Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp.

Васильева, Наталья Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp.
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp."

004606811

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВА НАТАЛЬЯ ВАЛЕРЬЕВНА

РОЛЬ ВНЕШНЕМЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ В СЕКРЕЦИИ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ЬУБОВАСТЕК вР.

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2010

004606811

Работа выполнена в лаборатории биохимии клеточной поверхности микроорганизмов Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Степная Ольга Андреевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Моргунов Игорь Григорьевич

доктор биологических наук, профессор Калебина Татьяна Сергеевна

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится «18» июня 2010 г. в 10 час.00 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Учреждении Российской Академии Наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская обл., г. Пущино, проспект Науки, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии Наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайте Института: http://www.ibpm.ru/

Автореферат разослан « fit » U60td? 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Многие живые организмы - вирусы, бактерии, растения, животные -продуцируют бактериолитические ферменты, разрушающие клеточные стенки различных бактерий. Они используют такие ферменты либо для борьбы с конкурентными или болезнетворными бактериями, либо для проникновения в бактерию-хозяина и выхода из нее.

Бактерии, характеризующиеся сильно выраженной способностью лизировать различные микроорганизмы, объединены в род ЬухоЬасСег. Представители этого рода интересны не только с точки зрения изучения взаимоотношений внутри различных биоценозов, но также с биотехнологической точки зрения. К настоящему моменту в медицине сложилась весьма неблагоприятная ситуация в терапии инфекционных заболеваний из-за появления патогенных микроорганизмов, устойчивых к большинству используемых антибиотиков. Одно из актуальных направлений современных биомедицинских исследований в рамках решения данной проблемы связано с исследованием и использованием естественных механизмов антагонизма среди микробов. Продукция бактериолитических ферментов - один из примеров микробного антагонизма. Важным преимуществом бактериолитических ферментов является отсутствие у микроорганизмов устойчивости к их действию.

Грамотрицательная бактерия 1.у$оЬас1ег зр. ХЫ при выращивании в специально подобранных условиях секретирует в окружающую среду бактериолитические ферменты. На основе культуральной жидкости 1у$оЬас1ег 5р. ХЫ получен антимикробный препарат широкого спектра действия - лизоамидаза (Кулаев и др., 2002). Ранее из культуральной жидкости ЬухоЬаМег ер. ХЫ были выделены и охарактеризованы четыре бактериолитических фермента (Л1-Л4). При длительном культивировании Ьу$оЬааег 5р. ХЫ на среде, способствующей секреции бактериолитических ферментов, в культуре появляются и со временем накапливаются клетки малоактивного штамма £у$оЬас1ег Бр. Х1Л, которые способны продуцировать только два бактериолитических фермента - Л2 и ЛЗ (Степная и др., 1996в). По специфичности действия на бактериальные пептидогликаны литические ферменты этой бактерии являются эндопептидазами (Л1 и Л4) (Степная и др., 19966, 2005), амидазами (Л1 и Л2) (Степная и др., 1986, 1992, 19966), мурамидазой (ЛЗ) (Степная и др., 1996а). При изучении генома Ьу$оЬас1ег яр. ХЫ установлена нуклеотидная последовательность гена, кодирующая бактериолитический фермент Л1, и гомологичная ей последовательность (60% гомологии), кодирующая неизвестный ранее белок, который был обозначен как бактериолитический фермент Л5. Обе последовательности в разной степени гомологичны а-литической протеазе 1.у$оЬас1ег етуто^епея (78% и 56% гомологии соответственно) (Кулаев и др., 2005).

Бактериолитический фермент Л5 ЬухоЬааег 5р. ХЫ ранее не был выделен в чистом виде и не были охарактеризованы его свойства. Совершенно никакой информации не имеется относительно путей секреции бактериолитических ферментов бактерий рода Ьу$оЬасШ. При изучении структуры генов, кодирующих ферменты Л1 и Л5, предсказано, что синтезируются они в виде препробелков. Следовательно, секреция этих белков из цитозоля бактерии в окружающую среду должна проходить по одинаковой схеме, в два этапа. Первый этап заключается в секреции через цитоплазматическую мембрану в периплазму. Наличие пре-части (сигнальная последовательность) позволяет предположить участие в этом процессе

See-зависимого секреторного пути. Второй этап, т.е. секреция из периплазмы в окружающую среду, может осуществляться несколькими путями, в том числе посредством внешнемембранных везикул, которые образуют многие грамотрицательные бактерии. О способности бактерий рода Lysobacter образовывать везикулы ранее не было известно.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования было установить, образует ли бактерия Lysobacter sp. (штаммы XL1 и XL2) внешнемембранные везикулы и если да, то исследовать их роль в секреции бактериолитических ферментов. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать способность клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2 образовывать везикулы.

2. Выделить и охарактеризовать везикулы Lysobacter sp. XL1 и XL2,

3. Выделить и охарактеризовать бактериолитический фермент Л5 Lysobacter sp. XL1.

4. Исследовать клетки Lysobacter sp. XL1 на присутствие в них белка SecA - компонента See-зависимого механизма секреции белков через цитоплазматическую мембрану.

5. Установить, попадают ли бактериолитические ферменты Lysobacter sp. в окружающую среду при помощи везикул.

6. Исследовать литическое действие везикул Lysobacter sp. XL I по отношению к различным микроорганизмам.

Научная новизна работы

Выделен, очищен и частично охарактеризован новый бактериолитический фермент JI5 Lysobacter sp. XL1. Впервые для бактерии рода Lysobacter показано наличие SecA белка - компонента Sec экспортного механизма секреции белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму. Впервые установлена способность клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2 образовывать внешнемембранные везикулы. Показано, что Л2 фермент Lysobacter sp. XL2 и ферменты Л2 и Л5 Lysobacter sp. XL1 попадают в окружающую среду при помощи везикул. Везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют широкий спектр литического действия по отношению к различным видам микроорганизмов.

Научно-практическое значение

Полученные в работе новые данные расширяют представление о роли внешнемембранных везикул в секреции белков у бактерий и межбактериальных взаимодействиях. Характеристика нового бактериолитического фермента Л5 дополняет знания о структуре антибактериального комплекса лизоамидаза. Результаты работы указывают на возможность применения препарата везикул и очищенного фермента Л5 для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных патогенными для животных и растений микроорганизмами. В Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) было проверено лечебное действие везикул Lysobacter sp. XL1 и очищенного фермента Л5 на моделях сибиреязвенной инфекции у беспородных белых мышей. Показано, что очищенный фермент Л5 не обладает лечебным действием, в то время как везикулы, содержащие этот же фермент, оказывают лечебный эффект в 100% случаев. Эти результаты позволяют считать целесообразной разработку в дальнейшем методов «упаковки» отдельных бактериолитических

ферментов в искусственные везикулярные структуры для получения эффективных лекарственных средств.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международная школа-конференция, посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино, 2006), The Fourth International Conference on «Science and Business» NanoBio and Related New and Perspective Biotechnologies (Pushchino, 2007), VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 2009). По материалам диссертации опубликовано две статьи, подано две заявки на патенты.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на fJÇ страницах, содержит S таблиц и /у рисунков. Библиографический указатель содержит ¿32 источника литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом данной работы являлась бактерия Lysobacter sp. (штаммы XL1 и XL2), секретерующая внеклеточные бактериолитические ферменты. Культуры выращивали при 29°С на качалке в течение 18-21 ч, что соответствовало началу стационарной стадии роста. Культивирование вели на модифицированной среде LB. В состав среды, способствующей продукции бактериолитических ферментов (среда 1) входили: пептон - 5 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 5 г/л, рН 7.5. В состав среды, блокирующей продукцию внеклеточных белков (среда 2) входили: пептон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 20 г/л, NaCl - 5 г/л, рН 7.5. Агаризованные питательные среды содержали агар в концентрации 1.5 %. Бактериальные штаммы, которые были использованы в качестве тест-культур, выращивали на среде 5/5, содержащей дрожжевой экстракт - 0.1%, соевый экстракт - 3%, триптон - 0.5% и аминопептид -6%, рН 7.2. Дрожжи выращивали на сусло среде. Мицелиальные грибы выращивали на глюкозо-картофельном агаре.

Периплазматическую фракцию клеток Lysobacter sp. получали осмотическим шоком по методу Носсала и Хэппела с модификациями (Nossal, Heppel, 1966). После обработки осмотическим шоком клетки суспендировали в 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, замораживали при -70°С, а затем разрушали продавливанием под давлением 9 атмосфер на прессе, разработанном в ИБФМ РАН. Полученную массу центрифугировали при 8000 g в течение 10 мин для удаления неразрушенных клеток. Затем надосадочную жидкость центрифугировали при 18000 g в течение 30 мин. Осадок содержал клеточные стенки и мембраны, надосадочная жидкость - цитозоль. Разделение белков внешней и цитоплазматической мембран проводили по методу Шнайтмана (Schnaitman, 1971 ).

Везикулы получали из культуралыюй жидкости Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2. Клетки из 0.6 л культуры удаляли центрифугированием при 4500 g в течение 20 мин и повторным центрифугированием супернатанта при 22000 g в течение 25 мин для удаления оставшихся клеток. Из полученной культуралыюй жидкости везикулы

осаждали центрифугированием при 140000 g в течение 2 ч при 4°С. Осадок везикул дважды промывали 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0 с последующим центрифугированием при той же скорости в течение 1 ч. Затем осадок везикул ресуспендировали в 3 мл 10 мМ Трис-HCl, pH 8.0 и хранили при -20°С.

Для негативного контрастирования препараты изолированных везикул или бактерий обрабатывали 0.2% раствором уранилацетата в воде. Ультратонкие срезы готовили как описано у Рейнольдса (Reynolds, 1963).

Для определения литического действия везикул использовали живые клетки грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. На подросший газон клеток-мишеней наносили 25 мкл препарата везикул Lysobacter sp. XL1, что соответствовало 24 мкг суммарного белка. Чашки продолжали инкубировать при 29°С до появления зон лизиса.

Электрофорез белков в 12.5% полиакриламидном геле проводили в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС-Na) по методу Лэммли (Laemmli, 1970). В качестве маркеров использовали белковые стандарты (Хеликон, Россия) следующего состава: целлюлаза - 94.6 кДа; бычий сывороточный альбумин (БСА) - 66.2 кДа; овальбумин - 45.0 кДа; карбоангидраза - 31.0 кДа; ингибитор трипсина - 21.5 кДа; лизоцим- 14.4 кДа.

Иммуноферментный анализ проводили после электрофоретического переноса белков с полиакриламидного геля на мембрану ПВДФ (поливинилиденфторид) (Bio Rad, США). Буфер для переноса содержал 25 мМ Трис-HCl, 200 мМ глицин, 20% метанол и 0.02% ДДС-Na. Перенос вели 2 ч с охлаждением при 80 V и 250 тА. Мембрану обрабатывали поликлональными кроличьими антителами к Л1 и Л5 ферментам или к белку SecA Е. coli, а затем коньюгатом белка А с пероксидазой хрена (Bio Rad, США) и проводили детекцию при помощи хемилюминисцентного субстрата (Pierce, США).

Концентрацию белка измеряли по поглощению при 280 нм и методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Содержание 2-кето-3-дезокси-0-маннооктоната (КДО) во внешних мембранах и везикулах определяли по реакции окисления КДО перйодной кислотой (Karkahnish étal, 1978).

Тейхоевую кислоту из клеточных стенок S. aureus 209Р выделяли методом горячей экстракции, предложенным Армстронгом с соавторами (Armstrong et al., 1960). Клеточные стенки S. aureus 209Р и В. subtilis W23 были получены в лаборатории ранее методом Шарона в модификации Шоу (Shaw et ai, 1970). Клеточные стенки Е. coli Kl2 также получены ранее как описано у Стрешинской с соавторами (Стрешинская « др., 1979).

Общую бактериолитическую активность определяли турбидиметрическим методом. Для этого в 0.6 мл суспензии автоклавированных клеток S. aureus 209Р в 10 мМ Трис-HCl, pH 7.5 - 8.0, с А54о=0.5 o.e. вносили 10-25 мкл ферментного препарата (0.11 - 0.28 мкг фермента Л5) и инкубировали при 37°С 5-20 мин. Реакцию останавливали помещением пробирок в лед и измеряли поглощение суспензии при 540 нм. За единицу бактериолитической активности (ЛЕ) принимали такое количество фермента, которое приводило к уменьшению поглощения клеточной суспензии на 0.01 o.e. при 37°С за 1 мин. Бактериолитическое действие ферментных препаратов определяли также по их способности лизировать автоклавированные клетки 5. aureus 209Р в концентрации 1 мг/мл в 50 мМ Трис-HCl, pH 7.5 - 8.0,

вплавленные в 1% агарозный гель. В геле делали лунки, в которые вносили по 10 мкл каждого образца и инкубировали при 29°С до появления зон лизиса.

Протеазную активность измеряли по скорости расщепления казеина по методу Халла (Hull, 1974) с модификацией. Для этого к 0.2 мл 1% раствора казеина добавляли 0.2 мл раствора ферментного препарата. В контрольные пробирки вносили раствор казеина без фермента. Контрольные и опытные пробирки инкубировали 10 мин при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 0.8 мл 5% ТХУ, а в контрольную пробирку вносили еще 0.2 мл раствора фермента и все пробы вновь инкубировали 10 мин при 37"С для формирования осадка. Полученный осадок отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 5 мин и в супернатанте определяли поглощение при 280 нм. За единицу протеазной активности (ПЕ) принимали такое количество фермента, которое при 37"С в течение 10 мин превращало казеин в неосаждаемое ТХУ состояние в таком количестве, которое соответствует повышению оптического поглощения реакционной смеси при 280 нм на 1.0.

Активность циклической фосфодиэстеразы определяли по скорости образования р-нитрофенола, используя в качестве субстрата натриевую соль бис[р-нитрофенил)фосфата (Serva, Германия) (Neu, Heppel, 1965).

Активность глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы определяли по скорости восстановления НАДФ (Kornberg, Horecker, 1955).

Активность М-ацетилмурамоил-Ь-аланинамидазы обнаруживали по способности препаратов гидролизовать синтетический субстрат Abz-Ala-Ala-Phe-pNA (антраноил-аланил-аланил-фенилаланил-паранитроанилид).

Мурамидазную активность обнаруживали по способности препаратов гидролизовать субстрат 4-нитрофенил р -0-!Ч,>Г,К"-триацетилхитотриозид (Sigma, Германия) (Ballardie, Capton, 1972).

Очистку бактериолитического фермента Л5 проводили с использованием носителей и колонок фирм «Pharmacia» (Швеция) и «Amersham Biosciences» (Швеция). Чистоту белковых препаратов определяли электрофоретически.

