Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии суспензионного культивирования клеток CHO для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии суспензионного культивирования клеток CHO для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а"

На правах рукописи

---

ЛОБАНОВА Наталия Валентиновна

Разработка технологии суспензионного культивирования клеток СНО для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О МАЙ 2013

Москва-2013

005060193

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Серёгин Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

Тихонов Игорь Владимирович — доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», кафедра биотехнологии, заведующий;

Королёва Ольга Владимировна — доктор биологических наук, профессор, Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, лаборатория молекулярных основ биотрансформаций, заведующая.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности».

Защита состоится » 2013 г. в /¿¿—часов на заседании дис-

сертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 37793-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВ-МиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

Автореферат разослан » ¡^ил^С 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Татьяна Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Получение белков медицинского назначения, произведенных по рекомбинантной технологии, является перспективной отраслью науки (Andersen D., 2002; Wurm F., 2004). Интерферон-бета (ИФН-ß), один из широко производимых рекомбинантных белков, применяется в качестве эффективного средства против рассеянного склероза - хронического аутоиммунного заболевания ЦНС (Kagawa Y., 1988).

Получение гликозилированной формы белка — ИФН-ß-1а — возможно только в клетках эукариот (Mark D., 1984). Из них наиболее часто в современной биотехнологии используется культура клеток яичников китайского хомячка (СНО), характеризующаяся высокой скоростью пролиферации, простотой культивирования и изученностью (Wurm F., 2004; Pavlou А., 2004).

ИФН-ß — сложный для производства белок, что обусловлено его высокой гидрофобностью и склонностью к агрегации (Runkel L., 2000). В связи с этим, необходим особый подход к разработке технологии его получения, включающий выбор оптимальной системы экспрессии, подбор физико-химических параметров культивирования, состава питательной среды, стратегии введения подпиток и добавок, а также типа биореактора.

В настоящее время на российском рынке широко представлены препараты ИФН-ß, производимые зарубежными компаниями. В рамках стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2020 г. поставлена задача снижения импортозависимости российского рынка лекарств. Поэтому разработка технологии производства отечественного препарата ИФН-ß для лечения аутоиммунных заболеваний людей и животных является актуальной задачей для медицины и ветеринарии.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось создание клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-ß-1а на основе клеток СНО, разработка технологии их суспензионного культивирования и её апробация в рамках общей технологии производства препарата ИФН-ß-1а.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Создание клонов-продуцентов ИФН-ß-la на основе клеток яичников китайского хомячка СНО.

2. Отбор полученных клонов-продуцентов по ростовым характеристикам и продуктивности.

3. Разработка лабораторной технологии культивирования клона-продуцента рекомбинантного ИФН-|3-1а.

4. Оптимизация параметров и режимов культивирования, состава питательной среды для повышения продуктивности и качества целевого белка.

5. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов ИФН-Р-1а в биореакторах различного типа.

6. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости, определение его физико-химических свойств и противовирусной активности.

7. Проведение доклинических и клинических испытаний полученного препарата ИФН-р-1а.

8. Разработка нормативной документации на производство субстанции рекомбинантного ИФН-Р-1а и препарата на её основе.

Научная новизна. Впервые создан продуцент рекомбинантного ИФН-Р-1а на основе системы индуцируемой экспрессии и клеток яичников китайского хомяка СНО, не имеющий аналогов на российских биотехнологических производствах. Впервые в России разработана и успешно апробирована технология получения рекомбинантного ИФН-р-1а, основанная на суспензионном культивировании клеток СНО без использования белков животного происхождения.

Доказана эффективность введения в среду 10 мМ галактозы и 2 мМ уриди-на, являющихся субстратами реакций гликозилирования, с целью повышения содержания целевой гликозилированной формы рекомбинантного ИФН-Р-1а в культуральной жидкости клеток СНО.

Впервые проведено сравнительное исследование процессов культивирования продуцента рекомбинантного ИФН-Р-1а в биореакторах различного типа -стеклянном с механическим перемешивающим элементом и волновом на основе одноразовых мешков, по результатам которого показаны преимущества последнего для сохранения ростовых характеристик, продуктивности клона и гликозилирования ИФН-р-1а при масштабировании.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты использованы в организации производства отечественного лекарственного препарата ИФН-Р-1а на площадке ООО «Фармапарк». Данные, полученные в ходе прове-

денных исследований, включены в опытно-промышленный регламент по производству рекомбинантного ИФН-р-1а. Разработана нормативная документация на производство субстанции (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению). Препарат ИФН-р-1а, созданный с использованием разработанной технологии, успешно прошёл доклинические исследования, а также первую фазу клинических исследований. Результаты проведенной работы могут быть применены к процессам оптимизации биотехнологических процессов производства других генно-инженерных лекарственных препаратов.

Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты рекомбинантного ИФН-Р-1а созданы в ходе совместных исследований автора с группой учёных Биотехнологического исследовательского института (Монреаль, Канада). Автором обоснована возможность использования куматной экспрессионной системы для получения клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-р-1а человека, проведена работа по ха-рактеризации полученных клонов. Автором создан клеточный банк лучшего клона, проведена его паспортизация. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на секрецию и гликозилирование нарабатываемого белка, а также по масштабированию процесса. Эксперименты по очистке рекомбинантного ИФН-р-1а и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк».

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VI международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, 2011), международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической конференции «Биотехнология - перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура и диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 201 источник, из них 189 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 18 таблиц, 35 рисунков, 10 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Рекомбинантная технология на основе суспензионных клеток СНО и индуцируемой экспрессионной системы обеспечивает получение стабильных клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-P-la за счет минимизации негативного влияния данного белка на клетки.

2. Максимальная продуктивность клеточной линии достигается при применении двухфазного температурного режима культивирования, использовании химически определенной бессывороточной питательной среды Power CHO-2CD и концентрации индуктора (кумата натрия) 1,5 мг/л.

