberg, Horecker, 1955). Активность лактатдегидрогеназы определяли по скорости окисления NADH (Kornberg, 1966). Активность циклической фосфодиэстеразы определяли по скорости образования /^-нитрофенола, используя в качестве субстрата натриевую соль бис(р-нитрофенил)фосфата (Neu, Heppel, 1965).
Автолитическую активность клеточных фракций определяли по способности лизировать автоклавированные клетки Lysobacter sp. XL1, вплавленные в 1%-ный агарозный гель. Автолитическую активность ферментных препаратов определяли по уменьшению оптической плотности суспензии аптоклавированных клеток Lysobacter sp. XL I при 400 нм.
Содержание белка измеряли по поглощению при 280 нм, методами Лоури (Lowry étal, 1951) и Брэдфорд (Bradford, 1976).
Электрофоретический анализ автолитических ферментов клеточных фракций Lysobacter sp. XL1 и XL2 проводили в неденатурирующих условиях в полиакриламидном геле (ПААГ), используя анодную (Ornstein, Devis, 1964) и катодную системы (Reisfeld et al., 1962). Электрофорез в присутствии SDS-Na проводили в системе Лэммли (Laemmli, 1970).
Клеточные стенки грамположительных бактерий получали методом Шарона в модификации Шоу (Shaw et ai, 1970). Тейхоевую кислоту из клеточных стенок выделяли методом горячей экстракции ТХУ (Armstrong et al., 1960).
Пептидогликан грамотрицательных бактерий получали в два этапа. На первом этапе выделяли пептидогликан-липополисахаридный комплекс бактерии с помощью модифицированных методов Braun and Sieglin (1970) и Goodwin and Shedlarsk (1975). На втором этапе получали пептидогликан по методу Стрешинской и соавт. (1979).
Для определения структуры пептидогликана образцы гидролизовали в 6 н HCl 18 ч. Полученные гидролизаты анализировали по методу Спакмана с соавт. (Spackman et al., 1958) в модификации на автоматическом анализаторе аминокислот Т339 («Microtehna», Чехославакия). Конфигурацию
диаминопимелиновой кислоты определяли методом нисходящей бумажном хроматографии (Rhuland et al., 1955).
Субстратную специфичность литических ферментов определяли по их способности расщеплять р-нитрофенил-2-ацетамидо-2-дезоксн-/7-0-глюко-пиранозид (NADG) - субстрат для глюкозаминидаз (Doson et al., 1991), 3,4-динитрофенил-тетра-Ы-ацетил-/(-0-хитотетраозид (DTAC) - субстрат дня мурамидаз (Ballardie, Capon, 1972), Abz-Ala-Ala-Phe-pNA (антранонл-аланнл-аланил-фенилаланил-паранитроанилид) - субстрат для Ы-ацетилмурамонл-Ь-апанинамидазы JI2.
Присутствие в гидролизате свободных NH2-rpynn определяли методом Гюзена (Ghuysen et al., 1966).
Очистку белков проводили методами ионообменной хроматографии, гельфильтрации, а также электрофореза в полиакриламидном геле. Структуру внеклеточного кислого полисахарида Lysobacter sp. XL I определяли так как описано в работе Лихошерстова с коллегами (Likhoshcrslov et al, 1995).
Количество полисахарида измеряли антроновым методом (Захарова н Косенко, 1982).
Для изучения действия лизоамидазы и ее компонентов па эндоспоры бактерий рода Bacillus использовали следующие методики:
1) К суспензиям спор добавляли лизоамидазу или лизоцим и инкубировали при 37°С в течение 20 часов. Споры собирали центрифугированием и трижды отмывали стерильной водой. Для индуцирования прорастания и инактивации вегетативных клеток споры прогревали при 80 °С в течение 15 минут, после чего споровый материал переносили в жидкую среду для прорастания при 29°С.
2) К споровым суспензиям добавляли лизоамидазу, гомогенные ферменты, полисахарид или различные вариации реконструированных фермент-полисахаридных комплексов. Пробы инкубировали при 37 °С на качалке в течение 24 часов. Споры собирали центрифугированием, дважды отмывали 0,1 М NaCI и 3 раза стерильной водой. Затем для инактивации ферментов лизоамидазы и вегетативных клеток и индуцирования прорастания споры прогревали при 85°С в течение 20 минут. Далее весь споровый материал переносили в жидкую среду для прорастания. Через 0, 7 и 9 часов прорастания делали высевы по 0,1 мл из жидкой среды на чашки с агаризованной средой. Прорастание спор проводили при 29°С. В жидкой среде прорастание контролировали по ODm, на чашках - визуально, по образованию колоний.
N-копцевые аминокислотные последовательности белка и пептидов определяли методом автоматической деградации по Эдману. Гидролиз трипсином немодифицироваиного белка и белка, модифицированного винилпиридином (Friedman, et at., 1970), проводили в N-этилморфолин-ацетатном буфере (pH 8,0). Гидролизат высушивали лиофильно. Затем его растворяли в трифторуксусной кислоте (ТФУ) и разделяли методом обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте концентрации ацетонитрила (0-80%).
Везикулы получали из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2. Клетки удаляли центрифугированием при 4500 g в течение 20 мин и повторным центрифугированием супернатанта при 22000 g в течение 25 мин. Из полученной культуральной жидкости везикулы осаждали центрифугированием при 140000 g в течение 2 ч при 4 °С, промывали и хранили при -20 "С.
Ультратонкие срезы готовили по Рейнольдсу (Reynolds, 1963).
Для определения литического действия везикул использовали живые клетки грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. На подросший газон клеток-мишеней наносили препарат везикул Lysobacter sp. XL1 и инкубировали при 29°С до появления зон лизиса.
Иммуноферментный анализ проводили после электрофоретического переноса белков с полиакриламидного геля на мембрану ПВДФ (поливинилиденфторид). Мембрану обрабатывали поликлональными кроличьими антителами к ЛI (AlpA) и Л5(А1рВ) ферментам или к белку SecA Е. coli, а затем коныогатом белка А с пероксидазой хрена и проводили детекцию при помощи хемилюминисцентного субстрата.
Содержание 2-кето-3-дезокси-0-манноо1сгоната (КДО) во внешних мембранах и везикулах определяли по реакции окисления КДО перйодной кислотой (Karkahnish et а!., 1978).
Общую бакгериолитическую активность определяли турбидиметрическим методом по уменьшению оптической плотности автоклавированных клеток S. aureus 209Р. За единицу бактериолитической активности (J1E) принимали количество фермента, приводящее к уменьшению поглощения клеточной суспензии на 0,01 o.e. при 37° С за 1 мин. Бактериолитическое действие ферментных препаратов определяли также по их способности лизировать автоклавированные клетки S. aureus 209Р, вплавленные в 1% агарозный гель.
Протеазную активность измеряли по скорости расщепления казенна (Hull, 1974) с модификацией. За единицу протеазной активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое при 37 °С в течение 10 мин превращало казеин н неосаждаемое ТХУ состояние в количестве, соответствующем повышению оптического поглощения реакционной смеси при 280 нм на 1,0.
Таксономическое положение бастернн-продуцента препарата лшоамндаза
Бактерия - продуцент препарата лизоамидаза - выделена в 1976 г из воды реки Оки сотрудниками ИБФМ РАН.
Исследуемый в настоящей работе литически высокоактивный штамм (ХЫ) был получен путем селекции из исходной культуры и депонирован в ВКМ (В-2249Д). На рисунке 1 представлены фотографии клеток бактерии, визуализированных при помощи микроскопии
Бактерия представляет собой неподвижные грамотрицательиые ровные палочки с округлыми концами, одиночные, в парах или цепочках, не образующие спор, без жгутиков. Клетки, выращенные на агаризованных средах, имеют размер 0,5-0,7 х 2,0-5,0 мкм, в жидких - 0,3-0,5 х 3,0-8,0 мкм.
Рисунок 1. Фотографии клеток бактерии.
А - световая микроскопия, х 1320; Б, В - электронная микроскопия, х 72000, х 42000, соответственно
Морфологические и биохимические свойства позволили отнести этот штамм к роду Lysobacter (Christensen and Cook, 1978). Анализ установленной нуклеотидной последовательности гена, кодирующего 16-S РНК продуцента, проведенный при помощи компьютерных программ анализа ДНК и РНК, представленных в базе данных «Ribosomal Database Project» (http://rdp.cme msu.edu/html/), также подтвердил, что изучаемая бактерия относится к роду Lysobacter.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
А
Б
В
Определена химическая структура пептидогликаиа исследуемой бактерии. В соответствии с классификацией Шлейфера и Канцлера (Schleifer, Kandier, 1972) она относится к А1у типу. Гликаиовая цепь пептидогликанов этого типа состоит in чередующихся остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, каждая мурамовая кислота несет тетрапептид с аминокислотной последовательностью: L-аланин - y-D-глютаминовая кислота - л<езо-диамино-пимслиновая кислота - D-аланин. В пептидогликанах А1у типа отсутствуют межпептидные мостики, а пептидные субъединицы соседних гликановых цепей соединены при помощи л<езо-диаминопимелиновой кислоты в третьем положении одной субъединицы и D-апанина в четвертом положении другой субъединицы. Пептидогликаны А1у типа характерны для большинства изученных грамотрицательных бактерий.
Система внутриклеточных (автолнтпческнх) пептндогликангидролаз Lysobacter sp.
При длительном культивировании Lysobacter sp. XL1 на средах, обеспечивающих высокий уровень внеклеточной логической активности, в популяции появляются малоактивные клетки (рисунок 2А), которые со временем вытесняют высокоактивные, так как скорость их роста на таких средах выше (рисунок 2Б). Малоактивный вариант бактерии был обозначен как Lysobacter sp. XL2.
Для характеристики системы внутриклеточных автолитических ферментов клетки Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2 выращивали на двух вариантах сред: способствующих продукции внеклеточных литических ферментов (среда 1) и блокирующих их продукцию (среда 2). В клетках Lysobacter sp. XL1 и XL2, не продуцирующих внеклеточные ферменты, выявлено девять внутриклеточных пептидогликангидролаз (AI-A6, А8-А10) различной локализации.
Шесть из них обнаружены в цитозоле (А1-А6), один в периплазме (А8), два во фракции клеточных стенок и мембран (А9, А10). При переходе культур от логарифмической к стационарной стадии роста наблюдались изменения в активности цитозольных ферментов - активность фермента AI значительно
І
з
з
!р '
4
із
■ І
Вріиі рості, ч
Рисунок 2. Расщепление культуры Lysobacter sp.
А - фотографии колоний клеток Lysobacter sp. и зон лизиса клеток золотистого стафилококка, вплавленных в агаризованную среду, вокруг них. ¡-колонии клеток литически высокоактивного (XL1) и низкоактивного (XL2) штаммов Lysobacter sp. Колонии низкоактивного штамма обозначены стрелками. 2- колонии клеток Lysobacter sp. XL1. 3- колонии клеток Lysobacter sp. XL2.
Б - скорость роста Lysobacter sp. XL2 (1) и Lysobacter sp. XLI (2) на различных средах. 1 -минеральная среда, 2- дрожжепептонная среда, 3 - среда 5/5, 4- среда LB «супербульон».
увеличивалась, в то время как активность ферментов А? и А<, уменьшалась. В цитозоле клеток Lysobacter sp. XL1, продуцирующих внеклеточные ферменты, в отличие от Lysobacter sp. XL2, выявлена дополнительная пептидогликангидролаза А7. На основе имеющихся в настоящий момент данных можно предположить, что фермент А7 является частично процессированной формой предшественника внеклеточной литической эндопептидазы Л5, продуцируемой Lysobacter sp. XL! (см. ниже). На рисунке 3 представлены электрофореграммы цитозольных автолитических ферментов Lysobacter sp. XL1. Таким образом, система автолитических ферментов Lysobacter sp XL2 (продуцирующего и непродуцирующего внеклеточные литические ферменты) и Lysobacter sp. XLI, непродуцирующего внеклеточные ферменты, включает в себя 9 ферментов, автолитическая система Lysobacter sp. XLI, продуцирующего внеклеточные ферменты - 10.
Установлена субстратная специфичность автолитических ферментов ЬухоЬас/ег 5р. Периплазматический фермент А8, цитозольный А1 и фермент А10, солюбилизированный из клеточных стенок и мембран Тритон Х-100, проявляли глгакозаминидазную активность Цитозольный фермент А4 и фермент А9,
Л» ЯГ
А1 0,02 А2 0,12
АЗ 0,38
А4 0,55
А5 0,69 Аб 0,79
А7 0,92
12 12
Рисунок 3. Электрофореграмма цитозольных автолитических ферментов ¿у$оЬас!ег яр. ХЫ. а - электрофорез в анодной системе, Ь - электрофорез в катодной системе, 1 - цитозоль клеток ЬузоЬас/ег 8р. XI, 1. (среда 2), 2 - цитозоль клеток ¿у!оЬас1ег ер. ХЫ. (среда 1), с - цитозоль клеток логарифмической фазы роста, (1 - цитозоль клеток стационарной фазы роста, А1-А7 - автолитические ферменты, темные пятна - зоны лизиса клеток 1у.чоЬас1сг 5р. ХЫ, вплавленных в агарозный гель, на который накладывали ПААГ после электрофореза
солюбилизированный из клеточных стенок и мембран 1ЛС1, являются мурамидазами. Цитозольные ферменты АЗ и А6 - Ы-ацетилмурамоил-Ь-аланин-амидазы. А5 - диаминопимелиноил-апанин эндопептидаза.
Изучены некоторые физико-химические свойства ферментов А5, А6 -наиболее активных автолитических ферментов цитозоля ¿уяоЬас/ег эр. ХЫ и XI,2 - и фермента А7, присутствующего только в цитозоле клеток 1узоЬас1ег зр. ХЫ, продуцирующих внеклеточные литические ферменты (таблица 1). Таким образом, внутриклеточные автолитические ферменты 1)чоЬас1ег 5р в основном являются кислыми белками, активными при 29 °С - температуре оптимального роста бактерии, высоком значении ионной силы среды и щелочном значении рН.
Таблица I. Свойства некоторых автолитических ферментов IузоЬааег эр.
Фермент Оптимальные условия активности Температура полуинактивации, °С
рн Концентрация буфера, лМ Т. °С
Глюкозаминидаза А1 8,0 30-300 37-40 47
Эндопептидаза А5 7,5 50-200 29 45
Амидаза А6 7,5-8,0 50-200 29 40
Эндопептидаза А7 7,0 25-100 29 50
Внеклеточные продукты 1*у5оЬас1ег $р.
Система внеклеточных пептидогликангидролаз ¿.уїоЬасІегєр.
іуяоЬасІег зр. ХЫ на средах, способствующих образованию внеклеточных продуктов, секретирует пять литических ферментов: мурамидазу ЛЗ, амидазу Л2, три эндопептидазы (Л1, Л4, Л5). іупоЬасіег яр. Хі_2 - только два (Л2, ЛЗ) (рисунок 4). Все ферменты в той или иной степени охарактеризованы (таблица 2).
кДа 66,2 <■»
45,0
31,0 —
21,5
М 1 2 3 4 5 6 7
Рисунок 4, Электрофореграммы культуральных жидкостей ¿у$оЬас!ег зр. ХЫ и ¡.узоЬааег зр. Х1.2 и очищенных литических ферментов. М - маркеры (БСА - 66,2 кДа, овальбумин - 45,0 кДа, карбоангидраза - 31 кДа, ингибитор трипсина - 21,5 кДа), 1 - культуральная жидкость ЬуноЬаагг ер. ХЫ (1мл на дорожку), 2 -культуральная жидкость Ьу5оЬас1ег Бр. ХЬ2 (10 мл на дорожку), 3 - мурамидаза (ЛЗ), 4 - амидаза (Л2), 5 - эндопептидаза Л5, 6 - эндопептидаза Л1, 7 -эндопептидаза Л4
Таблица 2. Сравнительная характеристика свойств внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp.
Фермент ММ, кДа Оптимум рН Трис-НСЦ мМ* Оптимум температуры,°С Ингибитор Субстратная специфичность N-концевая аминокислотная последовательность Номер в UniProt Клоп ledge base
Л1 22 7-11 50,0 70 ФМСФ, п-ХМБ Gly-Gly эндопептидаза, Ы-ацентилмурамоил-Ь-аланинамидаза ЕС 3.4.21 12 VNVLGG1 EYS I NNATLCSVG F S V Р27459
Л2 29 8,0 50,0 65 ЭДТА, ФМСФ Ы-ацентилмурамоил-Ь-аланинамидаза xNVVFLNx Рх Р Q V Р85143
ЛЗ 25 8,0 0,1 60 но. Мурамидаза 1 A I QGGxGYL xQPGDGYKYA Р85152
Л4 21 8,0 50,0 50-55 ФМСФ, п-ХМБ Диаминопимелиноил-аланин эндопептидаза AVVNGVNYVG Е Т Т А А Р85155
Л5 24 7,5 10,0 80 ФМСФ Эндопептидаза ATVQGGI х YR М Р Р85158
*) Оптимальная концентрация
х - Неидентцфицированные аминокислотные остатки н.о. - не определяли
Из таблицы 2 следует, что внеклеточные литические ферменты ¿1 чоЬааег Бр. являются белками с небольшой молекулярной массой в пределах от 21 до 29 кДа. Оптимальными для проявления активности ферментов являются щелочные значения рН и низкие значения ионной силы реакционной смеси. Следовательно, свойства внеклеточных литическнх ферментов заметно отличаются от свойств ферментов автолитической системы этой же бактерии (таблицы 1 и 2). Вероятно, различия в свойствах обусловлены тем, что автолитические ферменты функционируют внутри клетки-продуцента, а функцией внеклеточных ферментов является разрушение клеточной оболочки микроорганизмов-конкурентов снаружи.
Последовательность аминокислот Ы-концевой части молекулы фермента Л1 оказалась гомологичной последовательности аминокислот а-литической протеазы Ьу$оЬас1ег ercymogenes. Аминокислотные последовательности внутренних участков фермента Л1 также гомологичны соответствующим участкам а-литической протеазы (70% гомологии). Полученные данные позволили провести работу по установлению нуклеотидной последовательности гена фермента Л1. Была определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК ЬуяоЬасЫг 5р. ХЫ размером около 8 т.п.н., в составе которого идентифицированы две открытые рамки считывания (ОРС). Одна, размером 1197 п.н., кодирует эндопептидазу Л1 (А1рА), вторая ОРС, размером 1200 п.н., кодирует гомологичную (степень гомологии 59%) последовательность. Ы-концевая последовательность бактериологической эндопептидазы Л5 полностью совпала с соответствующим участком нуклеотидной последовательности второй ОРС. Таким образом, была установлена также нуклеотидная последовательность гена, кодирующего литическую эндопептидазу Л5 (А1рВ) (ОепВапк асс.# 01! 188567). Структура генов а!рА и а1рВ свидетельствует о том, что белки А1рА и А1рВ синтезируются в виде препробелков. Это характерно для ряда бактериальных внеклеточных белков. Гомологии остальных внеклеточных ферментов ¡.уяоЬаМег зр. с известными в литературе белками не выявлено.
Гомологичные бактериолитические сериновые протеазы Л1 и Л5 были охарактеризованы по способности лизировать живые и «убитые» клетки различных видов микроорганизмов. Результаты представлены в таблицах 3 и 4, и проиллюстрированы на рисунке 5.
Таблица 3. Литическое действие эндопептидазы Л5 на клетки тест-культур
Микроорганизмы A Б
Грамположнтельные бактерии
Bacillus subtilis W23 + 5120
Bacillus cereus 217 - 5270
Micrococcus roseus В1236 + 3260
Micrococcus Intens В1819 + 3880
Corynebacterium xerosis - 4030
Staphylococcus aureus 209P - 8990
Rathayibacter tritici - 4030
Listeria monocytogenes n766 HO.* 14000
Грамотрицательные бактеоии
Pseudomonas fluorescens 1472 - 4490
Pseudomonas putida + 3880
Proteus vulgaris H-19 + 5580
Proteus mirabilis N2 + 5270
Escherichia coli К. 12 ++ 5120
Envinia caratovora В15 - 6510
Alcaligenes faecalis ++ 4650
Дрожжи
Torulaspora delbrueckii BKM Y-706 - 1550
Candida utilis BKM Y-74 + 1860
Candida boidinii BKM Y-34 + 1705
Candida guilliermondii BKM Y-41 + 1395
Saccharomyces cerevisiae M660 - 930
Pseudozyma fusiformata BKM Y-2821 - 1395
А - действие на нативные клетки (наносили фермент на газон
микроорганизмов); Б - действие на авто клавиро ванные клетки (тестировали турбидиметрически), Е/мг белка *) не определяли; «—»- нет
литического эффекта; «+» - есть литический эффект; «++»- очень хороший литический эффект.
Из таблицы 3 видно, что литическая протеаза Л5 способна лизировать «убитые» клетки всех исследованных микроорганизмов. Очевидно, фермент гидролизует пептидные связи в пептидогликанах различной структуры, а также структурные белки клеточных стенок дрожжей. Однако не все живые клетки подвергались лизису под действием фермента Л5. Так, например, живые клетки В. cereus 217, С. xerosis. S. aureus 209Р, R. Iritici, P. fluorescens 1472, E. caralovora В15, Т. delbrueckii BKM Y-706, cerevisiae M660, P. fusiformata BKM Y-2821
оказались устойчивыми к действию фермента. Объяснить это можно тем. что полимеры, входящие в состав клеточных стенок живых микроорганизмов, образуют супрамолекулярные структуры, способные защитить клетку от действия литических ферментов.
Candida uälis Proteus vulgaris Escherichia coli
Рисунок 5. Литическое действие фермента Л5 на живые клетки тест-культур. Представлены фрагменты чашек с местом нанесения образца, где образовались зоны лизиса.
Следует особо отметить, что фермент Л5 способен лизировать нативные клетки грамотрицательных бактерий. Из литературы известны единичные примеры таких ферментов (Takahara et ai., 1974; Suzuki et aL, I985a,b; Ensing and Wolfe, 1965, 1966).
Гомологичные Л1 и Л5 ферменты имеют разный спектр микроорганизмов, которые они могут лизировать (таблица 4).
Таким образом, внеклеточные литические ферменты Lysobacter sp. XL1,
отличаясь друг от друга по способности лизировать различные микроорганизмы,
при совместном действии лизируют широкий спектр микробов.
Таблица 4, Сравнение действия эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 на различные живые микроорганизмы
Субстрат Натияный фермент
JIl(AlpA) Л5(А1рВ)
Г'рамотрицательные
бактерии
Atcaligenes faecalis - + +
Е. coli - + +
P. putida - +
Гоамположнтельные
бактерии
Bacilus subtiiis + +
Bacilus cereus + -
Micrococcus roseus - +
Micrococcus luteus + +
Corynebacterium xerosis - -
Brevibacterium flavum - +
Staphylococcus aureus + -
Таблица 4. (Продолжение)
Субстрат Нативный фермент
ЛІ(АІрА) Л5(АІрВ)
Тогиіазрога сіеІЬгиескіі _ _
СапсіШа иМіз + +
С.апсіїсіа ЬоШіпіі + +
Сапсіісіа %иіИіегтогиШ + +
Зассіїаготусез сегеуіїіае - -
Рзешіоіута /и:і/огтаЮ - -
Внеклеточный полисахарид ¿у^оЬаМг зр. Х1Л
ЬузоЬас1ег эр. ХЫ, кроме белков, секретирует в среду роста большое количество высокомолекулярного кислого полисахарида (ММ 300 Ша) Установлена стру!стура полисахарида. Повторяющаяся единица, образующая структуру полисахарида, состоит из 1^-ацетилглюкозамина, Ы-ацетилмануроновой и Ы-ацетилглюкуроновой кислот (рисунок 6).
Большая часть внеклеточных литических ферментов ЬузоЬаМег ер. ХЫ является щелочными белками, и в условиях своей оптимальной активности заряжены положительно.
Рисунок 6.
Структурная
единица
экзополисахарида ЬузоЬаМег Бр.ХЬ 1. Слева направо: Ы-ацетилманнуроновая кислота, Ы-ацетил-глюкуроновая кислота, Ы-ацетилглюкоэамин.
Очевидно, что положительно заряженные белки в среде взаимодействуют с отрицательно заряженным полисахаридом. Это взаимодействие приводит к стабилизации литических ферментов (рисунок 7).
15-, А
0 2 4 6 40
Дни
Рисунок 7. Влияние полисахарида на стабильность литических ферментов. А -мур амид аз а, В - эндопептидаза Л1, С - амидаза Л2, 1 - с полисахаридом, 2- без полисахарида На оси ординат представлена литическая активность ферментов по отношению к автоклавированным клеткам золотистого стафилококка (ЛЕ/мл).
Кроме того, взаимодействие ферментов с полисахаридом изменяет кинетические параметры их активности. Были исследованы реакции расщепления мурамидазой и эндопептидазой Л1 синтетических и природных субстратов без полисахарида и в его присутствии. В качестве синтетических субстратов использовали для мурамидазы 3,4-динитрофенил-тетра-Ы-ацетил-Р-0-хитотетраозид, для эндопептидазы - антраноил-алан ил-алан ил-фенил алан ил-пара-нитроанилид. В качестве природного субстрата использовали клетки золотистого стафилококка. В ходе работы было показано, что взаимодействие ферментов с полисахаридом приводит к увеличению максимальной скорости лизиса клеток стафилококка (рисунок 8 А, В) и ингибированию их активности по отношению к низкомолекулярным синтетическим субстратам (рисунок 8 Б, Г).
1/S, мл/мг
1/S, мМ
В
-60 -40 -20 0 20 40 60 1/S, мл/мг
" 1/S, мкМ'10,2
Рисунок 8. Влияние полисахарида на активность ферментов лизоамидазы. А - мурамидаза, субстрат - клетки S. aureus; Б - мурамидаза, синтетический субстрат; В - эндопептидаза, субстрат - клетки S. aureus; Г - эндопептидаза, синтетический субстрат, о - без полисахарида, • - в присутствии полисахарида.
Следует отметить, что в первом случае в связи с особенностями используемого субстрата активности ферментов и кинетические параметры выражены в условных единицах. Было также исследовано влияние полисахарида Lysobacter sp. XL1 на активность некоторых щелочных ферментов, выделенных из других источников и электростатически взаимодействующих с ним. Оказалось, что полисахарид полностью ингибирует активность лизоцима яичного белка и лизостафина S. staphylolylicus. Ферментный комплекс Streptomyces albus и мурамидазу 5. globisporus полисахарид активировал на 90 и 50% соответственно. Полисахарид не влиял на активность ферментов, которые в условиях своей оптимальной активности с ним не связаны. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что электростатическое взаимодействие ферментов с полисахаридом Lysobacter sp. XL! сопровождается изменением параметров катализируемых ферментами реакций - Кто, Vo. Это изменение может быть как положительным, так и отрицательным и зависит от типов фермента и субстрата. Следовательно, секретируемый Lysobacter sp. XLl во внешнюю среду кислый
полисахарид удерживает, перемещает ферменты продуцента в околоклеточном пространстве и регулирует их активность. Обладая способностью ингибировать некоторые чужеродные бактериолитические ферменты, полисахарид защищает клетку от их воздействия.
