Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к циклодекстрин глюканотрансферазе

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к циклодекстрин глюканотрансферазе"

Г-ПЕ^

САНКТ-ПЕтеРБУРГСКИИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ ИНСТИТУТ

,05$

гх

На правах рукописи

АРБАТОВА Елена Николаевна ¿уз

и

МОНОКЛОН А АЬ НЫЕ АНТИТЕЛА К ЦИКЛОДЕКСТРИН ГЛЮКАНО'ГРАНСФЕРАЗЕ

03.00.23 -Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1992

Работа выполнена да ка{едре органической и биологической химии Таллинского технического университета.

Научный руководитель: доктор технических наук,

профессор КЕСТНЕР Адо Ильмарович

Официальные оппоненты: доктор биологических паук ЕЖОВ Николай Петрович кандидат биологических наук К™4 Аркадий / Павлович

Ведущая организация: Санкт-Петербургский Институт эпидемиологии и микробиологии ни. Пастера

Защита состоится 3 кгота 1993 г. в10 часов е 61 аудитории на саседании специализированного совета Д 063.25.OQ при Сапкт-Бетерб.ургскоы технологическом институте.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Замечания и отзывы по работе, заверенные гербовой печатью в одном экземпляре, просим направлять по адресу: 196013, Санкт-Петербург, Загородный пр., 49, Санкт-Петербургский технологический институт, Ученый совет.

Автореферат разослан 3. с'Л 1993 г. •

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ -> специализированного совета, кандидат технических наук Т.Б. Ансицкая

ОБТдАЯ ХАРАГГЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Исследование даклодекстрнн глюканотранс?еразы (ЦГТгзы) л получение к ней монохлоиальных антител является заяной к актуальной гадачей. Изучению ЦГТаз посвяпеяо множество работ, число публикаций по этой теме постоянно растет. ЦГТаза является ферментом микробного происхождения с уникальной способностью к синтезу дяклодекстрипоз СЦЛ) -углеводных макроднклнческих соединений - аз крахмала. 2Д образуют комплексы зълтэчешш с различными молекулами, причем при включении з полость Т}Д другого вэдества свойства последнего могут заметно изменяться. Хотя немало веществ мозет образовывать подобные соединения вклкченпя в кристаллическом состоянии , особенность инклюзионньгх соединений НД заключается в том, что они устойчивы з растворе.

Способность ХТД к комплексообргзсвгаию к безвредность для чэлсгс-ческсго организма обусловили возможность их широкого применения для улучшения сгейств пидевых продуктов и лекарственных препаратоз , з косметике, химической промышленности, для моделирования разнообразных биохимических явлений. С§эра их применения раслирнется с каждым годом.

Удалось установить целый ряд микроорганизмов -продуцентов ЦГТаз, изучить условия их культивирования, определить некоторые »ерменгатив;ше свойства этик 5&рментов. Недавно были установлены аминокислотные последовательности ЦГТаз нескольких микроорганизмов и трехмерная структура двух ЦГТаз. Однако з области исследования этой группы {эрментов остается множество нерешенных вопросов. До сих пор в литературе отсутствуют данные о антигенных свойствах ЦГТаз. Молекулярно-кммунологпческие исследования с ними не проводились. Установление антигенной структуры ЦГТазы дает возможность полнее изучить взаимосвязь между структурой

белка и его $упкпияьш. Наличие точных м?годов детектирования малых количеств фермента позволяет определить ЦГТазу в сложных смесях, а также в $ерментатнвно неактивном состоянии.

Изучение диклодекстринов и циклоде:-: стонн глкканотранс$ераз являлось одним из важных направлений работ кафедры органической и биологической химии ТТУ. Исследования были связаны с выполнением работы РС-бОбО/1 и PC-6012, которые входили в программу ГКНТ 0.74.05.

