Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика взаимодействия моноклональных антител с различными олигомерными формами D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика взаимодействия моноклональных антител с различными олигомерными формами D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ _им. М. В. ЛОМОНОСОВА р Г К и Л

Биологический факультет ^ ^ MAR *.000

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

УДК 577.152Л21

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МОНОКЛОНЛЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С РАЗЛИЧНЫМИ ОЛИГОМЕРНЫМИ ФОРМАМИ D-ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2000

Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского Государственного Университета.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В. И Муронец

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н. Б. Ливанова

кандидат биологических наук, ст. науч. сотр. И. Д. Гроздова

Ведущая организация: Российский университет Дружбы народов

Защита состоится 24 апреля 2000 г. в 1530 часов на заседании Специализированного совета Д. 053.05.32 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 2000 г.

Ученый секретарь диссерта-

ционного совета, кандидат биологических наук

М. В. Медведева

Характеристика работы

Актуальность проблемы. D-глицеральдегид-З-фосфат-дегидрогеназа (ГАФД) на протяжении многих лет является объектом интенсивного изучения. Этот фермент катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата в 1,3-дифосфоглицерат с образованием NADH. Для ГАФД из различных источников известна первичная аминокислотная последовательность, для многих имеются данные рент-геноструктурного анализа. Все эти белки характеризуются высокой степенью гомологии и сходством четвертичной структуры. Фермент представляет собой тетрамер из 4-х химически идентичных субъединиц. Каталитический механизм реакции и структура фермента подробно охарактеризованы в многочисленных работах [Harris and Waters, 1976].

Вместе с тем, за последнее десятилетие появилось много данных о том, что роль ГАФД в клетке не ограничивается участием в гликолизе. Оказалось, что фермент играет существенную роль в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации ДНК, обладает фосфотрансферазной активностью. Имеются данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний и вирусных инфекций, а также непосредственно участвует в апоптозе. Кроме того, фермент является мишенью для воздействия клеточных окислителей: N0 и перекиси водорода. Эти важные биологические функции ГАФД в значительной степени определяются особенностями внутриклеточной локализации и олигомерной структуры фермента in vivo [Sirover, 1999]. Поэтому, для исследователя представляется очень важной возможность получения "инструмента", который мог бы различать олигомерные состояния ГАФД как in vitro, так и in vivo. Таким "инструментом" могут быть моноклональные антитела, специфичные к определенной форме белка.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось получение моноклональных антител, специфичных к ненативным формам ГАФД, характеристика их взаимодействия с различными олигомерными фор-

* Список сокращений: БСА - бычий сывороточный альбумин; ГАФД - D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа; ГАФДк - D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из мышц кролика; ГАФДц51 -D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа из Bacillus stearothermo-philus\ ДСН - додецилсульфат натрия; 3-ФГА - D-глицеральдегид-3 -фосфат ФМСФ - фенилметансульфонилфторид; ELISA - твердофазный иммуноферментый анализ, Ig - иммуноглобулины; mAbs -моноклональные антитела.

мами антигена, изучение влияния на ферментативную активность, а также получение данных о свойствах антигенной детерминанты, взаимодействующей с антителами.

Научная новизна работы. После иммунизации мышей препаратом нативной ГАФДк были получены два клона антител (mAbs 6С5 и mAbs 6G7), специфичных к ненативым формам ГАФДк- С помощью методов иммуноферментного анализа, гель-фильтрации, иммобилизации одного из партнеров реакции показано, что полученные антитела взаимодействуют с димсрами, мономерами и денатурированными формами ГАФД из мышц кролика, но не с нативными тетрамерами антигена. Впервые для выявления специфичности mAbs использован метод иммобилизации на сефарозе различных форм антигена. Установлено, что взаимодействие с антителами не влияет на ферментативную активность ГАФДк, но блокирует ее спонтанную ренатурацию. Иммобилизованные антитела mAbs 6G7 использованы для очистки препаратов ГАФДк от денатурированных примесей. Обнаружено перекрестное взаимодействие антител клона 6С5 с денатурированными молекулами ГАФДв51^ В то же время, в отличие от реакции с исходным антигеном, антитела не связываются не только с тетрамерами, но и с димерами й мономерами ГАФДд.,,. На основании полученных данных сделаны предположения о структуре и локализации антигенной детерминанты в молекуле ГАФД, взаимодействующей с антителами клона 6С5.

Практическое значение работы состоит в том, что полученные моноклональные антитела могут быть использованы для изучения олигомериого состояния ГАФД в процессе осуществления этим ферментом различных биологических функций. Кроме того, существенную практическую значимость имеют предложенные методы очистки препаратов фермента от денатурированных примесей, а также использования иммобилизованных олигомерных форм белков для выявления специфичности антител к различным состояниям антигена.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ, а также на Втором съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997 г.), на международной конференции "Biocatalysis-98. Fundamental and Applications" (Пущино-на-Оке, 1998 г), и на международном симпозиуме "Protein structure, stability and folding. Fundamental and Medical Aspects" (Москва, 1998).

Публикаиин. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов иссле-

дования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет¿§2страниц печатного текста, включая б_ таблиц и 22_ рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глицеральдегид-З-фосфатдсгидрогеназу из мышц кролика выделяли по методу Хилла [Hill et ai, 1975], глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из Bacillus stearothermophilus по методу Булатникова и соавторов [Bulatmkov et al., 1998]. Мутаптные формы этого белка были предоставлена профессором Г. Бранло (G. Branlant) из университета г. Нанси (Франция). Получение моноклональных антител по методу Кёлера и Мильштейна [Koler and Milstein, 1976], проводили совместно с сотрудником Московского института медицинской экологии А. Г. Катрухой. Изотипы антител определяли с использованием Mouse Hybridoma Subisotyping Kit (Calbiochem).

Определение концентрации белка. Концентрации растворимых белков определяли методом Бредфорд [Bradford, 1976], а также спек-трофотометрически при X - 280 нм. Молекулярные массы белков составляют: тетрамер ГАФД 144 кДа (субъединица 36 кДа), mAbs 6С5 (IgG) 150 кДа, mAbs 6G7 (IgM) 950 кДа.

Концентрации иммобилизованных белков определяли по модифицированному методу Бредфорд [Asryants et al., 1985].

Определение активности ГАФД. Активность растворимой ГАФД измеряли по увеличению поглощения NADH при X = 340 нм в реакционной среде pH 9,0 в случае ГАФД« и pH 10,0 для ГАФДВй, содержащей 50 мМ глицин, 100 мМ КН2Р04, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ 3-ФГА и 0,5 мМ NAD. Реакцию начинали внесением белка в реакционную среду.

Активность иммобилизованных ферментов определяли аналогично, но используя более высокие концентрации субстрата и кофер-мента: 2 мМ 3-ФГА и 2 мМ NAD. Реакцию начинали внесением 3-ФГА.

