Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2b и альфа-2a"

На правах рукописи

СТРАТОНОВА Наталия Валерьевна

Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ИДЯ ¿013

005059288

Москва, 2013

005059288

Работа выполнена в федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Хамитов Равиль Авгатович

Официальные оппоненты:

Тихонов Игорь Владимирович - доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», кафедра биотехнологии, заведующий;

Колышкин Владимир Михайлович - доктор биологических наук, ОАО "БИОМЕД" имени И.И.Мечникова, генеральный директор.

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича».

Защита состоится « ^ »

Об 20 Г-в ^ _ часов на заседании диссертаци-

онного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 337-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Препараты интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2Ь широко используются как в ветеринарии, так и медицине. В медицине их применяют при лечении хронического вирусного гепатита В и С, для лечения онкологических болезней, а также для профилактики гриппа и ОРВИ у взрослых и детей (Фролов А.Ф., 1990; Подымова С.Д., 1996; Malaguarnera M., 1997).

В связи с этим, крайне важно, во-первых, обеспечить внутренний рынок России эффективной субстанцией интерферона альфа-2а и альфа-2Ь отечественного производства, во-вторых, создать коммерчески рентабельную технологию производства субстанции, основанную на применении современных высокопродуктивных систем экспрессии рекомбинантных белков и новых технологиях культивирования генетически модифицированных бактериальных продуцентов.

При производстве «биоаналога», которым является интерферон альфа-2, для обеспечения эффективности и безопасности продукта, необходимо обеспечить его соответствие установленному стандартному образцу. В международной практике, как указано в Европейской фармакопее 7.0, в качестве стандарта должен использоваться референс-ный образец CRS (Chemical Reference Substances) интерферона альфа-2а (CRS 10320300) или интерферона альфа-2Ь (CRS 10320301), рекомендованный Европейским управлением по качеству лекарственных средств (The European Directorate for the Quality of Medicines). Только после проведения испытаний, методология которых указана в Европейской фармакопее 7.0, доказывающих, что полученный интерферон альфа-2 соответствует стандарту, субстанция интерферона альфа-2 может быть признана эффективной и безопасной. Если же полученный продукт отличается от стандартного образца, по каким либо параметрам, например, по аминокислотной последовательности, трехмерной структуре, наличию примесей, то продукт может обладать сниженной биологической активностью, повышенной иммуногенностью и вызывать непредсказуемые побочные эффекты.

Основной проблемой при производстве рекомбинантного интерферона альфа-2 в бактериальном штамме-продуценте является наличие N-концсвого метионина, который образуется при синтезе рекомбинантного белка рибосомой бактериальной клетки и может влиять на иммуногенность и стабильность рекомбинантного белка (S. Hermeling, D.J.A., 2004; M. Kamionka., 2011; Ben-Bassat A., Bauer К.; 1987).

В Европейской фармакопее 7.0 указано, что молекула рекомбинатного человеческого интерферона альфа-2 должна состоять из 165 аминокислот, в положении 23 у ин-

3

терферона альфа-2а находится лизин, у альфа-2Ь - аргинин, N-концевым аминокислотным остатком должен являться цистеин, связанный дисульфидной связью с 98 цис-теином белка. Любой рекомбинантный интерферон альфа-2, чья аминокислотная последовательность отличается от указанной, не может считаться «биоаналогом», аналогичным стандартным международным образцам, в том числе по биологической активности и безопасности.

В России на настоящий момент не существует технологии производства отечественной субстанции рекомбинатного человеческого интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2Ь, удовлетворяющей всем параметрам качества, указанным в Европейской фармакопее, в частности отсутствию N-концевого метионина в молекуле рекомби-нантного интерферона альфа-2.

Разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства отечественной субстанции интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, позволяющей получать продукт, чья себестоимость ниже себестоимости существующих препаратов более низкого качества, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлись разработка и реализация на практике технологии промышленного производства субстанции интерферона апьфа-2Ь и интерферона альфа-2а, соответствующей современным требованиям качества и безопасности, в том числе требованию отсутствия в белке N-концевого метионина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать и оптимизировать экспрессионные конструкции и штаммы-продуценты гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

2. Разработать универсальную схему культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3), дающую высокий выход по биомассе и целевому белку.

3. Разработать способ выделения и очистки телец включения, процесс ренатура-ции, процесс ферментативного гидролиза гибридных белков предшественников и схему дальнейшей очистки безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

4. Оценить соответствие параметров качества полученного безметионинового интерферона альфа-2Ь требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0.

5. Провести валидацию и перенос технологического процесса на производствен-

ную площадку ООО «Фармапарк».

6. Зарегистрировать субстанцию «Интерферон альфа-2б человеческий рекомби-нантный безметиониновый» и внести ее в Государственный реестр лекарственных средств.

Научная новизна. Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) и экспрессионной системы промотора фага Т7 под контролем lac оперона. Эта схема была реализована на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинант-ного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

В ходе работы изучено влияние редко встречающихся в Е. coli аминокислотных ко-донов на экспрессию гетерологичного белка, ген которого расположен на многоко-пийном экспрессионном векторе, под контролем регуляторных элементов транскрипции бактериофага Т7.

Изучено влияние способа выделения телец включения на протекание процесса фол-динга белка и предложена схема выделения телец включения, дающая минимальные потери продукта при высоком выходе ренатурированного белка.

Впервые изучена реакция ферментативного гидролиза гибридного белка протеина-зой Ulpl, ее зависимость от времени протекания, температуры, концентрации фермента и выбраны оптимальные условия ее проведения.

Научная новизна подтверждена патентом № 2473683 на изобретение «Способ промышленного культивирования штаммов К coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения» (приоритет от 15.12.2011).

Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании данные расширяют возможности оптимизации биотехнологических процессов производства генно-инженерных лекарственных средств.

Разработанная технология была использована для производства субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь на технологической площадке ООО «Фармапарк».