Ноль н ьадачи зсследочания.- Трелью настоящей работы является разработка з^ог.тивннх методов очистки фермента из культуральной жидкости бактерии Bacillus mzcerans, получение антител Е нему, изучение антигенных свойств ЦГТазы Bacillus macerans, сравнение антигенных свойств ЭДГТаз различны?; микроорганизмов» разработка методики определения малых количеств IjrTaa, а также иммунобнотехкилогЕческого метода получения диклодекстриков. В конкретные садачк работы входят:

1. Выделить дгтазу из культуральной жидкости Bacillus macorans. '

2. Получить гнбркдомные линии клеток , сегрегирующие . моноклонгльные антитела (МХА) к £ГТазе Bacillus macorans, а такжэ получить поликлональные антитела к этому {ермент у.

3- Ргзработать чувствительную иммуко^ермектную методдку для определения малых количеств ЦГТазы Badlius macerans.

4. Используя полученные Ша, изучит*, антигенную структуру дгтазы Badlius тгссг&пь Установить, к каким эпитопам получены МКА.

5,. Определить специфичность полученных антител к ЦГТазам, продуцируемым различными микроорганизмами. 6. Разработать метод иммунобяотехнологического получения укклодекстрияов при помощи ЦГТазы, иммобилизованной на иммуносорбенте.

Научнар новизна и практическая значимость работа. Разработана эмэктивная методика выделения ЦГТазы из

культуральной жидкости Bacillus macerc.ns. Фермент очищен до гомогенного состояния по данным электрофореза в полиакрил амидном геле.

Предложен новый экспресс-метсд определения активности ЦГТазы, позволяющий бистро определить активность фермента d минимальных объемах проб.

Впервые получены мэнохлональные антитела к этому $ерменту, которые являются также первыми МКА к ЦГТазам. Проведено изучение иммунологических свойств фермента, дана характеристика полученных антител. Установлено, что антитела узнают как катиону то, так и денатурированную ЦГТазу Bacillus macerans Наиболее детально' изучен« МКА 5В1, они получены из асцитной жидкости в препаративных количествах. Определена локализация эпитопа, узнаваемого МКА 5В1, на молекуле ЦГТазы Bacillus macerans.

разработан обладающий высокой чувствительностью иммуно$ерменткый метод детектирования малых количеств ЦГТазы (чувствительность 10 нг/мл). Изучено взаимодействие поли- и моноклональных антител с ЦГТаоамч Bacillus macerans , Bacillus circularise Klebsiella pneumoniae.

Показана принципиальная возможность получения циклодекстринов с помощью иммобилизованной на В г С N-агарозе ЦГТазы Bacillus macorans.

ЦГТаза является ферментом большой промышленной значимости. Исследованиям структурно-^ункдионалышх свойств ЦГТаз посвящены десятки работ в год. Иммунологическая характеристика §ермента поможет глубже понимать его структуру. Разработанный микрометод определения ферментативной активности ЦГТаз поззоляет массовый экспресс-анализ, что может быть применено для нахождения новых штаммов - продуцентов ЦГТаз. Полученные моно- и поликлональные антитела могут быть применены для детекции ЦГТаз в разных образцах (поликлональные антитела уже использовались в группе доктора Алана Шульыгна в Институте Биотехнологии Университета Хельсинки для определения ЦГТазы в

трансгенных растениях). Предлагаемый в работе микрометод для определения ЦГТаоной активности целесообразна использовать в академических я отраслевых научно-исследовательских организация д. занимающихся проблемами биотехнологии.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторства с Резбен МЗ. Автор выражает благодарность за помоць при иммунизации животных е при получении гибридом кх! л.Халли1Я" Т.. Аллккметс Э. к Самюэль К., за ценные совета при проведения иммунологических исследований к.бл. Яргекюлг А., сехвенировании пептндоз Поога М.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на VII биохимической коЕ$еренцш1 Прибалтийских республик "Теоретические и прикладные аспекты современной биохимии, молекулярной биологии к биотехнологии" (Каунас. 1990), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная знзимология" (получение к применение биокатализатороз в народном хозяйстве и медицине) (Москва, 1991). И Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991). BÍ03ALT ,92 83 td Event of Üia -Europasn Federation of Biotechnology (Таллинн, 1992). а также на семинарах кафедры органической и биологической химии Таллинского технического университета в Института химической в биологической {изихк Академии Наук Эстонки.

