Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения"

На правах рукописи

ГАВРИКОВ АЛЕКСЕЙ ВАЛЕРЬЕВИЧ

Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного

назначения

03.00.23. — биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006 год

Работа выполнена в производственной лаборатории Закрытого Акционерного Общества «Мосагроген» (ЗАО «Мосагрогсн»).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор C.B. Машко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кандидат технических наук, доцент

А.С. Миронов А.Е. Кузнецов

Ведущая организация: Факультет Биоинженерии и Биоинформатики

МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится « декабря 2006 года в часов на

заседании Диссертационного совета ДМ212.204.13 при Российском химико-технологическом Университете имени Д.И. Менделеева по адресу: 125047 Москва, Миусская пл. 9.

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре Российского химико-технологического Университета имени Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан «_ _» ноября 2006 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета ДМ212.204.13 кандидат технических наук У*/¿¿З

И.В. Шакир

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

С развитием методов молекулярной биологии, биохимии и биотехнологии повышаются требования качества к практически важным продуктам, получаемым в данных областях. Одним из примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий «рекомбинантных ДНК». Это, в частности, относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, — человеческому рекомбинантному интерферону а-2Ь.

Наиболее выгодным экономически является использование штаммов-продуцентов, в которых уровень биосинтеза целевого белка составляет десятки процентов от суммарных клеточных полипептидов (в этих случаях, как правило, гетерологичный белок накапливается в бактериальной клетке в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).

Создание подобных бактериальных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из которых - стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся аминокислотных кодонов, в гене, клонированном в составе мультикопийного экспрессионного вектора, подобная генетическая конструкция будет нежизнеспособна, или же, уровень синтеза целевого белка будет крайне низким. Другим фактором неэффективной экспрессии гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно, с сильного бактериального или фагового промотора) с процессом репликации рекомбинантной плазмиды, что возможно даже при наличии теминатора транскрипции в 3'-концевой нетрансли-руемой области целевого гена.

Повышение требований к чистоте препаратов на основе рекомбинантных белков, выделяемых из бактериальных штаммов-продуцентов, потребовало развитие новых биохимических методов анализа белков. Появились такие анализы на чистоту, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (ЛАЛ-тест). Усложнение аналитического контроля привело к принципиальным изменениям технологий производства субстанции рекомбинантных белков, т.к. применение старых технологических путей являлось не удовлетворительным по качеству конечного продукта, или же, экономически невыгодным.

При суперсинтезе гетеролошчных белков в клетках Е. соИ (в таких количествах, что целевой белок начинает образовывать тельца включения), бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих случаях бактериальная культура практически не растет после индукции синтеза целевого белка. Кроме того, в условиях стресса, накапливающиеся в тельцах включения белки могут иметь нежелательные модификации, начиная с неотщепленного Ы-концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых аминокислотных остатков белка. Подобные модифицированные варианты

могут ие отделяться от целевого белка при его очистке с помощью различных видов гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографий (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как при модификации изменение конформации белка не происходит, а изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению немодифицированной молекулой. Но при правильном подборе условий модифицированный белок можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а, следовательно, при большом количестве таких молекул в препарате, он не удовлетворяет критериям необходимой чистоты.

Было замечено, что количество и характер подобных примесей в препаратах рекомбинантных белков зависит от условий ферментации штамма-продуцента, а не только от использованной технологии выделения и очистки целевого продукта.

Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции реком-бинантного белка для ее дальнейшего практического использования при создании медицинских или ветеринарных препаратов представляет собой комплексную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные этапы.

Цели и задачи работы.

Целями работы являлись:

1) увеличение эффективности биосинтеза рекомбинантного интерферона бактериальными продуцентами (на примере лейкоцитарного интерферона a-F человека);

2) исследование влияния условий ферментации рекомбинантных штаммов Е. coli на образование модифицированных примесей целевого белка (на примере штамма-продуцента интерферона a-2b человека);

3) исследование возможности создания технологии выделения и очистки интерферона a-2b биомассы штамма-продуцента с оптимальным соотношением «цена-качество».

В ходе работы были решены следующие задачи:

• Созданы и клонированы варианты гена человеческого a-F интерферона с различными заменами редко встречающихся эукариотиче-ских кодонов.

• Создан штамм-суперпродуцент человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

• Разработаны несколько вариантов регламента ферментации штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

• Созданы несколько вариантов технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В ходе работы было подробно рассмотрено влияние редко встречающихся в E.coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного гена, расположенного на мультикопийном экспрессионном векторе, под контролем ре-гуляторных элементов транскрипции бактериофага Т7.

Разработан протокол ферментации штамма-продуцента

интерферона а-2Ь, в котором индукция синтеза интерферона осуществляется лактозой, вместо добавления ИГГГГ. Подобный подход значительно снижает себестоимость процесса ферментации. А также позволяет получать большие количества целевого продукта.

Показано, что за счет оптимизации процесса ферментации можно получать полупродукт более высокого качества, что позволяет упростить дальнейший процесс очистки интерферона, уменьшив количество хроматографических стадий, т.е. понизить себестоимость продукта.

Разработанные технологии позволили увеличить рентабельность производства субстанции интерферона а-2Ь на базе предприятия ЗАО «Мосагроген», Москва. Получаемая субстанция интерферона а-2Ь используется для приготовления ветеринарных лекарственных препаратов «Миксоферон®» и «Кино-рон®».

Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на: Международной конференции «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва-Минск, ноябрь 2001 г.); конференции, посвященной 60-тилетию МИФИ, (Москва, январь 2002); научно-производственных семинарах ЗАО «Мосагроген» (Москва, 20042006); семинаре отдела молекулярной биологии и биотехнологии ФГУП Гос-НИИгенетика (Москва, октябрь 2006).

Публикации

По теме диссертации опубликовано четыре статьи в отечественных журналах и одно тезисное сообщение в материалах научных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изложена на .страницах, включая /¿¿рисунков и SS таблиц. Список цитируемой литературы содержит St%/8 источников, в том числе на русском языке.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии гена интерферона a-F человека в системе транскрипции бактериофага Т7.

1.1. Создание вариантов гена интерферона a-F человека с различными заменами редко встречающихся в E.coli аминокислотных кодонов.

Человеческий интерферон a-F является одним из лейкоцитарных интер-феронов. В своем природном варианте ген интерферона a-F содержит редко встречающиеся для Е. coli аминокислотные кодоны — Arg - 6 кодонов AGA и 4

Рис. 1. Природный ген человеческого лейкоцитарного интерферона a-F. Жирным шрифтом в рамках отмечены редко встречающиеся в Е. coli кодоны.

1 11 21 31 41 51 61

MCDLPQTHSLGN R R A L I L L А 20

atgtgtgatctgcctcagacccacagcctgggtaat|Sggagg|gccttg|ata|ctcctggca

61 71 81 91 101 111 121

Q М G R ISPFSCLKD R H D F G F P 40

eaaatg)ggaaga[atctctcctttctcctgcctgaaggac|aga|catgacttt|gga]ttc|cccj

121 131 141 151 161 171 181

QEEFDGNQFQK. AQAISVLHE 60

caggaggagtttgatggcaaccagttccagaaggctcaagccatctctgtcctccatgag

181 191 201 211 221 231 241

M I QQ T FNL FS TKDS SATWE Q 80

atgatccagcagaccttcaatctcttcagcacaaaggactcatctgctacttgggaacag

241 251 261 271 281 291 301

S L L EKFSTELNQQLNDLEAC 100

agcctc|ota|gaaaaattttccactgaaettaaccagcagctgaatgacctqqaagcctqc

301 311 321 331 341 351 361

V I Q E V G V E E T P^ LMNVDSILA 120 gtg|ata|caggaggtt|gggjgtggaagagact|ccc|ctgatgaatgtggactccatcctggct

361 -371 381 391 401 411 421

V К К Y F Q R ITLY. LTEKKYSPC 140 gtgaagaaatacttccaa[aga|atcactctttatctgacagagaagaaatacagcccttgt

421 431 441 451 461 471 481

A W E V V R A E I M R SFSLSKIFQ 160

gcctgggaggttgtc|aga|gcagaaatcatglaga|tccttctctttatcaaaaatttttcaa

481 491 501

E R L R R К E & 169

gaa|aga|tta|aggagg|aaggaataa

кодона AGG, а также относительно редко встречающиеся Pro (2 — ССС), Не (2 -AUA), Leu (1 — CUА) и Gly (2 - GGA) кодоны (См. рис 1). Одним из факторов стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного гена.

Существует большое количество данных, когда замена редко встречающихся в Е. coli Arg-кодонов AGA/AGG на синонимичные прокариотические в гене, кодирующем гетерологичный белок, приводила к многократному увеличению его продукции (до 20 - 50% от суммарного клеточного белка). В Е. coli эти кодоны встречаются со следующими частотами — AGA - 2,8 на тысячу кодонов, AGG — 1,7 на тысячу, при максимальной встречаемости Arg-кодонов — CGU, CGC - 20,6. В то время, как, например, у человека - 11,5 и 11,3 соответственно (максимальное - CGG - 11,6). В природном гене IFN-aF находится 10 таких кодонов (2% от всех кодонов в гене). Наличие тандемов AGA или AGG кодонов, с большой вероятностью приводит к «сдвигу рамки считывания» при трансляции соответствующего гена в E.coli (Span]aard, R.A., et al. (1990). Nucleic Acids Res. 18(17): 5031-6). Подобных тандемов в гене интерферона a-F два

— AGGAGG — 37-42 пар оснований и 490-495 п.о., при общем размере гена — 500 п.о. Одиночные Arg-кодоны встречаются исключительно как AGA (см., Рис. 1).