Была разработана и утверждена нормативная документация на производство субстанции «Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный безметиониновый», фармацевтическая статья предприятия, технологический регламент. Субстанция была зарегистрирована и внесена в Государственный реестр лекарственных средств под №

ФС 000434-151112.

Полученная субстанция была использована для производства препарата «ПегАль-тевир», представляющего собой пегелированный интерферон альфа-2Ь, являющийся пролонгированной формой интерферона альфа-2Ь, который в настоящее время проходит клинические испытания.

Личный вклад соискателя. Автор выполнял работу по оптимизации штамма-продуцента, отбору штаммов, созданию клеточных банков культур, исследованию ростовых свойств штамма, разрабатывал способ культивирования штамма-продуцента, способ выделения и очистки телец включения, процесс ренатурации и ферментативного гидролиза гибридного белка. Автор проводил валидацию технологического процесса на этапах создания рабочего банка, культивирования, выделения телец включения, ренатурации и ферментативного гидролиза и осуществлял перенос этих этапов на технологическую площадку ООО «Фармапарк», организовывал работу по анализу конечной субстанции.

Метод биохимической очистки субстанции был разработан к.б.н В.И. Купцовым, сотрудником отдела медицинской биотехнологии ФГУП "ГосНИИ генетика", работа по конструированию плазмид и трансформации штаммов-продуцентов была проведена сотрудниками лаборатории экспрессии генов эукариотических систем ФГУП "Гос-НИИгенетика" под руководством к.б.н Д.Г. Козлова, за что им выражается глубокая благодарность.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИ генетика» и совещании сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2011).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК, получен патент № 2473683 на изобретение.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 186 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практическое использование результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список литературы (125 источников, из них 106 иностранных авторов). Диссертация включает 45 рисунков, 39 таблиц, 6 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Промышленная технология получения субстанции рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, базирующаяся на использовании оптимизиро-

ванных по редким кодонам штаммах Е. coli с применением экспрессионной системы промотора Т7 под контролем lacUV5 оперона, использовании 3-х компонентной подпитки, позволила обеспечить выпуск препаратов, соответствующих Европейской фармакопее 7.0, не содержащих N-концевой метионин, с производительностью не менее (26,2±0,5) г чистого белка с одного производственного цикла процесса культивирования.

2. Универсальный способ культивирования штаммов-продуцентов на основе платформы Е. coli BL21(DE3) и промотора фага Т7, реализованный на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека и обеспечивающий продуктивность процесса (4,8 ± 0,8) г/л и (3,8 ± 0,8) г/л целевого белка соответственно.

3. Внедренный способ производства субстанции позволил увеличить эффективность процесса культивирования в 10 раз и снизить себестоимость продукта на 32% по сравнению с существующей технологией производства метионинсодержащего интерферона альфа-2Ь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2010 - 2012 гг. на базе ФГУП "ГосНИИ генетика". Субстанция безметионинового интерферона получена по разработанной технологии на технологической площадке ООО «Фармапарк». Анализ субстанции проведен в лаборатории физико-химического контроля ООО «Фармапарк».

Микроорганизмы. В работе использованы следующие штаммы Escherichia coli:

1). Штамм-реципиент Е. coli BL21(DE3) (Novagen) (E. coli В F- dem ompT hsdS(rB-mB-) gal(DE3)) - штамм лизогенен по фагу ШЕЗ, который содержит ген Т7 РНК-полимеразы под контролем lacUV5 промотора. Штамм был получен из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ);

2). ECR-HSI-T - сконструированный в ходе работы продуцент гибридного белка предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь (депонирован в ВКПМ под номером В-10414);

- ECR-HSI-2aT - сконструированный в ходе работы продуцент гибридного белка предшественника безметионинового интерферона альфа-2а (депонирован в ВКПМ под номером В-10700).

Питательные среды, растворы и реактивы. При проведении работы использованы компоненты питательных сред, минеральные соли, реагенты для биохимии производства Amresco, Sigma Aldrich, Panreac, Applichem, ионообменная смола CM

7

Sephsrose Fast Flow, C18, смола Superdex 75.

Методы исследований. Культивирование штаммов-продуцентов проводили в ферментере Biostat С DCU (BBI, Германия) общим объемом 42 л в объеме жидкой питательной среды от 10 л до 30 л. В процессе культивирования контролировали концентрацию растворенного кислорода в среде, величину pH, температуру процесса, объемную подачу воздуха, перемешивание. В ходе процесса культивирования в среду асептически вносили подпитки - стерильные растворы глюкозы, глицерина, лактозы. На 10-12 часу роста клетки штамма-продуцента накапливали гибридный белок в виде телец включения, видимых при увеличении хЮОО в фазово-контрастный микроскоп.

Для выделения и очистки телец включения биомассу размораживали в течение 12 часов при температуре +4°С, диспергировали и дезинтегрировали в дезинтеграторе APV ЮОО (APV, Дания) при давлении 650-700 бар. Степень дезинтеграции контролировали микроскопией в фазово-контрастном микроскопе при увеличении хЮОО. Клеточный гомогенат осаждали на проточной центрифуге Heraeus Stratos (Termo, Германия) при 15 ООО об/мин и скорости протока 55 мл/мин при температуре +4°С.

Осадок телец включения гибридного белка-предшественника безметионинового интерферона альфа-2Ь растворяли в растворе 6 М гуанидин гидрохлорида в присутствии 20 мМ дитиотреитола и подвергали ренатурации. Образец ренатурированного белка анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Dionex на сорбенте С18. В качестве стандарта использовали гибридный белок предшественник альфа-2Ь интерферона - очищенный и характеризованный внутрипроизводственный стандарт. Биохимическую очистку проводили на хроматографе GE Pharmacia АКТА Purifier.