Твердофазный шшуноферментный анализ (ELISA). Взаимодействие антител с сорбированным антигеном оценивали в классической процедуре непрямого иммуноферментного анализа [Barh et al., 1980]. Коньюгат видоспецифических антимышинных антител с пероксида-зой использовали в разведении 1:500. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин.

Взаимодействие антител с антигеном в растворе изучали по модифицированному методу ELISA [Friguet et al, 1985]. Моноклональ-

ные антитела (в постоянной концентрации) инкубировали в растворе с антигеном в уменьшающихся разведениях. После достижения равновесия переносили раствор на сорбирующий микропланшет и в классической непрямой ELISA определяли пропорцию свободных антител, оставшихся в растворе

Илшобшизаиия белков. Иммобилизацию ГАФД проводили по методике Чередниковой и сотр. [Cherednikova et al, 1980]. При иммобилизации ГАФД за одну субъединицу использовалась степень активации сефарозы 3 - 5 мг BrCN, а за две субъединицы - 30 мг BrCN на мл влажного геля. Иммобилизованные димеры и мономеры ГАФД получали по методу Дуженковой [Douzenkova et al., 1986]. Иммобилизацию моноклональных антител за Fe фрагменты проводили по методике Чередниковой [Cherednikova ei al., 1981] при степени активации сефарозы 50 мг BrCN на мл влажного геля

Электрофорез в попиакршамидном геле. ДСН-электрофорез в 12,5% полиакриламидном геле проводили в по методике Лэмли [Laemmli, 1970].

Экстракты клеток Е. coli, готовили, суспендируя биомассы клеток в Tris-HCl буфере (pH 7,5), содержащем 2 мМ. ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,5 мМ ФМСФ (1г биом'ассы/2 мл буфера), с последующей обработкой клеток лизоцимом, ДНКазой I и ультразвуком. Белки в клеточном гомогенате концентрировали сульфатом аммония, центрифугировали, чтобы освободиться от обломков клеток, и супернатант обессоливали на колонке с Сефадексом G-50.

Качественное определение А ТР-азной активности проводили с меченным радиоактивным изотопом [у-32Р] ATP [Kalinina, et al., 1996].

Полное карбоксиметширование ГАФДи проводили по методике Воспельниковой [Воспельниковаи др., 1977].

Седиментационный аначиз проводили на аналитической ультрацентрифуге Beckman Spinko Е с использованием фотоэлектрической сканирующей приставки.

Компьютерный анализ проводили совместно с сотрудником хим. факультета МГУ И. Торшиным. В работе мы пользовались следующими базами данных: аминокислотные последовательности белков - SWISSPROT [Bairoch and Apweiler, 1999]; структуры ГАФДВз1 и ГАФД из мышц омара - PDB [Bernstein et al, 1977], доменная организация ГАФД - 3DEE [Asim et al., 1999]. Для анализа нековалентяых взаимодействий в белках использовали программу INTIG. При поиске одинаковых блоков в полипептидных последовательностях, а также при совмещении элементов последовательностей использовались программы MACAW [Schuler et а!., 1991] и CLUSTAL [Thompson et al, 1994].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и отбор мопоклональных антител, специфичных к нена-тивным формам ГАФДк На первом этапе работы мы должны были получить монокло-нальные антитела и отобрать те клоны, которые проявляют специфичность к ненативным формам антигена. Иммунизацию мышей проводили нативной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой, выделенной из скелетных мышц кролика, предполагая, что часть вырабатываемых в ходе иммунного ответа антител будет специфична к негативной структуре антигена. Для отбора клонов гибридом использовали классическую процедуру непрямой ELISA. Известно, что в условиях, используемых при сорбции на полистироловом микропланшете (низкие концентрации белка, отсутствие кофермента, промывание буфером, содержащим Тритон Х-100), ГАФДК диссоциирует на димеры и мономеры. Поэтому мы предположили, что взаимодействовать с сорбированным антигеном будут антитела, специфичные к ненативным формам, и отобрали два клона, проявившие высокое сродство: mAbs 6С5 - 4,2 х 10"'° М и mAbs 6G7 - 1,5 х 10"'° М. Было установлено, что антитела mAbs 6С5 относятся к классу IgGl (150 кДа), антитела mAbs 6G7 - к классу IgM (950 кДа).

Далее мы проверили, взаимодействуют ли отобранные антитела с нативным антигеном растворе. Для этого использовати модифицированный метод ELISA, предложенный Фриже и соавторами [Friguet et al., 1985]. Метод основан на определении в иммуноферментном анализе концентрации свободных антител, остающихся после достижения равновесия в реакции антиген - антитело в растворе в серии разведений с постоянной концентрации антител и уменьшающейся концентрацией антигена. В случае взаимодействия антител с нативным растворенным антигеном ожидается обратная пропорциональная зависимость между измеряемой концентрацией антител и концентрацией антигена, использованного в разведениях. Однако, в нашем случае количество свободных антител обоего типа после 18-часовой инкубации с ГАФДк оставалось постоянным и равным исходному во всех лунках и не зависело от концентрации антигена. Таким образом, взаимодействие антител с нативным антигеном в растворе отсутствовало, что подтвердило наше предположение о том, что отобранные антитела специфичные к ненативному состоянию антигена.

2. Выделение комплекса антиген-антитело Тетрамерные молекулы ГАФДк в процессе сорбции на плашке могли перейти в любое из следующих состояний: тетрамер о димер мономер <-» частично развернутый мономер <-» денатурированный мономер. Эти же состояния проходит молекула фермента при разворачивании под влиянием денатурирующих агентов. Мы предположили, что в процессе инкубации антител с раствором антигена, находящегося в ненативном состоянии, произойдет взаимодействие с доступными формами антигена, которые потом можно будет выделить в виде комплекса при помощи гель-фильтрации

Известно, что при низкой температуре и в присутствии АТР и анионов СГ ГАФДк диссоциирует на димеры и мономеры [Constantinides and Deal, 1969]. Диссоциация сопровождается инактивацией фермента. Мы инкубировали ГАФДк (0,5 мг/мл) в присутствии 20 мМ АТР, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, рН 7,5 при 4 °С до уровня остаточной активности 30%, затем добавляли в среду mAbs 6С5 (конечная концентрация 0,45 мг/мл) и инкубировали еще 60 мин. в тех же условиях. 200 мкл из среды инкубации наносили на колонку с Супер-озой 12. Профиль элюции представлен на Рис. 1. Молекулярные массы, соответствующие пикам, были определены по калибровочному графику и составляли: пик 1-182 кДа; пик 2-130 кДа; пик 3-28 кДа.

D 280нм!

0.1 \

°-02} /Wn. , ---' . Wi i

Рис. 1. Профиль элюции, полученный при хроматографии на Суперозс 12.