N-концевую аминокислотную последовательность белка определяли методом автоматической деградации по Эдману на белковом секвенаторе "Applied Biosystem™'' (модель 477А, США) с автоматической идентификацией фенилгиогидантоиновых производных аминокислот на анализаторе той же фирмы (модель 120А).

Для определения некоторых свойств фермента JI5 в качестве субстрата использовали автоклавированные клетки S. aureus 209Р. Для определения оптимального значения рН использовали 10 мМ растворы Na-ацетатного буфера (рН 5.0 - 6.5), Трис-HCl буфера (рН 6.5 - 8.5) и Na-карбонатного буфера (рН 9.0 - 10.0). Определение оптимальной концентрации буфера проводили в растворах Трис-HCl, рН 7.5 с концентрацией от 5 мМ до 350 мМ. Зависимость бактериолитической активности фермента Л5 от температуры проводили при 30 - 100°С. Для определения температуры полуинактивации фермента Л5 препарат инкубировали при 40 - 90°С 15 мин, охлаждали, добавляли суспензию клеток S. aureus и проводили определение бактериолитической активности при 37°С. Для определения влияния ингибиторов на бактериолитическую активность фермента Л5 использовали: ЭДТА в концентрациях 1 мМ и 10 мМ, ФМСФ в концентрациях 1 мМ и 2.5 мМ, п-ХМБ в концентрациях 0.1 мМ и 1 мМ.

Литическое действие фермента Л5 на живые клетки определяли после нанесения 5 мкл ферментного препарата (0.05 мкг белка) на подросший газон клеток-

мишеней. Чашки инкубировали при 29°С, наблюдая за появлением зон лизиса. Для определения бактериолитического действия на автоклавированные клетки, выбранные тест-культуры выращивали в жидкой среде 5/5 и автоклавировали. После автоклавирования 2 мл каждой культуры клеток центрифугировали при 22000 g 3 мин и дважды промывали 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Плотность суспензии автоклавированных клеток доводили до А540=0.5 о.е тем же буфером и проводили определение бактериолитической активности.

Специфичность действия фермента JI5 определяли с использованием клеточных стенок S1. aureus 209Р, В. subtilis W23 и Е. coli К12. Реакцию проводили аналогично определению общей бактериолитической активности. Для определения типа гидролизуемой связи в пептидогликане S. aureus 209Р к 0.6 мл суспензии пептидогликана с А5)а=0.5 о.е. в 10 мМ Трис-HCl, рН 7.5, добавляли 50 - 100 мкл ферментного препарата, что соответствовало 0.5 - 1.1 мкг белка JI5 в реакционной смеси. Реакцию проводили 5 мин при 80°С и оставляли на ночь при 40°С. После инкубации регистрировали падение оптической плотности суспензии. Присутствие в гидролизате свободных NH2-rpynn определяли методом динитрофенилирования Гюзена и Строминджера (Ghusen et al., 1966).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 НОВЫЙ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ LYSOBACTER SP.

Для выделения бактериолитического фермента Л5 из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 была разработана многостадийная схема очистки. На первом этапе белки культуральной жидкости осаждали сульфатом аммония (80% насыщения). Осадок растворяли в 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 и наносили на колонку с DEAE-сефадексом, уравновешенным 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0. В этих условиях бактериолитические ферменты Lysobacter sp. XL I не сорбировались на DEAE-сефадекс, но препарат освобождался от балластных белков. Не сорбировавшиеся белки наносили на колонку с СМ-сефадексом при аналогичных условиях. После промывки колонки 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, сорбировавшиеся белки элюировали в линейном градиенте концентрации NaCl от 0 до 0.3 M в 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0. Фракции, содержащие бактериолитическую активность, объединяли, лиофильно высушивали, растворяли в небольшом объеме бидистиллированной воды и наносили на колонку Superdex75, уравновешенную 0.1 M Трис-HCl, рН 8.0 с 0.15 M NaCl. Бактериологическая активность элюировалась с колонки четырьмя пиками. Фракции с наибольшим содержанием бактериолитического фермента Л5 объединяли и вновь наносили на колонку Superdex75, уравновешенную 0.1 M Трис-HCl, рН 8.0 с 0.5 M NaCl. После элюции фракции, содержащие фермент Л5, объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 и наносили на колонку monoS, уравновешенную 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0. Элюцию сорбировавшихся белков проводили в ступенчатом градиенте концентрации NaCl от 0 до 0.5 М. Фермент Л5 элюировался с колонки при концентрации NaCl равной 0.11 M в активном состоянии и электрофоретически чистом виде (ММ около 24 кДа). Гомогенность полученного препарата была подтверждена также анализом N-концевой аминокислотной последовательности выделенного белка. Была обнаружена только одна последовательность N-концевых аминокислот: ATVQGGIxYRMP. Эта последовательность внесена в базу данных UniProt Knowledgebase (номер Р85158).

Были изучены оптимальные условия гидролиза ферментом Л5 автоклавированных клеток S. aureus 209Р. Показано, что максимально активен фермент J15 при значении рН 7.5 и концентрации Трис-HCl буфера 10 мМ. Температурный оптимум составил 86С . Фермент JI5 является термостабильным белком - температура его полуинактивации равна 75°С. ФМСФ в концентрации 2.5 мМ ингибировал фермент на 100%. Была исследована протеазная активность фермента Л5 с использованием в качестве субстрата казеина и синтетического пептида Abz-Ala-Ala-Phe-pNA, а также мурамидазная активность с использованием субстрата 4-нитрофенил Р-0-;№,1^',№'-триацетилхитотриозид. Показано, что фермент JI5 гидролизовал казеин и синтетический пептид, но не проявлял мурамидазной активности. На основании полученных результатов можно заключить, что фермент Л5 Lysohacter sp. XL1 является бактериолитической сериновой протеазой.

Фермент Л5 был охарактеризован по его способности лизировать живые и «убитые» клетки различных видов микроорганизмов. Результаты представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Таблица 1. Литическое действие фермента Л5.

Микроорганизмы Живые клетки Убитые клетки, ЛЕ/мг белка

Грамположнтельные бактерии

Bacillus subtilis W23 + 5120

Bacillus cereus 217 - 5270

Micrococcus roseus В123 6 + 3260

Micrococcus ¡ulcus В1819 + 3880

Corynebacterium xerosis - 4030

Staphylococcus aureus 209P - 8990

Rathayibacler trilici - 4030

Listeria monocytogenes n766 не определяли 14000

Грамотрицательпые бактерии

Pseudomonas fluorescens 1472 - 4490

Pseudomonas putida + 3880

Proteus vulgaris H-19 + 5580

Proteus mirabilis N2 + 5270

Escherichia coli Kl 2 ++ 5120

Erwinia caratovora В15 - 6510

Alcaligenes faecalis -н- 4650

Дрожжи

Torulaspora delbrueckii В KM Y-706 - 1550

Candida utilis В KM Y-74 + 1860

Candida boidinii BKM Y-34 + 1705

Candida guilliermondii BKM Y-41 + 1395

Saccharomyces cerevisiae M660 - 930

Pseudozyma fusiformata BKM Y-2821 - 1395

- нет литического эффекта; + есть литический эффект; ++ очень хороший литический эффект.

Из таблицы видно, что протеаза Л5 способна лизировать «убитые» клетки всех исследованных микроорганизмов. Очевидно фермент гидролизует пептидные связи в пептидогликанах различной структуры, а также структурные белки клеточных стенок

дрожжей. Однако не все живые клетки подвергались лизису после их обработки ферментом J15. Так, например, живые клетки В. cereus 217, С. xerosis, S. aureus 209Р, R. tritici, P. fluorescens 1472, E. caratovora B15, T. delbrueckii BKM Y-706, S. cerevisiae M660, P. fusifomata BKM Y-2821 оказались устойчивыми к действию фермента. Клеточные стенки живых микроорганизмов могут иметь такие особенности структуры, которые способны защитить клетку от действия литических ферментов.

Candida utilis Proteus vulgaris Escherichia coli

Рис. 1. Литическое действие фермента Л5 на живые клетки ряда выбранных тест-культур. Представлены фрагменты чашек с местом нанесения образца, где образовались зоны лизиса.

Действие фермента Л5 определяли также с использованием в качестве субстрата клеточных стенок S. aureus 209Р, В. subtilis W23 и Е. coli К12. В результате проведенных исследований обнаружена способность фермента Л5 гидролизовать пептидогликан с тейхоевыми кислотами (клеточные стенки) и пептидогликан без тейхоевых кислот S. aureus 209Р. Активность фермента Л5 на этих субстратах, измеренная турбидиметрическим методом, была низкая (2.75 ЛЕ/мг белка и 1.65 ЛЕ/мг белка соответственно). Вероятно, в процессе гидролиза ферментом Л5 пептидогликана стафилококка образуются большие фрагменты, что приводит к слабому уменьшению поглощения реакционной смеси. Гидролиз клеточных стенок В. subtilis W23 и Е. coli KI2 ферментом Л5 был очень эффективным, и активность составила 620 ЛЕ/мг белка и 845 ЛЕ/мг белка соответственно. Известно, что пептидогликаны этих бактерий имеют одинаковое строение и относятся к одному А1у типу. Такое же строение имеет пептидогликан Lysobacter sp. XL1 (Ситкин и dp, 2003в). Ранее была установлена способность фермента J11, гомологичного ферменту Л5, гидролизовать связь между мезо-диаминопимелиновой кислотой и D-аланином пептидной субъединицы пептидогликана Lysobacter sp. XL1 (Степная и др., 2005). Исходя из этого можно предположить, что фермент Л5 гидролизует такие же связи в пептидогликане В. subtilis W23 и Е. coli К12.

2 СЕКРЕЦИЯ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ LYSOBACTER

SP. В ОКРУЖАЮЩУЮ СРЕДУ

Образование и характеристика везикул Lysobacter sp.

Изучение возможного участия внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов в окружающую среду было начато с электронномикроскопического исследования клеток Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2. Для этого использовали два варианта условий роста культур на агаризованых средах: 1 - среда, способствующая продукции внеклеточных белков, и 2 - среда, при выращивании на которой бактерия не продуцирует внеклеточные белки.

Из рисунка 2а видно, что в условиях, способствующих продукции внеклеточных белков (среда I), в межклеточном пространстве Lysobacter sp. XL!

выявляются крупные везикулы диаметром от 100 до 160 нм, заполненные веществом с низкой электронной плотностью, а также более мелкие, размером 50-60 нм. В этих же условиях в межклеточном пространстве 1у$оЬас1ег Бр. ХЬ2 присутствуют везикулы диаметром около 50 нм (Рис. 2в). В межклеточном пространстве Бр. ХЫ и ХЬ2, выращенных на среде 2, наблюдается много мелких везикул диаметром около 20 нм (Рис. 26, 2г)

Рис. 2. Электронная микроскопия ультратонких срезов колоний клеток ¿угабас/ег ер. ХЫ (а, б) и ЬухоЬаМег ер. ХЬ2 (в, г), а, в - клетки выращены в условиях, способствующих продукции внеклеточных белков; б, г - клетки выращены в условиях, подавляющих продукцию внеклеточных белков. В - везикулы. Метка соответствует 200 нм.

Таким образом, образование везикул у £у5оЬас1ег Бр. ХЫ и ХЬ2 наблюдается в разных условиях роста культур и, вероятно, является естественным физиологическим процессом для этой бактерии.

Препараты везикул были получены из культуральной жидкости обоих штаммов £у$оЬас1ег 5р. при выращивании на среде, способствующей секреции бактериолитических ферментов. Как правило, везикулы грамотрицательных бактерий образуются в результате выпячивания и отшнуровывания фрагмента внешней мембраны (Веуепс^е, 1999). Для подтверждения внешнемембранной природы выделенных везикул Ьу5оЬас1ег ер. ХЫ и ХЬ2 определяли в них КДО. который является специфическим компонентом липополисахарида (ЛПС) внешних мембран. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание КДО и белка во внешних мембранах и везикулах.

Образец ЬуъоЬааег ер. ХЫ ЬуьоЬаМег Бр. ХЬ2

Белок, мг/мл КДО, мМ/мл Белок, мг/мл КДО, мМ/мл

Везикулы 1.20 0.35 0.02 0.16

Внешние мембраны 44.30 5.50 45.00 7.00

В таблице представлены средние значения трех опытов.

Было показано, что КДО присутствует в препаратах везикул обоих штаммов. При этом в препарате везикул штамма ХЬ2 содержится в два раза меньше КДО, чем в препарате везикул штамма ХЫ, хотя количество КДО в препаратах внешних мембран обоих штаммов практически не отличается. Поскольку везикулы и внешние мембраны ХЫ и ХЬ2 были получены из одинакового количества культуры клеток, то результаты определения КДО указывают на то, что штамм ХЬ2 образует везикулы в меньшем количестве, чем штамм ХЬ1.

Разница в размерах и количестве везикул обоих штаммов может быть связана с их участием в выводе части секретируемых белков во внеклеточное пространство. Можно предположить, что больший размер везикул ¿узоЬааег ер. ХЫ связан с присутствием в них большего количества белка. Из таблицы 2 видно, что действительно, в препарате везикул 1у$оЬас1ег кр. ХЬ2 концентрация белка составила лишь 0.02 мг/мл, в то время как в препарате везикул [¿уэоЬаМег эр. ХЫ - 1.2 мг/мл. Концентрация белка во внешних мембранах обоих штаммов не отличалась.

Было также проведено сравнение белкового состава везикул с белковым составом внешних мембран методом электрофореза в денатурирующих условиях (Рис. 3).

кДа

94-6 * -МкДа

66.2 р

е? ■<-54 кДа

45.0 1*

®а» Ш <-38 кДа

31.0

21.5 Д» -23кДа

< Фт

М 1 2 3 4

Рис. 3. Сравнительная

характеристика белкового состава везикул и внешних мембран £узоЬасСег йр. М - маркеры, 1 -везикулы Ьу$оЬас<ег ер. ХЫ, 2 -везикулы ЬуяоЬааег ер. ХЬ2, 3 -белки внешних мембран 1^у$оЬас1ег Бр. ХЫ, 4 - белки внешних мембран ЬузоЬас1ег эр. ХЬ2.

Как видно из рисунка 3. внешние мембраны £у$оЬас1ег ер. ХЫ и £>«о6ас/ег ер. ХЬ2 практически не отличаются по составу мажорных белков, где присутствуют белки с молекулярной массой (ММ) около 94, 54, 38 и 23 кДа, но имеются незначительные различия по соотношению минорных (Рис. 3, образцы 3 и 4). В препаратах везикул обоих штаммов наблюдаются мажорные белки с ММ около 94 и 38 кДа и минорные белки, совпадающие по электрофоретической подвижности с белками внешних мембран (Рис. 3, образцы 1 и 2). Это также может служить подтверждением внещнемембранной природы везикул. Но вместе с тем в везикулах £уъоЬаМег ер. ХЫ присутствуют белки с ММ около 67 и 41 кДа, а в везикулах ЬузоЬаМег Бр. Х1_,2 белок с ММ около 33 кДа, которые не выявлены во внешних мембранах. Неполная идентичность белкового состава внешних мембран и везикул может указывать на локусную природу образования последних, т.е. образование везикул может осуществляться на определенных участках клеточной поверхности.