Определение N-концевой последовательности безметионинового человеческого ре-комбинантного альфа-2Ь интерферона методом автоматического N-концевого секве-нирования осуществляли методом деградации по Эдману на автоматическом секвена-торе Precise 492 (Applied Biosystems, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии производства человеческого рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2Ь

Технология получения безметионинового человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 основана на синтезе в клетке Е. coli гибридного белка, в котором аминокислотная последовательность человеческого интерферона альфа-2 слита с последовательностью белка Saccharomyces cerevisiae SMT3 SUMO (Small Ubiquitinc-like

8

protein Modifier), входящем d семейство убиквитин-подобных белков, состоящего из 101-аминокислотного остатка. N-конец гибридного белка представлен молекулой SUMO, С-конец — молекулой рекомбинантного интерферона альфа-2.

частица SUMO интерферон альфа-2

Рис. 1. Схема получения безметионинового человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2 путем гидролиза гибридного белка протеиназой Ulp

Синтез гибридного белка начинается с ATG кодона, кодирующего метионин, который остается на N-конце молекулы SUMO. После процесса биосинтеза в ходе ферментативного гидролиза гибридного белка протеиназой Ulpl частица SUMO отщепляется и высвобождается рекомбинантный человеческий интерферон альфа-2, N-концевым аминокислотным остатком которого является цистеин, связанный дисульфидной связью с 98 цистеином белка (рис. 1). Таким образом, частица SUMO экранирует молекулу рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2 от образования на ее N-конце дополнительного формилметионина.

Исследование влияния замены редко встречающихся в Е. coli аминокислотных кодонов на уровень экспрессии гена интерферона альфа-2Ь человека в системе транскрипции бактериофага Т7

В исходном варианте ген гибридного белка, в котором закодирована аминокислотная последовательность нативного безметионинового интерферона апьфа-2Ь человека, слитая с последовательностью белка SMT3 SUMO, содержит двенадцать редко встречающихся у Е. coli аминокислотных кодонов, кодирующих аминокислоту аргинин. Было предложено провести замену 12 редко встречающихся кодонов на синонимичные прокариотические в гене, кодирующем рекомбинантный гетерологичный белок.

Ген с заданной нуклеотидной последовательностью был клонирован в плазмиду pET28-HSI(+). Полученными плазмидными ДНК был трансформирован штамм Е. coli BL21(DE3). После отбора клонов на селективной среде методом рестрикционного ана--

лиза и секвенированием ДНК было подтверждено соответствие последовательности генов запланированной.

Сравнение продуктивности штаммов ЕСЯ-НЗИ с оптимизированной и неоптими-зированной нуклеотидной последовательностью было проведено на колбах и в процессе культивирования в ферментере в объеме 15 л. Были поставлены ферментации по одной схеме процесса культивирования с оптимизированным и неоптимизированным штаммом.

Выход телец включения в процессе культивирования оптимизированного штамма составил (29,3±0,9) г с 1 л культуральной жидкости, а при культивировании неоптими-зированного - (18,6±1,0) г с 1 л культуральной жидкости (рис. 2).

100

90

80

70

а 60

»

сэ

сэ 50

и О 40

30

20

10

0

Ж

-г

.-Г

¿г---*'

1

4,5

8

10 И 12,5

час культивирования, ч -!- оптимизированный штамм — - — нсоптимизированный штамм

Рис. 2, Кривые роста оптимизированного и неоптимизированного штаммов ЕСЯ-Н81-Т при культивировании в объеме 15 л

Биомасса оптимизированного штамма содержала на 65% телец включения больше, общий выход телец включения с единицы объема ферментера у оптимизированного штамма был выше на 57 %.

Разработка процесса промышленного культивирования штамма-продуцента

интерферона альфа-2Ь

В ходе разработки процесса культивирования был обоснован состав питательной среды, включая, азотсодержащие компоненты, минеральные соли, соли металлов, факторы роста, витамины. Подобраны оптимальные величины объемного расхода воздуха,

перемешивания, величины рН, температуры, продолжительности процесса. Разработа-

10

на система хранения мастер и рабочих банков штамма-продуцента, схема подготовки инокулята.

Наибольшее внимание было уделено изучению и подбору индуктора и углеродсо-держащего компонента.

Подбор индуктора синтеза целевого белка. Для подбора оптимального вида индукции было проведено сравнительное культивирование штамма ECR-HSI-T с индукцией стандартным индуктором штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента К coli BL21(DE3) изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозидом (ИПТГ) и лактозой.

Показано, что индукция ИПТГ тормозит рост культуры ECR-HSI-T и приводит к более низкой конечной оптической плотности культуральной жидкости. Индукция лактозой не тормозит рост культуры, позволяет получить более высокий выход по биомассе и одновременно индукция лактозой обеспечивает более высокий уровень экспрессии целевого белка.

Углеродсодсржащий субстрат. Как углеродсодержащие субстраты были исследованы глюкоза, глицерин и лактоза. Были исследованы три варианта подпитки углерод-содержащими субстратами и индуктором: подпитка глюкоза/лактоза, подпитка глицерин/лактоза и подпитка глюкоза/глицерин/лактоза.

Были проведены исследования для подбора оптимального количества углеродсо-держащих субстратов глюкозы и глицерина, индуктора лактозы и точки индукции. Индуктор вносили в середине и окончании логарифмической фазы роста культуры. Выход целевого белка с 1 литра культуральной жидкости при индукции в логарифмической фазе возрос на 51% по сравнению с индукцией в начале стационарной фазы. При стандартизированном составе среды, методике подготовки посевного материала и схеме процесса культивирования оптимальная точка индукции была специфицирована как 25 - 30 o.e. Параметры процесса представлены на рисунке 3.

При использовании 3-х компонентной подпитки глюкоза/глицерин/лактоза выход телец включения с 1 л культуральной жидкости составил (27,0±0,8) г/л и таким образом увеличился на 114 % по сравнению с подпиткой глицерин/лактоза и на 125 % по сравнению с подпиткой глюкоза/лактоза. 3-х компонентная подпитка показала высокую эффективность и была выбрана для применения в промышленной технологии.

о 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 час культивирования, ч

- ОП, o.e. —DO, %

- обороты мешалки, 10 об/мин —ж— аэрация, л/мин -pH

Рис. 3. Параметры процесса ферментации по схеме углеродсодержащий субстрат — глюкоза/глнцерин/лаюгоза при культивировании штамма ЕОМШ-Т в объеме 15 л

Комплексная 3-х компонентная подпитка совмещает в одной схеме положительные стороны использования углеродсодержащих субстратов глицерина и глюкозы. Глюкозу оптимально использовать на раннем этапе роста, при этом культура растет активно, глюкоза подавляет индукцию синтеза целевого белка, которая может возникнуть из-за наличия лактозы в компонентах питательной среды. Глицерин является нейтральным субстратом по отношению к лактозному оперону, культура на нем растет активно и при этом идет перестройка культуры на утилизацию лактозы и начинается синтез целевого белка. Лактозу вносят в оптимальной точке индукции.

Для усовершенствования технологической схемы 3-х компонентной подпитки была, во-первых, определена оптимальная концентрация индуктора; во-вторых, проведено исследование приведет ли повышение концентрации основного углеродсодержаще-го субстрата глицерина к повышению выхода, без увеличения продолжительности ферментации.

При уменьшении количества вносимой лактозы в ферментации выход телец включения с 1 культуралыюй жидкости снизился на 16 %. При увеличении количества лактозы и глицерина выход снизился на 36 %.

Сравнение выхода телец включения с 1 л культуральной жидкости при использова-

12

нии подпиток глюкозаУлактоза, глицерин/лактоза и глюкоза/глицерин/лактоза показано на рисунке 4.

30

м 25

« 20 £

и ¡г

1 15

л

я

и

к

К 10

О

Рис. 4. Сравнение эффективности ферментации штамма ЕСЫ-ШЬТ при культивировании с различными видами подпиток

Проведение установочных серий процесса культивирования в объеме 30 л. Три

установочные серии процесса культивирования, идущие последовательно друг за дру-

гом были проведены в объеме 30 л. На рисунке 5 приведена технологическая схема

этапа культивирования штамма-продуцента ЕСЯ-ШЫ в процессе производства без-метионинового интеферона альфа-2Ь.

Средний выход процесса культивирования составил (23,9 ± 0,9) г телец включения с 1 л культуральной жидкости. Было показано, что ферментация штамма-продуцента

ЕС1<-Н81-Т в объеме 30 л является воспроизводимой и стабильной.

Разработка процесса выделения и очистки телец включения

Очистка телец включения состоит из получения клеточного гомогената, выделения

из него телец включения и отмывки телец включения от примесей. Основная задача отмывки телец включения - повысить легкость процесса ренатурации белка и его дальнейшей биохимической очистки, минимизировав, при этом потери белка.

подпитка глюкоза/лактоза подпитка глицерин/лактоза подпитка

глюкоза'глицерин/лактоза

Рис. 5. Технологическая схема производства безметионинового интеферона альфа-2Ь — этап культивирования штамма-продуцента

Были исследованы четыре технологические схемы выделения телец включения, влияние состава буферных растворов, числа дезинтеграций, число стадий промывки буферными растворами на процесс ренатурации гибридного белка. Выбранный способ выделения телец включения позволил получать на стадии ренатурации гибридный белок с чистотой 70% и выходом 6-7% по отношению к сырому весу телец включения.

Для подтверждения воспроизводимости процесса и его стабильного выхода были проведены 3 установочные серии отмывки телец включения. Подтверждено, что процесс воспроизводим и стабилен, средний выход процесса отмывки по отношению массы телец включения к биомассе составляет (30,6±1,1) %.

Рис. 6. Технологическая схема производства безметионинового интеферона альфа-2Ь - этап выделения и очистки телец включения из биомассы штамма-

продуцента

На рисунке 6 приведена технологическая схема этапа выделения и очистки телец включения из биомассы штамма-продуцента в процессе производства безметионинового интеферона альфа-2Ь.

Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка

Ренатурацию и ферментативный гидролиз гибридного белка проводили в буферном растворе, содержащем пару окисленного и восстановленного глутатиона. Была исследована зависимость реакции ренатурации от концентрации гибридного белка, температуры, рН буферного раствора и концентрации глутатионов и подобраны оптимальные условия для проведения ренатурации.

Далее в ренатурационный буфер вносили фермент - протеиназу 1Лр1, которая обеспечивает высвобождение интерферона альфа-2Ь из состава гибридного белка. Была изучена зависимость протекания ферментативной реакции от концентрации фермента, температуры и времени протекания реакции и подобраны оптимальные условия проведения реакции. Полученный ренатурированный безметиониновый интерферон альфа-2Ь человека, содержащий корректно замкнутые дисульфидные связи, подвергали биохимической очистке.

Технологическая схема производства безметионинового интерферона альфа-2Ь - растворение телец включений, ренатурация и гидролиз гибридного белка /

(V дены начало 12.00 : wWHaima 16,00 Вромя процесса 4 ч растворе^ тожч ^^^талючоний, коми, т 'ЪОДО MPMSF : - 6 М гуэнидиигвдрохлород ; 0.5MDTT

Ренат>рациаи-ый контейнер с погружной мешалкой ВеЛсо

Ренапурация гибрцдмо'о бета, 12, оС

Буфер 7 (20 тЫ Tris-HQ рН 8,0: 0,8 М игез; 35 тМ МзО; 0,1% Triian Х-114; 1 тМ GSH; " ImMGSSG) 0.25М ЭДТА

;: IV день; начало 16.00 Л^день: окончание 10.00 Время процесса 18 ч

V день: начало 10.00 окончание 15 00

Время процесса 5 ч

KartcyribHbte фильтры Domini* Hunter полисупьфок 0,22 ш

Рис. 7. Технологическая схема производства безметионинового ингеферона альфа-2Ь — этап биохимическая очистка субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь

На рисунке 7 приведена технологическая схема этапа растворения телец включени-ия, ренатурации и гидролиза гибридного белка предшественника безметионинового интеферона альфа-2Ь.