Методом ПЦР в природном гене интерферона были заменены редко встречающиеся для Е. coli кодоны, на часто встречающиеся. В ходе работы были созданы пять вариантов гена интерферона a-F. Гены клонированы на рЕТ22Ь(+). Полученными плазмидными ДНК был трансформирован штамм TG1. После отбора клонов методом рестрикционного анализа, соответствие последовательности генов запланированной было подтверждено сиквенированием ДНК методом Сэнгера. Характер нуклеотидных замен и их количество для разных генов интерферона a-F, представлены в Таблице 1.

Полученными плазмидами с различными вариантами гена (кроме варианта №1), были трансформированы клетки штамма Е. coli BL21(DE3). Трансформанты культивировали в пробирках, в V = 5 мл жидкой среды LB // 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С и 240 грш, до значений оптической плотности 0,5-0,6 и индуцировали добавлением ИПТГ до 1 мМ, после чего культивировали еще 2 часа, и определяли количество интерферона методом белкового SDS электрофореза и методом биологического тестирования. Результаты представлены в Таблице 2.

Вариант № 1 представлял собой природный ген интерферона a-F, без изменения кодонов, клонированный на рЕТ22Ь(+) с плазмиды pPR-TGATG-CI-IFN-F. Проверка клонов показала очень низкий процент вставки. Последующее сиквенирование генов отобранных клонов выявило наличие мутаций, приводящих к сдвигу рамки считывания, т.е. клонировать природный ген в экспресси-онную систему под контролем регуляторных элементов фага T7 не удалось.

Рекомбинантные плазмиды с вариантами генов № 3 и № 4 не давали клонов после трансформации штамма BL21(DE3).

Характеристики роста индуцированных штаммов с вариантами гена № 2 и № 5 были примерно одинаковыми, но у штамма с вариантом гена № 6 (у которого заменены все редко встречающиеся кодоны) ОВкоиечная была в 3 раза выше.

Как видно из Таблицы 1, жизнеспособными оказались варианты гена с заменами Arg-кодонов в 3'-области (R, 484-486: AGA —» CGT и тандем R-R, 490-495: AGGAGG —» CGTCGT), что, похоже, является обязательным условием «выживаемости» генетической конструкции. Количество остальных редко встречающихся кодонов в гене интерферона влияет на выход продукта и характеристики роста культуры. Чем их остается больше в структуре гена, тем хуже рост рекомбинантного штамма и меньше нарабатывается целевого белка.

Таблица 1. Нуклеотидные замены для разных вариантов синтетического гена интерферона cc-F. Вариант №1 — природный ген интер_ферона a-F, без замен.__

Замены, А.к., положение кодона, замена Варианты генов, наличие замены

1 2 3 4 5 6

R-R, 37-42 : AGGAGG — CGTCGT - - + + - +

1,49-51 : ATA — ATT - - + + ' . - +

G, 67-69 : GGA GGC - + + + - +

R, 70-72 : AGA CGT - + + + - +

R, 100-102 : AGA CGT - + - + + +

0,112-114: GGA — GGC - + - + + +

P, 118-120 :CCC —CCG - + - + + +

L, 247-249 : СТА CTG - + - - - +

I, 304-306 : ATA — ATT - + - - - +

G, 316-318 :GGG-+ GGC - + - - - +

P, 331-333 : CCC —» CCG - + - - +

R, 379-381 : AGA —> CGT - + - - - +

R, 436-438 : AGA — CGT - + - - - +

R, 451-453 : AGA —♦ CGT - + - - - +

R, 484-486 : AGA — CGT - + - + +

R-R, 490-495 : AGGAGG CGTCGT - + - - + +

Таблица 2. Данные белкового электрофореза и биотеста штаммов ВЬ21(БЕЗ)[рЕТ22Ь(+)-1ПЧ-а1рЬаР-/]. Где г - варианты гена. _Данные биотеста нормированы на ОР культуры. _

Номер варианта 1 2 3 4 5 6

Накопление продукта, Биотсст, МЕ/мл /o.e. (8,0±1,5)-104 — (4,5+1,0)-104 (8,5+1,0)-105

Накопление продукта, электрофорез, % от суммарного клеточного белка - ND - - ND 7-10

1.2. Влияние терминаторов транскрипции в З'-нетранслируемой области гена на уровень биосинтеза интерферона a-F.

Хорошо известно, что терминация транскрипции, осуществляемая РНК полимеразой фага Т7 (РПТ7), недостаточно эффективна. Она, как правило, не происходит в участках эффективной р-независимой терминации РНК полимеразой E.coli, более того, даже строго специфический терминатор транскрипции фага Т7 — Тф, обеспечивает терминацию фаговой полимеразы in vivo с эффективностью не более 60% (McAllister, W. Т., Morris, С., Rosenberg, А.Н., et alJ/ J. Mol. Biol. - 1981 - V. 153 - P. 527 — 544). Для предотвращения циклической

транскрипции, инициированной в составе векторной плазмиды с фагового промотора, а возможно также и для потенциальной стабилизации 3'-концевого участка мРНК целевого гена, в состав экспрессионных векторов, как правило, вводят терминатор транскрипции Тф.

Было сделано предположение, что наличие одной копии терминатора транскрипции в 3'-концевой не транслируемой области гена недостаточно для максимизации уровня биосинтеза белка и стабилизации всего штамма в целом.

Используя технику ПЦР в плазмиду pET22b(+)-IFN-alpha-F (вариант гена № 6, в котором заменены все редко встречающиеся для Е. coli кодоны) была клонирована вторая копия терминатора транскрипции Тф. Отбор клонов методом рестрикционного анализа осуществлялся с штамме TG1. Полученной плаз-мидной ДНК, был трансформирован штамм BL21(DE3). Трансформанты культивировали на жидкой срсде до значений оптической плотности 0,5-0,6 и индуцировали 1 мМ ИГПТ, после чего культивировали еще 2 часа.

В результате, по данным биологического тестирования и результатам белкового SDS электрофореза, накопление продукта в штамме, имеющем в ре-комбинантной плазмиде два терминатора транскрипции, увеличилось в три раза, (см., Рис. 2).

Также, из Рис. 2А видно, что одновременно с накоплением hIFN-aF в условиях индукции достаточно эффективно синтезируется еще один полипептид с молекулярной массой примерно 32 kDa, при этом уровень его накопления также, как и уровень накопления интерферона, достигает около 7-10% от суммарных клеточных белков. Среди полипептидов, кодируемых векторной частью рекомбинантной плазмиды хорошим кандидатом на потенциальную ин-дуцибельную экспрессию в системе транскрипции фага Т7 является предшественник ß-лактамазы, ген которой расположен по ходу транскрипции с промотора ф10 за терминатором Тф. Образующийся в этом случае белок, с неудаленной в результате недостаточно эффективной секреции в периплазму сигнальной последовательностью, должен был бы обладать молекулярной массой как раз примерно 32 kDa.

Из Рис. 2В видно, что уровень синтеза целевого белка значительно возрос и составил более 22% от суммарных клеточных белков. Ранее тестируемый уровень индуцибельного синтеза белка с массой около 32 kDa в клетках с новой плазмидой значительно снизился и практически не отличался от его содержания в условиях репрессии РПТ7. Таким образом, введение второй копии терминатора транскрипции Тф в 3'-нетранслируемую часть клонированного гена bIFN-dF не только уменьшило «сквозную» транскрипцию, инициированную с промотора фЮ, что в свою очередь привело к снижению уровня экспрессии дистально расположенных по отношению к терминаторам генов, но и значительно повысило эффективность накопления целевого белкового продукта.

Рис. 2. Электрофореграмма суммарных клеточных белков штаммов BL21 (DE3)(pET22b(+)-IFN-aF) и BL21(DE3)(pET22b(+)-IFN-aF-гтф).

12 3 12 3

А ■ is В i

A. Накопление целевого продукта в штамме BL21(DE3)(pET22b(+)-IFN-alphaF).

№1 - белки-стандарты молекулярных масс (сверху вниз -116 кДа, 66 кДа, 45 жДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДд, 14,4 кДа).

Xs2 - через 2 часа после индужцни 1мМ ИПТГ. №3 - без индукции ИПТГ

B. Накопление целевого продукта в штамме BL21 (DE3)(pET22b(+)-IFN-alphaF-2Tiji).

№1 - белки-стандарты молекулярных масс (сверху вниз -116 кДа, 66 кДа, 45 кДа, 35 ».Да. 25 кДа, 18,4 кДа, 14,4 кДа).

№2 - без индукции ИПТГ.

№3 - через 2 часа после индукции 1мМ ИПТГ.