исследований опубликованы в б печатных работая.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на I стр. машинописного тексте, включает 4 таблицы в 21 рисунок. Работа состоит вэ введения, обзора литературы, экспериментальной часта, результатов в их обсуждения, а также выводов н списка цитируемой литературы (138 источников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение ЦГТааы из культуральной жидкости Bacillus

macerans, ЦГТазу виделяли из культуралыюй жидкости BacHtus macorans штамм ВКМВ 30С>. Культуру микроорганизмов выращивали в питательной среде, содержащей I5& натертого картофеля в водопроводной воде и мел для поддержания рН. Из ¡0 л культуральиой жидкости выделяли в среднем 2 мг чистого препарата ЦГТазы, Очистка состояла из 4 стадий: осаждение сульфатом аммония (701? от насыщения), ионообменная хроматография на ДЭ АЗ целлюлоз*. гель-{ильтргт]ид на со$гдексе G-:00 к FPUC (быстрая жидкостная хроматография белков). Чистоту препарата на каждой отдельной стадии очистки контролировали при помощи электрофореза а полнаяриламндтом теле в присутствии дод(?зилсуль}ата натрия (Рис.1), В результате проведенной нами очистки препарат оказался

гомогенным по дашшм элехтро^уреза п соответствовал белку с относительной молекулярной массой 74000, что согласовалось с литературными данными по ЭДГТаое РасШи$ macerar,s. Удельная активность очищенного фермента составляла 70,0 мхмоль/мин на 1 мг белка (50 мМ Ма-■ $ос$атного бу$ера, рН 7,5, 37 о, 1;з расворимого субстрата).

Определение активности НГТаом. Активность ЦГТазц определяли при помощи разработанного нами микрометода на основе известного метода, основанного на детектировании комплекса фенолфталеина с цщслодекстринами, Исследуемый раствор помещали в лунки иммунологических ИЛДТ Titertek, добавляли рабочий реактив фенолфталеина и через несколько минут измеряли оптическую плотность на автоматическом фотометре. Таким образом удалось значительно сократить время анализа проб, микрометод менее трудоемок, отличается большой точностью, высокой воспроизводимостью результатов, дает возможность определить большое количество проб. Количество образующихся уикдодокстринов определяли по калибровочной кривой, построенной по ряду разбавленийjS-цД (концентрация от 5 мкМ до 5 мМ ЦД в п^обе).

Иммунизации ;кивотних, Для получения антител к Щ'Таее мышам линии BALB/c вводили 50 мкг очищенного препарата

пш —94 К

«¡Ш —67К

fe ?'> f| ~43К

I i

шлея* —'

вал»—зок

.1

SlÖj-2CK

Рисунок 1. Электрофорвграмма очищенного препарата ЦГТааы и культуральной жидкости Bacillus maceransB ПААГ в присутствии DS- Na: 1-культуральная жидкость Bacillus macerans (40 мкл), 2-то же (10 мкл), 3-очищенный препарат ЦГТазы (2мкг), 4-стандарти фирмы " Pharmacia"

ЦГТазы, смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда внутрибрюшкнио. Через 3 недели проводили повторную инъекцию введением 25 мкг антигена с полным адъювантом Фрейнда. Затем спустя 4 недели проводили' последнюю иммунизацию введением 50 мкг антигена. После удаления селезенки у мышей собирали кровь, содержащую поликлональные антитела. Кровь центрифугировали для осаждения эритроцитов и определяли ее титр при помощи непрямого метода иммуно$ерментного анализа. Титр полученной сыворотхи был 10*5 ■

Результаты гибридизации. Гибридомыг, синтезирующие антитела к ЦГТазе ВасШиэ тзсегал?. получали в результате слияния клеток миеломы РА1 с клетками селезенки иммунизированных мышей линии ВА1.В/С. Клетки выращивали при 37° в атмосфере углекислого газа.'рост гибридом наблюдался в 155 лунках иммунологических плат. Тестирование гибридом и их клоков проводили непрямым методом ИФА. Для 15 клонов был получен положительный ■результат в ИФА (табл.1).

Табл.1 Характеристика различных типов моиоклоналыгах антител.