3. Профиль изоформ рекомбинантного ИФН-P-la может быть приведен в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи путем внесения в питательную среду галактозы и уридина в концентрации 10 и 2 мМ, соответственно.

4. Основные характеристики разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО (продуктивность, гликозилирование и активность рекомбинантного ИФН-p-la) остаются стабильными при масштабировании процесса в волновом биореакторе на основе одноразовых мешков объемом 10 л.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки РФ №2010-218-02-189 в 2010-2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии ФГУП «ГосНИИгенетика».

Клоны-продуценты ИФН-P-la были получены методом введения генетической конструкции, содержащей синтетический ген ИФН-р человека под контролем конститутивного и индуцируемого промотора (Mullick А., 2006), в клетки суспензионной линии CHO-S (Invitrogen, США).

Культивирование осуществляли стационарно или при перемешивании со скоростью 120 об/мин во влажной среде с 5% содержанием С02 при температуре 37 и 30 °С. Подсчет числа клеток и анализ их жизнеспособности осуществляли после окрашивания трипановым синим в камере Горяева. Для индукции экспрессии в среду вносили 1,5 мг/л кумата натрия. Для масштабирования культивирования использовали стеклянный биореактор с механическим перемешивающим элементом объемом Зли волновой биореактор на основе одноразовых мешков объёмом 10 л.

Выделение ИФН-р-1а из культуральной жидкости (КЖ) проводили методом аффинной хроматографии с последующей очисткой методом катионооб-менной хроматографии и переводом в буфер готовой лекарственной формы. Определение концентрации и анализ профиля изоформ ИФН-Р-1а проводили методом Вестерн-блотинга с использованием поликлональных антител к ИФН-р. Специфическую противовирусную активность ИФН-р-1а определяли в соответствии со стандартной методикой (Armstrong J., 1981) на культуре клеток аденокарциномы легкого А 549 и вируса энцефаломиокардита мыши в сравнении с международным стандартом активности ИФН-Р-1а .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-Р-1а. На начальном этапе исследований были сконструированы 2 экспрессионные плазми-ды, содержащие ген ИФН-р под контролем конститутивного и индуцируемого (куматного) промоторов. Плазмиды трансфецировали в клетки линии CHO-S, после чего отбирали позитивные клоны на автоматическом селекторе. Клоны с конститутивной экспрессией ИФН-р-1а характеризовались высоким уровнем агрегации клеток, приводящей к снижению жизнеспособности культуры, в связи с чем были исключены из работы. Таким образом, уже на начальном этапе стали очевидны преимущества куматной системы экспрессии, как наиболее оптимального способа организации процесса, поскольку наращивание биомассы проводится в отсутствии белка, обладающего токсическим действием на клетки-продуценты.

Было отобрано 36 клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-Р-1а, из которых 7 обладали максимальной продуктивностью и были адаптированы к условиям культивирования при перемешивании. С целью повышения стабильно-

сти экспрессии нами было проведено повторное клонирование клеток. Клоны были проанализированы по параметрам продуктивности и содержания глико-зилированных форм ИФН-р-1а, как одного из важных критериев качества белка. Для всех 11 клонов показана продуктивность по ИФН-Р-1а более 15 мг/л и доля гликозилированных форм не менее 60%. Согласно литературным данным, форма с массой около 18 кДа является негликозилированным ИФН-Р, тогда как все формы белка с массой более 21 кДа отличаются разной степенью гликози-лирования (табл. 1).

Таблица 1. Характеристики клонов-продуцентов ИФН-р-1а

№ клона Продуктивность, мг/л Доля гликозилированных форм, %

ЗЗА 28,7 ±3,7 68 ±5

33В 21,2 ± 3,1 61 ±6

ЗЗС 15,9 ±2,5 75 ±5

ЗЗБ 18,8 ±4,3 63 ±4

ЗЗЕ 27,1 ±4,2 68 ±8

ЗЗР 25,4 ±2,5 69 ±7

ззв 20,6 ± 1,9 69 ±5

ЗЗН 17,5 ±2,4 62 ±5

ЗЗК 19,9 ± 1,8 69 ±8

ззь 23,8 ±3,2 70 ±7

ЗЗN 25,7 ±4,1 63 ±9

Далее нами была проведена оценка стабильности продуцирования клонами целевого белка. Клетки культивировали в течение 2 месяцев, осуществляя измерение продуктивности методом Вестерн-блотинга в трех точках: начальной, по истечении первого и второго месяцев (рис. 1).

■ то

■ Т1

■ Т2

Рис. 1. Исследование стабильности продуцирования клонами ИФН-р-1а:

ТО — начальная точка, Т1 и Т2 - по истечении 1 и 2 месяцев, соответственно

ЗЗА 33В ЗЗС 330 ЗЗЕ ЗЗР ЗЗв ЗЗН ЗЗК 331. 33 N номер клона

По результатам проведенных экспериментов было отобрано 5 клонов (ЗЗА, 33В, ЗЗЕ, 33L, 33N), уровень продукции которых изменялся в пределах ±20% от первоначального значения. Анализ ДНК клеток методом Саузерн-блоттинга и секвенирования подтвердил генетическую стабильность всех пяти клонов, что позволяет применять их в производственном процессе.

Подбор оптимальной питательной среды и параметров культивирования. Создание клонов-продуцентов ИФН-р-1а и их первоначальное культивирование проводилось в химически определенной среде CD-CHO (Invitrogen, США). Для улучшения ростовых характеристик клоны были адаптированы к культивированию в средах других производителей: Power CHO-2CD (Lonza, США), CDM4CHO (ThermoScientific, США), Ex-Cell CD-CHO (Sigma, США). Было установлено, что оптимальной средой, положительно влияющей на скорость роста и продуктивность клеток, а также снижающей степень их агрегации, является Power CHO-2CD (рис. 2). Из всех проанализированных клонов лучшим по ростовым характеристикам и уровню продукции ИФН-р-1а являлся клон ЗЗА, который был использован в дальнейшей работе.