ю 14 5Г

Был также проведен седиментационный анализ элюата. Результаты, а также данные из литературных источников, представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Данные седиментационного анализа

Экспериментальные данные Данные из литературы

Sjp.W Мол. масса по данным седиментации, (Да) SlO.w Мол. масса (Да)

mAbs6C5, 0,4 мг/мл 6,69 ± 0,05 145700 IgG 6,5 - 7,0* 150000

ГАФД, 0,5 мг/мл 7,11 ±0,20 160000 ГАФД, тетрамер 7,0-7,4** в зависимости от условий 144000

пик 1 7,40 ±0,30 178000 ГАФД, димер 4,4 72000

пик 2 7,00 ±0,30 156300 ГАФД, мономер 3,2 36000

На основании полученных данных мы предполагаем, что пик 1 соответствует комплексу антитело - неактивный мономер ГАФД. Молекулярный вес такого комплекса должен быть 186 кДа (150 кДа антитело + 36 к Да мономер), что соответствует данным FPLC — 182 кДа, и результатам седиментационного анализа (178 кДа). Однако, полученный результат не исключает возможности связывания антител и с другими формами антигена, например, с димерами фермента, которые мы могли не обнаружить в рассмотренном выше эксперименте. Для выявления форм фермента, способных связываться с выбранными клонами, был использован метод иммобилизации фермента на BrCN-активированной сефарозе-4В.

3. Взаимодействие антител с тшобипизованпыми олигомерными формами ГАФДк Иммобилизация ГАФД за одну субъединицу позволяет получить связанные с сефарозой~4В активные тетрамеры, димеры и мономеры фермента [Ashmarina et al, 1981; Дуженкова и др., 1986]. Были получены препараты: тетрамеры - 450 - 510 мкг белка/мл плотной сефаро-зы с удельной активностью 13-16 ед./мг (в различных препаратах); димеры, содержащие 48-55% белка на матрице по сравнению с тетра-мерами, и обладающие активностью 16 ед./мг; неактивные мономеры (содержание белка составляло 26-28% от исходного), которые инкубировали с антителами 6С5 и 6G7 в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащим 5 мМ ЭДГА и 1 мМ ДТТ в течение 40 мин. при комнатной температуре.

* Данные по [Уайт и др., 1981]

** Данные по [Constantinidies and Deal, 1970]

Таблица 2. Взаимодействие шАЬз с различными олигомерными формами ГАФДК

Олигомерная форма ГАФДк Количество ГАФДк, иммо-билиз. на сефарозе мкг/ мл упл. моль/ мл упл. сефарозы сефар. Количество антител, связанных с ГАФДк мкг/ мл упл. моль/ мл сефар. упл. сефар Соотношение тАЬя/ ГАФДк моль/ моль Удельная активность ГАФДк (ед./мг) До инкуба- После ции с тАЬв инкуб, с шАЬэ

А: Взаимодействие с тЛЬэ 6С5 150 кДа)

тетрамер димер мономер контрольн. сефароза 508±25 (100%) 3,5х10"9(а) 254±12 (50%) 3,5х10'9(6) 141+7(27,5%) -3,9x10"9 <в) 0 0 35±2 0,23x10"9 337±1б 2,25x10"9 146+7 0,97x10"9 20±3 0,13x10"9 (неспецифическое связывание) 0,07/1 0,61/1 0,28/1 13+1,5 11+1,5 16+1,8 16±1,8 0 0

Б: Взаимодействие с шАЬб 6в7 (^М; 950 кДа)

тетрамер димер мономер 450±23 (100%) 3,1хЮ"9(а) 248112 (55%) 3,4х10'9(б) 128±7 (28%) 3,6х10"9(в) 384118 0,40х10"9 398120 0,44x10"9 0,12 0,12 16+1,5 1611,5 20+2,5 20+2,5 0 0

"моль тетрамеров, 6моль димеров,в моль мономеров

Промывали носитель от неспецифически связавшегося белка тем же буфером. Затем определяли энзим атическую активность и количество антител, связавшихся с ферментом. В качестве контроля инкубировали антитела с сефарозой, не содержащей иммобилизованной ГАФДК (контрольная сефароза). В Таблице 2 представлены результаты этих экспериментов.

Видно, что антитела обоих клонов связываются и с активными иммобилизованными димерами, и с неактивными мономерами ГАФДк, но практически отсутствует взаимодействие антител с иммобилизованными тетрамерами. Из данных Таблицы 2 (А) следует, что молярное соотношение [mAbs 6С5]/ [димеры ГАФДк] равно 0,63, а соотношение [mAbs 6С5]/ [мономеры] равно 0,27. Следовательно, димеры связывают примерно в два раза больше молекул антител, чем мономеры. В то же время, соотношение антитело/мономер, наблюдаемое в данном эксперименте, меньше единицы. Мы предполагаем, что сниженное соотношение объясняется стерическими препятствиями, особенно выраженными в случае мономера, обусловленными иммобилизацией одного из партнеров реакции на сефарозе. В растворе, по-видимому, каждый мономер ГАФДк способен связаться с одной молекулой mAbs 6С5.

Сходные результаты были получены при инкубации препаратов ГАФДк с антителами клона 6G7 (Таблица 2 (Б)). В этом случае также наблюдалось взаимодействие антител с неактивными мономерами и активными димерами ГАФДк, и отсутствовало взаимодействие с на-тивным тетрамерным ферментом. Однако молярное соотношение по связыванию антител с антигеном было ниже, чем в предыдущем случае, и количество связавшихся антител 6G7 с димерами и с тетрамерами было равным. Мы предполагаем, что понижение молярного соотношения, также как и отсутствие количественной разницы при взаимодействии с димерами и с мономерами, объясняется тем, что большая молекула mAbs 6G7 (IgM, 950 кДа) при взаимодействии с иммобилизованным антигеном, особенно находящимся внутри гранул сефарозы, сталкивается с более значительными стерическими препятствиями, чем молекула mAbs 6С5 (IgG, 150 кДа).

Итак, антитела обоих клонов взаимодействовали с димерами и мономерами ГАФД, но не с нативными тетрамерами. Возникает вопрос, возможно ли взаимодействие этих антител с денатурированными молекулами антигена. Для решения этого вопроса, а также для подтверждения рассмотренных выше результатов, мы использовали подход, основанный на выявлении методом ДСН-электрофореза белков, связавшихся с иммобилизованным на сефарозе партнером реакции.

4. Анализ взаимодействия различных олигомерных форм антигена с mAbs 6С5 при помощи ДСН-электрофореза Подход основан на том, что суспензию иммобилизованных олигомерных форм антигена инкубируют с раствором антител, или, наоборот, иммобилизованные антитела - с раствором антигена. Затем сефарозу отмывают от неспецифически связанных белков, и промытую суспензию подвергают кипячению в буфере для образцов для ДСН-электрофореза. При этом в раствор полностью переходят белки, связавшиеся с сефарозой нековалентно в результате реакции антиген-антитело. Таким образом, на электрфореграмме можно обнаружить, какие белки были связаны с носителем.