Подобное предположение ранее было высказано рядом авторов (Li et а/., 1996; Kadurugamuwa, Beveridge, 1996) на основании обнаруженных ими различий в структуре ЛПС везикул и внешних мембран P. aeruginosa PAOl. Р aeruginosa РА01 экспрессирует два типа боковых цепей О-антигенов липополисахарида - А-тип и В-тип. Везикулы, однако, обогащены ЛПС с более высоким зарядом и более длинной боковой цепью В-типа. Обогащение везикул В-типом боковых цепей ЛПС может происходить в том случае, если они образуются в тех районах внешней мембраны, где расположены молекулы этого типа.

Известно, что процесс образования везикул сопровождается включением в них периплазматического содержимого (Kesty, Kuehn, 2004). В препарате везикул Lysobacter sp. XL1 измеряли активность циклической фосфодиэстеразы - маркер на периплазматические белки. Активность этого фермента в везикулах составила 1.6 нмоль/мг суммарного белка. В препарате везикул измеряли также активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в качестве маркера на цитозольные белки. Это определение проводили для проверки вероятности попадания цитозольных компонентов и фрагментов лизированных клеток в препарат везикул. Активность цитозольного фермента в везикулах не была обнаружена.

Таким образом, везикулы Lysobacter sp. XL1 и XL2 имеют вкешнемембранную природу и в процессе своего образования захватывают компоненты периплазмы.

Литическая активность везикул

Литическую активность везикул определяли на чашках с вплавленными в агарозный гель автоклавированными клетками S. aureus 209Р. Как видно из рисунка 4, зоны лизиса образуются как вокруг препаратов везикул Lysobacter sp. XL1, так и вокруг препаратов везикул Lysobacter sp. XL2. Это указывает на присутствие в везикулах бактериологических ферментов. Рисунок также демонстрирует бактериолитический эффект препаратов культуральной жидкости обоих штаммов. Видно, что бактериолитический эффект препаратов везикул и культуральной жидкости штамма XL1 проявляется более четко, чем штамма XL2.

Известно, что автолитические системы обоих штаммов Lysobacter sp. являются идентичными (Ситкин и др., 2003а, 20036). и если бы активность везикул определялась присутствием в них только автолитических ферментов, то и активность везикул XL1 и XL2, вероятно, была бы одинаковой. Однако активность везикул Lysobacter sp. XL1 значительно выше, что позволяет предположить присутствие в них более активных внеклеточных бактериолитических ферментов.

Рис. 4. Бактериолитический эффект культуральной жидкости и везикул Lysobacter sp. XL1 и XL2 на чашках с вплавленными в агарозный гель автоклавированными клетками aureus 209Р. 1 - культуральная жидкость, 2 -везикулы. Для Lysobacter sp. XL1 время инкубации составило 1 сутки, для Lysobacter sp. XL2 -4 суток. В каждую лунку вносили по 10 мкл образца.

Lysobacter sp. XL1

1 2

Lysobacter sp. XL2

¿4%

m m

Какие именно бактериологические ферменты попадают в культуральную среду посредством везикул? Lysobacter sp. XL1 и XL2 секретируют бактериологические ферменты с разной субстратной специфичностью, что можно использовать для выявления конкретных ферментов в везикулах. Амидаза Л2 и мурамидаза ЛЗ секретируются обоими штаммами Lysobacter sp. и проявляют свою активность при использовании синтетических субстратов. Известно также, что в периплазме клеток обоих штаммов Lysobacter sp. присутствует автолитический фермент мурамидаза (Ситкин и др., 2003а, 20036), который может попадать в везикулы в процессе их образования.

Итак, бактериологическая активность везикул Lysobacter sp. XL2 может быть ассоциирована только с двумя внеклеточными бактериологическими ферментами -амидазой JI2 и мурамидазой ЛЗ, а также с автолитической мурамидазой. Было показано, что в препарате везикул штамма XL2 выявляется активность, характерная для амидазы Л2. Мурамидазная активность в препарате везикул не была обнаружена. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что внеклеточная амидаза Л2 Lysobacter sp. XL2 выводится за пределы клетки посредством везикул.

Бактериологическая активность везикул Lysobacter sp. XL1 может быть обусловлена пятью бактериологическими ферментами. В препарате везикул этого штамма также была обнаружена активность амидазы Л2, а мурамидазной активности выявлено не было. Таким образом, внеклеточная амидаза Л2 у Lysobacter sp. XL1 также секретируется в культуральную среду при помощи везикул. Помимо амидазы Л2 и мурамидазы ЛЗ Lysobacter sp. XL1 секретирует в окружающую среду еще Л1, Л4 и JI5 бактериолитические ферменты. К бактериологическим протеазам Л1 и Л5 получены поликлокальные кроличьи антитела, с помощью которых можно установить присутствуют ли эти ферменты в везикулах Lysobacter sp. XL1.

Секреция бактериолитических протеаз JIl u J15 Lysobacter sp. XL1

Секретируемые белки грамотрицательных бактерий, к которым относятся внеклеточные бактериологические ферменты Lysobacter sp. попадают из цитозоля бактерии в окружающую среду, преодолевая две мембраны. Для ферментов Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 известно, что синтезируются они в виде препробелков. Наличие сигнальной последовательности на N-конце (пре-часть синтезированной полипептидной цепи) позволяет предположить, что эти белки транслоцируются через цитоплазматическую мембрану в периплазму посредством See экспортного механизма. Многие принципы этого процесса в настоящее время уже установлены для Е. coli, у которой выявлены и охарактеризованы белковые компоненты секреторного аппарата. В частности, хорошо изучена транслокационная АТФаза SecA - важный компонент цитоплазматической стадии секреции. Для Lysobacter не было никаких данных о существовании подобного механизма секреции, и одной из задач настоящего исследования было выявление в клетках Lysobacter sp. XL1 транслокационной АТФазы SecA.

Для обнаружения в клетках Lysobacter sp. XL1 SecA белка был проведен иммуноферментный анализ клеточных белков этой бактерии с антителами к SecA Е. coli. В качестве контроля использовали клетки Е. coli. Результаты представлены на рисунке 5. Иммуноферментный анализ выявил наличие в клетках Lysobacter sp. XL1 белка, имеющего такую же электрофоретическую подвижность, как и белок SecA Е. coli. Однако, интенсивность проявления белковой полосы SecA в клетках Lysobacter sp. XLI меньше, чем в клетках Е. coli, хотя для анализа было взято одинаковое

количество клеток (А54о=0.02 o.e.). Разница в интенсивности проявления белковых полос может быть обусловлена либо тем, что в клетках Е. coli белка SecA больше, либо тем, что SecA Lysobacter sp. XL1 является гомологом SecA Е. coli, на который получены антитела, либо тем и другим.

SecA

Рис. 5. Иммуноферментный анализ клеточных белков Е. coli AD93/pDD72 (1) и Lysobacter sp. XL1 (2) с антителами к транслокационной АТФ-азе SecA Е. coli.

1 2

Таким образом, основываясь на полученных результатах, можно утверждать, что Lysobacter sp. XL1 имеет Sec экспортный механизм транслокации белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму, который может быть использован для секреции предшественников Л1 и Л5 белков.

Для того чтобы установить секретируются ли ферменты Л1 и Л5 Lysobacter sp. XL1 из периплазмы в окружающую среду посредством везикул, был проведен иммуноферментный анализ белков культуральной жидкости до и после осаждения везикул и самих везикул с антителами к JI1 и Л5 белкам. Электрофореграмма белков культуральной жидкости до и после осаждения везикул не демонстрирует каких-либо изменений в содержании Л1 и Л5 ферментов (Рис. 6а). Однако, иммуноферментный анализ с использованием антител к Л5 ферменту (Рис. 66) показал, что после осаждения из культуральной жидкости везикул, содержание в ней фермента Л5 сильно уменьшается. Вместе с этим фермент достоверно выявляется в везикулах. Это указывает на то, что подавляющее количество эндопептидазы Л5 присутствует в культуральной жидкости внутри везикул. Иммуноблоттинг с использованием антител к бактериолитическому ферменту Л1 (Рис. 6в) показал, что его содержание в культуральной жидкости после осаждения везикул не изменяется, и в везикулах этот фермент не обнаруживается. Из-за высокой гомологии ферментов Л5 и Л1, полученные антитела давали перекрестную реакцию, но это не мешало интерпретации данных.

кДа 94.6 66.2 45.0

31.0

21.5

Л5г Ж.

М I 2 3

12 3 12 3

Рис. 6. Иммуноферментный анализ везикул ЬувоЬаМег зр. ХЫ. а - электрофорез белков культуральной жидкости и везикул; б - иммуноблоттинг с антителами к Л5 бактериолитическому ферменту; в - иммуноблоттинг с антителами к Л1 бактериолитическому ферменту. 1 - культуральная жидкость до осаждения везикул; 2 - культуральная жидкость после осаждения везикул, 3 - везикулы. Образцы культуральной жидкости содержали 0.5 мг суммарного белка, везикулы - 0.05 мг суммарного белка.

Совокупность полученных данных позволила предложить схему секреции бактериолитических ферментов Л1 и Л5 ЬуэоЬааег ер. ХЫ из цитозоля бактерии в окружающую среду (Рис. 7).

цитозоль 1уюЬкт 5Р-Хи1

39а а.о.

Окружающая среда

Рис 7. Механизм секреции бактериолитических ферментов Л1 и Л5 ЬуяоЬааег ер. ХЫ из цитозоля бактерии в окружающую среду. ВМ - внешняя мембрана; ЦМ -цитоплазматическая мембрана; ПГ - пептидогликан; МВ - мембранные везикулы; препроЛ! и препроЛ5 - предшественники Л1 и Л5 ферментов.

Бактериолитические ферменты Л1 и Л5 синтезируются в виде препробелков и транслоцируются через цитоплазматическую мембрану в периплазму, используя, вероятно. Sec экспортный механизм. В периплазме предшественники подвергаются частичному процессингу. Происходит отщепление сигнального пептида (пре-часть препробелков) и остается пробелок. Для я-литической протеазы Lysobacter enzymogenes, которая является гомологом Л1 и Л5 ферментов, показано, что в периплазме происходит сворачивание пробелка в практически нативную конформацию, способствующую транслокации через внешнюю мембрану посредством, как предполагается, второго (II) типа секреции. После или во время транслокации происходит автокаталитическое отщепление про-части. сопровождающееся появлением зрелого фермента (Silen, Agard, 1989). Возможно таким же образом происходит созревание и секреция фермента Л1. Поскольку для Л5 фермента показано, что в везикулах выявляется зрелый белок, то можно предположить, что его предшественник уже в периплазме превращается в зрелый фермент и захватывается везикулами в процессе их образования.

Таким образом показано, что внеклеточные бактериолитические ферменты Л2 и Л5 Lysobacter sp. XL1 попадают в окружающую среду посредством везикул. Таким же образом из клеток выводится бактериолитический фермент Л2 Lysobacter sp. XL2.

Биологическая роль способа секреции бактериолитических ферментов

посредством везикул

Известно, что бактерии используют везикулы в агрессивной тактике, что дает им возможность получать преимущество над другими бактериями в условиях окружающей среды. Было проверено литическое действие везикул Lysobacter sp. XL1 в отношении различных живых микроорганизмов. Результаты представлены на рисунке 8 и в таблице 3. Установлено, что везикулы обладают литическим действием в отношении практически всех выбранных тест-культур за исключением Т. delbrueckii ВКМ Y-706, S. cerevisiae М660 и Sderotinium sclerotiorum.

Escherichia coli

Staphylococcus aureus Bacilus cereus

Candida boidinii Pseudozyma fusiformata

Рис. 8. Литическое действие везикул Lysobacter эр. ХЫ на некоторые виды выбранных тест-культур. Прозрачное пятно в центре каждой фотографии - место нанесения везикул, где образовалась зона лизиса.

Таблица 3. Логическое действие везикул Lysobacter sp. XL1.

Микроорганизмы Действие

везикул

Грамположительные бактерии

Bacillus subtilis W23 ++

Bacillus cereus 217 ++

Micrococcus roseus В1236 ++

Micrococcus luteus В1819 -н-

Corynebacterium xerosis ++

Staphylococcus aureus 209P ++

Ralhayibacter tritici ++

Грамотрицательные бактерии

Pseudomonas fluorescens 1472 +

Pseudomonas putida +

Proteus vulgaris H-19 +

Proteus mirabilis N2 +

Escherichia coli К12 ++

Erviinia carotovora В15 ++

Alcaligenes faecalis ++

Дрожжи

Torulaspora delbrueckii BKM Y-706 -

Candida utilis BKM Y-74 +

Candida boidinii BKM Y-34 +

Candida guilliermondii BKM Y-41 +

Saccharomyces cerevisiae M660 -

Pseudozyma fusiformata BKM Y-2821 +

Мицелнальиые грибы

Sclerotinium sclerotiorum -

Fusarium sporotrichieila ++

- нет литического эффекта; + есть логический эффект; ++ очень хороший лигический эффект.

Исходя из полученных данных, можно предложить схему действия везикул на клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий (Рис. 9). В случае действия на грамположительные бактерии везикулы, прикрепляясь к клеточкой стенке клетки-мишени, как бы «надламываются», что способствует выходу и связыванию литических ферментов с пептидогликаном. Место прикрепления везикулы, вероятно, является местом концентрированного действия литических ферментов. Можно предположить также, что само везикулярное окружение остается связанным с пептидогликаном и, возможно, таким образом защищает свое логическое содержимое от внешнего воздействия. Иначе происходит действие везикул на клетки грамотрицательных бактерий. Это связано с наличием внешней мембраны на поверхности их клеточной оболочки, которая препятствует доступу литических ферментов к своему субстрату - пептидогликану. Действие везикул на грамотрицательные бактерии происходит, вероятно, за счет слияния мембран клеток-мишеней с везикулярной мембраной. В результате этого слияния бактериологические ферменты везикул высвобождаются в периплазматическое пространство клетки-мишени, где находится их субстрат - пептидогликан. После попадания в периплазму клетки-мишени литические ферменты везикул разбавляются там и

концентрированного действия, как в случае грамположительных микроорганизмов, не происходит. Действие везикул на клетки грибов и дрожжей направлено, по-видимому, на структурные белки их клеточных стенок. Это действие происходит, вероятно, за счет протеазной активности ферментов Л2 и Л5.