CD-CHO PowerCHO-2CO CDM4CHO Ex-Cell CD-CHO PowerCHO-2CD C0M4CH0 EvCetl

а б

Рис. 2. Время удвоения клеток (а) и продуктивность клонов (б) при культивировании в различных средах

Было проведено сравнительное исследование параметров суспензионного культивирования при следующих температурных режимах: 37 и 30 °С в течение всего цикла продукции целевого белка, а также 37 °С в течение 2 суток с последующим переходом на температуру 30 °С (рис. 3). Наиболее эффективным оказалось использование двухфазного температурного режима: несмотря на сниженный темп роста клеток, по сравнению с культивированием при 37 °С, дос-

тигнутая концентрация ИФН-р-1а в КЖ являлась максимальной. Данный факт может быть обусловлен тем, что понижение температуры культивирования позволяет уменьшить степень агрегации производимого клетками ИФН-Р-1а.

^ о

М

5Г

сутки культивирования О

Рис. 3. Кривые роста (а) и вестерн-блот образцов КЖ (б) клона 33А, культивировавшегося при разных температурах:

1 _ 37 °с, 2 - 30 °С, 3 - 37 °С в течение 2 суток, затем 30 °С, М - маркер молекулярной массы, - стандарт ИФН-р-1а-С118, 5 нг

Далее нами была проанализирована зависимость ростовых характеристик и продуктивности клона ЗЗА от концентрации индуктора - кумата натрия (рис. 4, а). Было установлено, что при концентрации 1,5 мг/л зависимость продуктивности от концентрации кумата достигает выхода на плато. Именно данная концентрация индуктора являлась оптимальной и применялась нами во всех дальнейших экспериментах.

концентрация кумата, мг/л а

сутки культивирования б

Рис. 4. Зависимость продуктивности от концентрации кумата натрия (а); кривые роста (б) и Вестерн-блот образцов КЖ (в) клона ЗЗА, засеянного в разной плотности: 1, 2, 3, 4-0,30, 0,75, 1,50 и 3,00 млн. клеток/мл, соответственно, М - маркер молекулярных масс, 81- стандарт ИФН-р-1а-С118, 10 нг

Ранее было показано, что во время цикла продукции при температуре 30 °С пролиферации клеток практически не происходит. Поэтому логичным являлся анализ зависимости продукции ИФН-P-la и жизнеспособности клеток от исходной клеточной плотности. Как видно и рис. 4, б, временные зависимости жизнеспособности клеток, засеянных в плотности 0,30 и 0,75, млн. клеток/мл довольно близки. Кроме того, при использовании этих посевных плотностей достигается максимальная продуктивность по ИФН-Р-1а (20-25 мг/л, рис. 4, в).

Оптимизация состава питательной среды для увеличения продуктивности клона. Исходя из литературных данных, был отобран ряд веществ и исследовано их влияние на ростовые характеристики и уровень продуцирования клоном ИФН-Р-1а. Наибольший эффект оказало внесение 0,1%-го цвиттерион-ного детергента CHAPS: было отмечено увеличение скорости роста и жизнеспособности клеток, а также повышение концентрации ИФН-р-1а в КЖ на 2535%, по сравнению с контролем (табл. 2).

Таблица 2. Влияние добавок, вносимых в питательную среду, на ростовые

характеристики и продуктивность клеток

Добавка Концен- Длитель- Клеточная Доля живых Концентрация

трация, ность* , плотность на клеток на 8 ИФН-Р-1а,

мМ сут 8 сутки, млн./мл сутки,% мг/л

Контроль - 8 1,6 ±0,6 43,1 ±3,3 26,1 ±2,3

CHAPS 0,05% 8 2,3 ± 0,6 59,6 ± 6,7 27,7 ±2,1

0,1% 8 2,7 ± 0,4 63,0 ± 4,7 33,6 ±3,8

Однако при оптимизации условий выделения ИФН-Р-1а из КЖ было обнаружено негативное влияние CHAPS на связывание белка с сорбентом, в связи с чем было решено отказаться от его использования.

Был проведен ряд экспериментов в режиме культивирования с подпиткой: несмотря на увеличение клеточной плотности при добавлении некоторых коммерческих подпиток на 20-30% в сравнении с контролем, продуктивность клона значимо не повышалась. В работе также была определена возможность введения в среду ингибиторов ферментов, модифицирующих хроматин, как соединений, напрямую влияющих на уровень транскрипции генов. Однако в проведенных экспериментах влияние данных веществ на скорость роста биомассы и продуктивность было, преимущественно, нейтральным (данные не приведены). По-видимому, тот факт, что продуктивность клона слабо поддается оптимиза-

ции, обусловлен свойствами ИФН-р-1а, который при повышенном продуцировании в большей степени агрегирует и негативно воздействует на клетки.

Оптимизация состава среды для улучшения профиля изоформ ИФН-Р-1а. Одной из основных характеристик рекомбинантного ИФН-Р-1а является гликозилирование, положительно влияющее на стабильность и биологическую активность. В соответствии с требованиями Европейской Фармакопеи (ЕФ), профиль гликозилированных форм рекомбинантного ИФН-р-1а в готовом препарате должен соответствовать стандартному образцу ИФН-р-1а-СЛ8 - в нем должна, преимущественно, содержаться основная форма белка (рис. 5, 2). Содержание гликозилированных форм белка с меньшей молекулярной массой не должно превышать 5%.