Гибридома 5В1 1В2 5А1 ЗС4 5В4 11 вб

Титр антител 10"^ 10'^ 10'1 ю-1 10-3 Ю"2

6В2 4 03 1А4 6В5 вНЮ 5Е5 5Н2 6Н12 д 01

10"1 10 10-1 Ю-2 10"3 Ю"2 10*2 ю-З ю-З

Наилучшие показатели роста и высокие титры антител в г.ультуральной жидкости имели гибридомы 5В1, 4 03,1В2,5В4 и ашо (Рис. 2 ). Очевидно, эти клоны представляли интерес для

антител

-Рисунок 2 ■ Kjpusue титръ&анйя дох&здздшиэшх антител -к ^ЦГТа?е BscHlus maöerans, определяемие ширимый методам Ш>А. ©боаначезш!:

____ МКА

___ША SS4

____ 'ША «Щ

--- ША Ш

——_ ша дао

n

дальнейших исследований. Ланпие клони дважды субклонпровали методом лимктируюугг-: рэзпеденпй. Для Получения антител в больших количествах около 107 клеток клона 5В1 иньецировёлн янутрибрюиинно мышам линии OALB/c , предварительно обработанных пристаном. Через 6-12 суток собирали асцитгые жидкости (2,0 - 4.0 мл от мыши) .МКА из асцитной жидкости очистили нутом двухкратного ■осаждения пелизтиленгликолем. Очищенные Г/КА анализировали методом Электреjopec?, в полиакриламидном геле в присутствии додетдилсуль$г,та натрия. По данным электрофореза степень чистоты МКА составляла 90%. Полученные МХА исследовались непрямом методом ИФЛ при топдептрадии антигена 5 мкг/мл.Их татр бнл 10"^.

Определение подклассов .цококлонадътрях антител. 'Используя специальный комплект антител для определена подклассов иммуноглобулинов дпрмы " Caibiociicm" установили, 'гто удтятела 5В1 и 4 D3 относятся к !gG1, а антитела 5В4 и 1Б2 к IgM подклассу.

количеств ДГГачт-т.. Одной из ¡целей .данной работы являлась разработка точного н падежного метода определения малая количеств Tjnrasii, основанного на тшуко^ермеютом анализе. Kay известно из лнтературл., молекула зргтазы Baciüas лтасегаязлредставляет -с&боЯ длмер„ поэтому должно Йять эоаможвкм датеэпгарешгть этот fер.мелт .методом "сандвич* ®А, используя одно и то же МКА xzz. в качестве ■copGeirra, тазе л в качестве хонъгогата. д еРсплгг елтд! о, •"санивяч'-мстодом ЙФА с лташ-енешкм МКА 5В1 'шю .детектировать IJTTasy Счузствиг-ельиогп. метода 1 мхг/мл). Лоложятелъпий результат в '"сгыдвзчг-методе Ш"А дакэзиаает, та дативная мол^хухз действ ительно обладает двумя ©яотахозтмд зеттепам Так как чувствительность этот о метода отаталась не ©чааа> высокой., то,, до-андимому,, зпятодн в дамере блюто раак>л©яс«зщ друг ж другу я есть яростргиственные яревятсгвня ups "их ояныу«и«пгчм узтаватши двута аяяпгеламя, В ¡целяя: разработки метода, л-шв-аляетц-его детектировать

меньшие количества фермента, мы применили непрямой метод ИФА, используя в качестве сорбента мышиные поликлональные антитела к ЦГТасе Bacillus maceraos;этим методом фермент можно было детектировать в концентрации 10 нг/мл. Однако верхний предел определения не очень высок (около 100 нг/мл).

выяснения вопроса распознают ли синтезируемые четырьмя имеющими наиболее высокие титры МКА одинаковые или различные эпитопы на молекуле цГТазы, был. проведен ряд &кспериментоЕ. Методом иммуноблотинга установлено, что клоны 5В1 и 4D3 хорошо взаимодействуют с денатурированной ЦГТазой в отличие от клонов 132 и 5В4 (Рис.3 )• Следовательно, МКА 5В' и 4D3, в отличие от антител 1В2 и 554, узнают секвенциальные эпнтопы. Метод иммуноблотинга с МКА 5В1 обладает отличной чувствительностью, таким методом можно детектировать менее 10 нг чистого фермента.