2. Создание штамма-продуцента интерферона а-2Ь и оптимизация условий его регулируемой ферментации.

2.1. Создание штамма-продуцента.

Человеческий интерферон а-2Ь представляет белковую молекулу из 165 аминокислотных остатков и размером около 19 кДа. Он имеет четыре остатка цистеина и, соответственно, две дисульфидные связи (Cys-1 — Cys-98 и Cys-29 — Cys-138), одна из которых (Cys-29 - Cys-138) существенна для антивирусной активности интерферона (Morehead, Н., et al. //Biochemistry - 1984 - V. 23 - P. 2500 - 2507). Человеческие иптерфероны a-F и a-2 имеют 83 % гомологии.

Ген интерферона альфа-2Ь был собран из олигонуклеотидов методом ПЦР по теоретической последовательности, описанной ранее {Колосов, М.Н., и др./ Авторское свидетельство СССР № 1092176 - 1984 - Бюл. Изобр. № 18), и клонирован по сайтам ВатШ и Ndel в экспрессионный вектор рЕТ22(Ь+)-2Т^, имеющий две копии терминатора транскрипции. Штамм TG1 был трансформирован полученной плазмидой pET22(b+)-IFN-2Ty После отбора клонов содер-

жащих вставку гена интерферона методом рестрикционного анализа, соответствие полученной последовательности гена теоретической, была подтверждена постановкой сиквенса ДНК методом Сэнгера. Полученной плазмид-ной ДНК, был трансформирован штамм BL21(DE3). Трансформанты культивировали на жидкой среде до значений оптической плотности 0,5-0,6 и индуцировали ИНН', после чего культивировали еще 2 часа, и определяли количество интерферона методом белкового SDS электрофореза. Идентичность синтезированного бактериями полипептида человеческому лейкоцитарному интерферону а-2Ь была подтверждена методами биологического тестирования и ИФА. Количество интерферона а-2Ь, определенное методом белкового SDS электрофореза, составило около 30 % от суммарного клеточного белка.

2.2. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента IFN-

а2Ь на лабораторном (2-х л) ферментере Multigen.

Как показано ниже, ключевым моментом, как на стадии культивирования, так и в технологии выделения и очистки интерферона, является выбор индуктора синтеза интерферона. Были рассмотрены различные параметры условий культивирования и два индуктора — синтетический аналог лактозы, ИПТГ, и сама лактоза.

Единичная колония штамма BL21(DE3)[pET22(b+)-IFN-2T^,] пересевалась в колбу с 30 мл среды Лурия-Бертани (для дозы посевного материала 1:100 -две пробирки по 5 мл; для дозы посевного материала 1:10 — три колбы по 50 мл) с 100 мкг/мл ампициллина и культивировалась в течении 7-и часов при 37°С и 240 грт. Далее содержимым колбы засевали лабораторный ферментер Multigen (1,5 л рабочий объем), используя синтетическую среду М9 с триптоном (10 г/л), дрожжевым экстрактом (5 г/л), глюкозой (3 %) и ампициллином (200 мкг/мл). Клетки культивировали до плотности индукции, после чего в культуру добавляли ИПТГ или лактозу. И далее культивировали до тех пор пока изменение оптической плотности культуры не упадет до 1 о.е./час. рН-статирование процесса в обоих случаях поддерживалось на pH = 6,8 12% раствором аммония. Аэрация — 25 % растворенного кислорода от насыщения до и после индукции ИПТГ, а после индукции лактозой — 50 %. После окончания ферментации клетки собирали центрифугированием 20 минут, 7000 об/мин при 4°С.

Были подобраны такие параметры как доза посевного материала, оптимальные концентрации индукторов, определены точки индукции. Выходными параметрами для каждого эксперимента являлись: % интерферона от суммарного клеточного белка, (определялось электрофорезом), выход влажной биомассы после окончания процесса, г на 1 л к.ж., общее время роста культуры в ферментере, часы.

Инокулят вносили в количестве 1/50 от конечного объема ферментационной среды. ИПТГ добавлялось при достижении оптической плотности культуры 10 o.e. При «позднем» добавлении ИПТГ (15 — 20 o.e.) образовывались меньшие количества интерферона, чем при более раннем. Возможно, данного количества ИПТГ не хватало имеющимся, на тот момент, количествам клеток для максимальной индукции. Но и очень раннее добавление (5 o.e.) не было оптимальным, так как сильно ингибировало дальнейший рост культуры. ИПТГ

вносили до конечной концентрации 1 мМ, т.к. меньшие количества (менее 0,5 мМ) не позволяли достичь необходимого уровня накопления продукта, а большие количества (более 2 мМ) значительно йнгибировали рост культуры при том же уровне продукта.

. Дня лактозы точка индукции специально не подбиралась, так как пока в культуральной среде содержится глюкоза, лактоза не утилизируется. При значениях OD540 культуры около 30 o.e. достигается падение концентрации глюкозы в среде ниже значений 0,5 %. При этих оптических плотностях культуры добавлялась лактоза. Был проведен ряд экспериментов, в которых лактоза добавлялась при более низких значениях OD540 (от 10 до 20 o.e.), при этом, количество синтезировавшегося интерферона было значительно меньше (ниже 15 %) обычного.

Одного процента лактозы было не достаточно для полной индукции того количества бактериальной культуры, которое накапливалось на момент индукции. Кроме того, лактоза для клеток является не только индуктором, но и источником углерода, что видно из характеристик роста (выхода биомассы, времени роста после индукции и общего времени роста культуры). С другой стороны, ни по количеству продукта, ни по характеристикам роста культуры добавление трех процентов лактозы ничем не отличается от добавления двух процентов.

На Рис. 3 представлены кривые роста и накопления продукта в ходе ферментационных процессов, с оптимальными параметрами для каждого индуктора. Для процесса, индуцируемого лактозой, появление «ступеньки» на графике кривой роста связано не только с хорошо известным ростом бактериальной культуры на двух субстратах, но и с разбавлением культуры за счет внесения лактозы (разбавление на 10 % по объему).

Как видно из Рис. 3, OD540 процессов с индукцией лактозой выше почти в два раза по сравнению с индукцией ИПТГ, что также подтверждается выходами влажной биомассы с литра культуральной жидкости — 30 ± 5 г/л - для процессов с индукцией ИПТГ и 55 ± 5 г/л - для процессов с индукцией лактозой. При одинаковом количестве интерферона (в % от суммарного клеточного белка) наработка белка при индукции лактозой шла более плавно, в отличие от индукции IPTG. При этом в бактериальных клетках индуцируется синтез ферментов утилизации лактозы и, как бы, «побочно» происходит синтез интерферона. Бактериальная культура начинает активно расти после перехода на новый субстрат,. Клетки не находятся в стрессе резкого «мегасинтеза» гетерологичного белка, что происходит при индукции IPTG.

В результате, при сравнении этих двух условий культивирования штамма-продуцента интерферона, получается, что при использовании лактозы в качестве индуктора, выход бактериальной биомассы в два раза выше, а себестоимость процесса ниже (за счет отказа от использования ИПТГ).

Рис. 3. Кривые роста и накопления интерферона, при использовании двух индукторов — лактозы (2 %) и ИПТГ (1 мМ).

А — индукция культуры ИПТГ. В — индукция культуры лактозой.

2.3. Масштабирование ферментационного процесса на промышленном

(30 л) ферментере Marubishi.

Процесс культивирования штамма-продуцента интерферона ос-2Ь был масштабирован с лабораторного ферментера Multigen на промышленный 30 л ферментер Marubishi. Часть параметров осталась без изменений — ферментационная среда, доза посевного материала, аэрация (подача воздуха) 1:1, точка подачи индуктора, концентрация индуктора, рН-статирование. Некоторые параметры пришлось модифицировать. Подача глюкозы осуществлялась не разово, 3% при засеве, а по 1% на каждые 10 o.e. роста культуры, начиная с момента засева. Подача лактозы, также осуществлялась дробно, по 1% в точке индукции и на следующий час. Посевной материал приготовлялся в две стадии.

Подобный подход позволил выйти на те же параметры, что и при культивировании в лабораторном ферментере. При подаче Сахаров разово (3% глюкозы при засеве и 2% лактозы в точке индукции) рост культуры отличался в худшую сторону от лабораторного варианта.

Также был изменен параметр аэрации. Скорость вращения мешалки являлась функцией от % растворенного в среде кислорода (ПО). Во время интенсивного роста до добавления лактозы, аэрация является лимитирующим фактором, мешалка работала на максимально возможных оборотах, но % растворенного кислорода не превышал 20 %. С падением концентрации глюкозы в среде до лимитирующих рост значений (около 6-го часа), % ВО повышался, т.к. останавливается рост культуры. В этот момент добавляли индуктор и источник углерода — лактозу. Бактериальные клетки перестраивают метаболизм для возможности утилизировать лактозу, на кривой роста культуры образуется ступенька.

С 7-го часа промышленной ферментации начинается рост клеток штамма-продуцента интерферона на лактозе, % растворенного кислорода опять падает, индуцируется биосинтез интерферона. На этой стадии % БО поддерживали постоянным (около 50 %). К 12-14 часу рост культуры прекращался, БО поднималось до 95 %, количество синтезированного интерферона в клетках достигало 30 % от суммарного белка.