бактерий. МВ - мембранные везикулы.

Везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют более широкий спектр литического действия, чем гомогенный фермент Л5 (Табл. 1, Табл. 3), а также намного эффективнее лизируют живые клетки различных микроорганизмов. Вклад фермента Л2 в литическое действие везикул Lysobacter sp. XL1, по-видимому, незначительный. Литический эффект везикул может быть использован для борьбы с патогенными микроорганизмами. Например, везикулы, содержащие фермент Л5, активно лизируют клетки В. cereus 217, а гомогенный фермент Л5 таким свойством не обладает. Известно, что клеточная оболочка В. cereus имеет такое же строение, как и оболочка В. anthracis - возбудителя сибиреязвенной инфекции. Исходя из этого, предположили, что везикулы Lysobacter sp. XL1 могут быть литически активными в отношении сибиреязвенного микроба и использованы для лечения этой инфекции. Для проверки этого предположения препарат везикул, а также препарат гомогенного фермента Л5 были переданы в Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ГНЦ ПМБ, г. Оболенск). В центре проверяли лечебное действие препаратов на моделях сибиреязвенной инфекции. Опыт проводили in vivo на беспородных белых мышах. В качестве инфицирующего агента использовали споры В. anthracis 71/12 (11 вакцина Ценковского) в дозе 103 спор/мышь. Было показано, что нативный фермент Л5 в концентрации 5 и 10 мкг/мышь, введенный мышам через три часа после заражения, не обладает лечебным действием, в то время как везикулы, содержащие этот же фермент, оказывают лечебный эффект в 100% случаев. Эти результаты позволяют считать целесообразной разработку в дальнейшем методов «упаковки» отдельных бактериолитических ферментов в искусственные везикулярные структуры для получения эффективных лекарственных средств.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые охарактеризован бактериолитический фермент Л5 Lysobacter sp. XL1. Показано, что фермент лизирует автоклавированные клетки S. aureus 209Р при концентрации буфера Трис-HCl равной ЮмМ, при рН равном 7.5 и при температуре реакции равной 80°С. Температура полуинактивации фермента составила 75°С. Помимо автоклавированных клеток S. aureus фермент Л5 гидролизовал автоклавированные клетки P. fluorescens 1472, P. putida, P. vulgaris Н-19, P. mirabilis N2, E. coli К12, Е. caratovora В15, A.faecalis, В. subtilis W23, В. cereus 217, M. roseus B1236, M. luteus B1819, C. xerosis, S. aureus 209P, R. tritici, L. monocytogenes n766, T. delbrueckii BKM Y-706, C. utilis BKM Y-74, C. boidinii BKM Y-34, C. guilliermondii BKM Y-41, S.cerevisiae M660, P. fusiformata BKM Y-2821; живые клетки P. putida, P. vulgaris H-19, P. mirabilis N2, E. coli K12, A.faecalis, B. subtilis W23, M. roseus B1236, M. luteus B1819, C. utilis BKM Y-74, C. boidinii BKM Y-34, C. guilliermondii BKM Y-41; клеточные стенки S. aureus 209P, B. subtilis W23 и E. coli K12. Фермент способен гидролизовать казеин и синтетический пептид. Активность фермента полностью подавляется ФМСФ. Таким образом, выделенный фермент является бактериолитической сериновой протеазой.

При изучении механизма секреции внеклеточных бактериолитических ферментов в клетках Lysobacter sp. XL1 был обнаружен белок Sec А - компонент Sec экспортного механизма секреции белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму. Ранее бактерии рода Lysobacter не были охарактеризованы относительно наличия подобного экспортного пути.

В представленной работе впервые показана способность клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2 образовывать везикулы. Количество везикул, образуемых штаммом XL1, больше, чем штаммом XL2. Установлено, что везикулы обоих штаммов имеют внешнемембранную природу, в процессе своего образования захватывают компоненты периплазмы и обладают бактериолитической активностью. Литическая активность везикул Lysobacter sp. XL2 обусловлена присутствием в них амидазы Л2, а литическая активность везикул Lysobacter sp. XL1 обусловлена присутствием в них амидазы Л2 и протеазы Л5. Таким образом, везикулы Lysobacter sp. являются естественным транспортным средством, обеспечивающим выход некоторых белков за пределы клетки.

Показано, что везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют широкий спектр литического действия по отношению к различным микроорганизмам, патогенные виды которых могут представлять потенциальную опасность для растений, животных и человека. Везикулы лизируют живые клетки P. fluorescens 1472, P. putida, P. vulgaris H-19, P. mirabilis N2, E. coli K12, E. caratovora B15, A.faecalis, B. subtilis W23, B. cereus 217, M roseus В1236, M. luteus В1819, C. xerosis, S. aureus 209P, R. tritici, C. utilis BKM Y-74, C. boidinii BKM Y-34, C. guilliermondii BKM Y-41, P. fusiformata и F. sporotrichiella. Установлено, что везикулы обладают более выраженным литическим действием на живые клетки выбранных тест-культур, чем очищенный фермент Л5.

Таким образом, секреция бактериолитических ферментов посредством везикул имеет для Lysobacter sp. XL1 и XL2 важное биологическое значение в условиях окружающей среды. При помощи такого механизма секреции значительно расширяется спектр микроорганизмов, с которыми эта бактерия может конкурировать в природе.

ВЫВОДЫ

1. Выделен, очищен и частично охарактеризован не изученный ранее бактериолитический фермент Л5 Lysobacter sp. XL1. Новый фермент является бактериологической сериновой протеазой.

2. В клетках Lysobacter sp. XL1 выявлен SecA-подобный белок. Это демонстрирует наличие у бактерии Sec экспортного пути секреции белков через цитоплазматическую мембрану.

3. Показана способность клеток Lysobacter sp. XL1 и Lysobacter sp. XL2 образовывать везикулы. Везикулы имеют внешнемембранную природу, захватывают в процессе своего образования компоненты периплазмы и обладают литическим действием.

4. Установлено, что внеклеточные бактериологические ферменты Л2 и Л5 Lysobacter sp. XL1 и фермент Л2 Lysobacter sp. XL2 попадают в окружающую среду посредством вкешнемембранных везикул.

5. Показано, что везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют широкий спектр логического действия по отношению к различным видам микроорганизмов, в том числе представляющим потенциальную опасность для растений, животных и человека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Vasilyeva N.V., Tsfasman I.M., SuzinaN.E., Stepnaya О.A., Kulaev I.S. (2008). Secretion of bacteriolytic endopeptidase L5 of Lysobacter sp. XL1 into the medium by means of outer membrane vesicles. FEBS Journal. Vol. 275 (15). P. 3827-3835.

2. Васильева H.B.. Цфасман И.М., Сузина H.E., Степная О.А., Кулаев И.С. Внешнемембранные везикулы Lysobacter sp. (2009). Доклады Академии Наук. Т.426, №2. С. 257-260.

Заявки на патенты

1. Грановский И. Э., Калинин А.Е., Лаптева Ю.С., Латыпов О.Р., Васильева Н.В.. Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С., Муранова Т.А. (2009). Литический фермент AlpA бактерии Lysobacter sp. XLI, фрагмент ДНК, кодирующий литический фермент AlpA бактерии Lysobacter sp. XLI, и способ получения логического фермента AlpA бактерии Lysobacter sp. XLI. Заявка на патент №2009105828.

2. Грановский И. Э., Калинин А.Е., Лаптева Ю.С., Латыпов О.Р., Васильева Н.В., Красовская Л.А., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С., Муранова Т.А. (2009). Литический фермент AlpB бактерии Lysobacter sp. XLI, фрагмент ДНК, кодирующий литический фермент AlpB бактерии Lysobacter sp. XLI, и способ получения логического фермента AlpB бактерии Lysobacter sp. XLI. Заявка на патент №2009105830.

Тезисы

1. Васильева Н.В. Изучение механизмов секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp. XLI - продуцента медицинского препарата лизоамидаза, (2006). Международная школа-конференция посвященная 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино, 28 ноября-1 декабря. С. 66.

2. Васильева Н.В.. Цфасман И.М., Сузина Н.Е., Степная О.А., Кулаев И.С. Внеклеточные бакгериолитические ферменты Lysobacter sp. XLI: пути секреции и спектр антимикробного действия. (2007). VI симпозиум «Химия протеолитических ферментов». Москва, 23-25 апреля. С. 102-103.

3. Vasil'eva N.V., Tsfasman I.M., Suzina N.E., Stepnaya O.A., Kulaev I.S. Secretion mechanism of bacteriolytic enzymes of Lysobacter sp. XLI a medical preparation Lysoamidase producer. (2007). The Fourth International Conference on «Science and Business» NanoBio and Related New and Perspective Biotechnologies. Pushchino, October 15-18. P. 237-239.

4. Васильева H.B.. Цфасман И.М., Сузина H.E., Степная О.А., Кулаев И.С. Бактериолитческая эндопептидаза Л5 Lysobacter sp. XLI и ее секреция в окружающую среду (2009). IV Российский симпозиум «Белки и пептиды». Казань, 2327 июня. С. 371.

Подписано в печать:

07.05.2010

Заказ № 3706 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Васильева, Наталья Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ.

Внутриклеточные бактериолитические (автолитические) ферменты бактерий.

Внеклеточные бактериолитические ферменты бактерий.

1.2 КЛЕТОЧНАЯ ОБОЛОЧКА БАКТЕРИЙ.

Клеточная стенка грамположительных бактерий.

Строение клеточной оболочки грамотрицательных бактерий.

1.3 ПЕПТИДОГЛИКАН - СУБСТРАТ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ.

Структура пептидогликана.

Специфичность действия бактериолитических ферментов.

1.4 СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ У БАКТЕРИЙ.

Одностадийные способы секреции.

Двухстадийные способы секреции.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И УСЛОВИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ.

2.2 СУБКЛЕТОЧНОЕ ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ.

2.3 ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ.

2.4 ПОЛУЧЕНИЕ ВЕЗИКУЛ.

2.5 ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ.

2.6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЗИКУЛ.

2.7 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ.

2.8 ИММУНОБЛОТТИНГ БЕЛКОВ.

2.9 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА.

2.10 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ 2-КЕТ0-3-ДЕ30КСИ-0-МАННООКТОНАТА.:.

2.11 ЭКСТРАКЦИЯ ТЕЙХОЕВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК S. AUREUS 209Р.

2.12 АНАЛИЗ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ АКТИВНОСТЕЙ.

Определение общей бактериолитической активности.

Определение протеазной активности.

Определение активности циклической фосфодиэстеразы.

Определение активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы.

Определение активности N-ацетилмурамоил

L-ал анинамидазы.

Определение мурамидазной активности.

2.13 ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА Л5 LYSOBACTER SP. XL1.

Получение белков культуральной жидкости.

Ионообменная хроматография на DEAE-сефадексе и СМсефадексе.

Гельфильтрация на Superdex 75.

Ионообменная хроматография на monoS.

2.14 ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТА Л5 LYSOBACTER SP. XL1.

Определение N-концевой аминокислотной последовательности фермента Л5.

Определение оптимального значения рН для реакции лизиса клеток S. aureus 209Р ферментом Л5.

Определение оптимального значения концентрации буфера для реакции лизиса клеток S. aureus 209Р ферментом Л5.

Определение оптимальной температуры реакции лизиса клеток S. aureus 209Р ферментом Л5.

Определение температуры полуинактивации фермента Л5.

Определение действии ингибиторов.

Определение спектра литического действия фермента JI5.

Определение действия фермента JI5 на клеточные стенки некоторых бактерий.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 НОВЫЙ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИЙ ФЕРМЕНТ LYSOBACTER SP. XL1.

Выделение бактериолитического фермента Л5.

Определение некоторых свойств фермента Л5.

Определение спектра литического действия фермента Л5.

3.2 ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА СЕКРЕЦИИ

БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ LYSOBACTER SP.

Обнаружение и характеристика внеклеточных везикул

Lysobacter sp.

Обнаружение литической активности в везикулах

Lysobacter sp.

Секреция бактериолитических протеаз Л1 и Л

Lysobacter sp. XL1.

Биологическая роль способа секреции бактериолитических ферментов посредством везикул.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp."

Актуальность проблемы

Бактерии, характеризующиеся сильно выраженной способностью лизировать различные микроорганизмы, объединены в род Lysobacter. Представители этого рода интересны не только с точки зрения изучения взаимоотношений внутри различных биоценозов, но также с биотехнологической точки зрения. К настоящему моменту в медицине сложилась весьма неблагоприятная ситуация в терапии инфекционных заболеваний из-за появления патогенных микроорганизмов, устойчивых к большинству используемых антибиотиков. Поэтому одно из актуальных направлений современных биомедицинских исследований в рамках решения данной проблемы связано с исследованием и использованием естественных механизмов антагонизма среди микробов. Продукция бактериолитических ферментов - один из примеров микробного антагонизма. Важным преимуществом бактериолитических ферментов является отсутствие у микроорганизмов устойчивости к их действию.

Грамотрицательная бактерия Lysobacter sp. XL1 при выращивании в специально подобранных условиях секретирует в окружающую среду бактериолитические ферменты. На основе культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 получен антимикробный препарат широкого спектра действия - лизоамидаза (Кулаев и др., 2002). Ранее из культуральной жидкости Lysobacter sp. XL1 были выделены и охарактеризованы четыре бактериолитических фермента (JI1 — JI4). При длительном культивировании Lysobacter sp. XL1 на среде, способствующей секреции бактериолитических ферментов, в культуре появляются и со временем накапливаются клетки малоактивного штамма Lysobacter sp. XL2, которые способны продуцировать только два бактериолитических фермента - JI2 и JI3 (Степная и др., 1996в). По специфичности действия на бактериальные пептидогликаны литические ферменты этой бактерии являются эндопептидазами (JI1 и JI4) (Степная и др., 19966, 2005), амидазами (Л1 и Л2) (Степная и др., 1986, 1992, 19966), мурамидазой (JI3) (Степная и др., 1996а). При изучении генома Lysobacter sp. XL1 была установлена нуклеотидная последовательность гена, кодирующая бактериолитический фермент JI1 и гомологичная ей последовательность (60% гомологии), кодирующая неизвестный ранее белок, который был обозначен как бактериолитический фермент JI5. Обе последовательности в разной степени гомологичны а-литической протеазе Lysobacter enzymogenes (78% и 56% гомологии соответственно) (Кулаев и др., 2005).