Для более детальной локализации в молекуле ЦГТазы эпитопов, против которых были получены антитела, провели химическое расщепление фермента с помощью BrCN . ЦГТаза Bacillus macorans расщепляется BrCN на 12 фрагментов . Полученные BrCN-фрагменты разделяли методом электрофореза в полйакрнламидном геле, используя методику ' / Giulian к Graham для разделения полипептидов с низкой

молекулярной массой. В результате расщепления BrCN и последовательного иммуноблотинга фрагментов было установлено, что МКА 5В1 взаимодействуют с BrCN-Фрагментом ЦГТазы, имеющим молекулярную массу около 14 ООО. BrCN-' фрагмент ЦГТазы, с к : торым взаимодействовали МКА 5В1, был секвенирован методом деградации по Эдману с помощью газофазного сехвенатора Applied Biosysterns 477А. Анализ его аминокислотной последовательности убедительно показал, что МКА 5В1 взаимодекствовали с С-концевым BrCN-Фрагментом ЦГТазу Bacillus macerans (от Туг-627 до Asn-687), имеющего молекулярную массу 6 659. Несоответствие этой молекулярной массы сданными, полученными с помощью электрофореза, можно объяснить тем , что при электрофорезе Пептид находился в димериой форме (как известно,

г

i-

/ i||

Y l 3 4S

/ i.. -€

Laweäi *

j-?<

iV

•Via

■

fj

-'И

-.-"ч'рЯ?

■ч 1 {"t/ . ■ <i 'им

„ -J ^-i.v'

Рисунок Т. Детектирование дгТааы Bacillus macerans антителами методом иммуноблотинга : 6-9 2 мкг ЦГТааы, 2 -1 мкг цГТазц, 3 - 0,1 мкг ЦГТазы, 4 .- хультуральная жидкость Bacillus macerans (10 мкл), 5 - то же (40 мкл), 1-5 - МКА 5В1, 6 - МКА 4D3, 7 - мышиная'полисызоротха, б -МКА 1В2,9 - МКА 5В4

гидро}ооные пептиды иногда остаются в димерной $орме даже с денатурирующих условиях).

Специфичность поу/ч^чных антчтел. Поскольку ЦГТазы различных микроорганизмов гомологичны между собой, было изучено взаимодействие поли- и монохлова'лышх антител с ЦГТазами, продуцируемыми; различными микроорганизмами. ЦГТаеа Bacillus circuia:ts var. alkatophilis была любезно предоставлена ТИорпе-лз я ММакела (Финляндия), IJfTasa Klebsiella pneumoniae - XJSeндер (Германия). ЦГТазы различных микроорганизмов гомологичны между собой, поэтому закономерным результатом явилось взаимодействие ноликлочальных антител к ЦГГазс Bacillus macsransне другими изученными ЭДГТазами. Однако титр полксывороткн, полученной к ЦГТазе Bacillus macerans, для §ермекта Bacillus circulans примерно в 10 рас ниже (Рис. 4). Следовательно, около <30% антител в полисыворотке видоспеци£.ични. Методом иммуноблотинга установили, что МКА 5В1 хорошо азаимодействовали с нативной к денатурированной ЦГТазой Klebsiella pneumoniae, но не yoiiauaAi: фермент Bacillus circulans. Таким образом, у TjFTaa Bacillus-macerans и Klebsiella pneumoniae, в отличие от • ЦГТазы Bacillus circulans, имеется общий эпитоп..

Влияние ант^тед на ферментативную активность 1|ГТззы. Лля изучения ингибировашя ферментативной активности уГТазы Bacillus macerans антителами последовательные разведения ПКА и МКА инкубировали с раствором ЦГТазы в. течение 1 ч. Затем добавляли субстрат и проводили ферментативную реакцию. Через определенное время отбирали аликвоты для тестирования. Связывание МКА 5В1 с ЦГТаоой Bacillus macerans приводило к пнгибированию {орментативиой активности примерно на 405S, в то Еремя как ПКА яигибировали ее практически полностью(Рис. 5). На основе этих данных можно.сделать заключение, что МКА 5В1 получены не против активного центра фермента.