Очистка субстанции человеческого рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2Ь

Полученный ренатурированный интерферон подвергали очистке с помощью ионообменной хроматографии на ионообменной смоле CM Sephsrose Fast Flow, высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе С18 и гель фильтрационной хроматографии на смоле Superdex 75. После каждого этапа очистки проводили фильтрацию через апирогенные фильтры с размерами пор 0,22 микрон для уменьшения вероятности микробиологической контаминации и содержания механических включений.

Были проведены 3 установочные серии процесса производства субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь.

Средний выход процесса составляет (551±54) мг целевого белка с серии или (875 ±

86) мг белка с 1 л культуральной жидкости. По итогам 3-х серий можно утверждать, что все значения лежат в пределах иСЬ и ЬСЬ, что говорит о стабильности и воспроизводимости процесса производства безметионинового интерферона альфа-2Ь (рис. 8).

о

.О ы я

<я о.

•е-

|Л

4 хя

та о

св К

к аз

о о>

а. т

а» н

^ о ^ §

% 1 Я 2

5 к

и о С* о, о е

2 « ►а о

И к

ее о

о

775 725 675 625 575 525 475 425 375 325

1911

2011

22 11

-ись

714

714

714

■ЬСЬ

389

389

389

—ф— среднее

551

551

551

-О— выход с серии, мг

567

491

596

Рис. 8. Карта Шухарта для 3-х установочных серий производства субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь

На рисунке 9 приведена технологическая схема этапа биохимической очистки субстанции в процессе производства безметионинового интеферона альфа-2Ь.

Оценка параметров качества, полученной субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь

Субстанция безметионинового интерферона альфа-2Ь была проанализирована согласно требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0. Было показано полное соответствие полученной субстанции заданным параметрам качества.

Технологическая схема производства безметионинового интерферона альфа-2Ь — очистка субстанции^/

."Л/день: начало 15.00 окончание 20.00 Время процесса 5 ч ^^^шоьтообмен на я хроматограф^*», N21 на сорбенте ^*^****^карбоксиметилсефароэс (КМ1^*?* Буфер 8 (0,05 М №Ас; 0,001 М ЭДТА, рН 5,0) Буфер 9 (0.05 М МаАс; 0,5 М №СІ, 0,001 М ЭДТА, рН 5,5) Буфер 11 (12,5 тМ Ас№, 1 тМ ЭДТА, рН 4.5)

; Обрэтнофазная роматография (ЯРС) - 3 циыт

£тионнообмейная хроматография Г на ссрбенто карбоксиметилсефарозе (КМ2)

Градиент Буфера 9 в Пуфсро 8 от О % до 100%

Контроль по ФСП

Рис. 9. Технологическая схема производства безметионинового интеферона альфа-2Ь — этап биохимическая очистка субстанции безметионинового интерферона альфа-2Ь

Исследование полученного человеческого рекомбинантного альфа-2Ь безметионинового интерферона методом автоматического 1Ч-концевого секвсниро-вания. Для доказательства, что полученный человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2Ь является безметиониновым интерфероном и соответствует требованиям Европейской фармакопеи 7.0 было проведено определение Ы-концевой аминокислотной последовательностей (15 аминокислотных остатков) у образцов из 3-х установочных серий. Установлено, что образцы всех 3-х серий имеют идентичные аминокислотные последовательности, которые полностью совпадают с ТМ-концевой аминокислотной последовательностью интерферона альфа-2Ь человека, указанной в Европейской фармстатье. Метионин в М-концевом положении отсутствует.

18

Экономическая эффективность разработанной технологии

Технология получения интерферона альфа-2Ь безметионинового разрабатывалась вместо существующей технологии производства метионинового интерферона (регистрационный номер фармацевтической субстанции Р N003726/01). Разработанная технология имеет ряд преимуществ. При использовании одной технологической линейки, с аналогичными затратами трудоресурсов персонала она позволяет получать большие объемы продукта. Внедренный способ производства позволил увеличить эффективность процесса культивирования в 10 раз и снизить себестоимость продукта на 32% по сравнению с существующей технологией производства метионинсодержащего интерферона альфа-2Ь. Новая технология позволяет более эффективно и экономично использовать уже имеющееся оборудование, увеличить масштабы производства, повысить качество препарата, не меняя существующую технологическую линейку.

Разработка технологии культивирования штамма-продуцента безмстиоинового интерферона альфа-2а

Как уже упоминалось выше, интерферон альфа-2а отличается от интерферона аль-

фа-2Ь тем, что в молекуле интерферона альфа-2а в положении 23 находится лизин, а у альфа-2Ь — аргинин. Столь малые различия в структуре белка привели к мысли создания технологии получения безметионинового интерферона альфа-2а, аналогичной технологии получения безметионинового интерферона альфа-2Ь.

Штамм-продуцент интерферона альфа-2а аналогичен штамму интерферона альфа-2Ь, за исключение того, что в гене, кодирующем последовательность гибридного белка, в положении 23 белка интерферона альфа-2а находится аминокислота лизин, кодируемая кодоном AGC.

Была сконструирована плазмида pET28-HSI-T-2aT с одной нуклеотидной заменой и создан штамм-продуцент интерферона альфа-2а ECR-HSI-2aT - продуцент гибридного белка предшественника безметионинового интерферона альфа-2а (депонирован в ВКПМ под номером В-10700).

Разработанная технология производства безметионинового интерферона альфа-2Ь полностью воспроизвелась для безметионинового интерферона альфа-2а.