Бактериолитический фермент JI5 Lysobacter sp. XL1 ранее не был выделен в чистом виде и не были охарактеризованы его свойства. Совершенно никакой информации не имеется относительно путей секреции бактериолитических ферментов бактерий рода Lysobacter. При изучении структуры генов, кодирующих ферменты JI1 и J15, предсказано, что синтезируются они в виде препробелков. Следовательно, секреция этих белков из цитозоля бактерии в окружающую среду должна проходить по одинаковой схеме, в два этапа. Первый этап заключается в секреции через цитоплазматическую мембрану в периплазму. Наличие пре-части (сигнальная последовательность) позволяет предположить участие в этом процессе See-зависимого секреторного пути. Второй этап, т.е. секреция из периплазмы в окружающую среду, может осуществляться несколькими путями, в том числе посредством внешнемембранных везикул, которые образуют многие грамотрицательные бактерии. О способности бактерий рода Lysobacter образовывать везикулы ранее не было известно.

1. Исследовать способность клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2 образовывать везикулы.

2. Выделить и охарактеризовать везикулы Lysobacter sp. XL1 и XL2.

3. Выделить и охарактеризовать бактериолитический фермент JI5 Lysobacter sp. XL1.

4. Исследовать клетки Lysobacter sp. XL1 на присутствие в них белка SecA — компонента See-зависимого механизма секреции белков через цитоплазматическую мембрану.

5. Установить, попадают ли бактериолитические ферменты Lysobacter sp. в окружающую среду при помощи везикул.

6. Исследовать литическое действие везикул Lysobacter sp. XL1 по отношению к различным микроорганизмам.

Научная новизна работы

Выделен, очищен и частично охарактеризован новый бактериолитический фермент J15 Lysobacter sp. XL1. Впервые для бактерии рода Lysobacter показано наличие SecA белка - компонента Sec экспортного механизма секреции белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму. Впервые установлена способность клеток Lysobacter sp. XL1 и XL2 образовывать внешнемембранные везикулы. Показано, что JI2 фермент Lysobacter sp. XL2 и ферменты JI2 и JI5 Lysobacter sp. XL1 попадают в окружающую среду при помощи везикул. Везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют широкий спектр литического действия по отношению к различным видам микроорганизмов.

Научно-практическое значение

Полученные в работе новые данные расширяют представление о роли внешнемембранных везикул в секреции белков у бактерий и межбактериальных взаимодействиях. Характеристика нового бактериолитического фермента JI5 дополняет знания о структуре антибактериального комплекса лизоамидаза. Результаты работы указывают на возможность применения препарата везикул и очищенного фермента JI5 для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных патогенными для животных и растений микроорганизмами. В Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) было проверено лечебное действие везикул Lysobacter sp. XL1 и очищенного фермента JI5 на моделях сибиреязвенной инфекции у беспородных белых мышей. Показано, что очищенный фермент JI5 не обладает лечебным действием, в то время как везикулы, содержащие этот же фермент, оказывают лечебный эффект в 100% случаев. Эти результаты позволяют считать целесообразной разработку в дальнейшем методов «упаковки» отдельных бактериолитических ферментов в искуственные везикулярные структуры для получения эффективных лекарственных средств.

Апробация работы и публикации

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах, содержит 6 таблиц и 19 рисунков. Библиографический указатель содержит 293 источника литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Васильева, Наталья Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Выделен, очищен и частично охарактеризован не изученный ранее бактериолитический фермент JI5 Lysobacter sp. XL1. Новый фермент является бактериолитической сериновой протеазой.

4. Установлено, что внеклеточные бактериолитические ферменты JI2 и JI5 Lysobacter sp. XL1 и фермент JI2 Lysobacter sp. XL2 попадают в окружающую среду посредством внешнемембранных везикул.

5. Показано, что везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют широкий спектр литического действия по отношению к различным видам микроорганизмов, в том числе представляющим потенциальную опасность для растений, животных и человека.

ГЛАВА 4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые охарактеризован бактериолитический фермент Л5 Lysobacter sp. XL1. Показано, что фермент лизирует автоклавированные клетки S. aureus 209Р при концентрации буфера Трис-HCl равной ЮмМ, при рН равном 7.5 и при температуре реакции равной 80°С. Температура полуинактивации фермента составила 75°С. Помимо автоклавированных клеток S. aureus фермент Л5 гидролизовал автоклавированные клетки P. fluoresceins 1472, P. putida, P. vulgaris Н-19, Р. mirabilis N2, Е. coli К12, Е. caratovora В15, A. faecalis, В. subtilis W23, В. cereus 217, М. roseus В1236, М. luteus В1819, С. xerosis, R. tritici, L. monocytogenes n766, Т. delbrueckii ВКМ Y-706, С. utilis ВКМ Y-74, С. boidinii ВКМ Y-34, С. guilliermondii ВКМ Y-41, S.cerevisiae M660, P. fusiformata BKM Y-2821; живые клетки P. putida, P. vulgaris H-19, P. mirabilis N2, E. coli К12, A. faecalis, B. subtilis W23, M. roseus В1236, M. luteus В1819, С. utilis BKM Y-74, C. boidinii BKM Y-34, C. guilliermondii BKM Y-41; клеточные стенки S. aureus 209P, B. subtilis W23 и E. coli К12. Фермент способен также гидролизовать казеин и синтетический пептид. Активность фермента полностью подавляется ФМСФ. Таким образом, выделенный фермент является бактериолитической сериновой протеазой.

При изучении механизма секреции внеклеточных бактериолитических ферментов в клетках Lysobacter sp. XL1 был обнаружен белок SecA -компонент Sec экспортного механизма секреции белков через цитоплазматическую мембрану в периплазму. Ранее бактерии рода Lysobacter не были охарактеризованы относительно наличия подобного экспортного пути.

Показано, что везикулы Lysobacter sp. XL1 имеют широкий спектр литического действия по отношению к различным микроорганизмам, патогенные виды которых могут представлять потенциальную опасность для растений, животных и человека. Везикулы лизируют живые клетки Р. fluorescens 1472, P. putida, P. vulgaris Н-19, P. mirabilis N2, Е. coli К12, Е. caratovora В15, A. faecalis, В. subtilis W23, В. cereus 217, М. roseus В1236, М. luteus В1819, С. xerosis, S. aureus 209Р, R. tritici, С. utilis BKM Y-74, C. boidinii BKM Y-34, C. guilliermondii BKM Y-41, P. fusiformata и F. sporotrichiella. Установлено, что везикулы обладают более выраженным литическим действием на живые клетки выбранных тест-культур, чем очищенный фермент Л5.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильева, Наталья Валерьевна, Пущино

1. Бегунова Е.А., Степная О. А., Лысанская В .Я., Кулаев И.С. (2003). Специфичность действия ферментов препарата лизоамидаза на клеточные стенки Staphylococcus aureus 209 Р. Биохимия. Т. 68. С. 896 -901.

2. Бухарин О.Б., Усвяцов Б .Я. (1981). Лизоцимная активность микроорганизмов. Антибиотики. Т. 10. С. 782 793.

3. Головина И.Г. (1973). Литические ферменты микроорганизмов. Успехи микробиологии. Т. 8. С. 108 — 136.

4. Головина И.Г., Гужова Э.П., Богданова Т.И., Логинова Л.Г. (1972). О литических ферментах, образуемых термофильным актиномицетом Mictomonospora vulgaris DA II-4. Микробиология. Т. 42. С. 620 624.

5. Захарова И .Я., Павлова И.Н. (1985). Литические ферменты микроорганизмов. Наукова думка, Киев. 216 с.

6. Звягинцева И.С. (1981). Внеклеточные гидролазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Успехи микробиологии. Т. 16. С. 81 103.

7. Клесов А.А. (1984). Ферментативный катализ. МГУ, Москва. 216 с.

8. Клячко Н.Л., Дмитриева Н.Ф., Ещина А.С., Игнатенко О.В., Филатова Ю.В., Рейнина Е.И., Казаров А.К., Левашов А.В. (2008). Ферменты бактериофагов для профилактики и лечения бактериальных инфекции: стабильность и стабилизация фермента, лизирующего клетки

9. Streptococcus pyogenes. Биоорганическая химия. Т. 34. №3. С. 416 -421.

10. Кузнецов В.Д., Гуреева М.Н., Шпокенс А.П., Уискуренас А.П. (1982). Образование литических ферментов актиномицетами. Изв. АН СССР. Биология. Т. 3. С. 440 443.

11. Кулаев И.С., Северин А.И., Абрамочкин Р.В. (1984). Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине. Вестн. АМН СССР. Т. 8. С. 64 69.

12. Кулаев И.С., Степная О.А., Цфасман И.М., Черменская Т.С., Ледова Л.А., Зубрицкая Л.Г., Акименко В.К. (2002). Патент РФ № 2193063 «Бактериолитический комплекс, способ его получения и штамм для осуществления способа». Бюллетень №32.

13. Мирошников К.А., Чертков О.В., Назаров П.А., Месянжинов В.В. (2006). Петидогликанлизирующие ферменты бактериофагов -перспективные противобактериальные агенты. Успехи биол. химии. Т. 46. С. 65 98.

14. Наумова А.Б., Шашков А.С. (1997). Анионные полимеры клеточных стенок грамположительных бактерий. Биохимия. Т. 62. С. 947 — 982.

15. Наумова И.Б. (1978). Тейхоевые кислоты в регуляции биохимических процессов у микроорганизмов. Биохимия. Т. 43. С. 195 — 207.

16. Потехина Н.В. (2006). Тейхоевые кислоты актиномицетов и других грамположительных бактерий. Успехи биол. химии. Т. 46. С. 225 278.

17. Ситкин Б.В., Лысанская В.Я., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. (2003в). Структура пептидогликана бактерии Lysobacter sp.продуцента внеклеточных бактериолитических ферментов. Микробиология. Т.72. С. 136 — 137.

18. Ситкин Б.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. (2003а). Внутриклеточные пептидогликангидролазы бактерии Xanthomonas campestris XL1. Биохимия. Т. 68. С. 562 569.

19. Ситкин Б.В., Цфасман И.М., Степная О.А., Кулаев И.С. (20036). Могут ли автолизины бактерий являться предшественниками внеклеточных автолитических ферментов? Доклады Академии Наук. Т. 392. С. 406 — 409.

20. Степная О.А., Бегунова Е.А., Цфасман И,М., Кулаев И.С. (1996а). Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза: выделение и некоторые физико-химические свойства внеклеточной мурамидазы бактерии Xanthomonas sp. Биохимия. Т. 61. С. 648 — 655.

21. Степная О.А., Ледова Л.А., Кулаев И.С. (1999). Бактериолитические ферменты. Успехи биологической химии. Т. 39. С. 327 354.

22. Степная О.А., Северин А.И., Кулаев И.С. (1986). Некоторые физико-химические свойства литической протеиназы Л2 ферментного препарата, выделенного из бактерии семейства Pseudomonadaceae. Биохимия. Т. 51. С. 909 915.

23. Степная О.А., Цфасман И.М., Ледова Л.А., Петрикевич С.Б., Бегунова Е.А., Кулаев И.С. (19966). Бактериолитический ферментный препарат лизоамидаза. Очистка и некоторые свойства бактериолитической пептидазы Л1. Биохимия. Т. 61. С. 656 — 663.

24. Степная О.А., Цфасман И.М., Логвина И.А., Рязанова Л.П., Муранова Т.А., Кулаев И.С. (2005). Выделение и характеристика новой внеклеточной эндопептидазы Lysobacetr sp. XL1. Биохимия. Т. 70. С. 1250- 1257.

25. Стрешинская Г.М., Наумова И.Б., Панина Л.И. (1979). Химический состав клеточной стенки Streptomyces chrysomallus, образующего антибиотик аурантин. Микробиология. Т. 48. С. 814 819.

26. Akita М., Sasaki S., Matsuyama S., Mizushima S. (1990). SecA interaction with secretory proteins by recognizing the positive charge at the amino terminus of the signal peptide in Escherichia coli. Biol Chem. Vol. 265. P. 8164-8169.

27. Allan N.D. and Beveridge T.J. (2003). Gentamicin delivery to Burkholderia cepacia group Ilia strains via membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa PAOl. Antimicrob Agents Chemother. Vol. 47. P. 2962 2965.

28. Altman E., Kumamoto C., Emr S. (1991). Heat-shock proteins can substitute for SecB function during protein export in Escherichia coli. Vol. 10. P. 239 -245.

29. Ames G.F., Spudich E.N. and Nikaido H. (1974). Protein composition of the outer membrane of Salmonella typhnnurium: Effect of lipopolysaccharide mutations. J Bacteriol. Vol. 117. P. 406 416.

30. Archibald A.R. (1974). The structure, biosynthesis and function of teichoic acid. Adv Microb Physiol. Vol. 11. P. 53 59.

31. Archibald A.R. (1980). Phage receptors in gram-positive bacteria. In: Virus receptors, part 1, Receptors and Recognition. (Cuatrecasas P., Greaves M. F. eds.). Chapman and Hall, London. Series B. Vol. 7. P. 5 26.

32. Archibald A.R., Amstrong J.J., Baddiley J., Hay J.B. (1961). Teichoic acids and the structure of bacterial cell wall. Nature. Vol. 191. P. 570 572.

33. Archibald A.R., Hancock I.C., Harwood C.R. (1993). Cell wall structure, synthesis and turnover. In: Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria. (Hoch J.A., Losick R. eds.). American Society for Microbiology, Washington. P. 381 -410.

34. Armstrong J.J., Baddiley J. and Buchanan J.G. (1960). Structure of the ribitol teichoic acid from the walls of Bacillus subtilis. Bichemistry. Vol. 76. P. 610-621.

35. Atrih A., Foster S.J. (1999). The roles of peptidoglycan structure and structural dynamics during dormancy and germination. Antonie van Leeuwenhoek. Vol. 75. P. 299 307.

36. Baddiley J. (1988). The function of teichoic acids in walls and membranes of bacteria. In: The Roots of Modern Biochemistry (Kleinkauf von Dohren, Jaenicke S., eds.). Walter de Gruyter and C°, Berlin-New York. P. 223 -229.

37. Ballardie F.W., Capon B. (1972). 3,4-Dinitrophenyl tetra-N-acetyl-p-D-chitotetraoside a good chromophoric substrate for hen's egg-white lysozyme. J Chem Soc Commun. Vol. 14. P. 828 829.

38. Beacham I.R. (1979). Periplasmic enzymes in gram-negative bacteria. Int J Biochem. Vol.10. P.877 881.

39. Benz R. (1994). Uptake of solutes through bacterial outer membranes. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.M., Hakenbeck R. eds). Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 397 — 424.

40. Berks В., Sargent F., Palmer T. (2000). The Tat protein export pathway. Mol Microbiol. Vol. 35. P. 260 274.

41. Bernadac A., Gavioli M., Lazzaroni J.C., Raina S. and Lloubes R. (1998). Escherichia coli tol-pal mutants form outer membrane vesicles. J Bacteriol. Vol. 180. P. 4872-4878.

42. Bernhardt T.G., Wang I.-N., Struck D.K., Young R. (2002). Breaking free: "Protein antibiotics" and phage lysis. Research in Microbiology Vol. 53. P. 493-501.