Действие лизоамидазы и ее компонентов на различные микроорганизмы
Внеклеточные вещества Lysobacter sp. XL1 являются основой препарата лизоамидаза.Исследовалась способность лизоамидазы разрушать вегетативные клетки бактерий, дрожжей, гифы и споры грибов, бактериальные споры. В частности, лизоамидаза оказалась способна разрушать клетки грамположительных бактерий: S. aureus (79 штаммов), Micrococcus lysodeiklicus, Streplomyces aureus, S. chrysomallus, Streptococcus mutans (2 штамма), Peptostreptococcus intermedius, Corynebacterium flavum, вегетативные клетки, прорастающие и покоящиеся споры Bacillus subtilis (4 штамма), В. cereus, В. anthracis (4 штамма); клетки грамотрицательных бактерий: Fusobacterium necroforum, Prevotella melaninogenica, в сочетании с полимиксином В Pseudomonas aeruginosa (6 штаммов) Salmonella marcescens, Pseudomonas putida, Escherichia coli (3 штамма), в сочетании с гентамицином или амикацином Proteus vulgaris, Р. mirabilis, дрожжи: Saccharomyces cerevisia (3 штамма), Torulaspora delbrueckii (2 штамма), Cryptococcus terreus, Phichia fermentes, Pseudozyma fuziformiata, Candida boidinii, C. azyma, C. catenulata; грибы: Aspergillus terreus, A. japonicus, простейшие -Blastocystis homonis.
Как известно, в состав клеточных стенок грамположительных бактерий наряду с пептидогликаном - основным структурным компонентом, являющимся субстратом бактериолитических ферментов, входят полимеры, придающие клеточной стенке отрицательный заряд. Структура этих полимеров разнообразна (Потехина, 2006). Два основных класса - тейхоевые кислоты (фосфорсодержащие полимеры) и тейхуроновые кислоты (не содержащие фосфор полимеры). Влияют ли компоненты клеточных стенок грамположительных бактерий на гидролиз связей пептидогликана бактериолитическими ферментами? В качестве субстратов отдельных литических ферментов лизоамидазы и полного комплекса были использованы: а) клеточные стенки различных бактерий, содержащих разные пептидогликаны и разные типы тейхоевых и тейхуроновых кислот, б) клеточные стенки, содержащие один тип пептидогликана и разные типы анионных полимеров, в) клеточные стенки В. subtilis W-23 (клетки выращены на бесфосфорной среде и вследствие этого содержат в клеточных стенках
тейхуроновые кислоты вместо тейхоевых), подвергнутые периодатному окислению, которое нарушает структуру тейхуроновых кислот, но сохраняет их заряд и г) чистый пептидогликан клеточных стенок. Литические ферменты с разной скоростью гидролизовали все субстраты, за исключением чистых пептидогликанов. На основании этого был сделан вывод, что для эффективного гидролиза пептидогликанов грамположительных бактерий необходимо электростатическое взаимодействие бактериолитических ферментов лизоамидазы с анионными полимерами клеточной стенки, в частности, с тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами, причем для действия ферментов в первую очередь важен отрицательный заряд полимера, а не его структура. На основании этих данных была предложена гипотетическая схема механизма действия внеклеточного фермент-полисахаридного комплекса ЬуяоЬааег эр. ХЫ на грамположительные бактерии-мишени (рисунок 9).
Комплекс ферментов
Продуцент
Ферменты
и полисахарида
Мишень
Тейхоевая к-та
Пептидогликан
Полисахарид
Рисунок 9. Схема действия фермент-полисахаридного комплекса Іу^оЬасіег зр. ХЫ на грамположительные бактерии-мишени.
Как было отмечено, литические ферменты ¿узоЬас/ег зр, ХЫ - компоненты препарата лизоамидаза - способны гидролизовать пептидогликан грамотрицательных бактерий, выделенный из клетки, однако нативные клетки грамотрицательных бактерий практически не лизировали (за исключением фермента Л5). Оказалось, что липополисахарид, входящий в состав клеточных стенок этих бактерий полностью ингибировал процесс гидролиза пептидогликана бактериолитическими ферментами ЬузоЬасІег зр. ХЫ (таблица 5).
Таблица 5. Действие внеклеточных литических ферментов на компоненты клеточных стенок грамотрицательных бактерий
Субстрат Активность ферментов, JIE/мл
лизоамидаза Л1 Л2 лз
Пептидогликан Е. coli 25,5 7,9 5,8 1.2
Пептидогликан Р. putida 15,2 3,3 1,3 0
Пептидогликан-липополисахаридный комплекс Е. coli 0 0 0 0
Пептидогликан- липополисахаридный комплекс Р. putida 0 0 0 0
Пептидогликан Е. coli + 0 0 0 0
липополисахарид Е. coli
Лизис нативных клеток грамотрицательных микроорганизмов ферментами становился возможным только после изменения проницаемости внешней мембраны клеток-мишеней обработкой полимиксином В или гентамицином.
Спорообразующие бактерии рода Bacillus, в состав которого входят как непатогенные, так и патогенные для человека бактерии, имеют сложный жизненный цикл: вегетативная клетка, предспора, зрелая спора, прорастающая спора. Вследствие особенностей строения внешней оболочки бактериальные эндоспоры практически неуязвимы для внешнего воздействия, что создает ощутимые сложности при разработке эффективных методов борьбы с потенциально-патогенными (В. cereus) и патогенными (В. anthracis) спорообразующими бактериями. Обработка лизоамидазой зрелых спор В. sublilis 168, В. subtilis W 23 и В. cereus 217 приводила к повреждению их оболочки и утрате способности к прорастанию. На рисунке 10 проиллюстрировано действие лизоамидазы на споры В. sublilis W 23. Интересно было выяснить какие именно компоненты лизоамидазы проявляют спороцидные свойства. Оказалось, что только литические ферменты и только в сочетании с полисахаридом Lysobacler sp. XL1 проявляют спороцидное действие по отношению к зрелым спорам бактерий рода Bacillus. Литические ферменты без полисахарида и полисахарид без литических ферментов были неэффективны по отношению к спорам (рисунок 11).
А
Б
Рисунок 10. Атомно-силовая микроскопия спор В. зиЫШз до (А) и после (Б) действия лизоамидазы.
1,5
0.5
□ к вл
□ Л1 □ Л2
■ м □ Л4
ЇІ
ремя прорастания, часы
Время прорастания, часы
□ К
■ Л
□ Л1+Л2+М+Л4
□ Л1+Л2+М+Л4+протеаэа
■ Л1+Л2+М+Л4+ПС
7 9 11
Время прорастания, часы
Рисунок 11. Действие ферментов и полисахарида лизоамидазы на споры бацилл. А - фермент плюс полисахарид; Б - ферменты без полисахарида; В - комбинации ферментов с полисахаридом. К - контроль без обработки, Л - после обработки лизоамидазой; М, - мурамидазой; Л1, Л4 - эндопептидазами, Л2 - амидазой, ПС -полисахаридом.
Внешнемембранные везикулы Lysobacter sp.
Известно, что грамотрицательные бактерии могут образовывать внешнемембранные везикулы, которые содержат компоненты периплазы. Например, внешнемембранные везикулы P. aeruginosa РА01 содержат автолитические ферменты (Beveridge, 1999). Образуют ли клетки Lysobacter sp. внешнемембранные везикулы? И если да, то могут ли внеклеточные литические ферменты выводиться из клетки при помощи везикул? Было проведено электронномикроскопическое исследование клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2. Для этого использовали два варианта условий роста культур на агаризованых средах: 1 - среда, способствующая продукции внеклеточных белков, 2 - среда, при выращивании на которой бактерия не продуцирует внеклеточные белки. Из рисунка 12а видно, что в условиях, способствующих продукции внеклеточных белков (среда 1), в межклеточном пространстве Lysobacter sp. XL1 выявляются крупные везикулы диаметром от 100 до 160 нм. заполненные веществом с низкой электронной плотностью, а также более мелкие, размером 50-60 нм. В этих же условиях, в межклеточном пространстве Lysobacter sp. XL2 присутствуют везикулы диаметром около 50 нм (рисунок 12в). В межклеточном пространстве Lysobacter sp. XL1 и XL2, выращенных на среде 2, наблюдается много мелких везикул диаметром около 20 нм (рисунок 126, 12г).
Рисунок 12. Электронная микроскопия ультратонких срезов колоний клеток ЬузоЬас1ег эр. ХЬ1 (а, б) и ЬузоЬааег зр. Х1:2 (в, г), а, в - клетки выращены в условиях, способствующих продукции внеклеточных белков; б, г - клетки выращены в условиях, подавляющих продукцию внеклеточных белков. В -везикулы. Метка соответствует 200 нм
Таким образом, образование везикул у ЬузоЬааег яр. ХЫ и ХЬ2 наблюдается в разных условиях роста культур и, скорее всего, является естественным физиологическим процессом этой бактерии.
Препараты везикул были получены из культуральной жидкости обоих штаммов Ьу5оЬас1ег Бр., выращенных на среде, способствующей секреции бактериологических ферментов. Как правило, везикулы грамотрицательных бактерий образуются в результате выпячивания и отшнуровывания фрагмента внешней мембраны (Веуепс^е, 1999). Для подтверждения внешнемембранной природы выделенных везикул ¿у!оЬас1ег яр. ХЫ и ХЬ2 определяли в них содержание 2-кето-3-дезокси-0-маннооктоната (КДО), который является специфическим компонентом липополисахарида (ЛПС) внешних мембран. Результаты представлены в таблице 6.
Оказалось, что КДО присутствует в препаратах везикул обоих штаммов. При этом в препарате везикул штамма ХЬ2 содержится в два раза меньше КДО, чем в препарате везикул штамма ХЫ, хотя количество КДО в препаратах внешних мембран обоих штаммов практически не отличается. Поскольку везикулы и внешние мембраны ХЫ и ХЬ2 были получены из одинакового количества клеток, содержание КДО в препаратах указывает на то, что штамм ХЬ2 образует везикулы в меньшем количестве, чем штамм ХЬ1. Разница в размерах и количестве везикул обоих штаммов может быть связана с их участием в выводе части секретируемых белков во внеклеточное пространство.
Можно предположить, что больший размер везикул ЬуяоЬааег эр. ХЬ связан с присутствием в них большего количества белка. Из таблицы 6 видно, что действительно, в препарате везикул ¿угойас/ег эр ХЬ2 концентрация белка составила лишь 0,02 мг/мл, в то время как в препарате везикул ЬузоЬас1ег эр. ХЫ - 1,2 мг/мл. Концентрация белка в препаратах внешних мембран обоих штаммов не отличалась.
Таблица 6. Содержание КДО и белка во внешних мембранах и везикулах
Образец ЬухоЬас1ег ер. Х1Л ЬузоЬааег эр. ХЬ2
Белок, мг/мл КДО, мМ/мл Белок, мг/мл КДО, мМ/мл
Везикулы 1,20 0,35 0,02 0,16
Внешние мембраны 44,30 5,50 45,00 7,00
Было также проведено сравнение белкового состава везикул с белковым составом внешних мембран (рисунок 13).
кДа
94,6 -94^Да
66,2 Q ~ : , ЩЩ
к-* — -54 кДа
45,0 Щ
* * ■■ «-38 кДа
31,0 mm
21,5 вт *ттт +-23 кДа
М 1 2 3 4
При сравнении обнаружили, что внешние мембраны Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2 практически не отличаются по составу мажорных белков (94, 54, 38 и 23 кДа), но имеют незначительные различия по соотношению минорных (образцы 3 и 4). В препаратах везикул обоих штаммов наблюдаются мажорные белки с ММ около 94 и 38 кДа и минорные белки, совпадающие по элекгрофоретической подвижности с белками внешних мембран (образцы 1 и 2). Это также может служить подтверждением внешнемембранной природы везикул Но вместе с тем в везикулах Lysobacter sp. XL1 присутствуют белки с ММ 67 и 41 кДа, а в везикулах Lysobacter sp. XL2 белок с ММ 33 кДа, которые не выявлены во внешних мембранах. Неполная идентичность белкового состава внешних мембран и везикул может указывать на локусную природу образования последних, т.е. образование везикул может осуществляться на определенных участках клеточной поверхности. Подобное предположение ранее было высказано рядом авторов на основании обнаруженных ими различий в структуре ЛПС везикул и внешних мембран P. aeruginosa PAOl (Li et ah, 1996; Kadurugamuwa, Beveridge, 1996). В препарате везикул Lysobacter sp. была обнаружена активность циклической фосфодиэстеразы - маркера на периплазматические белки, но не найдена активность глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы - маркера на цитозольные белки. Таким образом, можно утверждать, что везикулы Lysobacter sp. XL I и XL2 имеют внешнемембранную природу и в процессе своего образования захватывают компоненты периплазмы.
Рисунок 13. Сравнительная характеристика белкового состава везикул и внешних мембран Lysobacter 5р. М - маркеры, 1 - везикулы Lysobacter зр. XL1, 2 - везикулы Lysobacter эр. Х1.2, 3 - белки внешних мембран іуяаЬасІег Бр. ХЬ1, 4 - белки внешних мембран Lysobacter Бр. XL2.
Литическая активность везикул
Литическую активность везикул определяли на чашках с вплавленными в агарозный гель автоклавированными клетками S. aureus 209Р. Как видно из рисунка 14, зоны лизиса образуются как вокруг препаратов везикул Lysobacter sp. XL1, так и вокруг препаратов везикул Lysobacter sp. XL2, Это указывает на присутствие в везикулах бактериолитических ферментов. Известно, что автолитические системы обоих штаммов Lysobacter sp. являются идентичными (Ситкин и др., 2003а, 20036). Если бы активность везикул определялась присутствием в них только автолитических ферментов, то и активность везикул XL1 и XL2, вероятно, была бы одинаковой. Однако активность везикул Lysobacter sp. XL1 значительно выше, что позволяет предположить присутствие в них более активных внеклеточных бактериолитических ферментов.
Lysobacter sp. XL 1
1 2
Lysobacter sp. XL2
t <8
Рисунок 14. Бактериолитический эффект культуральной жидкости и везикул Lysobacter sp. XL1 и XL2 на чашках с вплавленными в агарозный гель автоклавированными клетками 5. aureus 209Р. 1 - культуральная жидкость, 2 - везикулы. Для Lysobacter sp. XL1 время инкубации составило 1 сутки, для Lysobacter sp. XL2 - 4 суток. В каждую лунку вносили по 10 мкл образца.
ЬузоЬааег 5р. ХЫ и ХЬ2 секретируют бактериологические ферменты с разной субстратной специфичностью, что можно было использовать для выявления конкретных ферментов в везикулах. Амидаза Л2 и мурамидаза ЛЗ секретируются обоими штаммами ¿увоЬас/ег эр. и проявляют свою активность при использовании синтетических субстратов. Известно также, что в периплазме клеток обоих штаммов Lysobacter эр. присутствует автолитический фермент мурамидаза, который может попадать в везикулы в процессе их образования (Ситкин и др., 2003а, б). Поэтому бактериолитическая активность везикул Lysobacter 5р. XL2 может быть ассоциирована только с двумя внеклеточными бактериолитическими ферментами - амидазой Л2 и мурамидаэой ЛЗ, а также с автолитической мур амидазой В препарате везикул штамма ХЬ2 выявлена активность, характерная для амидаэы Л2. Мурамидазная активность в препарате везикул не была обнаружена. Эти результаты позволили сделать вывод о том, что
внеклеточная амидаза Л2 Lysobacter sp. XL2 выводится за пределы клетки посредством везикул. Бактериологическая активность везикул Lysobacter sp. XL1 может быть обусловлена пятью бактериолитическими ферментами. В препарате везикул этого штамма также была обнаружена активность амидазы Л2, а мурамидазная активность не выявлена. Следовательно, внеклеточная амидаза Л2 у Lysobacter sp. XL1 также секретируется в культуральную среду при помощи везикул. Помимо амидазы Л2 и мурамидазы ЛЗ Lysobacter sp. XL1 секретирует в окружающую среду еще Л1, Л4 и Л5 бактериолитические ферменты. К бактериологическим протеазам Л1 и Л5 получены поликлональные кроличьи антитела, с помощью которых можно было установить присутствуют ли эти ферменты в везикулах Lysobacter sp. XL1.
Был проведен иммуноферментный анализ белков культуральной жидкости до и после осаждения везикул и самих везикул с антителами к Л1 и Л5 белкам. Электрофореграмма белков культуральной жидкости до и после осаждения везикул не демонстрирует каких-либо изменений в содержании Л1 и Л5 ферментов (рисунок 15а). Однако иммуноферментный анализ с использованием антител к Л5 ферменту (риунок 156) показал, что после осаждения из культуральной жидкости везикул, содержание в ней фермента Л5 сильно уменьшается. Вместе с этим, фермент достоверно выявлялся в везикулах. Это указывало на то, что подавляющее количество эндопептидазы Л5 присутствует в культуральной жидкости внутри везикул. Небольшое количество фермента попадает в культуральную жидкость при их разрушении. Иммуноблотгинг с использованием антител к бактериолитическому ферменту Л1 (рисунок 15в) показал, что его содержание в культуральной жидкости после осаждения везикул не изменялось, и в везикулах этот фермент не обнаруживался.
Выше было отмечено, что Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 синтезируются в виде препробелков. Наличие сигнальной последовательности на N-конце (пре-часть синтезированной полипептидной цепи) позволяло предположить, что эти белки транспонируются через цитоплазматическую мембрану в периплазму посредством See экспортного механизма. Многие принципы этого процесса в настоящее время уже установлены для Е. coli, у которой выявлены и охарактеризованы белковые компоненты секреторного аппарата. В частности, хорошо изучена транслокационная АТФаза SecA - важный компонент цитоппазматической стадии секреции. Для обнаружения в клетках Lysobacter sp. XL1 SecA белка был проведен иммуноферментный анализ клеточных белков этой бактерии с антителами к SecA
E. coli- Было выявлено наличие в клетках Lysobacter sp. XL1 белка, имеющего такую же электрофоретическую подвижность, как и белок SecA Е. coli. Основываясь на полученных результатах, можно утверждать, что Lysobacter sp XL1 имеет See экспортный механизм транслокации белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму.
кДа 94.6 66.2 45.0
31.0 Б В
< Л5„ ы
21.5 ЗЕВЙНЮ <ЛЦ ^
М 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Рисунок 15. Электрофорез и иммуноферментный анализ везикул ¿узоЬасІег зр. ХЫ. А - электрофорез белков культуральной жидкости и везикул; Б -иммуноблотгинг с антителами к Л5 бакгериолитическому ферменту; В -нммуноблотгинг с антителами к Л1 бактернолитическому ферменту. 1 -культуральная жидкость до осаждения везикул; 2 - культуральная жидкость после осаждения везикул, 3 - везикулы. Образцы культуральной жидкости содержали 0,5 мг суммарного белка, везикулы - 0,05 мг суммарного белка.
По совокупности полученных данных предложена схема секреции бактериолитических ферментов Л1 и Л5 Іу^оЬасІег їр. ХЫ из цитозоля бактерии в окружающую среду (рисунок 16).
Бактериолитические ферменты Л1 и Л5 синтезируются в виде препробелков и транслоцируются через цитоплазматическую мембрану в периплазму, используя, скорее всего, Зес экспортный механизм.
Цитомлъ ¿уюЬкт Ч> X11
ЗИ»о 391 во.
Рисунок 16. Механизм секреции бактериолитических ферментов Л1 и Л5 ЬухоЬаМег «тр. ХЫ из цитозоля бактерии в окружающую среду. ВМ - внешняя мембрана; ЦМ - цитоплазматическая мембрана; ПГ - пептидогликан; МВ -мембранные везикулы; препроЛІ и препроЛ5 - предшественники Л1 и Л5 ферментов.
После отщепления сигнального пептида остается пробелок. Для а-литической протеазы Ь. enzymogenes, которая является гомологом Л1 и Л5 ферментов, показано, что в периплазме происходит сворачивание пробелка в практически нативную конформацию, способствующую транслокации через внешнюю мембрану, предположительно, посредством второго (II) типа секреции через специализированную пору. После или во время транслокации происходит автокаталитическое отщепление про-части, сопровождающееся появлением зрелого фермента (Бііеп, \gaid, 1989). Возможно таким же образом происходит созревание и секреция фермента Л1. Поскольку зрелый Л5 фермент обнаружен в везикулах, можно предположить, что предшественник этого белка уже в периплазме превращается в зрелый фермент и захватывается везикулами в процессе их образования.
Получены новые, ранее не известные данные о том, что внеклеточные бактериолитические ферменты Л2 и Л5 ЬузоЬас/ег эр. ХЫ и ХЬ2 попадают в окружающую среду при участии везикул.
Биологическая роль везикулярного способа секреции бактериолитических ферментов
Установлено, что везикулы Lysobacter sp. XL1 лизируют живые клетки практически всех выбранных тест-культур (лабораторные штаммы) за исключением Torulaspora delbrueckü ВКМ Y-706, S. cerevisiae М660 и Sclerotinium sclerotiorum Результаты представлены на рисунке 17 и в таблице 7
Stuphylococcus aureus Bacilus cereus Escherichin coli
Candida boidinü Pseudozyma fusiformnta Fusarium sporotrichiella
Рисунок 17. Литическое действие везикул Lysobacter sp. XL1 на некоторые виды выбранных тест-культур. Прозрачное пятно в центре каждой фотографии - место нанесения везикул, где образовалась зона лизиса.
Кроме того, везикулы эффективно лизировали клинические изоляты множественно устойчивых к антибиотикам грамотрицательных и грам-положительных бактерий (Serratia marcescens 570, В. subtilis var niger, В. cereus 504, В. cereus 164, В megaterium 1433, В. thuringiensis 1373, В. thuringiensis EG 7566, В mesentericus, В. brevis 1409, В polymyxa 1396, В. anthracis М71, В. anthracis ST1, В. anthracis STI PR, В anthracis STI pBC16, B. anthracis STf 5, Listeria monocytogenes L, L. monocytogenes R), а также клинические изоляты метициллинустойчивых 5. aureus (MRSA) - S. aureus 54, 5. aureus 78, S. aureus 175, S. aureus 227, S. aureus 246, S. aureus 53, 5е. aureus 136, S. aureus 159, S. aureus 245, S. aureus 261, S. aureus 53
Исходя из полученных данных предложена схема действия везикул на клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий (рисунок 18). В случае действия на грамположительные бактерии, в месте прикрепления везикулы к клеточной стенке клетки-мишени нарушается ее целостность, что способствует выходу и связыванию литических ферментов с пептидогликаном. Место прикрепления везикулы, вероятно, является местом концентрированного действия литических ферментов. Можно предположить также, что само везикулярное окружение остается связанным с пептидогликаном и таким образом защищает свое литическое содержимое от внешнего воздействия.
Таблица 7. Логическое действие везикул Lysobacter sp. XL1 на живые клетки
Микроорганизмы Действие
везикул
Грамположительные бактерии
В. subtilis 168 ++
Bacillus subtilis W23 ++
Bacillus cereus 217 ++
Micrococcus roseus В1236 ++
Micrococcus luteus В1819 ++
Corynebacterium xerosis ++
Staphylococcus aureus 209P ++
Rathayibacter tritici ++
Грамотрицательные бактерии
Pseudomonasfluorescein 1472 +
Pseudomonas putida +
Proteus vulgaris H-19 +
Proteus mirabilis N2 +
Escherichia coli Kl2 ++
Envinia carotovora В15 ++
Alcaligenes faecalis ++
Дрожжи
Torulaspora delbrueckii BKM Y-706 -
Candida utilis BKM Y-74 +
Candida boidinii BKM Y-34 +
Candida guilliermondii BKM Y-41 +
Saccharomyces cerevisiae M660 _
Pseudoiyma fusiformata BKM Y-2821 +
Мицелиальные грибы
Sclerotinium sclerotiorum
Fusarium sporotrichiella -H-
«—» нет литического эффекта; «+» есть литический эффект; «++" очень хороший литический эффект.
Иначе происходит действие везикул на клетки грамотрицательных бактерий. Это связано с наличием внешней мембраны на поверхности их клеточной оболочки, которая препятствует доступу литических ферментов к субстрату - пептидогликану.
Рисунок 18. Схема действия везикул на клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Л1, Л5 - литические ферменты; МВ - мембранные везикулы.
Действие везикул на грамотрицательные бактерии может происходить за счет слияния мембран клеток-мишеней с везикулярной мембраной. В результате этого слияния бактериолитические ферменты везикул высвобождаются в периплазматическое пространство клетки-мишени, где находится их субстрат -пептидогликан. После попадания в периплазму клетки-мишени литические ферменты везикул разбавляются там и концентрированного действия, как в случае грамположительных микроорганизмов, не происходит. Литическое действие везикул на клетки грибов и дрожжей объясняется тем, что литические протеазы Л2 и Л5 разрушают структурные белки, входящие в состав клеточных стенок этих микроорганизмов. Везикулы ЬуїоЬасіег $р. ХІЛ имеют более широкий спектр литического действия, чем гомогенный фермент Л5 (таблицы 1, 7), а также намного эффективнее лизируют живые клетки различных микроорганизмов. Вклад фермента Л2 в литическое действие везикул 1у.юЬас1ег кр. Х1Л, по-видимому, незначительный.
Получение рекомбинантных эндопептидаз Lysobacter sp. XL1.
Гомологичные сериновые протеазы Л1 (AlpA) и Л5 (AlpB) имеют разную N-концевую последовательность аминокислот, разный способ секреции из клетки продуцента, разный спектр действия на живые клетки микроорганизмов (таблица 4). Следовательно, на основе этих ферментов, используя их отдельно, или комбинируя друг с другом, или с антибиотиками, можно получать лекарственные препараты с нужной специфичностью. Это определяло перспективность работы по получению рекомбинантных эндопептидаз Л1 и Л5.
В качестве бактерии-реципиента на первом этапе была выбрана Е coli. В ходе работы выявили, что клетки Е. coli не способны секретировать образующиеся рекомбинантные литические эндопептидазы, а образование даже небольшого количества зрелого белка приводило к гибели клеток вследствие лизиса.
Поэтому был разработан способ получения зрелых эндопептидаз рефолдингом из телец включения. Поскольку этот метод оказался весьма трудозатратным, в дальнейшем в качестве бактерии-реципиента выбрали почвенные псевдомонады, близкие по ряду свойств Lysobacter. Ни один из потенциальных штаммов-реципиентов не секретировал во внешнюю среду бактериологические ферменты. Чувствительность или устойчивость к различным антибиотикам явились критерием выбора дня дальнейшей работы Р. ßuorescens Q2-87. Была сконструирована система экспрессии: ген литической протеазы Л1 или Л5 под контролем промотора Т71ас и ген белка репрессора лактозного оперона были встроены в хромосому штамма-хозяина. Источником Т7 РНК-полимеразы служит плазмида, в которой ген этого фермента находится под контролем /ас-промотора. На твердой индикаторной среде с вплавленными клетками стафилококка было показано, что рекомбинантные штаммы псевдомонад экспрессируют гены alpA и alpB. Это проявлялось в образовании зон лизиса вокруг выросших клеток Pseudomonas. При выращивании рекомбинантных штаммов на жидких средах разного состава в культуральных жидкостях при помощи антител было выявлено присутствие искомых белков. Максимальное количество накапливалось к 48 часам на средах LB и среде, специально разработанной для выращивания Lysobacter sp. XL1. Последняя была выбрана для выращивания рекомбинантных штаммов в условиях ферментации, так как адаптирована для этого. На рисунке 19 показано, что Р. ßuorescens Q2-87 с геном alpB к 18 часам роста имеет максимальную плотность культуры и логическую
активность культуральной жидкости, которые при дальнейшем культивировании мало изменяются.