ВЫВОДЫ

1. Обоснован эффективный и рентабельный способ получения интерферона альфа-2Ь и интерферона ачьфа-2а, не содержащих N-концевой метионин, при котором в клетках штамма-продуцента Е. coli синтезируется гибридный белок, состоящий из

слитых последовательностей интерферона и дрожжевого белка SUMO. После процесса биосинтеза в ходе ферментативного гидролиза частица SUMO отщепляется и высвобождается безметиониновый рекомбинантный человеческий интерферон альфа-2 без примеси фракции метионинсодержащего интерферона альфа-2.

2. Получен бактериальный Е. coli штамм-продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2Ь человека с уровнем накопления целевого белка 30 % от суммарных клеточных полипептидов, благодаря оптимизации нуклеотидной последовательности гена интерферона включением в его состав часто встречающихся в Е. coli синонимических аминокислотных кодонов. Оптимизация нуклеотидной последовательности увеличила выход телец включения с единицы объема ферментера на 57 %. По аналогии получен новый промышленный продуцент рекомбинантного интерферона альфа-2а человека с продуктивностью, составляющей более 25% от суммарных клеточных полипептидов.

3. Разработан универсальный способ культивирования штаммов-продуцентов на основе платформы К coli BL21(DE3) и промотора фага Т7. Способ реализован на ряде штаммов, в т.ч. штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметио-нинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека и обеспечивает продуктивность процесса (4,8±0,8) г/л и (3,8±0,8) г/л целевого белка соответственно.

4. Разработан способ выделения и очистки телец включения, процесс ренатурации, процесс ферментативного гидролиза гибридных белков предшественников и схема дальнейшей очистки безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека с выходом (875 ± 86) мг и (700 ± 63) мг с 1 л культуралыюй жидкости соответственно.

5. Показано соответствие параметров качества полученного безметионинового интерферона альфа-2Ь требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0.

6. Внедренный способ производства позволил увеличить эффективность процесса культивирования в 10 раз и снизить себестоимость продукта на 32%, а также более эффективно и экономично использовать уже имеющееся оборудование, увеличить масштабы производства, повысить качество препарата, не меняя существующую технологическую линейку.

7. Разработанный технологический процесс реализован и валидирован на производственной площадке ООО «Фармапарк». Разработана и утверждена нормативная документация на производство субстанции «Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный безметиониновый». Субстанция была зарегистрирована и внесена в Государственный реестр лекарственных средств под № ФС 000434-151112.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Штаммы-продуценты безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а были депонированы в ВКПМ (Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов) под номером В-10414 и В-10700 соответственно.

2. На основании разработанной схемы культивирования был получен патент № 2473683 на изобретение «Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения» (приоритет от 15.12.2011).

3. Разработан и утвержден технологический регламент на производство субстанции безметионинового интерферона альфа-2, содержащий схему и описание производственного процесса под № ПУР 56882590-06-07.

4. Утверждена ФСП (фармакопейная статья предприятия) на субстанцию безметионинового интерферона альфа-2Ь под № ФС 000434-151112.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Рекомендовать использовать разработанную схему промышленного культивирования для новых штаммов-продуцентов, созданных на основе BL21(DE3).

2. Рекомендовать использовать субстанцию безметионинового интерферона альфа-2Ь для изготовления пегилированных и спреевых ГЛФ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Стратонова Н.В., Леонов B.C., Литвинова НА. Разработка промышленного способа культивирования штамма-продуцента гибридного белка-предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь // Ветеринарная медицина. -2012.-№3-4.-С. 22-24.

2. Стратонова Н.В., Леонов B.C., Литвинова H.A. Способ выделения и очистки телец включения гибридного белка-предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь // Ветеринарная медицина. - 2012. -№3-4. - С. 24-26.

3. Хамитов P.A., Скрыпин В.И., Литвинова H.A., Леонов B.C., Стратонова Н.В. Способ промышленного культивирования штаммов Е. coli, полученных на основе штаммов BL21(DE3), несущего ген Т7 RNA полимеразы под контролем lacUV5 промотора, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения // Патент России № 2473683.2013. Бюл. № 3.

Подписано в печать:

23.04.2013

Заказ № 8401 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Стратонова, Наталия Валерьевна, Москва

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции

промышленных микроорганизмов»

На правах рукописи

04201357105

Стратонова Наталия Валерьевна

Разработка технологии промышленного производства безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Хамитов Р.А.

Москва-2013 г

Содержание

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................................14

1.1. Семейство белков человеческого интерферона альфа................................................14

1.2. Влияние наличия N-концевого метионина в молекуле интерферона 17 альфа-2 на свойства белка...............................................................

1.3. Существующие в настоящее время способы получения интерферона 19 альфа-2....................................................................................

1.4. Современные требования к параметрам качества субстанции интерфе- 23 рона альфа-2................................................................................

1.5. Способы получения интерферона без N-концевого метионина в Е. coli. 26

1.6. Технология получения рекомбинатных белков в Е. coli..........................................31

1.7. Обеспечение безопасности получаемого препарата для пациента..................35

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................................................36

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................36

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................................................................48

2.2.1. Разработка технологии производства безметионинового интерферо- 48

на альфа-2Ь.................................................................................

2.2.1.1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 48 фа-2Ь..........................................................................................

2.2.1.2. Исследование влияния замены редко встречающихся в Е. coli ами- 53 нокислотных кодонов на уровень экспрессии гена интерферона альфа-2Ь человека в системе транскрипции бактериофага Т7...............................

2.2.1.3. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гиб- 59 ридного белка интерферона альфа-2Ь................................................

2.2.1.3.1. Подбор оптимального состава культуральной среды..................................59

2.2.1.3.2.Азотсодержащий компонент................................................................................................61

2.2.1.3.3. Минеральные соли......................................................................................................................66

2.2.1.3.4. Факторы роста....................................................................................................................................51

2.2.1.3.5. Состав питательной среды для культивирования штамма ЕСЫ- 74 Ш1-Т........................................................................................

2.2.1.3.6. Подбор оптимальных условий культивирования............................................74

2.2.1.3.7.Подбор схемы получения инокулята..............................................................................78

2.2.1.3.8. Углеродсодержащие субстраты и индуктор..........................................................79

2.2.1.3.9. Проведение установочных серий процесса культивирования в 105 объеме 30 л.................................................................................