-250 -130

. _ -100

~70

кДа кД»

116-

•шкозилированные ( формы | неглнкоштированнач форма

формы 1 целевая — ¥ ' V нецелевая-—

- целевая

- нецелевая

12 3 4 5 6 7

а б

Рис. 5. Вестерн-блот (а) и электрофореграмма (б) образцов, содержащих ре-комбинантный ИФН-Р-1а: 1 - КЖ, полученная при культивировании клона 33А в колбах; 2 и 5 - стандарт 1Р"Ы-Ье1а-1 а СЯБ 5 нг и 1 мкг, соответственно; 3 и 4 - маркеры молекулярных масс, 6 - элюат с аффинной хроматографии; 7 -элюат с катионообменной хроматографии

Кроме основной формы белка, соответствующей стандарту, в КЖ клона-продуцента содержится несколько других форм, узнаваемых антителами к ИФН-Р: негликозилированная форма, а также 4-5 гликозилированных форм (рис. 5, /). При очистке ИФН-р-1а из описанного выше образца КЖ был детектирован состав гликозилированных форм белка, не соответствующий требованиям ЕФ. Элюат, полученный на стадии аффинной очистки, содержал все гли-

коформы ИФН-р-1а, присутствующие в исходной КЖ (рис. 5, б). На стадии ка-тионообменной хроматографии была получена фракция, обогащенная основной гликоформой ИФН-р-1а, однако при этом было обнаружено высокое содержание гликозилированной формы с меньшей молекулярной массой (рис. 5, 7). С целью получения ИФН-Р-1а с улучшенным профилем гликозилирования было решено подвергнуть оптимизации состав культуральной среды путем внесения ряда добавок.

«*-**- »шл*, щШШ Шш*

||и .| Д1 ш ц I ^¿•У}--

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 7 7 75

а б

Рис. 6. Вестерн-блоты (а, б) образцов КЖ, содержащих ИФН-р-1а: 1 и 15 -

маркер молекулярных масс; 2, 3, 4, 16 — стандарт ИФН-Р-1а-СЯ8, 10, 5, I, 5 нг, соответственно; 5, 11, 75-контроль; б- 1%глицерин; 7- 10 мМ глюкозамина; 5-10 мМ галактозы; 9 — 2 мМ уридина; 10-5 мМ ]4-ацетил-0-маннозамина; 12 - 2 мМ уридинтрифосфата; 13 - 0,5 мл/л среды жирных кислот; 14 - 1 мкм хлорида марганца, /7-10 мМ галактозы + 2 мМ уридина

Положительный влияние на профиль гликоформ белка оказало введение 1% глицерина, 1 мкм хлорида марганца, 2 мМ уридина, 10 мМ галактозы, жирных кислот (рис. 6, б, 8, 9, 13, 14). Однако максимальный эффект был получен при использовании смеси 10 мМ галактозы и 2 мМ уридина: введение в среду данных соединений позволило устранить образование нецелевой гликозилированной формы ИФН-Р-1а (рис. 6,17).

Анализ ростовых характеристик и продуктивности клона при культивировании в биореакторах. Важнейшим этапом разработки технологии является масштабирование процесса культивирования от лабораторного до промышленного уровня. Было проведено сравнительное изучение динамики роста и продуктивности полученной клеточной линии при культивировании в биореакторах различного типа: стеклянном с механическим перемешивающим эле-

ментом и одноразовом волнового типа. В качестве контроля использовали процесс культивирования в малом объеме, отработанный ранее. Типичный вид кривых роста и жизнеспособности клеток представлены на рис. 7.

Рис. 7. Кривые роста (а) и жизнеспособности (б) клеток-продуцентов ре-комбинантного ИФН-р-1а, культивируемых в колбе и биореакторах

Сутки культивирования 6

1 - --—Колбв

2 - —»^биореактор с перемешиванием

3 - ■ Бнореактор еолпового типа

2 4 6

Сутки культивирования

а

Для клеток, культивировавшихся в биореакторе с механическим перемешивающим элементом, отмечено уменьшение скорости роста и жизнеспособности, по сравнению с контрольной культурой (рис. 7, а, б), а также уменьшение концентрации ИФН-|3-1а в КЖ до 15-20 мг/л (рис. 8, а).

12 3 4 5 6 7 8 9 12 3456789 а б

Рис. 8. Вестерн-блот образцов КЖ, содержащих ИФН-р-1а, отобранных в разные дни культивирования из биореактора перемешивающего (а) и волнового (б) типа: 1 - маркер молекулярных масс; 2,3 - стандарт ИФН-Р-1а-СЯЭ, 5 и 1 нг, соответственно; 4 и 5, 6 и 7, 8 и 9 - 0,5 мкл КЖ на 3, 5, 7 сутки культивирования в колбе и соответствующем биореакторе.

Для биореактора волнового типа динамика роста клеток, а также продуктивность (25-30 мг/л) и профиль гликозилирования оказались весьма сходными с таковыми показателями, полученными для колб (рис. 7 и 8), что свидетельствует об успешном проведении масштабирования.

КЖ, наработанная при культивировании в мешке, содержащая ИФН-(5-1а в концентрации около 25 мг/л, была подвергнута двухступенчатой очистке. В результате был получен чистый препарат, содержащий 95-97% гликозилирован-ных форм ИФН-(3-1а, соответствующих изоформам стандартного образца (рис. 9, 2 и 4).

Рис. 9. Электрофореграмма (12,5% ПААГ) образцов, содержащих ре-комбинантный ИФН-р-1а: 1 — маркер молекулярных масс; 2 - стандарт ИФН-р-1а-СЯ8, 1 мкг; 3 и4-элюаты с аффинной и катионообменной хроматографии, соответственно.

12 3 4

Для подтверждения данных по содержанию целевого белка в КЖ, наработанной в биореакторе волнового типа, нами также была проведена оценка специфической активности ИФН-Р-1а. Было показано, что ИФН-Р-1а, нарабатываемый клетками СНО при культивировании в волновом биореакторе, обладает противовирусной активностью около 3,8 млн. МЕ/мл, что является важным критерием качества и соответствует требованиям ЕФ.