10 20 30 40 Время роста, ч
1ІПТГ
12 18 24 30 36 42 48 54 Время роста, ч
К 8 11 14 17 20 23 26 29 32А1рА
Рисунок 19. Динамика экспрессии рекомбинантных А1рА и А1рВ в условиях культивирования рекомбинантных штаммов Р.]]иоге$сет (22-87 в ферментере. А - экспрессия А1рВ (динамика роста, активности и иммуноблоттинг), Б -экспрессия А1рА (динамика роста, активности и иммуноблоттинг), ♦ - рост культуры, ■ - активность, К - культуральная жидкость РЦхюгезсет <32-87, не содержащего генов литических ферментов ЬухоЬааег зр. ХЫ, А1рА и А1рВ -нативные ферменты, нанесенные на гель в качестве маркеров.
Это подтвердили данные иммуноблоттинга. Другую картину наблюдали при культивировании Р. Аиогезсет 02-87 с геном а/рА. Также к 18 часам оптическая плотность и активность достигали максимума, затем культура лизировалась и активность уменьшалась. Это сопровождалось уменьшением содержания белка А1рА в культуральной жидкости, что, возможно, связано с протеолизом или автолизом. Рекомбинантные белки А1рА (Л1) и А1рВ (Л5) были очищены в 1 стадию ионообменной хроматографией (топоЗ). Выход белков составил около 1 мг/л культуры, что достаточно хорошо для таких потенциально смертельных для микробной клетки ферментов. Свойства рекомбинантных белков оказались аналогичны свойствам нативных. Таким образом, разработана система получения рекомбинантных литических эндопептидаз ЬухоЬааег 5р. ХЫ, которые могут явиться основой новых антимикробных препаратов.
Лечеиие модельной сибирской язвы внеклеточными продуктами ЬуйоЬааег5р. Х1Л.
На основании вышеизложенных материалов можно было предположить, что лизоамидаза, гомогенные литические ферменты (нативные и рекомбинантные), везикулы могут быть использованы для лечения сибиреязвенной инфекции как препараты, вводимые внутрь организма. Для лечения и профилактики модельной сибиреязвенной инфекции были использованы препарат лизоамидаза, нативные и рекомбинантные ферменты Л1 (А1рА) и Л5 (А1рВ), внешнемембранные везикулы, содержащие литический фермент А1рВ и литическую протеазу Л2. Работа проводилась в Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск).
Были получены следующие результаты:
• лизоамидаза оказывала лечебный эффект по отношению к экспериментальной генерализованной сибиреязвенной инфекции, вызванной у беспородных белых мышей введением спор В. аткгас18 71/12 (II вакцины Ценковского) - 100% выживаемость зараженных животных при подкожном введении лизоамидазы в концентрации I мг/мышь. В контрольной группе животных выживаемость - 0%;
• при лечении лизоамидазой легочной формы сибирской язвы, вызванной спорами В. атИгаш 71/12, лечебный эффект отмечали при подкожном введении препарата (выживаемость - 60%);
• лечение лизоамидазой мышей, зараженных спорами В. ашкгааз 71/12 внутрибрюшинно, пршюднло к 90% н 100% выживаемости животных в случае иведеиня препарата внутрибрюшинно и подкожно соответственно.
• лизоамидаэа оказывала лечебный эффект (90% выживаемости) по отношению к сибиреязвенной инфекции, вызванной вегетативными клетками В. тиЬгасм СТИ-1;
• применение лизоамидазы для лечения мышей, зараженных штаммом В. апФгаск СТИ-ПРТС (устойчивый к рифампицину, ампициллину, тетрациклину, докенциклину) демонстрировало 100%-ную выживаемость животных при заражающей дозе 105 и 10(' спор;
• применение лизоамидазы для лечения золотистых хомяков, зараженных вирулентным штаммом В. аш/иаах 4-7 в дозе 100 ЛД511, приводило к 100% -ной выживаемости в случае введения препарата (5мг/хомяка) в ту же лапу, в которую проводили заражение, и к 60%-ной выживаемости, если препарат вводили в другую конечность;
• показано, что рекомбинантный и нативный литический фермент А1рА оказывает лечебное действие лишь на 20-40% опытных животных, зараженных спорами или вегетативными клетками В. ашИгас/зИ/И (II вакцина Ценковского);
• рекомбинантный и нативный литический фермент А1рВ не обладает лечебным эффектом, профилактическую защиту в 80% случаев оказывает препарат А1рВ, введенный мышам за 72 часа до заражения, в концентрации 5 мг на мышь, более низкие концентрации препарата не обладают профилактическим действием;
• везикулы успешно лечат генерализованную инфекцию у мышей (100%-ная выживаемость), вызванную спорами В. ашИгасм 71/12 и антибиотикорезистентного штамма - В. ап/Ьгас^ СТИ-Тс при однократном введении, а доксициклин даже при 5-дневном применении оказался не эффективным: после его отмены начиналась гибель животных с 7 по 10 день.
Таким образом, отдельные логические ферменты лизоамидазы А1рА и А1рВ, находящиеся в растворимом состоянии, демонстрируют низкое лечебное и профилактическое действие в отношении модельной сибиреязвенной инфекции, в отличие от препарата лизоамидаза и везикул, в которые «упакован» фермент А1рВ, оказывающих 100%-пую защиту опытных животных в случае лечения и профилактики сибиреязвенной болезни.
выводы
1. Бактерия-продуцент препарата лизоамидаза, штамм XLI, отнесена к роду Lysobacter, семейства X'anthomonadaceae. При длительном выращивании литически высокоактивного штамма Lysobacter sp. XL1 на средах, способствующих секреции внеклеточных продуктов, в популяции возникают II накапливаются за счет более высокой скорости роста клетки литически низкоактивного штамма Lysobacter sp. XL2. Оба штамма Lysobacter sp. при любых условиях роста образуют внешнемембранные везикулы.
2. Впервые показано, что внутриклеточная и внеклеточная литические системы бактерии Lysobacter sp. (XLI, XL2) функционируют независимо. Свойства литических ферментов - компонентов этих систем - значительно отличаются друг от друга: внутриклеточные ферменты являются кислыми белками, активными при 29°С, высоком значении ионной силы среды и щелочном значении pH; внеклеточные ферменты - щелочные белки, активные при низких значениях ионной силы, щелочном pH и высоких температурах (50°-80°С). В составе внеклеточной литической системы Lysobacter sp. XLI обнаружено пять ферментов: мурамидаза, амидаза, три эндопептидазы, в составе литической системы Lysobacter sp. XL2 -амидаза и мурамидаза. В составе внутриклеточной литической системы Lysobacter sp. выявлено девять пептидоглнкангидролаз разной субстратной специфичности и локализации в клетках бактерии.
3. Впервые обнаружено, что постсекреторное электростатическое взаимодействие высокомолекулярного кислого полисахарида и ферментов Lysobacter sp. XLI приводит к значительной стабилизации ферментов и в ряде случаев к изменению их активности. В частности полисахарид усиливает действие мурамидазы на клетки золотистого стафилококка, а литические ферменты, связанные с полисахаридом, становятся способными разрушать покоящиеся споры бактерий рода Bacillus. Полисахарид Lysobacter sp. XLI полностью ингибирует активность ряда литических ферментов других микроорганизмов.
4. Впервые показано, что бактерия Lysobacter sp. транспортирует литические ферменты, разрушающие клетки микробов-конкурентов, в окружающее клетку пространство внутри внешнемембранных везикул. Везикулы, содержащие такие ферменты, способны лизировать живые клетки представителей различных групп микроорганизмов, например, грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas, Proteus, Envinia, Alcaligenes, грамположительных бактерий,
относящихся к родам Bacillus, Micrococcus, Stapliylococcus, Rolhayibacler. дрожжей рода Candida, мицелиального гриба Sclerotinia sclerotiorum в отличие от литических ферментов, находящихся вне везикул. Следовательно, такой способ секреции литических ферментов имеет для продуцента важное биологическое значение, расширяя спектр микроорганизмов, с которыми он может конкурировать в природе.
5. Установлены особенности взаимодействия литических ферментов Lysobacter sp. с нативными клетками-мишенями. Для эффективного гидролиза клеток грамположитсльных бактерий ферментам необходим предварительный контакт с отрицательно заряженным полимером клеточной стенки (тейхоевыми или тейхуроповыми кислотами), химическая структура этих полимеров не имеет решающего значения. Липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий иигибирует активность литических ферментов. Нативные клетки грамотрицательных бактерий ферменты Л1-Л4 разрушают только при условии предварительной дестабилизации внешней мембраны клетки тем или иным способом (температура, полимиксин В, гентамицин, амикации). Эндопептидаза Л5 способна лизировать нативные клетки ряда грамотрицательных бактерий без предварительной обработки внешней мембраны.
6. Установлена структура генов двух литических эндопегттидаз Lysobacter sp. XLI - Л1 (AlpA) и Л5 (AlpB); показано, что белки синтезируются как препроферменты, пре- части состоят из 33 и 28 а.о., про- части - из 166 а.о., зрелые ферменты - из 199 и 205 а.о. соответственно. Получены и охарактеризованы рекомбинантные AlpA и AlpB.
7. Показана возможность использования лиэоамидазы и внешнемембранных везикул Lysobacter sp. XLI для лечения и профилактики сибиреязвенной инфекции.
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Обзор
Степная O.A., Ледова Л.А., Кулаев И.С. Баюериолитические ферменты. Успехи биологической химии, 1999, с. 327-354.
Экспериментальные статьи
1. Степная O.A., Северин А.И., Кулаев И.С. Некоторые физико-химические свойства литической протеазы Л2 ферментного препарата лизоамидаза, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1986, том 51, вып.6, с. 909-915.
2. Степная O.A., Северин А.И., Круглая О.В., Кулаев И.С. Ответственные за бактериолитическую активность компоненты препарата лизоамидаза, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия, 1989, том 54, вып. 2, с. 201-205.
3. Степная O.A., Кудрявцева А.И., Северин А.И., Крупянко В.И., Козловский
A.Г., Кулаев И.С. Ферменты бактериологического препарата лизоамидаза. Некоторые свойства бактериолитической протеиназы Л2. Прикладная биохимия и микробиология, 1992, том 28, вып. 5, с. 666-673.
4. Степная O.A., Ледова Л.А., Кулаев И.С. Бактериолитический комплекс лизоамидаза. Определение природы взаимодействия ферментов и полисахарида, входящих в состав комплекса. Биохимия, 1993, том 58, вып. 10, с. 1523-1528.
5. Чумак Н.Е., Степная O.A., Черменская Т.С., Несмеянова М.А., Кулаев И.С. Особенности секреции бактериолитических ферментов и полисахарида у бактерии семейства Pseudomonadaceae. Микробиология. 1995, том 64, вып.1, с. 55-62.
6. Лихошерстов Л.М., Сенченкова С.Н., Книрель Ю.А., Шашков A.C., Шибаев
B.Н., Степная O.A., Кулаев И.С. Структура кислого полисахарида, входящего в состав бактериолитического комплекса лизоамидаза. Биохимия, 1995, том 60, вып. 3, с. 617-624.
7. Likhosherstov L.M., Senchenkova S N., Knirel Yu.A., Shashkov A.S., Shibaev V.N., Stepnaya O.A., Kulaev I S. Structure of an acidic polysaccharide present in the bacteriolytic complex lysoamidase. FEBS Letters, 1995, v. 368, 1 13-116.
8. Кулаев И.С., Наумова И.Б., Стрешинская Г.М., Тульская Е.М., Степная O.A.,
С'енернп А.И.. Бегунова E.A. Лмтнческое действие лизоамидазы из Xanthomonas sp. коррелирует с присутствием в клеточной стенке грам-положнтельных бактерий-мишеней рибиттейхоевых кислот. Микробиология, 1996, том 65, №3, с. 326-332.
9. Степная O.A., Цфасман И М., Ледова Л.А., Петрикевич С.Б., Бегунова Е.А., Куласв И.С. Сравнение состава комплекса бактериолитических ферментов бактерии Xanthomonas sp. - продуцента бактериолитического ферментного препарата лизоамидаза и ее малоактивной (|юрмы. Микробиология. 1996, том 65, № 3, с. 339-344.
10. Степпая O.A., Бегунова Е.А., Цфасман ИМ., Кулаев И.С. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза: выделение и некоторые физико-химические свойства внеклеточной мурамидазы бактерии Xanthomonas sp. Биохимия, 1996, том 61, вып. 4, с. 648-655.
11. Степная O.A., Бегунова Е.А., Цфасман ИМ., Кулаев И.С. Бактериолитическнй ферментный препарат лизоамидаза: очистка и некоторые свойства бактериолитической пептидазы Л1. Биохимия, 1996, том 61, вып. 4, с. 656-663.
12. Цфасман И М., Степная O.A., Бажанова H B., Кулаев И.С. Внутриклеточная глюкозаминидаза бактерии Xanthomonas campestris ИБФМ В-124: очистка и некоторые свойства. Биохимия, 2000, том 65, вып. 9, с. 57-62.
13. Степпая O.A., Рязанова Л.П., Крупянко В.И., Кулаев И.С. Влияние кислого экзополисахарида Xanthomonas campestris ИБФМ В-124 на кинетические параметры внеклеточных бактериолитических ферментов. Биохимия, 2001, том 66, вып. 6, с. 816-821.
14. Ситкин Б.В., Цфасман И М., Степная O.A., Кулаев И.С. Внутриклеточные пептидогликангидролазы бактерии Xanthomonas campestris XL I. Биохимия, 2003, том 68, вып. 4, с. 562-569.
15. Ситкин Б.В., Лысанская В.Я., Цфасман ИМ., Степная O.A., Кулаев И.С. Структура пептидогликана бактерии Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов. Микробиология, 2003, том 72, № 1, с. 136137.
16. Бегунова Е.А., Степная O.A., Лысанская В.Я., Кулаев И.С. Специфичность действия ферментов препарата лизоамидазы на клеточные стенки Staphylococcus aureus 209 Р. Биохимия, 2003, том 68, вып. 7, с. 896-901.
17. Ситкин Б.В., Цфасман И М., Степная O.A., член-корреспондент РАН Кулаев
И.С. Могут ли автолизины бактерий являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов? Доклады Академии наук, 2003, том 392, № 3, с. 406-409.
18. Муранова Т.А., Красовская Л. А., Цфасман И М., Степная O.A., Кулаев И.С. Структурные исследования и идентификация внеклеточной бактериолитической эндопептидазы Л1 Lysobacter sp. XL 1. Биохимия. 2004, том 69, вып. 5, с. 617-622.
19. Степная О. А., Бегунова Е. А.,. Цфасман И. М., Тульская Е. М., Стрешннская Г. М., Наумова И.Б., Кулаев И.С. Роль анионных полимеров клеточных стенок грамположительных бактерий-мишеней в механизме действия па них внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp. Микробиология. 2004, том 73, № 4, с. 479-485.
20. Бегунова Е.А., Степная O.A., Цфасман И.М., Кулаев И.С. Действие внеклеточных бактериолитических ферментов Lysobacter sp. па грамотрицательные бактерии. Микробиология, 2004, том 73, № 3, с. 320-325.
21. Степная O.A., Цфасман И М., Логвина И.А., Рязанова Л.П., Муранова Т А., Кулаев И.С. Выделение и характеристика новой внеклеточной бактериолитической эндопептидазы Lysobacter sp. XLI. Биохимия, 2005, том 70, вып. 9, стр. 1250-1257.
22. Рязанова Л.П., Ледова Л.А., Цурикова Н.В., Степная O.A., Синнцнн А.П., Кулаев И.С. Воздействие протеолитических ферментов Bacillus licheniformis и лизоамидаэы Lysobacter sp. XL I на клетки Proteus vulgaris и Proteus mirabilis. Прикладная биохимия и микробиология, 2005, том 41, № 5, стр. 558-563.
23. Ryazanova L P., Stepnaya O.A., Suzina N E., Kulaev I S. EtTect of lysoainidase preparation on yeast and mycelial fiingi. Process Biochemistry, 2005, v. 40, № 2, p. 557-564.
24. Бегунова E. А., Чайка И.А., Степная O.A., Сафиева Д.О., Будашов И.А., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д., Кулаев И.С. Изучение действия лизоамидазы на споровую форму бактерий рода Bacillus. Доклады Академии наук, 2006, том 408, № 4, с. 550-552.
25. Цфасман И.М., Ситкин Б.В., Лысанская В.Я., Степная O.A., Кулаев И.С. Субстратная специфичность и некоторые физико-химические свойства автолитических ферментов бактерии Lysobacter sp. XL1. Биохимия, 2007, том 72, вып. 7, с. 760-765.
26. Степная O.A., Цфасман U.M., Чайка И.А., Муранова Т А., Кулаев И.С.,
Внеклеточный дрожжелнтическпй фермент бактерии Lysobacter sp.XLI. Биохимия, 2008, том 73, вып. 3, с. 381-387.
27. Vusilyeva N.V., Tsfasman I.M., Suzina N.E., Slepnaya O A. and I. S. Kulaev Secretion of bacteriolytic endopeptidase L5 of Lysobacter sp. XL1 into the medium by means ofouler membrane vesicles. FEBS Journal, 2008, v. 275, p. 3827-3835.
28. Зырина H В , Ильясов П.В., Кувичкина Т.Н., Степная О.А., Решетилов А Н. Оценка эффективности литического действия пептндогликангидролаз на основе дыхательной активности клеток тест-культуры. Вестник био технологии, 2008, том 46, № 2, с. 5-11.
29. Васильева Н.В., Цфасман И М., Сузина Н Е., Степная О.А., Кулаев И.С. Внешнемембранные везикулы Lysobacter sp. Доклады Академии наук, 2009, том 426, № 2, с. 257-260.
30. Mikoulinskaia G.V., Odinokova I.V., Zimin A.A., Lysanskaya V.Ya., Feofanov S.A., Stepnaya O A. Identification and characterization of the metal ion-dependent L-alanoyl-D-glulamate peptidase encoded by bacteriophage T5. FEBS Journal, 2009, v. 276, N 24, p. 7329-7342.
31. Красовская Л.А., Руденко И.В., Аббасова С. Г., Шувалова О.П., Видягина Е.О., Сухаричева НА., Ледова Л.А., Степная О.А., Кулаев И.С. Моноклоиальные антитела к пропептиду эндопептидазы AlpB Lysobacter sp. XL I для изучения AlpB-белковых взаимодействий в клетках бактерии. Доклады Академии наук, 2011, №6, т.441, №, с.841-844.
Патенты
1. Патент РФ № 2139348, 1999, Степная О.А., Ледова Л.А., Кулаев И.С., Прудникова О.В. Средство для лизиса клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий.
2. Патент РФ № 2193063, 2002, Кулаев И.С., Степная О.А., Цфасман И.М., Черменская Т.С., Акименко В.К., Ледова Л.А., Зубрицкая Л.Г. Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа.
3. Патент США № 7,150,985 В2, 2006, Kulaev I S., Stepnaya O A., Tsfasman I.M., Chermenskaya T.S., Akimenko V.K., Ledova L.A., Zubrilskaya L.G. Bacteriolytic complex, method for producing said complex and strain for carrying out said method.
4. Патент Китая № 274608, 2006, Kulaev I S , Stepnaya O.A., Tsfasman I.M.,
Chermenskaya T.S.. Akimenko V.K., Ledova L.A., Zubrilskaya L.G. Bacteriolytic complex,method for producing said complex and strain for carrying out said method.
5. Патент РФ № 2296576, 2007, Кулаев И.С., Степная О.А., Бегунова Е.А., Цфасман ИМ., Логвина И.А., Маринин Л И., Старицын Н.А., Шишкова Н А. Средство, обладающее бактерицидным действием в отношении вегетативных и споровых клеток Bacillus anthracis, способ профилактики и лечения сибирской язвы.
6. Заявка РСТ WO 2006/123962 А2 Schischova N.A., Starizin N.A., Marinin L.I., Stepnaya O.A., Kulaev I S., Tsfasman I.M., Begunova E.A., Chaika I.A. Agent exhibiting bactericidal action with respect to vegetative and spore cells Bacillus anthracis, anthrax preventing and treating method.
7. Патент РФ № 2407782, 2010, Грановский И. Э., Калинин А.Е., Лаптева Ю.С., Латыпов О.Р., Васильева Н.В., Цфасман И М., Степная О.А., Кулаев И.С., Муранова Т.А., Литический фермент AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1, фрагмент ДНК, кодирующий литический фермент AlpA бактерии Lysobacter sp. XL1, и способ получения литического фермента AlpA бактерии Lysobacter sp. XL I.
8. Патент РФ № 2408725, 2011, Грановский И. Э., Калинин А.Е., Лаптева Ю.С., Латыпов О.Р., Васильева Н.В., Цфасман И М., Степная О.А., Кулаев И.С., Муранова Т А., Литический фермент AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1, фрагмент ДНК, кодирующий литический фермент AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1, и способ получения литического фермента AlpB бактерии Lysobacter sp. XL1.
9. Европейский патент № 1902719 Bl, 2011, Schischova N.A., Starizin N.A., Marinin L.I., Stepnaya O A., Kulaev I S., Tsfasman I.M., Begunova E.A.. Chaika I.A. Agent exhibiting bactericidal action with respect to vegetative and spore cells Bacillus anthracis, anthrax preventing and treating method.
Тезисы докладов
1. Северин А.И., Абрамочкин Г.В., Степная O A., Кулаев И.С. Характеристика лизоамидазы - нового бактериолитического комплекса, перспективного терапевтического средства для лечения ран и ожогов. Тезисы докладов четвертой Всесоюзной конференции «Биосинтез ферментов микроорганизмами», Ташкент, 1988, с. 17.
2. Severin A.I.. Abramochkin G.V., Stepnaya O A.. Kulaev I.S. Characteristic of lysoamidase - a new bacteriolytic complex, perspective therapeutic remedy for treating wounds and burns. 14 International Congress of Biochemistry, Prague, CSSR, Abstract, 1988, p.59.
3. Степная O A., Кулаев И.С. Характеристика ферментов литического препарата лизоамидаза. Тезисы Всесоюзной конференции «Регуляция микробного метаболизма», Пущино, 1989, с. 41.
4. Северин А.И., Степная О.А., Кулаев И.С. Ферменты бактериолитического препарата лизоамидаза: выделение и характеристика. Пятая международная конференция по химии и биотехнологии активных природных соединений, Варна. Болгария, 1989, Тезисы докладов, с. 51.
5. Severn A.I., Abramochkin G.V., Stepnaya O A., Kulaev I S. Lysoamidase - a new polyenzymatic staphylolilic bacteriolytic therapeutic remedy. I International symposium «Molecular organization of biological structures», Moscow, 1989, Abstract book, p. 19-24.
6. Северин А.И., Абрамочкин Г.В., Степная O A., Кулаев И.С., Крупянко В.И., Валиахметов А.Я, Кудрявцева А.И., Ильченко В.Я., Плотникова З.С., Зякун A.M., Козловский А.Г. Бактериолитический препарат лизоамидаза. Физиологические, биохимические и клинические аспекты. Сборник научных трудов, Пущино, 1989, с. 80-99.
7. Stepnaya O A., Kudriavtseva A.I., Krupyanko V.I., Kozlovsky A.G., Kulaev I.S. Some properties of bacteriolytic proteinase L2 of the polyenzyme bacteriolytic preparation lysoamidase obtained from the Pseudomonas culture liquid. 5th European Congress on Biotechnology, Copenhagen, 1990, Abstract book, p. 272.
8. Severin A.I., Slepnaya O A., Kulaev I.S. Lysoamidase: a novel antibacterial drug. International conference on antimicrobial activity of nonantibiotices, Copenhagen, 1990. Abstract book, p. 33.
9. Kulaev I S., Krupyanko V.I., Severin A.I., Stepnaya O.A., Kozlovsky A.G. Neutral phosphatase from a bacterium of the family Pseudomonadaceae: isolation and properties. Abstracts of European congress on biotechnology, Copenhagen, 1990, p. 273.
10. Лихошерстов Л.М., Сенченкова C.H., Книрель Ю.А., Шашков А.С., Шибаев В Н., Степная О.А., Кулаев И.С. Структура кислого полисахарида, входящего в состав бактериолитического комплекса лизоамидаза. Тезисы докладов конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров.
Фундаментальные и прикладные аспекты». Пущпно, 1995, с. 34.
11. Степная O.A., Ледова Л.А , Бегунова Е.А., Цфасман И М., Кулаев И С Бактериолитические ферменты бактерии рода Xanthomonas. Конференция «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты». Тезисы докладов, Пущнно, 1995, с. 50.
12. Likhosherstov L.M., Senchenkova S.N., Knirel Y.A., Shashkov A S., Shibaev V.N., Stepnaya O.A., Kulaev I S. The slructure of an exopolysaccharide from a lysoamidase bacteriolytic complex. International Conferense «Microbial polysaccharide», Canada, 1995, Abstract book, p. 48.
13. Likhosherstov L.M., Senchenkova S.N., Knirel Y.A., Shashkov A S., Shibaev V.N., Stepnaya O.A., Kulaev I.S. The structure of an exopolysaccharide from a lysoamidase bacteriolytic complex. First International Conference «Polysaccharide Engineering», 1995, Trondheim, Abstract book, p.65.
14. Кулаев И.С., Ежов В.А., Степная O.A., Ледова Л.А., Ляшедько П.П., Блатун Л.А., Галицкий А.П., Карповский А.И., Толстых П И. Лнзоамидаза - новый ферментный антибактериальный препарат. Конференция хирургов, Калуга, 1996, Тезисы докладов, с. 30.
15. Степная O.A., Северин А.И., Цфасман И М., Бегунова И М., Штерандова А.И., Крупянко В.И., Кулаев И.С. Протеиназы медицинского препарата «лизоамидаза». IV Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», Москва, 1997, Тезисы докладов и стендовых сообщений, с. 54.
16. Степная O.A., Бегунова Е.А., Цфасман И.М , Ледова Л.А., Рязанова Л.П., Стрешинская Г.М., Тульская Е.М., Наумова И.Б., Кулаев И.С. Механизм действия бактериолитических ферментов лизоамидазы на грамположительные и грамотрицательные клетки-мишени. Второй съезд биохимического общества РАН, Москва, 1997, Тезисы докладов, ч. I, с. 236-237.
17. Скрябин Г.К., Кулаев И.С., Северин А.И., Ежов В.А., Козловский А.Г.. Степная O.A., Ледова Л.А., Шупьга A.B. Лизоамидаза - комплексный ферментный препарат для медицинских целей. Семинар-презентация инновационных научно-технических проектов «Биотехнологии Подмосковья-97», Пущино, 1997, Тезисы докладов, с. 12.
18. Кулаев И.С., Ежов В.А., Степная O.A., Козловский А.Г., Ледова Л.А. Новое эффективное средство для лечения инфекционных заболеваний. «Биотехнологии Подмосковья», 1998, Сборник тезисов, с. 21.
19. Кулаев И.С., Степная O.A., Ежов В.А., Ледова Л.А., Цфасман И М., Рязанова
JI.П., Козловским Л.Г., Шульга А В. Лизоамидаза - новый ферментный антибактериальный препарат. Международный семинар-презентация шшонациопиых научно-технических проектов. Пущино, 1999, Сборник тезисов, с. 30.
20. Slepnaya O A., Karpov A.V., Sidorov I.A., Ryazanova L P., Krupyanko V.I., Likhoshcrstov L.M., Sliibaev V.N., Kulaev I S. Interaction of Xanthomonas campeslris XL I acidic polysaccharide with exoenzymes: role ofO-acetyl groups of polysaccharide in muramidase presentation. International symposium «Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology», Pushchino, 2000, Abstracts book, p. 78-79.
21. Slepnaya O A., Tslasman I.M.. Ledova L.A., Ryazanova L P., Sitkin B.V.. Kulaev I S. Bacteriolytic enzymes of Xanthomonas campeslris XL1. International symposium «Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology», Pushchino, 2000, Abstracts book, p. 80-81.
22. Ситкин Б.В., Цфасман ИМ., Степная О.А. Внутриклеточные пептндогликангидролазы бактерии Xanthomonas campeslris XL1. 5-я Путинская конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», Пущино, 2001, Тезисы докладов, с. 51-51.
23. Ситкин Б.В., Цфасман И М., Степная О.А., Кулаев И.С. Внутриклеточные бактериолитические ферменты Xanthomonas campeslris XL1 - продуцента антибактериального препарата лизоамидаза. Международная конференция «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, 2001, Тезисы докладов, с.199-201.
24. Ситкин Б.В., Цфасман И М., Степная О.А., Кулаев И.С. Внутриклеточные пептндогликангидролазы бактерии Xanthomonas campeslris XL1. 3-й Съезд биохимического общества. Санкт-Петербург. 2002, Тезисы докладов с. 106107.
25. Степная О.А., Цфасман И М., Ледова Л.А., Рязанова Л.П., Кулаев И.С. Ферментный антибактериальный препарат «Лизоамидаза». Российско-ЮжноКорейский семинар-презентация инновационных научно-технических проектов в области биотехнологии, Пущино, 12-13 сентября 2002 г., Тезисы докладов, с. 5.
26. Степная О.А.. Цфасман И М., Ледова Л.А., Рязанова Л.П., Кулаев И.С. Ферментный антибактериальный препарат лизоамидаза. Всероссийская конференция «Проблемы медицинской энзимологии. Современные
технологии лабораторной диагностики нового столетия». Москва. 2002 г.. Труды конференции, с. 194-195.
27. Логвина И.А., Цфасман ИМ., Степная O.A. Выделение, очистка и исследование свойств нового внеклеточного фермента Л4 бактерии Lysobacicr sp. «Биология - наука 21 века»: 7-ая Путинская школа - конференция молодых ученых, Пущино, 2003, Сборник тезисов, с. 348.
28. Кулаев И.С., Степная O.A., Цфасман И М., Рязанова Л П., Бегунова Е.А., Ледова Л.А. Бактериолитический препарат лнзоамидаза: новые перспективы использования в медицине. II Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва, 2003, Сборник тезисов, часть вторая, с. 181.
29. Рязанова Л.П., Ледова Л.А., Степная O.A. Действие лекарственного препарата лизоамидаза на клетки грибов. Первый Всероссийский конгресс «Успехи медицинской микологии», Москва, 2003, Сборник тезисов, т. 1, с. 109-110.
30. Safieva D.O., Budashov I.A., Doncova К.A., Kurochkin I.N, Logvina I.A., Begunova E.A., Stepnaya O.A., Kulaev I S. «Atomic-force microscopy analysis of alive Bacillus spores in different environmental conditions. Abstract of III conference «Biotechnology: State and Perspective of Investigation», Moscow, 2005, Abstracts book, p. 210-211.
31. Степная O.A., Рязанова Л.П., Крупянко В.И., Лихошерстов Л.М., Шибаев ВН., Карпов А.И., Сидоров H.A., Кулаев И.С. Взаимодействие кислого экзополисахарида Lysobacler sp. XL 1 с экзоферментами. Роль О-ацетильных групп экзополисахарида при взаимодействии с мурамндазой. 3-я Всероссийская школа-конференция «Химия и биохимия углеводов», Саратов, 2004, Сборник тезисов, с. 57.
32. Логвина И.А., Бегунова Е.А., Степная O.A., Изучение действия лизоаммдазы на споры Bacillus sublilis и В. Cereus. «Биология - наука XXI века»: 8-ая международная Путинская школа - конференция молодых ученых, Пущнно,
2004, Сборник тезисов, с. 121.
33. Stepnaya О. Lisoamidase, an antimicrobial preparation based on bacterial lytic enzymes, 2-nd International Conference «Science-Business-Education», Pushchino,
2005, c. 75.
34. Кулаев И.С., Лаптева Ю.С., Калинин A.E., Хохлова О Н., Шляпников М.Г., Цфасман И.М., Степная O.A., Грановский И.Э. Антимикробный ферментный препарат лизоамидаза: клонирование и экспрессия в Е. coli генов
бактериолитических ондопептидаз Л1 (а!р А) и Л5 (alpB). Тезисы конференции «Фундаментальные пауки-медицинс», Москва, 2005, с.171-172.
35. Чайка И.А., Цфасман И М., Степная O.A., Муранова Т А. Дрожжелнтическое действие металлопротеазы лизоампдазы. «Биология - наука XXI века»: 10-ая Пущипская школа - конференция молодых ученых, Пущино, 2006, Сборник тезисов, с.99.
36. Кулаев И С., Степная O.A., Цфасман U.M., Грановский И.Э., Лаптева Ю.С., Шишкова H.A., Марннин ЛИ Антимикробный ферментный препарат лизоамидаза: создание штаммов-суперпродуцентов бактериолитических ферментов лизоамидазы. Материалы симпозиума «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств», Москва, 2008, Сборник тезисов, с. 103-104.
37. Кулаев И.С., Степная O.A., Шишкова H.A., Маринин Л.И. Бактериолитическне ферменты для профилактики и лечения сибирской язвы. Тезисы докладов пятого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2009, Москва, Сборник тезисов, с. 88.
38. Васильева Н.В., Цфасман И М., Сузина Н Е., Степная O.A., Кулаев И.С. Бактериолитнческая эндопегттидаза Л5 Lysobacler sp. XLI и ее секреция в окружающую среду. Тезисы докладов 4 Российского симпозиума «Белки и пептиды», Казань, 2009, Сборник тезисов, с. 371.
39. Лаптева Ю.С., Михайлова И М., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная O.A., Грановский И.Э. Создание гетерологичной системы экспрессии генов бактериолитических эндопептидаз Л1 и Л5 Lysobacler sp. XL1 на основе бактерий рода Pseudomonas. Тезисы докладов 4 Российского симпозиума «Белки и пептиды». Казань, 2009, Сборник тезисов, с. 374.
40. Сухаричева Е.О., Видягина Н.В., Руденко Н.В., Латыпов O.P., Красовская Л.А., Степная O.A. Выявление моноклональными антителами белковых комплексов, образующихся в клетках Lysobacler sp. XL1 в процессе секреции лнтической эндопептидазы AlpB. Материалы всероссийской конференции «Экотокснкология-2010», Тула, 2010, Сборник тезисов, с. 41.
41. Кулаев И.С., Степная O.A., Цфасман И.М., Васильева Н.В., Грановский И.Э., Латыпов O.P.,. Шишкова НА, Маринин Л.И. Проверка лечебной эффективности внешнемембранных везикул, содержащих литическую эндопептидаэу, на моделях сибиреязвенной инфекции. Материалы
конференции «Фундаментальные науки - медицине», 2010, Москва, Сборник тезисов, с. 28.
42. Шишкова H.A., Маринин Л И., Васильева H B., Ледова Л.А., Кулаев И.С., Цфасман И М., Степная O.A. Антимикробный потенциал впешнемембранных везикул Lysobacter sp. XL1. Всероссийский симпозиум с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», Москва, 2011, Сборник тезисов, с. 141.
43. Красовская Л.А., Васильева Н.В., Лаптева Ю.С., Грановский И.Э., Руденко Н.В., Цфасман И.М., Степная O.A., Кулаев И.С. Получение рекомбинантных литических эндопептидаз AlpA и AlpB Lysobacler sp. XL1 в гетерологичной системе Pseudomonas. Всероссийский симпозиум с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее», Москва, 2011, Сборник тезисов, с.70.
Подписано в печать:
04.04.2012
Заказ № 6905 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
2- 1 2490
soo
2011307272
2011307272
Содержание диссертации, доктора биологических наук, Степная, Ольга Андреевна
I. ВВЕДЕНИЕ.
1.1 Состояние вопроса и актуальность проблемы.
1.2 Цель и задачи работы.
1.3 Научная новизна работы.
1.4 Практическое значение работы.
1.5 Апробация работы.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Глава 1. ЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ.
1.1 Автолитические ферменты бактерий.
1.1.1 Физиологическая роль автолитических ферментов.
1.1.2 Спектр и субклеточная локализация автолитических ферментов.
1.1.2.1 Локализация автолитических ферментов в клетках грамположительных бактерий.
1.1.2.2 Локализация автолитических ферментов в клетках грамотрицательных бактерий.
1.1.3 Свойства автолитических ферментов.
1.1.4 Регуляция и контроль активности автолитических ферментов.
1.2 Внеклеточные бактериолитические ферменты.
Глава 2. КЛЕТОЧНАЯ ОБОЛОЧКА БАКТЕРИЙ.
2.1 Клеточная стенка грамположительных бактерий.
2.2 Клеточная оболочка грамотрицательных бактерий.
2.3 Пептидогликан - субстрат бактериолитических ферментов.
2.3.1 Структура пептидогликана.
Глава 3. СПОРООБРАЗУЮЩИЕ БАКТЕРИИ КАК МИШЕНИ
ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.
3.1 Жизненный цикл спорообразующих бактерий.
3.2 Характеристика бактериальных спор.
3.2.1 Функции оболочки спор.
Глава 4. СПЕЦИФИЧНОСТЬ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.
Глава 5. СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ У БАКТЕРИЙ.
5.1 Одностадийные способы секреции белков в окружающую среду у грамотрицательных бактерий.
5.2 Двухстадийные способы секреции белков в окружающую среду у грамотрицательных бактерий.
5.3 Секреция белков с помощью внешнемембранных везикул.
5.3.1 Преимущества бактерий, производящих везикулы.
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
Глава 6. МЕТОДЫ.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 7. ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ И СТРОЕНИЕ
ПЕПТИДОГЛИКАНА БАКТЕРИИ-ПРОДУЦЕНТА ЛИЗОАМИДАЗЫ.
Глава 8. СИСТЕМА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ (АВТОЛИТИЧЕСКИХ) ПЕПТИДОГЛИКАНГИДРОЛАЗ Lysobacter sp.
8.1 Субстратная специфичность автолитических ферментов по отношению к пептидогликану бактерии Lysobacter sp. XL1.
8.2 Автолитические ферменты Lysobacter sp. XL1, секретирующего внеклеточные бактериолитические ферменты.
8.3 Автолитические ферменты Lysobacter sp. XL2.
Глава 9. ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ Lysobacter sp.
9.1 Система внеклеточных пептидогликангидролаз Lysobacter sp.
9.2 Нуклеотидная последовательность генов литических эндопептидаз
Л1 (AlpA) и Л5 (AlpB).
9.3 Получение рекомбинантных эндопептидаз AlpA и AlpB.
9.4 Внеклеточный полисахарид Lysobacter sp. XL1 - структура и функции.
9.5 Действие лизоамидазы и ее компонентов на различные микроорганизмы.
9.5.1 Действие лизоамидазы и ее компонентов на грамположительные бактерии.
9.5.2 Действие лизоамидазы и ее компонентов на грамотрицательные бактерии.
9.5.3 Действие лизоамидазы на зрелые споры бактерий рода Bacillus.
9.5.3.1 Исследование спор бацилл после обработки лизоамидазой методом атомно-силовой микроскопии.
9.5.3.2 Изучение роли компонентов лизоамидазы в действии препарата на зрелые споры бактерий рода Bacillus.
Глава 10. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ СЕКРЕЦИИ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Lysobacter sp. XL
И Lysobacter sp. XL2 В ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ.
10.1 Обнаружение и характеристика везикул.
10.2 Обнаружение литической активности в везикулах.
10.3 Секреция гомологичных эндопептидаз Л1 (AlpA) и Л5 (AlpB).
10.3.1 Секреция через цитоплазматическую мембрану.
10.3.2 Секреция через внешнюю мембрану.
10.4 Литическое действие везикул ЬуяоЬаМег эр. ХЬ на живые клетки грамположительных, грамотрицательных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов.
Глава 11. ЛЕЧЕНИЕ МОДЕЛЬНОЙ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ
ВНЕКЛЕТОЧНЫМИ ПРОДУКТАМИ ЬухоЪасгег ер. ХЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Литические ферменты Lysobacter sp."
1.1 Состояние вопроса и актуальность проблемы
Литические ферменты, разрушающие клеточные оболочки бактерий, были впервые обнаружены в слюне человека и описаны Александром Флемингом в 1922 году (Fleming, 1922). Вещество назвали лизоцимом, что означает «фермент, растворяющий бактерии». В 1929 г. Флеминг впервые описал антибактериальные свойства гриба Penicillum notatum -продуцента первого промышленного антибиотика пенициллина, за что в 1945 г. в соавторстве с Эрнестом Чейном и Говардом Флори был награжден Нобелевской премией. После выпуска пенициллина и до настоящего времени проводится постоянная работа по созданию и выпуску новых антибиотиков, что вызвано не только необходимостью получать вещества требуемой специфичности и лучшего качества, но также постоянным появлением патогенных микробов, устойчивых к любому, даже самому новому антибиотику (www.who.int). Сложившаяся в связи с этим неблагоприятная ситуация в терапии инфекционных заболеваний заставляет искать новые эффективные антимикробные средства. Многие исследователи указывают на перспективность использования в этих целях литических ферментов, так как способ их воздействия на микробы, а именно растворение микробной клетки, позволяет надеяться на отсутствие появления устойчивых к ним штаммов.
В период 50х - 70х годов 20 века проводилась интенсивная работа по поиску продуцентов таких ферментов, их выделению и изучению свойств. Сейчас известно, что многие живые организмы - от вирусов до человека - продуцируют литические ферменты. Среди бактерий обнаружены продуценты ферментов, активно лизирующих не только клетки бактерий-конкурентов, но и клетки микроорганизмов других систематических групп - дрожжей, мицелиальных грибов, простейших. Для таких бактерий в 1978 году был сформирован порядок Lysobacter ales, включающий семейство Lysobacteraceae и род Lysobacter, объединяющий четыре вида (Christensen and Cook, 1978). В эту систематическую группу были переведены бактерии, ранее относящиеся к другим родам, но по ряду свойств, а главное по литической способности, отличающиеся от их типичных представителей. В последующее время интерес к лизирующим бактериям несколько ослаб, однако сейчас они вновь стали интересовать исследователей. В период первого десятилетия 21 века выявлено одиннадцать новых видов рода Lysobacter. В результате постоянно ведущейся работы по таксономии известных микроорганизмов было скорректировано и систематическое положение рода Lysobacter. Сейчас он включен в семейство Xanthomonadaceae (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001). В литературе же до сих пор можно наблюдать очевидную путаницу в систематическом положении описываемых продуцентов литических ферментов. Например, продуцент ферментов, по всем свойствам аналогичных ферментам типового вида рода Lysobacter -Lysobacter enzymogenes - обозначается авторами как Achromobacter lyticus (Shiraki et al., 2002, Li et al., 1997).
Для бактерий, продуцирующих внеклеточные литические ферменты, как для любой бактерии, жизненно необходимы внутриклеточные автолитические ферменты, разрушающие ковалентные связи в пептидогликане - основном структурном компоненте их клеточной стенки, и играющие таким образом главную роль в процессах роста и деления. В клетках бактерий-продуцентов внеклеточных литических ферментов идет параллельный синтез и передвижение через цитоплазматическую мембрану к месту своего действия как автолитических ферментов, которые могут локализоваться в мембране, периплазме и клеточной стенке, так и внеклеточных бактериолитических ферментов, секретируемых в окружающую среду. В связи с этим встает вопрос о механизме и регуляции процесса одновременного функционирования этих ферментов, о том могут ли автолитические ферменты являться предшественниками внеклеточных бактериолитических ферментов? К настоящему времени опубликовано большое количество работ, посвященных выделению и характеристике как внеклеточных, так и внутриклеточных бактериолитических ферментов бактерий. Однако до сих пор нет сведений по сравнительному изучению у одной и той же бактерии вне- и внутриклеточных литических систем. Автолитические ферменты хорошо изучены у многих представителей грамположительных бактерий (Shockman, Holtje, 1994), у грамотрицательных, за исключением Escherichia coli (Holtje, Tuomanen, 1991), их подробно не изучали.
В 1973 году в ИБФМ АН СССР (ИБФМ РАН) по распоряжению Академии наук была начата работа по теме «Создание эффективных средств борьбы с патогенными множественно устойчивыми к антибиотикам микроорганизмами». Культуральная жидкость грамотрицательной бактерии, выделенной сотрудниками института в 1976 году из воды реки Оки в районе очистных сооружений г. Пущино, Московской области, явилась основой препарата, названного лизоамидаза и обладающего бактериолитической и протеолитической активностями. Успешные клинические испытания лизоамидазы позволили зарегестрировать ее в качестве лекарственного средства для лечения наружных инфекций, вызванных грамположительной микрофлорой. По ряду морфологических и биохимических признаков бактерия-продуцент была предположительно отнесена к роду
ХапЖотопах. Однако по ряду существенных свойств, например, по отсутствию подвижности, продуцент лизоамидазы отличался от бактерий этого рода.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Степная, Ольга Андреевна
VI. выводы
1. Бактерия-продуцент препарата лизоамидаза, штамм XL1, отнесена к роду Lysobacter, семейства Xanthomonadaceae. При длительном выращивании литически высокоактивного штамма Lysobacter sp. XL1 на средах, способствующих секреции внеклеточных продуктов, в популяции возникают и накапливаются за счет более высокой скорости роста клетки литически низкоактивного штамма Lysobacter sp. XL2. Оба штамма Lysobacter sp. при любых условиях роста образуют внешнемембранные везикулы.
2. Впервые показано, что внутриклеточная и внеклеточная литические системы бактерии Lysobacter sp. (XL1, XL2) функционируют независимо. Свойства литических ферментов - компонентов этих систем - значительно отличаются друг от друга: внутриклеточные ферменты являются кислыми белками, активными при 29°С, высоком значении ионной силы среды и щелочном значении рН; внеклеточные ферменты -щелочные белки, активные при низких значениях ионной силы, щелочном рН и высоких температурах (50°-80°С). В составе внеклеточной литической системы Lysobacter sp. XL1 обнаружено пять ферментов: мурамидаза, амидаза, три эндопептидазы, в составе литической системы Lysobacter sp. XL2 - амидаза и мурамидаза. В составе внутриклеточной литической системы Lysobacter sp. выявлено девять пептидогликангидролаз разной субстратной специфичности и локализации.
3. Впервые обнаружено, что постсекреторное электростатическое взаимодействие высокомолекулярного кислого полисахарида и ферментов Lysobacter sp. XL1 приводит к значительной стабилизации ферментов и в ряде случаев к изменению их активности. В частности полисахарид усиливает действие мурамидазы на клетки золотистого стафилококка, а литические ферменты, связанные с полисахаридом, становятся способными разрушать покоящиеся споры бактерий рода Bacillus. Полисахарид Lysobacter sp. XL1 полностью ингибирует активность ряда литических ферментов других микроорганизмов.
4. Впервые показано, что бактерия Lysobacter sp. транспортирует литические ферменты, разрушающие клетки микробов-конкурентов, в окружающее клетку пространство внутри внешнемембранных везикул. Везикулы, содержащие такие ферменты, способны лизировать живые клетки представителей различных групп микроорганизмов, например, грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas, Proteus, Erwinia, Alcaligenes, грамположительных бактерий, относящихся к родам Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Rothayibacter, дрожжей рода Candida, мицелиального гриба Sclerotinia sclerotiorum в отличие от литических ферментов, находящихся вне везикул.
163
Следовательно, такой способ секреции литических ферментов имеет для продуцента важное биологическое значение, расширяя спектр микроорганизмов, с которыми он может конкурировать в природе.
5. Установлены особенности взаимодействия литических ферментов Lysobacter sp. с нативными клетками-мишенями. Для эффективного гидролиза клеток грамположительных бактерий ферментам необходим предварительный контакт с отрицательно заряженным полимером клеточной стенки (тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами), химическая структура этих полимеров не имеет решающего значения. Липополисахарид клеточной стенки грамотрицательных бактерий ингибирует активность литических ферментов. Нативные клетки грамотрицательных бактерий ферменты Л1-Л4 разрушают только при условии предварительной дестабилизации внешней мембраны клетки тем или иным способом (температура, полимиксин В, гентамицин, амикацин). Эндопептидаза Л5 способна лизировать нативные клетки ряда грамотрицательных бактерий.
6. Установлена структура генов двух литических эндопептидаз Lysobacter sp. XL1 -Л1 (AlpА) и Л5 (AlpB); показано, что белки синтезируются как препроферменты, пре-части состоят из 33 и 28 а.о., про- части - из 166 а.о., зрелые ферменты - из 199 и 205 а.о. соостветственно. Получены и охарактеризованы рекомбинантные Alp А и AlpB.
7. Показана возможность использования лизоамидазы и внешнемембранных везикул Lysobacter sp. XL1 для лечения и профилактики сибиреязвенной инфекции.
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов в настоящее время приобрела характер глобальной угрозы и требует разработки новых антибиотических препаратов с оригинальным механизмом действия и новых неантибиотических способов воздействия на инфекционный процесс. В связи с этим целью проведенной работы являлось исследование биохимических и генетических особенностей функционирования и взаимосвязи внутриклеточной и внеклеточной литических систем бактерии-продуцента препарата лизоамидаза для создания на основе полученной информации нового поколения антимикробных лекарственных средств.
В результате проведенной работы было установлено, что бактерия, продуцирующая внеклеточные литические ферменты, относится к роду Lysobacter. Исследуемый в настоящей работе штамм Lysobacter sp. XL1 был получен путем селекции из исходной культуры и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ В-2249Д). При длительном выращивании этого литически высокоактивного штамма на средах, способствующих секреции внеклеточных продуктов, в популяции возникают и накапливаются за счет большей скорости роста клетки литически низкоактивного штамма Lysobacter sp. XL2.
Были исследованы внутриклеточная и внеклеточная системы литических ферментов обоих штаммов этой бактерии. В составе эндоклеточной системы обоих штаммов выявлено девять ферментов разной субстратной специфичности и локализации (глюкозидазы, амидазы, эндопептидазы). В составе внеклеточной литической системы Lysobacter sp. XL1 обнаружено пять ферментов, среди которых мурамидаза (ЛЗ), амидаза (Л2), три эндопептидазы (Л1, Л4, Л5). Внеклеточная литическая система низкоактивного штамма Lysobacter sp. XL2 состоит из мурамидазы и амидазы. Показано, что свойства ферментов разных литических систем значительно отличаются друг от друга: внутриклеточные ферменты являются кислыми белками, активными при 29°С -температуре оптимального роста бактерии, высоком значении ионной силы среды и щелочном значении pH; внеклеточные ферменты - щелочные белки, активные при низких значениях ионной силы, щелочном pH и высоких температурах (50°- 80°С).
Было показано, что наряду с внеклеточными литическими ферментами Lysobacter sp. XL1 продуцирует высокомолекулярный 300 кДа), кислый полисахарид. Структура этого полисахарида образована повторяющейся единицей, состоящей из N-ацетилглюкозамина, N-ацетилмануроновой и N-ацетилглюкуроновой кислот. Постсекреторное электростатическое взаимодействие этого полисахарида и ферментов
160
Lysobacter sp. XL1 приводит не только к значительной стабилизации ферментов, но и, в ряде случаев, к изменению их активности. Полисахарид усиливает действие мурамидазы на клетки золотистого стафилококка, а литические ферменты, связанные с полисахаридом, становятся способными разрушать покоящиеся споры бактерий рода Bacillus. Полисахарид Lysobacter sp. XL1 полностью ингибирует активность ряда литических ферментов других продуцентов. Очевидно, что образование микроорганизмами таких внеклеточных комплексов является для них экологически значимым.
Для ферментов J11 и JI5 можно предположить путь секреции через цитоплазматическую мембрану в периплазму посредством Sec экспортного механизма, исходя из известной первичной структуры этого белка, а также наличия в клетках Lysobacter sp. XL1 компонента Sec машины - белка SecA.
В представленной работе впервые установлена способность клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2 образовывать везикулы. Количество везикул, образуемых штаммом XL1 больше, чем штаммом XL2. Показано, что везикулы обоих штаммов имеют внешнемембранную природу, в процессе своего образования захватывают компоненты периплазмы и обладают бактериолитической активностью. Литическая активность везикул Lysobacter sp. XL2 обусловлена присутствием в них амидазы Л2, а литическая активность везикул Lysobacter sp. XL1 обусловлена присутсвием в них амидазы Л2 и протеиназы Л5. Таким образом, везикулы Lysobacter sp. являются естественным транспортным средством, обеспечивающим выход некоторых секретируемых белков за пределы клетки.
Ферменты, заключенные в везикулы, способны лизировать живые клетки представителей различных групп микроорганизмов, например, грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas, Proteus, Erwinia, Alcaligenes, грамположительных бактерий, относящихся к родам Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Rothayibacter, дрожжей рода Candida, мицелиального гриба Sclerotinia sclerotiorum, в отличие от литических ферментов, находящихся вне везикул. Таким образом, подобный путь секреции литических ферментов имеет для клетки-продуцента важное биологическое значение, так как расширяет спектр микроорганизмов, с которыми она может конкурировать в природе.
Установлены важные особенности взаимодействия внеклеточных литических ферментов Lysobacter sp. с нативными клетками-мишенями. Показано, что для эффективного гидролиза клеток грамположительных бактерий ферментам необходим предварительный контакт с отрицательно заряженным полимером клеточной стенки (тейхоевыми или тейхуроновыми кислотами), оказалось, что химическая структура полимера не имеет решающего значения. Нативные клетки грамотрицательных бактерий
161 литические ферменты Lysobacter sp. (за исключением J15) разрушают только при условии предварительной дестабилизации внешней мембраны клетки-мишени подходящим способом (температура, полимиксин В, гентамицин, амикацин). Литический фермент Л5 разрушает клетки грамотрицательных бактерий без предварительной обработки.
На основании полученных данных разработан и масштабирован новый регламент получения препарата лизоамидаза с высоким выходом целевого продукта (до 80%).
Разработаны способы получения двух рекомбинантных литических эндопептидаз Lysobacter sp. XL1 (Л1 и Л5) с использованием гетерологичных систем на основе Е. coli (рефолдинг из телец включения) и Pseudomonas fluorescens (очистка секретируемых белков).
Установлена возможность использования препарата лизоамидаза, а также везикул Lysobacter sp. XL1 для лечения различных форм экспериментальной сибирской язвы.
Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Степная, Ольга Андреевна, Пущино
1. Безденежных И.С., Никифоров В.Н. 1980. Эпидемиологический анализ заболевания сибирской язвой в Свердловске. Микробиология. Т5. С. 111-113.
2. Бухарин О.Б., Усвяцов. 1981. Лизоцимная активность микроорганизмов. Антибиотики. № 10. С. 782-793.
3. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. 2005. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 367 С.
4. Головина И.Г. 1973. Литические ферменты микроорганизмов. Успехи микробиологии. Т 8. С 108-136.
5. Головина И.Г., Гужова Э.П., Богданова Т.И., Логинова Л.Г. 1972. О литических ферментах, образуемых термофильным актиномицетом Micromonospora vulgaris DA II-4. Микробиология. Т 42. С. 620-624.
6. Захарова И.Я., Косенко Л.В. 1982. Методы изучения микробных полисахаридов. Наукова думка. Киев. 215 С.
7. Захарова И.Я., Павлова И.Н. 1985. Литические ферменты микроорганизмов. Наукова думка. Киев. 216 С.
8. Звягинцева И.С. 1981. Внеклеточные гидролазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Успехи микробиологии. Т16. С81-103.
9. Калебина Т.С., Кулаев И.С. 2001. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей. Усп. биол. хим. Т. 41. С. 105-130.
10. Клесов A.A. 1984. Ферментативный катализ. Изд-во МГУ. Москва. 216 С.
11. Кузнецов В.Д., Гуреева М.Н., Шпокенс А.П., Уискуренас А.П. 1982. Образование литических ферментов актиномицетами. Изв. АН СССР. Биология. Т. 3. С. 440-443.
12. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Р.В. 1984. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. Вестн. АМН СССР. Т. 8. С. 64-69.
13. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. 2002. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Т. 24, С. 104-127.
14. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов A.B., Старицын H.A., Кравченко Т.Б. 2006. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. Оболенск. 357 С.
15. Мирошников К.А., Чертков О.В., Назаров П.А., Месянжинов В.В. 2006. Петидогликанлизирующие ферменты бактериофагов перспективные противобактериальные агенты. Успехи биол. химии. Т. 46. С. 65 - 98.
16. Наумова А.Б., Шашков A.C. 1997. Анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий. Биохимия. Т 62. С. 947-982.
17. Наумова И.Б. 1978. Тейхоевые кислоты в регуляции биохимических процессов у микроорганизмов. Биохимия. Т.43. С. 195-207.
18. Поздеев O.K. 2001. «Медицинская микробиология». Учебник для ВУЗов, под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. Изд. дом «Гэотар-Мед».
19. Полевая Л.К. 1982. Гомология лизоцимов бактериального и животного происхождения. Молекулярная биология. Т. 16. С. 1211-1222.
20. Потехина Н.В. 2006. Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамположительных бактерий. Успехи биол. химии. Т. 46. С. 225 278.
21. Северин А.И., Маркелова Н.Ю., Афиногенова A.B., Кулаев И.С. 1987. Выделение и некоторые физико-химические свойства литической протеиназы паразитической бактерии Micavibrio admirandus. Биохимия. Т. 52. С. 1594-1599.
22. Степная O.A., Цфасман И.М., Логвина И.А., Рязанова Л.П., Муранова Т.А., Кулаев И.С. Выделение и характеристика новой внеклеточной бактериолитической эндопептидазы Lysobacter sp. XL1. Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1250-1257.
23. Степная O.A., Северин А.И., Кулаев И.С. Некоторые физико-химические свойства литической протеазы Л2 ферментного препарата лизоамидаза, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия. 1986. Т 51. С. 909-915.
24. Степная О. А., Бегунова Е.А., Цфасман И,М., Кулаев И.С. 1996а. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза: выделение и некоторые физико-химические свойства внеклеточной мурамидазы бактерии Xanthomonas sp. Биохимия. 61. С. 648-655.
25. Степная О.А., Цфасман И.М., Ледова Л.А., Петрикевич С.Б., Бегунова Е.А., Кулаев И.С. 19966. Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза. Очистка и некоторые свойства бактериолитической пептидазы L1. Биохимия. Т. 61. С. 656-663.
26. Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Панина Л.И. 1979. Химический состав клеточной стенки Streptomyces chrysomallus, образующего антибиотик аурантин. Микробиология. Т. 48. С. 814 819.
27. Черкасский Б.Л. 2002. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: Интерсэн. 384 С.
28. Черкасский Б.Л. 2003. Путешествие эпидемиолога во времени и пространстве. Воронеж: ФГУП ИПФ «Воронеж». С. 372-509.
29. Шлегель Г. 1987. «Общая микробиология». Мир. 567 С.
30. Ahmed, К., S. Chohnan, Н. Ohashi, Т. Hirata, Т. Masaki, and F. Sakiyama. 2003. Purification, bacteriolytic activity, and specificity of P-lytic protease from Lysobacter sp. IB-9374. J. of Bios, and Bioeng. Vol. 95. P. 27-34.
31. Akesson A., Hedstrom S. A., and Ripa T. 1991. Bacillus cereus: a significant pathogen in post-operative and posttraumatic wounds on orthopedic wards. Scand. J. Infect. Dis. Vol. 23. P. 71-77.
32. Akita M., Sasaki S., Matsuyama S. and Mizushima S. 1990. SecA interaction with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in Escherichia coli. Biol Chem. Vol. 265. P. 8164- 8169.
33. Al-Hemidan A., Byrne-Rhodes K.A., and Tabbara K.F. 1989. «Bacillus cereus panophthalmitis associated with intraocular gas bubble». Br. J. Ophthalmol. Vol. 73. P. 25-28.
34. Allan N.D. and Beveridge T.J. 2003. Gentamicin delivery to Burkholderia cepacia group Ilia strains via membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa PAOl. Antimicrob Agents Chemother. Vol. 47. P. 2962 2965.
35. Altman E., Kumamoto C. and Emr S. 1991. Heat-shock proteins can substitute for SecB function during protein export in Escherichia coli. Vol. 10. P. 239 245.
36. Ames G.F., Spudich E.N. and Nikaido H. 1974. Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhimurium: Effect of lipopolysaccharide mutations. J Bacterid. Vol. 117. P. 406-416.
37. Archibald A.R. 1974. The structure, biosynthesis and function of teichoic acid. Adv. Microb. Physiol. Vol 11. P. 53-59.
38. Archibald A.R. 1980. Receptors and recognition. In: Virus receptors, ser. B. 7. (Randall L.L., Philipson L., eds). Chapman and Hall. London. 7-26.
39. Archibald A.R., Amstrong J.J. and Baddiley J., Hay J.B. 1961. Teichoic acids and the structure of bacterial cell wall. Nature. Vol. 191. P. 570-572.
40. Archibald A.R., Hancock I.C. and Harwood C.R. 1993. Cell wall struchure, synthesis and turnover. In: Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria (Hoch J.A., Losick R., eds). Ameri. Soc. for Microbiol. Washington D.C. P. 381-410.
41. Armstrong J. J., Baddiley J. and Buchanan J.G. 1960. Structure of the ribitol teichoic acid from the walls of Bacillus subtilis. Biochemistry. Vol. 76. P. 610-621.
42. Aronson A.I., Ekanayake L. and Fitz-James P. 1992. Protein filaments may initiate the assembly of the Bacillus subtilis spore coat. Biochem. Vol. 74. P. 661-667.
43. Aronson A.I., Fitz-James P. 1976. Structure and morphogenesis of the bacterial spore coat. Bacteriol. Rev. Vol. 40. P. 260-402.
44. Aronson A.I., Horn D. 1972. Characterization of the spore coat protein of Bacillus cereus T. In Halvorson H.O., Hansen R., Campbell (ed.), Spores V. American Society for Microbiology. Washington. P. 19-27.
45. Aronson A.I., Pandey N.K. 1978. Comparative structural and functional aspects of spore coats In G. Chambliss and J.C. Vary (ed.) Spores VII. Ameri. Soc. for Microbiol., Washington. P.54-61.
46. Atrih A., Foster S.J. 1999. The roles of peptidoglycan structure and structural dynamics during dormancy and germination. Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 75. P. 299 307.
47. Attwood A.I., and D.M. Evans. 1983. Bacillus cereus infection in burns. Burns. Vol. 9. P.355-357.
48. Baddiley J. 1972. Teichoic acids in cell walls and membranes of bacteria. Essays Biochem. Vol. 8. P. 35-77.
49. Baddiley J. 1988. The function of teichoic acids in walls and membranes of bacteria. In: The Roots of Mordern Biochemistry (Kleinkauf von Dohren, Jaenicke S., eds.). Walter de Gruyter and Co. Berlin-New York. P. 223-229.
50. Baddiley J., Hancock I.C. and Scherwood P.M.A. 1973. X-ray photoelectron studies of magnesium ions bound to the cell walls of gram-positive bacteria. Nature. Vol. 243. P. 43-45.
51. Bailey-Smith K., Todd S.J., Southworth T.W., Proctor J., and Moir A. 2005. The ExsA protein of Bacillus cereus is required for assembly of coat and exosporium onto the spore surface. J. Bacterid. Vol. 187. P. 3800-3806.
52. Bae, H. S., W. T. Im, and S. T. Lee. 2005. Lysobacter concretionis sp. nov., isolated from anaerobic granules in an upflow anaerobic sludge blanket reactor. Int J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 55. P. 1155-61.
53. Bais W.J. 1927. Case of pathogenicity of Bacillus subtilis. J. Infect. Dis. Vol. 40. P. 313-315.
54. Ballardie F.W., Capon B. 1972. 3,4-Dinitrophenyl tetra-N-acetyl-p-D-chitotetraoside a good chromophoric substrate for hen's egg-white lysozyme. J. Chem. Soc. Commun. Vol. 14. P. 828-829.
55. Baneijee C., Bustamante C.I., Wharton R., Talley E., and Wade J.C. 1988. Bacillus infections in patients with cancer. Arch. Intern. Med. Vol. 148. P. 1769-1774.
56. Barrie D., Wilson J.A., Hoffman P.N., and Kramer J.M. 1992. Bacillus cereus meningitis in two neurosurgical patients: an investigation into the source of the organism. J. Infect. Vol. 25. P. 291-297.
57. Beacham I.R. (1979). Periplasmic enzymes in gram-negative bacteria. Int J Biochem. Vol.10. P. 877-881.
58. Beaman T.C., Greenamyre J.T., Corner T.R., Pankratz H.S., and Gerhardt P. 1982. Bacterial spore heat resistance correlated with water content, wet density, and protoplast/sporoplast volume ratio. J. Bacterid. Vol. 150. P. 870-877.
59. Beaman, T.C., H.S. Pankratz, and P. Gerhardt. 1972. Ultrastructure of the exosporium and underlying inclusions in spores of Bacillus megaterium strains. J. Bacteriol. Vol. 109. P.1198-1209.
60. Beer P.M., Ludwig I.H., and Packer A.J. 1990. Complete visual recovery after Bacillus cereus endophthalmitis in a child. Am. J. Ophthalmol., v. 110 p. 212-213.
61. Bekemeyer W.B., and Zimmerman G.A. 1985. Life-threatening complications associated with Bacillus cereus pneumonia. Am. Rev. Respir. Dis. Vol. 131. P. 466469.
62. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J. and Sayers E.W. «GenBank». Nucleic Acids Res. 2009. V. 37 (Database issue). D26-31.
63. Benz R. 1994. Uptake of solutes through bacterial outer membranes. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall. (Ghuysen J.M., Hakenbeck R. eds). Elsevier Science B.V. Amsterdam. P. 397 424.
64. Berks B., Sargent F., Palmer T. 2000. The Tat protein export pathway. Mol Microbiol. Vol. 35. P. 260 274.
65. Bernadac A., Gavioli M., Lazzaroni J.C., Raina S. and Lloubes R. 1998. Escherichia coli tol-pal mutants form outer membrane vesicles. J Bacteriol. Vol. 180. P. 4872 -4878.
66. Bernadsky G., Beveridge T.J., Clarke A.J. 1994. Analysis of the sodium dodecyl sulfate-stable peptidoglycan autolysins of select gram-negative phatogens by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J. Bacteriol. Vol. 176. P. 5225-5232.
67. Bernhardt T.G., Wang I.-N., Struck D.K. and Young R. 2002. Breaking free: "Protein antibiotics" and phage lysis. Research in Microbiology Vol. 53. P. 493 501.
68. Beukes M., Bierbaum G., Sahl H.-G. and Hastings J.W. 2000. Purification and partical characterization of a murein hydrolase, millericin B, produced by Streptococcus milleri NMSCC 061. Appl Anviron Microbiol. Vol. 66. P. 23 28.
69. Beveridge T.J. 1981. Ultrastructure chemistry and function of the bacterial wall. Intern. Rev. Cytol. Vol 72. P. 229-317.
70. Beveridge T.J. 1999. Structure of gram-negative cell walss and their derived membrane vesicles. J. Bacterid. Vol. 181. P. 4725-4733.
71. Binet R., Le'toffe' S., Ghigo J., Delepelaire P. and Wandersman C. 1997. Protein secretion by Gram negative bacterial ABC exporters a review. Gene. Vol. 192. P.7 - 11.
72. Bitter W., Koster M., Latijnhouwers M., De Cock H. and Tommassen J. 1998. Formation of oligomeric rings by XcpQ and PilQ, which are involved in protein transport across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. Vol. 27. P. 209-219.
73. Blackman S.A., Smith T.J. and Foster S.J. 1998. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. Vol. 144. P. 73-82.
74. Blackmoore M, Patel N, Hillman B. and Kobayashi D. 2009. Involvment of type IV secretion in Lysobacter enzymogenes pathogenesis of fungal and algal hosts. APS Annual Meeting.
75. Blaser M.J., Hopkins J.A., Berka R.M., Vasil M.L. and Wang W.L. 1983. Identification and characterization of Campylobacter jejuni outer membrane proteins. Infect Immun. Vol. 42. P. 276 284.
76. Blobel G., Dobberstein B. 1975. Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J.Cell Biol. Vol. 67. P. 835 851.
77. Block C., Levy M., and Fritz V. 1978. Bacillus cereus endocarditis a case report. S. Afr. Med. J. Vol. 53. P. 556-557.
78. Boland F.M., Atrin A., Chirakkal H., Foster S.J. and Moir A. 2000. Complete spore-cortex hydrolysis during germination of Bacillus subtilis 168 requires SleB and YpeB. Microbiology. Vol. 146. P. 57-64.
79. Boland F .M., Atrin A., Chirakkal H., Foster S.J., Moir A. 2000. Complete spore-cortex hydrolysis during germination of Bacillus subtilis 168 requires Sle B and Ype B. Microbiology. Vol. 146. P. 57-64.
80. Bone R., Silen J.L. and Agard D.A. 1989. Structural plasticity broadens the specificity of an engineered protease. Nature. Vol. 339. P. 191 195.
81. Bourne, N., P.C. Fitz-James, and A.I. Aronson. 1991. Structural and germination defects of Bacillus subtilis spores with altered contents of a spore coat protein. J. Bacteriol. Vol. 173. P. 6618-6625.
82. Bos M.P, Robert V. and Tommassen J. 2007. Biogenesis of the gram-negative bacterial outer membrane. AnnuRev Microbiol. Vol.61. P. 191-214.
83. Boydston J.A., Chen P., Steichen C.T. and Turnbough C.L.J. 2005. Orientation within the exosporium and structural stability of the collagen-like glycoprotein BclA of Bacillus anthracis. J. Bacteriol. Vol. 187. P. 5307-5310.
84. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. Vol. 72. P. 248-254.
85. Braun V., Sieglin U. 1970. The covalent murein-lipoprotein structure of Escherichia coli cell wall. Eur. J. Biochem. Vol. 13. P. 336-346.
86. Briese T., Hakenbeck R. 1985. Interaction of the pneumococcal amidase with lipoteichoic acid and choline. Eur. J. Biochem. Vol. 146. P. 417-427.
87. Briggs M., Gierash L.M. 1986. Molecular mechanisms of protein secretion: the role of the signal sequence. Adv Protein Chem. Vol. 38. P. 109 180.
88. Bronneke V., Fiedler P. 1994. Production of bacteriolytic enzymes by Streptomyces globisporus regulated by exogenous bacterial cell walls. Appl. Env. Microbiol. Vol. 60. P. 785-791.
89. Brook I., Elliott T.B., Pryor H.I., Sautter T.E., Gnade B.T., Thakar J.H. and Knudson G.B. 2001. In vitro resistance of Bacillus anthracis Sterne to doxycycline, macrolides and quinolones. Int. J. Antimicrob. Agents. Vol. 18. P. 559-562.
90. Broun W.C., Wilson C.R. and Lukehart S. 1976. Analysis of autolysins in temperature-sensitive mutant of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol.125. P. 166-173.
91. Brown W.C. 1973. Rapid methods to extracting autolysins from Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Vol. 25. P. 295-300.
92. Buchanan C.E., and Gustafson A. 1992. Mutagenesis and mapping of the gene for a sporulation-specific penicillin-binding protein in Bacillus subtilis. J. Bacterid. Vol. 174. P. 5430-5435.
93. Buist G., VenemaG and Kok J. 1998. Autolysis of Lactococcus lactis is influenced by proteolysis. J. Bacterid. Vol 180. P. 5947-5953.
94. Burge R.E., Fowler A.G. and Reaveley D.A. 1977. Structure of the peptidoglican of bacterial cell walls. I. J Mol Biol. Vol. 117. P. 927 953.
95. Caldentey J., Bamford D.H. 1992. The lytic enzyme of the Pseudomonas phage phi 6. Purification and biochemical characterization. Biochim Biophys Acta. Vol. 1159. P. 44 50.
96. Cascales E. and Christie P.J. 2004. Definition of a bacterial type IV secretion pathway for a DNA substrate. Science. Vol. 304. P. 1170 1173.
97. Cascales E., Bernadac A., Gavioli M., Lazzaroni J.C. and Lloubes R. 2002. Pal lipoprotein of Escherichia coli plays a major role in outer membrane integrity. J Bacterid. Vol. 184. P. 754 759
98. Chada V.G.R., Sanstad E.A., Wang R., and Driks A. 2003. Morphogenesis of Bacillus Spore Surfaces. J. Bacterid. Vol. 185. P. 6255-6261.
99. Chaloupka J., Kreckova P. and Richova L. 1962a. Changes in the character of the cell wall in growth of Bacillus megaterium cultures. Folia Microbiol. (Prague). Vol. 7. P. 269-274.
100. Chaloupka J., Kreckova P. and Richova L. 1962b. The mucopeptide turnover in the cell walls of growing cultures of Bacillus megaterium K.M. Experientia. Vol. 18. P. 362-364.
101. Chatteijee A.N. and Park J.T. 1964. Biosynthesis of cell wall mucopeptide by a particulate fraction from Staphylococcus aureus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol. 54. P. 9-16.
102. Chatteijee S.N. and Das J. 1967. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. J Gen Microbiol. Vol. 49. P. 1-11.
103. Chen, J., Moore, W., Yuen, G., Kobayashi, D. and Caswell-Chen, E. 2006. Influence of Lysobacter enzymogenes strain C3 on nematodes. Journal of Nematology. Vol. 38. P. 233-239.
104. Cheng X., Zhang X., Pflugrath J.W. and Studier F.W. 1994. The structure of bacteriophage T7 lysozyme, a zinc amidase and an inhibitor of T7 RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 91. P. 4034 4038.
105. Chernov, A.A. 1984. Modern Crystallography III. Crystal Growth. Springer-Verlag. Berlin. 458 P.
106. Chohnan, S., J. Nonaka, K. Teramoto, K. Taniguchi, Y. Kameda, H. Tamura, Y. Kurusu, S. Norioka, T. Masaki, and F. Sakiyama. 2002. Lysobacter strain with high lysyl endopeptidase production. FEMS Microbiol. Lett. Vol. 213. P. 13-20.
107. Chohnan, S., K. Shiraki, K. Yokota, M. Ohshima, N. Kuroiwa, K. Ahmed, T. Masaki, and F. Sakiyama. 2004. A second lysine-speciflc serine protease from Lysobacter sp. strain IB-9374. J. Bacterid. Vol. 186. P. 5093-100.
108. Christensen P. and Cook F.D. 1978. Lysobacter, a new genus of nonfruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 28. P. 367 393.
109. Christie P.J. 2001. Type IV secretion: intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. Vol. 40. P. 294 -305.
110. Cieslak T.J. and Eitzen E.M. 1999. Clinical and Epidemiologic Principles of Anthrax. Emerg. Infect. Dis. Vol. 5. P. 552-555.
111. Ciofu O., Beveridge T.J., Kadurugamuwa J., Walther-Rasmussen J. and Hoiby N. 2000. Chromosomal P-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother. Vol. 45. P. 9 13.
112. Cleveland R.F., Wicken A.J., Daneo-Moore L. and Shockman G.D. 1976. Inhibition of wall autolysis in Streptococcus faecalis by lipoteichoic acid and lipids. J. Bacteriol. Vol. 126. P. 192-197.
113. Cornelis G.R. and van Gijsegem F. 2000. Assembly and function of type III secretory systems. Annu. Rev. Microbiol. Vol. 54. P. 735 774.
114. Cornett J.B., Johnson C.A., Shockman G.D. 1979. Release of autolytic enzyme from Streptococcus faecalis cell wall by treatment with dilute alcali. J. Bacteriol. Vol. 138. P. 699-704.
115. Costerton J.W., Ingram J.M., Cheng L. 1974. Structural and function of the cell envelope of gram-negative bacteriae. Bacteriol. Rev. Vol. 81. P. 87-110.
116. Cotton D.J., Gill V.J., Marshall D.J., Gress J., Thaler M., and Pizzo P. 1987. Clinical features and therapeutic interventions in 17 cases of Bacillus bacteremia in an immunosuppressed patient population. J. Clin. Microbiol. Vol. 25. P. 672-674.
117. Cowan C.L., Madden W.M., Hatem G.F., and Merrit J.C. 1987. Endogenous Bacillus cereus panophthalmitis. Ann. Ophthalmol. Vol. 19. P. 65-68.
118. Coyette J. and Shockman G.D. 1973. Some properties of the autolytic N-acetylmuramidase of Lactobacillus acidophilus. J. Bacterid. Vol. 114. P. 34-41.
119. Croux C., Canard B., Goma G. and Soucaille P. 1992. Purification and characterization of an extracellular muramidase of Clostridium acetobutylicum ATCC-824 that acts on non-N-acetylated peptidoglycan. Appl. Env. Microbiol. Vol. 58. P. 1075-1081.
120. Croux C., Ronda C., Lopez R. and Garcia J.L. 1993. Role of the C-terminal domain of the lysozyme of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 in a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme. FEBS. Vol. 336. P. 111-114.
121. Croux C., Ronda C., Lopez R. and Garcia J.L. 1998. Interchange of functional domains switches enzyme specificity: construction of a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme. Mol. Microbiol. Vol. 9. P. 1019-1025.
122. Das A. and Xie Y.H. 2000. The Agrobacterium T-DNA transport pore proteins VirB8, VirB9, and VirBlO interact with one another. J Bacteriol. Vol. 182. P. 758 -763.
123. Deutsch, J. 1983. in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.,U., Editor-inChief) Verlag Chemie. Florida. Vol. 3. P. 190-197.
124. Dijkstra A.J. and Keck W. 1996. Peptidoglycan as barrier to transenvelope transport. J. Bacteriol. Vol. 178. P. 5555-5562.
125. Doganay M. and Aydin N. 1991. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anthracis. Scand. J. Infect. Dis. Vol. 23. P. 333-335.
126. Dorward D.W. and Garon C.F. 1989. DNA-binding proteins in cells and membrane blebs of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. Vol. 171. P. 4196 4201.
127. Dorward D.W., Garon C.F. and Judd R.C. 1989. Export and intercellular transfer of DNA via membrane blebs of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. Vol. 171. P. 2499 -2505.
128. Doyle R.J., Chaloupka J. and Vinter V. 1988. Turnover of cell walls in microorganisms. Microbiol. Rev. Vol. 52. P. 554-567.
129. Doyle R.J. and Koch A.L. 1987. The function of autolysins in the growth and division of Bacillus subtilis. Crit. Rev. Microbiol. Vol. 15. P. 169-222.
130. Driessen A. 1993. Sec A, the peripheral subunit of the Escherichia coli precursor protein translocase, is functional as a dimer. Bichemistry. Vol. 32. P. 13190 13197.
131. Driks A. 1999. Bacillus subtilis spore coat. Microbiology and Molecular Biology Reviews. Vol. 63. P. 1-20.
132. Driks A. 2002. Maximum shields: the armor plating of the bacterial spore. Trends Microbiol. Vol. 10. P. 251-254.
133. Driks A., and Setlow P. 1999. Morphogenesis and properties of the bacterial spore. Americ. Soc. for Microbiol. Washington. D.C.
134. Drobniewski F.A. 1993. Bacillus cereus and related species. Clinical Microbiology Reviews. Vol. 6. P. 324-338.
135. Dryden M.S. 1987. Pathogenic role of Bacillus cereus in wound infections in the tropics». J. R. Soc. Med. Vol. 80. P. 480-481.
136. Duez C., Lakaye B., Houba S., Dusart J. and Ghuysen J.M. 1990. Cloning, nucleotide sequence and amplified expression of the gene encoding the extracellular metallo (Zn) DD-peptidase of Streptomyces albus G. FEMS Microbiol. Lett. Vol. 59. P. 215219.
137. Duong F., Eichler J., Price A., Leonard M.R. and Wickner W. 1997. Biogenesis of the Gram-negative bacterial envelope. Cell. Vol. 91. P. 567-573.
138. Duong F. and Wickner W. 1997b. Distinct catalytic roles of the Sec YE SecG and SecDFyajC subunits of preprotein tranlocase holoenzyme. EMBO J. Vol. 16. P. 2756 -2768.
139. Duong F. and Wickner W. 1997c. The SecDFyajC domain of preprotein translocase controls preprotein movement by regulating SecA membrane cycling. EMBO J. Vol. 16. P. 4871 -4879.
140. Economou A. 1999. Following the leader: bacterial protein export through the Sec pathway. Trends Microbiol. Vol. 7. P. 315 320.
141. Eggert U.S., Ruiz N., Falcone B.V., Branstrom A.A., Goldman R.C., Silhavy T.J. and Kahne D. 2001. Genetic basis for activity differences between vancomycin and glycolipid derivatives of vancomycin. Science. Vol. 294. P. 361 364.
142. Ehlert K., Holtje J.V. and Templin M.F. 1995. Cloning and expression of a murein hydrolase lipoprotein from Escherichia coli. Mol. Microbiol. Vol. 16. P. 761-768.
143. Engel H., Smink A.J., Van Wijngaarden L. and Keck W. 1992. Murein-metabolizing enzymes from Escherichia coli: on the existence of a second lytic transglycosylase. J. Bacterid. Vol. 175. P. 120-210.
144. Ensing J.S. and Wolf R.S. 1965. Lysis of bacterial cell walls by an enzyme isolated from Myxobacter, J.Bacteriol. Vol. 90. P. 395-402.
145. Ensing J.S. and Wolf R.S., 1966. Characterization of a small proteolytic enzyme which lyses bacterial cell walls. J. Bacteriol. Vol. 91. P. 524-534.
146. Epstein D.M. and Wensink P.C. 1988. The a-lytic protease gene of Lysobacter enzymogenes. J. Biol. Chem. Vol. 263. P. 16586-16590.
147. Evrard C., Declercq J.P. and Fastrez J. 1997. Crystallization and preliminary X-ray analysis of bacteriophage lambda lysozyme in which all tryptophans have been replaced by aza-tryptophans. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Vol. 53. P. 217 -219.
148. Fackrell H.B., Campbell G.K., Huang J.C.C., Robinson J. 1972. Evidence for a lytic enzyme produced by Bdellovibrio bacteriovorus 6-5-S. Can. J. of Microbiol. Vol.18. P. 281-287.
149. Fackrell H.B. and Robinson J. 1972. Purification and characterizayion of a lytic peptidase produced by Bdellovibrio bacteriovorus 6-5-S. Can. J. of Microbiol. Vol.19. P. 659-666.
150. Fan D.F., Beckman M.M. 1971. Mutant of Bacillus subtilis demonstrating requirement of lysis for growth. J. Bacteriol. Vol. 105. P. 629-636.
151. Fan D.P. 1970. Cell wall binding properties of the Bacillus subtilis autolysin(s). J. Bacteriol. Vol. 103. P. 488-493.
152. Fan D.P., Beckman B.E. 1973b. Structural difference between walls from hemispherical caps and partial septa of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 114. P. 790-797.
153. Fan D.P., Beckman M.M. 1972. New centrifugation technique for isolating enzymes ' from large cell structure: isolation and characterization of two Bacillus subtilis autolysins. J. Bacteriol. Vol. 109. P. 1258-1265.
154. Fan D.P. and Beckman M.M. 1973a. Micrococcus lysodeikticus bacterial wall as a substrate specific for the autolytic glycosidase of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 114. P. 804-813.
155. Farrar W.E. 1963. Serious infections due to "non-pathogenic" organisms of the genus Bacillus. Am. J. Med. Vol. 34. P. 134-141.
156. Fein J.E. 1979. Possible involvement of bacterial autolytic enzymes in flagellar morphogenesis. J. Bacteriol. Vol. 137. P. 933-946.
157. Fekkes P. and Driessen A. 1999. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol Mol Biol Rev. Vol. 63. P. 161 173.
158. Feldman S. and Pearson T.A. 1974. Fatal Bacillus cereus pneumonia and sepsis in a child with cancer. Clin. Pediatr. Vol. 13. P. 649-655.
159. Fermor T.R. and Wood D.A. 1981. Degradation of bacteria by Agaricus bisporus and other fungi. J Gen Microbiol. Vol. 126. P. 377 388.
160. Fermor T.R. and Wood D.A. 1981. Degradation of bacteria by Agaricus bisporus and other fungi. J. Gen. Microbiol. Vol. 126. P. 377-388.
161. Ferrandiz M.J., Fenoll A., Linares J. and De La Campa A. 2000. Horizontal transfer of parC and gyrA fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Streptococcus pneumoniae. Antimicrob. Agent Chemother. Vol. 44. P. 840-847.
162. Filloux A., Bally M., Ball G., Akrin M., Tommassen J. and Lazdunski A. 1990. Protein secretion in Gram negative bacteria: transport across the outer membrane involved common mechanism in different bacteria. J EMBO. Vol. 9. P. 4323 - 4329.
163. Filloux A., Hachari A. and Bleves S. 2008. The bacterial typy VI secretion mashine: yet another player for protein transport across membranes. Microbiology. Vol. 154. P. 1570-1583.
164. Fischer W. 1994. Lypoteichoic acids and lipoglycans. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds). Elsevier Science B.V., Amsterdam, Netherlands. P. 199-216.
165. Fives-Taylor P.M., Meyer D.H., Mintz K.P. and Brissette C. 2000. Virulence factors of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Periodontol. Vol. 20. P. 136 167.
166. Fleming A. 1922. On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions. Proc. Royal Soc. (London, ser. B). Vol. 93. P. 306-317.
167. Folman, L. B., J. Postma, and J. A. van Veen. 2003. Characterisation of Lysobacter enzymogenes (Christensen and Cook 1978) strain 3.1 T8, a powerful antagonist of fungal diseases of cucumber. Microbiological Research. Vol. 158. P. 107-115.
168. Formanek M., Formanek K.S. and Wawra H. 1974. A three-dimensional atomic model of the murein layer of bacteria. Eur. J. Biochem. Vol. 46. P. 279-294.
169. Formanek M., Schleifer R.H., Seidle H.P., Lindemann R. and Zundel G. 1976. Three-dimensional structure of peptidoglycan of bacterial cell walls: infrared investigation. FEBS Lett. Vol. 70. P. 150-154.
170. Forsberg C.W. and Rogers H.J. 1974. Characterization of Bacillus licheniformis 6346 mutants with have altered lytic enzymes activities. J. Bacteriol. Vol. 118. P. 358-368.
171. Foster S.J. 1992. Analysis of the autolysins of Bacillus subtilis 168 during vegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J. Bacteriol. Vol. 174. P. 464-470.
172. Foster S.J. 1994. The role and regulation of cell wall structural dynamics during differentiation of endospore-forming bacteria. J. Appl. Bacteriol. Vol. 76. P. 25-39.
173. Fotiadis D., Scheuring S., Muller S.A., Engel A., and Muller D.J. 2002. Imaging and manipulation of biological structures with the AFM. Micron. Vol. 33. P. 385-397.
174. Franco-Paredes C., Rodriguez-Morales A. and Santos-Preciado J.I. 2005. Bioterrorism agents: getting ready for the unthinkable. Rev. Invest. Clin. Vol. 57. P. 695-705.
175. Fricchione L.F., Sepkowitz D.V., Gradon J.D., and Berkowitz L.B. 1991. Pericarditisdue to Bacillus cereus in an intravenous drug user. Rev. Infect. Dis. Vol. 13. P. 774.179
176. Friedlander M., Pittman R. and Parker G.W. 1999. Anthrax Vaccine, evidence for safety and efficiacy against inhalational anthrax. J. Am. Med. Assoc. Vol. 282. P. 2104-2106.
177. Funada H., Machi T., and Matsuda T. 1991. Bacillus cereus pneumonia with empyema complicating aplastic anaemia a case report. J. Japn. Assoc. Infect. Dis. Vol. 65. P. 477-480.
178. Galan J.E. and Collmer A. 1999. Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. Vol. 284. P. 1322 1328.
179. Gamazo C. and Moriyon I. 1987. Release of outer membrane fragments by exponentially growing Brucella melitensis cells. Infect Immun. Vol. 55. P. 609 615.
180. Gankema H., Wensink J., Guinee P.A., Jansen W.H. and Witholt B. 1980. Some characteristics of the outer membrane material released by growing enterotoxigenic Escherichia coli. Infect Immun. Vol. 29. P. 704 713.
181. Geller B. 1991. Energy requirements for protein translocation across the Escherichia coli inner membrane. Mol Microbiol. Vol. 5. P. 2093 2098.
182. Gentschev I., Dietrich G. and Goebel W. 2002. The E. coli alpha-hemolysin secretion system and its use in vaccine development. Trends Microbiol. Vol. 10. P. 39-45.
183. Gerhardt P. and Marquis R.E. 1989. Spore thermoresistance mechanisms. In: I. Smith, R.A. Slepecky, and P. Setlow (ed.), Regulation of procaryotic development. Amer. Soc. Microbiol. Washington. D.C. P. 43-63.
184. Gerhardt P. and Ribi E. 1964. Ultrastructure of the exosporium enveloping spore of Bacillus cereus. J. Bacteriol. Vol. 88. P. 1774-1789.
185. Ghuysen J.M. 1968. Use of bacteriolytic enzymes in determination of wall structure and they role in cell metabolism. Bacteriol. Rev. Vol. 32. P. 425-464.
186. Ghuysen J.M. 1991. Serine beta-lactamases and penicillin-binding proteins. Annu. Rev. Microbiol. Vol. 45. P. 37-67.
187. Ghuysen J.M., and R. Hakenbeck (ed.). 1994. Bacterial cell wall. Elsevier, Amsterdam, Netherlands. 569 P.
188. Ghuysen J.M., Brasseur J.L., Joris B.and Shockman G.D. 1994. Binding site-shaped repeated sequences of bacterial wall peptidoglycan hydrolases. FEBS Lett. Vol. 342. P. 23-28.
189. Ghuysen J.M., Tipper D.T. and Strominger J.L. 1966. Enzymes that degrade bacterial cell wall. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P. and Kaplan N.O., eds) Acad. Press. New York Vol. 8. P. 685-699.
190. Giesler, L. J., and G. Y. Yuen. 1998. Evaluation of Stenotrophomonas maltophilia strain C3 for biocontrol of brown patch disease. Crop Protection. Vol. 17. P. 509-513.
191. Gigantelli J.W., Gomez J.T. and Osato M.S. 1991. In vitro susceptibilities of ocular Bacillus cereus isolates to clindamycin, gentamicin, and vancomycin alone or in combination. Antimicrob. Agents Chemother. Vol. 35. P. 201-202.
192. Gilmore M.E., Bandyopadhyay D., Dean A.M., Linnstaedt S.D. and Popham D.L. 2004. Production of muramic delta-lactam in Bacillus subtilis spore peptidoglycan. J. Bacteriol. Vol. 186. P. 80-89.
193. Glauner B. and J.-V. Holtje. 1990. Growth pattern of the murein sacculi of Escherichia coli. J. Biol. Chem. Vol. 263. P. 18988-18996.
194. Goodell E.W. 1985. Recycling of murein by Escherichia coli. J. Bacteriol. Vol. 163. P. 305-310.
195. Goodwin S.D. and Shedlarski J.C. 1975. Purification of cell wall peptidoglycan of dimorphic bacterium Caulobacter crescentus. Arch. Biochem. Biophys. Vol. 170. P. 23-36.
196. Grass S. St. Geme J.W. III. 2000. Maturation and secretion of the non-typable Haemophilus influenzae HMW1 adhesin: roles of the N-terminal and C-terminal domains. Mol Microbiol. Vol. 36. P. 55 67.
197. Green B.D., Battisti L., Koehler T.M., Thorne C.B. and Ivins B.E. 1985. Demonstration of capsule plasmid in Bacillus anthracis. Infect. Immun. Vol. 49. P. 291-297.
198. Grenier D. and Mayrand D. 1987. Functional characterization of extracellular vesicles produced by Bacteroides gingivalis. Infect Immun. Vol. 55. P. 111-117.
199. Groicher K.H., Firek B.A., Fujimoto D.F. and Bayles K.W. 2000. The Staphylococcus aureus lrg AB operon modulates murein hydrolase activity and penicillin tolerance. J. Bacterid. Vol. 182. P. 1794-1801.
200. Hachisuka, Y. and S. Kozuka. 1981. A new test of differentiation of Bacillus cereus and Bacillus anthracis based on the existence of spore appendages. Microbiol. Immunol. Vol. 25. P. 1201-1207.
201. Hachisuka, Y., S. Kozuka, and M. Tsujikawa. 1984. Exosporia and appendages of spores of Bacillus species. Microbiol. Immunol. Vol. 28. P. 619-624.
202. Hacker J. and Kaper J.B. 2000. Pathogenicty islands and the evolution of microbes. Annu Rev Microbiol. Vol. 54. P. 641 79.
203. Hara S. and Matsushima I. 1972. Stadies on the substrate specificity of egg white lysozyme. A comparative study of the substrate specificity of lysozyme from different sources. J. Biochem. Vol. 72. P. 993-1000.
204. Hase S. and Matsushima I. 1977. The structure of the branching point between acidic polysaccharide and peptidoglycan in Micrococcus lysodeikticus cell wall. J. Biochem. Vol. 81. P. 1181-1186.
205. Hash J.H., Wishnick M., Miller P.A. 1964. Formation of «protoplasts» of Staphylococcus aureus with a fungal N-acetylhexosaminidase. J. Bacteriol. Vol. 87. P. 432-437.
206. Haska I. 1972. Purification and properties of lytic enzymes from Myxococcus virescenens. Physiol. Plant. Vol. 27. P. 139-142.
207. Heidrich C., Ursinus A., Berger J., Schwarz H. and Holtje J.V. 2002. Effects of multyple deletions of murein hydrolases on viability, septum cleavage and sensitivity to large toxic molecules in Escherichia coli. J. Bacteriol. Vol. 184. P. 6093-6099.
208. Hendersen T.A., Templin M. and Young K.D. 1995. Indntification and cloning of the gene encoding penicillin-binding protein 7 of Escherichia coli. J. Bacterid. Vol. 177. P. 2074-2079.
209. Henderson I.R. and Nataro J.P. 2001. Virulence functions of autotransporter proteins. Infection and Immunity. Vol. 69. P. 1231 1243.
210. Henrickson K.J. 1990. A second species of Bacillus causing primary cutaneous disease. Int. J. Dermatol. Vol. 29. P. 19-20.
211. Henry L. 2001. Inhalational Anthrax: Threat, Clinical Presentation, and Treatment. J. Am. Acad. Nurse Pract. Vol. 13. P. 164-168.
212. Higgins M.L., Pooley H.M. and Shockman G.D. 1970. Site of initiation of cellular autolysis in Streptococcus faecalis as seen by electron microscopy. J. Bacteriol. Vol. 103. P. 504-512.
213. Hiragi, Y. 1972. Physical, chemical and morphological studies of spore coat of Bacillus subtilis. J. Gen. Microbiol. Vol. 72. P. 87-99.
214. Hoekstra D., van der Laan J.W., de Leij L. and Witholt B. 1976. Release of outer membrane fragments from normally growing Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. Vol. 455. P. 889-899.
215. Holtje J.V. 1975. Novel type of murein transglycosylase in Escherichia coli. J. Bacteriol. Vol. 124. P. 1067-1076.
216. Holtje J.V. 1995. From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli. Arch. Microbiol. Vol. 164. P. 243-254.
217. Holtje J.-V. and Tuomanen E.I. 1991. The murein hydrolases of Escherichia coli: properties, function and impact on the course of infection in vivo. J. Gen. Microbiol. Vol. 137. P. 441-454.
218. Holtje J.V. 1998. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. Vol. 62. P. 181-203.
219. Holtje J.V. and Glauner B. 1990. Structure and metabolism of the murein sacculus. Res. Microbiol. Vol. 141. P. 75-89.
220. Holtje J.V. and Tomasz A. 1975. Lypoteichoic acid: a specific inhibition of autolysin in Pneumococcus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Vol. 72. P. 1690-1694.
221. Hooper D.C. 2001. Emerging mechanisms of fluoroquinolone resistance. Emerg. Infect. Dis. Vol. 7. P. 337-341.
222. Horstman A.L. and Kuehn M.J. 2000. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. Vol. 275. P. 12489 12496.
223. Huang J.Z. and Schell M.A. 1990. Evidence that extracellular export of the endoglucanase encoded by egl Pseudomonas solanacearum occurs by a two-step process involving a lipoprotein intermediate. J. Biol. Chem. Vol. 265. P. 1162811632.
224. Huang J.Z. and Schell M.A. 1992. Role of the two component leader sequence and mature acid sequences in extracellular export of endoglucanase EGL from Pseudomonas solanacearum. J. Bacteriol. Vol. 174. P. 1314-1323.
225. Hull M.E. 1974. Studies on milk proteins. II. Colorimetric determination of the partial hydrolysis of the proteins in milk. J Diary Sci. Vol. 30. P. 881 884.
226. Imae Y. and Strominger J.L. 1976. Relationship between cortex content and properties of Bacillus sphaericus spores. J. Bacteriol., Vol. 126. P. 907-913.
227. Imoto N, Jonson LN, North FCN, Phillips DC and Rupley GA. 1972. Vertebrate lysozim. In The Enzymes (Bayer PD, ed). 3-rd.ed. 7. Acad. Press. New York. P. 665868.
228. Inglesby T.V. 2002. Anthrax as a biological weapon. Updated recommendations for management. J. Am. Med. Assoc. Vol. 287. P. 2236-2252.
229. Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G. 1999. Anthrax as a biological weapon: medical and public health management. J. Am. Med. Assoc. Vol. 281. P. 1735-1745.
230. Irhuma A., Gallagher J., Hackett T.J. and McHale A.P. 1991. Studies on N-acetylglucosaminidase activity produced by Streptomyces hydroscopicus. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1074. P. 1-5.
231. Ishikawa S., Hara Y., Ohnishi R. and Sekiguchi J. 1998. Regulation of a new cell wall hydrolase gene cwlF, which affects cell separation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 180. P. 2549-2555.
232. Iversen O.J. and Grov A. 1973. Studies of lysostaphin. Separation and characterization on three enzymes. Eur. J. Biochem. Vol. 38. P. 293-300.
233. Jacob-Dubuisson F., Locht C. and Antoine R. 2001. Two-partner secretion in Gramnegative bacteria: a thrifty, specific partway for large virulence proteins. Mol. Microbiol. Vol. 40. P. 306 313.
234. Jaruratanasirikul S., Kalnauwakul S., and Lekhakula A. 1987. Traumatic wound infection due to Bacillus cereus in an immunocompromised patient: a case report. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. Vol. 18. P. 112-114.
235. Jenkinson, H.F., W.D. Sawyer, and J. Mandelstam. 1981. Synthesis and order of assembly of spore coat proteins in Bacillus subtilis. J. Gen. Microbiol. Vol. 123. P. 116.
236. Jenson H.B., Levy S.R., Duncan C., and Mcintosh S. 1989. Treatment of multiple brain abscesses caused by Bacillus cereus. Pediatr. Infect. Dis. J. Vol. 8. P. 795-798.
237. Jochum, C. C., L. E. Osborne, and G. Y. Yuen. 2006. Fusarium head blight biological control with Lysobacter enzymogenes. Biological Control. Vol. 39. P. 336-344.
238. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. 1996. Bacteriolytic effect of membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa on other bacteria including pathogens: Conceptually new antibiotics. J. Bacteriol. Vol.178. P. 2767 2774.
239. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. 1997. Natural release of virulence factors in membrane vesicles by Pseudomonas aeruginosa and the effect of aminoglycoside antibiotics on their release. J. Antimicrob Chemother. Vol.40. P. 615 621.
240. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. 1998. Delivery of the non-membrane-permeative antibiotic gentamicin into mammalian cells by using Shigella flexneri membrane vesicles. Antimicrob. Agents Chemother. Vol. 42. P. 1476 1483.
241. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. 1999. Membrane vesicles derived from Pseudomonas aeruginosa and Shigella flexneri can be integrated into the surfaces of other Gram-negative bacteria. Microbiology. Vol. 145. P. 2051 2060.
242. Kadurugamuwa J.L., Mayer A., Messner P., Sara M., Sleytr U.B. and Beveridge T.J. 1998. S-layered Aneurinibacillus and Bacillus spp. are susceptible to the lytic action of Pseudomonas aeruginosa membrane vesicles. J. Bacteriol. Vol. 180. P. 2306 -2311.
243. Kaneko T., Nozaki R., and Aizawa K. 1978. Deoxyribonucleic acid relatedness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Microbiol. Immunol. Vol. 22. P. 639-641.
244. Kariyama R., Shockman G.D. 1992. Extracellular and cellular distribution of muramidase-2 and muramidase-1 of Enterococcus hirae ATCC 9790. J. Bacteriol. Vol. 174. P. 3236-3241.
245. Karkhanish Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J.J. and Carlo D.J. 1978. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gramnegative bacteria. Anal Biochem. V. 85. P. 595 601.
246. Kato K., Matsubara T., Mori J. and Kotani S. 1960. «Protoplasts» formation in Staphylococcus aureus using the lytic enzyme produced by a Flavobacterium. Biken'S J. Vol. 3. P. 201-203.
247. Kato K., Umemoto T., Fukuhara H., Sagawa H. and Kotani S. 1981. Variation in dibasic amino acid in the wall peptidoglycan of bacteria of genus Fusobacterium. FEMS Microbiol. Lett. Vol. 10. P. 81-85.
248. Kato S., Kowashi Y. and Demuth D.R. 2002. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microb. Pathog. Vol. 32. P. 1-13.
249. Kawata S., Takemura T., Takase Y. and Yokogawa K. 1984. Purification and characterization of N-acetyl-muramyl-L-alanine amidase from Streptomyces globisporus 1829. Agr. Biol. Chem. Vol. 48. P. 261-269.
250. Keck W., Van Leeuwen A.M., Leuber M. and Goodell E.W. 1990. Cloning and characterization of mep A, the structural gene of the penicillin-insensitive murein hydrolase from Escherichia coli. Mol. Microbiol. Vol. 4. P. 209-219.
251. Keenan J., Day T., Neal S., Cook B., Perez-Perez G., Allardyce R. and Bagshaw P. 2000. A role for the bacterial outer membrane in the pathogenesis of Helicobacter pylori infection. FEMS Microbiol. Lett. Vol. 182. P. 259 264.
252. Kehoe M.A. 1994. Cell-wall-associated proteins in Gram-positive bacteria. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell-wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 217-261.
253. Kessler F. 1995. P-Lytic endopeptidases. In: Methods in Enzymol (eds). Acad. Press. NY. Vol. 248. P. 740-756.
254. Kesty N.C. and Kuehn M.J. 2004. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. Vol. 279. P. 2069-2076.
255. Kesty N.C., Mason K.M., Reedy M., Miller S.E. and Kuehn M.J. 2004. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. Vol. 23. P. 4538 4549.
256. Khandelwal P. and Banerjee-Bhatnagar N. 2003. Insecticidal activity associated with the outer membrane vesicles of Xenorhabdus nematophilus. Appl Environ Microbiol. Vol. 69. P. 2032 2037.
257. Kilic-Ekici, O., and G. Y. Yuen. 2003. Induced resistance as a mechanism of biological control by Lysobacter enzymogenes strain C3. Phytopathology. Vol. 93. P. 1103-1110.
258. Kilic-Ekici, O., and G. Y. Yuen. 2004. Comparison of strains of Lysobacter enzymogenes and PGPR for induction of resistance against Bipolaris sorokiniana in tall fescue. Biological Control. Vol. 30. P. 446-455.
259. Kim S.Y., Ohk S.H., Bai D.H. and Yu J.H. 1999. Purification and properties of bacteriolytic enzymes from Bacillus licheniformis YS-1005 against Streptococcus mutants. Bioscience biotechnology and biochemistry. Vol. 63. P. 73-77.
260. Kim H., R.M. Garavito, and R. Lai. 2000. Atomic force microscopy of the three-dimensional crystal of membrane protein, OmpC porin. Coll. Surf. B: Biointerfaces. Vol. 19. P. 347-355.
261. Klauser T., Pohlner J., Meyer T.F. 1992. Selective extracellular release of cholera toxin B subunit by Escherichia colv. dessection of Neisseria Ig Ab-mediated outer membrane transport. J EMBO. Vol.11. P. 2327 2335.
262. Klobutcher L.A., Ragkousi K. and Setlow P. 2006. The Bacillus subtilis spore coat provides «eat resistance» during phagocytic predation by the protozoan Tetrahymena thermophila. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 103, p. 165-170.
263. Kobayashi H., Uematsu K., Hirayama H. and Horikoshi K. 2000. Novel toluene elimination system in a toluene-tolerant microorganism. J Bacteriol. Vol. 182. P. 6451 -6455.
264. Kobayashi, D. Y., and G. Y. Yuen. 2005. The role of clp-regulated factors in antagonism against Magnaporthe poae and biological control of summer patch disease of Kentucky bluegrass by Lysobacter enzymogenes C3. Can. J. Microbiol. Vol. 51. P. 719-23.
265. Koch A.L. 1982. On the growth and form of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. Vol. 128. P.2527-2540.
266. Koch A.L. 1985. Primeval cells: possible energy-generating and cell-division mechanisms. J. Mol. Evol. Vol. 21. P. 270-277.
267. Koch A.L. 1988. Biophysics of bacterial wall viewed as a stress-bearing fabric. Microbiol. Rev. Vol. 52. P. 337-353.
268. Koch A.L. 1995. Bacterial growth and form. Chapman and Hall. New York. 385 P.188
269. Koch A.L. 2000. The exoskeleton of bacterial cells (the sacculus): still a highly specific target for antibacterial agents that will last for a long time. Crit. Rev. Microbiol. Vol. 25. P. 275-307.
270. Koch A.L. 20006. Simulation of the conformation of the murein fabric. I. The oligoglycan, penta-muropeptide, and crosslinked nona-muropepetide. Arch. Microbiol. Vol. 174. P. 429-439.
271. Koch A.L. 2001. Bacterial growth and form, 2nd ed. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht. Netherlands.
272. Koch A.L. 2003. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. Vol. 16. P. 673-687.
273. Koch A.L., and R.J. Doyle. 1985. Inside-to-outside growth and the turnover of the Gram-positive rod. J. Theor. Biol. Vol. 117. P. 137-157.
274. Koch A.L., and R.J. Doyle. 1986. The growth strategy of the Gram-positive rod. FEMS Microbiol. Rev. Vol. 32. P. 247-254.
275. Koch A.L., M.L. Higgins, and R.J. Doyle. 1981. Surface tension-like forces determine bacterial shapes: Streptococcus faecium J. Gen. Microbiol. Vol. 123. P. 151-161.
276. Kohlrausch U. and Holtje J.V. 1991. Murein and murein precursor analysis during antiobiotic-induced lysis of Escherichia coli. J. Bacteriol. Vol. 173. P. 3425-3431.
277. Kolling G.L. and Matthews K.R. 1999. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli 0157:H7. Appl Environ Microbiol. Vol. 65. P. 1843- 1848.
278. Komatsuzawa H., Sugai M., Nakashima S. and Suginaka H. 1995. Alteration of bacteriolytic enzymes profile of Staphylococcus aureus during growth. Microbiol. Immunol. Vol. 39. P. 629-633.
279. Komatsuzawa H., Sugai M., Nakashima S., Yamada A., Matsumoto T., Oshida T., Suginaka H. 1997. Subcelullar localization of the major autolysin ATL and its processed proteins in Staphylococcus aureus. Microbiol. Immunol. Vol 41. P. 469479.
280. Kondo K., Takade A. and Amako K. 1993. Release of the outer membrane vesicles from Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus. Microbiol Immunol. Vol. 37. P. 149- 152.
281. Korat B., Motll H. and Keck W. 1991. Penicillin-binding protein 4 of Escherichia colt molecular cloning of the dac B gene, controlled overexpression and alterations in murein composition. Mol. Microbiol. Vol. 5. P. 675-684.
282. Kornberg A. 1966. Lactic dehydrogenes. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P., Kaplan, N.O., eds). Acad. Press. New York. Vol.2. P. 441-443.
283. Kornberg A., Horecker B.L. 1955 Glucose-6-phosphate dehydrogenase. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P., Kaplan, N.O., eds). Acad. Press. New York. Vol. 2. P. 323-325.
284. Kornberg, A., J.A. Spudich, D.L. Nelson, and M. Deutscher. 1968. Origin of proteins in sporulation. Ann. Rev. Biochem. Vol. 37. P. 51-78.
285. Koronakis V, Koronakis E, Hughes C. 1989. Isolation and analysis of the C-terminal signal directing export of Escherichia coli hemolysin protein across both bacterial membranes. EMBO J. Vol. 8. P. 595 605.
286. Kostakioti M., Newman C.L., Thanassi D.G. and Stathopoulos C. 2005. Mechanisms of Protein Export across the Bacterial Outer Membrane. J Bacterid. Vol. 187. P. 4306 -4314.
287. Kozuka, S., and K. Tochikubo. 1985. Properties and origin of filamentous appendages on spores of Bacillus cereus. Microbiol. Immunol. Vol. 29. P. 21-37.
288. Kuehn M.J. and Nicole C. and Kesty N.C. 2005. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Develop. Vol. 19. P. 2645 2655.
289. Kulakauskas S., Wikstrom P.M. and Berg D.E. 1991. Efficient introduction of cloned mutant alleles into the Esherichia coli chromosome. J. Bacteriol. Vol. 173. P. 26332638.
290. Kulp A. and Kuehn M.J. 2010. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Ann. Rev. Microbiol. Vol. 64. P. 163-184.
291. Kumamoto C. and Beckwith J. 1985. Evidence for specificity at an early step in protein export in Escherichia coli. J Bacteriol. Vol. 163. P. 267 274.
292. Kuroda A. and Sekiguchi J. 1990. Cloning, sequencing and genetic mapping of a Bacillus subtilis cell wall hydrolase gene. J. Gen. Microbiol. Vol. 136. P. 2209-2216.
293. Kuroda A. and Sekiguchi J. 1991. Molecular cloning and sequencing of a major Bacillus subtilis autolysins gene. J. Bacteriol. Vol. 173. P. 7304-7312.
294. Kuroda A., Sugimoto Y., Funahashi T. and Sekiguchi J. 1992. Genetic structure, isolation and characterization of a Bacillus licheniformis cell wall hydrolases. Mol. Gen. Genet. Vol. 234. P. 129-137.
295. Kusukawa N., Yura T., Ueguchi C., Akiyama Y. and Ito K. 1989. Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBO J. Vol. 8. P. 3517 3521.
296. Kuwana R., Kasahara Y., Fujibayashi M., Takamatsu H., Ogasawara N., and Watabe K. 2002. Proteomic characterization of novel spore proteins of Bacillus subtilis. Microbiology. Vol. 148. P. 3971-3982.
297. Labischinski H. and Maidhof H. 1994. Bacterial peptidoglycan: overview and evolving concepts. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell-wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds) Elsevier Science B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 23-28.
298. Ladant D. and Ullmann A. 1999. Bordetella pertussis adenylate cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Microbiol. Vol. 7. P. 172-176
299. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature. Vol. 277. P. 680-685.
300. Lai E.-M., Phadke N.D., Kachman M.T., Giorno R., Vazquez S., Vazquez J.A., Maddock J.R., and Driks A. 2003. Proteomic analysis of the spore coats of Bacillus subtilis and Bacillus anthracis. J. Bacterid. Vol. 185. P. 1443-1454.
301. Lambert P.A. 1998. Enterobacteriaceae: composition, structure and function of cell envelope. J. Appl. Bacteriol. Vol. 65. P. 21S 34S.
302. Lambert-Buisine C., Willery E., Locht C., Jacob-Dubuisson F. 1998. N-terminal characterization of the Bordetella pertussis filamentous haemagglutinin. Mol Microbiol. Vol. 28. P. 1283 1293.
303. Lederer E., Adam A., Ciorbaru R., Petit J.F. and Wietzerbin J. 1975. Cell walls of mycobacteria and related organisms: chemistry and immunostimulant properties. Mol. Cell Biochem. Vol. 7. P. 87-104.
304. Lee V.T. and Schneewind O. 2001. Protein secretion and the pathogenesis of bacterial infections. Genes Dev. Vol. 15. P. 1725 1752.
305. Lee, J. W., W. T. Im, M. K. Kim, and D. C. Yang. 2006. Lysobacter koreensis sp. nov., isolated from a ginseng field. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 56. P.231-5.
306. Lee, M. S., J. O. Do, M. S. Park, S. Jung, K. H. Lee, K. S. Bae, S. J. Park, and S. B.
307. Kim. 2006. Dominance of Lysobacter sp. in the rhizosphere of two coastal sand dune191plant species, Calystegia soldanella and Elymus mollis. Antonie Van Leeuwenhoek. Vol. 90. P. 19-27.
308. Leff A., Jacobs R., Gooding V., Hauch J., Conte J., and Stulbarg M. 1977. Bacillus cereus pneumonia. Survival in a patient with cavitary disease treated with gentamicin. Am. Rev. Respir. Dis. Vol. 115. P. 151-154.
309. Leighton T.J., and Doi R.H. 1971. The stability of messenger ribonucleic acid during sporulation in Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. Vol. 254. P. 3189-3195.
310. Lew D.P. 1995. Bacillus anthracis (Anthrax). In: Mandell G.L., Bennett J.E., Dolin R. Principles and practice of infectious diseases. P. 1885-1889.
311. Lewis J.C., Snell N.S., and Burr H.K. 1960. Water permeability of bacterial spores and the concept of a contractile cortex. Science. Vol. 132. P. 544-545.
312. Leyh-Bouille M., Ghuysen J.M., Tripper D.J. and Strominger J.L. 1966. Structure of the cell wall of Micrococcus lysodeikticus I. Study of the structure of the glycan. Biochemistry. Vol.10. P. 3079-3090.
313. Li S.L., Norioka S. and Sakiyama F. 1998. Bacteriolytic activity and specificity of Achromobacter a-lytic protease. J Biochem. Vol. 124. P. 332-339.
314. Li S.L., Norioka S. and Sakiyama F. 2000. Purification, characterization, and primary structure of a novel cell wall hydrolytic amidase, Cwha, from Achromobacter lyticus. J Biochem. Vol. 127. P. 1033-1039.
315. Li S., Norioka S., and Sakiyama F. 1997. Purification, staphylolytic activity, and cleavage sites of alpha-lytic protease from Achromobacter lyticus. J. Biochem. (Tokyo). Vol. 122. P. 772-778.
316. Li S.L., Norioka S. and Sakiyama F. 1990. Molecular cloning and nucleotide sequence of the beta-lytic protease grne from Achromobacter lyticus J Bacteriol. Vol. 172. P. 6506.
317. Li Z., Clarke A. and Beveridge T.J. 1996. A major autolysin of Pseudomonas aeruginosa: Subcellular distribution, potential role in cell growth and division and secretion in surface membrane vesicles. J Bacteriol. Vol. 178. P. 2479 2488.
318. Li Z., Clarke A. and Beveridge T.J. 1998. Gram-negative bacteria produce membrane vesicles which are capable of killing other bacteria. J Bacteriol. Vol. 180. P. 54785483
319. Lightfoot N.F., Scott R.J. and Turnbill P.C. 1990. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anthracis. Salisbury Med. Bull. Vol. 68. P. 95-98.
320. Likhosherstov L.M., Senchenkova S.N., Knirel Y.A., Shashkov A.S., Shibaev V.N., Stepnaya O.A., and Kulaev I.S. 1995. Structure of an acidic polysaccharide present in the bacteriolytic complex lysoamidase. FEBS Lett. Vol. 368. P. 113-116.
321. Linderoth N.A., Simon M.N. and Russel M. 1997. The filamentous phage plV multimer visualized by scanning transmission electron microscopy. Science. Vol. 278. P. 1635 1638.
322. Lindsay B., Glaser L. 1976. Characterization of the N-acetylmuramic acid L-alanine amidase from Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 127. P. 803-811.
323. Loeb M.R. and Kilner J. 1978. Release of a special fraction of the outer membrane from both growing and phage T4-infected Escherichia coli B. Biochim Biophys Acta. Vol. 514. P. 117-127.
324. Logan S.M. and Trust T.J. 1982. Outer membrane characteristics of Campylobacter jejuni. Infect Immun. Vol. 38. P. 898 906.
325. Lopez R., Garcia E., Garcia O. and Garcia J.P. 1997. The pneumococcal cell wall degrading enzymes: a modular design to create new lysins? Microb. Drug Resist. Vol. 2. P. 199-211.
326. Low L.Y., Yang C., Perego M., Osterman A. and Liddington R.C. 2005. Structure and lytic activity of a Bacillus anthracis prophage endolysin. J. Biol. Chem. Vol. 280. P. 35433-35439.
327. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. Vol. 193. P. 265-275.
328. Lueders, T., R. Kindler, A. Miltner, M. W. Friedrich, and M. Kaestner. 2006. Identification of bacterial micropredators distinctively active in a soil microbial food web. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 72. P. 5342-5348.
329. Malkin, A.J., A. McPherson, and P.D. Gershon. 2003. Structure of intracellular mature vaccinia virus visualized by in situ AFM. J. Virol. Vol. 77. P. 6332-6340.
330. Malkin, A.J., M. Plomp, and A. McPherson. 2004. Unravelling of the architecture of human viruses by high-resolution atomic force microscopy. In: Methods in Molecular
331. Biology: DNA Viruses: Methods and Protocols. P.M. Lieberman, editor. Humana Press. Totowa. NJ. P. 85-108.
332. Margot P., Mauel C. and Karamata D. 1994. The gene of the N-acetylglucosamidase, a Bacillus subtilis 168 cell wall hydrolase not involved in vegetative cell wall autolysis. Mol. Microbiol. Vol. 144. P. 535-545.
333. Margot P., Pagni M. and Karamata D. 1999. Bacillus subtilis 168 gene lyt F encodes a y-D-glutamate-meso-diaminopimelate muropeptidase expressed by the alternative gevetative sigma factor, aD. Microbiology. Vol. 145. P. 57-65.
334. Margulis, L., J.Z. Jorgensen, S. Dolan, R. Kolchinsky, F.A. Rainey, and S.C. Lo. 1998. The Arthromitus stage of Bacillus cereus: intestinal symbionts of animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95. P. 1236-1241.
335. Matz L.L., Beaman T.C., and Gerhardt P. 1970. Chemical composition of exosporium from spores of Bacillus cereus. J. Bacteriol. Vol. 101. P. 196-201.
336. Mauk J. and Glaser L. 1970. Turnover of the cell wall of Bacillus subtilis W-23 during logariphmic growth. Biochem. Byophys. Res. Commun. Vol. 39. P. 699-706.
337. Mauk K., Chan L. and Glaser L. 1971. Turnover of the cell wall of gram-positive bacteria. J. Biol. Chem. Vol. 246. P. 1820-1827.
338. Mayrand D. and Grenier D. (1989). Biological activities of outer membrane vesicles. Can J Microbiol. Vol. 35. P. 607 613.
339. McDowell T.D. and Lemanski C.L. 1988. Absence of autolytic activity (peptidoglycan nicking) in penicillin-induced nonlytic death in a group a Streptococcus. J. Bacteriol. Vol. 170. P. 1783-1788.
340. McLaughlan A.M. and Foster S.J. 1998. Molecular characterization of an autolytic amidase of Listeria monocytogenes. EGD. Micribiol. Vol. 144. P. 1359-1367.
341. McPherson, A. 1999. Crystallization of Biological Macromolecules. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. NY.
342. Meador-Parton J. and Popham D. L. 2000. Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation. J. Bacteriol. Vol. 182. P. 4491-4499.
343. Meadow P.M., Wells P.L., Salkinoja-Salonen M. and Nurmiaho E.L. 1978. The effect of lipopolysaccharide composition on the ultrastructure of Pseudomonas aeruginosa. J Gen Microbiol. Vol. 105. P. 23 28.
344. Mesnage S. and Fouet A. 2002. Plasmid-encoded autolysin in Bacillus anthracis: modular structure and catalytic properties. J. Bacteriol. Vol. 184. P. 331-334.
345. Mett H., Keck W., Funk A. and Schwarz U. 1980. Two spesies of murein transglycosylase in Escherichia coli. J. Bacteriol. Vol. 144. P.45-52.
346. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D. and Dreier T.M. 1983. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis. Infect Immun. Vol. 39. P. 371-376.
347. Mizuki, E., M. Ohba, T. Ichimatsu, S.-H. Hwang, K. Higuchi, H. Saitoh, and T. Akao. 1998. Unique appendages associated with spores of Bacillus cereus isolates. J. Basic. Microbiol. Vol. 38. P. 33-39.
348. Mock M. and Fouet A. 2001. Anthrax. Ann. Rev. Microbiol. Vol. 55. P. 647-671.
349. Model P. and Pussel M. 1990. Procaryotic secretion. Cell. Vol. 61. P. 739-741.
350. Moir A. 1981. Germination properties of a spore coat-defective mutant of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 146. P. 1106-1116.
351. Mollner S. and Braun V. 1984. Murein hydrolase (N-acetylmuramyl-L-alanine amidase) in human serum. Arch. Microbiol. Vol. 140. P. 171-177.
352. Moreillon P., Markiewicz Z., Nachman S. and Tomasz A. 1990. Two bactericidal targets for penicillin in pneumococci: autolysis-dependent and autolysis-independent killin mechanisms. Antimicrob. Agents Chemother. Vol. 34. P. 33-39.
353. Mori H. and Ito K. 2001. The Sec protein-translocation pathway. Trends Microbiol. Vol. 9. P. 494 500.
354. Mug-Opstelten D. and Witholt B. 1978. Preferential release of new outer membrane fragments by exponentially growing Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. Vol. 508. P. 287-295.
355. Muller, D., and A. Engel. 1999. Voltage and pH-induced channel closure of porin OmpF visualized by atomic force microscopy. J. Mol. Biol. Vol. 285. P. 1347-1351.
356. Munoz E., Ghuysen J.M., Leyh-Bouille M., Petit J.F., Tinelli R. 1966. Structural variation in bacterial ceel wall peptidoglycans studied with Streptomyces F1 endo-N-acetylmuramidase. Biochemistry. Vol. 5. P. 3091-3098.
357. Murao S. and Takahara G. 1973. Lytic enzymes for gram-negative bacteria produced by Bacillus subtilis YT-25. Agr. Biol. Chem. Vol. 37. P. 2671-2673.
358. Murrell W.G. 1969. Chemical composition of spores and spore structures. In: G.W. Gould and A. Hurst (ed.). The bacterial spore. Academic Press. Inc. New York. P. 215-273.
359. Naclerio, G., L. Baccigalupi, R. Zilhao, M. De Felice, and E. Ricca. 1996. Bacillus subtilis spore coat assembly requires cotH gene expression. J. Bacteriol. Vol. 178. P. 4375-4380.
360. Nakashio S., and Gerhardt P. 1985. Protoplast dehydration correlated with heat resistance of bacterial spores. J. Bacteriol. V. 162. P. 571-578.
361. Narayanan S.K., Nagaraja T.G., Chengappa M.M. and Stewart G.C. 2002. Leukotoxins of gram-negative bacteria. Vet Microbiol. Vol. 84. P. 337 356.
362. Naumova I.B. 1988. The teichoic acids of actinomycetes. Microbiol. Sci. Vol. 5. P. 275-279.
363. Navarre W.W. and Schneewind O. 1999. Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol, and Mol. Biol. Rev. Vol. 63. P. 174-229.
364. Neu H., Heppel L.A. 1965. The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J. Biol. Chem. Vol. 240. P. 36853692.
365. Nguyen T.T., Saxena A. and Beveridge T.J. 2003. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gramnegative bacterium Pseudomonas aeruginosa. J. Electron. Microscopy (Tokyo). Vol. 52. P. 465-469.
366. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and Gunnar von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering. Vol. 10. P. 1-6
367. Nishihara, T.Y., E. Takubo, T. Kawamata, J. Koshikawa, J. Ogaki, and M. Kondo. 1989. Role of outer coat in resistance of Bacillus megaterium spore. J. Biochem. Vol. 106. P. 270-273.
368. Nossal N.G. and Heppel L.A. 1966. The release of enzymes by osmotic shock from Escherichia coli in exponential phase. J. Biol. Chem. Vol. 241. P. 3055-3062.
369. Nour, S. M., J. R. Lawrence, H. Zhu, G. D. W. Swerhone, M. Welsh, T. W. Welacky, and E. Topp. 2003. Bacteria associated with cysts of the soybean cyst nematode (Heterodera glycines). Appl. and Environ. Microbiol. Vol. 69. P. 607-615.
370. Nouwen N., Ranson N., Saibil H., Wolpensinger B., Engel A., Ghazi A. and Pugsley A.P. 1999. Secretin PulD; association with pilot PulS, structure, and ion-conducting channel formation. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 96. P. 8173 8177.
371. Nowotny A., Behling U.H., Hammond B., Lai C.H., Listgarten M., Pham P.H. and Sanavi F. 1982. Release of toxic microvesicles by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect Immun. Vol. 37. P. 151 154.
372. Obermann W., and J.-V. Holtje. 1994. Alterations of murein structure and of penicillin-binding proteins in minicells from Escherichia coli. Microbiology. Vol. 140. P. 79-87.
373. Odendaal M.W., Peterson P.M., de Vos V., Botha A.D. 1991. The antibiotic sensitivity patterns of Bacillus anthracis isolated from the Kruger National Park. Onderstepoort J. Vet. Res. Vol. 58. P. 17-19.
374. Ohbuchi K., Hasegawa K., Hamachi M., Ozeki K., Kumagai C. 2001. Isolation of a new lytic enzyme for hiochi bacteria and other lactic acid bacteria. J. Biosci. Bioeng. Vol. 91. P. 487-492.
375. Ohnishi R., Ishikawa S., Sekiguchi J. 1999. Peptidoglycan hydrolase Lyt F plays a role in cell separation with Cwl F during vegetative growth of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 181. P. 3178-3184.
376. Ohta H., Hara H., Fukui K., Kurihara H., Murayama Y. and Kato K. 1993. Association of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin with nucleic acids on the bacterial cell surface. Infect Immun. Vol. 61. P. 4878 4884.
377. Ohye D.F., and Murrell W.G. 1973. Exosporium and spore coat formation in Bacillus cereus. T. J. Bacterid. Vol. 115. P. 1179-1190.
378. Oliver D.B. and Beckwith J. 1982. Regulation of a membrane component required for protein secretion in Escherichia coli. Cell. Vol. 30. P. 311 319.
379. Ornstein L. and Devis B.J. 1964. Disc electrophoresis. I. Background and theory. Ann. N.Y. Acad. Sci. Vol. 121. P. 321-403.
380. Ou L.-T. and Marquis R.E. 1970. Electromechanical interactions in cell walls of gram-positive cocci. J. Bacteriol. Vol. 101. P. 92-101.
381. Paetzel M., Dalbey R. E. and Strynadka N. 2000. The structure and mechanism of bacterial type I signal peptidases. A novel antibiotic target. Pharmacology and Therapy. Vol. 87. P. 27 49.
382. Paidhungat M., Ragkousi K., and Setlow P. 2001. Genetic requirements for induction of germination of spores of Bacillus subtilis by Ca2+-dipicolinate. J. Bacteriol. Vol. 183. P. 4886-4893.
383. Pandey N.K., and A.I. Aronson. 1979. Properties of the Bacillus subtilis spore coat. J. Bacteriol. Vol. 137. P. 1208-1218.
384. Park J.T. 1995. Why does Escherichia coli recycle its cell wall peptides? Mol. Microbiol. Vol. 17. P. 421-426.
385. Park L.C., Shockman G.D. and Higgins M.L. 1980. Growth of Streptococcus mutants protoplast is not inhibited by penicillin. J. Bacteriol. Vol. 143. P. 1491-1497.
386. Patel N, Blackmoore N., Hillman M. and Kobayashi B. 2009. Evidence for the role of type VI secretion during Lysobacter enzymogenes pathogenesis of fungal hosts. APS Annual Meeting.
387. Paton J.C., Andrew P.W. and Boulnois G.J., Mitchell T.J. 1993) Molecular analysis of the pathogenicity of Streptococcus pneumoniae: the role of pneumococcal proteins. Annu Rev Microbiol. Vol. 47. P. 89 115.
388. Patrick C.C., Langston C., and Baker C.J. 1989. Bacillus species infections in neonates. Rev. Infect. Dis. Vol. 11. P. 612-615.
389. Patrignani P., Delmaschio A., Bazzoni G., Daffonchio L., Hernandez A., Modica R., Montesanti L., Volpi D., Patrono F. and Dejana E. 1991. Inactivation of endothelin by polymorphonuclear leukocyte-derived lytic enzymes. Blood. Vol. 78. P. 2715-2720.
390. Pearce S.M. and Fitz-James P.C. 1971. Sporulation of a cortexless mutant of a variant of Bacillus cereus. J. Bacterid. Vol. 105. P. 339-348.
391. Pettit R.K. and Judd R.C. 1992. The interaction of naturally elaborated blebs from serum-susceptible and serum-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae with normal human serum. Mol Microbiol. Vol. 6. P. 729 734.
392. Piggot P. and Losick R. 2002. Sporulation genes and intercompartmental regulation. In: A.L. Sonenshein, J.A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and its closest relatives. Amer. Soc. Microbiol. Washington. D.C. P. 483-517.
393. Pink D., Moeller J., Quinn B., Jericho M., Beveridge T.J. 2000. On the architecture of the gram-negative bacterial murein sacculus. J. Bacteriol. Vol. 182. P. 5925-5930.
394. Pittman P.R., Gibbs P.H., Cannon T.L. and Friedlander A.M. 2001. Anthrax vaccine: short-term safety experience in humans. Vaccine. Vol. 20. P. 972-978.
395. Plomp M., Leighton T.J., Wheeler K.E. and Malkin A.J. 2005. The High-Resolution Architecture and Structural Dynamics of Bacillus Spores. Biophysical Journal. Vol. 88. P. 603-608.
396. Plomp, M., Rice M.K., Wagner E.K., McPherson A. and A.J. Malkin. 2002. Rapid visualization at high resolution of pathogens by atomic force microscopy: structural studies of herpes simplex virus-1. Amer. J. Pathol. Vol. 160. P. 1959-1966.
397. Pohlner J., Langenberg U., Wolk U., Beck S.C. and Meyer T.F. 1995. Uptake and nuclear transport of Neisseria IgAl protease-associated alphaproteins in human cells. Mol Microbiol. Vol. 17. P. 1073 108.
398. Pooley H. and Karamata D. 1984a. Flagellation and the control of autolysisns in Bacillus subtilis. In: Microbial, cell wall synthesis and autilysis (Nombela C., ed.). Elsevier Sciense B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 13-19.
399. Pooley H. and Karamata D. 1984b. Genetic analysis of autolysin-deficient and agellaless mutants of Bacillus subtilis. J. Bacteriol. Vol. 160. P. 1123-1129.
400. Popham D.L. and Setlow P. 1993. The cortical peptidoglycan from spores of Bacillus megaterium and Bacillus subtilis is not highly cross-linked. J. Bacteriol. Vol. 175. P. 2767-2769.
401. Popham D.L., Gilmore M.E., and Setlow P. 1999. Roles of low-molecular-weight penicillin-binding proteins in Bacillus subtilis spore peptidoglycan synthesis and spore properties. J. Bacteriol. Vol. 181. P. 126-132.
402. Postma, J., Schilder, M.T., Bloem, J. and Van Leeuwen-Haagsma, W.K. 2008. Soil suppressiveness and functional diversity of the soil microflora in organic farming systems. Soil Biol, and Biochem. Vol. 40. P. 2394-2406.
403. Pugsley A. P. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev. Vol. 57. P. 50 108.
404. Pugsley A.P. and Scwarts M. 1985. Export and secretion of proteins by bacteria. FEMS Microbiol Rev. Vol. 32. P. 3 38.
405. Radnedge L., Agron P.G., Hill K.K., Jackson P.J., Ticknor L.O., Keim P. and Andersen G.L. 2003. Genome differences that distinguish Bacillus anthracis from Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 69. P. 2755-2764.
406. Raphael S.S., and Donaghue M. 1976. Infection due to Bacillus cereus. Can. Med. Assoc. J. Vol. 115. P. 207.
407. Redfield C. and Dobson C.M. 1990. 1H NMR studies of human lysozyme: spectral assignment and comparison with hen lysozyme. Biochemistry. V. 29(31). P.7201-14.
408. Redmond C., Baillie L.W., Hibbs S., Moir A.J. and Moir A. 2004. Identification of proteins in the exosporium of Bacillus anthracis. Microbiology. Vol. 150. P. 355-363.
409. Reevers P. 1994. Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 281-318.
410. Reisfeld R.A., Lewis U.J. and Williams D.E. 1962. Disk electrophoresis of basic protein and peptides on polyacrylamide gel. Nature. Vol. 195. P. 281.
411. Renelli M., Matias V., Lo R.Y. and Beveridge T.J. 2004. DNA-containing membrane vesicles of Pseudomonas aeruginosa PAOl and their genetic transformation potential. Microbiology. Vol. 150. P. 2161 2169.
412. Reynolds E.S. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell Biol. Vol. 17. P. 208 213.
413. Rhuland L.E., Work E., Denman R.F. and Hoare D.S. 1955. The behavior of the isomers of a,s-diaminopimelic acid on paper chromatograms. J. Amer. Chem. Soc. Vol. 77. P. 959-966.
414. Riachard V., Van der Auwera P., Snoeck R., Daneau D., and Meunier F. 1988. Nosocomial bacteremia caused by Bacillus species. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. Vol. 7. P. 783-785.
415. Rivas B., Garcia J.L., Lopez R., Garcia P. 2002. Purification and polar localization of pneumococcal LytB, a putative endo-(3-N-acetylglucosaminidase: the chain-dispersing murein hydrolase. J Bacteriol. Vol. 184. P. 4988 5000.
416. Robinnson J.M., Hardman J.K. and Sloan G.L. 1980. The characteristics of extracellular protein secretion by Staphylococcus staphylolyticus. J. Gen Microbiol. Vol. 118. P. 529-533.
417. Robinow C.F. 1953. Spore structure as revealed by thin sections. J. Bacteriol. Vol. 66. P. 300-311.
418. Roesti, D., K. Ineichen, O. Braissant, D. Redecker, A. Wiemken, and M. Aragno. 2005. Bacteria associated with spores of the arbuscular mycorrhizal fungi Glomus geosporum and Glomus constrictum. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 71. P. 66736679.
419. Rogers H.J. 1967. Killing of Staphylococci by penicillins. Nature. Vol. 213. P. 31-33.
420. Rogers H.J. and Forsberg C.W. 1971. Role of autolysins in killing of bacteria by some bacterial antibiotics. J. Bacteriol. Vol. 108. P. 1236-1243.
421. Rogers H.J., McConnell M. and Burdet G.D.J. 1970. The isolation and characterization of mutants of Bacillus licheniformis with disturbed morphology and cell division. J. Gen. Microbiol. Vol. 61. P. 155-171.
422. Rogers H.J., Pooley H.M., Thurman P.F. and Taylor C. 1974. Wall and membrane growth in Bacilli and their mutants. Ann. Microbiol. Vol. 125. P. 135-147.
423. Rogers H.J., Taylor C., Rayter S. and Ward J.B. 1984. Purification and properties of an autolytic endo-p-glucosaminidase and the N-acetylmuramyl-L-alanine amidase from Bacillus subtilis strain 168. J. Gen. Microbiol. Vol. 130. P. 2395-2402.
424. Romanenko, L.A., Uchino, M., Tanaka, N., Frolova, G.M. and Mikhailov, V.V. 2008. Lysobacter spongiicola sp. nov., isolated from a deep-sea sponge. Int. J. of Syst. and Evol. Microbiol. Vol. 58. P. 370-374.
425. Sabra W., Lunsdorf H. and Zeng A.P. 2003. Alterations in the formation of lipopolysaccharide and membrane vesicles on the surface of Pseudomonas aeruginosa PAOl under oxygen stress conditions. Microbiology. Vol. 149. P. 2789 -2795.
426. Sado S. and Dworkin M. 1972. Bacteriolytic enzymes produced Myxococcus xanthus. J Bacteriol. Vol. 110. P. 236 245.
427. Salton M.R. 1952. The nature of the cell walls of some Gram-positive and Gramnegative bacteria. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 9. P. 334-335.
428. Salton M.R.J. 1994. The bacterial cell envelope a historical perspective. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.-M., Hakenbeck R., eds). Elsevier Science B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 1-22.
429. Sanderson D.D. 1926. Bacillus subtilis in pure culture complicating mastoiditis and meningitis. Nebraska Med. J. Vol. 11. P. 318.
430. Santo, L.Y., and R.H. Doi. 1974. Ultrastructural analysis during germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores. J. Bacteriol. Vol. 120. P. 475-481.
431. Sanz J.M., Diaz E. and Garcia J.L. 1992. Studies on the structure and function of the N-terminal domain of the pneumococcal murein hydrolases. Mol. Microbiol. Vol. 6. P. 921-931.
432. Saunders N.B., Shoemaker D.R., Brandt B.L., Moran, E.E., Larsen T. and Zollinger W.D. 1999. Immunogenicity of intranasally administered meningococcal native outer membrane vesicles in mice. Infect Immun. Vol. 67. P. 113 119.
433. Schaeffer P. 1969. Sporulation and the production of antibiotics, exoenzymes and exzotoxins. Bact. Revs. Vol. 33. P.48-71.
434. Scherrer, R., T.C. Beaman, and P. Gerhardt. 1971. Macromolecular sieving by the dormant spore of Bacillus cereus. J. Bacteriol. Vol.108. P. 868-873.
435. Schindler C.A. and Schuhardt V.T. 1964. Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the staphylococcus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 51. P. 414-421.
436. Schleifer K.H. and Joseph R. 1973. A directly cross-linked L-ornithine containing peptidoglycan in cell walls of Spirochaeta stenostera. FEBS Lett. Vol. 36. P. 83-86.
437. Schleifer K.N. and Kandler O. 1972. Peptidoglycan types of bacterial cell wallsand their taxonomic implications. Bacteriol. Rev. Vol. 36. P. 407-477.
438. Schmalenberger, A., and C. C. Tebbe. 2003. Bacterial diversity in maize rhizospheres: conclusions on the use of genetic profiles based on PCR-amplified partial small subunit rRNA genes in ecological studies. Molecular Ecology. Vol. 12. P. 251-261.
439. Schmelzer E., Weckesser J., Warth R. and Mayer M. 1982. Peptidoglycan of Rhodopseudomonas viridis: partial lack of N-acetyl substitutionof glucosamine. J. Bacteriol. Vol. 88. P. 815-816.
440. Schnaitman C.A. 1971. Solubilization of cytoplasmic membrane of Escherichia coli by Triton X-100. J. Bacteriol. Vol. 108. P. 545-552.
441. Schnaitman C.A. and Klena J.D. 1993. Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol Rev. Vol. 57. P. 655 682.
442. Schuch R., Nelson D. and Fischetti V.A. 2002. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature. Vol. 418. P. 884-889.
443. Seki T., Chung C., Mikami H., and Oshima Y. 1978. Deoxyribonucleic acid homology and taxonomy of the genus Bacillus. Int. J. Syst. Bacteriol. Vol. 28. P. 182189.
444. Shao, Z., D. Shi, and A.V. Somlyo. 2000. Cryoatomic force microscopy of filamentous actin. Biophys. J. Vol. 78. P. 950-958.
445. Shaw D., Mirelman D., Chatteijee N.N. and Park J.T. 1970. Ribitol teichoic acid synthesis in bacteriophage resistant mutant of Staphylococcus aureus H. J Mol Biol. Vol. 245. P. 5101-5106.
446. Shoberg R.J. and Thomas D.D. 1993. Specific adherence of Borrelia burgdorferi extracellular vesicles to human endothelial cells in culture. Infect. Immun. Vol. 61. P. 3892-3900.
447. Shockman G.D. 1992. The autolytic (suicide) system of Enterococcus hirae: from lysine depletion autolysis to biochemical and molecular studies of the two muramidase of Enterococcus hirae ATCC 9790. FEMS Microbiol. Lett. Vol. 79. P. 261-267.
448. Shockman G.D., and Holtje J.-V. 1994. Microbiol peptidoglycan (murein) hydrolases. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial Cell Wall (Ghuysen, J.M., and Hakenbeck, R. eds). Elsevier Sciense B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 131-165.
449. Shockman G.D., Daneo-Moore L., Cornet J.B. and Mychajlonka M. 1979. Does penicillin kill bacteria? Rev. Infect. Dis. Vol. 1. P. 787-796.
450. Shockman G.D., Daneo-Moore L., Karyama R. and Massidda O. 1996. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins and autolysis. Microb. Drug Resist. Vol. 2. P. 95-98.
451. Shockman G.D., Kolb J.J. and Toennie S.G. 1958. Relations between bacterial cell wall synthesis, growth phase and autolysis. J. Biol. Chem. Vol. 230. P. 961-977.
452. Siegman-Igra Y., Lavochkin J., Schwartz D. and Konforti N. 1983. Meningitis and bacteremia due to Bacillus cereus. Isr. J. Med. Sci. Vol. 19. P. 546-551.
453. Silen J.L. Frank D., Fujishige A., Bone R. and Agard D.A.I989 Analysis of prepro-a-lytic protease expression in Escherichia coli reveals that the pro region is required for activity. J Bacteriol. Vol. 171. P. 1320 1325.
454. Silen J.L., Agard D.A. 1989. The a-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. Nature. Vol. 341. P. 462 -464.
455. Simonen M. and Palva I. 1993. Protein secretion in Bacillus sp. Microbiol Rev. Vol. 57. P. 109-137
456. Sinha R.K. and Rosental R.S. 1980. Release of soluble peptidoglycan from growing gonococci: demonstration of anhydromuramyl-containing fragments. Infect. Immun. Vol. 29. P. 914-925.
457. Singer S.I. Current concepts of molecular organization in cell membranes. 1981. Biochem Soc Trans. V.9. P 203-206.
458. Slepecky R.A. 1971. Ecology of bacterial sporeformers. In: H.O. Halvorson, R. Hansen, and L.L. Campbell (ed.). Spores—V. American Society for Microbiology. Washington. D.C. P. 297-313.
459. Sleytr U.B. 1997. Basic and applied S-layer research: an overview. FEMS Microbiol. Rev. Vol. 20. P. 5-12.
460. Sliman R., Rehm S., and Shlaes D.M. 1987. Serious infection caused by Bacillus cereus. Medicine. Vol. 66. P. 218-223.
461. Smit J., Kamio Y. and Nikaido H. 1975. Outer membrane of Salmonella typhimurium: Chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants. J Bacterid. Vol. 124. P. 942 958.
462. Smith T.J., Blackman S.A. and Foster S.J. 1996. Peptidoglycan hydrolases of Bacillus subtilis 168. Microb. Drug Resist. Vol. 2. P. 113-118.
463. Smith T.J., Blackman S.A. and Foster S.J. 2000. Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple function. Microbiology. Vol. 146. P. 249-262.
464. Sohl J.L., Jaswal S.S. and Agard D.A. 1998. Unfolded conformations of a-lytic protease are more stable than its native state. Nature. Vol. 395. P. 817-819.
465. Somerville H.J. and Jones M.L. 1972. DNA competition studies within the Bacillus cereus group ofbacilli. J. Gen. Microbiol. Vol. 73. P. 257-265.
466. Sousa J.C.F., Silva M.T., and Balassa G. 1976. An exosporium-like outer layer in Bacillus subtilis spores. Nature. Vol. 263. P. 53-54.
467. Sousa, J.C.F., M.T. Silva, and G. Balassa. 1978. Ultrastructure and development of an exosporium-like outer spore envelope in Bacillus subtilis. Ann. Microbiol. (Paris). V. 129. P. 339-362.
468. Spackman D.H., Stein W.H. and Moore S. 1958. Automatic recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Anal. Chem. Vol. 30. P. 1190-1210.
469. St Geme J.W. Ill and Grass S. 1998 Secretion of the Haemophilus influenzae HMW1 and HMW2 adhesins involves a periplasmic intermediate and requires the HMWB and HMWC proteins. Mol Microbiol. Vol. 27. P. 617 630.
470. Steen M.K., Bruno-Murtha L.A., Chaux G., Lazar H., Bernard S., and Sulis C. 1992. Bacillus cereus endocarditis: report of a case and review. Clin. Infect. Dis. Vol. 14. P. 945-946.
471. Steichen C.T., Chen P., Kearney J.F. and Turnbough C.L.J. 2003. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium. J. Bacterid. Vol. 185. P. 1903-1910.
472. Steichen C.T., Kearney J.F. and Turnbough C.L.J. 2005. Characterization of the exosporium basal layer protein BxpB of Bacillus anthracis. J. Bacterid. Vol. 187. P. 5868-5876.
473. Stephens D.S., Edwards K.M., Morris F. and McGee Z.A. 1982. Pili and outer membrane appendages on Neisseria meningitidis in the cerebrospinal fluid of an infant. J Infect Dis. Vol. 146. P. 568.
474. Stevens L. 1996. Egg proteins: what are their functions? Sci. Prog. Vol. 79. P. 65-87.
475. Stolz M., D. Stoffler U. Aebi and C. Goldsbury. 2000. Monitoring biomolecular interactions by time-lapse atomic force microscopy. J. Struct. Biol. Vol. 131. P. 171— 180.
476. Strominger J.L. and Ghuysen J.M. 1967. Mechanisms of enzymatic bacteriolysis. Science. Vol. 156. P. 213-221.
477. Strominger J.L. and Tipper D.J. 1974. Structure of bacterial cell wall: the lysozyme substrate. In: Lysozyme (Osserman E.F., Canfield R.E., Beychok S. eds) Acad. Press. New York-London. 169-184.
478. Strynadka, N.C.J, and James, M.N.G. 1991. Lysozyme Revisited: Crystallographic Evidence for Distortion of an N-Acetylmuramic Acid Residue Bound in Site D. Journal of Molecular Biology. Vol. 220. P. 401 424.
479. Sugai M., Akiyama T., Komatsuzawa H., Miyake Y. and Suginaka H. 1990. Characterization of sodium dodecyl sulfate-stable Staphylococcus aureus bacteriolytic enzymes by polyacrylamide gell electrophoresis. J. Bacteriol. Vol. 172. p. 6494-6498.
480. Suzuki K., Uyeda M. and Shibata M. 1985a. Serratia marcescens-lytic enzyme produced by Micromonospora sp. Strain No 152. Agr. Biol.Chem. 49, 1719-1726.
481. Suzuki K., Uyeda M. and Shibata M. 1985b. Serratia-lytic enzyme produced by Streptomyces sp. Strain No 177. Agr. Biol.Chem. Vol. 49. P. 3049-3050.
482. Sylvestre P., Couture-Tosi E., and Mock M. 2002. A collagen-like surface glycoprotein is a structural component of the Bacillus anthracis exosporium. Mol. Microbiol. Vol. 45. P. 169-178.
483. Takahara Y., Machigaki E. and Murao S. 1974. Lytic action of B-enzyme on Pseudomonas aeruginosa. Agr. Biol. Chem. Vol. 38. P. 2349-2356.
484. Tanaka J., Suzuki T., Mimuro H. and Sasakawa C. 2003. Structural definition on the surface of Helicobacter pylori type IV secretion apparatus. Cell Microbiol. Vol. 5. P. 395-404.
485. Taylor A., Das B.C. and Van Heijenoort J. 1975. Bacterial cell wall peptidoglycan fragments produced by phage lambda or Vi II endolysin and containing 1,6-anhydro-N-acetylmuramic acid. J. Biochem. Vol. 53. P. 47-54.
486. Taylor P.W. 1983. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against gramnegative bacteria. Microbiol. Rev. Vol. 47. P. 46-83.
487. Thanassi D.G. and Hultgren S. J. 2000. Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane. Curr. Opin. Cell Biol. Vol. 12. P. 420 430.
488. Thumm G. and Gotz F. 1997. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostapfm immunity factor(lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Mol. Microbiol. Vol. 23. P. 1251-1265.
489. Tipper D.J. and Linnet P.E. 1976. Distribution of peptidoglycan synthetase activities between sporangia and forespores in sporulating cells of Bacillus sphaericus. J. Bacteriol. Vol. 126. P. 213-221.
490. Tipper D.J., and Gauthier J.J. 1972. Structure of the bacterial endospore. In: Spores V. Edited by H.O. Halvorson, R. Hanson and L.L. Campbell. Amer. Soc. Microbiol. Washington. D.C. P. 3-12.
491. Todd S.J., Moir A.J., Johnson M.J., and Moir A. 2003. Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium. J. Bacteriol. Vol. 185. P. 3373-3378.
492. Tokuda H. 2009. Biogenesis of outer membranes in Gram-negative bacteria, Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol. 73. P. 465-473.
493. Thomashow M.F. and Rittenberg S.C. 1978. Intraperiplasmic growth of Bdellovibrio bacreriovorus 109J: solubilization of Escherichia coli peptidoglycan. J. Bacteriol. Vol. 135. P. 998-1007.
494. Tomasz A., Albino A. and Zanati E. 1970. Multiple antibiotic resistence in a bacterium with suppressed autolytic system. Nature. Vol. 227. P. 138-140.
495. Tripper D.J., Ghuysen J.M. and Strominger J.L. 1965. Structure of the cell wall of Staphylococcus aureus, strain Copenhagen. III. Further studies of the disaccharides. Biochemistry. Vol. 4. P. 468-473.
496. Tsugita A. 1971. Phage lysozyme and other lytic enzymes. In: The enzymes (Boyer P.D., ed) New York-London: Acad. Press. Vol. 5. P. 343-413.
497. Tuazon, C.U., H.W. Murray, C. Levy, M.N. Solny, J.A. Curtin, and J.N. Sheagren. 1979. Serious infections from Bacillus species. JAMA. Vol. 241. P. 1137-1140.
498. Turnbull P.C. 2002. Introduction: anthrax history, disease, and ecology. Curr. Top. Microbiol. Immunol. Vol. 271. P. 1-19.
499. Turnbull P.C.B., French T.A., and Dowsett E.G. 1977. Severe systemic and pyogenic infections with Bacillus cereus. Brit. Med. J. Vol. 1. P. 1628-1629.
500. Uchido K. and Aido K. 1979. Taxonomic significance of cell-wall acyl type in Corynebacterium-Micobacterium-Nocardia group by a glycolate test. J. Gen. Apll. Microbiol. Vol. 25. P. 169-183.
501. Umemoto T., Ota T., Sagawa H., Kato K., Takasa H., Tsujimoto M., Kawasaki A., Ogawa T., Harada K. and Kotani S. 1981. Chemical and biological properties of a peptidoglycan isolated from Treponema palladium Uasan. Infect. Immun. Vol. 31. P. 767-774.
502. Ursinus A. and Holtje J.V. 1994. Purification and properties of a membrane-bound lytic transglycosylase from Escherichia coli. J. Bacteriol. Vol. 176. P. 338-343.
503. Valence F., and Lortal S., 1995. Zymogram and preliminary characterization of Lactobacillus helveticus autolysins. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 61. P. 3391-3399.
504. Vallinger Z., Ladesic B. and Tomasic J. 1982. Partial purification and characterization of N-acetylmuramyl-L-alanine amidase from human and mouse serum. Biochim. Biophis. Acta. Vol. 701. P. 63-71.
505. Vanderwinkel E, De Vlieghere M, De Pauw P, Cattalini N, Ledoux V, Gigot D and Ten Have J-P 1990. Purification and characterization of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase from human serum. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1039. P. 331-339.
506. Van Setten G.B., Tervo T. and Tarkkanen A. 1989. Acute keratitis and contamination of contact lens care systems with Bacillus cereus. Klin. Monatsbl. Augenheilkd. Vol. 195. P. 28-31.
507. Vanderwinkel E., De Vlieghere M. 1985. Modulation of Escherichia coli N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase activity by phosphatidylglycerol. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 838. P. 54-59.
508. Vanderwinkel E., De Vlieghere M., De Tanhoffer L. 1981. Activity of N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase in phospholipidic environments. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 663. P. 46-57.
509. Vasilyeva N.V., Tsfasman I.M., Suzina N.E., Stepnaya O.A. and I. S. Kulaev. 2008. Secretion of bacteriolytic endopeptidase L5 of Lysobacter sp. XL1 into the medium by means of outer membrane vesicles. FEBS Journal. Vol. 275. P. 3827-3835.
510. Vassault A. 1983. in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.,U., Editor-inChief) Verlag Chemie. Florida. Vol. 3. P. 118-126.
511. Vasstrand E.N., Jensen H.B., Miron T. and Hofstad T. 1982. Composition of peptidoglycan in Bacteroidaceae: determination and distribution of lanthionine. Infect. Immun. Vol. 36. P. 114-122.
512. Vekilov, P.G., and A.A. Chernov. 2002. The physics of protein crystallization. In: Solid State Physics. H. Ehrenreich and F. Spaepen, editors. Academic Press. New York. Vol. 5. P. 1-147.
513. Vesy C.J., Kitchens R.L., Wolfbauer G., Albers J.J. and Munford R.S. 2000. Lipopolysaccharide-binding protein and phospholipid transfer protein release lipopolysaccharides from Gram-negative bacterial membranes. Infect Immun. Vol. 68. P. 2410-2417.
514. Von Heijne G. 1990. The signal peptide. J. Membrane Biol. Vol. 115. P. 195 201.
515. Vrontou E. and Economou A. 2004. Structure and function of SecA, the preprotein translocase nanomotor. Biochim. Biophys. Acta. Vol. 1694. P. 67 80.
516. Wadstrom T. and Hisatsune K. 1970. Bacteriolytic enzymes from Staphylococcus aureus: purification of an endo-ß-N-acetylglucosaminidase. Biochem. J. Vol. 120. P. 725-734.
517. Waller L.N., Fox N., Fox K.F., Fox A., and Price R.L. 2004. Ruthenium red staining for ultrastructural visualization of a glycoprotein layer surrounding the spore of Bacillus anthracis and Bacillus subtilis. J. Microbiol. Methods. Vol. 58. P. 23-30.
518. Wandersman C. 1989. Secretion, processing and activation of bacterial extracellular proteases. Mol Microbiol. Vol. 3. P. 1825 1831.
519. Wang Z-M, Li X, Cocklin RR, Wang M, Wang M, Fukase K, Inamura S, Kusumoto Sh, Gupta D. and Dzarski R. 2003. Human peptidoglycan recognition protein-L is an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. J. Biol. Chem. Vol. 278. P. 49044-49052.
520. Ward J.B. 1981. Teichoic and teichuronic acids: Biosynthesis, assembly and location. Microbiol. Rev. Vol. 45. P. 211-243.
521. Ward J.B., Perkins H.R. 1968. The purification and properties of two staphylolytic enzymes from Streptomyces griseus. Biochem.J. Vol. 106. P. 69-76.
522. Ward J.B. and Williamson R. 1984. Bacterial autolysins: specificity and function. In: Microbial cell wall synthesis and autolysis (Nombela C., ed.). Elsevier Sciense B.V. Amsterdam. Netherlands. P. 159-166.
523. Warth A.D. 1979. Molecular structure of the bacterial spore. Adv. Microbiol. Physiol. Vol. 17. P. 1-45.
524. Warth A.D. 1985. Mechanisms of heat resistance. In: G.J. Dring, D.J. Ellar, and G.W. Gould (ed.), Fundamental and applied aspects of bacterial spores. Academic Press. Inc. London. P. 209-225.
525. Warth A.D. and Strominger J.L. 1969. Structure of the peptidoglycan of bacterial spores: occurrence of the lactam of muramic acid. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. Vol. 64. P. 528-535.
526. Warth A.D. and Strominger J.L. 1971. Structure of the peptidoglycan from vegetative cell walls of Bacillus subtilis. Biochemistry. Vol. 10. P. 4349-4358.
527. Warth A.D. and Strominger J.L. 1972. Structure of the peptidoglycan from spores of Bacillus subtilis. Biochemistry. Vol. 11. P.1389-1396.
528. Warth A.D., D.F. Ohye, and W.G. Murrell. 1963. The composition and structure of bacterial spores. J. Cell Biol. Vol. 16. P. 579-592.
529. Watanabe H., Kume T., Okazawa G. and Sato T. 1976. Lysis of radioresistant bacteria by enzyme of Achromobacter lunatus. Agr. Biol. Chem. Vol. 40. P. 427-429.
530. Watanabe H. and Sato T. 1981. Properties and lytic action of the P-2 enzyme capable of lysing cells of Micrococcus radiodurans. Agr. Biol.Chem. Vol. 45. P. 1215-1221.
531. Weibull 1953. The isolation of protoplasts from Bacillus megaterium by controlled treatment with lysozyme. J. Bacteriol. Vol. 66. P. 688-695.
532. Weisse M.E., Bass J.W., Jarrett R.V., and Vincent J.M. 1991. Nonanthrax Bacillus infections of the central nervous system. Pediatr. Infect. Dis. J. Vol. 10. P. 243-246.
533. Weller H.F., Nicholson A., and Braslow N. 1979. The spectrum of Bacillus bacteremias in heroin addicts. Arch. Intern. Med. Vol. 139. P. 293-294.
534. Weon, H. Y., B. Y. Kim, M. K. Kim, S. H. Yoo, S. W. Kwon, S. J. Go, and E. Stackebrandt. 2007. Lysobacter niabensis sp. nov. and Lysobacter niastensis sp. nov., isolated from greenhouse soils in Korea. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 57. P. 54851.
535. White D. 1995. The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. Oxford University Press. N.Y. 378 P.
536. Wickus G.G., Warth A.D. and Strominger J.L. 1972. Appearance of muramic lactam during cortex synthesis in sporulating cultures of Bacillus cereus and Bacillus megaterium. J. Bacteriol. Vol. 111. P. 625-627.
537. Wild J., Altman E., Yura T. and Cross C. 1996. Involvement of the DnaK-DnaJ-GroE chaperone team in protein export in Escherichia coli. Genes Dev. Vol. 6. P. 1165 -1172.
538. Williamson R. and Ward J.B. 1981. Deficiency of autolytic activity in Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae is associated with a decreased permeability of the wall. J. Gen. Microbiol. Vol. 125. P. 325-334.
539. Wren B.V. 1991. A family of clostridial and streptococcal ligand-binding proteins with conserved C-terminal repeat sequences. Mol. Microbiol. Vol. 5. P. 797-803.
540. Wu J.A., Kusuma C., Mond J.J. and Kokai-Kun J.F. 2003. Lysostaphi disrupts Staptylococcus aureus and Staptylococcus epidepmidis biofilms on artificial surfaces. Antimicrob. Agents and Chemother. Vol. 47. P. 3407-3414
541. Yaganza E.S., Rioux D., Simard M., Arul J. and Tweddell R.J. 2004. Ultrastructural alterations of Erwinia carotovora subsp. atroseptica caused by treatment with aluminum chloride and sodium metabisulfite. Appl. Environ. Microbiol. V.70. P. 6800-6808.
542. Yalpani M. 1988. Polysaccharides. Syntheses, modifications and structure/property relations. Elsevier. 499 P.
543. Yaron S., Kolling G.L., Simon L. and Matthews K.R. 2000. Vesicle-mediated transfer of virulence genes from Escherichia coli 0157:H7 to other enteric bacteria. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 66. P. 4414 4420.
544. Yem D.W., Wu H.C. 1976. Purification and properties of (3-D-acetylglucosaminides from Escherichia coli. J. Bacterid. Vol. 125. P. 324-331.
545. Yokogawa K., Kawata S., Takemura T., Yoshimura Y. 1975. Purification and properties of lytic enzymes from Streptomyces globisporus 1829. Agr. Biol. Chem. Vol. 39. P. 1533-1543.
546. Yokogawa K., Kawata S., Yoshimura Y. 1973. Lytic enzyme from Streptomyces globisporus 1829. Agr. Biol. Chem. Vol. 37. P. 799-808.
547. Yoshimoto T., Tsura D. 1972. Studies on bacteriolytic Enzymes. II. Purification and some properties of two types of staphylolytic enzymes from Streptomyces griseus. J. Biochem. Vol. 72. P. 379-390.
548. Yoshino S., Ogata S., Hayashida S. 1982. Some properties of autolysins of Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Agr. Biol. Chem. Vol. 46. P. 1243-1248.
549. Yuen G. Y., J. R. Steadman D. T. Lindgren D. Schaff and C. Jochum. 2001. Bean rust biological control using bacterial agents. Crop Protection. Vol. 20. P. 395-402.
550. Zhang Z. and G. Y. Yuen. 1999. Biological control of Bipolaris sorakiniana on tall fescue by Stenotrophomonas maltophilia strain C3. Phytopathology. Vol. 89. P. 817822.
551. Zhang Z., G. Y. Yuen, G. Sarath and A. R. Penheiter. 2001. Chitinases from the plant disease biocontrol agent, Stenotrophomonas maltophilia C3. Phytopathology. Vol. 91. P. 204-211.
552. Zheng L. and R. Losick. 1990. Cascade regulation of spore coat gene expression in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. Vol. 212. P. 645-660.
553. Zheng L., W.P. Donovan, P.C. Fitz-James, and R. Losick. 1988. Gene encoding a morphogenic protein required in the assembly of the outer coat of the Bacillus subtilis endospore. Genes Dev. Vol. 2. P. 1047-1054.
554. Zhou L., Srisatjaluk R., Justus D.E. and Doyle R.J. 1998. On the origin of membrane vesicles in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Lett. Vol. 163. P. 223 228.
555. Автор искренне благодарен своему учителю и консультанту настоящей работы чл,-корр. РАН Кулаеву И.С.
-
Степная, Ольга Андреевна
-
доктора биологических наук
-
Пущино, 2012
-
ВАК 03.01.04
- Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1
- Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp.
- Локализация и свойства автолитических ферментов Lysobacter sp. - продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов
- Действие препарата лизоамидаза и его компонентов на эндоспоры бактерий рода Bacillus
- ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, ЛИЗИРУЮЩИХ PSEUDOMTWAS AERUGINOSA