2.2.1.4. Разработка процесса выделения и очистки тел включений гибрид- 106 ного белка интерферона альфа-2Ь..........................................

2.2.1.4.1. Подбор оптимальных условий процесса выделения и очистки те- 106

лец включений............................................................................

2.2.1.5. Растворение, ренатурация и гидролиз гибридного белка............................116

2.2.1.6.Очистка субстанции человеческого рекомбинантного безметиони- 121

нового интерферона альфа-2Ь..........................................................

2.2.1.7. Исследование полученного человеческого рекомбинантного альфа- 127

2Ь безметионинового интерферона методом автоматического N-концевого

секвенирования............................................................................

2.2.1.8. Определение подлинности человеческого рекомбинантного безме- 128 тионинового интерферона альфа-2Ь методом пептидного картирования в сравнении с Европейским стандартным образцом................................

2.2.1.9. Технологическая схема........................................................ 139

2.2.1.10. Валидация технологического процесса производства человече- 140 ского рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2Ь

2.2.1.12. Экономическая эффективность процесса................................. 150

2.2.1.13. Перенос технологии на производственную площадку ООО «Фар- 152

мапарк».....................................................................................

2.2.2. Разработка технологии производства безметионинового интерферо- 152 на альфа-2а.................................................................................

2.2.2.1. Создание штамма-продуцента гибридного белка интерферона аль- 153 фа-2а.....................................................................................

2.2.2.2. Разработка процесса культивирования штамма-продуцента гиб- 155 ридного белка интерферона альфа-2а................................................

3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ........................................................158

4. ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................162

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ 164 РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ... 165

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................166

8 .ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................................180

Приложение 1 - Патент № 2473683

Приложение 2, 3 - Справки депонирования штаммов-продуцентов (ВКПМ)

Приложение 4 - Титульный лист ФСП № 000434-151112 на субстанию безметионинового интерферона альфа-2Ь

Приложение 5 - Титульный лист Пускового регламента ПУР 56882590-0607 на производство субстацции безметионинового интерферона альфа-2Ь

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Повышение эффективности отечественного биофармацевтического производства, ликвидация технологического отставания отечественной биотехнологии является актуальной проблемой, решение которой связано, в том числе, с коммерциализацией созданных передовых технологий, применением эффективных систем экспрессии рекомбинантных белков и технологий культивирования клеток.

Препараты интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2Ь широко используются как в ветеринарии, так и медицине. В медицине препараты интерферона альфа-2а и интерферона альфа-2Ь широко используются для лечения социально значимых и тяжелых заболеваний, таких как хронический вирусный гепатит В и С (17, 14, 71, 3), для лечения онкологических болезней, в том числе волосатоклеточного лейкоза, хронического миелолейкоза, неходжкинской лимфомы, меланомы, множественной миеломы, саркомы Капоши на фоне СПИДа, прогрессирующего рака почки и других (12), а также для профилактики гриппа и ОРВИ у взрослых и детей (9). Широкое применение интерферонов альфа-2 связано с их действием на реакции инфекционного и противоопухолевого иммунитета.

Миллионы людей в России используют препараты интерферона альфа-2, в том числе и в длительных курсах лечения. В связи с этим, необходимо, во-первых, обеспечить внутренний рынок России эффективной субстанцией интерферона альфа-2а и альфа-2Ь отечественного производства, во-вторых, создать коммерчески рентабельную технологию производства субстанции, основанную на применении современных высокопродуктивных систем экспрессии рекомбинантных белков и новых технологий культивирования генетически модифицированных бактериальных продуцентов.

Современные требования к качеству субстанции рекомбинантного интерферона альфа-2, изложены в Европейской фармакопее, 7-ой редакции.

Параметры качества субстанции включают в себя аминокислотную последо-

5

вательность белка, его происхождение, чистоту, физико-химические свойства, активность и стабильность, причем эти параметры должны контролироваться валидированными методиками, методическое описание которых приведено в Европейской фармакопее, 7-ой редакции.

При производстве «биодженерика», которым является и интерферон альфа-2, для обеспечения эффективности и безопасности продукта, необходимо обеспечить его соответствие установленному стандартному образцу. В международной практике, как указано в Европейской фармакопее, в качестве стандарта должен использоваться референсный образец Chemical Reference Substances (CRS) интерферона альфа-2а (CRS 10320300) и интерферона альфа-2Ь (CRS 10320301), рекомендованный Европейским управлением по качеству лекарственных средств (The European Directorate for the Quality of Medicines).

Только после проведения всех испытаний, доказывающих, что полученный интерферон альфа-2 соответствует стандарту, субстанция интерферона альфа-2 может быть признана эффективной и безопасной. Если же полученный продукт отличается от стандартного образца, по каким либо параметрам, например, по аминокислотной последовательности, трехмерной структуре, наличию примесей, то продукт может обладать сниженной биологической активностью, повышенной иммуногенностью и вызывать непредсказуемые побочные эффекты.

Основной проблемой при производстве рекомбинантного интерферона является удаление из молекулы N-концевого метионина, который образуется при синтезе рекомбинантного белка рибосомой бактериальной клетки и может влиять на иммуногенность и стабильность (S. Hermeling, D.J.A., 2004; M. Kamionka., 2011; Ben-Bassat A., Bauer К.; 1987).

В Европейской фармакопее указано, что молекула рекомбинатного человеческого интерферона альфа-2 должна состоять из 165 аминокислот, в положении 23 у интерферона альфа-2а находится лизин, у альфа-2Ь - аргинин, N-концевым аминокислотным остатком должен являться цистеин, свя-

6

занный дисульфидной связью с 98 цистеином белка. Любой рекомбинант-ный интерферон, чья аминокислотная последовательность отличается от указанной, не может считаться «биодженериком», аналогичным стандартным международным образцам, в том числе по биологической активности и безопасности.