Сначала мы исследовали взаимодействие иммобилизованных антител с раствором антигена.

Суспензию антител на носителе инкубировали с раствором ГАФДк различной степени нативности:

1. С нативным антигеном.

2. С ферментом, инактивированным в присутствии 0,15 М NaCl и 10 мМ АТР. В таком растворе могут присутствовать димеры, мономеры и развернутые мономеры антигена.

3. С ферментом, денатурированным в 8М мочевине. Активность фермента полностью утрачивалась и не восстанавливалась после отделения мочевины при гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-50. По-видимому, фермент после такого воздействия находится в частично денатурированном, частично агрегированном состоянии.

4. С полностью развернутым антигеном.

Чтобы получить препарат полностью развернутой ГАФДк, мы провели полное карбоксиметилирование остатков цистеина, входящих в структуру белка. Модификация происходит в присутствии 8 М мочевины, при этом происходит карбоксиметилирование всех 4-х SH-групп каждой из субъединиц фермента. В результате, после удаления мочевины и избытка реагента на колонке с Сефадексом G-50, молекулы белка остаются полностью развернутыми и не способны восстановить нативную конформацию.

Результаты этих экспериментов представлены на Рис. 2 А. На электрофореграмме антител видны две полосы, соответствующие легким (22 кДа) и тяжелым (52 кДа) цепям IgG (дорожка mAbs6C5). Далее (дорожка А: 1) показаны белки, оставшиеся на сефа-розе после инкубации иммобилизованных антител с нативной ГАФДк. Видны только полосы антител, что говорит об отсутствии взаимодействия mAbs 6С5 с тетрамерным антигеном.

кДа А 66 ;

45 'ДТ*

36 Щ . 29

• 4-Х

20 '¿jfe ^ 14 fi:

1 2 3 4 1 2

и 1 t

маркеры mAbs6C5 маркеры Рис. 2. Взаимодействие олигомсрпых форм ГАФДк с антителами

А: Взаимодействие иммобилизованных антител mAbs 6С5 с раствором ГАФДк: 1 - нативной; 2 - после холодовой инактивации с NaCl и АТР; 3 - денатурированной в 8 М мочевине; 4 - модифицированной йодацетамидом.

Б: взаимодействие иммобилизованного мономера ГАФДк с: 1 - раствором БСА; 2 - раствором mAbs 6С5

В случае инкубации антител с препаратами ненативной ГАФДк, полученной различными способами, на электрофореграмме появляется дополнительная полоска с молекулярной массой 36 кДа (А: дорожки 2, 3, 4), что подтверждает наличие взаимодействия. Существенно, что антитела связывают и полностью развернутые молекулы ГАФДк, полученные после модификации йодацетамидом всех БН-групп белка.

Кроме того, мы проанализировали с помощью ДСН-электрофореза результаты инкубации раствора тАЬэ 6С5 с препаратами иммобилизованных мономеров ГАФД. На дорожку Б: 1 был нанесен препарат иммобилизованного мономера после инкубации с БСА. При кипячении сефарозы с иммобилизованными белками в буфере для ДСН-электрофореза происходит частичное расщепление ко-валентных связей между ВгС№сефарозой и иммобилизованными на ней белками, которые в некотором количестве переходят в раствор. Поэтому на дорожке Б: 1 видна тонкая полоска 36 кДа, соответствующая мономеру ГАФД. Неспецифическое связывание БСА отсутствует. В результате инкубации иммобилизованного мономера с антителами появляются полосы легких и тяжелых цепей гпАЬб 6С5 (дорожка Б: 2), что подтверждает взаимодействие антител с мономером.

5. Влияние антител на активность ГАФДк Данные таблицы 2 (А, Б) свидетельствуют о том, что связывание моноклональных антител обоих клонов с активными иммобилизованными димерами антигена не влияет на его ферментативную активность. Далее мы проверили, оказывают ли влияние антитела на активность фермента в растворе. Для этого мы должны были создать в растворе условия для диссоциации ГАФДк, поскольку, как было установлено в предыдущих экспериментах, взаимодействие с тетрамерным антигеном отсутствует. Известно, что фермент в низких концентрациях и в отсутствие субстрата и кофермента диссоциирует на димеры и мономеры раешске еГ а!., 1968]. Кроме того, присутствие избытка антител, специфичных к димерной и мономерной форме антигена, способствует дальнейшему сдвигу равновесия.

ГАФДк (0,005 мг/мл) инкубировали при температуре 25 °С в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 1 мМ ДТТ и 5 мМ ЭДТА в присутствии антител шАЪб 6С5 (0,25 мг/мл), Контроль не содержал антител. Через определенные промежутки времени отбирали аликвоты из инкубационной среды в кювету и определяли в них энзи-матическую активность. Реакцию начинали одновременным добавлением ЫАБ и ФГА. Инкубация с антителами в течение 4-20 часов не привела к изменению активности фермента. Аналогичные результаты были получены с антителами 607.

6. Влияние антител на денатурацию ГАФДк в мочевине и на спонтанную ренатураиию фермента Поскольку изучаемые антитела взаимодействуют с ненативны-ми формами антигена, мы решили проверить, какое влияние они оказывают на процессы его денатурации и сворачивания.

Мы инкубировали фермент (0,5 мг/мл) в присутствии 5-кратного избытка шАЬб 6С5 в среде, содержащей 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5), 1 мМ ДТТ, 5 мМ ЭДТА 15 мин. при комнатной температуре. Затем добавили в среду раствор 8 М мочевины в том же буфере так, чтобы конечная концентрация мочевины была 3,5 М. Контроль содержал вместо антител БСА. За ходом денатурации следили по изменению активности в отбираемых пробах. На Рис. 3 видно, что добавление антител не влияет на скорость снижения ферментативной активности в мочевине. Однако нельзя исключить, что присутствие мочевины оказывает влияние связывание антител с антигеном. Рена-турацию фермента инициировали разведением в 50 раз полученного в предыдущем опыте раствора денатурированной ГАФДк. Как видно на Рис. 4, БСА (контроль) не влияет на этот процесс. Однако, если перед денатурацией в мочевине в среде присутствовали антитела, ренатура-ция полностью блокируется. Добавление в среду антител непосредст-

венно перед ренатурацией оказывает такой же эффект. Аналогичные результаты были получены и с гпАЬб 607. Можно предположить, что связывание антител с денатурированными молекулами препятствует их сворачиванию.

Рис. 3 Денатурация ГАФДк в мочевине

ГАФДк 0,32 мг/мя (3,6 х 106 М) и • -2 х 10"5 М mAbs ; о - 2 х 10"5МБСА;

3,6 М мочевина, 50 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ

Рис. 4. Влияние антител на спонтанную ренатурацию ГАФДк

• - 5х 10"8 М ГАФДк + 20х 10"8 М mAbs 6С5

а - 5х 10"8 М ГАФДк,

. о - 5х 10"8 ГАФДк + 20х 10"8 М Б С А Кроме того, подтверждается, что антитела взаимодействуют с ГАФДк с высоким сродством, поскольку они не вытесняются сворачивающимися субъединицами и препятствуют переходу молекулы в нативное состояние.

Поскольку было обнаружено прочное связывание антител с денатурированными молекулами антигена, мы решили использовать это свойство для очистки препаратов ГАФДк от денатурированных примесей.

7. Очистка растворов ГАФЦу от денатурированных примесей

Ренатурация белков, как in vivo, так и in vitro не происходит со стопроцентной эффективностью. С процессом фолдинга конкурирует агрегация ненативных полипептидных цепей. Часто агрегаты имеют большую молекулярную массу и могут быть легко отделены обычными методами, но бывают и небольшими, и тогда их отделение вызывает трудности [Murry-Brelier et al., 1989]. Чтобы продемонстрировать возможности очистки растворов ГАФДК мы использовали иммобилизованные антитела 6G7.

ГАФДк (0,7 мг/мл, удельная активность 112 ед./мг) денатурировали в 4,5 М мочевине в 50 мМ К-фосфатном буфере (рН 7,5), 5 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ до полной потери активности. Процесс ренатура-ции начинали разведением денатурированного белка в 50 раз в том же буфере. Из среды реактивации отбирали пробы 1 мл и инкубировали их в течение 1,5 часов с 0,5 мл суспензии иммобилизованных антител (180 мкг белка/ мл уплот. сефарозы). Сефарозу отделяли центрифугированием, и определяли концентрацию фермента на матрице и в растворе и его активность в супернатанте. В качестве контроля инкубировали пробы с сефарозой, не содержащей антител. Результаты эксперимента, а также график реактивации фермента в растворе, не содержащем сефарозу, представлены на Рис. 5.

1

10 20 30 40

Время, мин.

50

Рис. 5. Увеличение удельной активности ГАФДк после отделения денатурированного белка

• - Спонтанная реактивация послс денатурации в 4,5 М мочевине;

- Удельная активность ГАФДк в растворе после инкубации с контрольной сефарозой;

□ - Удельная активность ГАФДк в растворе после инкубации с иммобилизованными тАЬв 607.

о

Инкубация иммобилизованных антител mAbs 6G7 с раствором ГАФДк, находящейся в процессе ренатурации, привела к следующим результатам: содержание белка на матрице изменилось с 45 мкг до 53 мкг в пробе. Неспецифическое связывание с контрольной сефарозой .отсутствовало. При этом концентрация белка в растворе снизилась с 14 мкг/мл до 7 мкг/мл. Одновременно удельная энзиматическая активность раствора возросла с 35 ед./мг в контроле до 60 ед./мг в опыте. Таким образом, этот подход можно использовать для очистки растворов ГАФДк от денатурированных примесей.

8. Конкуренция за связывание с мономером ГАФД между mAbs 6С5 и GroEL из Е. coli Итак, изучаемые антитела оказались способны различать натив-ную и ненативную структуру ГАФДк. В этом смысле они имитируют

одно из свойств шаперонов — белков, которые также связывают негативные полипептиды и, затем, способствуют их правильному сворачиванию. Возникает вопрос: перекрываются ли области контакта при взаимодействии ненативной ГАФДК с антителом и шапероном. В качестве источника шаперонина мы решили использовать экстракт клеток Е. coli.

Сначала необходимо было проверить, имеет ли место взаимодействие между какой-либо из ненативных форм ГАФДк и шаперона-ми, присутствующими в экстракте клеток Е. coli. Были получены препараты иммобилизованных активных тетрамеров и димеров, а также неактивных мономеров ГАФДк, которые инкубировали с клеточным экстрактом клеток Е. coli при перемешивании в течение 30 мин. при температуре 20°С. Инкубационная среда содержала 50 мМ Tris-HCl буфер (pH 7,5), 2 мМ ЭДТА и 1мМ ДТТ. Затем, чтобы освободиться от неспецифически связавшихся белков, промывали сефарозу на стеклянном фильтре тем же буфером, и затем буфером, содержащим 0,15 М NaCI, Препараты сефарозы, отмытой от неспецифически связанных белков, анализировали с помощью ДСН-электрофореза. Результаты эксперимента представлены на Рис. 6 (Aj. На электрофореграмме видны полосы М 36 кДа, соответствующие иммобилизованной ГАФДК, (дорожки: 4 - тетрамер, 5 — димер, 6 - мономер). Также проявляются полосы белков, связавшихся в результате инкубации с экстрактом. Наибольшей интенсивностью характеризуются полосы М 58 и 60 кДа, которые появляются после инкубации экстракта с мономером и димером (5, 6) и отсутствуют при инкубации экстракта с тетрамером (4). Молекулярную массу 60 кДа имеет мономер шаперонина GroEL. Известно, что GroEL не обладает высокой специфичностью и связывается не только с денатурированными молекулами, но другими нена-тивными формами белков. Известно также, что GroEL обладает АТР-азной активностью, причем связывание АТР с шаперонином приводит к уменьшению его сродства к белку-мишени [Fenton, 1994]. Следовательно, если связавшийся белок действительно GroEL, то в процессе инкубации в присутствии АТР он должен перейти в раствор. Полученные препараты сефарозы со связавшимися белками из экстракта инкубировали с 5 мМ Mg-ATP 25 мин. при комнатной температуре. Сефарозу отделили центрифугированием, а супернатант проанализировали при помощи ДСН-электрофореза, а также на наличие АТР-азной активности. На Рис. 6 (Б) представлены олектрофореграммы белков, связанных с сефарозой после инкубации экстракта Е. coli с мономером (Б 2) и белки, перешедшие в раствор в результате инкубации с Mg-ATP (Б 3). Видно, что в последнем случае присутствует в основном белок с молекулярной массой 60 кДа. Он же обладал АТР-азной активностью. Совокупность этих данных позволяет предполо-

жить, что связавшийся белок является ОгоЕЬ. Важно также, что имело место взаимодействие не с денатурированным белком, а с иммобилизованным мономером, который, хотя и не имел ферментативной активности, но мог в значительной степени сохранить трехмерную структуру.

кДа А

кДа Б

В

i 60

65 JJM

45'

збМ

йРтйМч"-1лЫт И И

.шх

НД5 22

1 23456

1 2 3 1 2 3 4

bii Ш

Рис. 6. Влияние mAbs 6С5 на взаимодействие белков из экстракта Е. coli с иммобилизованной ГАФДк

А: 1 - маркеры; 2,3 - экстракт Е. coli',

сефароза с иммобилизованными олигомерными формами ГАФД после инкубации с экстрактом £ coli: 4-е иммобилизованным тетрамером ГАФДк; 5-е иммобилизованным димером ГАФДк", 6 -с иммобилизованным мономером ГАФДк Б: 1 - маркеры; 2 - сефароза с иммобилизованным мономером ГАФДк после инкубации с экстрактом Е. coli, 3 - элгоат после инкубации препарата, представленного в дорожке (2 Б), с 5 мМ Mg-ATP.

В: 1 - сефароза с иммобилизованным мономером ГАФДк после инкубации с mAbs 6С5; 2 - иммобилизованный мономер ГАФДк; 3 - сефароза с иммобилизованным мономером ГАФДк после инкубации с mAbs 6С5 и, затем, с экстрактом Е. coli; 4 - сефароза с иммобилизованным мономером ГАФДк после инкубации с экстрактом.

Чтобы проверить, перекрываются ли области взаимодействия mAbs 6С5 и GroEL, мы провели йнкубацию иммобилизованного мономера ГАФДк сначала с антителами, а затем с экстрактом клеток is. coli. В качестве контроля иммобилизованные мономеры фермента инкубировали только с экстрактом. Как видно на электрофореграмме, антитела (полосы 52 кДа и 25 кДа), связываются с мономером ГАФДк (36 кДа) (дорожка В 1). При инкубации мономера с экстрактом происходит связывание довольно значительно количества белков, среди которых выделяются по интенсивности полосы 70 кДа, 60 кДа, 54 кДа и 46 кДа (В 3, 4). Полоса 60 кДа, в соответствии с результатами предыдущего эксперимента, относится к мономеру GroEL. Полоса 46 кДа, вероятно, соответствует фосфоглицераткиназе, образующей комплексы с ГАФД [Fokina et al, 1997]. Для определения других белков требуются дополнительные эксперименты. Сканирование электрофоре-

граммы и определение интенсивности белковых полос при помощи программы GelScan показало, что присутствие антител влияет только на интенсивность полосы 60 кДа, а интенсивность остальных полос не изменяется. Взаимодействие с антителами уменьшает связывание GroEl из экстракта в 1,5 раза. На основании этого результата можно сказать, что присутствие mAbs 6С5 уменьшает связывание GroEL, т. е. по-видимому, области связывания на молекуле фермента для mAbs 6С5 и GroEL перекрываются.

9. Взаимодействие ГАФДиз Bacillus stearothermophilus с антителами mAhs 6С5 Связывание моноклональных антител с антигеном характеризуется высокой степенью специфичности, которая обусловлена пространственной комплиментарностью между антигенной детерминан-той и антигенсвязывающим участком молекулы антитела. Однако, при взаимодействии антитела с белками, структурно близкими с антигеном, может наблюдаться перекрестная реактивность (cross-reactivity), т. е. связывание антител с несколькими антигенами. Анализируя особенности взаимодействия моноклональных антител с гомологичными антигенами, можно получить важную информацию об эпитопе. Мы решили выяснить, возможно ли взаимодействие тех же антител с ферментом, выделенным из довольно отдаленного источника - термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus ГАФДв st, и, если удастся, сделать предварительные выводы о том, как организован эпитоп, с которым взаимодействуют mAbs 6С5.,

Сродство антител к ГАФДв^ в стандартной процедуре ELISA оказалось очень низким (Рис. 7). Известно, что ГАФДЦз, является весьма стабильным белком, не диссоциирующим даже в присутствии умеренных концентраций денатурирующих агентов [Suzuki and Harris, 1975]. Поэтому можно предположить, что в условиях, используемых в процедуре ELISA, он не диссоциирует, в отличие от ГАФДк. Возможно, что предполагаемый эпитоп, способный к связыванию с mAbs 6С5, в этом случае остается скрытым в тетрамерной структуре ГАФДвз,, и поэтому взаимодействие не проявляется. Фермент из термофильной бактерии проявляет значительную устойчивость к денатурации: в присутствии 8 М мочевины он теряет активность в течение 70 - 85 мин., удаление мочевины приводит к быстрому восстановлению активности до 80% от исходного уровня. Методом кругового дихроизма нами было подтверждено, что процесс потери активности происходит параллельно с утратой белком вторичной структуры. Также ГАФДв5[ можно денатурировать в присутствии 0,15 М NaCl и 20 мМ АТР при понижении pH среды до 4,5.

0,60

Q

0,20

о 0,30

s

0,40

0,10

0,50 "

Рис. 7. Связывание

mAbs 6С5 с ГАФДк (•) и ГАФДвя (о) в ELISA

0,00

5 6 7 8 9 10 11 -lg[mAbs 6С5]

В этом случае процесс занимает 30 - 40 мин., и активность фермента после восстановления нейтрального значения рН среды не восстанавливается. Чтобы установить, способны ли какие-нибудь формы ГАФДв51 к связыванию mAbs 6С5, мы снова воспользовались методом иммобилизации одного из партнеров реакции на BrCN-активированной сефарозе. Были получены препараты иммобилизованных антител (180 мкг/мл уплотненной сефарозы), которые мы инкубировали с препаратами денатурированной и нативной ГАФДВз1, а затем анализировали связывание белков с помощью ДСН-электрофореза, как это было описано выше. На Рис. 8 представлены результаты этого эксперимента. Видно, что нативный антиген не взаимодействует с антителами (А 2), в то время как при инкубации с денатурированным ферментом помимо полос легкой и тяжелой цепей антител появляется полоса 36 кДа, подтверждающая связывание какой-то из денатурированных форм антигена (дорожки А 3, Б 1).

Было также определено содержание белка на матрице до и после инкубации с ГАФДв51-' с каждой молекулой антител в случае инкубации с денатурированным антигеном связалось, около двух молей мономера ГАФДвя. Таким образом, имеет место перекрестная реактивность mAbs 6С5 с ненативными формами антигена. С какими именно, сказать на основании полученных результатов нельзя, поскольку при инактивации в использованных условиях в растворе могут находиться все олигомерные формы белка.

Рис. 8. Результаты инкубации и»* мобилизованных mAbs 6С5 с различными формами ГЛФДв5|

А: 1 - маркеры;

2 -с нативной ГАФДв*; 3-е ГАФ-Двбь денатурированной в присутствии NaCl и АТР при рН 4,5; 4 - иммобилизованные mAbs 6С5

Б: 1 - с ГАФДв5(, денатурированной в 8 М мочевине; 2 - маркеры

Для выяснения этого вопроса мы провели инкубацию иммобилизованных антител с мутантными формами антигена, существующими в виде димеров в растворе: D282G (димер образован по оси OR) и Y46G/R25G (димер образован по оси ОР). Кроме того, были получены иммобилизованные тетрамеры (250 мкг/мл уплотненной сефарозы, удельная активность 12,5 ед./мг при 25 °С), димеры (115 мкг/мл уплотненной сефарозы, удельная активность 12,5 ед./мг) и неактивные мономеры (60 мкг/мл уплотненной сефарозы) ГАФДв st, которые инкубировали с раствором антител. Было проведено определение количества белка на отмытых препаратах сефарозы, и они были проанализированы на ДСН-электрофорезе. Оба метода не показали взаимодействия антитела и антигена в данном эксперименте. Таким образом, связывание mAbs 6С5 с наблюдается только с денатурированной формой ГАФДВ:<(, тогда как при взаимодействии с первоначальным антигеном - ГАФДк - происходит взаимодействие также с мономерами и активными димерами фермента.