Усредненные данные по десяти ферментационным процессам представлены на Рис. 4.

Рис. 4. Кривые роста, накопления продукта и % растворенного кислорода, в ходе ферментационного процесса на 30-л ферментере.

3. Создание технологии выделения и очистки субстанции человеческого рекомбинантного интерферона а-2Ь.

3.1. Получение грубого экстракта нативного мономера интерферона.

Биомассу, полученную после проведения ферментации сразу, без замораживания, ресуспендировали в дезинтеграционном буфере и разрушали на проточном дезинтеграторе (френч-пресс).

Однократная дезинтеграция клеточной биомассы приводила к разрушению 93 - 95% клеток (данные микроскопии). После повторной дезинтеграции оставалось менее 0,5% целых клеток. При недостаточной дезинтеграции клеточной биомассы, оставшиеся целыми бактериальные клетки, осаждаются вме-

сте с тельцами включения интерферона (ТВ) при процедурах отмывок и лизируют при растворении осадка телец включения в ОиНС1. Таким образом, нуклеиновые кислоты (ДНК) этих клеток дополнительно загрязняют раствор денатурированного белка и способствуют выпадению интерферона в осадок в последующем процессе ренатурации, что уменьшает выходы интерферона па этом этапе.

По этой же причине, были рассмотрены несколько различных буферов для отмывки телец включения. Этап отмывки ТВ, сам по себе, сильно увеличивает выходы мономера интерферона после этапа ренатурации, по сравнению с не отмывавшимися ТВ. Применение солевых растворов в высокой концентрации (0,5 — 2 М) не отличалось от отмывки дистиллятом. Применение детергентов (мочевина - от 1 до 7 М, ОиНС1 - от 0,3 до 3 М, Тритон Х-100, Твин-20, Твин-80, Бридж, Нонидет - от 0,1 до 1 %) приводило к увеличению чистоты интерферона после этапа отмывки, но не увеличивало эффекости ренатурации, и было причиной значительных потерь продукта в процессе этапа отмывки. Увеличение соотношения ТВ : Буфер, соответственно, увеличивало объемы, и, следовательно, снижало рентабельность и увеличивало трудоемкость процесса. Наиболее оптимальные результаты были получены при использовании двухкратной отмывки ТВ дистиллятом (с промежуточными ресуспендированиями).

Отмытые ТВ интерферона сразу пускали в дальнейшую работу или хранили в замороженном виде при -20°С до 6 месяцев. При увеличении срока хранения ТВ снижался выход мономера интерферона после этана ренатурации.

Растворение осадка ТВ проводили в растворе 7М СиНС1, смешивая сухую навеску гуанидин гидрохлорида, осадок отмытых телец включения и 10-и кратный буферный раствор Тпб-НО, рН = 8,0, доводя конечный объем до расчетного. При этом концентрация суммарного белка в растворе составляла 30-35 г/л.

Более полное растворение, а также деполимеризация интерферона достигалась проведением реакции окислительного сульфитолиза, с использованием сульфита натрия. Эта реакция более полно расщепляла хаотично замкнутые Б-Б связи полимеров интерферона, чем восстановление дитиотреитолом или 2-меркаптоэтанолом, и позволяла работать при очень высоких концентрациях белка, значительно уменьшая расход СиНС1.

После проведения диафильтрации для удаления ОиНС1 и сульфита, и дополнительным восстановлением 2-меркаптоэтанолом, интерферон ренатуриру-ет в течение двух суток, без перемешивания, при температуре около 4-8°С в 50 мМ фосфатном буфере.

На характер прохождения ренатурации могут влиять наличие в ренатура-ционном буфере солей, детергентов, а также исходная чистота и концентрация целевого белка. Были рассмотрены несколько вариантов ренатурационного буфера, но их влияние на выходы интерферона после ренатурации, и конечную чистоту грубого экстракта (и по данным белкового электрофореза и по данным ВЭЖХ) было незначительно.

По окончании ренатурации рН раствора переводят с 8,0 до 4,5 ледяной уксусной кислотой. На данном этапе образуется осадок, который убирают фильтрацией. В осадок выпадает часть бактериальных белков, часть непра-

вильно и правильно собранных интерферонов. Возможны

существенные потери интерферона. Это связано с условиями хранения телец включения (замораживались ли они и на какой срок, или же сразу после получения растворялись в виНС1), а также с содержанием примесей в ренатураци-онной смеси: нуклеиновых кислот, бактериальных белков, которые могут являться центрами коагуляции интерферона, из-за сильной гидрофобности последнего.

Выходы интерферона в процессе получения грубого экстракта даны в Таблице 3. Суммарный выход составляет около 70% и для полуфабриката интерферона, полученного из биомассы, индуцированной лактозой и для полуфабриката интерферона, полученного из биомассы, индуцированной ИГПТ.

Табл. 3. Выходы интерферона в процессе получения грубого экстракта, вычислялись по данным измерения концентраций белка и дан_ным 8Р8-НАА гель электрофореза в восстановленных условиях.

Этап V, л белка* Г Мгта, г Выход 1FN, %

Биомасса после сепарации 1 90 27 100

Дезинтеграция, френч-пресс 5 60 26,7 99

Отмывка ТВ, Н20 2x2 35 25,4 94

Растворение, GuHCl 2 35 25,4 94

Разведение, фосфатный буфер 20 35 25,4 94

Микрофильтрация, 0,45 мкм 19,5 28 22,9 85

Диафилырация, ЮкДа 10 25 21,8 81

Ренатурация 50 25 21,8 81

Микрофильтрация, 0,45 мкм 49 22 19,6 73

Концектрирова-ние/Днафилътрашя, ЮкДа 10 20 18,6 69

В отличие от чистоты грубого экстракта по БОБ-ПАА гель электрофорезу (93% в восстановленных условиях и около 90% - в невосстановленных), чистота полуфабриката по ВЭЖХ составляла 45 — 70%, в зависимости от биомассы. На Рис.5 хорошо видно, что использование лактозы, вместо ИГПТ в качестве индуктора при проведении ферментации значительно снижает количество модифицированного интерферона. Пики № 4 и 5 на Рис. 5 В (индуктор - ИГПТ), полностью отсутствуют на Рис. 5 С (индуктор - Лактоза), и, кроме того, пики № 6,7 (Рис. 5 В) стали значительно меньше (на Рис. 5 С это пики № 4,5).

3.2. Хроматография на катионите SP-Toyopearl 550-С.

Для дальнейшей очистки грубого экстракта интерферона необходимы хроматографические методы. При этом основным вопросом чистоты конечной субстанции интерферона является вопрос используемых методов анализа. Практически любым методом ионообменной хроматографии низкого давления можно получить субстанцию интерферона с чистотой выше 95 - 98% по данным SDS-ПАА гель электрофореза в восстановленных и невосстановленных условиях, так как отделить интерферон от примесных белков Escherichia coli, а также от полученных в ходе ренатурации ди-, три- и полимеров интерферона не представляет сложности.

Рис. 5. Профили хроматограмм ВЭЖХ.

А - стандарт интерферона, Биотехна, Литва, содержание нативного интерферона альфа-2Ь - 97 %. В - грубый экстракт интерферона, полученный из биомассы индуцированной ИПТГ, содержание нативного интерферона альфа-2Ь - 48 %. С - грубый экстракт интерферона, полученный из биомассы индуцированной лактозой, содержание нативного интерферона альфа-2Ь - 72 %. А

В

При использовании в качестве анализа на чистоту ОФ-ВЭЖХ становятся видны примеси интерфероновой природы, не доступные другим методам анализа. Результаты представленные на Рис. 6 получены для субстанции из биомассы индуцированной лактозой. Сходных результатов для субстанции из биомассы индуцированной ИПТГ удавалось достичь только за счет использования рехроматографии (и то не всегда), что естественно, снижало выходы конечного продукта и увеличивало себестоимость процесса.

Выход интерферона на этапе хроматографической очистки составляет от 75 до 92 %, в среднем - (84 ± 9)%. Общий выход технологии выделения и очистки интерферона, от биомассы до этапа очистки на 8Р-Тоуореаг1 - (58 ± 6) % Рис. 6. Анализ ВЭЖХ субстанции интерферона после очистки на вР-ТоуореагГе.

4

ю II 1* 16 1В 20 22 и 2t 2* 3« 32 34 36 ЗЛ 40 42

Как видно из Рис. 6, получаемый после очистки на сорбенте БР-Тоуореаг] интерферон имеет два пика. Первый пик, содержание которого зависит от свойств биомассы (т.е. не определенных пока характеристик процесса ферментации), составляет от 4 до 10% (от суммы «переднего» и «нативного» пиков) для биомассы, полученной в ферментационном процессе с использованием лактозы в качестве индуктора. Т.е. чистота по ВЭЖХ нативного интерферона составляет от 90 до 96%. Для биомассы, получаемой в ферментационном процессе с использованием ИПТГ в качестве индуктора, количество переднего пика составляло от 8 до 20%, т.е. ровно в два раза больше.