Иммунобиотехнологический метод получения цирлодекстринов. Поскольку МКА 5В1 взаимодействуют не с

Рисунок 4. Сравнение иммуиореахтнвности ЦГТааы Bacillus macerans (1) и Bacillus circutans (2 ) в • непрямом ИФА метод» {в лумках сорбировали 5 мсг/мл соответствующих антигенов). Использовали мышиную полпсыворотку. полученную к ЦГТазе Bacillus macerans. Субстрат - орто|енилендиамнн*

активным центром фермента, существует возможность использования их для иммобилизации ЩГТазы на твердый носитель и получс-ния тгхчм путем уиклодекстринов. МКА 5В1 были ковалеятно пришита к BrCN-агарозе. 1 мл полученного иммуиосорбента содержал около 1 мг МКА 5В1-Иммобилизованная на этом нммуносорбенте ЦГТаза оставалась активной (она сохраняла около 20% от своей активности в растгоре). Причиной уменьшения активности, вероятно, ячляется то, что скорость работы осязанного с антителом < $ермента меньше, чем свободной ЦГТазы. Возможно также, что доступ субстрата (растворимого крахмала) к ферменту внутри гранул агарозы несколько затруднен. При пропускании раствора крахмала через колонку снизу ьверх со скоростью 20 мл/ч с колонки выходил раствор крахмала вместе с уиклодекстринами. Конверсия крахмала в 1]Д составляла ЗОЙ при условиях проведения эксперимента (0,5л крахмала, 50 мМ фосфатного буфера. pH 7,5, комнатная температура). Иммобилизованный фермент не смывался с колонки буфером Сен субстрата. Однако но .дере пропускания через колонку растворенного в 50 мМ фосфатном буфере 0,5% крахмала Происходит постепенное ы,шыванце ЦГТазы. После -пропускания субстрата в 30 объемах колонки со скоростью 2 мл/мин на колонке остается только 50Ж связанного с носителем фермента (Рис. 6). Вероятно, при вхождении субстрате в активный центр молекулы ЦГТазы происходят лонформацисшше изменения, ухудшающие связывание фермента с антителом..

ВЫВОДЫ:

1. Из культургльной жидкости бактерий Bacillus macerans штамм ВКМБ 506 выделена и очищена цнклодекстрнн глюканотрансфераза (цГТааа) с удельной активностью 70 мкмоль/мни на l мг белка. Очищенный фермент был злектрофоретически гомогенен и соответствовал белку с молекулярной массой 74 000.

2. Аминокислотная последовательность двадцати пяти N-хонцевых остатков выделенного фермента совпадала с N-

Рисунок 5. Ингибировакие ферментативной активности ЦГТ-азц ПКА (« ) и МКА 5В1 (о ).

СТ-Г-Г, |*ин

Рисунок б . Уменьшение концеитргцшг дтслодзкстрпнов, продуцируемых иммобилизованной на иммуяосообвяте ЦГТ-азоЙ при пропускании через колонку раствора крахмала,

концом ЦГТаэы Bacillus macerans штамм IAM 1243. иосл едовательность которой была опубликована в печати, что доказывает высокую гомологию аминокислотных последовательностей ферментов из разных итаммов.

3. Разработан ыккрометод для определения f ерыентативной активности ЦГТазы, проводимый на иммунологических платах, на основе известного метода, основанного на детектировании комплекса фенолфталеина с циклодекстринами. Преимущества разработанного микрометода: высокая чувствительность, точность, возможность массового анализа проб.

4. Впервые получены специфические моноклоналыше антитела к ЦГТазе Bacillus macerans, которые являются первыми антителами к ЦГТазам.

5. Разработан метод иммунологического определения малых количеств ЛГГазы, основанный на иымуно^ерментнсм анализе. Метод обладает высокой чувствительностью U0 нг'м/v] п специфичностью.

