Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Теоретические и практические аспекты микробиологического производства лимонной кислоты

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Теоретические и практические аспекты микробиологического производства лимонной кислоты"

^ ^ 0 ^ На правах рукописи

НИКИФОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСЕЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

03.00.23 — Биотехнология

Диссертация

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора технических наук

На правах рукописи

НИКИФОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСЕЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

03.00.23 — Биотехнология

Диссертация

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора технических наук

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследователь институте пищевых ароматизаторов, кислот и красителей (ВНИИГ, Российской академии сельскохозяйственных наук

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки и техники РФ, член-корр. РАСХН, д. т. н., профессор

Доктор технических наук

Доктор биологических наук, профессор

Устинников Борис Алексеев!

Свентицкий Евгений Никола«

Яковлева Елена Павловна

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государстве! Академия холода и пищевых технологий

Защита состоится уЛ^ъ /ъ&я^Р? ¡999 г в /о qacoi заседании диссертационного совета Д 063.25.09 в Санкт-Пе' бургском государственном технологическом институте (техничес университете) по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр.,

С диссертацией в форме научного доклада можно ознакомить библиотеке Санкт-Петербругского государственного технологичен института (технического университета) по адресу: 198013, Caí Петербург, Московский пр., 26.

Замечания и отзывы по данной работе в одном экземши заверенные печатью, можно присылать по адресу 198013, Cat Петербург, Московский пр., 26.

Диссертация в форме научного доклада разослана <<^> \%

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Лисицкая Т. I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из направлений современной промышленной биотех-ологии является микробиологическое производство органических ислот, полифункциональные свойства которых предопределяют шрокую сферу их применения в различных направлениях народного озяйства. Важнейшая среди них — лимонная кислота, применяемая пищевой и перерабатывающей промышленности в качестве одкислителя, антиоксиданта и консерванта, с момента организации е производства в нашей стране (1935 г.) является дефицитным родуктом, спрос на который постоянно растет.

В связи с этим, развитие научных основ микробиологического роизводства и регуляции биосинтеза лимонной кислоты дает озможность осуществлять целенаправленную и научно обоснованную олитику в области технологии и сырьевых ресурсов для производства имонной кислоты.

Отсутствие системного, научно-регламентированного подхода к ыбору эффективных штаммов — продуцентов лимонной кислоты, зерментации разного по качеству традиционного и нового сырья, озданию оптимальных технологий глубинного культивирования [редопределили необходимость научных исследований в этом управлении.

Представленная работа направлена на изучение мицелиальных рибов Aspergillus niger — продуцентов лимонной кислоты, а также словий их ферментации, влияющих на эффективность биосинтеза [имонной кислоты и выход целевого продукта.

В связи с этим создание новых высокопродуктивных штаммов— [родуцентов лимонной кислоты, поиск новых источников сырья и >азработка научно-обоснованных технологических приемов подготовки [итательных сред к ферментации, поиск эффективных регуляторов ¡иосинтеза и внедрение новых технологий в промышленность тановятся актуальными.

Исследования выполнены в рамках важнейших отраслевых ;аданий МПП СССР, проектов Федеральной научно-технической

подпрограммы «Перспективные процессы в перерабатывающих отраслях АПК» Министерства науки и технологий РФ и НТП программы Россельхозакадемии на период 1992—2000 гг. «Перспективные экологически безопасные технологии и комплексная переработка сельскохозяйственной продукции».

Цель и задачи работы

Цель работы. Разработать высокоэффективные конкурентно-способные технологии производства лимонной кислоты на основе научно-обоснованных подходов к выбору штаммов — продуцентов и подготовке различного углеводсодержащего сырья к ферментации.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести селекцию штаммов — продуцентов лимонной кислоты гриба Aspergillus niger и раскрыть потенциальные возможности селекционированных штаммов.

2. Изучить новые источники сырья для культивирования Aspergillus niger, обеспечивающие целенаправленный синтез лимонной кислоты и разработать методы подготовки сырья к ферментации.

3. Найти пути интенсификации процесса биосинтеза лимонной кислоты в процессе ферментации Aspergillus niger и изучить биохимические закономерности влияния субстрата на продуктивность биосинтеза.

4. Разработать технологии ферментации селекционированных штаммов — продуцентов лимонной кислоты на различных средах с целью создания гибкого технологического процесса.

Научная новизна

Научно обоснованы принципы и методы селекционной работы с продуцентом лимонной кислоты—мицелиальным грибом Aspergillus niger для получения эффективных штаммов —продуцентов лимонной кислоты.

Впервые проведено генотипирование промышленных и вновь селекционированных штаммов Aspergillus niger методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами, что дает возможность осуществлять идентификацию и мониторинг мицелиальных проду-

ентов лимонной кислоты. Изучена активность фермента цитрат-¡нтазы при культивировании селекционированных штаммов Aspergillus iger на сахарозо-, глюкозоминеральных и мелассных средах, становлена коррелятивная зависимость между содержанием внутри-внеклеточного цитрата. Предложен механизм инактивации итратсинтазы избытком цитрата.

Сформулированы требования к новым видам сырья. Установлены х химические и технологические параметры, которые позволяют пределить конкретные условия культивирования продуцента, беспечивающие направленный синтез лимонной кислоты.

Разработана математическая модель непрерывного процесса иосинтеза лимонной кислоты в режиме одно- и двухстадийного емостата, адекватность которой подтверждена экспериментальными ;анными, полученными на промышленных ферментаторах.

Найдены пути повышения интенсивности биосинтеза лимонной ислоты при промышленной ферментации на мелассных средах путем [рименения ряда природных и синтезированных стимуляторов :ислотообразования и роста продуцентов.

Новизна результатов научных исследований подтверждена 6 вторскими свидетельствами и 10 патентами СССР и РФ.

Практическая ценность и промышленная реализация

результатов исследований

Получены высокопродуктивные штаммы Aspergillus niger— проценты лимонной кислоты для различных видов сырья, зареги-лрированные во Всероссийской коллекции промышленных микроор-анизмов и хранящиеся в музее ВНИИПАКК.

Разработаны новые технологии ферментации селекцио-шрованных штаммов на питательных средах, полученных на основе ;векловичных и тростниковых меласс, крахмала и сока сорго в широком диапазоне исходной концентрации углеводов. Предложенные технологии дают возможность работать в режиме гибкого технологи-iecKoro процесса в зависимости от качества, наличия и стоимости :ырья. Разработаны технологические приемы, позволяющие 1спользовать в промышленном масштабе сырье различного технологического качества.

Решен ряд экологических проблем путем снижения или полноп исключения при подготовке питательных сред экологически опасны: реагентов и перехода на экологически чистое сырье.

Результаты работы внедрены в период 1981—1998 гг. т предприятиях отрасли: Белгородском, Ленинградском и Дигорско.\ заводах лимонной кислоты (РФ), Харьковском и Смелянском 3JIF (Украина), Скидельском 3J1K (Белоруссия) и Гырбовском ЗЛБ (Молдова) общим объемом 15,0 тыс. тонн лимонной кислоты в год.

Проведенные научные исследования позволили решить ря; практических задач, связанных со снижением расхода сырья, повышением производительности цехов ферментации и снижением себестоимости продукции, что явилось основанием для включения новых технологических решений в отраслевую техническую документацию.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования являлись мицелиальные грибы Aspergillus niger из коллекции культур ВНИИПАКК. В ходе селекционной работы изучена морфологическая изменчивость и биохимическая активность более трех тысяч мутантов. В селекционной работе использованы методы индуцированного мутагенеза, вегетативной гибридизации и слияния протопластов под воздействием ферментов различного происхождения в сочетании со стабилизирующим ступенчатым отбором и др.

Экспериментальный материал собран при изучении продуцента Aspergillus niger в условиях культивирования на качалках в колбах емкостью 750 см3, на установке управляемого культивирования АК-210 в аппаратах вместимостью 10 дм3, в ферментаторах мешалочного типа вместимостью 30 дм3 и в производственных ферментаторах вместимостью 50 м3 и 100 м3.

Для получения клеточных лизатов и амплификации геномной ДНК использован метод Булата и сотр. (1992). Агарозный и не денатурирующий ПААГ — электрофорезы выполнены по методу Sambrook et all. (1989). Активность цитратсинтазы определена в гомогенатах клеток, отобранных в различные фазы развития культуры по методу Srere et all. (1963) с некоторой модификацией.

Микро- и макроэлементный состав сырья, минеральных лементов и питательных сред выполнен на спектрографе ДФС-13 и вантометре МФС-4, индивидуальные моносахара — на газохрома-ографе Vista 6500.

За основу количественного определения ионов ферроцианида был зят метод Майера и Кларка, который был модифицирован [рименительно к условиям подготовки меласс к ферментации.

Исследования математической модели биосинтеза осуществле-[ы на аналоговом вычислительном комплексе АВК-32.

Апробация работы

Основные материалы по выполненным исследованиям были (оложены на следующих конференциях и семинарах:

Всесоюзное совещание «Основные направления интенсификации ехнологичсских процессов в производстве пищевых кислот» (п. Фрунзе, Молдова, 18—20 июня 1985 г.).

Всесоюзное совещание «Направления интенсификации производства пищевых кислот, создание безотходных технологий» (г. Смела, Ю—31 мая 1989 г.).

Всесоюзный семинар «Опыт работы предприятий по освоению говой техники и перспективные направления интенсификации и развития троизводства пищевых кислот» (г. Белгород, И—12 июня 1991 г.).

Международная конференция, г. Бернбург (ФРГ), 4—10 сентября 1995 г.

Республиканский семинар «Интенсификация и автоматизация технологических процессов обработки пищевых продуктов» (г. Москва, 30 июня 1998 г.).

Результаты работы были доложены на заседаниях научно-технических Советов Минпищепрома СССР, Госагропрома СССР и Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции РАСХН.

Публикации

Основные результаты работы опубликованы в 44 печатных изданиях, в том числе в описаниях 6 авторских свидетельств СССР и 10 патентах СССР и РФ.

Объем и структура научного доклада

Работа изложена на 48 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 рисунками, 3 таблицами, состоит из 4 глав, выводов и списка опубликованных работ.

В первой главе приведены результаты селекционной работы по поиску наиболее эффективных штаммов Aspergillus niger — продуцентов лимонной кислоты, описание некоторых штаммов и результаты их генотипирования.

Во второй главе представлена характеристика новых видов сырья для производства лимонной кислоты, а также способы подготовки его к ферментации и параметры, которым должно оно соответствовать.

В третьей главе представлены результаты исследований по влиянию фермента цитратсинтазы на процесс биосинтеза лимонной кислоты, а также выбору веществ, стимулирующих кислотообразо-вание.

Четвертая глава посвящена описанию особенностей технологии биосинтеза лимонной кислоты на различном углеводсодержащем сырье и результатам внедрения их в промышленность.

1. СЕЛЕКЦИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ ШТАММОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Знание генетических и физиологических особенностей биологического объекта, применяемого в любом биотехнологическом производстве, является фундаментальной научной базой для управления процессом биосинтеза.

Свойством продуцировать лимонную кислоту обладают многие микроорганизмы, но для промышленного производства в основном используют микромицет Aspergillus niger.

Современная технология производства кислоты, основанная на различных источниках углерода и различных способах культивирования (поверхностном, глубинном периодическом и непрерывном) требует создания новых эффективных продуцентов лимонной кислоты.

Штаммы для производства лимонной кислоты должны отвечать определенным научным критериям:

1. Обладать высокой скоростью кислотообразования.

2. Обладать высокой степенью трансформации источника углерода в лимонную кислоту.

3. Быть генетически однородными и стабильными.

4. Быть толерантными, в том числе к высоким концентрациям /глеводов, изменениям температуры среды и контаминантам процесса.

Селекция эффективных штаммов Aspergillus niger была проведена та базе промышленных штаммов и музейных культур из коллекции ЗНИИПАКК и основывалась на изучении изменчивости продуцента тод воздействием физических и химических мутагенных факторов, методах вегетативной гибридизации ауксотрофных мутантов и гибридизации протопластов различных штаммов /1,21.

Отбор перспективных культур проводился из колоний с измененной морфологией. Для ускорения селекционной работы из этбора исключались генеративные аконидиальные мутанты, не терспективные для получения лимонной кислоты /1/.

В результате поиска путей селекции штаммов Aspergillus niger 5ыл разработан метод получения митотических диплоидов у Aspergillus Tiger, заключающийся в выдерживании моноконидиальной суспензии гаплоидного штамма в парах камфоры при 20°С, под воздействием которой образуются крупноклеточные варианты с частотой 2-102 после 20 часов экспозиции, расщепляющиеся и образующие полиморфные и гаплоидные варианты. Из популяции полиморфной культуры однородную диплоидную культуру выделяют, применяя фильтрационный метод и облучение ультрафиолетом в дозах, летальных для гаплоидных вариантов /3/.

Установлены существенные отличия микроскопических признаков диплоидной культуры Aspergillus niger от исходного гаплоидного штамма, а именно, увеличение диаметра конидий в 1,3 раза, объема конидий в 2,2 раза, веса сухой конидии в 1,7 раза /3/. Для диплоида, по сравнению с исходным штаммом, характерно ограничение роста биомассы, что значительно повышает его продуктивность по лимонной кислоте.

В ходе селекционной работы изучена морфологическая изменчивость и биохимическая активность более трех тысяч мутантов,

что позволило выделить эффективные штаммы-продуценты отвечающие научным критериям. В табл. 1 приведены результать биосинтеза лимонной кислоты селекционированными штаммами продуцентами при ферментации на различных углеводсодержащю средах в условиях периодического и непрерывного культивирования.

Штамм ВКПМ F-410. Получен методом автоселекции активны? мутантов в сочетании с мутагенезом для непрерывного культивирования на мелассных средах. В качестве объекта селекции взят; популяционная смесь производственных штаммов JI-1, ВКПМ F-171 ВКПМ F-326 и мутанта JI-4-30. Раздельная обработка нитрозо-метилбиуретом в концентрации 2,5 г/дм3 конидий каждого штамма с последующим культивированием обработанной мутагеном популяции в совместной культуре в течение 7, 12 и 15 суток позволила из ЗОС отобранных вариантов выделить наиболее активный, полученный из 15-ти суточной культуры после 4-х часовой обработки мутагеном, который был рекомендован для промышленных испытаний и впоследствии получил коллекционный номер ВКПМ F-410/4/.

Штамм ВКПМ F-501. Селекционирован методом соматической гибридизации протопластов мицелия штамма ВКПМ F-410 и активного мутанта 288/9-108/19-96/5, полученного на ранних ступенях селекции с последующим облучением рекомбинантов УФ-лучами в дозе 0,33 кДж/м2 и отбором спонтанных вариантов. Селекционированный штамм предназначен для ферментации на сахарозоминеральных средах /5/.

Штамм ВКПМ F-681. Исходным объектом селекции служил черноокрашенный вариант Aspergillus niger 163/9 из коллекции ВНИИПАКК. Сочетание УФ-облучения со стабилизирующим отбором устойчивых спонтанных вариантов позволило на пятой ступени селекции получить штамм с темно-серой окраской конидий, имеющий ограниченный рост и высокую продуктивность мицелия /6/.

Штамм ВКПМ F-696. Селекционирован из высокоактивных мутантов, полученных на 4 ступени селекции штамма ВКПМ F-681 при дозе УФ-облучения 0,5 кДж/м2; имеет в отличие от него кремовую окраску конидий 111.

Штаммы ВКПМ F-681 и ВКПМ F-696 предназначены для ферментации на сахарозоминеральных и глюкозоминеральных средах.

Таблица 1

Биосинтез лимонной кислоты продуцентами Aspergillus niger на различном углеводсодержащем сырье

Штамм Длительность ферментации, сут. Массовая доля лимонной кислоты, % Интенсивность образования лимонной кислоты, кг/(м3-сут.) Выход ЛИМОННОЙ кислоты, % от сахара Расход сырья, т/т Абсолютно сухая биомасса, г/дм3 Способ культивирования Автор, св-ва, патенты Степень освоения

Свекловичные мелассы

82 (родит.) 6,0 66,2 5,1 36,0 5,9 15,9 период. — —

ВКПМ F-410 16,0 91,8 9,1 85,3 2,6 22,4 непрер. АС 1609150 внедрен

Сахарозоминеральные среды

ВКПМ F-501 6,0 99,7 16,0 99,0 1,0 , 13,8 период. П1811697 внедрен

ВКПМ F-681 5,0 97,6 23,7 89,0 1,2 9,5 период. П 2089615 лабор.

ВКПМ F-696 5,0 98,6 24,0 90,0 1,1 11,5 период. П2078810 опытно-пром.

Глюкозоминеральные среды

ВКПМ F-501 6,0 97,3 16,7 70,0 1,3 14,2 период. П1811697 внедрен

ВКПМ F-681 7,0 98,1 20,0 84,0 1,3 8,8 период. П2089615 лабор.

ВКПМ F-696 6,0 98,4 23,0 84,0 1,25 9,6 период. П2078810 опытно-пром.

Концентрированный сок сорго

ВКПМ F-719 5,0 | 97,5 18,7 80,0 2,55 17,2 период. П 2088658 опытно-пром.

Штамм ВКПМ F-719. Получен в ходе ступенчатой селекции из промышленного штамма ВКПМ F-171 под воздействием УФ-лучей в дозе 1 кДж/м2 в сочетании со стабилизирующим отбором спонтанных вариантов /8/. Штамм селекционирован для нового вида сырья — сгущенного сока сорго.

При изучении морфологической изменчивости селекционированных штаммов установлено, что у мутантов Aspergillus niger в процессе селекционной работы размер конидий в диаметре уменьшался в среднем с 4,3 до 3,4 мкм, но при этом сохранялся основной систематический признак — образование стеригм в два слоя, причем, длина стеригм первого слоя (10—23 мкм) вдвое крупнее стеригм второго слоя (4,5—6,9 мкм). Характерно, что в строении стеригм у мутантов отмечалась меньшая упорядоченность по сравнению с родительским штаммом /91. Селекционированные штаммы генетически стабильны, морфологическая изменчивость колоний элитных линий не превышает 0,3%.

Идентификация новых штаммов Aspergillus niger по традиционным культуралыю-морфологическим характеристикам не в полной мере обеспечивает определение индивидуального статуса той или иной культуры.

Известно, что полимеразные цепные реакции, разработанные для амплификации и анализа конкретных генетических локусов и базирующиеся на предварительном знании нуклеотидных последовательностей этих локусов, в модифицированном варианте — с использованием универсальных праймеров—пригодны для детального анализа геномов многих микроорганизмов.

Данная методика была использована нами для генотипирования штаммов: ВКПМ F-501, F-696, F-719 в сравнении с родительским штаммом 82 /10/. В качестве универсальных праймеров (УП) использованы 3 основных УП: AS15inv, L15/AS19 и АА2. Сравнительный анализ УП-полимеразной цепной реакции профилей 4-х штаммов с тремя УП показал, что исследуемые штаммы обладают сходной структурой геномов. Тем не менее, посредством праймера АА2 удалось выявить различия у всех 4-х штаммов (рис. 1, 2).

М 1 2 3 4 i г 3 4 1 2 3 4 М

а ttsmtttttm тттт immmw

AS15inv L15/AS19 АА2

'ис. 1. Оригинальная картинка с профилями штаммов, полученных с ремя разными УП-праймерами (праймеры указаны под картинкой): —82; №2—ВКПМ Р-696; №3—ВКПМ Р-719; №4— ВКПМ Р-501

1 2 3 4 м

в

'ис. 2. Фрагмент картинки для профилей с праймером АА2. Стрелки казывают на области различия. М—маркеры мол. масс/ДНК фага :лямбда», расщепленная энзимом Pst 1, разделение в 5,5% юлиакриламидном геле

Родительский штамм 82 по структуре генома наибо; отличается от других культур. Далее по степени отличия след; штамм ВКПМ F-696. Штаммы ВКПМ F-501 и F-719, селекц! нированные из культур более поздних ступеней селекции, оказал1 наиболее сходными.

Селекционированные штаммы, несмотря на большое сходс. по структуре геномов, отличались друг от друга, в том числе и продуктивности биосинтеза лимонной кислоты (табл.1). Индуки. генов, ответственных за синтез и секрецию лимонной кислоты селекционированных штаммов не связана со значительной перестрою их геномов. Повышение эффективности биосинтеза лимонной кисло при их использовании обусловлено не только генетическими, не совокупностью эпигенетических факторов, определяющих получен конечного продукта.

Метод генотипирования с использованием универсальн) праймеров может быть рекомендован для более полной и тонн идентификации новых селекционированных штаммов мицелиальн] грибов — продуцентов лимонной кислоты.

Селекционированные штаммы вошли в коллекцию продуцент лимонной кислоты, включающую свыше 130 культур Aspergillus nig созданную во ВНИИПАКК — головном НИИ по биосинтезу орган ческих кислот.

2. ИСТОЧНИКИ УГЛЕРОДА ДЛЯ БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

В качестве источника углерода для микробиологического синте лимонной кислоты используют как возобновимое сырье (различи! углеводсодержащие продукты), так и невозобновимое (парафии нефти).

На современном уровне развития биотехнологии мож* сформулировать определенные научные критерии выбора сырья Ri биосинтеза лимонной кислоты:

1. Сырье должно содержать необходимое количество углеводе в доступной для штаммов-продуцентов форме.

2. Иметь в составе определенное количество минеральных шмпонентов, необходимых для биосинтеза лимонной кислоты.

3. Быть дешевым, доступным, относиться к категории возобновимых.

4. Не требовать сложной технологии подготовки сырья к ферментации и утилизации отходов.

Свекловичная меласса

Наиболее распространенным и хорошо изученным сырьем для получения лимонной кислоты методом глубинной ферментации в нашей лране является свекловичная меласса.

Однако ее применение связано со сложностью подготовки к ферментации из-за непостоянства состава, большого количества примесей и большой экологической нагрузкой на окружающую среду. Поэтому разработка новых приемов подготовки свекловичных меласс к ферментации, улучшающих ее качество и снижающих отрицательное влияние на экологию, остается актуальной.

Широко практикуемый способ подготовки меласс к ферментации предусматривает ее обработку гексацианоферратом калия (ГЦФК). Рядом авторов (Журавский и Терентьева, 1962, Nour et all, 1979, Bruchmann, 1986) была доказана необходимость присутствия гвободного иона ферроцианида в питательной среде, который оказывает влияние на активность биосинтеза лимонной кислоты.

Литературные сведения о концентрационных пределах свободного иона ферроцианида в питательных средах крайне противоречивы и трудно сравнимы из-за принципиально различных способов подготовки меласс к ферментации и применяемых штаммов.

Нами исследованы образцы свеклосахарных меласс, обработанные ГЦФК в различных концентрациях (800—1400 мг/дм3 раствора), и показано, что концентрация свободного иона ферроцианида зависит Fie только от дозы введенного ГЦФК, но и от минерального состава сырья. При этом биосинтетическая активность гриба находится в прямой зависимости от содержания иона ферроцианида в растворе. Статистический анализ полученных данных показал, что присутствие ионов ферроцианида в мелассных средах на 18—24 часов ферментации

в количестве 130±20 мг/дм3 для свеклосахарных меласс обеспечивает наиболее высокий выход лимонной кислоты/11/.

Поскольку традиционный химический способ очистки мелассы не является экологически безопасным, нами совместно с ГосНИИОЧБ был разработан и испытан электросорбционный метод очистки меласс, носящий комплексный характер и сочетающий процессы электрокоагуляции, электросорбции, комплексообразования и, частично, электродиализа. Метод основан на использовании новой электро-сорбционной техники и осуществляется путем пропускания мелассных растворов через электросорбционные колонки с гранулированной сегнетокерамической насадкой /12/.

Проведенные исследования позволили научно обосновать и выбрать конструкционные материалы для элекгросорбционных колонок применительно к мелассным средам (сорбент — сегнетокерамика на основе титаната бария, материал для мембраны — целлофан с фторопластовой подложкой, электролит — ацетатный буфер с рН 5,3— 5,6), режимы очистки мелассы (сила тока 8—9 А, напряженность электрического поля 30—40 В/см) и создать полупромышленную установку для очистки мелассных растворов.

В результате электрофизической обработки происходит изменение физико-химического состава мелассы по сравнению с необработанной, а именно, уменьшается количество сухих веществ до 10,0%, коллоидов до 37,0%, зольности до 30,0%, ионов кальция до 38%, ионов калия до 20,0%, ионов железа до 3,0%. Применение электрофизической обработки приводит к уменьшению оптической и физической плотности мелассы, а также вязкости, что в конечном итоге улучшает качество сырья /13/. На рис. 3 представлены сравнительные результаты ферментации Aspergillus niger на мелассных средах, подготовленных традиционной химической обработкой и электрофизическим способом, которые свидетельствуют о принципиальной возможности применения экологически более чистого способа обработки меласс.

Изучение дыхательной активности гриба—продуцента лимонной кислоты показало, что характер изменения интенсивности потребления кислорода, выделения диоксида углерода и дыхательного коэффициента в процессе ферментации сред, очищенных электросорбционным способом, и очищенных химреагентами, одинаков.

Рис. 3. Динамика накопления органических кислот (1,2), биомассы(3,4) л потребления Сахаров (5,6) грибом-продуцентом Aspergillus niger при ферментации меласс, очищенных химреагентами (кривые 2,4,6) и электрофизическим способом (кривые 1,3,5), на опытно-промышленной установке

В количественном отношении на средах, очищенных электрофизическим способом, дыхание продуцента после 2-х суток в период активного кислотообразования ниже, чем на средах, обработанных химреагентами с последующим сохранением этой закономерности до экончания процесса. В итоге, потребление кислорода в расчете на 1 т воздушно-сухой биомассы за цикл ферментации продолжительностью 5 суток составило на средах, очищенных химреагентами, 118 м3 02/т, а на очищенной электрофизическим способом 83 м3 02/т. Эти данные позволили пересмотреть технологические параметры ферментации

очищенных мелассных сред и перейти на более концентрированную подпитку погруженной культуры.

Тростниковые мелассы

В России сахарный тростник не произрастает, но тростнико-восахарные мелассы широко применяются во многих странах, поэтому представляло интерес изучить ферментацию этого сырья в сравнительном аспекте со свеклосахарным с использованием отечественных штаммов-продуцентов. Установлено, что в тростниковых мелассах значительная доля ферментируемых углеводов приходится на свободноредуцирующие сахара, избыток которых в среде приводит не только к ускоренному развитию мицелия продуцента, но и к образованию ингибиторов процесса в результате взаимодействия их с другими компонентами мелассы при термообработке.

Тростниковые мелассы имеют повышенную зольность, а по содержанию солей кремния, железа, и магния они заметно отличаются от свекловичных меласс (соответственно, в 2, 2—3 и 6—10 раз). Поэтому при подготовке тростниковых меласс к ферментации требуется повышенный расход ГЦФК, для удаления избыточного количества кремния и других взвешенных частиц необходима дополнительная очистка сырья путем центрифугирования.

Количество азотистых соединений в тростниковых мелассах ниже, чем в свекловичных, а усвояемых фосфорных соединений в 3—8 раз больше, что на фоне высокого содержания биотина создает неблагоприятные условия для биосинтеза лимонной кислоты.

Химические параметры тростниковых меласс и их технологические качества заметно изменяются в процессе хранения /14/. При длительном хранении (больше 6 месяцев) снижается доброкачественность тростниковой мелассы вследствие уменьшения содержания сухих веществ на 1,2% и суммы ферментируемых Сахаров на 5,4%. При этом происходят изменения в составе Сахаров: уменьшается количество сахарозы на 1%, инвертного сахара на 3,5%. Увеличивается содержание коллоидов, сернистого ангидрида, летучих веществ, цветность мелассы возрастает в 1,6 раз. Увеличение количества летучих кислот при неизменной зольности, естественно,

приводит к увеличению буферное™ мелассы.

Интенсивность биосинтеза лимонной кислоты на средах, приготовленных на основе меласс сроком хранения более 6 месяцев, снижается на 23,9% с одновременным уменьшением массовой доли лимонной кислоты на 6,4%. При хранении сырья от 6 до 10 месяцев технологические качества тростниковой мелассы изменяются еще в большей степени: интенсивность биосинтеза лимонной кислоты снижается в 2,4 раза.

Учитывая низкие технологические качества тростниковых меласс, нами испытан ряд способов их подготовки и очистки: реагентная (ГЦФК), механическая, адсорбционная (бентонитом), тепловая, кислотно-тепловая. При ферментации на тростниковой мелассе, подготовленной способом кислотно-тепловой обработки (рН=4,65) в сочетании с реагентной, отмечено ограничение роста биомассы продуцента и возрастание биосинтетической активности единицы мицелия /15/.

Учитывая химический состав тростниковых меласс и результаты влияния кислотно-тепловой обработки на минеральный состав сырья, разработаны составы питательных сред для различных стадий технологического процесса. Установлено, что дополнительное азотное питание следует вносить не на стадии подращивания посевного материала, а вводить на стадии ферментации в виде солей азотнокислого аммония (1,5 г/дм3), хлористый калий, повышающий мембранную проницаемость клеток и способствующий транспорту растворенного в среде кислорода, вносить при приготовлении сред на основную ферментацию, а соли цинка—исключить.

Предложенная схема подготовки тростниковых меласс к ферментации в сочетании с подобранным составом питательных сред для каждой стадии процесса позволяет осуществлять процесс биосинтеза лимонной кислоты на сырье низкого технологического качества.

Сок сорго

В качестве нового субстрата для биосинтеза лимонной кислоты нами впервые исследован сок сорго нативный (зеленый) и концен-

трированный (сгущенный), выделенный из стеблей сахарного сорго по технологии НПО «Саратовсорго» и МГИПП «Сорго» (г. Зерноград Ростовской обл.).

Сок сорго содержит до 20% Сахаров, в том числе дисахариды (сахарозу), моносахариды (глюкозу, фруктозу, арабинозу), а также рафи-нозу и мальтозу. Сгущенный сок сорго отличается от свекловичных меласс более низким значением рН (4,5—5,5), низкой буферностью, низким содержанием зольных элементов (3,5—4,0%), что благоприятно для жизнедеятельности Aspergillus niger /16/. Отрицательным фактором является высокое содержание в соке сорго усвояемого фосфора (0,1 %) и низкое — усвояемого азота (0,1%) по сравнению со свекловичной мелассой.

При концентрировании зеленого сока сорго происходят некоторые изменения в составе моносахаров и образование полисахаридов: Так, при концентрировании сока в 2,7 раза отмечено практически одинаковое содержание глюкозы, фруктозы, арабинозы и отсутствие рамнозы в нативном и сгущенном соке сорго, на фоне увеличения ферментируемых Сахаров в 3 раза.

Учитывая необходимость обеспечения стерильности в ходе биосинтеза лимонной кислоты, а также длительность хранения сырья, объектом дальнейших исследований выбран концентрированный сок сорго.

Особенностью состава питательных сред на основе сока сорго, сбалансированных по основным питательным компонентам, является строгое выдерживание соотношения углерода к азоту, а также азота к фосфору в зависимости от фазы роста гриба /17/. Так, при культивировании продуцента по технологии разбавленных сред соотношение C/N должно быть: для посевной культуры в пределах 12-Т-20, в период основной ферментации — 35-^-45, для подпитки — 147-И 83, а соотношение N/P: 12н-20, 6^-8, 2^6, соответственно. При культивировании по технологии концентрированных сред изменялось только соотношение C/N на стадии ферментации (60-н55).

В качестве источника азота для ферментации Aspergillus niger на средах, приготовленных из сгущенного сока сорго, лучшие результаты получены при использовании цитрата аммония. Необходимая

концентрация солей фосфора должна быть в 4 раза ниже, чем для сред на основе свекловичных меласс (0,04 v/m3) /18/.

Таким образом, на основе сока сорго была разработана простая по составу питательная среда для направленного биосинтеза лимонной кислоты.

Гидролизаты крахмала

В мировой практике промышленно освоенным и экологически чистым углеводсодержащим сырьем для микробиологического синтеза являются гидролизаты крахмала, однако в России исследований по использованию этого сырья для производства лимонной кислоты мицелиальными грибами Aspergillus niger не проводилось. В качестве объектов были выбраны кукурузный и пшеничный крахмалы.

Самым важным этапом исследований был выбор способа подготовки крахмала к ферментации, то есть его разжижения и осахаривания.

По разработанной нами методике при ферментативном способе гидролиза крахмала образуются гидролизаты, которые содержат небольшое количество глюкозы (2—5 г/дм3) и мальтозы (13—15 г/дм3), а основное количество углеводов находятся в форме декстринов (140— 150 г/дм3). Для селекционированных нами штаммов гриба Aspergillus niger субстрате невысокой степенью расщепления полиглюкозидных связей (ДЕ не более 20) наиболее предпочтителен. Объясняется это тем, что Aspergillus niger BKnMF-171, F-326, F-501,F-681 могут синтезировать комплекс кислотостабильных амилолитических ферментов (а-амилазу, глюкоамилазу), которые осуществляют поэтапную биотрансформацию полисахаридов в моносахара, ассимилируемые грибом Aspergillus niger /19/. Как видно из данных, представленных на рис. 4, а-амилаза, катализирующая расщепление декстринов, достигает максимальной активности на 3 сутки биосинтеза, при этом содержание декстринов в среде снижается до остаточных количеств на фоне накопления глюкозы и мальтозы. С третьих суток ферментации начинается синтез глюкоамилазы, максимум ее активности приходится на 5 сутки. Рост активности глюкоамилазы приводит к расщеплению мальтозы — резервного конвертируемого субстрата — до глюкозы, но накопления

глюкозы в среде не происходит из-за ее постоянного потребления продуцентом. Таким образом, для питательных субстратов на основе гидролизатов крахмала для селекционированных штаммов характерен двухфазный цикл расщепления углеводов, что создает предпосылки для более полной их конверсии в лимонную кислоту /20/.

г 0,35

1 2 3 4 5 6 7 Время культивирования, сут.

Рис. 4. Превращения субстрата и синтез амилолитических ферментов при биоконверсии гидролизата крахмала в лимонную кислоту: 1 — декстрины; 2— мальтоза; 3— глюкоамилаза; 4— амилаза; 5— глюкоза

Оптимальным источником азота для питательных сред на основе крахмала является азотнокислый аммоний. Максимальный уровень конверсии углеводов в лимонную кислоту достигнут для кукурузного крахмала при соотношении C/N, равном 75, N/P — 13,5, а для пшеничного, соответственно, 64 и 10,6.

На основе изучения химических и технологических параметров новых видов сырья сформированы требования к новым углевод-содержащим субстратам для биосинтеза лимонной кислоты, применительно к отечественным продуцентам Aspergillus niger (табл. 2,3).

Таблица 2

Контролируемые параметры сырья для производства лимонной

кислоты

Наименование показателей Углеводсодержащие субстраты

тростниково-сахарные мелассы сгущенный сок сорго

Значение рН, единицы рН 5,5—6,0 4,5—5,8

Массовая доля сухих веществ, % 80,0—83,0 55,2—60,4

Массовая доля ферментируемых Сахаров, % 44,0—50,0 43,0—46,0

Массовая доля редуцирующих веществ, % 12,0—18,0 25,0—30,0

Доброкачественность, % 55,0—60,0 76,0—78,0

Массовая доля общего фосфора, в пересчете на Р205, %, не более 0,1—0,2 0,08—0,1

Массовая доля коллоидных веществ, % 10,0—12,0 5,0—6,0

Массовая доля кальция, в пересчете на СаО, % 1,0—1,2 0,6—0,7

Массовая доля железа, в пересчете на Ре203, % 0,03—0,04 0,012—0,015

Плотность, г/см3 1,2—1,6 1,0—1,1

Массовая доля магния, в пересчете на МвО, % 0,2—0,4 0,01—0,014

Количество механических включений и взвесей,% 0,1—0,2 отсутств.

Гарантийный срок хранения без изменения перечисленных параметров, месяцев, не более 6,0 3,0

Сравнительный анализ химических параметров и технологических качеств, определяющих целесообразность использования новых субстратов для ферментации, позволил сырьевые источники в производстве лимонной кислоты разделить на группы по степени их экологической безопасности и влияния на стохастичность процесса ферментации.

Таблица 3

Контролируемые параметры крахмалов для производства лимонной

кислоты

Наименование показателей Углеводсодержащие субстраты

кукурузный крахмал пшеничный крахмал

Массовая доля сухих веществ, % 86,2—88,0 84,0—87,0

Доброкачественность, % 92,0—94,0 90,0—95,0

Массовая доля зольных элементов, % 0,13—0,18 0,4—0,9

Массовая доля протеина, % 1,1—1.3 2,9—5,2

Массовая доля фосфорных соединений в пересчете на Р2О5, % 0,02—0,03 0,04—0,07

Массовая доля мезги, % — 0,2—0,4

Микробная загрязненность, клеток на 1 г, не более 1-Ю6—МО7 1-Ю5—1-Ю7

В первую группу входит сырье, химический состав которого обеспечивал возможность унификации рецептур питательных сред и достижение стабильности процесса биосинтеза. Это субстраты на основе кристаллического сахара и гидролизатов крахмала, являющиеся, кроме того, экологически безопасными.

Вторая группа объединила наиболее широко используемые в настоящее время углеводсодержащие субстраты — свекловичную и тростниковую мелассы, которые имеют сложный и непостоянный состав, что требует тщательного их отбора не только по химическим параметрам, но и по биологической пробе, и, как правило, использования для достижения высоких технико-экономических показателей специальных способов подготовки сырья и технологических приемов активации процесса.

Промежуточное положение занимает сгущенный сок сорго, химические параметры которого исключают применение при приготовлении питательных сред экологически опасных компонентов, но не позволяют в то же время унифицировать состав среды на фоне относительно стабильного процесса биосинтеза.

3. ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОЦЕССА БИОСИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Для успешного управления процессом ферментации штаммов — продуцентов лимонной кислоты необходимо знать механизм биосинтеза, который, несмотря на большое количество исследований, остается недостаточно изученным.

Ключевое значение в механизме биосинтеза играют многочисленные ферменты, синтезируемые продуцентом, однако роль многих из них не исследована в полной мере.

Так, в последние годы было установлено, что цитратсинтаза, ответственная за синтез цитрата, способствует также транспорту последнего из митохондрий в растворимую фракцию клеток, взаимодействуя с белковым переносчиком цитрата (Sandor et all, 1994).

Нами была исследована активность и содержание цитратсинтазы в клетках селекционированных штаммов по сравнению с родительским штаммом 82, а также концентрация синтезированного цитрата в клетках и во внеклеточном пространстве при культивировании продуцента на мелассных, сахарозо- и глюкозоминеральных средах /21,22/.

Исследуемые штаммы — мутанты и рекомбинант, полученные из исходного штамма 82 Aspergillus niger, имели более низкий уровень активности цитратсинтазы на начальных этапах культивирования. Однако, если активность фермента в клетках исходного штамма резко падала после 3-х суток роста гриба, то селекционированные штаммы сохраняли относительно высокий уровень активности цитратсинтазы на протяжении всего процесса их культивирования. Кроме того, скорости секреции и накопления цитрата во внеклеточной среде были намного выше у мутантов и рекомбинанта по сравнению с исходным

штаммом.

Динамика изучаемых биохимических показателей на примере штамма ВКПМ Р-501 при ферментации на гидролизатах крахмала представлена на рис. 5. При культивировании продуцента на гидролизатах крахмала обнаружено, что активность цитратсинтазы достигает максимального уровня уже на первые сутки роста мицелия, далее происходит резкое снижение активности фермента вплоть до трех суток. Возрастание активности цитратсинтазы отмечено на четвертые сутки культивирования со вторым максимумом активности фермента на шестые сутки. Таким образом, первый максимум активности фермента приходится на завершение экспоненциальной фазы роста мицелия, а минимальная ферментативная активность, соответствующая максимальному содержанию лимонной кислоты в культуральной жидкости, -— на стадию ацидогенеза.

Повышение активности цитратсинтазы приводит к резкому увеличению концентрации внутриклеточного цитрата и, соответственно, к усилению процессов секреции последнего в среду культивирования (см. рис. 3, кривая 4)

При культивировании штамма ВКПМ р-501 на сахарозо-минеральной среде динамика уровня активности цитратсинтазы также характеризовалась кривой с двумя максимумами на первые и шестые сутки роста культуры. Как и в предыдущих опытах, максимальная скорость прироста цитрата в культуральной жидкости соответствовала минимальному уровню активности цитратсинтазы.

Определение активности цитратсинтазы в культуральной жидкости дало отрицательные результаты, на основании чего был сделан вывод об отсутствии секреции данного фермента из клеток мицелия. Динамика изменений цитратсинтазной активности и содержания цитрата в культуральной жидкости, представленная для штамма ВКПМ Р-501, в той или иной степени характерна для других изучаемых штаммов, то есть обнаружена коррелятивная зависимость: минимальная активность фермента — максимальное содержание целевого продукта, свойственны как исходному штамму, так и штаммам, полученным в ходе селекции.

3 4

Сутки роста

Рис. 5. Динамика уровня активности цитратсинтазы (1), секреции цитрата (2), концентрации белка (3) и внутриклеточного цитрата (4) в клетках Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501

ÜJ

Более того, установлено, что максимальное содержание секретируемого цитрата коррелирует с его внутриклеточным содержанием (см. рис. 5, кривые 2 и 4). Это дало основание полагать, что избыток субстрата является обратимым ингибитором фермента и стимуляция секреции цитрата восстанавливает цитратсинтазную активность в клетках.

Полученные результаты могут служить основой для разработки новых биохимических методов оценки эффективности биосинтеза лимонной кислоты и поиска путей интенсификации и управления процессом.

Одним из простых путей интенсификации биосинтеза лимонной кислоты в промышленных масштабах при ферментации на мелассных средах является применение различных веществ, стимулирующих кислотообразование продуцента

Анализ литературных источников позволил обосновать целесообразность испытаний ряда веществ с неспецифическим характером воздействия на синтез первичных и вторичных метаболитов на процесс биосинтеза лимонной кислоты.

При поиске веществ, стимулирующих синтез лимонной кислоты, определенный интерес представлял хмель, химический состав которого позволял рассматривать его в качестве потенциального источника биологически активных веществ.

Нами разработан способ получения биологически активных веществ, основанный на экстракции хмеля в водно-щелочной среде с последующим осаждением комплексов соляной кислотой /23/. Проведение экстракции-изомеризации при различных значениях рН, температуры и продолжительности, а также различном количестве щелочи приводит к получению солянокислых фракций горьких веществ хмеля различного состава. Этим методом были получены продукты изомеризации хмеля, названные солянокислыми комплексами «Изргумулон», «Твердые смолы» и «Мягкие смолы». При одинаковых условиях экстракции-изомеризации выход комплексов биологически активных веществ определяется содержанием в хмеле горьких веществ и зависит от качества сырья. Различия в накоплении лимонной кислоты при применении солянокислых комплексов хмеля в

оптимальной дозировке 0,03 г/дм3 обусловлены качественным составом биологически активных веществ. Наибольший стимулирующий эффект по отношению к контролю получен при применении комплекса «Твердые смолы» (до 14,9%), наименьший — при внесении в ферментационную среду комплекса «Мягкие смолы» (не более 5%). Промежуточное положение по эффективности влияния на активность биосинтеза лимонной кислоты занимает комплекс «Изо1умулон» (10%). Важно, что эффект стимуляции биосинтеза лимонной кислоты не зависит от технологического качества мелассы /24, 25/ и достигается за счет повышения суммарной концентрации органических кислот в культуральной жидкости и, в основном, массовой доли лимонной кислоты.

Используемые в производстве лимонной кислоты антибиотики леворин и ЛИА № 0842, как было нами установлено, наряду с предупреждением развития дрожжевого инфицирования субстрата, оказывают положительное влияние на продуцент Aspergillus niger в начальной стадии его роста и развития и позволяют получать посевной мицелий с более высокой жизнеспособностью и продуктивностью по лимонной кислоте/26/. Наибольший эффект достигается при введении антибиотиков в мелассный питательный раствор для выращивания инокулята в количестве 0,00001—0,001 г/дм3 среды в период от 6 до 10 часов после засева спорового материала. Пределы используемых концентраций ограничены, с одной стороны, минимальной ингиби-рующей концентрацией антибиотиков по отношению к дрожжевой микрофлоре (0,00001 г/дм3) и, с другой стороны, максимальной концентрацией антибиотика, не угнетающей активность кислотооб-разования продуцента при однократном введении.

Менее эффективным оказалось введение в исходную питательную среду фосфатидного концентрата — отхода масложировой промышленности. Биосинтетическая активность продуцента при применении фосфатидов в концентрации 2,5—5,0 г/дм3 повышается в среднем на 11% с увеличением биомассы на 6—16% /27/.

Положительные результаты, достигнутые при использовании неионогенного поверхностно-активного вещества Твин 80 в производстве лимонной кислоты (Фишкова, 1978), предопределили

продолжение работ в этом направлении. Нами изучено влияние на биосинтез лимонной кислоты неионогенного ПАВ препарата ОС-20, представляющего собой смесь полиоксиэтиленгликолевых эфиров высших жирных спиртов. Положительный эффект достигается только при определенной концентрации ПАВ 0,04—0,07 г/дм3, более высокие дозировки ингибируют биосинтетическую активность продуцента. Для процесса с добавлением препарата ОС-20 характерно более полное ассимилирование сахарозы субстрата по сравнению с контролем. Ведение ферментации с добавками ПАВ ОС-20 повышает интенсивность кислотообразования на 11 %, выход от сахара на 9% при снижении расхода сырья на производство 1 т целевого продукта на 6,3% /28/.

Совместно с сотрудниками кафедры технологии микробиологического синтеза СПГТИ(ТУ) было исследовано влияние продуктов водно-щелочного окисления керогена сланца, в частности, сланцевых кислот на рост и развитие гриба Aspergillus niger.

В опытах на твердых средах установлено, что добавление в сусло-агар сланцевых кислот в количестве 0,005% от объема среды оказывало положительное действие на процессы набухания и прорастания конидий гриба Aspergillus niger. Так, если через 28 часов культивирования в контроле диаметр конидий составляет 8,5 мкм и только появляются единичные точки роста, то на среде с добавлением сланцевых кислот диаметр конидий достигает 11,5 мкм и уже отмечаются единичные случаи прорастания. Введение сланцевых кислот в концентрации 0,005—0,01% от объема среды на стадии формирования посевной культуры или в первые двое суток ферментации приводит к повышению синтеза лимонной кислоты и снижению биомассы продуцента. Максимальный эффект был достигнут при дозировке 0,001 г/дм3 питательной среды при внесении на 2 сутки процесса. В этом случае выход целевого продукта увеличивается на 25%, доля лимонной кислоты в общем составе органических кислот возрастает на 8,2%, количество биомассы снижается по сравнению с контролем в среднем на 10% /29/. Анализ экспериментальных материалов показал, что увеличение выхода лимонной кислоты на средах с добавлениехМ сланцевых кислот определено рядом составляющих, а именно снижением образования побочных кислот (глюконовой и щавелевой) и расхода субстрата на рост биомассы и

дыхание продуцента.

Проведенными в СПГТИ(ТУ) исследованиями показано, что синтетические сахара (формоза), получаемые путем альдольной конденсации формальдегида, являются источниками углерода для целого ряда культур микроорганизмов, в основном, рода Candida (Сухаревич В. И., 1984).

Использование формозы в качестве субстрата для биосинтеза лимонной кислоты при частичной или полной замене сахарозы мелассы на синтетические углеводы приводит к ингибированию синтеза лимонной кислоты и подавлению роста продуцента. Однако добавление в среду с сусло-агаром формозы в незначительных концентрациях (0,015 г/дм3) способствует ускорению процессов набухания и прорастания конидий гриба Aspergillus niger/30/. Внесение формозы в исходную питательную среду в концентрациях 0,025—0,075 г/дм3 увеличивает биосинтетическую способность продуцента на 20—30% и, что не менее важно, снижает до 11% количество образуемой биомассы продуцента /31—33/. Весьма существенно, что эффект от введения формозы при использовании в качестве сырья плохо ферментируемых меласс в 2 раза выше, чем при ведении процесса на мелассах, отвечающих требованиям производства.

Полученные нами в лабораторных условиях экспериментальные данные по всем исследованным веществам нашли подтверждение в ходе опытно-промышленных испытаний и внедрения технологии получения лимонной кислоты с применением стимуляторов в ферментаторах вместимостью 100 м3 (рис. 6).

Таким образом, в результате исследований был апробирован ряд веществ, относящихся к различным группам органических соединений, на способность активизировать биосинтез лимонной кислоты на мелассных средах. Сложность состава этих веществ не позволяет в настоящее время объяснить механизм их влияния на гриб-продуцент. Однако можно предположить, что такие препараты, как фосфатидный концентрат и солянокислый комплекс «Мягкие смолы» являются типичными стимуляторами роста, так как при их применении большая продуктивность процесса достигается за счет увеличения биомассы продуцента.

кг/(м'- суг) г/дм3 30-

24-

18-

12-

1_

- контроль

шж! - опыт

I

I

зг

1

1

1

%

и « 1 § 1 ! 1

а!

л

1 1

|

в 1

Л 1

« 1

|

с,% -]00

Рис. 6. Показатели биосинтеза лимонной кислоты на мелассных субстратах: А- интенсивность биосинтеза; В - воздушно-сухая биомасса; С- массовая доля лимонной кислоты в сумме органических кислот; 1- сланцевые кислоты; 2 - ПАВ ОС-20; 3 - "Изогумулон"; 4 - "Твердые смолы"; 5- "Мягкие смолы"; 6 - фосфатидный концентрат; 7- формоза

Литературные данные об усилении элиминации целевого продукта из клеток в среду под воздействием синтетических Сахаров при биосинтезе лизина объясняют, в определенной степени, положительные результаты, полученные нами при применении формозы для стимуляции биосинтеза лимонной кислоты. При изучении активности цитратсинтазы нами было показано, что увеличение скорости секреции цитрата в культуральную жидкость восстанавливает цитратсинтазную активность и, как следствие, ведет в повышению синтеза лимонной кислоты.

4. ПРОГРЕССИВНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ПРОИЗВОДСТВЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Производство лимонной кислоты в России до начала 80-х годов базировалось на технологии периодического глубинного культивирования продуцента на мелассных средах и ее разновидности отьемно-доливном методе.

При использовании последнего с каждым новым отъемом культуральной жидкости и новым доливом дополнительного количества питательной среды продуктивность процесса снижалась, возрастала вязкость ферментируемого раствора. Морфологические изменения в клетках мицелия свидетельствовали о процессах старения гриба-продуцента.

УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ ОТЪЕМНО-ДОЛИВНОЙ МЕТОД

ФЕРМЕНТАЦИИ МЕЛАССНЫХ СРЕД (ПАТЕНТ РФ №907072)

Для повышения продуктивности биосинтеза лимонной кислоты при ферментации штамма Aspergillus niger Л-1 на свекловичных мелассах отъемно-доливным методом был разработан способ оптимизации углеводного и минерального питания продуцента/34,35/.

По разработанной схеме к основному концентрированному доливу Сахаров (180—220 г/дм3), осуществляемому в первые 24—72 часа ферментации, вводится 4-х кратная дополнительная подпитка из расчета 30 г/дм3 сахара на каждый долив.

Такое дробное дополнительное углеводное питание должно

обеспечивать поддержание постоянной концентрации сахара в растворе на уровне 17—21 г/дм3. В связи с увеличением длительности процесса ферментации для предотвращения старения мицелия и его возобновления необходимо с каждым доливом вносить хлористый аммоний в количестве одной четверти от исходного.

Для ферментации на мелассных средах с повышенной суммарной концентрацией Сахаров требуется повышение уровня аэрации погруженной культуры для поддержания степени насыщения культуральной среды кислородом на уровне не ниже 60% путем увеличения расхода воздуха в 2 раза.

Применение разработанного способа позволило увеличить интенсивность биосинтеза лимонной кислоты в 1,2 раза и массовую долю лимонной кислоты в сумме органических кислот до 10% по сравнению с периодическим методом ферментации.

Усовершенствованная технология отъемно-доливного метода ферментации внедрена на четырех предприятиях отрасли.

Технологии биосинтеза лимонной кислоты на концентрированных средах

В связи с развитием многотоннажного производства лимонной кислоты действующий технологический процесс биосинтеза лимонной кислоты на мелассных средах с низкой исходной концентрацией Сахаров (25—30 г/дм3) перестал удовлетворять запросам развивающейся отрасли. Появилась необходимость упрощения технологической схемы, исключающей наиболее трудоемкую стадию процесса — долив питательного раствора, а также снижения общего количества производственных отходов — стоков, биомассы отработанного мицелия и энергоемкости процесса в целом.

Селекция новых штаммов — продуцентов для мелассных, сахарозо- и глюкозоминеральных сред, а также разработанные способы подготовки сырья к ферментации позволили создать новые технологии, основанные на ферментации продуцентов лимонной кислоты на средах с повышенной исходной концентрацией углеводов.

Характерной для этих технологий является стадия подготовки посевного материала, которая включает:

— поэтапную адаптацию конидий штаммов к высоким концентрациям Сахаров;

— поддержание более высокого температурного оптимума в период выращивания посевной культуры (37—38°С);

—увеличение длительности формирования кислотообразующего посевного мицелия до 36 часов.

ТЕХНОЛОГИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ НА СВЕКЛОСАХАРНЫХ КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ СРЕДАХ (ПАТЕНТ РФ № 1296580)

Продуцент лимонной кислоты — осмофильный штамм Aspergillus niger ВКПМ F-171. На стадии подготовки спорового материала требуется выдерживание конидий гриба в стандартной сахарозо-минеральной среде с концентрацией Сахаров 100 г/дм3. Для подращивания посевной культуры концентрация углеводов в питательной среде должна быть 50 г/дм3. Основная ферментация осуществляется с исходной концентрацией Сахаров на уровне 120— 200 г/дм3 (против 30 г/дм3 по традиционной технологии) с последующим ведением процесса как в периодическом режиме, так и с применением отьемно-доливного метода/36/. Лимитирующим фактором процесса является снабжение погруженной культуры гриба кислородом, что требует поддержания скорости растворения кислорода в среде на уровне 6—9 г/(дм3-ч).

Технология внедрена в аппаратах вместимостью 100 м3 на двух действующих предприятиях по производству лимонной кислоты и позволяет повысить интенсивность биосинтеза лимонной кислоты в 1,4 раза при снижении удельных затрат на сырье и теплоресурсы на 7% и 15,9% соответственно.

ТЕХНОЛОГИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ НА САХАРОЗОМИНЕРАЛЬНЫХ КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ СРЕДАХ

Продуцент лимонной кислоты — штамм Aspergillus niger ВКПМ F-501. Концентрация Сахаров при ферментации на сахарозоминеральных средах составляет от 100 до 180 г/дм3 /37/. Оптимальная концентрация Сахаров — 150 г/дм3. Особенностями данной технологии по сравнению с технологией на мелассных

средах является использование для выращивания инокулюма среды, обогащенной мелассой (20 г/дм3).

Технология внедрена в производство с высокими технико-экономическими показателями: удельный расход сырья 1,0 т/1,0 т кристаллической лимонной кислоты, конверсия углеводов в лимонную кислоту 95—98%, производительность процесса 14,0— 15,0 кг кислоты/(м3-сут.). Расход электро- и теплоэнергии на 1 т готовой продукции по сравнению с технологией на мелассах ниже на 15%, водопотребление на 30%. Для технологии характерна высокая стабильность процесса. Она является экологически безопасной, исключающей применение химических реагентов, обязательных при переработке свекловичных меласс.

ТЕХНОЛОГИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ НА КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ СРЕДАХ ГИДРОЛИЗАТОВ КРАХМАЛА (ПАТЕНТ РФ №2132384)

Для ферментации на гидролизатах крахмала селекционированы штаммы Aspergillus niger ВКПМ F-501 и F-696.

Полноценная кислотообразующая посевная культура гриба-продуцента получена при плотности засева питательной среды конидиями штаммов не ниже 25 мг на 1 дм3 среды.

Технология предусматривает концентрацию ферментируемых Сахаров в питательной среде в пределах 155±5 г/дм3. Увеличение концентрации свыше 170 г/дм3 приводит к неполной утилизации Сахаров даже при увеличении длительности ферментации.

По данным опытно-промышленных испытаний технология отличается высокой стабильностью. Конверсия углеводов в лимонную кислоту находится на уровне 92—93%, удельный расход сырья не более 1,3 т/т готовой продукции, производительность процесса по лимонной кислоте составляет 12,0—12,5 кг/(м3-сут.). Одновременно решен ряд экологических проблем, так как при подготовке питательных сред и в процессе ферментации исключено применение химически опасных реагентов, что позволяет перейти на экологически безопасный бесцитратный способ выделения лимонной кислоты /38/.

ТЕХНОЛОГИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ НА ТРОСТНИКОВОСАХАРНЫХ МЕЛАССАХ (ПАТЕНТ РФ № 1734373)

Продуцентом для ферментации на тростниковых мелассах был выбран штамм ВКПМ F-326, образующий меньше, чем другие продуценты, биомассы /39/.

Для подращивания посевной культуры и ферментации используют низкоконцентрированные среды (25 г/дм3 по сахару). Оптимальный возраст посевной культуры Aspergillus niger 16—19 часов, увеличение сроков подращивания посевного мицелия ведет к увеличению количества биомассы с пониженной кислотообразующей способностью.

Чтобы снизить расход субстрата на рост биомассы обработку меласс проводят при более высоких дозировках ГЦФК и дополнительно вводят его в культуральную среду в количестве до 200 мг/дм3 по иону ферроцианида на 24—30 час культивирования.

В ходе ферментации осуществляют подпитку погруженной культуры гриба растворами, обеспечивающими постоянную концентрацию Сахаров на уровне 8,0 г/дм3 культуральной среды, что значительно выше, чем при ферментации на свекловичных мелассах.

Принципиальное значение для жизнедеятельности продуцента в условиях культивирования на тростниковых мелассах имеет минеральное питание, что достигается заменой традиционного источника азота в виде соли NH4C1 на азотнокислый аммоний (1,2— 1,7 г/дм3) и дополнительным введением хлористого калия (0,25 г/дм3). Концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде при ферментации тростниковых меласс поддерживают на более высоком уровне (75—80% от насыщения).

При производственных испытаниях двух образцов тростниковых меласс (кубинской и индийской) получены положительные результаты: интенсивность биосинтеза лимонной кислоты — 7,5 кг/(м3 в сут.); удельный расход сырья — 3,4 т/т; массовая доля лимонной кислоты в сумме кислот—85%. При выделении лимонной кислоты по нитратному способу получена кислота, отвечающая требованиям ГОСТ 908—79 сорт экстра.

Разработанная технология была принята для проектирования завода лимонной кислоты мощностью 5,0 тыс. т в республике Куба.

ТЕХНОЛОГИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ НА СРЕДАХ ИЗ СГУЩЕННОГО СОКА СОРГО (ПАТЕНТ РФ №2084530)

Продуцент лимонной кислоты—штамм Aspergillus niger ВКПМ F-719.

Полноценная посевная культура на среде из сока сорго формируется на 34—36 час. Количество посевного мицелия, переводимого на основную ферментацию, составляет 5% от объема питательной среды, что вдвое ниже, чем на мелассных средах.

Оптимальной для данного вида сырья является технология 3-х стадийного периодического процесса с подпиткой продуцента.

Концентрация ферментируемых Сахаров в среде составляет: в период выращивания вегетативного посевного мицелия — 30 г/дм3, на основную ферментацию — 50 г/дм3, для подпитки гриба —160 г/дм3.

В период ферментации в культуральной среде поддерживается постоянная концентрация остаточных Сахаров на уровне 3,5—6,0 г/дм3, что выше, чем при ферментации на свекловичных мелассах /40/.

Опытные ферментации на сгущенном соке сорго в полупромышленных условиях показали достаточно высокую эффективность процесса: уровень конверсии углеводов в лимонную кислоту—81,7%, производительность — 11,0 кг к-ты/(м3-сут), массовая доля лимонной кислоты в сумме органических кислот — 95,9%.

Разработана нормативно-техническая документация с аппара-турно-технологической схемой и спецификацией оборудования на опытное производство мощностью 1000 т лимонной кислоты в год.

Технология непрерывного процесса биосинтеза лимонной кислоты в батарее аппаратов на основе двухстадийного

хемостата

Непрерывное культивирование микроорганизмов нашло применение в тех отраслях микробиологической промышленности, где в качестве продуцентов используются бактериальные и дрожжевые культуры. Исследования по непрерывному культивированию

мицелиальных грибов Aspergillus niger, начатые с середины 70-х годов (Журавский и др., 1971; Бережной, 1976), не вышли за рамки лабораторных и опытных циклов.

Мониторинг мицелиальных грибов показал, что Aspergillus niger относится к медленно растущим культурам и один из основных показателей роста — время удвоения биомассы составляет от 10 до 98 часов в период со 2 по 5 сутки культивирования. Кроме того, массовая доля лимонной кислоты в сумме кислот резко возрастает только к 4 суткам процесса (82%). Поэтому именно с 4-х суток ферментации целесообразен перевод культуры в режим непрерывного культивирования. Эти показатели процесса были приняты при изучении закономерностей развития продуцента на мелассных средах в батарее из 2,3 и 4 аппаратов на основе двухстадийного хемостата.

В условиях непрерывного культивирования постоянство содержания основного лимитирующего фактора — сахарозы и стабильность физиологического состояния продуцента поддерживают технологическим приемом — отводом культуральной жидкости из основного аппарата в аппарат второй стадии в количествах, обеспечивающих концентрацию сахара в основном аппарате на уровне 9—12 г/дм3, в аппарате второй стадии в пределах 2—4 г/дм3.

Однако при ферментации продуцента Aspergillus niger в режиме классического двухстадийного хемостата наблюдается снижение активности биосинтеза лимонной кислоты по сравнению с периодическим и отьемно-доливным способами в среднем на 28,6%. При этом, в аппарате второй стадии происходит интенсивное потребление Сахаров, поэтому требуется периодическое дополнительное введение мелассного раствора, что, в конечном итоге, приводит к увеличению удельного расхода сырья на 19,1% по сравнению с технологией периодического культивирования.

Анализ экспериментальных данных показал, что наиболее эффективным является ведение процесса непрерывного культивирования в батарее из 4-х аппаратов. Активность биосинтеза лимонной кислоты в этом случае выше на 81,7% по сравнению с процессом в батарее из двух ферментаторов и на 19,4% по сравнению с батареей из 3-х аппаратов.

Полученные результаты были приняты в качестве исходных данных для разработки математической модели непрерывного процесса биосинтеза лимонной кислоты в режиме двухстадийного хемостата в батарее аппаратов /41/. Удовлетворительные качественные и количественные совпадения кинетических кривых модели и экспериментальных данных достигнуты для характерных условий опыта: концентрация Сахаров в питательном растворе для подпитки — 180 г/дм3, количество основных ферментаторов— 3, скорость разбавления 0,00467 ч1.

Адекватность модели, в которой количество аппаратов в батарее является независимой переменной, подтверждена сравнением с экспериментальными данными, полученными на опытной установке двухстадийного хемостата и на промышленных ферментаторах вместимостью 100 м3.

При реализации разработанной технологии в промышленном масштабе по сравнению с периодическим культивированием достигнуто увеличение интенсивности кислотообразования с единицы ферментационного объема в 1,2 раза, снижение удельного расхода сырья на 20,6% и ГЦФК на 30%.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан ряд новых промышленных технологий для биосинтеза лимонной кислоты на различных питательных средах, что позволяет осуществлять ферментацию в режиме гибкого технологического процесса в зависимости от наличия, качества и стоимости того или иного сырья и, в конечном итоге, обеспечивать поддержание себестоимости целевого продукта — лимонной кислоты на конкурентноспособном уровне.

Полученные в ходе выполнения данной работы экспериментальные данные по новым технологиям и методам контроля введены в отраслевую нормативную документацию /42,43/.

Результаты внедрения новых технологий производства лимонной кислоты (1980 — 1998 гг.)

В развитии глубинного способа производства лимонной кислоты в нашей стране можно выделить два этапа. На первом этапе,

охватывающем период с 1961 по 1980 г., единственным сырьем для ферментации была свекловичная меласса, продуцентом служил Aspergillus niger штамм JI-1, а технология базировалась на низкоконцентрированных средах.

Второй этап (1980—1998 гг.) характерен тем, что в этот период были селекционированы и внедрены новые эффективные штаммы Aspergillus niger, позволяющие осуществлять ферментацию на различном сырье (сахар, тростниковая и свекловичная мелассы, гидролизаты крахмала, сок сорго) в широком диапазоне исходной концентрации Сахаров (30,0—200,0 г/дм3) с использованием различных технологий.

Анализ развития производства лимонной кислоты в России и странах СНГ в 1980—1998 годах выявил преимущества как глубинного способа культивирования, так и новых научно-обоснованных биотехнологических решений.

Если в 1980 году было выработано 15 тыс. тонн кристаллической лимонной кислоты, в том числе глубинным способом ферментации — 7,5 тыс. т (50%), то в 1985 году доля лимонной кислоты, полученной глубинным способом, увеличилась до 55 %, причем 47,8% прироста достигнуто за счет внедрения новых технологий. В 1990 году в общем объеме выпуска лимонной кислоты 18,8 тыс. т — 59% приходится на глубинный способ, причем 53,8% прироста является результатом внедрения НИР. В период 1991—1998 гг. доля лимонной кислоты, полученной глубинным способом, выросла до 82,5%, причем 64,8% прироста получено за счет реконструкции действующих производств, а 35,2% — за счет внедрения новых разработок.

Удельный расход сырья — мелассы на 1 т лимонной кислоты сократился с 4-х т в 1980 г. до 2,5 т в 1998 г., причем все снижение расхода сырья произошло за счет внедрения новых штаммов и технологий.

Съем лимонной кислоты с 1 м3 объема ферментатора на мелассных средах вырос за 1981 — 1998 гг. с 7,3 кг/(м3-сут.) до 12,0 кг/(м3-сут.), при этом 86% прироста приходится на внедрение новых технологических решений.

В 1980 году производственная мощность заводов лимонной

кислоты использовалась всего на 69,4%. К 1995 году уровень использования производственных мощностей достиг 100%.

Выполненный цикл исследований привел к созданию стабильных многофункциональных ресурсосберегающих технологий, которые являются реальной основой для создания гибких универсальных комплексов по производству лимонной кислоты /44/.

ВЫВОДЫ

1. Комплекс выполненных исследований позволил научно обосновать создание ряда новых эффективных технологий производства лимонной кислоты, основанных на глубинном культивировании продуцента в периодическом и непрерывном режимах и внедрить научные разработки на действующих промышленных предприятиях с высоким экономическим эффектом в промышленных и опытно-промышленных масштабах.

2. Получены эффективные штаммы — продуценты лимонной кислоты традиционными и современными методами селекции гриба Aspergillus niger, адаптированные к ферментации на питательных средах, получаемых из различных источников углерода — свекловичной и тростниковой мелассы, кристаллического сахара, гидролизатов крахмала и сока сорго.

3. Разработаны условия и проведено генотипирование селекционированных штаммов Aspergillus niger методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами. Установлено, что наиболее значительные отличия характерны для родительского штамма 82, а у селекционированных штаммов индукция генов, ответственных за синтез и секрецию лимонной кислоты, не связана со значительной перестройкой их геномов. Выявленные УП-ПЦР маркеры позволят проводить идентификацию, паспортизацию и мониторинг мицелиальных грибов—продуцентов лимонной кислоты.

4. Установлено, что изменение активности фермента цитрат-синтазы в процессе культивирования штаммов Aspergillus niger имеет фазный характер, снижение которой обусловлено накоплением внутриклеточного цитрата — ингибитора активности и синтеза

цитратсинтазы. Полученные результаты являются основой для разработки новых методов биохимического контроля и управления процессом биосинтеза лимонной кислоты.

5. Создана база данных химических и биохимических показателей углеводсодержащего сырья, на основе которой сформулированы требования к новым источникам сырья для микробиологического производства лимонной кислоты.

6. Разработаны способы подготовки к ферментации новых для отечественного производства источников сырья (тростниковосахарные мелассы, сок сорго, крахмал), которые являются перспективными для организации малотоннажных и крупнотоннажных производств лимонной кислоты. Предложены пути снижения экологической нагрузки при ферментации традиционных мелассных сред за счет применения концентрированных по сахару питательных сред и электрофизической очистки исходного сырья.

7. Для интенсификации биосинтеза лимонной кислоты продуцентом при ферментации на мелассных средах предложен ряд веществ, оказывающих стимулирующий эффект на его биосинтетическую способность («сланцевые кислоты», «Формоза», антибиотики, солянокислые комплексы «Изогумулон» и «Твердые смолы»). Найдены вещества, стимулирующие рост биомассы гриба (фосфатидный концентрат, солянокислый комплекс «Мягкие смолы»), применение которых целесообразно только для меласс, на которых ингибируется формирование и развитие продуцента.

8. Широкомасштабное внедрение селекционированных штаммов Aspergillus niger, новых технологических приемов и ресурсосберегающих, экологически безопасных технологий позволило обеспечить конкурентоспособность отечественного производства в современной рыночной экономике по основным технико-экономическим показателям и увеличить объем выпуска пищевой лимонной кислоты глубинным способом в России и в странах СНГ в 2,4 раза.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ НАУЧНОГО

ДОКЛАДА

1. Никифорова Т. А., Щербакова Е. Я. Продуценты пищевой лимонной кислоты для культивирования в глубинных условиях: Обзор инф. АгроНИИТЭИПП. — 1995, вып. 2. — С. 1—21.

2. Щербакова Е. Я., Никифорова Т. А. Метод гибридизации прото-трофных штаммов Aspergillus niger—продуцентов лимонной кислоты// Вестник Российской академии с/х наук. — 1995.— № 3. — С. 65—66.

3. Никифорова Т. А., Щербакова Е. Я. Селекция, биологические свойства митотических диплоидов Asp. пщег//Хранение и переработка сельхозсырья. — 1997. — № 2. — С.51—53.

4. А. с. 1609150 СССР, МКИ5 С 12 1/14, С 12 Р 7/48. Штамм гриба Aspergillus niger — продуцент лимонной кислоты/В. П. Ермакова, В. М. Голубцова, В. М. Финько, Т. А. Никифорова, Ю. Р. Мовчан, В. Н. Жданова (СССР). — № 4657333; Заявл. 27.12.88; Опубл. 23.11.90, Бюл. № 43.

5. Пат. 1811697 СССР, МКИ5 С 12 1/14, С 12 Р 7/48. Штамм гриба Aspergillus niger — продуцент лимонной кислоты/В. М. Голубцова, В. П. Ермакова, Е. С. Минц, Т. А. Никифорова, А. В. Галкин, В. М. Финь-ко,В. Н.Жданова (СССР).—№4916539; Заявл. 05.03.91; Опубл. 23.04.93, Бюл. № 15.

6. Пат. 2089615 РФ, МКИ5 С 12 Р 7/48, С 12 1/14. Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-681 —продуцент лимонной кислоты/Е. Я. Щербакова, Т. А. Никифорова, А. В. Галкин, В. Н. Жданова, Л. Н. Мушникова (РФ). — № 93048665/31; Заявл. 29.10.93; Опубл. 10.09.97, Бюл. № 25.

7. Пат. 2078810 РФ, МКИ6 С 12 1/14, С 12 Р 7/48. Штамм гриба Aspergillus niger ВКПМ F-696 — продуцент лимонной кислоты/ Е. Я. Щербакова, Т. А. Никифорова, А. В. Галкин, В. Н. Жданова, В. М. Финько (РФ).—№94031050; Заявл. 02.08.94; Опубл. 10.05.97, Бюл. №13.

8. Пат. 2088658 РФ, МКИ6 С 12 1/14, С 12 Р 7/48 (С 12 1/14, С 12 1/ 85). Штамм гриба Aspergillus niger — продуцент лимонной кислоты/ Н. В. Красикова, Т. А. Никифорова, А. В. Галкин, В. М. Финько (РФ). — № 95116715/13; Заявл. 27.09.95; Опубл. 27.08.97, Бюл. № 24.

9. Никифорова Т. А., Щербакова Е. Я. Штаммы Aspergillus niger— продуценты лимонной кислоты//Хранение и переработка сельхозсырья. — 1997.—№ 6. — С.25—28.

10. Никифорова Т. А., Комов В. П. Геиотипирование штаммов продуцентов лимонной кислоты/ТХранение и переработка сельхозсырья. — 1998,— № 9. — С. 24—25.

11. Мушникова JI. Н., Никифорова Т. А., Позднякова Т. А., Галкин А. В. Взаимодействие гексацианоферрата калия с компонентами мелассы при подготовке ее к ферментации в лимонную кислоту//Вестник Российской академии с/х наук. — 1995. — №8. — С. 67—68.

12. A.c. 1693054 СССР, МКИ5 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/В. С. Андреев, Л. А. Сергеева, Е. Б. Львова, Л. А. Лыкова, Т. А. Никифорова, Ю. Р. Мовчан (СССР). — № 4875408; Заявл. 07.03.89; Опубл. 23.11.91, Бюл. № 43.

13. Лыкова Л. А., Галкин А. В., Чернышкова Н. М., Никифорова Т. А. Влияние электрофизической очистки меласс на их физико-химические показатели//Хранение и переработка сельхозсырья. — 1995. — № 8. — С. 12—13.

14. Никифорова Т. А., Мушникова Л. Н., Галкин А. В. Тростниковая меласса—сырье для производства пищевой лимонной кислоты//Хране-ние и переработка сельхозсырья. — 1996. — № 2. — С. 30—31.

15. Никифорова Т. А., Львова Е. Б., Выборнова Т. В. Подготовка тростниково-сахарных меласс к ферментации в лимонную кислоту// Вестник Российской академии с/х наук. — 1997. — № 4. — С. 77—79.

16. Мушникова Л. Н., Никифорова Т. А., Галкин А. В., Позднякова Т. А., Кричман Е. С., Выборнова Т. В. Биоконверсия концентрированного сока сорго в лимонную кислоту//Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования: Тез. докл. I междунар. симп. Пущино, 1—5 августа 1995. — Пущино, 1995. — С. 679—680.

17. Никифорова Т. А., МушниковаЛ. Н., Выборнова Т. В. Концентрированный сок сорго — новое экологически чистое сырье для производства лимонной кислоты//Всероссийская научно-производственная конференция по интродукции растений: Тез. докл. — Пенза, 1998,—С. 87—88.

18. Galkin А. V., Nikiforova Т. А., Mousnikova L. N. Carbohydrate — containing plants as raw materials for citric acid production//HellriegeI-Konferenz, Kurzrefferate. — Bernburg. Deutschland. — 1995. — V.2.

19. Никифорова Т. А.,БрикН. Ю., МушниковаЛ. H.,ШароваН. Ю. Некоторые особенности биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту/ТРесурсосберегающие технологии пищевых производств: Тез.

докл. Международной научно-технической конференции, 28—29 апреля 1998. — СПб, 1998.— С. 181—182.

20. Никифорова Т. А., БрикН. Ю.,МушниковаЛ. Н., ШароваН. Ю., Выборнова Т. В. Роль экзогенных амилолитических ферментов Asp. niger при биосинтезе лимонной кислоты на гидролизате крахмала// Хранение и переработка сельхозсырья. — 1999. — № 9. — С. 17—18.

21. Никифорова Т. А., Комов В. П. Сравнительная оценка активности цитратсинтазы и образования цитрата мицелиальными грибами Asp. niger на гидролизатах крахмала//Хранение и переработка сельхозсырья,— 1998,—№ 10.— С. 17—18.

22. Никифорова Т. А., Мушникова Л. Н., Позднякова Т. А., Комов В. П., Кириллова Н. В., Смирнова М. Г. Активность цитратсинтазы в клетках мицелиальных грибов Asp. niger при культивировании на различных углеводсодержащихсубстратах//Хранение и переработка сельхозсырья — 1999.— № 4,— С. 32—34.

23. А. с. 1092944 СССР, МКИ3 С 12 С 3/00, С 12 1/38. Способ получения комплекса биологически активных веществ хмеля/

B. Ф. Турецкая, Т. А. Никифорова, Е. Б. Львова, И. В. Аглиш, Л. А. Лыкова, Е. А. Павлова, Ю. Р. Мовчан, Н. М. Чернышкова (СССР). —№ 3415039; Заявл. 28.03.82; Опубл. 15.06.84, Бюл. № 18.

24. А. с. 1011684 СССР, МКИ3 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/Т. А. Никифорова, В. Ф. Турецкая, И. В. Аглиш, Е. Б. Львова, Е. А. Павлова, Л. А. Лыкова, Ю. Р. Мовчан, Н. М. Чернышкова (СССР). — № 3375843; Заявл. 29.12.81; Опубл. 15.04.83. Бюл. №14.

25. Никифорова Т. А., Павлова Е. А.,ГурецкаяВ. Ф.,ЛыковаЛ. А. Стимуляция кислотообразования гриба Aspergillus niger/Повышение эффективности производства пищевых кислот: Тр. ЛенНИИ пищ. промышленности. —Л., 1985. — С. 55—65.

26. Пат. 1285787 РФ, МКИ4 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/Э. С. Фишкова, Е. Б. Львова, Т. А. Никифорова, И. Г. Гома, М. А. Малков (РФ). —№3810314; Заявл.05.11.84; Опубл. 23.01.87, Бюл. №3.

27. Никифорова Т. А., Аглиш И. В., Львова Е. Б., Мовчан Ю. Р., Хрущева И. М., Лыкова Л. А. Интенсификация процесса биосинтеза лимонной кислоты при культивировании гриба продуцента—Asp. niger в глубинных условиях//Вопросы биохимии и физиологии микроорганизмов: Сб. тр. Саратовского университета. —Саратов, 1982. —

C. 31—38.

28. Никифорова Т. А., ФишковаЭ. С., Лыкова JI. А., Львова Е. Б. Влияние поверхностно-активных веществ на биосинтез лимонной кислоты глубинной культурой Asp. nigerZ/Получение и применение регуляторов роста: Межвуз. сб. научн. тр./ЛТИ им. Ленсовета. — Л., 1986, —С. 94—100.

29. A.c. 875850 СССР, МКИ3 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/Е. Б. Львова, Н. В. Красикова, Т. А. Никифорова, В. И. Сухаревич, В. И. Яковлев, И. В. Аглиш, Е. А. Волкова, Т. Ф. Чубарова, И. М. Хрущева, Р. Г. Хмелинина, В. Б. Кохановский, Т. Д. Беликова, И. Д. Дашковский (СССР). — № 2943134; Заявл. 19.06.80; Опубл. 23.10.81, Бюл. № 39.

30. Никифорова Т. А., Хрущева И. М., Львова Е. Б., Медведева Н. Г. Действие препарата формоза на активность прорастания конидий гриба Asp. niger—продуцента лимонной кислоты и кислотообразование при культивировании на твердых средахУ/Получение и применение регуляторов роста. Регуляторы роста микроорганизмов: Межвуз. сб. тр.— Л.: 1982. —С. 27—31.

31. Никифорова Т. А., Львова Е. Б., СухаревичВ. И., Аглиш И. В., Лыкова Л. А., Мовчан Ю. Р., Хрущева И. М., Медведева Н. Г. Влияние формозы на биосинтез лимонной кислоты глубинной культурой Asp. niger//n^y4eHiie и применение регуляторов роста. Регуляторы роста микроорганизмов: Межвуз. сб. тр. — Л.: 1982. — С. 35—37.

32. A.c. 837065 СССР, МКИ3 С 1/38. Способ получения биомассы/ В. И. Сухаревич, Е. И. Глибин Е.И., Н. П. Дивова, P. X. Кутуев, Н. Г. Медведева Н. Г., В. И. Яковлев, Е. Б. Львова, Т. А. Никифорова, И. М. Васили-нец, Г. А. Вилявдо, И. В. Аглиш, Л. А. Лыкова (СССР).— № 2681987; Заявл. 30.10.78; Опубл. 17.08.81, Бюл. №21.

33. Никифорова Т. А., Сухаревич В. И. Повышение эффективности биосинтеза лимонной кислоты при культивировании продуцента Asp. niger в глубинных условиях//Биотехнология. — 1985. — № 1, —С. 68—70.

34. Пат. 907072 РФ, МКИ3 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/ И. В. Аглиш, Е. Б. Львова, Ю. Р. Мовчан, Т. А. Никифорова, И. Г. Гома, В. А. Борисович, И. М. Хрущева, Л. А. Лыкова, Е. И. Чульский (РФ). —№2970187; Заявл. 30.08.80; Опубл. 23.02.82.

35. Аглиш И. В., Львова Е. Б., Никифорова Т. А., Хрущева И. М., Лыкова Л. А., Чернышкова Н. М. Интенсификация биосинтеза лимонной кислоты при отъемно-доливном культивировании//

Хлебопекарная и кондитерская промышленность. — 1984. — № 9. — С. 36—38.

36. Пат. 1296580 РФ, МКИ4 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/Е. Б. Львова, И. В. Аглиш, Т. А. Никифорова, Т. В. Вы-борнова, А. А. Штень, Б. А. Шапошник (РФ). — № 3816568; Заявл. 26.11.64; Опубл. 15.03.67, Бюл. № 10.

37. Никифорова Т. А. Развитие отечественной биотехнологии лимонной кислоты//Вестник Российской академии с/х наук. — 1996. — №5, —С. 9—11.

38. Патент 2132384 РФ, МПК6С 12 Р 7/48,1/14. Способ получения лимонной кислоты/Т. А. Никифорова, Е. П. Назарец, Л. Н. Мушникова, И. Н. Воронова, А. В. Галкин, Т. А. Позднякова (РФ). — № 96120611; Заявл. 08.10.96; Опубл. 27.06.99, Бюл. № 18.

39. Пат. 1734373 РФ, МКИ5 С 12 Р 7/48. Способ получения лимонной кислоты/Т. А. Никифорова, Е. Б. Львова, Л. А. Лыкова, Т. В. Выборнова, Н. М. Чернышкова(РФ).—№470602; Заявл. 19.06.89; Опубл. 10.11.95, Бюл. №31.

40. Пат. 2084530 РФ, МКИ6 С 12 Р 7/46. Способ получения лимонной кислоты/Л. Н. Мушникова, Т. А. Никифорова, А. В. Галкин, Н. А. Туник,Т. А. Позднякова (РФ).—№94041280/13;Заявл. 15.11.84; Опубл. 20.07.87, Бюл. № 20.

41. Никифорова Т. А., Львова Е. Б., Гуревич М. А. Математическое моделирование процесса биосинтеза лимонной кислоты// Доклады Российской академии с/х наук. —1998. — № 4. — С. 44—46.

42. ВасилинецИ. М., НовотельноваН. Я., Мушникова Л. Н., Никифорова Т. А., Минц Е. С., Аглиш И. В., Гайдей Л. А., Петрова Л. Ф., Фишкова Э. С., Юрченко Р. А., Шевцова Т. П., Тарабарова Г. Н., Хрычев Г. А. Технологическая инструкция по производству пищевой лимонной кислоты. — Л., 1981. — С. 1—-130.

43. Галкин А. В., Никифорова Т. А., Красикова Н. В., Львова Е. Б., Мушникова Л. Н., Новотельнова Н. Я., Фейлик Е. А. Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты. — С-Пб., 1997. — С. 1—268.

44. Никифорова Т. А., Гуревич М. А., Рябчеев А. К, Развитие системы технологических процессов и оборудования крупнотоннажного производства лимонной кислоты//Хранение и переработка сельхоз-сырья. — 1998. — № 4. — С. 26—28.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора технических наук, Никифорова, Татьяна Алексеевна, Санкт-Петербург

-о

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

На правах рукописи

НИКИФОРОВА ТАТЬЯНА АЛЕКСЕЕВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

03.00.23 —-Биотехнология

Диссертация

в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора технических наук

Санкт-Петербург 1999

5650 -00

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте пищевых ароматизаторов, кислот и красителей (ВНИИПАК) Российской академии сельскохозяйственных наук

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки и техники РФ, член-корр. РАСХН, д. т. н., профессор

Доктор технических наук

наук,

профессор

Устинников Борис Алексеевич

Свентицкий Евгений Николаевич

Яковлева---------------

Елена Павловна

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная Академия холода и пищевых технологий

1999 г. в /0 часов на

Защита состоится « ¿0» заседании диссертационного совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете) по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26.

С диссертацией в форме научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербругского государственного технологического института (технического университета) по адресу: 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26.

Замечания и отзывы по данной работе в одном экземпляре, заверенные печатью, можно присылать по адресу 198013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26.

Диссертация в форме научного доклада разослана «о0> X 1999 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета О^с^ Лисицкая Т. Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из направлений современной промышленной биотехнологии является микробиологическое производство органических кислот, полифункциональные свойства которых предопределяют широкую сферу их применения в различных направлениях народного хозяйства. Важнейшая среди них — лимонная кислота, применяемая в пищевой и перерабатывающей промышленности в качестве подкислителя, антиоксиданта и консерванта, с момента организации ее производства в нашей стране (1935 г.) является дефицитным продуктом, спрос на который постоянно растет.

В связи с этим, развитие научных основ микробиологического производства и регуляции биосинтеза лимонной кислоты дает возможность осуществлять целенаправленную и научно обоснованную политику в области технологии и сырьевых ресурсов для производства лимонной кислоты.

Отсутствие системного, научно-регламентированного подхода к выбору эффективных штаммов — продуцентов лимонной кислоты, ферментации разного по качеству традиционного и нового сырья, созданию оптимальных технологий глубинного культивирования предопределили необходимость научных исследований в этом направлении.

Представленная работа направлена на изучение мицелиальных грибов Aspergillus niger — продуцентов лимонной кислоты, а также условий их ферментации, влияющих на эффективность биосинтеза лимонной кислоты и выход целевого продукта.

В связи с этим создание новых высокопродуктивных штаммов— продуцентов лимонной кислоты, поиск новых источников сырья и разработка научно-обоснованных технологических приемов подготовки питательных сред к ферментации, поиск эффективных регуляторов биосинтеза и внедрение новых технологий в промышленность становятся актуальными.

Исследования выполнены в рамках важнейших отраслевых заданий МПП СССР, проектов Федеральной научно-технической

подпрограммы «Перспективные процессы в перерабатывающих отраслях АПК» Министерства науки и технологий РФ и НТП программы Россельхозакадемии на период 1992—2000 гг. «Перспективные экологически безопасные технологии и комплексная переработка сельскохозяйственной продукции».

Цель и задачи работы

Цель работы. Разработать высокоэффективные конкурентно-способные технологии производства лимонной кислоты на основе научно-обоснованных подходов к выбору штаммов — продуцентов и подготовке различного углеводсодержащего сырья к ферментации.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

1. Провести селекцию штаммов — продуцентов лимонной кислоты гриба Aspergillus niger и раскрыть потенциальные возможности селекционированных штаммов.

2. Изучить новые источники сырья для культивирования Aspergillus niger, обеспечивающие целенаправленный синтез лимонной кислоты и разработать методы подготовки сырья к ферментации.

3. Найти пути интенсификации процесса биосинтеза лимонной кислоты в процессе ферментации Aspergillus niger и изучить биохимические закономерности влияния субстрата на продуктивность биосинтеза.

4. Разработать технологии ферментации селекционированных штаммов — продуцентов лимонной кислоты на различных средах с целью создания гибкого технологического процесса.

Научная новизна

Научно обоснованы принципы и методы селекционной работы с продуцентом лимонной кислоты—мицелиальным грибом Aspergillus niger для получения эффективных штаммов—продуцентов лимонной кислоты.

Впервые проведено генотипирование промышленных и вновь селекционированных штаммов Aspergillus niger методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами, что дает возможность осуществлять идентификацию и мониторинг мицелиальных проду-

центов лимонной кислоты. Изучена активность фермента цитрат-синтазы при культивировании селекционированных штаммов Aspergillus niger на сахарозо-, глюкозоминеральных и мелассных средах. Установлена коррелятивная зависимость между содержанием внутри-и внеклеточного цитрата. Предложен механизм инактивации цитратсинтазы избытком цитрата.

Сформулированы требования к новым видам сырья. Установлены их химические и технологические параметры, которые позволяют определить конкретные условия культивирования продуцента, обеспечивающие направленный синтез лимонной кислоты.

Разработана математическая модель непрерывного процесса биосинтеза лимонной кислоты в режиме одно- и двухстадийного хемостата, адекватность которой подтверждена экспериментальными данными, полученными на промышленных ферментаторах.

Найдены пути повышения интенсивности биосинтеза лимонной кислоты при промышленной ферментации на мелассных средах путем применения ряда природных и синтезированных стимуляторов кислотообразования и роста продуцентов.

Новизна результатов научных исследований подтверждена 6 авторскими свидетельствами и 10 патентами СССР и РФ.

Практическая ценность и промышленная реализация

результатов исследований

Получены высокопродуктивные штаммы Aspergillus niger—продуценты лимонной кислоты для различных видов сырья, зарегистрированные во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и хранящиеся в музее ВНИИПАКК.

Разработаны новые технологии ферментации селекционированных штаммов на питательных средах, полученных на основе свекловичных и тростниковых меласс, крахмала и сока сорго в широком диапазоне исходной концентрации углеводов. Предложенные технологии дают возможность работать в режиме гибкого технологического процесса в зависимости от качества, наличия и стоимости сырья. Разработаны технологические приемы, позволяющие использовать в промышленном масштабе сырье различного технологического качества.

Решен ряд экологических проблем путем снижения или полного исключения при подготовке питательных сред экологически опасных реагентов и перехода на экологически чистое сырье.

Результаты работы внедрены в период 1981—1998 гг. на предприятиях отрасли: Белгородском, Ленинградском и Дигорском заводах лимонной кислоты (РФ), Харьковском и Смелянском 3JTK (Украина), Скидельском ЗЛК (Белоруссия) и Гырбовском 3JIK (Молдова) общим объемом 15,0 тыс. тонн лимонной кислоты в год.

Проведенные научные исследования позволили решить ряд практических задач, связанных со снижением расхода сырья, повышением производительности цехов ферментации и снижением себестоимости продукции, что явилось основанием для включения новых технологических решений в отраслевую техническую документацию.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования являлись мицелиальные грибы Aspergillus niger из коллекции культур ВНИИПАКК. В ходе селекционной работы изучена морфологическая изменчивость и биохимическая активность более трех тысяч мутантов. В селекционной работе использованы методы индуцированного мутагенеза, вегетативной гибридизации и слияния протопластов под воздействием ферментов различного происхождения в сочетании со стабилизирующим ступенчатым отбором и др.

Экспериментальный материал собран при изучении продуцента Aspergillus niger в условиях культивирования на качалках в колбах емкостью 750 см3, на установке управляемого культивирования АК-210 в аппаратах вместимостью 10 дм3, в ферментаторах мешал очного типа вместимостью 30 дм3 и в производственных ферментаторах вместимостью 50 м3 и 100 м3.

Для получения клеточных лизатов и амплификации геномной ДНК использован метод Булата и сотр. (1992). Агарозный и неденату-рирующий ПААГ — электрофорезы выполнены по методу Sambrook et all. (1989). Активность цитратсинтазы определена в гомогенатах клеток, отобранных в различные фазы развития культуры по методу Srere et all. (1963) с некоторой модификацией.

Микро- и макроэлементный состав сырья, минеральных элементов и питательных сред выполнен на спектрографе ДФС-13 и квантометре МФС-4, индивидуальные моносахара — на газохроматографе Vista 6500.

За основу количественного определения ионов ферроцианида был взят метод Майера и Кларка, который был модифицирован применительно к условиям подготовки меласс к ферментации.

Исследования математической модели биосинтеза осуществлены на аналоговом вычислительном комплексе АВК-32.

Апробация работы

Основные материалы по выполненным исследованиям были доложены на следующих конференциях и семинарах:

Всесоюзное совещание «Основные направления интенсификации технологических процессов в производстве пищевых кислот» (п. Фрунзе, Молдова, 18—20 июня 1985 г.).

Всесоюзное совещание «Направления интенсификации производства пищевых кислот, создание безотходных технологий» (г. Смела, 30—31 мая 1989 г.).

Всесоюзный семинар «Опыт работы предприятий по освоению новой техники и перспективные направления интенсификации и развития производства пищевых кислот» (г. Белгород, 11—12 июня 1991 г.).

Международная конференция, г. Бернбург (ФРГ), 4—10 сентября 1995 г.

Республиканский семинар «Интенсификация и автоматизация технологических процессов обработки пищевых продуктов» (г. Москва, 30 июня 1998 г.).

Результаты работы были доложены на заседаниях научно-технических Советов Минпищепрома СССР, Госагропрома СССР и Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции РАСХН.

Публикации

Основные результаты работы опубликованы в 44 печатных изданиях, в том числе в описаниях 6 авторских свидетельств СССР и 10 патентах СССР и РФ.

Объем и структура научного доклада

Работа изложена на 48 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 рисунками, 3 таблицами, состоит из 4 глав, выводов и списка опубликованных работ.

В первой главе приведены результаты селекционной работы по поиску наиболее эффективных штаммов Aspergillus niger — продуцентов лимонной кислоты, описание некоторых штаммов и результаты их генотипирования.

Во второй главе представлена характеристика новых видов сырья для производства лимонной кислоты, а также способы подготовки его к ферментации и параметры, которым должно оно соответствовать.

& третШГТлаве представлены результаты исследований по влиянию фермента цитратсинтазы на процесс биосинтеза лимонной кислоты, а также выбору веществ, стимулирующих кислотообразо-вание.

Четвертая глава посвящена описанию особенностей технологии биосинтеза лимонной кислоты на различном углеводсодержащем сырье и результатам внедрения их в промышленность.

1. СЕЛЕКЦИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ ШТАММОВ — ПРОДУЦЕНТОВ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ

Знание генетических и физиологических особенностей биологического объекта, применяемого в любом биотехнологическом производстве, является фундаментальной научной базой для управления процессом биосинтеза.

Свойством продуцировать лимонную кислоту обладают многие микроорганизмы, но для промышленного производства в основном используют микромицет Aspergillus niger.

Современная технология производства кислоты, основанная на различных источниках углерода и различных способах культивирования (поверхностном, глубинном периодическом и непрерывном) требует создания новых эффективных продуцентов лимонной кислоты.

Штаммы для производства лимонной кислоты должны отвечать определенным научным критериям:

1. Обладать высокой скоростью кислотообразования.

2. Обладать высокой степенью трансформации источника углерода в лимонную кислоту.

3. Быть генетически однородными и стабильными.

4. Быть толерантными, в том числе к высоким концентрациям углеводов, изменениям температуры среды и контаминантам процесса.

Селекция эффективных штаммов Aspergillus niger была проведена на базе промышленных штаммов и музейных культур из коллекции ВНИИПАКК и основывалась на изучении изменчивости продуцента под воздействием физических и химических мутагенных факторов, методах вегетативной гибридизации ауксотрофных мутантов и гибридизации протопластов различных штаммов /1,2/.

Отбор перспективных культур проводился из колоний с измененной морфологией. Для ускорения селекционной работы из отбора исключались генеративные аконидиальные мутанты, не перспективные для получения лимонной кислоты /1/.

В результате поиска путей селекции штаммов Aspergillus niger был разработан метод получения митотических диплоидов у Aspergillus niger, заключающийся в выдерживании моноконидиальной суспензии гаплоидного штамма в парах камфоры при 20°С, под воздействием которой образуются крупноклеточные варианты с частотой 2-102 после 20 часов экспозиции, расщепляющиеся и образующие полиморфные и гаплоидные варианты. Из популяции полиморфной кулыуры однородную диплоидную культуру выделяют, применяя фильтрационный метод и облучение ультрафиолетом в дозах, летальных для гаплоидных вариантов /3/.

Установлены существенные отличия микроскопических признаков диплоидной культуры Aspergillus niger от исходного гаплоидного штамма, а именно, увеличение диаметра конидий в 1,3 раза, объема конидий в 2,2 раза, веса сухой конидии в 1,7 раза/3/. Для диплоида, по сравнению с исходным штаммом, характерно ограничение роста биомассы, что значительно повышает его продуктивность по лимонной кислоте.

В ходе селекционной работы изучена морфологическая изменчивость и биохимическая активность более трех тысяч мутантов,

д^ещйе^я ГОС5'г ' " "" * 1 Zi'tr>It>'v.t- ,

что позволило выделить эффективные штаммы-продуценты, отвечающие научным критериям. В табл. 1 приведены результаты биосинтеза лимонной кислоты селекционированными штаммами-продуцентами при ферментации на различных углеводсодержащих средах в условиях периодического и непрерывного культивирования.

Штамм ВКПМ F-410. Получен методом автоселекции активных мутантов в сочетании с мутагенезом для непрерывного культивирования на мелассных средах. В качестве объекта селекции взята популяционная смесь производственных штаммов J1-1, ВКПМ F-171, ВКПМ F-326 и мутанта JI-4-30. Раздельная обработка нитрозо-метилбиуретом в концентрации 2,5 г/дм3 конидий каждого штамма с последующим культивированием обработанной мутагеном популяции в совместной культуре в течение 7, 12 и 15 суток позволила из 300 отобранных вариантов выделить наиболее активный, полученный из 15-ти суточной культуры после 4-х часовой обработки мутагеном, который был рекомендован для промышленных испытаний и впоследствии получил коллекционный номер ВКПМ F-410 /4/.

Штамм ВКПМ F-501. Селекционирован методом соматической гибридизации протопластов мицелия штамма ВКПМ F-410 и активного мутанта 288/9-108/19-96/5, полученного на ранних ступенях селекции с последующим облучением рекомбинантов УФ-лучами в дозе 0,33 кДж/м2 и отбором спонтанных вариантов. Селекционированный штамм предназначен для ферментации на сахарозоминеральных средах 151.

Штамм ВКПМ F-681. Исходным объектом селекции служил черноокрашенный вариант Aspergillus niger 163/9 из коллекции ВНИИПАКК. Сочетание УФ-облучения со стабилизирующим отбором устойчивых спонтанных вариантов позволило на пятой ступени селекции получить штамм с темно-серой окраской конидий, имеющий ограниченный рост и высокую продуктивность мицелия /6/.

Штамм ВКПМ F-696. Селекционирован из высокоактивных мутантов, полученных на 4 ступени селекции штамма ВКПМ F-681 при дозе УФ-облучения 0,5 кДж/м2; имеет в отличие от него кремовую окраску конидий /7/.

Штаммы ВКПМ F-681 и ВКПМ F-696 предназначены для ферментации на сахарозоминер