«Первый» пик на Рис. 6, также как и нативный интерферон, обладает биологической активностью (он был выделен с использованием полупрепаративного ВЭЖХ, и проверен на биологическую активность), его удельная активность равна удельной активности нативного интерферона. По данным №концевого секвинирования белки в этом пике, также как и выделяемый интерферон, не содержат Ы-концевого метионина, и, по-видимому, представляют собой некий вариант пост-трансляционно-модифицированного интерферона.

3.3. Хроматография на полу-препаративном ОФ-ВЭЖХ, ODS.

Дальнейшая очистка продукта от данной примеси (пик № 1 на Рис. 6) осуществлялась методами препаративной ОФ-ВЭЖХ, с использованием стальной колонки ODS, 300 А, 5 мкм, 4,6x250 мм, Jupiter, Phenomenex. Субстанцию

интерферона (с исходной чистотой по ВЭЖХ - 93%) наносили через инжектор (1 мл), масса нанесения - 1,5 мг. Отбор фракций осуществляли с 10 по 15-ю минуты (25 фракций). Объединили фракции с 5 по 18-ю (см., Рис. 7).

Профиль препаративной хроматографии представлен на Рис. 7. Из рисунка видно, что при нанесении на ВЭЖХ колонку препаративных количеств белка (1,5 мг), становятся видимыми остаточные пики, которые не детектируются при нанесении аналитических количеств (около 10 мкг, см., Рис. 6). Несмотря на их кажущиеся большие количества, при аналитическом детектировании они составляют менее 0,01 % (пределы интегрирования). «Передний» пик, составляющий около 7%, при таких количествах нанесения, не разделялся, а выходил одним пиком с нативным интерфероном. Результаты анализов, полученной после препаративного ВЭЖХ субстанции интерферона (объединенные фракции 518) представлены на Рис. 8. Выход этапа препаративного ВЭЖХ по нативному интерферону составил около 87%. Таким образом, общий выход - (50 ± 5) %. Полученный интерферон имеет уделыгую активность (2,4 ± 0,2)х108 МЕ/мг, (биологическая активность измерялась после удаления из субстанции ацето-нитрила и ТХУ методом диафилырации в натрий-ацетатный буфер) что соответствует данным других авторов для фармакологически чистого препарата интерферона.

Рис. 7. Профиль препаративной ВЭЖХ.

I 4 С I !t U 14 М и м а М lt X м u м

42 44 44 4» » Я и

Рис. 8. Анализ ВЭЖХ субстанции интерферона, после очистки на препаративной ВЭЖХ.

Передний пик - 0,99 %, нативный интерферон - 99,01 %.

i 1 i ! ! ! | | i i i 1 1 I i i I i í i ...j.....I..4.....i lili i i i i Mi! M M ••"•>.....~.....^.....♦..... i i i i M i и M M i i i i i i ! i i .....+.....f.....i.....+.....j.....+•— f.....i.....f.....

......i.....i......j.....f—j......\ Ш j i i ]__ ; i ' ! i i i I .....{.....}■■■•].....{••■■ .....1.....1......!.....I..... ! i ! ! 1 i i i .....1.....1.....1.....1.....

—4.....i--].....|.....i......\ .....¡.....|.....i.....t..... .....T.....T.....v-"!"'" .....)...-{.....j.....j...... .....*.....i.....i.....1...... i ! ! Í .....].....i.....j.....s...... í T 1 Mil

cbl. ...........+.....i......i МММ i ! i ! .....\.....i......\.....4..... .....■{■.....t.....i...... lili ......1.....{.....j.....i..... i II ! M i

■ 10 II 1« Jé Ift » и 14 М 2S »0 п и М Ж

90 М .4

Таким образом, субстанции интерферона получаемые по разработанной технологии имеют следующие показатели чистоты:

Метод После очистки ионообменной хро-матографей После очистки препаративной ОФ-ВЭЖХ

ОФ-ВЭЖХ, ODS, 4,6x250 мм, 5 мкм, 300 А 93% > 99 %

SDS электрофорез, восстановленные условия, окраска серебром >9«% > 99 %

SDS электрофорез, не восстановленные условия, окраска серебром >98% > 99 %

Остаточные белки штамма-продуцента, ИФА Около 50 нг на 1 мг белка (менее 50 ррм) Менее 5 нг на 1 мг белка (менее 5 ррм)

Остаточная ДНК штамма-продуцента и вектора, метод молекулярной гибридизации Менее 150 пг на I мг белка (менее 0,15 ррм) Менее 150 пг на 1 мг белка (менее 0,15 ррм)

Бактериальные эндотоксины, ЛАЛ-тест Окало 20 МЕ, в объеме, который содержит 1 мг белка Менее 1 ME, в объеме, который содержит 1 мг белка

Удельная Активность (2,4 ± 0,2)х10" МЕ/мг (2,4 ± 0,2)х 10* МЕ/мг

Не смотря на то, что препаративное ВЭЖХ является дорогостоящей процедурой, использование этого метода на конечной стадии очистки рекомби-нантного интерферона от модифицированных вариантов этого белка, является одним из нескольких путей решения проблемы получения высокоочшценной фармакопийной субстанции интерферона.

Разработанная в процессе выполнения данной диссертационной работы технология выделения и очистки рекомбинантного интерферона а-2Ь человека из биомассы бактериальных продуцентов (с использованием одной хромато-графической стадии — очистки на катионите БР-Тоуореаг1) успешно применяется с 2004 г. в ЗАО «Мосагроген» (Москва) для создания ветеринарных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®».

ВЫВОДЫ

1. Получен новый бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного интерферона а-Б человека с уровнем накопления целевого белка более 25 % от суммарных клеточных полипептидов. Этот уровень был достигнут благодаря модификации гена интерферона а-Б включением в его состав часто встречающихся в Е.соИ синонимических аминокислотных кодонов и обеспечением транскрипции РНК полимеразой фага Т7 целевого гена, входящего в состав экспрессионной кассеты с тандемом терминаторов транскрипции в З'-нетранслируемой области.

2. Создан также новый промышленный продуцент рекомбинантного интерферона а-2Ь человека с продуктивностью, составляющей более 30% от суммарных клеточных полипептидов.

3. Разработаны варианты протокола промышленной ферментации бактериального штамма-продуцента человеческого реком-бинантного интерферона а-2Ь, позволяющие упростить дальнейшую очистку интерферона и уменьшить ее себестоимость.

4. Разработаны варианты технологии выделения и очистки интерферона а-2Ь, с общим выходом 50 — 60 %, позволяющие получать субстанцию интерферона ветеринарного и фармакопийного качества. Препаративный уровень соответствует получению порядка 150 тыс ветеринарных терапевтических доз и 3 млн. медицинских терапевтических доз.

5. Созданные в работе новые штаммы-продуценты рекомбинантных интер-феронов человека и промышленных способов их выделения и очистки с 2004 г. успешно используются в ЗАО «Мосагроген» для промышленного получения субстанций этих белков и создания на их основе эффективных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®» ветеринарного назначения.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Скороходова А.Ю., Зимеиков Д.В., Гавриков А.В., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Машко С.В. «Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях XXI века» // В сб.:МИФИ, Москва, январь 2002, 125-139.

2. Машко С.В., Скороходова А.Ю., Зимеиков Д.В., Мичурина Т.А., Гавриков А.В., Беневоленский М.С., Киверо АД., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Дебабов В.Г. «Использование метаболической регуляции для оптимизации экспрессии генов в бактериальных клетках — новое направление биотехнологии XXI-века.» // Биотехнология №4 (2002), 3-14.

3. Гавриков А.В., Зименков Д.В., Машко С.В. «Введение тандема терминаторов транскрипции повышает эффективность накопления рекомбинантных белков в клетках Escherichia coli при использовании системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7» // Биотехнология №2 (2005), 18-25.

4. Зименков Д.В., Гавриков А.В., Машко С.В. «Замена редко встречающихся в Escherichia coli эукариотических аминокислотных кодонов на синонимические прокариотические увеличивает эффективность накопления рекомбинантных интерферона-aF и ин-терлейкина-ip человека» // Биотехнология №3 (2006), 17-32.

5. Гавриков А.В., Рязанов И.А., Калужский В.Е., Машко С.В. «Зависимость процедуры выделения и очистки рекомбинантного ин-терферона-а2Ь человека от условий его накопления в клетках штамма-продуцента в ходе регулируемого культивирования» // Биотехнология №5 (2006), 23-31.

Принято к исполнению 09/11/2006 Исполнено 10/11/2006

Заказ № 908 Тираж: 120 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www. autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гавриков, Алексей Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в Escherichia coli

1.2. Создание штаммов-продуцентов интерферона альфа-2Ь на основе Escherichia coli и их ферментационное культивирование.

1.3. Выделение и очистка интерферона альфа-2Ь.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Генноинженерные методики.

2.2.2. Ферментационное культивирование в 2-х л ферментере.

2.2.3. Ферментационное культивирование в 30-и л ферментере.

2.2.4. Получение телец включения.

2.2.5. Получение грубого экстракта интерферона.

2.2.6. Очистка интерферона на катионите SP-Toyopearl.