Оценка стабильности и экономической эффективности процесса культивирования в волновом биореакторе. Важной частью исследования являлось подтверждение стабильности процесса культивирования в биореакторе и воспроизводимости его результатов, поскольку это один из основных критериев, учитываемых при передаче технологии в серийное производство. Нами были последовательно проведены 3 установочные серии процесса культивирования в одноразовом мешке объемом 10 л в волновом биореакторе. Для изучения стабильности были отобраны такие параметры процесса, как специфическая

скорость роста клеток, уровень продуцирования ИФН-Р-1а, содержание глико-зилированных форм и специфическая активность (табл. 3).

Таблица 3. Результаты проведения 3 установочных серий культивиро-

вания в биореакторе волнового типа

Серия Параметры культивирования

Специфическая скорость роста, сут"1 Продуктивность, мг/л Содержание гликозилиро-ванных форм, % Активность, млн. МЕ/мл

290512 0,49 ±0,01 23,4 ± 1,4 65 ±3 3,6 ±0,2

070612 0,48 ±0,01 22,9 ± 1,4 68 ±3 3,8 ±0,2

180612 0,50 ±0,01 25,5 ± 1,4 61 ±3 3,9 ±0,2

Средний выход целевого белка в процессе культивирования клона-продуцента в биореакторе составлял 24,0 ± 1,4 мг/л. При этом основные характеристики ИФН-р-1а оставались на стабильном уровне. В результате проведенных экспериментов было показано, что культивирование созданного клона-продуцента рекомбинантного ИФН-р-1а в волновом биореакторе в объеме 10 л является воспроизводимым.

При оценке экономической эффективности разработанной технологии был проведен расчёт затрат на культивирование клона-продуцента в биореакторе волнового типа. Себестоимость процесса культивирования в пересчете на 1 упаковку препарата рекомбинантного ИФН-р-1а (132 мкг) составляет 460 руб., стоимость упаковки препарата-оригинатора (Ребиф), при этом, составляет 10 ООО руб. Таким образом, процесс производства рекомбинантного ИФН-Р-1а с использованием разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО является рентабельным.

Технологическая схема процесса суспензионного культивирования СНО. Разработанная технология включает несколько базовых стадий (рис. 10). Подготовительным этапом для каждой стадии служит приготовление необходимых растворов и питательных сред. Процесс культивирования начинают с размораживания пробирки с рабочим банком клеток-продуцентов рекомбинантного ИФН-р-1а. Клетки культивируют с целью получения достаточного для засева биореактора количества биомассы, после чего вносят в мешок волнового биореактора объемом 10 л. Культивирование проводят в соответствии с разработанной и описанной выше технологией. После окончания процесса клеточный супернатант, содержащий целевой белок, отделяют центрифугировани-

ем от биомассы. КЖ передают на стадию хроматографической очистки с последующим приготовлением готовой лекарственной формы препарата реком-бинантного ИФН-Р-1а.

Рис. 10. Технологическая схема разработанного процесса

Разработанная технологическая схема вошла в состав опытно-промышленного регламента на производство субстанции рекомбинантного ИФН-р-1а (№ 0047 9942-07-11). Препарат рекомбинантного ИФН-Р-1а, полученного с применением разработанной технологии суспензионного культивирования, прошел доклинические исследования на животных и первую фазу клинических исследований на здоровых добровольцах, по результатам которых была подтверждена его безопасность, переносимость, а также соответствие фармакокинетических параметров таковым у препарата-оригинатора.

ВЫВОДЫ

1. Использование суспензионных клеток СНО и индуцируемой системы экспрессии на основе кумата натрия позволило получить клоны, стабильно продуцирующие рекомбинантный ИФН-Р-1а и обладающие высоким уровнем жизнеспособности. Для лучшего клона показана продуктивность не менее 20 мг ИФН-Р-1а на литр среды, уровень гликозилирования более 60%, стабильный уровень экспрессии при непрерывном культивировании в течение 2 месяцев, а также подтверждена генетическая стабильность.

2. Проведен подбор условий суспензионногб культивирования клона-продуцента рекомбинантного ИФН-р-1а: выбрана питательная среда, оптимальная для роста клеток и продуцирования целевого белка (Power CHO-2CD, Lonza, США); определена оптимальная концентрации индуктора (1,5 мг/л), исходная клеточная плотность (0,30-0,75 млн. клеток/мл среды); подобран температурный режим (2 суток при 37 °С, далее 6 суток при 30 °С), позволяющий повысить продуктивность процесса.

3. Проведенные эксперименты с внесением 35 видов добавок (антиокси-дантов, детергентов, ферментов, модифицирующих хроматин и проч.) и подпиток различного состава показали их слабое влияние на продуктивность клеточной линии.

4. Осуществлен подбор добавок, улучшающих профиль изоформ нарабатываемого клетками-продуцентами ИФН-Р-1а: внесение в среду 10 мМ галактозы и 2 мМ уридина позволило устранить образование нецелевой гликозилиро-ванной формы ИФН-Р-1а.

5. Разработана технология культивирования клеток СНО в биореакторе волнового типа на основе одноразовых мешков, оптимальная для сохранения ростовых характеристик клона-продуцента, профиля изоформ рекомбинантного ИФН-P-la и позволяющая повысить выход целевого белка на 15-20%, по сравнению с процессом в стеклянном биореакторе с механическим перемешивающим элементом.

6. Очистка культуральной жидкости, наработанной в мешке объемом 10 л, позволяет получать субстанцию рекомбинантного ИФН-P-la, обладающего профилем изоформ, соответствующим стандартному образцу, и уровнем противовирусной активности равным не менее 3,6 млн. МЕ/мл.

7. Проведены 3 установочные серии культивирования продуцента рекомбинантного ИФН-P-la в мешке объемом 10 л на волновом биореакторе, подтвердившие стабильность и воспроизводимость процесса.

8. Расчёт технико-экономических показателей подтвердил, что процесс производства рекомбинантного ИФН-P-la с использованием разработанной технологии суспензионного культивирования является экономически выгодным: себестоимость культивирования составляет около 5% от рыночной стоимости препарата-оригинатора.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Клеточная культура-продуцент рекомбинантного ИФН-Р-1а была депонирована в ВКПМ (Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов) под номером Н-124 (дата депонирования - 24.04.2012 г.).

2. Данные, полученные в ходе исследований, включены в опытно-промышленный регламент на производство субстанции рекомбинантного ИФН-Р-1а человека (№ 00479942-07-11).

3. Разработана фармакопейная статья предприятия на субстанцию рекомбинантного ИФН-Р-1а (2012 г.).

4. Препарат рекомбинантного ИФН-Р-1а, созданный с применением разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО, успешно прошёл доклинические исследования, а также первую фазу клинических исследований.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Препарат, созданный на основе субстанции рекомбинантного ИФН-Р-1а человека, получаемой по разработанной технологии, является первым отечественным препаратом данного белка, используемым для лечения рассеянного склероза. Полученный препарат рекомбинантного ИФН-Р-1а не уступает по качеству оригинальному препарату, обладая при этом гораздо меньшей стоимостью, и рекомендуется для широкого применения в медицинской и ветеринарной практике.

2. Разработанная технология суспензионного культивирования отвечает всем современным требованиям качества, предъявляемым к медицинским препаратам на основе рекомбинантных белков. Данная технология рекомендуется к внедрению в серийное производство биофармацевтических препаратов вместо технологий, основанных на адгезионном культивировании, как способствующая сокращению объема работ и трудозатрат.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оптимизация процесса культивирования клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный интерферон-бета / Лобанова Н.В., Трусова И.Н., Благодатских Е.Г. идр.// Биотехнология. -2011.- №6,- С. 55-62.

2. Особенности разработки и оптимизации эукариотических клонов-продуцентов рекомбинантного интерферона-бета / Серегин Ю.А., Благодатских Е.Г., Лобанова Н.В. и др. // VI международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии». — 2011.-С. 95-96.

3. Оптимизация условий культивирования эукариотических продуцентов рекомбинантного интерферона-бета / Лобанова Н.В., Трусова И.Н., Благодатских Е.Г. и др. // Научная конференция по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова». - М.: ИБХ РАН. -2011.-С. 41.

4. Влияние ингибирования ферментов, модифицирующих хроматин, на уровень экспрессии генов под контролем вирусных промоторов в клетках млекопитающих / Серегин Ю.А., Лобанова Н.В., Копылова О.И. и др. // IV международная научно-практическая конференция «Современная медицина: анализ и перспективы развития».-М.: Спутник-плюс.-2012.-С. 32-37.

5. Оптимизация технологии культивирования эукариотического продуцента рекомбинантного интерферона-бета-1а в одноразовом биореакторе / Лобанова Н.В., Нурбаков A.A., Трусова И.Н. и др. // Конференция «Биология - наука XXI века». -М.: Макс-Пресс. -2012. - С. 495-497.

6. Разработка технологии очистки интерферона бета-1а из культуральной жидкости клеток СНО / Чупыркина A.A., Шамонов H.A., Лобанова Н.В. и др. // Международная конференция «Биология - наука XXI века». - М.: Макс-Пресс. -2012.-С. 1032-1033.

7. Сравнение эффективности технологий культивирования клеток СНО, продуцентов рекомбинантного интерферона-бета-1а, в биореакторах различного типа / Лобанова Н.В., Нурбаков A.A., Ермолина Л.В. и др. // Ветеринарная медицина. - 2012. -№ 3-4. - С. 26-30.

8. Optimization of CHO cell culture medium for production of recombinant human erythropoietin and interferon beta-la / N. Lobanova, I. Savinova, I. Trusova et al. // 15th European congress on biotechnology. - Elsevier : Oxford. - 2012. - P. 72.

9. Preclinical investigation of a new interferon beta-la biosimilar / E. Sautkina, Y. Seregin, N. Lobanova et al. // 15th European congress on biotechnology. - Elsevier B.V.: Oxford.-2012. - P. 202.

10. Оптимизация условий культивирования клеток СНО как ключевой этап создания технологии производства рекомбинантных белков медицинского назначения / Лобанова Н.В., Нурбаков A.A., Шукуров P.P. и др. // II Международная научно-практическая конференция «Биотехнология - перспективы развития». - Уфа: БГПУ. - 2012. г- С. 24-26.

11. Оптимизация процессов культивирования эукариотических клеток-продуцентов на основе линии СНО при производстве биофармацевтических препаратов / Лобанова Н.В., Нурбаков A.A., Сауткина E.H. и др. // Биотехнология. - 2013.-№1. - С. 8-25.

12. Оптимизация профиля гликозилирования рекомбинантного интерферо-на-бета-1а при культивировании клеток СНО в биореакторе волнового типа / Лобанова Н.В., Нурбаков A.A., Аксенова В.И., и др. // Биотехнология. - 2013. -№2. - С. 55-66.

Подписано в печать:

22.05.2013

Заказ № 8536 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Объем: 1 усл.п.л. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autorcferat.ni

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лобанова, Наталия Валентиновна, Москва

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

На правах рукописи

04201357973

ЛОБАНОВА Наталия Валентиновна

Разработка технологии суспензионного культивирования клеток СНО для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Серёгин Юрий Александрович

Москва-2013

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................11

1.1. Интерферон-бета - строение, свойства и применение........................................11

1.2. Этапы создания продуцентов рекомбинантных белков....................................20

1.3. Получение биофармацевтических препаратов с помощью культур клеток млекопитающих..................................................................................................................26

1.4. Методы оптимизации процессов культивирования клеток СНО..............34

1.5. Режимы и аппаратурное оформление процессов культивирования..................................................................................................................................47

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................................................................52

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................................................................................52

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................................................................64

2.2.1. Технология получения рекомбинантного ИФН-Р- 1а....................................64

2.2.2. Создание клонов-продуцентов ИФН-Р-1а..................................................................66

2.2.3. Выбор клонов, обладающих максимальной продуктивностью............72

2.2.4. Изучение стабильности клонов-продуцентов ИФН-Р-1а............................76

2.2.5. Подбор питательной среды, оптимальной для культивирования клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-Р- 1а............................................79

2.2.6. Подбор параметров культивирования..........................................................................84

2.2.7. Оптимизация состава питательной среды для увеличения продуктивности клона-продуцента..................................................................................91

2.2.8. Оптимизация состава среды для улучшения состава гликозилированных форм ИФН-Р-1а..............................................................................98

2.2.9. Анализ ростовых характеристик, продуктивности и гликозилирования при культивировании биореакторах..............................108

2.2.10. Технологическая схема процесса и материальный баланс......................116

2.2.11. Экономическая эффективность процесса................................................................119

3. ОСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................................................122

4. ВЫВОДЫ........................................................................................................................................................131

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ..........................................................................................................................................132

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ

ВЫВОДОВ......................................................................................................................................................133

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ......................................................134

ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................................................................157

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CHAPS - 3-[(3-холамидопропил) диметиламмония]-1-пропансульфонат CMV, hCMV, mCMV - цитомегаловирус, человека, мыши DHFR - дигидрофолатредуктаза EF-1 а - фактор элонгации -1 а

IFNAR - трансмембранный рецептор интерферона-альфа IRF - интерферон-регулирующий фактор SDS - додецилсульфат натрия АК - аминокислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЛФ - готовая лекарственная форма ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК, кДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, кодирующая

ДТТ - дитиотреитол

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН-Р - интерферон-бета

КЖ - культуральная жидкость

мкАТ - моноклональные антитела

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК, дцРНК, мРНК - рибонуклеиновая кислота, двухцепочечная, матричная

PC - рассеянный склероз

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Получение белков медицинского назначения, произведенных по рекомбинантной технологии, является одной из наиболее перспективных и динамически развивающихся отраслей науки в современном мире. На настоящий момент на мировом рынке реализуется несколько сотен препаратов, полученных на основе рекомбинантных белков, еще около тысячи находится на стадии регистрации и начала производства после проведенных клинических исследований. Данные препараты успешно применяются для лечения онкологических, сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других тяжелых заболеваний человека, и объем их продаж занимает одно из ведущих мест в мире. Значительную часть производимых рекомбинантных препаратов представляют гликозилированные белки (цитокины, гормоны, антитела, факторы коагуляции и др.), получение которых осуществимо только в клетках млекопитающих (17, 145, 190).

Одним из широко используемых белков, получаемых по рекомбинантной технологии, является интерферон-бета (ИФН-ß). Данный биотехнологический препарат входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств, кроме оригинального препарата производится множество биоаналогов. ИФН-ß является эффективным средством борьбы с рассеянным склерозом (PC) - хроническим аутоиммунным заболеванием ЦНС, характеризующимся обширными повреждениями головного мозга. Эффективность ИФН-ß подтверждена в ходе многоцентровых клинических испытаний (54).

Коммерчески доступные рекомбинантные препараты ИФН-ß бывают двух типов: интерферон-бета-16 (ИФН-ß-16) - получаемый в бактериальных экспрессионных системах (Escherichia coli) и, являющийся негликозилированным (100) и интерферон-бета-1а (ИФН-ß-1а) -гликозилированный белок, продуцируемый эукариотическими клетками (СНО, яичники китайского хомячка) (130). По данным Антонетти и соавт.

(18), оба препарата обладают сходными свойствами, однако биологическая активность ИФН-Р-1а выше, что обусловлено его гликозилированием.

Для производства гликозилированных рекомбинантных белков в мире наиболее часто используют культуру клеток яичников китайского хомячка (СНО). К положительным особенностям клеток СНО можно отнести высокую скорость пролиферации, простоту культивирования и изученность, которые упрощают процесс контроля качества и регистрацию лекарственных препаратов (190). Суспензионное культивирование клеток СНО является современным способом организации процесса, оно позволяет достичь высоких клеточных плотностей и, соответственно, продуктивностей, а также не требует использования продуктов животного происхождения (17, 145, 190). По литературным данным, существующие продуценты рекомбинантного ИФН-Р-1а основаны на адгезионных линиях клеток СНО (153, 155, 156), однако, их применение в производстве не согласуется с требованиями регуляторных органов, предъявляемых к качеству лекарств.

Одним из ответственных моментов разработки технологии является выбор оптимальной системы экпрессии целевого рекомбинантного белка. Довольно часто при производстве рекомбинантных белков используется экспрессия под контролем конститутивных промоторов, как наиболее простой и изученный способ. Однако, для ИФН-Р, характеризующегося токсическим действием на клетки, данный вариант не является оптимальным.

ИФН-Р - сложный для производства белок, что, по мнению Ранкель и соавт. (155), обусловлено его высокой гидрофобностью и склонностью к агрегации. Несколькими коллективами авторов (153, 156) показано, что при гиперэкспрессии ИФН-Р в клетках млекопитающих он теряет нативную конформацию и образует агрегаты, преципитирующие на органеллах клеток. Вследствие этого необходим особый подход к разработке технологии культивирования, минимизирующий токсические эффекты, производимые ИФН-(3 на клетки. Для достижения этой цели оптимальным, на наш взгляд, является использование индуцируемого промотора гена ИФН-Р (136). Важным моментом в разработке технологии получения гидрофобных

рекомбинантных белков является подбор ряда параметров культивирования: температурного режима, различных добавок, влияющих на продукцию белка, моделирующих посттрансляционные модификации и повышающих его стабильность (83, 170).

