Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов E. Coli - продуцентов альфа-интерферонов в связи с проблемами таксономии и экологии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов E. Coli - продуцентов альфа-интерферонов в связи с проблемами таксономии и экологии"

р V 6 од

7 6 №

МОСКОВСЕМ МЩЩИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

ИМЕНИ И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УДК: 57.063.8:579.255:616-093-/098: :579.26:57,06

ХОРОШКО Наина Вяадашсовна

ИЗУЧЕНИЕ ВЮЛОШЕСШ СВОЙСТВ РЕКОМШНАНТНЫХ ШТАШОВ Е.СОЫ - ПРОДУШНТОВЬС- ИНГЕРФЕРОНОВ В СВЯЗИ С ПРОЩЕШЛИ ТАКСОНОМИИ и экшош

03.00.07. - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994

Работа выполнена в Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова

Научный руководитель -Академик РАМП, доктор медицинских наук, профессор А. А. Воробьев.

Офодвяыше оппоненты -

доктор медицинских наук Д. Д. Мзньшиков , доктор медицинских наук, профессор С.Д.Воропаева.

Ведущее учреждение -

Научно-исслвдовэтельокий институт ввкцик и сывороток им. И. И. Мечни ков а, РАШ.

Защита диссертации состоится " ^ " ^^ 1994 г. в ^Ц часов на заседании специализированного совета Д 07405.10 в Московской медицинской академии имени И. И Сеченова по адресу: 119881, Ыооквв, ул. Б. Пироговская, 2/6.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московски медицинской академии им. И. М. Сеченова по адресу: Москва, Зубовская пл., д.1.

Автореферат разослан " 1994 г.

Ученый секретарь спеадаявзированното совета, кандидат медицинских наук

А. 10. Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последнее время появляется все больше технологий, использующих штаммы различных видов микроорганизмов с рекомбшштгами ДНК в качестве продуцентов таких биологически активных веществ (БАВ), как ферменты, гормоны, интерфероны, инсулин, антигены бактерий и вирусов и др. ( В. Ас^ек , 1993; А.А.Еоробьев, 1993).

Применение методов генной инженерии при конструир9вании . промышленных штаммов микробов-продуцентов позволяет получать большие количества высокоактивных препаратов ВАВ, что невозможно при традиционных способах их производства. Создание высокопродуктивных штаммов генно-инженерных микробов (ГШ) привело к накоплении в лабораториях, на биотехнологических производствах значительных количеств микроорганизмов с искусственно измененным геномом.

Биологические свойства промышленных штаммов ГШ изучаются лишь с целью оптимизации технологических процессов получения SAB. Вопроси безопасности использования этих ГШ на производстве часто отходят на второй план. Наименее изучена биология штаммов ГШ, продуцирующих не свойственные бактериям продукты, в частности, оукарио-тические белки (В.Г.Дебабов, 1992; А.А.Воробьев и соавт., 198?). Несовершенство технологических процессов делает возможным попадание ГИМ-продуцентов по внешнюю среду, что приводит к повышении степени микробной загрязненности рабочей зоны (И.З.Зельцер, 1991; A.M. beruiatt , 1992) и достоверному трехкратному росту числа дис-биозов, гнойно-воспалительных и аллергических заболеваний среди работников биотехнологических производств (И.И.Прохорова, 1991).

Часто продуценты конструируются на основе условно-патогенных бактерий: bacillus Subtitis , Luherlch-lo. со ti, PstudomonAj jpp.' и др. - широко распространенных в окружающей среде и/или входящих

в состав нормальной микрофлоры человека. Наиболее изученной в генетическом и биологическом отношении, доступной для культивирования и идентификации считается кишечная палочка, на основе которой уже получены высокопродуктивные штаммы для производства инсулина, интер феронов, вирусных антигенов и др. Этот микроорганизм широко распространен в природных биоценозах, в т.ч. в организме человека, способен к адаптации при изменяющихся внешних условиях и к приобретению в результате генетических рекомбинаций и/или мутаций новых признаков, повышающих его вирулентность и устойчивость в окружающей среде (В.Г.Дебабов, 1992; Л.Ю.Попова и'соавт., 1993; К.К. Attas, и соавт., 1992).

Осложнение экологической обстановки во всем мире под влиянием антропогенных факторов обострило интерес к проблеме безопасности биотехнологических производств (А.Ф.Гирич'и соавт., 1993; IE.berliner , 1992; м.CtfamfAetro , 1992). Однако, до настоящего времени не существует стандартной методики для адекватной оценки экологической опасности, а также методов мониторинга и идентификации штаммов ГШ, в т.ч. созданных на основе Е.соЦ и продуцирующих эу-кариотические белки. Не исследована также степень влияния целенаправленных изменений генома на комплекс биологических свойств таких ГШ-продуцентов.

Цель и задачи исследования:

- провести сравнительное изучение биологических свойств исходных и рекомбинантных штаммов E.cali -продуцентов аС -интерферонов для уточнения их таксономического положения и

- оценить степень биологической опасности и адаптационных воз ыожностей этих микроорганизмов при воздействии различных факторов внешней среда.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи в

ч

отношении штаммов E.colt -продуцентов ¿,-интс.рферонов:

1. Определение морфологических, тинкториальных свойств, оценка культуральных особенностей и динамики роста и размножения на питательных средах; определение спектра ферментативной актйвностй; изучение антигенной структуры.

2. Определение чувствительности к различны« типам колицинов.

3. Изучение биологических свойств, обусловливающих пагоген-ность (адгезивной способности, гемолитической активности, токсичности, токсигенности).

4. Оценка вирулентности в отношении восприимчивых животных в зависимости от способов заражения.

5. Выявление характера диссеминации во внутренних органах экспериментальных животных при различных способах заражениям скорости элиминации из организма.

6. Оценка влияния факторов внешней среды (температуры, кислотности и состава питательной среды, степени аэрации, антибактериальных химиопрепвратов, антисептиков и дезинфектантов) на динамику роста и размножения штаммов, а также на постоянство биологических признаков и стабильность внедренных плазмид.

Научная новизна. Настоящее исследование существенно дополняет сведения о биологических свойствах рекомбинантных штаммов E.coli -продуцентов А -интерферонов. Охарактеризовано таксономическое положение данных рекомбинантных штаммов, выявлено соответствие их биологических свойств признакам, присущим виду Escherichia cott . На основании результатов проведенных исследований получена возможность оценить степень биологической опасности при работе с данными микробами-продуцентами. Изучены вирулентность данных штаммов и основные биологические свойства, ее определяющие. Исследован характер диссеминации Е.соН -продуцентов Л -интерфероне в в организ-

- Ii -

ые экспериментальных животных. Установлены способы воздействия на эти микроорганизмы с помощью антибактериальных хишолрепаратов, антисептиков и дезинфектантов. Выявлена множественная лекарственная резистентность у продуцентов А. -интерферона-Xj. Изучены адаптационные возможности штаммов E.coli , продуцирующих «L -интерферо-кы, при изменении параметров различных факторов внешней среды. Ilpej дожено использование дифференциально-диагностических сред с антибиотиками для определения стабильности плазмиды.

Практическая значимость. Достоверно подтвервденная принадлежность исследованных штаммов E.colt -продуцентов <L -ингерферонов

к виду E5cltB8.ich.UL Coli по совокупности ключевых биологических свойств, а также наличие стабильных генетических маркеров позволяет использовать эти признаки для идентификации данных иташов на всех этапах технологического цикла и в случае их попадания во внек нш среду. Выявленные низкие адаптационные способности данных продуцентов и слабая вирулентность позволяют установить Ш-1У класс опасности при работе с этими .микробами. Определение спектра чувствительности данных штаммов-продуцентов к антибактериальным препаратам позволяет выработать меры воздействия на эти микробы в соответствии с их индивидуальной чувствительностью. Показана опасност: использования антибиотикорезистентности в качестве генатического маркера. Подтвервдена целесообразность расширения стандартной методики исследования генетически измененных микроорганизмов-продуцентов при решении вопроса о внедрении их в производство.

Материалы настоящего исследования используются при чтении лекций по экологической микробиологии и проведении занятий на ка федре микробиологии, вирусологии и иммунологии им. И.М.Сеченова.

Апробация. Основные положения диссертационной работы были дс ложены: на У Объединенном съезде гигиенистоъ, эпидемиологов, mmkj

биологов, паразитологов и инфекционистов Казахстана (г.Алма-Ата, 1991 г.), на Всероссийском съезде микробиологов» эпидемиологов и паразитологов (г„ Нижний Новгород, 1991 г.), на конференции (" &iotec!mo£o§£.ü. meiitcincc' (г. Гвардалахара, Мексика, 1994 г.), на ХХУ Национальном микробиологическом конгрессе (Мексика, 1594г., г.Обрегон), на научной конференции молодых ученых России, посвященной 50-легки АМН (г.Москва, 1994 г.), на научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова (29 марта 1993 г.).

Публикации. По теме диссертация опубликовано б работ. Структура и объем работы. Диссертация изложена на -110. страницах машинописного текста, включая ii таблиц, РА рисунков и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 5 глав с результатами собственных.исследований, обсуждение полученных результатов, вывода. Список использованной литературы содержит 2SA источника, в том числе 160 , опубликованных на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы я методы Исследование проводили в отношении полученных генно-инженерными методами шташов-продуцентов -интерферона X j E.coli K602/pVi/609 (регистрационный номер Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКГМ) В-3478); E.colt. KBü2/pV^22 (регистрационный номер ВШМ В-3479) и штамма-продуцента А ¿-интерферона E.coli T(j I/p VM74 (регистрационный номер ВКШ В-3774). Для сравнительного изучения использовали исходные штаммы E.coli KÖ02 и E.coli Все штаммы были получены во ВНИИ генетики и селекции

промышленных микроорганизмов (авторы Ю.И.Козлов, В.А.Народицкая- и др.).

- в -

В отношении всех исследуемых штаммов определяли их таксономическое положение; биологические свойства, обусловливающие патоген-ность штаммов; изучали вирулентность, характер диссеминации и пер-систирования в организме экспериментальных животных при различных при различных способах введения микроорганизмов; исследовали влияние антибактериальных химиопрепаратов, дезинфектантов и антисептиков на характер роста и размножения штаммов-продуцентов. Изучали адаптационные возможности штаммов под воздействием физических, химических и биологических факторов окружающей среды при сохранении способности к продукции ^-интерферона. Способность к синтезу целевого белка оценивалась перед началом каждой серии экспериментов и после их завершения путем постановки ИМ с поли- и моноклональ-ными антителами к «^-интерферону, коньюгированными с пероксидазой. Для ¡Ш. применяли тест-систему НПО "Фермент" (г.Вильнюс, Литва), учет результатов проводили на мультискане ( ИцШ-&кйП. , Финляндия). Текущий контроль стабильности внедренных пяазмид проводили в соответствии с экспериментально-производственным регламентом № 211-89 "Интерферон человеческий рекомбинантный альфа-2 (полуфабрикат)" от 20.11Л989 г., а также по наличию индивидуальных генетических маркеров кавдого штамма-продуцента (ауксотрофность, лактозо-отрицатедоность, антибиотикорезистентность).

Бактериоскопическое исследование проводили с использованием световой и электронной микроскопии.

Культуральные свойства изучались на плотных питательных средах (МПА, Ь -среда, дифференциально-диагностические среды) под биокулярной лупой и в косопроходящем свете по методу 1»йп<Ц} ("Эн-теробактерии", М., 1935). Также исследовали характер роста на жидких питательных средах (ШШ, 1.-бульон ) с культивированием в тер-мокач.алке (37°С, 200 оборотов/мин.). Параллельно готовили высевы

на плотные питательные среда для определения количества КОЕ/мл. Оптическую плотность (ОД) бульонных культур определяли на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете 1,0 см. По результатам исследования строили графики зависимости величин Ц. ОД и Ц ШЕ культур от времени культивирования и рассчитывали время генерации культур (Д.Н.Миллер, 1976). Ферментативную активность изучали с помощью тест-систем Apt-20Е, Apt -50-сн (Франция), Entejto+est (ЧСФР) и автоматизированных микробиологических систем Quantum и ЬапЩе с АЬЫЬ, США). В целом исследование ферментативной активности каждого штамма проводили по 60 тестам.

Антигенную структуру штаммов изучали в реакции агглютинации с эшерихиозными поли- и ыонорецепторными ОК-сывороткаьш и Н-сыво-ротками в рапид-системе (Ю.А.Ратинер, 1982).

Наличие адгезивных антигенов (К88, Ш9, А20, P4I, 987Р) определяли в реакции агглютинации на стекле с соответствующими моноре-цепторными сыворотками ("Методические указания № 044-3 по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоэа) животных").

Адгезивную активность штаммов также определяли в реакции прямой гемагглвтинации (Evcms<)ДцссоЦ 1984) с эритроцитами различных видов животных и птиц, а также разных групп крови человека. Способность к адгезии определяли при различных условиях культивирования штаммов-продуцентов, а также после пассирования через организм животных.

Оценку патогенности изучаемых штаммов проводили с использованием 1026 экспериментальных животных. В исследование были взяты белые нелинейные мыши, массой 18-24 г, обоих полов. Определение средневирулентной дозы, токсичности и токсигенности при разных способах заражения осуществляли по общепринятой методике (М.О.Биргер, 19в2). ибсемененность внутренних органов учитывали путем количест-

венных высевов на плотные питательные среды с последующей идентификацией штаммов-продуцентов и определением активности синтеза ими целевого белка е ША.

В настоящем исследовании изучали влияние изменений условий культивирования на характер роста и размножения штаммов-продуцентов, а также на постоянство биологических признаков и уровень продукции целевого белка. Культивирование штаммов проводили при следующих режимах: температура (20°, 37°, 42°С); скорость перемешивания культур (0-100-200 оборотов/мин.}; различный состав питательных сред (Ь-среда, МЛБ, минимальная среда с необходимыми добавками соответственного паспорту каждого штамма как без антибиотиков, так и с внесением их в среду). Также использовали среды с различными показателями кислотности (рН- 5,5; 6,8; 10,0). Характер роста оценивали по указанной выше методике (Д.Н.Мнллер, 1976). После куль тивирования при каждом из режимов у всех штаммов оценивали не только уровень продукции целевого белка и стабильность внедренных плаз-мид, но'и следующие биологические свойства: морфологические и тин-кториаяыше особенности, биохимическую активность, антигенную струи туру, чувствительность к колицинам, антибиотикам и дезинфектантам, вирулентность, адгезивную способность.

Влияние антисептиков и дезинфектантов на изучаемые штаммы оценивали методом диффузии в агар (А.А.Адарченко и соавт., 1985). Для исследования были взяты препараты из различных химических групп: хлорамин Б, диоксидин, сульфацил натрий, резорцин, хлоргексидина биглюконат, роккал и борная кислота. В результате исследования оп редеяяли минимальные ингибирующие концентрации атих веществ в отно шении каждого из штаммов.

Влияние антибактериальных химиопрепарагов проводили с исполь зованием автоматизированной микробиологической системы Дуй^А^й

( ALbefcfc t США). Определены минимальные ингибирущие концентрации 20 препаратов различных групп { ji -лакгамы, аминогликозиды, тетрациклины, хинолоки, сульфаниламиды и др.) на исследуемые штаммы с построением кривых роста последних в'присутствии каждого из антибиотиков.

Определение чувствительности к различным типам колиципов проводили методом отсроченного антагонизма (К.Харди, 1990). Эталонные колициногенные штаммы были получены из коллекции ГИСК им. J1.A.Тарасовича.-

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью методов вариационной статистики, с применением критерия Стыодента (Ашарин И.П., Воробьев A.A., 1962), а тагсте с помощью микробиологических систем QtiftfttUM и AvCthtd^ ( Abboifc , США).

Результат» исследований и их обсуждение

Для исследования были выбрани бактериальные штаммы-продуценты, которые, во-первых, искусственно сконструированы гекно-инженер-кши методами и несут ген, детерминирукцяй синтез оукариотического белка iL -интерферона, а во-вторых, получен:! н*а основе широко распространенной в природе и входящей в состав нормальной микрофлоры человека и животных кшзчной палочки.

Проведе!Ш исследования биологических свойств атешов-проду-центов eL -интерферонав E.coli K802/pVH609, E.coli K802/pVtJ22 и E.coli TGI/pV'i V4 с целью определения их таксономического положения. Изучены морфологические, нультуральные, биохимические и антигенные свойства данных штаммов. Проведено сравнительное изучение аналогичных признаков у исходных штаммов E.coli KÜU2 и E.coli. т.е. микробов-реципиентов, использованных для внедрения гелазмид, несущих гек -интерферона.

По данным световой и электронной микроскопии различий в мор-

фологии и тинкториальных свойствах рекомбинантных и исходных штаммов не установлено. Все изученные микроорганизмы представляют собой грамотрицательные мелкие (1,5+0,2x3,0+0,9 мкм) прямые палочковидные клетки с закругленными концами, перитрихи, имеют фимбрии, спор и капсул не образуют. Все исследованные штаммы давали образование слизистых нитей в КШ-тексге ( фйе^е«.«« Т, , 1978).

При изучении характера роста колоний на плотных питательных средах (МПА, ЬБ-агар, среда Эвдо и др.) достоверных различий между рекомбинантныыи и исходными штаммами не установлено. На дифференци-альио-диагностических средах, содержащих лактозу,, все исследованные штаммы давали рост неокрашенных или елабоокрашенных в цвет среда колоний, что обусловлено их лактозонегативностью.

При изучении характера роста и размножения на жидких питательных средах при оптимальных условиях (температура 3?°С, скорость обращения термокачалки 200 об/мин., рН - 6,8) установлено, что время генерации как рекомбинантных, так и исходных штаммов составило 28+ 0,9 мин. Однако, в связи с.наличием в составе плазмид р УН609, р\Ш 22, рV/] 74 генов резистентности к некоторым антибиотикам, штаммы-продуценты в отличие от исходных, хорошо размножались на средах, содержащих ампициллин, стрептомицин и тетрациклин, соответственно. Эти свойства использовались и в качестве генетических маркеров при работе с рекомбинантными штаммами.

При исследовании ферментативной активности по 60 признакам установлено, что ее спектр практически совпадает у рекомбинантных и исходных штаммов. Штаммы Е.соН КВ02/рУЙ22 и Е.сои К802/рУМ 609 не обладали способностью ферментировать аргинин, что может объясняться гетерогенностью популяции и не позволяет вынести эти штаммы за пределы вида. Биохимическая активность исследуемых штаммов не изменялась в зависимости от состава сред, условий нультивиро-

вания и характера внешних воздействий. По результатам компьютерной, обработки данных на основании спектра ферментативной активности, рекомбинантные штаммы могут быть отнесены к виду Es&ViefclchiOi colt с вероятностью в среднем 98,5+0,3$.

Исследование антигенной структуры рекомбинантных штаммов E.coli. H802/pVM22, E.coIL K8u2/pVM609 и E.coli TqVpVN74 показало, что определение групповой принадлежности О-антигена невозможно, в связи с тем, что все штаммы находятся в R> -форме. Все штаммы-продуценты обладали H4Ö антигеном. Адгезивно активными антиге-s нами (К88, К99, А20, 987P..P4I) как рекомбинантные, так и исходные штаммы не обладали.

Таким образом, по совокупности выявленных в результате экспериментов морфологических, тинкториальных, культуральных признаков, ферментативной активности и особенностям антигенной структуры штаммы-продуценты Л -интерферона- I1, E.coli K802/pVN 22, E.coli К802/р\Шб09, а также продуцент ¿Ц-интерферона E.coli TQ/pVM 74 могут быть отнесены к веду Eschsfcichlü, ce>LL . Внедрение в геном исходных штаммов плазмид, детерминирующих синтез эукариотичаако- • го белка, не привело к изменению тахсонономического положения этих микроорганизмов, что делает доступным идентификацию традиционными методами штаммов-продуцеитоэ на всех этапах технологического цикла и в случае их попадания в окружающую среду.

Влияние искусственного изменения генома на вирулентность штаммов-продуцентов исследовали на экспериментальных животных. Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов, имеющих значение для проявления вирулентности вклвчало в себя определение адгезивной активности, токсичности, токсигенности.

В результате проведенных исследований установлено, что как рекомбинантные, так и исходные штаммы не обладали адгезивными ан-

- lA -

тигенами, присущими энтеропатогенным . и уропатогеннкм . эшерихиям. Все штаммы давали маннозочувствктельную геыагглютинаци» с эритроцитами морской свинки, некоторых видов животных, а ташке разных груш крови человека, что позволило утверждать о наличии как у штаммов-продуцентов, так и у исходных микробов адгезинов I типа.

При сравнении адгезивной активности изучаемых штаммов, культивированных в различных условиях, обнаружено, что максимальная способность к агглатинации эритроцитов наблюдалась у 24-часовых культур, выращенных на богатой компонентами питательной среде в оптимальных условиях (РГА+++). При изменении этих условий адгезивная активность всех штаммов достоверно снижалась б 2 и более раз

Бульонные суточные культуры, выраженные d оптимальных условиях, проявляли максимальную способность к агглютинации эритроцитов при аэрировании культуры 200 об/мин«

Таким образом, адгезивная способность рекомбинантных и исходных. штаммов E.colí практически не отличалась в зависимости от условий культивирования. . .

Для определения степени токсичности штаммов-продуцентов экспериментальным животным вводили гретые культуры внутрибрюшияно и перорально. Установлено, что введение дозы 5*10^ микробных клеток/мл не вызывало гибели более К% животных. Достовер?^ос различий в степени токсичности рекомбинантных и исходных штаммов не обнаружено. Таким образом, все изученные микроорганизмы могут быть отнесены к малотоксичным культурам ( Методические указания & 2955-83 "Постановка исследований для обоснования ПДК производственных штаммов микроорганизмов в воз,пухе рабочей зоны" от 23.12.83).

Определение токсичности изучаемых штаммов проводили путем введения животным культуральной жидкости, полученной при центрифу-

гирояании 7 и 14-суточньк бульонных культур. Установлено, что при введении 1,0 мл центрифугата культуральмой годности погибало лишь 18-20% животных. Достоверных различий в степени токсигенности исходных и рекомбинантных штаммов установлено не было. Таким образом, данные штаммы могут считаться нетоксигенными.

Далее в работе проводилось определение вирулентности продуцентов А-ингерферонов E.coli КБ02/рУЯ 22, Е. coli K802/pVP4 609, E.coli TGjI/pWJ74 в зависимости от способа заражения. Установлено, что средне вирулентные дозы составили при внутрибрюиинном введении для E.coli, K802/pVN22 - 1,54+1,I5*I09 м. ил/мл, для E.coli КВ02/ рVA/609 - I,69+Ü,2I-I09 м. кл./мл., для E.coli T<?I/pVf474 - I.6&+ +0,30*10®м. кл./мл.

Эти величины достоверно не отличались от средневирулентных доз исходных штаммов. При пероральном введении средневирулентныэ дозы составили 4,2*0,ОЗ'Ю^м.кл./мл; 4,7+0,3*10^ м.кл./мл.;-3,7+ +1,20*10® м.кл/мл соответственно, тогда как известно, что для эн-теротоксигенных штаммов кишечной палочки средневирулентные дозы '

гу

составляют 1*10 м.кл/мл (Кулинич Л.И., 1990).

Таким образом установлено, что штаммы-продуценты E.coli KB02/pVfJ 22, E.coli K802/pVM609 и E.coli T^I/pVM74 являются слаботоксичными, нетоксигенными и паловирулентными.

При изучении характера диссеминации штаммов-продуцентов cL-интерферона в организме кивотшх установлено, что наибольшая обсемененность как рекомбинантными, так и исходными штаммами в первые 6 часов после введения наблюдалась в тканях печени и селезенки (средние значения Ц, KLE/r ткани у рекоыбинантных штампов составили для печени: 7,54+0,64 и для селезенки: 8,12+0,09). наименьшая обсемененность наблюдалась в ткани сердца. Все посевы кропи были стерильны. Рекомбинантные штаммы элиминировали из внутрен-

Рис. I. Динамике сгапени очищения органов белых мышей после

однократного внутрибрюшинного введения 5 х 10 мпкр.кд/i рекомбинантных штаммов E.coli - продуцентов« - интерферона - Ij; и исходного штамма E.coÜ К 802. Примечание:

_ - динамика клиренса S.coli К 802

_____- динамика клиренса Е.со1<- К 802/pv^ 609

. . . -динамика клиренса E.colt К 802/pV^ 22

них органов в течение 48 часов после введения (клиренс 100%). Динамика выведения отражена на рис. I. Не обнаружено достоверных различий в характере диссеыинации и степени обсемененности внутренних органов, а также в скорости выведения рекомбинантных штаммов-продуцентов «О-интерферона E.coli K8Q2/p\M22, E.coli KB02/pVfJ 609, E.coli ТфД>УД/74 и исходных штаммов E.coli. K8Q2 и E.coli TGj I.

Таким образом, установлено, что рекомбинантиые штаммы не обладают способностью колонизировать внутренние органы теплокровных и элиминируются полностьв из организма в течение первых 48 часов от момента однократного введения.

Следующим этапом исследования стало изучение влияния на рекомбинантные и исходные штаммы различных факторов внешней среды (температура, степень аэрирования, кислотность и состав питательных сред), а также антибактериальных препаратов с цель» определения адаптационной способностью этих микроорганизмов и разработка мер воздействия на рекомбинантные штаммы, что позволяет оценить степень экологической опасности этих микроорганизмов.

При изучении спектра чувствительности рекомбинантных штаммов и исходных микробов к антибактериальным химиопрепаратам установлено, что исходные штаммы были чувствительны ко всем 20 исследованным препаратам. Продуцент X -интерферона E.coli TG,I/pVW 74 был устойчив только к тетрациклину, что объясняется наличием во внедренной плазмиде соответствующего гена резистентности. 1 продуцентов dt, -интерферона-^ E.coli Ю302/рЧИ 609 и E.coItpVM22 выявлена множественная лекарственная резистентность, несмотря на то, что в состав плаэмид р\М 609 и pVf) 22 были включены гены резистентности только к стрептомицину и ампициллину. Указанные штаммы оказались устойчивыми.ко многим антибиотикам из группы £ -лактаыов: уреидо-пенициллкнам, полусинтетическим пенициллинам и цефалоспоринам I по-

- Id -

коления, а также аугаентину - препарату, содержащему помимо антибиотиков ингибитор jä -лактамаэ. Формирование множественной лекарственной устойчивости под влиянием, в том числе, и внедренной плазми-ды подтверждает положение об опасности использования признака ан-тибиотикорезистентности для.генетического маркирования рекоыбинант-ных штаммов ( bested , 1992).

При исследовании влияния присутствия антибиотиков в.среде на х рактер роста и размножения, рехомбинантных штампов показано, что ско рость роста (время генерации) не менялась относительно таковой на среде без антибиотика. Однако установлено, что длительное культивирование продуцентов на средах в отсутствие селективного влияния антибиотика достоверно снижает стабильность плазм иды (уровень элиминации плазмиды превышает допустимую величину (5^) в И,9-13,7 раза, Соответственно снижается и уровень продукции целевого белка.

Далее в настоящем исследовании определяли влияние антисептико и дезинфектантов на рекоыбинонгные штаммы E.coIU K8Q2/ptf^ 22, E.coll Ш02 pÜ.'<VöQ9, E.coli Т^1/рй374. Изучали влияние препаратов с раэличныни механизмами антибактериального действия и принадяена-щих к разным химическим группам (галлоиды, детергенты, производ ныз хиноксалина, фенолы, сульфаниламиды, кислоты и катионные ПАВ). Установлено, что все примененные препараты оказались эффективными как в отношении рекокбинантных, так и в отношении исходных штаммов E.coll . При сравнении средних величин минимальных ингибирую-щих концентраций препаратов для исходных и рекомбинантных штаммов достоверных различий выявлено не было. Наиболее действенным препа ратом оказался хлоргексидин, далее по мере возрастания средних зн чений ЫЛК следуют соответственно: диоксидин-роккал-резорцин-борна кислота-хлорамин Б. Установлено, что данные препараты (за исключе нием роккала) были эффективными в отношении рекомбинантных штамме

йЙ №

оса

г»

40

1Г

■с,

кг/ ,

/Ш 10-

-сР

0,3

ш

/на

X !Г

МО

£0

Щ"

/ы 50'

✓Р

X Е *

Рис.2. МИК ЬНТиСЕПТМКОЬ И ¿.ЕЗМНФЕКТАИТОВ & ОТНОШЕНИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ

И исходных ШТАММОВ Е.СоИ.. ТГрИМЕЧЛниЕ:

■Ср. - -рабочая" концентрами» препарата

•СР

-ДА» исходны» Е.со1С.

I

1.мик. ма продуцснтой а-интерферон а -Хч i а-алл Е.сои яш/румл4)са-лл9 е.сои к.*ог/Рил!год. 1.пик ал« продуцента л4-мнтерсрерона :_а-ААЛ Е.соИ тс,

в дозах значительно меньших, чем рабочие концентрации этих веществ (рис. 2). Таким образом, данные препараты могут быть рекомендованы для проведения дезинфекционных и антисептических мероприятий против рекомбинантных штаммов. Однако, наличие резистентности к антибактериальные препаратам делает необходимым проведение периодического контроля за состоянием чувствительности - устойчивости штаммов -продуцентов к этим препаратам для эффективности дезинфекционных мероприятий.

Изучение влияния биологических факторов на рекомбинантные штам мы заключались в исследовании холициночувствительности этих микроорганизмов. Установлено, что продуценты А -интерферонов E.coli. K30i р W22, E.coli HB02/pW609, E.coli TQiyPVM 74 имели, в основном, идентичный колицинотип. Единственным отличием была устойчивость продуцентов 4* -интерферона-1, к колицину типа 6А .

Заключительным этапом исследования стало изучение влияния услс вий культивирования штаммов-продуцентов на постоянство их биологических характеристик, стабильность внедренных плазмид и уровень пр* дукции целевого белка. Было показано, что оптимальными условиями культивирования рекомбинантных штаммов E.coli« K8G2/pVw 22, E.coli. KS02/pVH 609, E.coli TQI/pVtf 74 следует считать следующие: темпера тура +37°С, скорость перемешивания культуры - 200 об/мин., pH среды - 6,0-7,0; богатые питательными веществами среды. Максимальная стабильность плазмиды и сохранение продукции целевого белка на урс не 1,5*I04 ИЕ/мл достигалось при наличии селективного действия антибиотиков в среде, соответственно устойчивости каждого из штаммо! При отклонении условий культивирования от оптимальных наблюдалось достоверное замедление скорости роста штаммов-продуцентов, увеличение Lag -фазы.увеличивался процент штаммов, утративших плазмиду снижался уровень продукции -интерферона. Указанные условия

Рис.3. Влияние условий культивирования на рост и размножение

рекомбинантного штамма Е. coI¿ ТО i/pV// 74 - продуцента cL - интерферона и исходного штамма E.coI¿ TCJI.

Примечание:

_- роот штамма E.coI¿ Т<31

______- рост штамма E.coI¿ TG I/PVV74

I. - рост штаммов при оптимальных условиях /+ 37°С ; рН = 6,8 ± 0,5;200 обУмин/ П. - рост штаммов при изменении рН ореды : в. при рН = 5,5 £ 0,5

б. при рН = 10,0 ¿0,5 Ш. - рост штаммов при изменении степени аэрации:

а. без дополнительной аэрации

б. в териокэчалке при 100 об/мин 1У. - рост штаммов при изменении температуры:

а. при твмпратурв + 20°С

б. пи температуре + 42°С

- ж -

аналогично влияли на исходные штаммы, однако замедление скорости роста происходило в меньшей степени: в 1,7-2,2 раза меньше, чем у рекомбинантных в зависимости от изменения конкретных параметров (рис. 3). Остальные биологические признаки (морфологические, тинкто-риальные, биохимические, антигенные) не изменялись. Штаммы, культивированные не в оптимальных условиях, были слабоадгезивными, негок-сигенными, маловирулентными, слаботоксичными в отношении экспериментальных животных.

Таким образом, можно утвервдать, что рекомбинантные штаммы обладают низкими адаптационными возможностями при изменении условий внешней среды, что обусловлено перестройкой биохимических, энергетических процессов, Изменением функций регуляторных систем клеток, синтезирующих эукариотические белки.

ВЫВОДЫ

1. Исследованные штаммы-продуценты <Ъ.-интерферонов E.coli KB02/pVM22, E.coli K8ü2/pVtf 609, E.coli TQI/pVN 74 относятся к виду Escherichia, cotu ПО совокупности морфологических, тинктори-альных, культуральных признаков, биохимической активности, антигенным свойствам, что позволяет проводить мониторинг и идентификацию этих штаммов традиционными методами с учетом генетических маркеров на всех этапах технологического цикла и в случае их попадания в

• окружающую среду.

2. Рекомбинантные штаммы-продуценты оС -интерферонов E.coli, K802/pVfl609, E.coli K802/pVM 22, E.coli TqiyPVfJ74 достоверно не отличаются по ключевым биологическим свойствам от исходных штаммов реципиентов E.coli K8G2 и E.coli. TCjl. Внедренные плазмиды pVtf 609 и pVN 22, несущие ген «о-интерферона-, обусловили формирование множественной лекарственной резистентности к р -лактамным антибиотикам у штаммов E.coli Ш02/рМ22 и E.coli Kb02/pVKi609.

- аз -

3. Уровень продукции целевого белка ( «О-интерферона) исследованными рекомбинантными штаммами остается стабильным При соблюдении оптимальных условий их культивирования, что'позволяет использовать штаммы E.coli K802/pVh/609, E.coli K802/pW22 и E.coli TCjl/pVi/74 в качестве продуцентов -интерферонов. В отсутствие селективного влияния антибиотиков стабильность плазмид резко снижается, что делает необходимым проведение мониторинга стабильности плазмид и уровня продукции целевого белка в условиях промышленного культивирования, а также периодическое обновление используемых на производстве штаммов ГШ-продуцентов.

4. Средневирулентные дозы рекомбикангных штаммав-продуцентоз сL -интерферонов значительно превыпают таковые для энтеропатогенных штаммов E.coli независимо от способа заражения. Изученные штаммы E.coli K8G2/pVrt22, E.coli K802/pVtf609 и E.coli Tqi/pVM 74 элиминируются из организма животных полностью в течение 48 часов;-генерализации инфекционного процесса не происходит.

5. Рекоыбинантные штаммы E.coli K802/pVN 22, E.coli К802/ • pVft/609, E.coli T^I/pVfi 74 являются маловирулентными, слабоадгезивными, не токеигенны, слабо токсичны, чувствительны к эталонным ко-лицинам, быстро элиминируются из организма и, следовательно, относятся к Ш-1У классу опасности по "Классификации штаммов промышленных микроорганизмов по степени опасности".

6. При изменении внешних воздействий (температуры культивирования, состава и кислотности питательных сред, степени аэрации культуры) достоверно замедляется скорость роста штаммов-продуцентов А -интерферонов E.coli K802/pVN22, E.coli K8G2/pVN609, и E.coli TGiI/pVN74. При этом снижается уровень продукции целевого белка.

7. Низкие адаптационные возможности штаммов E.coli KBQ2/pVi/6G9, E.coli K902/pVW22, E.coli Т(Ц/рУ//74 при сохранении уровня продукции целевого белка позволяют использовать обычные дезинфекционные мероприятия в случае ив попадания в окружающую среду.■Учитывая множественную резистентность штаммов E.coli K8Q2/pVi) 22 и E.coli. KB02/pW6Q9 к ß -лактамнш антибиотикам, необходимо подбирать антибактериальные препараты в соответствии с индивидуальной чувствительностью штаммов.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ

1. Воробьев A.A., Хорошко Н.В., Селезнева О.Ю. Рекоыбинантные штаммы: биологические свойства и меры безопасности при работе// Вестн.РАЫН. - 1993. - » 2. - с. 31-37.

2. Воробьев A.A., Хорошко Н.В., Селезнева О.Ю. К проблеме экологической безопасности рекомбинантных штаммов бактерий-продуцентов БАВ// Объединенный съезд гигиенистов, эпидемиологов, микробиоло гов, паразитологов и инфекционистов Казахстана* 5-й, Материалы, Алма-Ата. - 1991. - » 5. - с. 105-107.

3. Хорошко Н.В., Селезнева О.Ю. Рекомбинантные штаммы микроорганизмов и экология// Гигиенические аспекты охраны окружающей среда и здоровья человека.// Научные труды медико-профилактического ф-та. U. - 1992. - с. 120-122.

4. Хорошко Н.В. Изучение биологических свойств рекомбинантных бактерий с целью определения их значения для экологии// Материалы Всесоюзной конференции молодых ученых "Молодежь - практическому здравоохранению". М. - 1990. - с. 33-34.

5. Воробьев A.A., Хорошко Н.В. Роль рекомбинантных промышленных штаммов в экологии человека// Материалы У1 Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов// г.Нижний Новгоро; - ноябрь 199I г. - И. - 1991. - т. 2. - с. 90-91.

6. Селезнева О.Ю., Хорошко Н.В. Некоторые вопросы экологической безопасности рекомбинантных штаммов E.coli П Научная конференция молодых ученых России, посвященная 50-летию АМН. Тезисы докладов. - И. - 1994 г. - с. 136-137.