2.2.7. Очистка интерферона с использованием ОФ-ВЭЖХ.

2.2.8. Аналитические методы.

2.2.8.1. Измерение концентрации белка.

2.2.8.2. Постановка белкового SDS электрофореза.

2.2.8.3. ВЭЖХ.

2.2.8.4. Метод молекулярной гибридизации на остаточную ДНК штамма-хозяина и вектора.

2.2.8.5. Метод ИФА на остаточные белки штамма-продуцента.

2.2.8.6. Метод биологического тестирования активности интерферона.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа-F интерферона под контролем регуляторных элементов Т7-экспрессионной системы.

3.1.1. Создание вариантов гена человеческого альфа-F интерферона с различными заменами редко встречающихся кодонов и их клонирование в векторную плазмиду рЕТ22(Ь+).

3.1.2. Влияние тандема терминаторов транскрипции в 3'-нетранслируемой области гена.

3.2. Создание и ферментационное культивирование штаммапродуцента альфа-2Ь интерферона.

3.2.1. Создание штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь.

3.2.2. Подбор условий культивирования на лабораторном 2-х л ферментере Multigen.

3.2.3. Масштабирование ферментационного процесса на промышленном 30-и л ферментере Marubishi.

3.3. Создание технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь.

3.3.1. Получение грубого экстракта нативного мономера интерферона.

3.3.2. Хроматография на катионите SP-Toyopearl 550-С.

3.3.3. Хроматография на полу препаративном ОФ-ВЭЖХ, ODS.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения"

Актуальность проблемы. С развитием молекулярной биологии и ряда ее методических приложений (генно-инженерных методик и методов жидкостной хроматографии) повышаются требования качества к продуктам, получаемым в данной области. Одним из основных примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий «рекомбинантных ДНК». Более конкретно это относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, - человеческому рекомбинантному интерферону альфа-2Ь.

Наиболее выгодным экономически является использование штаммов-продуцентов, в которых экспрессия целевого белка увеличена до количеств, измеряемых в процентах от суммарного клеточного белка (в этих случаях гетерологичный белок «складируется» в клетке в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).

Создание подобных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из которых - стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся аминокислотных кодонов, в гене, клонированном на мультикопийный экспрессионный вектор, подобная генетическая конструкция будет нежизнеспособна, или же, синтез целевого белка будет крайне низким. Другим фактором нестабильности мРНК гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно, если его экспрессия находится под контролем сильного бактериального или фагового промотора) с процессом репликации плазмидного вектора, что возможно даже при наличии теминатора транскрипции в нетранслируемой З'-концевой области целевого гена.

Одновременно с развитием генно-инженерных технологий, повысились требования к чистоте конечной субстанции. Появились такие анализы на чистоту получаемого интерферона, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (JlAJI-тест). Усложнение аналитического контроля привело к принципиальным изменениям технологий производства субстанции интерферона, т.к. применение старых технологических путей являлось не достаточным для получения высокоочищенного белка, или же, экономически невыгодным.

При суперэкспрессии гетерологичных белков в клетках Е. coli (в таких количествах, что экспрессируемый белок начинает образовывать тельца включения), бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих случаях бактериальная культура практически не растет после индуцирования синтеза целевого белка. Кроме того, в данных условиях стресса, синтезируемые в тельцах включения белки могут иметь всевозможные модификации, начиная с неотщепленного N-концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых аминокислотных остатков белка. Подобные модификации могут не удаляться различными видами гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографий (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как при модификации изменение их конформации не происходит, а изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению с нативной молекулой белка. Но при правильном подборе условий их можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а, следовательно, при их большом количестве относительно нативного белка, конечная субстанция не проходит анализ ВЭЖХ.

Было замечено, что количество и характер подобных примесей напрямую зависит от условий ферментационного культивирования штамма-продуцента интерферона, а не только от подбора условий технологии выделения.

Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции рекомбинантного белка представляет собой комплексную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные этапы.

Цели и задачи работы.

Целями работы являлись:

1) увеличение эффективности биосинтеза рекомбинантного интерферона бактериальными продуцентами (на примере лейкоцитарного интерферона a-F человека);

2) исследование влияния условий ферментации рекомбинантных штаммов Е. coli на образование модифицированных примесей целевого белка (на примере штамма-продуцента интерферона а-2Ъ человека);

3) исследование возможности создания технологии выделения и очистки интерферона a-2b биомассы штамма-продуцента с оптимальным соотношением «цена-качество».

В ходе работы были решены следующие задачи:

• Созданы и клонированы варианты гена человеческого a-F интерферона с различными заменами редко встречающихся эукариотических кодонов.

• Создан штамм-суперпродуцент человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

• Разработаны несколько вариантов регламента ферментации штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

• Созданы несколько вариантов технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы было подробно рассмотрено влияние редко встречающихся в E.coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного гена, представленного на мультикопийном векторе, под контролем регуляторных элементов на основе Т7 РНК-полимеразы.

Был разработан ферментационный протокол культивирования штамма-продуцента интерферона альфа-2Ь, в котором индукция синтеза интерферона осуществляется лактозой, вместо ИПТГ. Подобный подход значительно снижает себестоимость процесса ферментации. А так же позволяет получать больше количества продукта.

Было показано, что за счет оптимизации ферментационного процесса культивирования можно получать полупродукт более высокого качества, что позволяет упростить дальнейший процесс очистки интерферона, уменьшив количество хроматографических стадий, т.е. понизить себестоимость продукта.

Разработанные технологии позволили наладить рентабельное производство субстанции интерферона альфа-2Ь на базе предприятия ЗАО «Мосагроген», Москва. Получаемая субстанция интерферона альфа-2Ь используется для приготовления ветеринарных лекарственных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®».

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы в отечественных журналах и одно тезисное сообщение в материалах научных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изложена на 102 страницах, включая 12 рисунков и 18 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 128 источников, в том числе J2 на русском языке.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гавриков, Алексей Валерьевич

ВЫВОДЫ

1. Получен новый бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного интерферона a-F человека с уровнем накопления целевого белка более 25 % от суммарных клеточных полипептидов. Этот уровень был достигнут благодаря модификации гена интерферона a-F включением в его состав часто встречающихся в E.coli синонимических аминокислотных кодонов и обеспечением транскрипции РНК полимеразой фага Т7 целевого гена, входящего в состав экспрессионной кассеты с тандемом терминаторов транскрипции в З'-нетранслируемой области.

2. Создан также новый промышленный продуцент рекомбинантного интерферона a-2b человека с продуктивностью, составляющей более 30% от суммарных клеточных полипептидов.

3. Разработаны варианты протокола промышленной ферментации бактериального штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона a-2b, позволяющие упростить дальнейшую очистку интерферона и уменьшить ее себестоимость.

4. Разработаны варианты технологии выделения и очистки интерферона а-2Ь, с общим выходом 50 - 60 %, позволяющие получать субстанцию интерферона ветеринарного и фармакопийного качества. Препаративный уровень соответствует получению порядка 150 тыс ветеринарных терапевтических доз и 3 млн. медицинских терапевтических доз.

5. Созданные в работе новые штаммы-продуценты рекомбинантных интерферонов человека и промышленных способов их выделения и очистки с 2004 г. успешно используются в ЗАО «Мосагроген» для промышленного получения субстанций этих белков и создания на их основе эффективных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®» ветеринарного назначения.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Скороходова А.Ю., Зименкое Д.В., Гавриков А.В., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Машко С.В. «Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях XXI века» // В сб.:МИФИ, Москва, январь 2002, 125-139.

2. Машко С.В., Скороходова А.Ю., Зименкое Д.В., Мичурина Т.А.У Гавриков А.В., Беневоленский М.С., Киверо АД., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Дебабов В.Г. «Использование метаболической регуляции для оптимизации экспрессии генов в бактериальных клетках - новое направление биотехнологии XXI-века.» // Биотехнология №4 (2002), 3-14.

3. Гавриков А.В., Зименкое Д.В., Машко С.В. «Введение тандема терминаторов транскрипции повышает эффективность накопления рекомбинантных белков в клетках Escherichia coli при использовании системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7» // Биотехнология №2 (2005), 18-25.

4. Зименкое Д.В., Гавриков А.В., Машко С.В. «Замена редко встречающихся в Escherichia coli эукариотических аминокислотных кодонов на синонимические прокариотические увеличивает эффективность накопления рекомбинантных интерферона-aF и интерлейкина-ip человека» // Биотехнология №3 (2006), 17-32.

5. Гавриков А.В., Рязанов И.А., Калужский В.Е., Машко С.В. «Зависимость процедуры выделения и очистки рекомбинантного интерферона-а2Ь человека от условий его накопления в клетках штамма-продуцента в ходе регулируемого культивирования» // Биотехнология (2006) - в печати.

4. Заключение.

Получение лекарственных препаратов на основе человеческих рекомбинантных белков представляет собой комплексную проблему. Получение высокоэффективного бактериального штамма-продуцента, безусловно, первый и основной шаг на этом пути. При этом, с одной стороны, возникают чисто технические вопросы клонирования гетерологичного гена в соответствующую экспрессионную бактериальную систему, а с другой стороны, необходимо понимание фундаментальных основ процессов транскрибции и трансляции для оптимизации экспрессии гетерологичного белка. В нашем случае - влияние редко встречающихся в Е. coli кодонов и процесса терминации транскрибции экспрессии гетерологичного гена под контролем высокоэффективных экспрессионных элементов бактериофага Т7.

Частое явление, когда исследователи, создав высоко эффективный штамм-продуцент, не уделяют достаточного внимания его дальнейшему ферментационному культивированию. Для штаммов-продуцентов гетерологичных белков, экспрессия которых находится под контролем экспрессионных элементов бактериофага Т7 (чаще всего используют векторные плазмиды серии рЕТ и штамм-хозяин BL21(DE3)) и для лабораторного и для промышленного культивирования, в качестве индуктора синтеза целевого белка используют IPTG.

Как мы показали, использование вместо IPTG лактозы во-первых более экономически выгодно на стадии ферментационного культивирования, во-вторых увеличивает выход бактериальной биомассы в 1,5 - 2 раза (а, следовательно, и выход целевого белка), а в третьих, влияет на формирование телец включения интерферона в процессе синтеза. Основное отличие телец включения, полученных при индукции бактериальной культуры лактозой, от телец включения, полученных индукцией классическим индуктором IPTG, состоит в том, что первые содержат меньше примесей модифицированного интерферона. Благодаря этому в поцессе дальнейшей очистки белка выше его выход на этапе ренатурации и для получения ветеринарной субстанции интерферона достаточно одной стадии хроматографической очистки на катионите SP-Toyopearl, а не две. Т.е. при индукции лактозой выше выход нативного интерферона в ходе последующих процедур выделения и очистки, что дополнительно понижает его себестоимость.

Для получения субстанции интерферона фармакологической чистоты необходима дальнейшая очистка ветеринарной субстанции от примесей модифицированного интерферона, не удаляемых методами жидкостной хроматографии низкого давления. Один из возможных вариантов - доочистка методом препаративной ВЭЖХ, что и было продеманстрировано. Другой возможный вариант - продолжение исследований характеристик ферментационного культивирования, с целью разработки такого ферментационного протокола, при котором в процессе формирования телец включения не будут образовываться модифицированные варианты интерферона.

В Европейской и Британской фармакопеях чистота по анализу ВЭЖХ конечной субстанции интерферона должна составлять не менее 95 % [121]. Субстанция подобной чистоты получалась примерно в 1 цикле выделения интерферона из 7, без применения этапа препаративного ВЭЖХ. Как говорилось выше, содержание «переднего» пика зависит от характеристик ферментационного процесса, не определенных на данный момент. Возможна дальнейшая работа в этом направлении.

Технология выделения и очистки рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2Ь с использованием одной хроматографической стадии -очистки на катионите SP-Toyopearl, успешно применяется последние два года в ЗАО «Мосагроген», Москва, для получения ветеринарной субстанции интерферона и создания на ее основе ветеринарных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®».

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гавриков, Алексей Валерьевич, Москва

1. Sowers, G., Jarsch, M. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996 - V.46 - P. 1 - 9.

2. Овчинников Ю.А., Свердлов Е.Д., Царев С.А. и др. II Авторское свидетельство СССР № 1328963.-(1987).

3. Davison J. // Gene. 1984. - V. 28. - P. 1-15.

4. Zurita M, Bolivar F., SoberonX. II Gene. 1984. - V. 28. - P. 119-122.

5. Summer D.K., SherratD.J. II Cell. 1984. - V. 36. - P. 1097-1103.

6. Lee N. Cozzitorto J. et al. II Nucl. Acids. Res. 1984. - V. 12. - P. 6797-6812.

7. Mashko S. V., Mochulsky A. V., Kotenko S. V. et al. И Gene. 1991. - V. 97. - P. 259-266.

8. Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. IIEMBO J. 1986. - V. 5. - P. 2987-2994.

9. Kammerer W., Deuschle U., Gentz R., Bujard H. II EMBO J. 1986. - V. 5. - P. 2995-3000.

10. Машко C.B., Горовиц P.Л., Трухан М.Э. и др. II Докл. АН СССР. 1986. - Т. 291.-С. 1510-1513.

11. Remaut Е., Stanssens P., Fiers W. II Gene. 1981. - V. 15. - P. 81 -93.

12. Poindexter К., Gayle III, R.B. II Gene. 1991. - V. 97. - P. 125-130.

13. RussellD.R., Bennett G.N. //Gene. 1982. -V. 20. - P. 231-243.

14. Brosius J., Erfle M., Storella J. II J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 35393541.

15. Nishi Т., Itoh S. II Gene. 1986. - V. 44. - P. 29-36.

16. PetrenkoL.A., Gileval.P., Kravchenko V.V. //Gene.- 1989.-V. 78.-P. 85-91.

17. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J. J., Dubendorff J.W. II Meth. Enzymol. -1990.-V. 185.-P. 60-89.

18. Joho K.E., Gross L.B., McGraw N.J. et all I J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 31-39.

19. Raskin C.A. II "Characterization of the promoter specificity determinants of bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases". (Ph.D. Thesis, under the guidance of

20. W.T. McAllister), Dept. Microbiol. & Immunol. Morse Inst, of Molecular Genetics, State University of New York, Health Science Center at Brooklyn, (1991).

21. Maksimova T.G., Mustayev A.A., Zaychikov E.F. et al. II Eur. J. Biochem. 1991. -V. 195.-P. 841-847.

22. Soma R., Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. II Nature. 1993. - V. 364. - P. 593-599.

23. Chamberlin M., Ring J. II J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 2235-2244.

24. Golomb M, Chamberlin M. II J. Biol. Chem. 1974. V. 249. - P. 2858-2863.25. lost I., Guillerez J., Dreyfus M. // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 619-622.

25. Tabor S., Richardson C.C. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82. - P. 1074-1078.

26. Jeng S.-T., Gardner J.F., Gumport R.I. 11 J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 3823-3830.

27. Giordano T.J., Deuschle U., BujardH., McAllister W.T. II Gene. 1989. - V. 84. -P. 209-219.

28. Tanhauser S.M., Jewell D.A., Tu C.K. et al. I I Gene. 1992. - V. 117. - P. 113117.

29. Studier F. W., Moffat B.A. II J. Mol. Biol. 1986. - V. 189. - P. 113-130.

30. Перельман A.H., Мочульская H.A., Миронов А.С., Машко C.B.I I Биотехнология. 1995. -№ 1-2. - С. 11-18.

31. StudierF.W. II J. Mol. Biol. 1991. -V. 219. -P. 37-44.

32. Moffatt B.A., Studier F. W. // Cell. 1987. - V. 49. - P. 221-227.

33. Ильичев А.А., Меламед H.B., Закабунин А.И. и др. II Докл. АН СССР. 1988. -Т. 303.-С. 496-498.

34. DubendorffJ. W., Studier F. W. И J. Mol. Biol. 1991. - V. 219. - P. 45-59.

35. Lebedeva M.I., Rogozhkina E. V., Tsyba N.A., Mashko S. V. II Gene. 1994. - V. 142.-P. 61-66.

36. Uhlenbeck O.C., Bailer J., Doty P. //Nature. 1970. -V. 225. - P. 508-510.

37. Shine J., Dalgarno L. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - V. 71. - P. 13421346.

38. Olins, P.O., Devine, C.S., Rangwala, S.H., Kavka, K.S. H Gene. 1988. - V. 73. -P. 227-235.

39. Olins, P.O., Rangwala, S.H. II J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 1697316976.

40. McCarthy, J.E.G., Sebald, W., Gross, G„ Lammers, R. И Gene. 1986. - V. 41. -P. 201-206.

41. Boni, I. V., Isaeva, D.M., Musychenko, M.L., Tzareva, N.V. II Nucl. Acids Res. -1991.-V. 19.-P. 155-162.

42. Petersen, G.B., Stockwell, P.A., Hill, D.F. IIEMBO J. 1988. - V. 1. - P. 39573962.

43. Faxen, M, Plumbridge, J., Isaksson, L.A. II Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. -P. 5247-5251.

44. Sprengart, M.L., Fatscher, H.P., Fuchs, E. II Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. -P. 1719-1723.

45. Iserentant D., Fiers W. II Gene. 1980. - V. 3. - P. 1-12.

46. Stanssens P., RemautE., Fiers W. // Gene. 1985. - V. 36. - P. 211-223.49. de Smit M.H., van Duin. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 7668-7672.