43. Beukes M., Bierbaum G., Sahl H.-G., Hastings J.W. (2000). Purification and partical characterization of a murein hydrolase, millericin B, produced by Streptococcus milleri NMSCC 061. Appl Anviron Microbiol. Vol. 66. P. 23 -28.

44. Beveridge T.J. (1981). Ultrastructure, chemistry, and function of the bacterial wall. Int Rev Cytol. Vol. 72. P. 229 317.

45. Beveridge T.J. (1999). Structures of Gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. Vol. 181. P. 4725 4733.

46. Beveridge T.J., Makin S.A., Kadurugamuwa J.L. and Li Z. (1997). Interactions between biofilms and the environment. FEMS Microbiol Rev. Vol. 20. P. 291 -303

47. Binet R., Le'toffe' S., Ghigo J., Delepelaire P. and Wandersman C. (1997). Protein secretion by Gram negative bacterial ABC exporters — a review. Gene. Vol. 192. P.7-11.

48. Bitter W., Koster M., Latijnhouwers M., De Cock H. and Tommassen J. (1998). Formation of oligomeric rings by XcpQ and PilQ, which are involved in protein transport across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. Vol. 27. P. 209 219.

49. Blackman S.A., Smith T.J, Foster S.J. (1998). The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. Vol. 144.P. 73 — 82.

50. Blaser M.J, Hopkins J.A, Berka R.M., Vasil M.L. and Wang W.L. (1983). Identification and characterization of Campylobacter jejuni outer membrane proteins. Infect Immun. Vol. 42. P. 276 284.

51. Blobel G, Dobberstein B. (1975). Transfer of proteins across membranes. I. Presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma. J.Cell Biol. Vol. 67. P. 835 851.

52. Boland F.M., Atrin A, Chirakkal H, Foster S.J, Moir A. (2000). Complete spore-cortex hydrolysis during germination of Bacillus subtilis 168 requires SleB and YpeB. Microbiology. Vol. 146. P. 57-64.

53. Bone R, Silen J.L, Agard D.A. (1989). Structural plasticity broadens the specificity of an engineered protease. Nature. Vol. 339. P. 191 195.

54. Braun V, Wu H.C. (1994). Lipoproteins, structure, function, biosynthesis and model to protein export. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.M, Hakenbeck R. eds), Elsevier Science B.V, Amsterdam. P. 319 342.

55. Briggs M, Gierash L.M. (1986). Molecular mechanisms of protein secretion: the role of the signal sequence. Adv Protein Chem. Vol. 38. P. 109 -180.

56. Bronneke V, Fiedler P. (1994). Prodaction of bacteriolytic enzymes by Streptomyces globisporus regulated by exogenous bacterial cell walls. Appl Env Microbiol. Vol. 60. P. 785-791.

57. Burge R.E., Fowler A.G., Reaveley D.A. (1977). Structure of the peptidoglican of bacterial cell walls. I. J Mol Biol. 1977. Vol.117. P. 927 -953.

58. Caldentey J., Bamford D.H. (1992). The lytic enzyme of the Pseudomonas phage phi 6. Purification and biochemical characterization. Biochim Biophys Acta. Vol. 1159. P. 44 50.

59. Cascales E. and Christie P.J. (2004). Definition of a bacterial type IV secretion pathway for a DNA substrate. Science. Vol. 304. P. 1170 1173.

60. Cascales E., Bernadac A., Gavioli M., Lazzaroni J.C. and Lloubes R. (2002). Pal lipoprotein of Escherichia coli plays a major role in outer membrane integrity. J Bacteriol. Vol. 184. P. 754 759

61. Chatterjee S.N. and Das J. (1967). Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. J Gen Microbiol. Vol. 49. P. 1 11.

62. Cheng X., Zhang X., Pflugrath J.W., Studier F.W. (1994). The structure of bacteriophage T7 lysozyme, a zinc amidase and an inhibitor of T7 RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 91. P. 4034 4038.

63. Christensen P., Cook F.D. (1978). Lysobacter, a new genus of nonfruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Int J Syst Bacteriol. Vol. 28. P. 367 -393.

64. Christie PJ. (2001). Type IV secretion: intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. Vol. 40. P. 294 305.

65. Ciofu O., Beveridge T.J., Kadurugamuwa J., Walther-Rasmussen J. and Hoiby N. (2000). Chromosomal 3-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob Chemother. Vol. 45. P. 9 13.

66. Cornelis G.R., van Gijsegem F. (2000). Assembly and function of type III secretory systems. Annu Rev Microbiol. Vol. 54. P. 735 774.

67. Costerton J.W., Ingram J.M., Cheng L. (1974). Structural and function of the cell envelope of gram-negative bacteriae. Bacteriol Rev. Vol. 81. P. 87 — 110.

68. Croux C., Canard В., Goma G., Soucaille P. (1992). Purification and characterization of an extracellular muramidase of ClosMdium acetobutylicum ATCC-824 that acts on non-N-acetylated peptidoglycan. Appl Env Microbiol. Vol. 58. P. 1075 1081.

69. Croux C., Ronda C., Lopez R., Garcia J.L. (1993). Role of the C-terminal domain of the lysozyme of Clostridium acetobutylicum ATCC 824 in a chimeric pneumococcal-clostridial cell wall lytic enzyme. FEBS. Vol. 336. P. Ill 114.

70. Das A. and Xie Y.H. (2000). The Agrobacterium T-DNA transport pore proteins VirB8, VirB9, and VirBlO interact with one another. J Bacteriol. Vol. 182. P. 758-763.

71. De Boer P.A., Cook W.R., Rothfield L.I. (1990). Bacterial cell divisioin. Annu Rev Genet. Vol. 24. P. 249 274.

72. Dijkstra A.J., Keck W. (1996). Peptidoglycan as barrier to transenvelope transport. J Bacteriol. Vol. 178. P. 5555 5562.

73. Dorward D.W. and Garon C.F. (1989). DNA-binding proteins in cells and membrane blebs of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. Vol. 171. P. 4196 -4201.

74. Dorward D.W., Garon C.F. and Judd R.C. (1989). Export and intercellular transfer of DNA via membrane blebs of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. Vol. 171. P. 2499-2505.

75. Driessen A. (1993). SecA, the peripheral subunit of the Escherichia coli precursor protein translocase, is functional as a dimer. Bichemistry. Vol. 32. P. 13190- 13197.

76. Duong F., Eichler J., Price A., Leonard M.R., Wickner W. (1997a). Biogenesis of the Gram-negative bacterial envelope. Cell. Vol. 91. P. 567 -573.

77. Duong F., Wickner W. (1997b). Distinct catalytic roles of the SecYE SecG and SecDFyajC subunits of preprotein tranlocase holoenzyme. EMBO J. Vol. 16. P. 2756-2768.

78. Duong F., Wickner W. (1997c). The SecDFyajC domain of preprotein translocase controls preprotein movement by regulating SecA membrane cycling. EMBO J. Vol. 16. P. 4871 4879.

79. Economou A. (1999). Following the leader: bacterial protein export through the Sec pathway. Trends Microbiol. Vol. 7. P. 315 320.

80. Eggert U.S., Ruiz N., Falcone B.V., Branstrom A.A., Goldman R.C., Silhavy T.J. and Kahne D. (2001). Genetic basis for activity differences between vancomycin and glycolipid derivatives of vancomycin. Science. Vol. 294. P. 361-364.

81. Epstein D.M., Wensink P.C. (1988). The a-lytic protease gene of Lysobacter enzymogenes. J. Biol. Chem. Vol. 263. P. 16586 16590.

82. Evrard C., Declercq J.P., Fastrez J. (1997). Crystallization and preliminary X-ray analysis of bacteriophage lambda lysozyme in which all tryptophans have been replaced by aza-tryptophans. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. Vol. 53. P. 217-219.

83. Fan D.P., Beckman M.M. (1973). Micrococcus lysodeikticus bacterial wall as a substrate specific for the autolytic glycosidase of Bacillus subtilis. J Bacteriol. Vol. 114. P. 804 813.

84. Fekkes P., Driessen A. (1999). Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane. Microbiol Mol Biol Rev. Vol. 63. P. 161 173.

85. Fermor T.R., Wood D.A. (1981). Degradation of bacteria by Agaricus bisporus and other fungi. J Gen Microbiol. Vol. 126. P. 377 388.

86. Filloux A., Bally M., Ball G., Akrin M., Tommassen J., Lazdunski A. (1990). Protein secretion in Gram negative bacteria: transport across the outer membrane involved common mechanism in different bacteria. J EMBO. Vol. 9. P. 4323 - 4329.

87. Fischer W. (1994). Lypoteichoic acids and lipoglycans. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 199-216.

88. Fives-Taylor P.M., Meyer D.H., Mintz K.P. and Brissette C. (2000). Virulence factors of Actinobacillus actinomycetemcomitans. Periodontal. Vol. 20. P. 136- 167.

89. Fleming A. (1922). Proc. R. Soc., London. Ser. B. Vol. 93. P. 306-317.

90. Formanek M. (1985). Three-dimensional model of the carbohydrate moieties of murein and pseudomurein. Z Naturforsch. Vol. 40. P. 555 — 561.

91. Galan J.E, Collmer A. (1999). Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells. Science. Vol. 284. P. 1322 — 1328.

92. Gamazo C. and Moriyon I. (1987). Release of outer membrane fragments by exponentially growing Brucella melitensis cells. Infect Immun. Vol. 55. P. 609-615.

93. Gankema H., Wensink J., Guinee P.A., Jansen W.H. and Witholt B. (1980). Some characteristics of the outer membrane material released by growing enterotoxigenic Escherichia coli. Infect Immun. Vol. 29. P. 704 713.

94. Geller В. (1991). Energy requirements for protein translocation across the Escherichia coli inner membrane. Mol Microbiol. Vol. 5. P. 2093 2098.

95. Genin S. and Boucher C.A. (1994) A superfamily of proteins involved in different secretion pathways in gram-negative bacteria: modular structure and specificity of the N- terminal domain. Mol Gen Genet. Vol. 243. P. 112 118.

96. Gentschev I, Dietrich G. and Goebel W. (2002). The E. coli alpha-hemolysin secretion system and its use in vaccine development. Trends Microbiol. Vol. 10. P. 39 45.

97. Ghuysen J.M, Brasseur J.L, Joris B, Shockman G.D. (1994). Binding siteshaped repeated sequences of bacterial wall peptidoglycan hydrolases. FEBS'i1.tt. Vol. 342. P. 23 28.

98. Glauner B, Holtje J,V, Schwarz U. (1988). Composition of the murein of Escherichia coli. J Biol Chem. Vol. 263. P. 10088 10095.

99. Gombas D.E, LabbeR.G. (1981). Extraction of spore-lytic enzyme from Clostridiumperfingens spores. J Gen Microbiol. Vol. 126. P. 37 — 44.

100. Goodell E.W. (1985). Recycling of murein by Escherichia coli. J Bacteriol. Vol. 163. P. 305-310.

101. Grass S. and St. Geme J.W. III. (2000). Maturation and secretion of the non-typable Haemophilus influenzae HMW1 adhesin: roles of the N-terminal and C-terminal domains. Mol Microbiol. Vol. 36. P. 55 — 67.

102. Grenier D. and Mayrand D. (1987). Functional characterization of extracellular vesicles produced by Bacteroides gingivalis. Infect Immun. Vol. 55. P. 111-117.

103. Hacker J., Kaper J.B. (2000). Pathogenicty islands and the evolution of microbes. Annu Rev Microbiol. Vol. 54. P. 641 79.

104. Hara S., Matsushima I. (1972). Studies on the substrate specificity of egg white lysozyme. A comparative study of the substrate specificity of lysozyme from different sources. Bichemistry. Vol. 72. P. 993 1000.

105. Hash J.H., Wishnick M., Miller P.A. (1964). Formation of «protoplasts» of Staphylococcus aureus with a fungal N-acetylhexosaminidase. J Bacteriol. Vol. 87. P. 432-437.

106. Haska I. (1972). Purification and properties of lytic enzymes from Myxococcus virescenens. Physiol Plant. Vol. 27. P. 139 142.

107. Henderson I.R. and Nataro J.P. (2001). Virulence functions of autotransporter proteins. Infection and Immunity. Vol. 69. P. 1231 1243.

108. Hoekstra D., van der Laan J.W., de Leij L. and Witholt B. (1976). Release of outer membrane fragments from normally growing Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. Vol. 455. P. 889 899.

109. Holtje J.V. (1975). Novel type of murein transglycosylase in Escherichia coli. J Bacteriol. Vol. 124. P. 1067 1076.

110. Holtje J.V. and Tuomanen E.I. (1991). The murein hydrolases of Escherichia coli: properties, function and impact on the course of infection in vivo. J Gen Microbiol. Vol. 137. P. 441 454.

111. Horstman A.L. and Kuehn M.J. (2000). Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. Vol. 275. P. 12489 12496.

112. Huang J., Schell M.A. (1990). Evidence that extracellular export of the endoglucanase encoded by egl of Pseudomonas solanacearum occurs by a two-step process involving a lipoprotein intermediate. J Biol Chem. Vol. 265. P. 11628- 11632.

113. Hull M.E. (1974). Studies on milk proteins. II. Colorimetric determination of the partial hydrolysis of the proteins in milk. J Diary Sci. Vol. 30. P. 881 -884.

114. Imoto Т., Jonson L.N., North A.C.T., Phillips D.C., Rupley J.A. (1972). Vertebrate lysozyme. In: The enzymes (Boyer P.D. ed). Acad Press, New York, London. Vol. 7. P. 665 868.

115. Ishikawa S., Hara Y., Ohnishi R., Sekiguchi J. (1998). Regulation of a new cell wall hydrolase gene cwlF, which affects cell separation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. Vol. 180. P. 2549 2555.

116. Iversen O.J., Grov A. (1973). Studies of lysostaphin. Separation and characterization on three enzymes. Eur J Biochem. Vol. 38. P. 293 300.

117. Jacob-Dubuisson F., Locht C., Antoine R. (2001). Two-partner secretion in Gram-negative bacteria: a thrifty, specific partway for large virulence proteins. Mol Microbiol. Vol. 40. P. 306 313.

118. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. (1996). Bacteriolytic effect of membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa on other bacteria including pathogens: Conceptually new antibiotics. J Bacteriol. Vol. 178. P. 2767 2774.

119. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. (1997). Natural release of virulence factors in membrane vesicles by Pseudomonas aeruginosa and the effect of aminoglycoside antibiotics on their release. J Antimicrob Chemother. Vol. 40. P. 615-621.

120. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. (1998). Delivery of the non-membrane-permeative antibiotic gentamicin into mammalian cells by using Shigella flexneri membrane vesicles. Antimicrob Agents Chemother. Vol. 42. P. 1476- 1483.