6. Наиболее детально изу -¡ены МКА 5В1, которые реагируют как с нативной, так и с денатурированной {ормами ЦГТгзгц, т.е. данные МКА узнают линейный зпнтоп на ыолекул.е {ермепта. МКА 5В1 были получены в препаративных количествах, определен подкласс антител. Установлено, что МКА 5В1 взаимодействуют с С-копцевой частью f ерыента (627-657 аминокислотные остатки).

7. Полученные МКА использована для изучения гомологии ферментов, продуцируемых Bacillus macerans, BacilHus circulans и Klebsiella pneumoniae. Установлено, что два первых фермента обладают 10S гомологией. МКА 5В1 к НГТазе Bacillus macerans хорошо, взаимодействуют с ЦГТазой Klebsiella pneumoniae, однако не узнают натнвную и денатурированную цГ Тазу Bacillus circulans. Это доказывает наличие у ферментов Bacillus macerans и Klebsiella pneumoniae общего линейного впитопа, который отсутствует в молекуле ЦГТаэы Bacillus circulans.

6. Разработан н апробирован прототип проточной системы с иммобилизованной при помощи МКА 5В1 на твердый носитель

ЦПазоп. При использовании указанной системы конверсия крахмала в циклодекстршш составляла ЗОЯ.

Синеок работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Арбатова E.H., Реэбен М.В., Кестнер А.И. Моноклональнйд антитела к циклодекстрин глюканотранс$еразе Bacillus macerans//T&3. дскл. VII биохимической конференции Прибалтийских республик "Теоретические и прикладные аспекты современной биохимии, молекулярной биологии и биотехнология", 26-26 сентября 1990 г. - Каунас,1990.- CÍO.

2. Арбатова ЕЛ., Халлинг Т.А., Реэбен М.В. Получение моноклональных антител к циклодекстрин глюканотранс$еразе Вас. macerans//Tp. Таллинск. политехи, ин-та. - 1990. - N 715. - С.49-57.

3. Арбатова E.H., Кестнер А.И., Реэбен MJ3. Моноклоналышд антитела к цнклодекстрин глюкапотранс}ераэе Bacillus macerans//T<3<¡. докл. VII Всесоюзного симпозиума "Инженерная энзимологня" (получение и применение биокаталпзаторов в народном хозяйств« и медицине), 6-12 апреля 1991 г. -Москва, 1991.-С169.

4. Arbatova Y.N., Reebon М., Kestner A. Mo-.ocíonal antibodiss to ciclodaxtrin -glyoosyltransforaso of, Bacillus rnacorans// Russíárt Biochemistry & Biotechnology. - 1991.- V.1 - N 2/3. - P.10S, ^

5. Арбатова ЕЯ., Реэбен MJB., Кестнер А.И. Мсяоклоналышэ антитела к циклодекстрин глюканотраяс&ераае ВасШиз

- mäcerans//Teo. докл. И Всесоюзного Симпогиума "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологин", 22-2бсентября 1991 г . - Самарканд, 1991. - С1Л/

6. Арбатова E.H., Реэбен М.В. Изучение иммобилизованной при помощи моноклональных антител циклодекстрин глюкаиотрайсфераоы (дгтазы) Bacillus märrraris. Микрометод для определения ЦГТавной активности//Тр. Таллинск. техн. ун-та. - 1991. - N 727. - C.40-4«.

7. Арбатова E.H., Реэбен М.В., Кестнер А.И. Моноклональных антитела к циклодекстрин глюк аяотрапс$ераэе Bacillus tnacerans//Биохимия. - 1991. - Т.50,вып.11. -С.2069-2076.

Arbatova Y., Reeben M., Koslner A. Monoclonal antibodies agains cyclodextrin glycosyltransferase//Biochemistry - USSR (engl. transl.). - 1991. - V.56, issue 11. - P.1463-1468. 8, Arbatova Y., Rcebon M. Immunological properties of the Bacillus macerans cyclodexfrin glycosyltransferase and immobilization of the enzyme// BIOBALT'92. 83rd Event of the Europaen Federation of Biotechnology. - 1992. - (in press).

re03.93r. 3aK.20-.IG0 PTH ¡IK GHHTE3

/

UockoeoksS np.36