47. Backman K., Ptashne M. 11 Cell. 1978. - V. 13. - P. 65-71.

48. Roberts Т., Kacick R., Ptashne M. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. -P. 760-764.

49. Guarente L., Roberts T.M., Ptashne M. II Science. 1980. - V. 209. - P. 14281430.

50. Spanjaard R.A., van Dijk M.C.M., Turion A.J., van Duin J. II Gene. 1989. - V. 80.-P. 345-351.

51. Andersson S.G.E., Kurland C.G. II Microbiol. Rev. 1990. - V. 54. - P. 198-210.

52. Chen G.-F.T., Inouye M. II Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 1465-1473.

53. Fahnestock S.R., Irwin S.L. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. - P. 23-32.

54. Yarchuk O., Guillerez J., Jacques N., Dreyfus M. II J. Mol. Biol. 1992. -V. 226. -P. 581-596.

55. Holm I. II Nucl. Acid. Res. 1986. - V. 14. - P. 3075-3078.

56. Robinson M., Lilley R., Little S. et al. II Nucleic Acids Res. 1984. - V. 12. - P. 6663-6671.

57. Sorensen M.A., Kurland C.G., Pedersen S. II J. Mol. Biol. 1989. - V. 207. - P. 365-377.

58. Belasco J.G., Higgins C.F. II Gene. 1988. - V. 72. - P. 15-23.

59. Collins J.J., Roberts G.P., Brill W.J. II J. Bacteriol. 1986. - V. 168. - P. 173178.

60. Melin L., Rutberg L., von Gabain A. II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 21102115.

61. Mudd E.A., Prentki P., Belin Д, Krisch H.M. II EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 3601-3607.

62. Koraimann G., Hogenauer G. II Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 12831298.

63. Cannistraro V.J., Subbarao M.N., Kennell D. II J. Mol. Biol. 1989. - V. 192. -P. 257-274.

64. Deutscher M.P. II Cell. 1985. - V. 40. - P. 731-732.

65. Chen C.-Y.A., BeattyJ.T., Cohen S.N., Belasko J.G. И Cell. 1988. - V. 52. - P. 609-619.

66. Newbury S.F., SmithN.H., Higgins C.F. //Cell.- 1987.-V. 51.-P. 1131-1143.

67. Melefors O., von Gabain A. //Cell. 1988. -V. 52. - P. 893-901. IX.Lundberg U., Nilsson G., von Gabain A. II Gene. - 1988. - V. 72. - P. 141-149.

68. Emory S.A., Belasco J.G. H J. Bacteriol. 1990.-V. 172.-P. 4472-4481.

69. Cannistraro V.J., Kennel D. II J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 820-822.

70. Lundberg U., von Gabain A., Melefors О. II EMBO J. 1990. - V. 9. - P. 27312741.

71. Wong H.C., Chang S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 32333237.

72. Chanda P., Ono M., Kuwano M., Kung H. II J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 446-449.

73. Claverie-Martin F., Diaz-Torres M.R., Yancey S.D., Kushner S.R. II J. Bacteriol. 1989.-V. 171.-P. 5479-5486.

74. VarshavskyA. //Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1996.-V. 93.-P. 12142-12149.

75. Blanquet S., Hirel P.-H., Schmitter J.-M. et al. II Abstr. Soviet-French Symp. "Physico-chemical foundation of life", Bordo, France, 1988.

76. Cheng Y.-S.E., Kwoh D.Y., Kwoh T.J. et al. // Gene. 1981. - V. 14. - P. 121130.

77. KaneJ.F., HartleyD.L. //TibTech.- 1988. V. 6.-P. 95-101.

78. Chen S.-H. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 4627-4631.

79. Кетре Т., Kent B.H., Chow F. et al. I I Gene. 1985. - V. 39. - P. 239-245.

80. Swebilius В., Gold L. II Gene. 1991. - V. 106. - P. 1-6.

81. Стронгин А.Я., Борухов С.И., Богуш В.Г. и др. II Биотехнология. 1987. - Т. З.-С. 325-331.

82. Lundell D., Greenberg R., Alroy Y. et al II J. Ind. Microbiol. 1990. - V. 5. - P. 215-228.

83. Kimmenade A., Dang W. I I J. Biotechnol. 1989. - V. 11. - P. 11-24.

84. Belev M., Zhou Y, Wang S. et al. II J. Chromatogr. 1994. - V. 679. - P. 67-83.

85. Fraser Т.Н., Bruce B.J. 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Y. 75. - P. 59365940.

86. Van der WerfS., Dreano M., Bruneau P. et al. И Gene. 1983. - V. 23. - P. 8593.

87. Sakamoto K., Ishimaru S., Kobayashi T. et al. II J. Bacteriol. 2004. - V. 186. -P. 5899-5905.

88. Kim, D.Y., Bochar, D.A., Stauffacher, C.V., Rodwell, V.W. II Protein Expr. Purif. 1999.-V. 17.-P. 435-442.

89. Hua, Z, Wang, H., Chen, D. et al. И Mol. Biol. Int. 1994. - V. 32. - P. 537-543.

90. Died, G., Bottarelli, L., Ballabeni, A., Ottonello, S. II Protein Expr. Purif. 2000. -V. 18.-P. 346-354.

91. Jiang, L., Yang, Y., Chatterjee, S. et al. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. -V. 63.-P. 2097-2101.

92. Calderone, T.L., Stevens, R.D., Oas, T.G. II J. Mol. Biol. 1996. - V. 262. - P. 407-412.

93. Spanjaard, R.A., Chen, K., Walker, J.R., van Duin, J. II Nucleic Acids Res. -1990.-V. 18.-P, 5031-5036.

94. Zahn К. II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 2926-2933.

95. Brinkmann U., Mattes R.E., Buckel P. II Gene. 1989. - V. 85. - P. 109-114.

96. HirschfeldE, Riesenberg DII Appl Microbiol Biotechnol. 1992 - V. 36(4) -P. 487-492.

97. Ivanov I, MarkovaN, Bachvarov D, Alexciev K, SaraffovaA, Maximova V, Tsaneva I, Markov G. II Int J Biochem. 1989 - V.21(9) - P. 983-985.

98. Laplace F, Hartmann M, Klessen C, Tonew M, Malke H. IIJ Basic Microbiol. -1988 V.28(l-2)-P. 55-61.

99. Petrenko LA, Gileva IP, Kravchenko VV. //Bioorg Khim. 1987 - V. 13(11) -P. 1561-1569.

100. Srivastava P, Bhattacharaya P, Pandey G, Mukherjee KJ. II Protein Expr Purif. -2005 -V. 41(2)-P. 313-322.

101. IvanovIG, SaraffovaA, Alexandrova R, AbouHaidar MG. IIFEMS Microbiol Lett.- 1993-V. 108(2)-P. 231-236.

102. Waine GJ, Wines BD, Wang L, McMullen GL. //Biochem Int. 1992 - V.28(2) -P. 255-263.

103. Кравченко B.B., Гшева И.П., Сандахчиев JI. С. и др. II Патент Российской Федерации № 2054041 (1996).

104. Пикалова М.И., Доманова З.М., Хайбуллина И.И. u dp. II Патент Российской Федерации № 2118366 (1998).

105. Черепанов П.А., Михайлова Т.Г., Черепанов П.П. и др. //Патент Российской Федерации № 2165455 (2001).

106. Riesenberg D., Menzel К., Schulz V., Schulmann К., Veith G., Zuber G., Knorre W.A. II Appl Microbiol Biotechnol. 1990 - V. 34 - P. 77-82.

107. Bodo G., Maurer-Fogy I., Falkner E., et al. И United State Patent № 5,196,323 -(1993).

108. Hauptmann R., Falkner E., Bodo G., et al. И United State Patent № 5,710,027 -(1998).

109. Бажутипа H.B., Гурьев В.П., Гурьева Т.Л., и др. II Патент Российской Федерации № 2123010 (1998).

110. Beldarrain A., Cruz Y, Cruz О., Navarro М., Gil М. II Biotechnol. Appl. Biochem. 2001-V.33.-P. 173-182.

111. Bab и K.R., Swaminathan S., Marten S., KhannaN., Rinas U. II Appl Microbiol Biotechnol. 2000 - V. 53 - P. 655-660.

112. Guo L.A. II Se Pu Abstract - 2001 - V. 19(4) - P. 301-303.

113. Cho J.M., Park Y. W., Park S.J., et al. //Europe Patent № 0 553 494 (1993).

114. Swaminathan S., Khanna N. II Protein Expr. Purif. 1999 - V. 15(2) - P. 236242.

115. Di Marco S., Fendrich G., Meyhack В., Grutter M.G. II J.Biotechnol. 1996 -V. 50(1)-P. 63-73.

116. Yan Y, WangX., Wu A., Sun Y H Chin J Biotechnol. Abstract - 1996 - V. 12(1)-P. 25-29.

117. Anon. Monograph 1100. Concentrated interferon alpha 2 solution. II European Pharmacopoeia 3rd edition 1998 - Strasburg, France.

118. Фармакопейная статья предприятия 42-0241118201. ДГУ ПП «Вектор-Фарм» - 2001 - Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный (субстанция).

119. Фармакопейная статья предприятия 42-0543549504. ООО «Фармапарк» -2004 - Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный.

120. Hershenson S., Shaked Z., Thomson J. // United State Patent № 4,961,969 -(1990).

121. Hershenson S., Shaked Z. 11 United State Patent № 4,894,330 (1990).

122. McAllister, W.T., Morris, C., Rosenberg, A.H., et al.// J. Mol. Biol. 1981 - V. 153-P. 527-544.

123. Morehead, H., et al //Biochemistry 1984 - V. 23 - P. 2500 - 2507.

124. Колосов, M.H., и dp J Авторское свидетельство СССР № 1092176 1984 -Бюл. Изобр. № 18.