121. Kadurugamuwa J.L. and Beveridge T.J. (1999). Membrane vesicles derived from Pseudomonas aeruginosa and Shigella flexneri can be integrated into the surfaces of other Gram-negative bacteria. Microbiology. Vol. 145. P. 2051 -2060.

122. Kadurugamuwa J.L., Mayer A., Messner P., Sara M., Sleytr U.B. and Beveridge T.J. (1998). S-layered Aneurinibacillus and Bacillus spp. are susceptible to the lytic action of Pseudomonas aeruginosa membrane vesicles. J Bacteriol. Vol. 180. P. 2306-2311.

123. Kamamura Т., Shockman G.D. (1983). Purification and some properties of the endogenous, autolytic N-acetylmuramylhydrolase of Streptococcus faecium, a bacterial glycoenzyme. J Biol Chem. Vol. 258. P. 9514 — 9521.

124. Karkhanis Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J.J. and Carlo D.J. (1978). A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. Anal Biochem. Vol. 85. P. 595-601.

125. Kato К., Matsubara Т., Mori J., Kotani S. (1960). «Protoplasts» formation in Staphylococcus aureus using the lytic enzyme produced by a Flavobacterium. Biken'S J. Vol. 3. P. 201 203.

126. Kato S., Kowashi Y. and Demuth D.R. (2002). Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microb Pathog. Vol. 32. P. 1 13.

127. Kawata S., Takemura Т., Takase Y., Yokogawa K. (1984). Purification and characterization of N-acetyl-muramyl-L-alanine amidase from Streptomyces globisporus 1829. Agr Biol Chem. Vol. 48. P. 261 269.

128. Keck W., van Leeuwen A.M., Leuber M., Goodell E.W. (1990). Cloning and characterization of mepA, the structural gene of the penicillin-insensitive murein hydrolase from Escherichia coli. Mol Microbiol. Vol. 4. P. 209-219.

129. Keenan J., Day Т., Neal S., Cook В., Perez-Perez G., Allardyce R. and Bagshaw P. (2000). A role for the bacterial outer membrane in the pathogenesis of Helicobacter pylori infection. FEMS Microbiol Lett. Vol. 182. P. 259-264.

130. Kehoe M.A. (1994). Cell-wall-associated proteins in Gram-positive bacteria. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell-wall (Ghuysen J.M., HakenbeckR., eds). Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 217 — 261.

131. Kesty N.C. and Kuehn M.J. (2004). Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J Biol Chem. Vol. 279. P. 2069 2076.

132. Kesty N.C., Mason K.M., Reedy M., Miller S.E. and Kuehn M.J. (2004). Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. Vol. 23. P. 4538 4549.

133. Khandelwal P. and Banerjee-Bhatnagar N. (2003). Insecticidal activity associated with the outer membrane vesicles of Xenorhabdus nematophilus. Appl Environ Microbiol. Vol. 69. P. 2032 2037.

134. Kim S.Y., Ohk S.H., Bai D.H., Yu J.H. (1999). Purification and properties of bacteriolytic enzymes from Bacillus licheniformis YS-1005 against Streptococcus mutants. Bioscience biotechnology and biochemistry. Vol. 63. P. 73 77.

135. Klauser Т., Pohlner J., Meyer T.F. (1992). Selective extracellular release of cholera toxin В subunit by Escherichia coli: dessection of Neisseria Ig Ab-mediated outer membrane transport. J EMBO. Vol.11. P. 2327 2335.

136. Kobayashi H., Uematsu K., Hirayama H. and Horikoshi K. (2000). Novel toluene elimination system in a toluene-tolerant microorganism. J Bacteriol. Vol. 182. P. 6451 -6455.

137. Koch A.L. (1995). Bacterial growth and form. Chapmen and Hall, New York. 385 p.

138. Koebnik R., Locher K.P. and van Gelder P. (2000) Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. Vol. 37. P. 239-253

139. Kolling G.L. and Matthews K.R. (1999). Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli 0157:H7. Appl Environ Microbiol. Vol. 65. P. 1843 1848.

140. Komatsuzawa H., Sugai M., Nakashima S., Suginaka H. (1995). Alteration of bacteriolytic enzymes profile of Staphylococcus aureus during growth. Microbiol Immunol. Vol. 39. P. 629 633.

141. Kondo K., Takade A. and Amako K. (1993). Release of the outer membrane vesicles from Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus. Microbiol Immunol. Vol. 37. P. 149 152.

142. Kornberg A., Horecker B.L. (1955). Glucose-6-phosphate dehydrogenase. In: Methods in Enzymology (Colowick S.P., Kaplan N.O. eds). Acad Press, New York. P. 323-325.

143. Koronakis V, Koronakis E, Hughes C. (1989). Isolation and analysis of the C-terminal signal directing export of Escherichia coli hemolysin protein across both bacterial membranes. EMBO J. Vol. 8. P. 595 — 605.

144. Kostakioti M., Newman C.L., Thanassi D.G. and Stathopoulos C. (2005). Mechanisms of Protein Export across the Bacterial Outer Membrane. J Bacteriol. Vol. 187. P. 4306 4314.

145. Kuehn M.J. and Nicole C. Kesty N.C. (2005). Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Develop. Vol. 19. P. 2645 2655.

146. Kumamoto C., Beckwith J. (1985). Evidence for specificity at an early step in protein export in Escherichia coli. J Bacteriol. Vol. 163. P. 267 — 274.

147. Kuroda A., Sugimoto Y., Funahashi Т., Sekiguchi J. (1992). Genetic structure, isolation and characterization of a Bacillus licheniformis cell wall hydrolases. Mol Gen Genet. Vol. 234. P. 129 137.

148. Kusukawa N., Yura Т., Ueguchi C., Akiyama Y., Ito K. (1989). Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBO J. Vol. 8. P. 3517 3521.

149. Labischinski H., Maidhof H. (1994). Bacterial peptidoglycan: overview and evolving concepts. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell-wall (Ghuysen J.M., Hakenbeck R., eds). Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 23 28.

150. Ladant D. and Ullmann A. (1999). Bordetella pertussis adenylate cyclase: a toxin with multiple talents. Trends Microbiol. Vol. 7. P. 172 176

151. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature. Vol. 277. P. 680 685.

152. Lai E.M. and Kado C.I. (2000). The T-pilus of Agrobacterium tumefaciens. Trends Microbiol. Vol. 8. P. 361 369.

153. Lambert P.A. (1998). Enterobacteriaceae: composition, structure and function of cell envelope. J Appl Bacteriol. Vol. 65. P. 21S 34S.

154. Lambert-Buisine C, Willery E, Locht C, Jacob-Dubuisson F. (1998). N-terminal characterization of the Bordetella pertussis filamentous haemagglutinin. Mol Microbiol. Vol. 28. P. 1283 1293.

155. Lederer E, Adam A, Ciorbaru R, Petit J.F, Wietzerbin J. (1975). Cell walls of mycobacteria and related organisms: chemistry and immunostimulant properties. Mol Cell Biochem. Vol. 7. P. 87 104.

156. Lee V.T. and Schneewind O. (2001). Protein secretion and the pathogenesis of bacterial infections. Genes Dev. Vol. 15. P. 1725 — 1752.

157. Leyh-Bouille M, Ghuysen J.M., Tripper D.J, Strominger J.L. (1966). Structure of the cell wall of Micrococcus lysodeikticus I. Study of the structure of the glycan. Bichemistry. Vol. 10. P. 3079 3090.

158. Li Z, Clarke A. and Beveridge T.J. (1996). A major autolysin of Pseudomonas aeruginosa: Subcellular distribution, potential role in cell growth and division and secretion in surface membrane vesicles. J Bacteriol. Vol. 178. P. 2479-2488.

159. Li Z, Clarke A. and Beveridge T.J. (1998). Gram-negative bacteria produce membrane vesicles which are capable of killing other bacteria. J Bacteriol. Vol. 180. P. 5478-5483

160. Lindeberg M, Collmer A. (1992). Analysis of eight out genes required for pectic enzyme secretion by Erwinia chrysanthemi: protein sequence comparison with secretion genes from other gram- negative bacteria. J Bacteriol. Vol. 174. P. 7385 7397.

161. Linderoth N.A., Simon M.N. and Russel M. (1997). The filamentous phage plV multimer visualized by scanning transmission electron microscopy. Science. Vol. 278. P. 1635 1638.

162. Lindsay В., Glaser L. (1976). Characterization of the N-acetylmuramic acid L-alanine amidase from Bacillus subtilis. J Bacteriol. Vol. 127. P. 803 — 811.

163. Loeb M.R. and Kilner J. (1978). Release of a special fraction of the outer membrane from both growing and phage T4-infected Escherichia coli B. Biochim Biophys Acta. Vol. 514. P. 117 127.

164. Logan S.M. and Trust T.J. (1982). Outer membrane characteristics of Campylobacter jejuni. Infect Immun. Vol. 38. P. 898 906.

165. Lopez R., Garcia E., Garcia O., Garcia J.P. (1997). The pneumococcal cell wall degrading enzymes: a modular design to create new lysins? Microb Drug Resist. Vol. 2. P. 199 211.

166. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J Biol Chem. Vol. 193. P. 265 -275.

167. Makino S., Ito N., Inoue Т., Miyata S., Moriyama R. (1994). A spore-lytic enzyme released from Bacillus cereus spores during germination. Microbiology. Vol. 140. P. 1403 1410.

168. Margot P., Pagni M., Karamata D. (1999). Bacillus subtilis 168 gene lytF encodes a y-D-glutamate-meso-diaminopimelate muropeptidase expressed by the alternative gevetative sigma factor, aD. Microbiology. Vol. 145. P. 57 -65.

169. Mauk K., Chan L., Glaser L. (1971). Turnover of the cell wall of gram-positive bacteria. J Biol Chem. Vol. 246. P. 1820 1827.

170. Mayrand D. and Grenier D. (1989). Biological activities of outer membrane vesicles. Can J Microbiol. Vol. 35. P. 607 613.

171. McLaughlan A.M., Foster S.J. (1998). Molecular characterization of an autolytic amidase of Listeria monocytogenes EGD. Micribiol. Vol. 144. P. 1359- 1367.

172. Meadow P.M., Wells P.L., Salkinoja-Salonen M. and Nurmiaho E.L. (1978). The effect of lipopolysaccharide composition on the ultrastructure of Pseudomonas aeruginosa. J Gen Microbiol. Vol. 105. P. 23 28.

173. Model P., Pussel M. (1990). Procariotic secretion. Cell. Vol. 61. P. 739-741.

174. Mollner S., Braun V. (1984). Murein hydrolase (N-acetylmuramyl-L-alanine amidase) in human serum. Arch Microbiol. Vol. 140. P. 171 — 177.

175. Mori H., Ito K. (2001). The Sec protein-translocation pathway. Trends Microbiol. Vol. 9. P. 494 500.

176. Mug-Opstelten D. and Witholt B. (1978). Preferential release of new outer membrane fragments by exponentially growing Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. Vol. 508. P. 287 295.

177. Munoz E., Ghuysen J.M., Leyh-Bouille M., Petit J.F., Tinelli R. (1966). Structural variation in bacterial cell wall peptidoglycans studied with Streptomyces F1 endo-N-acetylmuramidase. Bichemistry. Vol. 5. P. 3091 -3098.

178. Murao S., Takahara G. (1973). Lytic enzymes for gram-negative bacteria prodused by Bacillus subtilis YT-25. Agr Biol Chem. Vol. 37. P. 2671 — 2673.

179. Narayanan S.K., Nagaraja T.G., Chengappa M.M. and Stewart G.C. (2002). Leukotoxins of gram-negative bacteria. Vet Microbiol. Vol. 84. P. 337 -356.

180. Naumova I.B. (1988). The teichoic acids of actinomycetes. Microbiol Sci. Vol. 5. P. 275 279.

181. Navarre W.W., Schneewind O. (1999). Surface proteins of gram-positive bacteria and mechanisms of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol Mol Biol Rev. Vol. 63. P. 174 229.

182. Neu H, Heppel LA (1965). The release of enzymes from Escherichia coli by osmotic shock and during the formation of spheroplasts. J Biol Chem. Vol. 240. P. 3685-3692.

183. Nguyen T.T., Saxena A. and Beveridge T.J. (2003). Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. J Electron Microsc (Tokyo). Vol. 52'. P. 465 469.

184. Nossal N.G., Heppel L.A. (1966). The release of enzymes by osmotic shock from Escherichia coli in exponential phase. J Biol Chem. Vol. 241. P. 3055 3062.

185. Nouwen N., Ranson N., Saibil H., Wolpensinger B.,,Engel A., Ghazi A. and Pugsley A.P. (1999). Secretin PulD; association with pilot PulS, structure, and ion-conducting channel formation. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 96. P. 8173 -8177.

186. Nowotny A., Behling U.H., Hammond В., Lai C.H., Listgarten M., Pham P.H. and Sanavi F. (1982). Release of toxic microvesicles by Actinobacillus actinomycetemcomitans. Infect Immun. Vol. 37. P. 151 — 154.

187. Ohnishi R., Ishikawa S., Sekiguchi J. (1999). Peptidoglycan hydrolase LytF plays a role in cell separation with CwlF during vegetative growth of Bacillus subtilis. J Bacteriol. Vol. 181. P. 3178 3184.

188. Ohta H., Нага H., Fukui K., Kurihara H., Murayama Y. and Kato K. (1993). Association of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin with nucleic acids on the bacterial cell surface. Infect Immun. Vol. 61. P. 4878 -4884.

189. Oliver D.B., Beckwith J. (1982). Regulation of a membrane component required for protein secretion in Escherichia coli. Cell. Vol. 30. P. 311 — 319.

190. Paetzel M., Dalbey R. E., Stiynadka N. (2000). The structure and mechanism of bacterial type I signal peptidases. A novel antibiotic target. Pharmacology and Therapy. Vol. 87. P. 27 — 49.

191. Paton J.C., Andrew P.W., Boulnois G.J., Mitchell T.J. (1993). Molecular analysis of the pathogenicity of Streptococcus pneumoniae: the role of pneumococcal proteins. Annu Rev Microbiol. Vol. 47. P. 89 — 115.

192. Pettit R.K. and Judd R.C. (1992). The interaction of naturally elaborated blebs from serum-susceptible and serum-resistant strains of Neisseria gonorrhoeae with normal human serum. Mol Microbiol. Vol. 6. P. 729 — 734.

193. Pink D., Moeller J., Quinn В., Jericho M., Beveridge T.J. (2000). On the architecture of the gram-negative bacterial murein sacculus. J Bacteriol. Vol. 182. P. 5925-5930.

194. Pohlner J., Langenberg U., Wolk U., Beck S.C. and Meyer T.F. (1995).к

195. Uptake and nuclear transport of Neisseria IgAl protease-associated alphaproteins in human cells. Mol Microbiol. Vol. 17. P. 1073 108.