Стоит отметить, что в настоящее время на российских биотехнологических производствах назревает необходимость разработки и внедрения новых процессов, основанных на современных технологиях культивирования. В данной работе описано несколько подходов к организации производства рекомбинантного ИФН-(3, включающих подбор оптимальных физико-химических параметров, состава питательной среды, стратегии введения подпиток и добавок, а также типа используемого биореактора для масштабирования процесса.

На данный момент на российском рынке, в основном, представлены препараты ИФН-(3, производимые зарубежными компаниями. В рамках стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2020 г. поставлена задача снижения импортозависимости российского рынка лекарственных средств. Поэтому разработка технологии производства отечественного препарата ИФН-[3 для лечения аутоиммунных заболеваний людей и животных является актуальной задачей для медицины и ветеринарии.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось создание клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а на основе клеток СНО, разработка технологии их суспензионного культивирования и её апробация в рамках общей технологии производства препарата ИФН-(3-1а.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание клонов-продуцентов ИФН-Р-1а на основе клеток яичников китайского хомячка СНО.

2. Отбор полученных клонов-продуцентов по ростовым характеристикам и продуктивности.

3. Разработка лабораторной технологии культивирования клона-продуцента рекомбинантного ИФН-(3-1а.

4. Оптимизация параметров и режимов культивирования, состава питательной среды для повышения продуктивности и качества целевого белка.

5. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов ИФН-(3-1а в биореакторах различного типа.

6. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости, определение его физико-химических свойств и противовирусной активности.

7. Проведение доклинических и клинических испытаний полученного препарата ИФН-|3-1а.

8. Разработка нормативной документации на производство субстанции рекомбинантного ИФН-(3-1а и препарата на её основе.

Научная новизна. Впервые создан продуцент рекомбинантного ИФН-(3-1а на основе системы индуцируемой экспрессии и клеток яичников китайского хомяка СНО, не имеющий аналогов на российских биотехнологических производствах. Впервые в России разработана и успешно апробирована технология получения рекомбинантного ИФН-(3-1а, основанная на суспензионном культивировании клеток СНО без использования белков животного происхождения.

Доказана эффективность введения в среду 10 мМ галактозы и 2 мМ уридина, являющихся субстратами реакций гликозилирования, с целью повышения содержания целевой гликозилированной формы рекомбинантного ИФН-|3-1а в культуральной жидкости клеток СНО.

Впервые проведено сравнительное исследование процессов культивирования продуцента рекомбинантного ИФН-|3-1а в биореакторах различного типа - стеклянном с механическим перемешивающим элементом и волновом на основе одноразовых мешков, по результатам которого показаны преимущества последнего для сохранения ростовых характеристик, продуктивности клона и гликозилирования ИФН-(3-1а при масштабировании.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты использованы в организации производства отечественного лекарственного препарата ИФН-(3-1а на площадке ООО «Фармапарк». Данные, полученные в

ходе проведенных исследований, включены в опытно-промышленный регламент по производству рекомбинантного ИФН-(3-1а. Разработана нормативная документация на производство субстанции (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению). Препарат ИФН-(3-1а, созданный с использованием разработанной технологии, успешно прошёл доклинические исследования, а также первую фазу клинических исследований. Результаты проведенной работы могут быть применены к процессам оптимизации биотехнологических процессов производства других генно-инженерных лекарственных препаратов.

Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты рекомбинантного ИФН-|3-1а созданы в ходе совместных исследований автора с группой учёных Биотехнологического исследовательского института (Монреаль, Канада). Автором обоснована возможность использования куматной экспрессионной системы для получения клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а человека, проведена работа по характеризации полученных клонов. Автором создан клеточный банк лучшего клона, проведена его паспортизация. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на секрецию и гликозилирование нарабатываемого белка, а также по масштабированию процесса. Эксперименты по очистке рекомбинантного ИФН-(3-1а и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк».

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VI международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, 2011), международной конференции «Биология -наука XXI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической

конференции «Биотехнология - перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура и диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 201 источник, из них 189 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 18 таблиц, 35 рисунков, 10 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Рекомбинантная технология на основе суспензионных клеток СНО и индуцируемой экспрессионной системы обеспечивает получение стабильных клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а за счет минимизации негативного влияния данного белка на клетки.

2. Максимальная продуктивность клеточной линии достигается при применении двухфазного температурного режима культивирования, использовании химически определенной бессывороточной питательной среды Power CHO-2CD и концентрации индуктора (кумата натрия) 1,5 мг/л.

3. Профиль изоформ рекомбинантного ИФН-(3-1а может быть приведен в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи путем внесения в питательную среду галактозы и уридина в концентрации 10 и 2 мМ, соответственно.

4. Основные характеристики разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО (продуктивность, гликозилирование и активность рекомбинантного ИФН-Р-1а) остаются стабильными при масштабировании процесса в волновом биореакторе на основе одноразовых мешков объемом 10 л.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Интерферон-бета - строение, свойства и применение

В ответ на проникновение патогенного организма клетки нашей иммунной системы, в частности, лейкоциты, начинают секретировать разнообразные цитокины. Цитокины характеризуются широким спектром действий, заключающихся в активации адаптативного и врожденного иммунитета и прямом воздействии на инфицированные клетки. Интерфероны (ИФН) являются природными цитокинами, которые вырабатываются клетками большинства позвоночных в ответ на проникновение вирусов, препятствуя их репликации и пролиферации (27, 94). Пестка и соавт. показали (147), что важнейшими функциями данных цитокинов является иммуномодулирующая и антипролиферативная.

Первичным сигналом к началу выработки клетками ИФН является двухцепочечная РНК (дцРНК). В норме здоровые клетки организма не содержат дцРНК, а ее появление может быть обусловлено репликацией вирусных частиц (27, 94). Точный механизм активации процессов биосинтеза И