Мы также проверили, влияет ли присутствие антител на ренату-рацию ГАФДв5( после разворачивания в 8 М мочевине. В случае рена-турации ГАФДк mAbs 6С5 блокировали этот процесс (Рис. 4). Однако, добавление избытка антител одновременно с разведением инактиви-рованной в мочевине ГАФДП5, в 25 раз не оказали влияния на реактивацию белка (Рис. 9). По-видимому, сродство антител к ГАФДв5ъ значительно слабее сродства к ГАФДк, и сворачивающиеся субъединицы бактериального фермента вытесняют mAbs 6С5 в процессе ассоциации в тетрамерную структуру.

кДа

66 Й

45

36 Щ

29 24

Ш'

20

й 20

60 -

40-

20-

0-

-10

10

20 30 40 50 Время, мин.

60 70

Рис. 9 Ренатурация ГАФДгы

Препарат после денатурации в 8 М мочевине разводили в 25 раз 50 мМ К-фосфатным буфером pH 7,5, содержащим 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и 10-кратный по отношении к ферменту избыток mAbs 6С5 (•) или БСА (о). Конечная концентрация ГАФДВ510,008 мг/мл.

10. Предварительная характеристика вероятного эпитопа, взаимодействующего с антителами mAbs 5С5 Суммируя результаты, полученные при изучении особенностей взаимодействия mAbs 5С5 с ГАФДк и с ГАФДвэъ и, исходя из того, что эпитопы (антигенные детерминанты), с которыми реагируют антитела в гомологичных белках, обычно структурно очень близки друг к другу, можно выдвинуть ряд предположений об организации антигенной детерминанты:

1. Поскольку антитела связываются как с мономерами и димерами ГАФДк, "так и с денатурированными молекулами антигена, эпитоп является "последовательным", т. е. формируется последовательностью аминокислотных остатков, а не остатками, находящимися далеко друг от друга и сближающимися при образовании третичной структуры.

2. Область антигенной детерминанты не перекрывается с активным центром фермента или с NAD-связывающим участком, поскольку мы показали, что взаимодействие mAbs 6С5 с ГАФДк не снижает ее ферментативную активность. Следовательно, эпитоп расположен и вне области домен-доменного контакта в субъединице

3. Эпитоп скрыт в четвертичной структуре тетрамерного фермента и становится доступным при диссоциации ГАФДк на димеры и далее на мономеры. Следовательно, эпитоп, узнаваемый антителами, находится в области межсубъединичного контакта в тетрамере. Вместе с тем, он может лишь незначительно перекрываться с областью внутриди-мерного контакта, поскольку имеет место взаимодействие и с димерами и с мономерами ГАФДк-

4. В молекуле ГЛФД^^ эпитоп экранируется при формировании третичной структуры мономера и становится доступным только при денатурации субъединицы. Должны существовать отличия в аминокислотном составе или в пространственном окружении антигенной детерминанты в молекулах ГАФДк. и ГЛФД3,Ь которые обуславливают отличие во взаимодействии шАЬэ 6С5 с этими антигенами.

Используя доступные базы данных о последовательностях и трехмерных структурах ГАФД, выделенных из различных источников, а также программы для сравнения структур белков, мы предприняли попытку выявить последовательности, которые соответствуют перечисленным выше характеристикам предполагаемого эпитопа. Использовались следующие процедуры: поиск одинаковых блоков в последовательностях, поиск последовательностей, входящих в область межсубъединичных и междимерных контактов, анализ профилей ан-тигенности. В отличие от ГАФДВ51, рентгенограмма трехмерной структуры ГАФДк отсутствует. Поэтому при сопоставлении трехмерной структуры ферментов использовались имеющиеся данные по структуре фермента из мышц человека и из мышц омара. Консервативность 85% последовательности позволяет предположить, что общая архитектура молекулы у них совпадает и, следовательно, делает возможным попарное сопоставление для анализа пространственного окружения предполагаемой последовательности в ГАФДк- В результате были обнаружены две последовательности, в значительной степени отвечающие выдвинутым предположениям :

Последовательность 1: <229-238> в молекуле ГАФДк и <227236> в молекуле ГАФДв5, является единственной областью максимального сходства по аминокислотному составу (см. Табл. 3), которая находится в области межсубъединичных контактов и при этом не экранирует активный центр фермента. В структуре фермента она находится в главной полости тетрамерной молекулы, внутри небольшой полости в-димере и в незначительном углублении мономера.

Таблица 3. Аминокислотный состав последовательности 1

ГАФДк 229-238 ау Ме1 А1а РЬе* Аг§ Уа1 Рго ТЬг А1а* АБП

ГАФДСЫ 227-236 Мй А1а Ме^ АГ£ Уа1 Рго ТЬг Рго* АБП

Были установлены аминокислотные остатки, составляющие пространственное окружение последовательности 1 в ГЛФДвч1, а также соот-

* Звездочкой помечены отличающиеся аминокислотные остатки.

ветствующие им остатки в молекуле ГАФДк- Они представлены в Табл. 4.

Таблица 4. Пространственное окружение последовательности 1 в ГАФДвз, и в ГАФДк

№ остатка 203 205 207 171 173 175

в ГАФДш Ile Pro Thr Met Thr Val

в ГАФДк Ile Pro Ser* Leu* Thr Val

№ остатка 178 241 280 281 201 202

вГАФДш, Туг Asp Ser Arg Glu Ser

вГАФД, Ile* Asp Ser Cys* Gin* Asn*

Пространственное окружение предполагаемой области заметно отличается, что может служить причиной отличий во взаимодействии mAbs 6С5 с ГАФДк и ГАФДв5(.

Последовательность 2: в ГАФДВ51 остатки 179-194 < Thr * Asn Asp Gin Arg Ile Leu Asp Leu Pro His Lys Asp Leu Arg > ; в ГАФДк остатки 180-194 < Thr Ala Thr Gin Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser Gly Lys Leu Trp Arg >.

Последовательность является участком S-петли субъединицы ГАФД. Известно, что линейные эгштопы чаще всего формируются именно неспирализованными петлями в молекулах антигена. Кроме того, это самая длинная последовательность внутритетрамерного контакта. экранированная в тетрамере, но доступная при его диссоциации. Пять из аминокислотных остатков одинаковы, и совпадают по местоположению. Известно, что решающий вклад в процессе связывания с антителом осуществляют около одной трети от всех остатков, участвующих в контакте [Jin and Wells, 1994]. Поэтому, представляется вероятным, что этот участок последовательности может образовывать антигенную детерминанту при взаимодействии с mAbs 6С5.

Таким образом, компьютерный анализ, основанный на предположениях, выдвинутых при изучении особенностей взаимодействия антител с двумя гомологичными антигенами, позволил нам выделить две последовательности, которые, возможно, участвуют в формировании эпитопа. Разумеется, необходимы прямые эксперименты, которые могли бы подтвердить их участие ko взаимодействии с антителами. Однако сама возможность выбора ограниченного числа участков для дальнейшего анализа представляет существенный интерес.

* Звездочкой помечены отличающиеся аминокислотные остатки.

* Жирным шрифтом выделены консервативные остатки

ВЫВОДЫ:

1. Получены два клона моноклональных антител, 6С5, класса IgG и 6G7, класса IgM, специфичные к ненативными формам ГАФД из мышц кролика.

2. С использованием методов иммуноферментного анализа, гель-фильтрации, иммобилизации одного из партнеров реакции показано, что полученные антитела взаимодействуют с нативными диме-рши, мономерами и денатурированными формами ГАФД из мышц кролика, но не с нативными тетрамерами антигена.

3. Показано, что антитела обоих клонов блокируют спонтанную реактивацию ГАФД из мышц кролика.

4. Установлено, что взаимодействие с антителами не влияет на активность иммобилизованных димеров, а также фермента в растворе.

5. Иммобилизованные антитела клона 6G7 использованы для очистки препаратов ГАФД от денатурированных примесей.

6. Обнаружено взаимодействие антител клона 6С5 с денатурированными молекулами ГАФД из В. stearothermophilus. В то же время антитела не связываются с тетрамерами, димерами и мономерами ГАФД из В. stearotermophilus.

7. На основании полученных данных сделаны предположения о структуре и локализации антигенной детерминанты в молекуле ГАФД, взаимодействующей с антителами клона 6С5.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дайняк, М. Б.. Григорьева, Ю. А., Фокина, К. В., Муронец, В. И. "Влияние антител, взаимодействующих с ненативными формами белков, на их сворачивание" Тезисы стендовых сообщений II съезда биохимического общества РАН, Москва, 1997 г., часть I, стр. 22.

2. Muronetz, V. I., Bulatnikov , I. G., Dainyak, M .В., Asryants, R. A., Grigorieva, J. A. "Interactions of chaperones and chaperone-like proteins with D-glyceraldehyde-3-phospate dehydrogenase" Тезизы международной конференции "Biocatalysis-98. Fundamental and Applications", Пущино-на-Оке, 1998 г., стр. 5.

3. Grigorieva, J. A, Muronetz, V. I., Dainyak, M. B. "Folding of immobilized and soluble enzymes: influence of the monoclonal antibodies on this process" Тезизы международной конференции "Biocatalysis-98. Fundamental and Applications", Пущино-на-Оке, 1998 г., стр. 36.

4. Muronetz, V. I., Bulatnikov , I. G., Dainyak, M. В., Grigorieva, J. A. "Influence of chaperones and monoclonal antibodies of folding of D-glyceraldehyde-3-phospate dehydrogenase" Международный симпозиум "Protein structure, stability and folding. Fundamental and Medical Aspects", Москва, 1998, стр. 179.

5. Grigorieva, J. A, Dainyak, M. В., Katrukha A. G., Muronetz, V. I. "Antibodies to the normative forms of glyceraIdehyde-3-phospate dehydrogenase: identification, purification and influence on the renaturation of the enzyme" Arch. Biochem. Biophys., 1999, v. 369, 2, p. 252-260.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Григорьева, Юлия Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Моноклональные антитела и их взаимодействие с антигенами.

Взаимодействие антитела с антигенной детерминантой.

Организация эпитопа.

Использование моноклональных антител для изучения олигомеризации и сворачивания белков.

Методы характеристики антигенной детерминанты.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура и функции.

Основные свойства и роль в катализе.

Олигомерные состояния ГАФД и ее функции в клетке.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы.

Определение концентраций реагентов.

Определение концентрации белков в растворе.

Определение концентрации иммобилизованных белков.

Определение активности ГАФД.

Выделение ГАФД.

ГАФД из мышц кролика.

ГАФД из В. stearothermophilus.

Получение апо-ГАФД.

Гель-фильтрация на Суперозе 12.

Твердофазный иммуноферментный анализ ELISA.

Взаимодействие антител с сорбированным антигеном.

Взаимодействие антител с антигеном в растворе.

Очистка антител.

Иммобилизация белков на сефарозе -4В.

Активация сефарозы.

Иммобилизация ГАФД.

Иммобилизация антител.

Получение иммобилизованных за одну субъединицу димеров

ГАФД.

Получение иммобилизованных за одну субъединицу мономеров

ГАФД.

Получение иммобилизованных за две субъединицы димеров

ГАФД.

Процедуры инкубации иммобилизованных белков с растворимыми партнерами реакции.

ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.

Приготовление экстракта клеток Е. coli.

Определение АТР-азной активности.

Полное карбоксиметилирование ГАФДК.

Определение константы седиментации.

Компьютерный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Отбор моноклональных антител.

Выделение комплекса антитело - антиген при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Взаимодействие различных олигомерных форм ГАФДК с моноклональными антителами.

Получение иммобилизованных олигомерных форм ГАФДК.

Количественное определение антител, связавшихся с иммобилизованным антигеном.

Анализ взаимодействия различных олигомерных форм антигена с моноклональными антителами при помощи

ДСН-электрофореза в ПААГ.

Влияние антител на активность ГАФДК.

Влияние антител mAbs 6С5 на термоинактивацию ГАФДК

Влияние антител на разворачивание ГАФДК в мочевине.

Влияние антител на спонтанную ренатурацию ГАФДК.

Очистка растворов ГАФДК от денатурированных примесей.

Конкуренция за связывание с мономером ГАФДК между mAbs 6С5 и GroEL.

Взаимодействие белков из экстракта Е. coli с иммобилизованными олигомерными формами ГАФДК.

Конкуренция GroEL и mAbs 6С5 за связывание с мономером

ГАФДк.

Взаимодействие ГАФД из Bacillus stearothermophilus с антителами mAbs 6С5.

Взаимодействие нативной и денатурированной ГАФДвэ! с иммобилизованными антителами.

Взаимодействие димеров и мономеров ГАФДв^ с антителами. 103 Предварительная характеристика вероятного эпитопа, взаимодействующего с антителами mAbs 6С5.

ВЫВОДЫ.