Однако синтез любого белка рибосомой бактериальной клетки инициируется АТГ-кодоном, поэтому N-конец любого бактериального белка представлен формилметионином. При эффективной экспрессии рекомбинантных белков в современных экспрессионных системах рекомбинантные белки накапливаются в клетках прокариот в больших количествах. Отщепление фор-милметионина в этом случае идет неэффективно, и рекомбинантный белок содержит дополнительный формилметионин на N-конце молекулы, который может влиять на иммуногенность и стабильность белка (51, 70, 27).

В России на настоящий момент не существует технологии производства отечественной субстанции рекомбинатного человеческого интерферона аль-фа-2а и интерферона альфа-2Ь, удовлетворяющей всем параметрам качества, указанным в Европейской фармакопее, в частности отсутствию N-концевого метионина в молекуле рекомбинантного интерферона альфа-2.

Разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства отечественной субстанции интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, позволяющей получать продукт, чья себестоимость ниже себестоимости существующих аналогов более низкого качества, является актуальной задачей.

На настоящий момент FDA (Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США) и ЕМЕА (Европейское агентство по лекарственным средствам) выдали лицензию на применение в фармацевтике более чем 150 рекомбинантных белков (83). Мировые продажи биофармацевтических препаратов на 2010 год оцениваются в 70-80 миллиардов долларов (114). Для производства 30 % рекомбинатных фармацевтических белков в качестве штаммов-продуцентов используются бактерии,

7

среди которых самой часто используемой является Е. coli. В современном биотехнологическом производстве широко используются эффективные системы экспрессии рекомбинантных белков на основе генетически модифицированных микроорганизмов, одной из которых является система на основе штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) и экспрессионной системы промотора фага Т7 под контролем lac оперона. Эта экспрессионная система широко используется и в научных исследованиях, и в промышленной биотехнологии.

На основе штамма Е. coli BL21(DE3), который является одной из наиболее эффективных систем экспрессии рекомбинантных белков, созданы штаммы-продуценты ряда важнейших фармацевтических продуктов, таких как соматотропин, проинсулин, различные виды интерферонов.

Существует стандартный подход к культивированию штаммов-продуцентов BL21(DE3), при котором индуктором синтеза является ИПТГ (изопропил-|3-0-1-тиогалактопиранозид). Этот подход может применяться для тестирования штаммов в процессе разработки, но для использования в промышленности он малоэффективен - из-за низкого выхода продукта при такой схеме культивирования и высокой стоимости ИПТГ. Для реализации в производстве необходимо разработать высокоэффективную схему культивирования, которая должна обеспечить высокий выход целевого белка и позволить создать коммерчески рентабельную технологию.

Разработка и оптимизация процесса культивирования часто идет эмпе-рическим путем. Создание универсальной технологической схемы процесса культивирования для штаммов-продуцентов, созданных на основе одной экспрессионной системы, позволило бы снизить затраты в процессе фармацевтической разработки.

При широком использовании штаммов-продуцентов на основе разработка такого универсального способа культивирования является актуальной задачей.

Предложенная схема культивирования штаммов-продуцентов на основе штамма-реципиента ВЬ21(ОЕЗ) позволяет применять ее для новых продуктов и оптимизировать уже существующие технологии. При широком использовании штаммов-продуцентов на основе штамма-реципиента ВЬ21(БЕЗ) в современном биотехнологическом производстве разработка такого универсального способа культивирования является актуальной задачей.

Таким образом, разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства субстанции интерферона альфа-2Ь и альфа-2а, в том числе и разработка высокоэффективной схемы культивирования штаммов-продуцентов и биохимической очистки, позволяющей получать продукт, чья себестоимость ниже себестоимости существующих аналогов более низкого качества является актуальной задачей.

Создание коммерчески рентабельной технологии, обеспечивающей получение отечественной субстанции интерферона альфа-2, препараты которого внесены в Реестр жизненно важных и необходимых лекарственных средств, соответствующей по параметрам качества и безопасности современным требованиям, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлись разработка и реализация на практике технологии промышленного производства субстанции интерферона альфа-2Ь и интерферона альфа-2а, соответствующей современным требованиям качества и безопасности, в том числе требованию отсутствия в белке Ы-концевого метионина.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создать и оптимизировать экспрессионные конструкции гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

2. Разработать универсальную схему культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. соИ ВЕ21(ОЕЗ), дающую высокий выход по биомассе и целевому белку.

3. Разработать способ выделения и очистки телец включений, процесс рена-турации, процесс ферментативного гидролиза гибридных белков предшественников и схему дальнейшей очистки безметионинового интерферона альфа-2Ь и альфа-2а человека.

4. Оценить соответствие параметров качества полученного безметионинового интерферона альфа-2Ь требованиям Фармстатьи предприятия, гармонизированной с Европейской фармакопеей 7.0.

5. Провести валидацию и перенос технологического процесса на производственную площадку ООО «Фармапарк».

6. Зарегистрировать субстанцию «Интерферон альфа-2б человеческий ре-комбинантный безметиониновый» и внести ее в Государственный реестр лекарственных средств.

Научная новизна. Впервые в России разработана универсальная технология промышленного культивирования штаммов-продуцентов, созданных на основе штамма-реципиента Е. coli BL21(DE3) и экспрессионной системы промотора фага Т7 под контролем lac оперона. Эта схема была реализована на ряде штаммов, в том числе штаммах-продуцентах гибридного белка предшественника безметионинового рекомбинантного интерферона аль-фа-2Ь и альфа-2а человека.

В ходе работы изучено влияние редко встречающихся в Escherichia coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного белка, ген которого расположен на многокопийном экспрессионном векторе, под контролем регуляторных элементов транскрипции бактериофага Т7.

Изучено влияние способа выделения телец включений на протекание процесса фолдинга белка и предложена схема выделения телец включений, дающая минимальные потери продукта при высоком выходе ренатурирован-