196. Pooley H., Karamata D. (1984). Flagellation and the control of autolysins in Bacillus subtilis. In: Microbial cell wall synthesis and autolysis (Nombela C., ed.). Elsevier Sciense B.V., Amsterdam. P. 13 19.

197. Possot O., d'Enfert C., Reyss I., Pugsley A.P. (1992). Pullulanase secretion in Escherichia coli K12 requires a cytoplasmic membrane protein and putative polytopic cytoplasmic membrane protein. Mol Microbiol. Vol. 6. P. 95- 105.

198. Poulsen K., Brandt J., Hjorth J.P., Thogersen H.C. and Kilian M. (1989). Cloning and sequencing of the immunoglobulin Al protease gene (iga) of Haemophilus influenzae serotype b. Infect Immun. Vol. 57. P. 3097 — 3105.

199. Pugsley A. P. (1993). The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol Rev. Vol. 57. P. 50 108.

200. Pugsley A.P., Scwarts M. (1985). Export and secretion of proteins by bacteria. FEMS Microbiol Rev. Vol. 32. P. 3 38.

201. Reevers P. (1994). Biosynthesis and assembly of lipopolysaccharide. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.M., Hakenbeck R, eds). Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 281 318.

202. Renelli M., Matias V., Lo R.Y. and Beveridge T.J. (2004). DNA-containing membrane vesicles of Pseudomonas aeruginosa PAOl and their genetic transformation potential. Microbiology. Vol. 150. P. 2161 2169.

203. Reynolds E.S. (1963). The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J Cell Biol. Vol. 17. P. 208 213.

204. Rivas В., Garcia J.L., Lopez R., Garcia P. (2002). Purification and polar localization of pneumococcal LytB, a putative endo-P-N-acetylglucosaminidasa: the chaine-dispersing murein hydrolase. J Bacteriol. Vol. 184. P. 4988-5000.

205. Robinnson J.M., Hardman J.K., Sloan G.L. (1980). The characteristics of extracellular protein secretion by Staphylococcus staphylolyticus. J Gen Microbiol. Vol. 118. P. 529 533.

206. Rogers H.J., Taylor C., Rayter S., Ward J.B. (1984). Purification and properties of an autolytic endo-p-glucosaminidase and the N-acetylmuramyl-L-alanine amidase from Bacillus subtilis strain 168. J Gen Microbiol. Vol. 130. P. 2395 2402.

207. Sabra W., Lunsdorf H. and Zeng A.P. (2003). Alterations in the formation of lipopolysaccharide and membrane vesicles on the surface of Pseudomonas aeruginosa PAOl under oxygen stress conditions. Microbiology. Vol. 149. P. 2789-2795.

208. Sado S., Dworkin M. (1972). Bacteriolytic enzymes produced Myxococcus xanthus. J Bacteriol. Vol. 110. P. 236 245.

209. Salmond G.P.C. (1994). Secretion of extracellular virulence factors by plant pathogenic bacteria. Annu Rev Phytopathol. Vol. 32. P. 181 200.

210. Salton M.R. (1952). The nature of the cell walls of some Gram-positive and Gram-negative bacteria. Biochim Biophys Acta. Vol. 9. P. 334 335.

211. Salton M.R. 1952. The nature of the cell walls of some Gram-positive and Gram-negative bacteria. Biochim Biophys Acta. Vol. 9. P. 334 335.

212. Salton M.R.J. (1994). The bacterial cell envelope a historical perspective. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial cell wall (Ghuysen J.M., Hakenbeck R., eds), Elsevier Science B.V., Amsterdam. P. 1 — 22.

213. Sanz J.M., Diaz E., Garcia J.L. (1992). Studies on the structure and function of the N-terminal domain of the pneumococcal murein hydrolases. Mo 1 Microbiol. Vol. 6. P. 921 931.

214. Saunders N.B., Shoemaker D.R., Brandt B.L., Moran, E.E., Larsen T. and Zollinger W.D. (1999). Immunogenicity of intranasally administered meningococcal native outer membrane vesicles in mice. Infect Immun. Vol. 67. P. 113-119.

215. Schiebel E., Schwarz H., Braun V. (1989). Subcellular location and unique secretion of the hemolysin of Serratia marcescens. J Cell Biol. Vol. 264. P. 16311- 16320.

216. Schindler C.A., Schuhardt V.T. (1964). Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for the staphylococcus. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 51. P. 414 -421.

217. Schleifer K.N., Kandler O. (1972). Peptidoglycan types of bacterial cell wallsand their taxonomic implications. Bact Rev. Vol. 36. P. 407 — 477.

218. Schmelzer E., Weckesser J., Warth R., Mayer M. (1982). Peptidoglycan of Rhodopseudomonas viridis: partial lack of N-acetyl substitutionof glucosamine. J Bacteriol. Vol. 88. P. 815-816.

219. Schnaitman C.A. (1971) Solubilisation of cytoplasmic membrane of Escherichia coli by Tryton X-100. J Bacteriol. Vol. 108. P. 545 552.

220. Schnaitman C.A. and Klena J.D. (1993). Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria. Microbiol Rev. Vol. 57. P. 655 — 682.

221. Sekiguchi J., Akeo K., Yamamoto H., Khasov F.K., Alonso J.C., Kuroda A. (1995). Nucleotide sequence and regulation of a new putative cell wall hydrolase gen, cw/D, which affects germination in Bacillus subtilis. J Bacterilogy. Vol. 177. P. 5582 5589.

222. Shaw D., Mirelman D., Chatterjee N.N., Park J.T. (1970). Ribitol teichoic acid synthesis in bacteriophage resistant mutant of Staphylococcus aureus H. J Mol Biol. Vol. 245. P. 5101 5106.

223. Shindler C.A., Schuhard V.T., (1964). Lysostaphin: a new bacteriolytic agent for staphylococcus. Proc Natl Acad Sci USA. Vol. 51. P. 414 421.

224. Shoberg R.J. and Thomas D.D. (1993). Specific adherence of Borrelia burgdorferi extracellular vesicles to human endothelial cells in culture. Infect Immun. Vol. 61. P. 3892 3900.

225. Shockman G.D. (1992). The autolytic (suicide) system of Enterococcus hirae: from lysine depletion autolysis to biochemical and molecular studies of the two muramidase of Enterococcus hirae ATCC 9790. FEMS Microbiol Lett. Vol. 79. P. 261 267.

226. Shockman G.D. and Holtje J.V. (1994). Microbial peptidoglycan (murein) hydrolases. In: New Comprehensive Biochemistry. Bacterial Cell Wall (Ghuysen J.M. and Hakenbeck R. eds). Elsevier Sciense B.V, Amsterdam. P. 131 165.

227. Silen J.L. Frank D, Fujishige A, Bone R, Agard D.A. (1989). Analysis of prepro-a-lytic protease expression in Escherichia coli reveals that the pro region is required for activity. J Bacteriol. Vol. 171. P. 1320 1325.

228. Silen J.L, Agard D.A. (1989). The я-lytic protease pro-region does not require a physical linkage to activate the protease domain in vivo. Nature. Vol. 341. P. 462-464.

229. Simonen M, Palva I. (1993). Protein secretion in Bacillus sp. Microbiol Rev. Vol. 57. P. 109-137

230. Sinha R.K, Rosental R.S. (1980). Release of soluble peptidoglycan from growing gonococci: demonstration of anhydromuramyl-containing fragments. Infect Immun. Vol. 29. P. 914 925.

231. Sleytr U.B. (1997). Basic and applied S-layer research: an overview . FEMS Microbiol Rev. Vol. 20. P. 5 12.

232. Smit J, Kamio Y. and Nikaido H. (1975). Outer membrane of Salmonella typhimurium: Chemical analysis and freeze-fracture studies with lipopolysaccharide mutants. J Bacteriol. Vol. 124. P. 942 958.

233. Smith T.J, Blackman S.A, Foster S.J. (2000). Autolysins of Bacillus subtilis: multiple enzymes with multiple function. Microbiology. Vol. 146. P. 249 262.

234. Sohl J.L., Jaswal S.S., Agard D.A. (1998). Unfolded conformations of a-lytic protease are more stable than its native state. Nature. Vol. 395. P. 817 — 819.

235. St Geme J.W. Ill and Grass S. (1998) Secretion of the Haemophilus influenzae HMW1 and HMW2 adhesins involves a periplasmic intermediate and requires the HMWB and HMWC proteins. Mol Microbiol. Vol. 27. P. 617-630.

236. Stephens D.S., Edwards K.M., Morris F. and McGee Z.A. (1982). Pili and outer membrane appendages on Neisseria meningitidis in the cerebrospinal fluid of an infant. J Infect Dis. Vol. 146. P. 568.

237. Stevens L. (1996). Egg proteins: what are their functions? Vol. 79. P. 65-87.

238. Strominger J.L., Ghuysen J.M. (1967). Mechanisms of enzymatic bacteriolysis. Science. Vol. 156. P. 213 -221.

239. Strominger J.L., Tipper D.J. (1974). Structure of bacterial cell wall: the lysozyme substrate. In: Lysozyme (Osserman E.F.,Canfield R.E., Beychok S. eds). Acad. Press, NewYork-London. P. 169 184.

240. Strominger J.L., Tipper D.J. (1974). Structure of bacterial cell wall: the lysozyme substrate. In: Lysozyme (Osserman E.F.,Canfield R.E., Beychok S. eds). Acad. Press, NewYork-London. P. 169 184.

241. Strynadka, N.C.J.; James, M.N.G. (1991). Lysozyme Revisited: Crystallographic Evidence for Distortion of an N-Acetylmuramic Acid Residue Bound in Site D. Journal of Molecular Biology. Vol. 220. P. 401 -424.

242. Sugai M., Akiyama Т., Komatsuzawa H., Miyake Y., Suginaka H. (1990). Characterization of sodium dodecyl sulfate-stable Staphylococcus aureus bacteriolytic enzymes by polyacrylamide gell electrophoresis. J Bacteriol. Vol. 172. P. 6494 6498.

243. Tanaka J., Suzuki Т., Mimuro H. and Sasakawa C. (2003). Structural definition on the surface of Helicobacter pylori type IV secretion apparatus. Cell Microbiol. Vol. 5. P. 395 404.

244. Taylor P.W. (1983). Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against gram-negative bacteria. Microbiol Rev. Vol. 47. P. 46 83.

245. Thanassi D.G. and Hultgren S. J. (2000). Multiple pathways allow protein secretion across the bacterial outer membrane. Current Opinion in Cell Biology. Vol. 12. P. 420 430.

246. Tripper D.J., Ghuysen J.M., Strominger J.L. (1965). Structure of the cell wall of Staphylococcus aureus, strain Copenhagen. III. Further studies of the disaccharides. Bichemistry. Vol. 4. P. 468 473.

247. Tsugita A. (1971). Phage lysozyme and other lytic enzymes. In: The enzymes (Boyer P.D. ed). Acad Press, New York-London. Vol. 5. P. 343 -413.

248. Uchido K., Aido K. (1979). Taxonomic significance of cell-wall acyl type in Corynebacterium-Micobacterium-Nocardia group by a glycolate test. J Gen Apll Microbiol. Vol. 25. P. 169 183.

249. Valence F., Lortal S. (1995). Zymogram and preliminary characterization of Lactobacillus helveticus autolysins. Appl Environ Microbiol. Vol. 61. P. 3391 3399.

250. Vallinger Z., Ladesic В., Tomasic J. (1982). Partial purification and characterization of N-acetylmuramyl-L-alanine amidase from human and mouse serum. Biochim Biophis Acta. Vol. 701. P. 63 71.

251. Vrontou E., Economou A. (2004). Structure and function of SecA, the preprotein translocase nanomotor. Biochim Biophys Acta. Vol. 1694. P. 67 -80.

252. Wandersman C. (1989). Secretion, processing and activation of bacterial extracellular proteases. Mol Microbiol. Vol. 3. P. 1825 1831.

253. Ward J.B. (1981). Teichoic and teichuronic acids: Biosynthesis, assembly and location. Microbiol Rev. Vol. 45. P. 211 243.

254. Ward J.B., Perkins H.R (1968). The purification and properties of two staphylolytic enzymes from Streptomyces griseus. Bichemistry. Vol. 106. P. 69-76.

255. Ward J.B., Williamson R. (1984). Bacterial autolysins: specificity and function. In: Microbial cell wall synthesis and autolysis (Nombela C., ed.). Elsevier Sciense B.V., Amsterdam. P. 159 166.

256. Weibull C. (1953). The isolation of protoplasts from Bacillus megaterium by controlled treatment with lysozyme. J Bacteriol. Vol. 66. P. 688 695.

257. White D. (1995). The Physiology and Biochemistry of Prokaryotes. Oxford University Press, N.Y. 378 p.

258. Wild J., Altman E., Yura Т., Cross C. (1996). Involvement of the DnaK-DnaJ-GroE chaperone team in protein export in Escherichia coli. Genes Dev. Vol. 6. P. 1165- 1172.

259. Wren B.V. (1991). A family of clostridial and streptococcal ligand-binding proteins with conserved C-terminal repeat sequences. Mol Microbiol. Vol. 5. P. 797 803.

260. Yaron S, Kolling G.L, Simon L. and Matthews K.R. (2000). Vesicle-mediated transfer of virulence genes from Escherichia coli 0157:H7 to other enteric bacteria. Appl Environ Microbiol. Vol. 66. P. 4414 4420.

261. Yem D.W, Wu H.C. (1976). Purification and properties of p-D-acetylglucosaminides from Escherichia coli. J Bacteriol. Vol. 125. P. 324 -331.

262. Yokogawa K, Kawata S, Takemura T, Yoshimura Y. (1975). Purification and properties of lytic enzymes from Streptomyces globisporus 1829. Agr Biol Chem. Vol. 39. P. 1533 1543.

263. Yokogawa K, Kawata S, Yoshimura Y. (1973). Lytic enzyme from Streptomyces globisporus 1829. Agr Biol Chem. Vol. 37. P. 799 808.

264. Yoshimoto T, Tsuru D. (1972). Studies on bacteriolytic Enzymes. II. Purification and some properties of two types of staphylolytic enzymes from Streptomyces griseus. Bichemistry. Vol. 72. P. 379 390.

265. Yoshino S, Ogata S, Hayashida S. (1982). Some properties of autolysins of Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Agr Biol Chem. Vol. 46. P. 1243 1248.

266. Zhou L, Srisatjaluk R, Justus D.E. and Doyle R.J. (1998). On the origin of membrane vesicles in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol Lett. Vol. 163. P. 223-228.

Информация о работе

Васильева, Наталья Валерьевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Роль внешнемембранных везикул в секреции бактериолитических ферментов Lysobacter sp. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы