Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, ЛИЗИРУЮЩИХ PSEUDOMTWAS AERUGINOSA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, ЛИЗИРУЮЩИХ PSEUDOMTWAS AERUGINOSA"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи. ШИБКО АЛЕКСАНДР ВИКТОРОВИЧ

УЖ 576.8.095+579.68/282.247/

ЛИЗИИПОЦИІ Р5ЕиіЮМШ$ АЫШЫШ

Специальность 03.00.07 микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени -кандидата биологических наук

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ

Москва - 1987

- Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.:

Научные руководители: член-корреспондент АН СССР И.С.Кулаев, -'■"■■■ / - кандидат биол.наук В.А.Ламбина

Официальные оппонента: доктор биологических наук " Л.Г.Логинова (ИнШ), . кандидат биологических наук ■ . - И.Н.Скворцова (МГУ)

Ведущее учреждение: Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР

: Защита состоится " /}-" кЛ^сХЬ ? 196г. в /^ч&ймин. в аудитории М-2 на заседании специализированного, ученого совета' К 053.05.80 в МГУ им.М.В.Ломоносова CII9899 Москва, ГСП.Ленин- . ские горы, факультет почвоведения МГУ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ. ■'.*.■

Автореферат разослан " ' '" _' ■ 198 г.

Ученый секретарь

спедаализированного совета

■Поиск антимикробных средств является одним из основных направлений микробиологической науки. Решащие успехи на-ътомпути. достигнута в 'результата' изучения и использования микробного антагонизма. Применение антибиотиков положило начшю широкому наступлению иа микроорганизмы-возбудители и привело к небывалому•• ендасени» инфекционной заболеваемости. Использование аитишпфоб-v них средств'позволило управлять жизнедеятельностью микроорганизмов В ПрОМШИШНОСТИ И В сельском хозяйстве, " V к ."<'■'■

. Однако а эру антибиотиков в биологии макроорганизмов прои-. зошли определенные изменения: среди тахогеншх микроорганизмов, нередко стали появляться шташц, лроявлящаа устойчивость к ш-; тибиотикам,1: все чаще признаки патогенности обнаруживаются у ви-. дов,.считавшихся ранее непатогенными, возросла роль града трица-тельных бактерий, в этиологии:внутрибольничных лнфекций,7ведущее место среди которых занимает сдаегнойная инфекция / Fi» tarnt 1980; Dixo» 1981/. Возбудитель- Pseudomonas dtruytuoss -- обладает множественной естественной устойчивостью к широкому : кругу современных антибактериальных. препаратов /Влодавец, Исха- ; кова, 1979; Putvcr6r • ,1902/. > : - -

Т: " В этих условиях наряду с новыми антибиотиками все более гфистальпое внимание-* стали привлекать другие способы воэдейст- • вт на микробную клетку. *0днш из таких средств - оказались бакте-риолитичесние ферменты,'продуцируемые внеклеточно отдельными штаммами микроорганизмов и разрушающие клеточные стенки бактерий /Кулаев и'соавт., 1984; Захарова, Павлова, 1985/. '

'Актуальность ^емц г Основой Успешного получения1 биологически адтивньа веществ микробной природа является' наличие высоко активных микроорганизмов-продуцентов. Поиск, продуцентов в природе .

это процесс, состоящий из последовательных этапов, включающих нахождение 'оптимальных, источников, выделение культур-продуцзн-" тов, изучение кх активности и отбор наиболее активных штаммов»--.

■. Выбор источников дая систематического целенаправленного вы- -, деления микроорганизмов• продуцирувоцк- внеклеточные литические _ ферменты, возможен в результате выяснении их экологичеОКОЙ'роли ■' в нахождения природных очагов распространения. К настоящему вре- ^ ' мени накоплены сведения о распространении в природе микроорга-яиаыов, лизирутащх грашюложительвые бактерии и дрожжи. Сообща-ния о мшфоорганизмах, продуцирупцих литические ферменты против ' грамотрицательных бактерий,' весьма немногочисленны.'Однако они . *. показывают,, что способность разрушать живые клетки Аеифятоп^з-, -геги$аю$а - и .других грамотрицательных'бактерий чаще нрояв- / ляют литические фермента бактериального. происхоидения. Штаммы, лизирующкРееи^/отопая , найдены среди представите-

ле Ё родов /¡¿сШиЗ ., /Ъеис/отол.*$ и некоторых ДРУГИХ. Тем - неменее.'пшрота их распространения в природе не изучалась, а методы выделения не разрабатывались. .*■■.*

' С учетом потребностей различных областей-науки и практики в . " 1 принципиально новых антимикробных агентах, воздействующих на грамотрицателыгае бактерии^ вопросы поиска ¿ахтерий продуцентов, постоянных источников.их получения и изучение биологических , ' свойств является весьма актуальными.; * '

Цель настоящей работа ; заключалась; в выбореоптимальных-природных источников для постоянного выделения бактерий, продуцирую- -ЩИХ внеклеточные" литические фермента против Рзеис/отоп<33 ,

по$з ; получении. природных штаммов-изолятов, изучении их биологи- ■ . ческих свойств и литического действия на живые и мертвые клетки

и других мшдюорганизмов; отборе штатов, наиболее -перспективных для получения ферментных, препаратов литического ' • '• действия; разработке методических рекомендаций по выделении иташов-продуцентов из природных сред.

■ \ - Для достижения поставленной цели необходимо было решить". -следующие задачи: ,, - г■■' ■. '. ■/■;;;^ :■'■■"'"■■■■ ■

.I. Провести поиск бактерий, лиэирукнцих Р.-¡регод^олл ' при . различных температурах,в почве, естественные водоемах,:цромышен- ' них и бытовых сточных водах.' ";" .: ■ ' -

1 2. Выделить штаммы бактерий, продуцирующие внеклеточные !■■ литические ферменты и определить их таксономическую принадлежность * 3. Провести скрининг выделенных штаммов по'степени литического действия на живые' клетки Р ¿бгидмо^с! • и отобрать' штаммы, ■ . обладающие наибольшей литической активностью. ^ ..'... V

.•4, Изучить спектры литического действия тташгов-изолятов ^ .-в отношении грамотридательных и грамположительных бактерий.,

5. Разработать:методические рекомендации ш вадедению из природных сред бактерий- 1фодуцентов Статических ферментов против;;. Р. ¿вгид1поиХ *■".;.' . ' " ■ " ^ '■ ' ■ ' ■,• .

\ , : Даучная новизна ^ значимости.'Впервые представлены дан--ныё о' численности бактерий, продуцирующих внеклеточные литические - ферменты'против грамотрицательно¡1 бактерии -А , в дер-

■ ново-подзолистой почве, естественных водоемах, хозяйственно-бытовых и'промышленных'сточных; водах. Получено более 200 природных ■ ШТаММОВ, ЛИЭЯРУЮЩИХ ЖИВЫе И мертвые КЛеТКИ Р. ■ при <( ^различных температурах. Изучены их биологические и литические : свойства.' Установлено, что при температуре 45°С способность . к внеклеточному выделению Логических ферментов против Раеп/уй70$а

■ / проявляютштамш бактерий, соответствующие .описанню вида Saeii- ,

-■■■"."..'."■ . '¿us suStilts :: , наиболее широко, распространенные и дсриово-; ; ПОДЗОЛИСТОЙ почве ПОД ЛИСТВ6ЦНЫМ ЛЄСОМ И ХОЗЯЙСТВОННО-6ЫТОВЫХ

сточных водазсГ.пря"темаературе'2Э-30оС способностью лизировать , . P.tierugtnosa обладают штаммы бактерий, соответствующие описа-~ . шю родов Pseudomonas ,£r**-int'<i ,. . Aero/nosras ^ , и Alealigenes , наиболее распространенные в хозяйственно- ■' ,;7 V

1" « бытовых 'сточных водах и'водоемах," характеризующихся преоблада-"" * нием грамотрицательных бактерий, в ток числе, псевдомонад. . :Показана'преимущества шталмов-продуцентов 3. suStiUs

\ перед пгтаимами -продупентамирода Pseudomo/tas ■ в степени ' • лизиса живых клеток Р. aeruginosa , способности продуцаро-^ ■■ ' вать литические ферменты при росте в жидких питательных средах,

сохранности литических свойств в широте- спектров дєііствкя.'' . ' Цракгцчосдая пердость и использование. Проведенные иссле-,■ дования позволили обосновать и разработать методические рекомен- ■<i. дашт'для выделения из воды и почва штампов бактериа. щюдутару-, . юдих*внеклеточно литические ферменты в отношении Р- aeruginosa . • и других грамотрицательных бактерий. Настояпдае рекомендации ;,- ї ; t утверждены и приняты к использованию в лабораториях'ВНИИ приклад- ■ ; ной микробиологии Мкимедбиопрома. . v -V : Л

4 : ^ , >- Выделенные штаммы депонированы ¿ коллекциях культур лабо-".}""■ раторий бактериального паразитизма и регуляции биохимческих про- , пёссов ИБЇМ АН СССР и используются в научно-исследовательской*. работе по получению препаратов бактериолитического действия.\ ■ ; ■ -■■'. . АПРОЕ/ЩЦЛ РАЕОТЫ. Основные положения диссертационной работы • ' ' доложены на 'I Всесоюзной конференции "Микробиология очистки вода" : ' /Каев, 1902/, на конференциях молодых ученых ИБ5М АН СССР/ТЗущино, 1982/ и НЦШ АН СССР /Пуіцино, 1983/. Д'^ї ;

ПУБЛИКАЦИИ. ■ По теш диссертации опубликовано 4 печатных работы. ■'■ V. ■'■'.. '.*■:'.:''.':■■ ,-"' . °V"., ■ ■■.-" ■■ '. " СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит t из введения, обзора литературы, включавшего 4 главы; экспериментальной часта» состоящей из описания объектов и методов исследования и 5 глав г собственных исследований о обсуждением результатов;' заключения,:выводов, списка литературы и приложений.. Диссер- -тащи изложена на 140 страницах машинописного' текста, иллкютри- ■ ровава 15 яаблицами , 6 рисунками и 14 фотография!®!. Список литературы на 21 странице включает 178 источников;(53 отечественных ■и 125 зарубежных). " • - \ ' - ' ' ^ : 4 ■

■ 'V/V-./ ; МАТЕРЖШ и;МЕТОДЫ .

Объекты исследования. Для изучения распространения и выделения бактерий, продущфупцнх внеклеточные литические ферменты;' против' Я были использованы: . ¡ ; v V..

V I. Река.Ока вблизи г.Пущино, Московской области (10 станций); 2. Рока Амур вдоль г.Хабаровска (8 станций);

' \3. Канал Салар в г .Ташкенте (10 станций); "> "

4. Химкинское водохранилище на территории г. Москвы (З стан- .

;4BH)íV:.V,_ .■'.■.' --/.J.. ■■ .""'■■.■.; ■/"■ ' .".' . ' .■ . ■'VÍ; :

i 5. Рижский;залив на участке Лиелупе - Дзинтари (7 станций); ." 6. Сточные воды г. Пущино на 5 этапах очистки (32 проба);; 7. Сточные'воды целлшозно-картонного комбината в г.Амурс- .„■ ке' (13 проб); ■• ; v V л' '.'■ ' .■ ■■,

V; ' 8. Дерново-подаолистые почвы смешанного, лиственного и хвойного лесов, почва пахотных полей и городских цветочных газонов , / 'в южных районах Московской'области (всего 38 проб; горизонт Ао-1).

Пробы вода отбирали'батометром в непосредственной близости от берега из поверхностного слоя.воды, проба почва - в поверх-': ностном горизонте А (1-3 см). Подготовку проб почва проводили как .описано у Д.Г.Звягинцева о соавторши /1980/, Исследование,водоемов проводили о мая по сентябрь, сточных вод г„Пущино - в зимний период года; сточные вода Амурского ДОС исследовали в июле,.почву - в ъесенне-лотний период. • - " ^ ■?' ■ ■•' ■■

Определение числ^ндосуи бмутери^. лдзирущи?<; /? Jert/otnasá , проводили при средник температурах Х29-30 °С) и в условиях, близких к термофильным (45 °С), методом прямого посева материала из > ' разведений проб на двуслойный агар /Адаме, 1961; Stoíp ... , •Starr , 1963/. Использовали разведенную в 4 раза дрожжевую пеп-тонную среду ДП/4 . /Stolp, St^ г г- , 1963/,* а в качестве тест- г бактерии -. PseudomMss jeruginesA -штамм B-I из коллекции культур микроорганизмов 'лаборатории бактериального паразитизма Института биохимии и физиологии микроорганизмов All СССР. 0 численное- , ти бактерий, продувдрувдих внеклеточные литические ферланты, су- ■ дошило количеству колоний» окруженных зонами лизиса ка:газоне айвах клеток fi¿eruginosa . B-I, через 8-10 суток при 29 °С;й через 2 суток при 45 °С. Для" получения суспензии клеток тост-бактерии при приготовлении двуслойного агара штамм Я B-I ' выращивали на поверхности ША в матрацах. Через 24 -часа инкубации ; бактериальный "газон.смывалд'с поверхности агара. 15-20 Ш1 дрожко-, вой пептонной среды ДЦ/4*и использовали, добавляя по 1,0 ыл к ~ 5 мл 0,8 % ДЦ/4 агара верхнего слоя. ' - : ,

■ Общее количество гетеротроФннх; микооооганиз^в в' исслетгемцх объектах .определяли методом глубинного посева из разведений на ША.:: ч.. ;Л :; ^.^'V;'.-; .'■ "' > ■

; Количество гоанутяшательных бактерий определяли «ем же методом о добавлением в ША генцианвиолета 1:500000. '

- л*

Лі. Н. . . / г . , .. .. і. ^ ^ т ,

'-'<■"■ ..і-'*' \ ■■■■* л

.ч? ■V- -

-.7 - •• г ( ........

.'*■■..■ !■ •Вчдаление бактерий. ігоояуішруших литическга «Тч?пмснта. Мате- / - •

риал кодониїїі окруженных зонами лизиса, 'триады последовательно

« ' •' . ■'■ ■■■'■■ . >■ - ■ -* '■; • і' -т,п ... :

упересевали на двуслойной агаре с живыми клетками тест-бактерии о*

.. ■■■■■■.■■■ : ■■'•-{■■ ■ / •••• ■,-■■.-■..■ ' - - л'..г";.„'

последующий высевом на двуслойный _ агар,' - содержащий мертвые: клет--. .

ки тест-бактерии для'.доказательства ферментной природы'их лизиса ■..

.; ' і и для получения'отдельных колоний, которые затем отеевали на ША. .',:'. *

чУ.'Ввделение культур мезофадьных:продуцентов проводили при 29-30 ?С, • •

^ термофильных,- при 45 °С. Мертвые.клетки • Р. аегидіпо** полу- у '

," -■■'■'■чао путем обработки, суспензии-живых клеток текучим "паром втече--.;

нив 30 минут.: . '. ' '•* V- ,, г '-'

( „-г^ Отделение культур т бактерій проводили - в ''соответствия' с Меж-г - ^ >

дунаролнш'Определителем бактерий Берги 7і974"г./ с послсдукицпл . : . ,

уточнением систематического диагноза'по,9 изданию Определителя

Д934 : • - ■ ; -

: - Г Определение способности Бактерий ■ продуцировать литцческие; .: :: . . : ,у аегментц'1ря жидкой питательной'среде проводили путем ис- -. ^

- ' -питания литического действия культуральяой жидкости■ исследуемых г". -

штаммов, внращенных: в дрожжевой пептонной среде ДЛ - /, 3£о£р; . '

г /1962/.В отсутствие;клеток тест-бактерий,*, против" суспензий' живых и. •

инактивированных тест-клеток. ^: . / ^/

: ., , 1 ■ь ■>■•■■ ■■ ..■■■ ■' .-■ г;■■' ■ , . \ ■",.-'' : Состав оштной реакционной'смеси включал 1,5 мл суспензии;*.'; /.";. г -."'■■1 '■■" v '■■'■. ■ •■■'.' ■ '■: ^ *. а. ■■■' ■ í ....■: *■ ■■■.-; ■■-,-■■' -'л'. ?

■ живых или мертвых клеток тест-бактерии, предварительно 2-х кратно ..:*■■■■■'

отмытых дистиллированной водой и ресуспенадрованных .в 0,0Г,М фос- ■' ;.'„.

■:.т фатном^ буфере * '8,5; и 0,5 мл культуральной кадкости» В контроль- •

' ной смеси к- суспензии теот-клеток добавляли 0,5 мл культуральной - " ч.

. жидкости, , инантивировашзой - кипячением.Смеси'1Шкубировали1: час '

-.при 37 и 45 °С (соответственно для мсэсфильиых и'терюфильных''' '

. ;; -. отаымов).Оптическую плотность измеряли на ФЗК156 ПМ.;' : .' -V

У .V, ; V Степень ЛИТИЧ6СК0Г0 действия определяли ПО формуле - , 4

; ' ТегиI ,, 1962/:1 • ** Ой^опыт ~~ " Щ)коугр'а*1.;: ЮО %, ! Г

см* . . : : : -г}

•г .: ■

где' 01>о - начальная оптическая плотность смеси, . ■"■ >.л .- оитизеская плотность смеси через I чао, ■■>■:■'.'■ !. -

(?пектрц лрттичеекого'' де^урвия штаммов-изолятов изучали двумя ; / методами:; при росте на плотной питательной среде (метод двуслойно- ; го агара) и методом определения степени литического действия куль- -туральной жидкости против суспензий живых и ; мертвых клеток тест- • . микроорганизмов. -Культуры микроорганизмов ,- использованные в каче— : ■ : ствв'тестовых,,были получены из коллекции культур микроорганизмов лабораторш'бактериального паразитизма ИБШ АН СССР я включали 28 ; : видов бактерий (33 штамма),,в том числе: 23 вида грамотрицатель-иых (28 штаммов) и 5 ввдов (5 штаммов). грамположительных; бактерий; а также 2 вида дрожжей. Среди :грамотрицательных бактерийЛЗ сос-; тавляли различные'виды псевдомонад (14 штаммов) . ••'•..' ; ,

■ . Математическую обработку данных ггооводилявсоответствии с методами вариационной статистики /Лакин, 1973/. на управляемом вычислительном комплексе УБК СМ 1420 в лаборатории атоматизированвых систем управления ВНИИ прикладной микробиологии. V' ' - : '

; .2 ■ .РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛКИ0ВЛ1Ш М ;-

; . I,. Распространение бактерий, лизирупцих Р ¿еги^епоза , И" ■■■ Л ■'■;■■;в естественных водоемах,, сточных водах и почве . " '

,, ; ' Настоящие исследования показали, что штаммы бактерий, способ--,, ныо лизировать клетки Р. ^еги^^пмл встречаются'как, в пресных, ; тая и в'ьюрских водоемах, в промышленных и хозяйственнобытовых'.сто-, чных водах, и в почве. Сравнительное изучение количественного сос-' тава бактерий, продуцирующих литические'ферменты.и других групп ■. -гетеротрофных микроорганизмоввисследованных биотопах позволило \ выявить особенности распространения штаммов, обладающих литически- ; : ми'свойствами.1 ' . •;>''■;"'■.' У." : .' ■.■■■'..*■■,.■

' ■ Ц^зойилънце #аКТ?р!рт.ЛИЗИРТЩДД9 ,

В естественных водоемах абсолштная.числевность'бактерий^этой.группы очень мала и составляет от 0-1 до нескольких,десятков (и редко сотен) кл/ил. Относительное содержание в структуре гетеротрофов . колеблется в шфоких пределах (в среднем от,0,0002 % до 0,07 -¡8)'-'

- таблица I; ■'л ^Я ■ " . ■ \ :.'■'■ /■ В водоемах," имеющих постоянные-источники загрязнения свежим органическим;веществом или находящихся вблизи источников-загряз- -нения и характеризующихся высоким содержанием.£40-60 %) грамотри- . нательных бактерий,'.'наблюдается максимальное содержание мезофилъ- ' ных бактерий,лтаируодих 'Р. легадхлеха. , составляющее' ..* 0,01-0,07 % общего количества гетеротрофов (Рижский залив, канал ' Саиар, Химкинское водохранилище). в биотопах, расположенных вдали -от источников' загрязнения, - с малым содержанием грамотрицательных .: форм (менее 10 % от общего количества гетеротрофных микроорганизмов) содержание мезофильных бактерий, лжзирущих. Р <*ег-ид*г№& Крайне* мало и составляет в среднем 0,0002-0,0008 #.гетеротрофов (роки Ока, Амзгр). ' .'' ' ' '"-. Д '.':. - Г . - '•.

- „ -Четкая взаимосвязь дшилики численности мезофилышх бактерий, лизируйцих -Р.-аег-щгяез*'^ и уровня'общей микробной -загрязненности наблюдается в'системе очисткц хозяйственно-бытовых сточных вод. Выявлена црямая (сольной степени.теснотц) корреляционная связь между общим количествен гетеротрофов. и грамотрицательных 'бакт ерий с одной сторона и численностью бактерий, лнзируища* ,

- с другой/(коэффициент-корреляции рфсона" 0,9 и 0,8 соотвотст- . векно при уровне вероятности Р< 0,01).'-Такая яр'(во"средней степе" ни тесноты) связь' обнаружена между численностью псевдомонад ибак-

терий', лиз!фу1зцих Р-. (коэффициент, корреляции 0,45 при

Р«£ 0,05).' На'этапах механической очистки (решетка - первичный ' отстойник) отмечается прогрессивный рост численности лнтически ак-

Количественный состав некоторых групп гетеротрофных бактерий; в том числе бактерий, лизирувдвд Рмае/ы в водоемах я сточных водах

Таблица 1.

Объект и место исследований

Средние величина

Темпера-VКШ® . КГО^6 : КГОБ -Псевдо- ■ Бактерии,'- лнзирущне

С ■ Ргасхий залив (добере- - ■■ ■: " ■ . ■ v: Л'.- ■

лье Лнелупе-Дзинтари) :■■ 15,5 2,8 . 1,7 60,7 ■ V 0,2 2 0,07 - не иссл, ■ - <

р.Ока (г.Пувдно)- ; 22,0 47,1 . 2,4 : 5,1 0,1 0,4 0,0008 2 ' -0,004 ■ о

р.Салар Сг.Ташкент) : ' ■ ^ 16,0 40,9 22,4 - 54,7 0,8 ; . 5 . 0,012 7 0,017 ,

" Химкинское водохрани- • : V — .- •■■: ' .. *■'. ' : : ■-' '

' ' ладо ■■„ Л ■ 14,0 . 308,4 128,4 41,6 15,6 .. 100 0,03 ; 42 0,013 . .

; р.Амур (¿.Хабаровск) ^ \ 22,0 4308,0 409,5 8,5 8,3 ' . 12 0,0002 .49 0,001 '<■" 4

? точные" вода г.Пущино ' ■- 1 -. ' ' ■ ■ V' '.-* ■ ";' Л • " : "' ■" '.'■ - - -

первичный отстойник) : 20,0 5388,0 1932,0 . 35,9 25,9 . ^815 0,015 . 4566 0,09

Сточные воды ДОК ' ':'■'.'■ ■ ', ,-' ' ' V ■ • ' . ;

.- г.Амурска - • ' ■ »■-■ ' V- ■■■■■.-.-■'- ■:'■-■■-■' ■ ' • .

(аэротенка) • • 33,0 17780,0 • 4260,0 24,0 '5,4 О :. ;. . - Г. ; 5 0,00003

■ X Количество гетеротрофних ишфоорганизмов ". . .„ ■" ■ ; : ■ -1 :

■ m Количество грамотрицательных бактерий ....." ' >. . 1 . /

РисЛ. Динамика.численности различных групп гетеротрофных ■"".. бактерий на этапах очистки сточных - вод г .Пущино ,

общее количество гетеротрофов; ^^^ -количество

грамотрицательных бактерий;'_• IIIIIII -бактерии рода

" Psee/cfo/rronas .;. А .'■'■,. I . J -мезофилышо бактерии- . ■'• щродуцентн литических ферментов (29-30°С); ДЛД -термофильные бактерии-продуценты лигических ферментов (45 °С);• 1 :■*■■.

I- на входе в очистные сооружения (до решетки); П- на выходе п^сле решетки; Ш- навыходе из песколовки;: 1У'-первич- ' ный отстойник; • У- аэротенд;'У1- вторичный> отстойник. |.А

тивных бактерий,'достигающей I03 кд/мл.На этапе биологической очистки их численность начинает уменьшаться и во.вторичном отстойнике составляет только 0-1 .кл/мл. ■.' ■ ~ г;■АПл*'- ■'■'■ .:■'.■'< j

В сточных водах"целлшозно-картонной промышленности ■ мезо-^ильные.бактерии-продуценты.литических ферментов отсутствует, а в почве встречаются лишь в единичном количестве. . А■ .

Термофильные бактерии, лизитгюшие <3ertt<?inos<i '.Числен— ность бактерий этой ipynnu имеет тенденцию к возрастанию в во-

V доемах о более высоким уровнем микробной загрязненности (табл. I).

Не выявлено зависимости их количественного состава отпреоблада-■■■ ния в структуре гетеротрофов тех или иных изучаемых групп бакте-* ■ ^ рИЙ. .: 7 -.": у'^'.. \ ; ' ■'.■■■■;...

: > В системе очистки бытовых сточных вод численность термофяль-^ ных продуцентов на всех этапах достигает нескольких тысяч кл/мл и снижается по;мере уменьшения общего количества гетеротрофов во, вторичном отстойнике. Максимальное распространение термофильных бактерий,' лззируицих Р. •аегирглезл :, наблюдается в почве' смешанных и лиственных лесов~(до 24 тысяч кл/г) и значительно меньше в почве-хвойного'леса и пахотных полей (100-300 кл/г, рис. '2), ^

.7 V « 5

4

.>

■г

; I,

шкрроргояазмоа

Рис. 2. Численность различишь групп гетеротрофных-бактерий в . дерново-подзолистой почве под-разными растительными • • • ассоциациями (Московская область)' /Л

■I- численность гетеротрофов на МПА;- 1 ■'

: ЕЗЭ-бактерии, рода' Р^а/сЬжегглз на среде Дифко для поевдо- ,' ; ■"; монад; 7" ГГ¡.л " .: .;■■■■.■.".. • . .

/ - Е23 -' бактерии, ' продуцирующие литические ферменты при 45?С; СИ- бактерии, продуцаруьщие литические ферменты при '

■ ' 2.' Вцделение'бактерий, продуцирующих литические ' •"

; - 'ферменты против Pseudomonts . ¿ere/ft/tosa '

v : Из различных;источников было выделено 100 культур бактерий, .:

Продуцирупщк литические ферменты в мезофильньос условиях ■'.;■' .."г (29-30 °С), и 104 культуры,продуцдоувдиелитические ферменты в ' Í условиях, близких к термофильным .(45 °С).' В процессе ввделения Í большого числа штаммов было установлено, что при использовании . * ; "¿.-.■данного:метода'можно достаточно эффективно обнаруживать и ваде-

лять штаммы . бактерий, продуцирущие .литические ферменты, опреде- 1 ..-'■'. ляя их то-образованию зон просветления газона тест-бактерий' вок-' ■ч .■ l руг колоний.' О том, - чтолизис происходит. под действием литических ..

фердентов,' свидетельствует способность лизировать и кивые, и мерт-',... вые клетки тест-бактерии.. ;:. '■■■•лЛ[ .'■"■■■. С ."

• ' .3. Таксономическая принадлежность бактерий,лазируадах ,

•. físeudomefJS ¿tet-ugt/tesj • ;■■;-■:!■■■.

- При; определении мезофильных. й термофильных нзолятов было установлено их таксономическое различие.' В связи с утратой яитичес-. ких свойств у большинства мезофильных культур г процессе хранения . их определение проводили до рода; 99 % штаммов"этой грущш оказа- ..,..' лись грамотрицательными бактериями. Бактерии рода fireadomonés : составляли 06 % штаммов, бактерии рода BrWinia 7 %, А$го~

monas - 3 %Alcátiffenes- 3 %-а factilus - i Термофиль- . '.' ные бактерии были представлены' одним видом - Bsct ¿it/s su¿ tvlis .'■' : Штаммы '8. su¿t¿¿ts . o - одинаковым« морфологическими, „ культураль- .: - ными, биохимическими и физиологическими свойствами были выделены из водных 'и почвенных биоценозов различных климато-географических ■■■\ зон. .■ ■■ ' ■ ;■■'■'■.■'.■."■ ■'.■'",■"■■■■ ■ ■■. ■;'.". .':

4. Характеристика литического действия выделенных -. штампов на Pseudomonas aerupt/rosa ■■:. ■

Сравнительная характеристика литического действия мезобильных и термофильных штаммов на - aervyúicsa . .. цри росте на плотной питательной среде в присутствие клеток тест-бактерии представлена в таблице 2. v ¡ ■ ■.'■■■.-■ : . Л.,г . ;'..

•-„ v ' •';': ■"■"- -К Таблица 2

- Логическое действие мезоф илышх и термофильных штаммов при росте на агаризованной среде, содержащей живые и мертвые клетки 'fi¡eucfemos>as

■г.-. - Мезофкльные (29-30°С)- Термофильные (45°С)

Своего 100 штаммов) (всего 104 штамма)

'живые :клетки

На газоне, содержащем:

мертвые живые мертвые клетки • : клетки КЛЄТКІ?

1, Число штаммов, сохранивших литичес- .'

. кую активность после 6-месячного■

"'■■ -хранения

2. Срок появления лизиса ' ;*, : ■

3, Диаметр'колоний.мл:

4. Диаметр литичёской ■ зоны, мм .

■ II 24 - • 98 • 100

(включая " : л"- -9 штаммов', ' '■.■■'' :

" • 'лизируэдих • ., .

■'■ -"—'о■ и жвгые «

клетки).- _ <у: л

3-7-е. . - 18-48-Ч. . 24-48 ч. 6-Ю ч. " ■■ сутки ■ . • ' - ','.■■ ■

: 2-6 7-12 " I-I8 / 2-28

'4-Ю 8-30 4-30 1^-40'• .

Способность выделенных штаммов продуцировать литические ферменты при росте на кадкой питательной среде' показана вг таблице 3, , Термофильные штаммы обладают более выраженным и;быстрым лити-ческим действием на й ае/ъумсза] ' на плотных питательных сре- ■ дах {рис.3), среди них чаще встречаются варианты,. продуцирующие .'■'..

Таблица 3

Литическое действие меэофилькых и термофильных штаммов ■ ' при росте в жидкой питательной среде в.отсутствие клеток

■ Степень лизиса

'. Число юта.\?мов 1 -" \

Мезофилъные (29-30-С) Термофильные (45 °С) -

к живым

к мертвым к живым. к мертвым

■ клеткам клеткам ■ клеткам- клеткам

• 0 .V. 92 у' '■V 92 ■■■Л:.' 6 о V-

от 0 до 5 .* ч' 5 ;; у 0 -'.л- э.; з ■ : ■■;

от. 5 до 10 , ■;■ 2' 0 ' 5 ■ 5

ОТ 10 до 20 1 • 7 л • 24 ■■ ■■■■■'.'4

от 20 до 30 . 0 - 4 ''

от 30 до 35 ■■ * 0 0 1.'

от'35 до 40 ■ ■ V ■ . ■";: о • 2

от 40 до:60 Г .■ ' 0 - ■ 0 " ■ 12'

от 60.до 70 ; - ■0 ^ о ■ СЗ

от 70 до 90 ' ■л 9 ' 2 ; ^ . ; 0 ;' II ■ ■■■■.'■

Всего: У. . хоо. . 100. - /104 , 104

логические ферменты при росте в жидкой питательной среде. Куль, туральная жидкость термофильных штаммов облагает большей -оптической активностью, и она долго сохраняют литические свойства "без заметного снижения актхвности» .'.тт.";.. * - -

■ В таблице 4 представлены штаммы, куль туральная жидкость ко- ■ торых обладала Наибольшей степенью литической активности по отношению к. Р , ;_ ■'-■ V ■■.' -' ■ ■•'; .

Рис.3. Литичоскае зоны вокруг колоний. &. £и4?шб СЛ-1 • на газоне хешах клеток . Р <зегиу/яо^а В-;1, двуслойный . . агар, 45 °С, 48 часов А . : - ■ ■'. А '-"

. V — -'"Ч А г- '■"*.■..; :*':■■'".. Таблица::"у

Штаммы бактерий, обладамцив:наибольшей литнчесной • активностью'культуральной гсидкости 1—- ; ■■■ I?'

Штамм

Степень'лизиса клеток . • живых : ; мёртвых

■"..*: Источник ... ■ .

3. : сл-1;; .30-35'

8. ,;' СЛ-27. : 30-35

.'- ' ' • ' ' ' '•••

■ 30-35, СЛ-31 '30-35

В ; СЛ-32. 30-35* Р&иХоп1С- I; ■ 9-12

' 70-90 сер^е* Ст.Ташкент).

■ 70-90 почва смешанного*' ■ , ■;' ; ;леса Московской области- . .

70-90 ' ' •

70-60 река Амур. Ч-л:

: 00-70 , река Агдур;

! 70-90 \ • сточные вода ■ ■- ' : : Г.ПуЩИНО

Выделенные шташы засаживают,внимания как потенциальные .продуцонты литичоских ферментных препаратов. • ; ■'-'.:'.*■■

" ' ; " с учетом широты спектров литического действия ферментные г ;: препараты, полученные.с помощью.этих штаммов, могут,найти при- ' меноние в различных областях науки,и.практики, для разрушения , живых или - инактивированных клеток бактерий,-в первую очередь',' грамотрицательных.* В связи с актуальностью проблемы грамотрица-' тельных бактерий в медицине . такие препараты могут быть использ о- ., ваны в дезинфекции,'стерилизации и,'возможно,, лечении больных о - :-, ^отдельными формами инфекций, вызванных различными представителя* ми грамотрщательной бактериальной "микрофлоры. ..' \

■ .:.; *■' 5. Спектры литического действия

-1-. '. Изучены микробные спектры литического действия у всех кггам-

: мов-изодятов мезофильной (100 штаммов) и термофильной (104 вгаам- -, *; ма) групп при росте на плотной питательной среде, содержащей живые и мертвые (раздельно) ктотки 'тесх-мшфоорганизмов. Изучены ■ , также;спектры литичеркой активности культуральной жидкости у 8 штаммов мезофилъноЯ и у 12 штаммов термофильной группы по отношению к живым и мертвым клеткам твемликроорганизмов.„

V * В результате анализа полученных спектров обнаружены следую-

■■■.;■■ цие закономерности: . , . .г■ ■ '■■'■■' ■..>. ■?•':,.■.■" Л. л

- \^ . ; : штаммы 'бактерий обеих групп не обладают специфичностью ли-. . тического действия ни ввдовом,* ни,на родовом уровнях; : " .-Г

. ,представители термофильной, группы обладают широкими спект-/ рами действия по отношению к живым клеткам хтамотридательних и ' . " лизируют некоторые грамположительные бактерии, а спектра действия , / мезофкльных „штаммов. в отношении. живых клеток' бактерий резко огра-

, Г' .

'" V - ''' % • , I, 'I' ' * х Л ''4 г:•/ чу'

•'■■ кичеыы; , . .» . . • •>. ч'

:в мезофильной"грушхе'стойко сохраняют литические свойства? только некоторые штаммы рода - Рхеие^оягояяз. ; утрата способно- ""' ' СТИ лизировать ЖИВЫ6ИЛИ МерТВЫе КЛеТКИ;;/? не- все- -

> ■. ;гда сопровождается уних утратой способности лизировать клетки : ^ . Л ; /других бактерий; . : Г';'?- ;', • г I-

! .'г: -: штаммы .термофильной грушш о^идеэтитаыми биологическими;: - Л. .

свойствами'обладают,'почтигвдентлчН1^:спен1рши :дейогаиг незави-^ ' ., -;.,,*' с шло . от источника их выделения различия- в биологических - свойст- : Г. ■ ■ вах -сопровоадаются у, них различиями в спектрах лизаруемых" бакт©^

^ -1 ■ / -

'* , термическая инактивация клеток.тест-микроорганизмов приво-

: " - дит к-расширению спектров чувстаотельта грамотрицательных банте- Л.'. ''.рий и сужению - спектров лизируемых: грамположительных бактерий, у, .''

,. :-.■ могут не совпадать;^ • '. V/ ... • ■ ."'• ."V ' ¡.-. ,1ч' ; . .: >'• ■■■■ -. ■ - т ■ . ■ ),-.■.- .---.т. ■, /',.;>, ,•■>. г",-■: ■ ■ ¡'..-«

■ ■■ ' , ■: • .••"••. ;»•••*' • - :•*-.' -»^Л.-..-.;,^- ■.:- • -":. :.>— .ч - •. "

- живые клетки.различных видов псевдомонад проявляют более,вы- -

- раженную чувствительность ■ к действию культуральной жщцсости шта№- ■ ■ >

мов термофильной группы, а мертвые, клетки псевдомонад и энтеро- ' ■

■'*-д* бактерий - к.действию 1дгльтуральноа.яадкости штаммов " Аге^аЬ- /

:г; ; . грамположцтельные бактерт: обладают слабой чувствительностью <!*• ^■'к*литическим ферментам культуральной жидкости штаммов обеих групп.

• - • •' • - г Спектры литичеокого действия культуральной "жидкости двух. . ■ • \ штамлов мезофштьдой и термофильной. групп представлены ка рис. 4и.

Рис.4. Спектр логического действия культурапьной жидкости . штамма Рлеис/етом* : ЛС-1 по отношению к живым ( о ) и мертвым С . • )-клеткам

Рис.5., Спектр литического действия югдьтуральной жидкости "'■■■'■СЛ-1 по отношению к живым С , о ) И мертвым ( • ) • V ■ клеткам 7? . ' ; . ; '

*• ."■ - .вы В О'д- Ы'- ; ' ' •• ' " Л,

X» Бактерии, щюдуцврутадае"внеклеточные логические фер- ;.}' ;. менты против Asece/oirron^s jerufinoss : при 45°С, распро-стран ендае в' почвенных и водных биотопах; относятся к виду . ; "

SjetlLus ', ■!/■„ • ,

.¡ ■2.-Постоянными источниками "-'для наделения штаммэв ¿Jet/-_ , Cus -suátitis .ЛИЭИЕУЙЩИХ ,№>vrs служить дерново- '-.;'

подзолистые почш (горизонт AqJj) лесных массивов с цреищу- ; щественно лиственным характером.растительного' покрова (бере-; V эовый лес), а тайке хозяйственно-бытовые сточные воды. Числен-насть-бактерий-продуцентов логических ферментов в почвенных . -<&ото1Шх достигает;10-аС|,тво^клеток » I г шчви; а в сточных •. водах - 5-IO тыс .клеток в I мл воды. .V . . V'. '.а- 7

3. Бактерии,: продуцирующие внеклеточные литические .' ферменты против Afeut/omoMs ^erugtaosj при 29-Э0°С, распро- ■';■■■ странектм в естественных водоемах и сточных вода^,..являются ' .

" представителями родов ■;, frt-tWtít ; Г I Aei-asmtoJS

И . Alcalige»Q& ■ '.;...';' ■■ -.'-.-Л л V"

4. Постоянными источниками гетеротрофных бактерий, ли-зирупцих Ajeruyirtosá при 29-30°С, могут служить хозяйств ' венно-бытовне сточные воды и загрязненные участки водоемов с. j';

-содержанием грамотридательных: бактерий 40-60 и более % от общей численности гетеротрофов с;преобладанием среди них бакте-■ рИЙ рода /'■Sbe/Jostto/rjs \ ' ■,' : ■ ' " ■ i - ' ■ Y.'.1

' 5. И^аыш-продуценты оказывают .более Г;*

интенсивное ЛИТИЧеСКОв 'деЙСТШе .На Seri/fthoSJ .

при росте на плотных питательных, средах, чем штаммы бактерий мезо-:

.■■■'■■■г -21- ; -; ■■

фяльной группы; свыше 90^ штаммов продуцируют ли- -

тические ферменты ори росте в " жидкой питательной средэ и сохраняют высокую литическую активность в течение длительного времени.

6. В результате скрининга 204 бактериальных изолятов"отоб-раны штаммы,: обладающие наибольшей лигической активностью,- ре- . камендуемне' для получения литическгас ферментных препаратов, т-зируицих живые и мертвые клетки Дееас/о/гголія вегцуілеіЯ.

' 7, Бактерии, продуцирующие внеклеточные литические фермен-• ты против , не проявляют специфичности ,

литического действия ни на видовому ни на родовом 'уровнях и обладают широкими!спектрами действия, включающими многие храмотри-цателыгае и некоторые.грамположитольные бактерии. ; . < '

, '8.. Разработаны методапеские рекомендашга для направленного поиска и выделения штаммов бактерий, продуцирующих внеклеточные литические ферменты В отношении , ' ■-: У

■■'І

- йг -

По теме диссертации опубликованы следующие работы: .

1. Седявко A.B., Ламбина В.А., 1982.

* Микроорганизмы, лизируыцае Pseudomonas tfcr-i/^x/rostt . , в системе бытовых сточных вод. В сб.Микробиология очистки , вода. - Тез.докд. ^Всесоюзной ков$,, Киев, 7-10 декабря ^

' 1982 г., Киев, "Наукова думка",'" I8I-I82. "" " ' '' .'.' '

2. Селявко A.B., 1983. : " Микроорганизмы, продуцируициё литические ферменты против ; ßseu<fomen<t&', и источники для их выделения. ;

. В сб.; Некоторые асдецты физиологии микроорганизмов: йизио-

логические, биохимические и молекулярно-биологические исслё- ■ - дования, Пудяно, 51-54. ' . 'v , ■-. '■: 1 ■ " : . ^.• - -. '.<

3. Селявко A.B., Ламбина В.А., 1985. ■ '' V, . ' •• Распространение микроорганизмов, лизирувдих; А^аи^^ллг жги-gtHosä и ■ftjpAytococcvs <зигеаа « системе бытовых сточных вод. - Еиол.науки, Л 4,-84-88. ■ Т- ■ ■'>

4. Ламбина В.А., Солявко A.B., 1986,. '.'■'-■ .'■ ■ ■ - ; : Распро с гранение микроорганизмов, лизиругацих flfet/o'ojnMfS ; ■

, легир/тееа , в водоемах и почве* — Микробиология,: т.55, v вып.1, 135-137. ' :

- Л.-77І0І, . г.оз.ез г. а»к. 9ігр. ■ т*р. 125 вм, Оішчатаао ве ' ро»пЕив*е в' ОНТИ нші. ' -