Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка эукариотического продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина и технологии его культивирования для целей биотехнологического производства

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Разработка эукариотического продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина и технологии его культивирования для целей биотехнологического производства"

На правах рукописи

НУРБАКОВ Альфред Анасович

Разработка эукариотического продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина и технологии его культивирования для целей биотехнологического производства

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

005539376

Москва-2013

005539376

Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Серёгин Юрий Александрович

Официальные оппоненты:

Мирзаев Микаиль Нурбагандович - доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», научно-исследовательский отдел, лаборатория иммунобиотехнологии, заведующий

Воронько Ольга Евгеньевна - кандидат биологических наук, ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» РАМН, лаборатория медицинской геномики, заведующая

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН»

Защита состоится « 13 » декабря 2013 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

Автореферат разослан «\ £ » _ 41 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Грязнева Татьяна Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Препараты на основе эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина широко используются в практике здравоохранения для лечения тяжельгх анемий при хронической почечной недостаточности, химиотерапии у онкологических больных и др. Широкое применение эритропоэтина и его аналогов связано с их стимулирующим действием на эритропоэз. Препараты на основе эритропоэтина выпускаются в виде готовых лекарственных форм (ГЛФ) - растворов для внутривенного и подкожного введения.

В России до настоящего момента не существовало технологии производства субстанции рекомбинатного дарбэпоэтина, поэтому ее разработка является актуальной задачей. Дарбэпоэтин - рекомбинантный белок, который производится клетками яичников китайского хомяка (СНО). Технология их промышленного культивирования заключается в следующем: суспензионная клеточная линия продуцента дарбэпоэтина культивируется в биореакторах разного типа в питательной среде специально разработанного состава с добавлением подпитки, восполняющей дефицит питательных веществ в процессе культивирования, что обеспечивает высокий выход и качество целевого белка.

В рамках данного исследования была разработана технология производства субстанции дарбэпоэтина. Продуцент целевого белка был создан на основе суспензионных клеток СНО, была разработана высокоэффективная схема его культивирования, а также были изучены биотехнологические аспекты повышения эффективности процесса.

Предложенная схема культивирования клонов-продуцентов на основе платформы СНО-Б использует новейшие компоненты питательных сред и позволяет применять ее для других продуктов и оптимизировать уже существующие технологии. При широком использовании клонов-продуцентов на основе суспензионных клеток СНО в современном биотехнологическом производстве разработка такого универсального способа культивирования весьма актуальна.

В последние годы существенно ужесточаются требования к лекарственным средствам на основе рекомбинантных белков. Они должны быть произведены по технологии, не использующей компонентов животного происхождения, органических растворителей, иммуноаффинных сорбентов, других токсичных и биологически активных веществ. Рекомбинантный продукт должен пройти полную характеризацию по ключевым физико-химическим и биологическим параметрам, список которых подготавливается отдельно для каждого белка в зависимости от его индивидуальных особенностей. Предлагаемая технология производства дарбэпоэтина является одной из первых в России, которая учитывает эти современные тенденции.

Таким образом, разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства дарбэпоэтина, соответствующего по параметрам качества и безопасности современным требованиям, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований -разработать и реализовать на практике технологию промышленного производства дарбэпоэтина, соответствующего современным требованиям качества и безопасности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создание клонов-продуцентов дарбэпоэтина на основе суспензионных клеток яичников китайского хомячка СНО; отбор полученных клонов-продуцентов по продуктивности и профилю гликозилирования.

2. Оптимизация состава питательной среды и добавок для повышения продуктивности и качества целевого белка.

3. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов дарбэпоэтина в биореакторах различного типа.

4. Исследование качества препарата дарбэпоэтина, полученного с использованием разработанной технологии, в том числе проведение доклинических испытаний.

5. Разработка технологической документации на производство субстанции рекомбинантного дарбэпоэтина и препарата на её основе.

Научная новизна. Впервые в России была разработана схема получения и культивирования клонов-продуцентов белка дарбэпоэтина.

При создании генетической конструкции использовался нестандартный подход, при котором рекомбинантная плазмида содержала две одинаковые копии гена дарбэпоэтина и участок связывания с ядерным матриксом S/MAR.

При разработке технологии особое внимание уделялось такому важному показателю эффективности препарата как соотношение гликозилированных форм дарбэпоэтина в целевом продукте. Поскольку биологическая активность дарбэпоэтина напрямую зависит от степени сиалирования его молекулы, целью оптимизации технологического процесса являлось повышение выхода высокосиалированных изоформ. Данная цель была достигнута с помощью периодического добавления в среду культивирования химически определённого компонента, состоящего из липидов, что является новым способом оптимизации гликозилирования.

Технология промышленного культивирования была разработана с учётом перспективных направлений современной биофармацевтики - с использованием биореактора волнового типа, создающего более комфортные условия для эукариотических клеток по сравнению с традиционными биореакторами перемешивающего типа, а также с применением одноразовых контейнеров для культивирования, что позволяет снизить риск контаминации, сократить время обслуживания биореактора и упростить валидацию процесса.

Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании данные расширяют возможности оптимизации биотехнологических процессов производства генно-инженерных лекарственных средств. Разработанная технология станет основой для производства субстанции дарбэпоэтина на технологической площадке ООО «Фармапарк». Разработанная технология использовалась для получения опытных серий препарата, которые успешно доклинические испытания.

Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты дарбэпоэтина созданы в ходе совместных исследований автора с сотрудниками департамента

экспериментального производства ООО «Фармапарк» Воробьёвой И.Г. и Шукуровым P.P., а также заведующим лабораторией эукариотических систем экспрессии генов ФГУП «ГосНИИгенетика» Козловым Д.Г. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на продуктивность и степень гликозилирования нарабатываемого белка. Автор осуществлял масштабирование процесса в биореакторах различного типа. Эксперименты по очистке дарбэпоэтина и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк» Кряжевских И.С., Орловой Н.В., Мосиной А.Г и Антоновой Л.П.

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на международной конференции «Биология — наука XXI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической конференции «Биотехнология - перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 143 источника, из них 136 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 12 таблиц, 21 рисунок, 5 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Использование суспензионной клеточной линии CHO-S и вектора с двумя генами дарбэпоэтина и участком S/MAR обеспечивает получение стабильных клонов, продуцирующих рекомбинантный дарбэпоэтин.

2. Наибольшая продуктивность клеточной линии достигается при использовании химически определенной бессывороточной питательной среды PowerCHO-2CD и подпитки PowerFeed A (Lonza).

3. Соотношение гликозилированных изоформ дарбэпоэтина может быть приведено в соответствие со спецификацией для препарата путем внесения в питательную среду химически определённого липидного компонента Lonza.

4. Основные характеристики разработанной технологии суспензионного культивирования клона-продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина (продуктивность, гликозилирование и активность дарбэпоэтина) остаются стабильными при масштабировании процесса на биореакторе волнового типа в одноразовых мешках объёмом 10 л.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка технологии была выполнена в 2011 - 2013 гг. в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов в Отделе медицинской биотехнологии.

Клоны-продуценты дарбэпоэтина были получены путём введения генетической конструкции, содержащей два синтетических гена дарбэпоэтина под контролем конститутивного промотора hCMV и участок S/MAR бета-интерферона в клетки суспензионной линии CHO-S (Invitrogen, США).

Трансфекция клеток CHO-S проводилась с использованием набора Freestyle MAX (Life Technologies). Клоны после трансфекции селектировали при помощи метода предельных разведений в присутствии антибиотика G418 (Life Technologies, 400 мг/л) в течение 28 суток с последующим измерением концентрации дарбэпоэтина с использованием ИФА-набора "Эритропоэтин-ИФА-Бэст" (Вектор-Бэст).

Культивирование осуществляли стационарно или при перемешивании со скоростью 120 об/мин во влажной среде с 5% содержанием С02 при температуре 37°С. Подсчет числа клеток и анализ их жизнеспособности осуществляли после окрашивания трипановым синим в камере Горяева. Для масштабирования культивирования использовали стеклянный биореактор с механическим перемешивающим элементом объемом 3 л Applikon BioBundle и

волновой биореактор на основе одноразовых мешков объёмом 10 л Applikon AppliFlex.

Выделение дарбэпоэтина из культуральной жидкости (КЖ) проводили в 3 стадии хроматографии с переводом в буфер готовой лекарственной формы. Определение концентрации проводили с помощью иммуноферментного анализа и аналитической обращенно-фазовой хроматографии. Соотношение изоформ дарбэпоэтина определяли методами изоэлектрического фокусирования и капиллярного электрофореза элюатов с аффинного сорбента, содержащего моноклональные антитела к рекомбинантному эритропоэтину. Биологическая активность in vivo изучалась на мышах линии Balb/c. В качестве стандарта использовался препарат-оригинатор Aranesp (Amgen, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Создание эукариотического продуцента дарбэпоэтина. На первом этапе разработки технологии с целью создания наиболее эффективной генетической конструкции были сконструированы 8 вариантов плазмид, несущих в своём составе ген дарбэпоэтина и различающихся между собой типом промотора и числом копий гена. Исходную клеточную линию CHO-S трансфецировали различными вариантами плазмид, инкубировали в 6-луночных планшетах в С02-инкубаторе при 37°С и анализировали концентрацию дарбэпоэтина в культуральной жидкости на 3-й день культивирования. Генетическая конструкция, содержащая двойной набор генов, каждый под контролем CMVenh/rEFl промотора, и две копии S/MAR элемента обеспечила максимальный уровень экспрессии дарбэпоэтина, и, соответственно, была выбрана для получения стабильных клонов-продуцентов.

Отбор клонов проводился последовательно в 96-луночных, 6-луночных планшетах и колбах объемом 125 мл. В колбах, кроме продуктивности, также определяли профиль гликозилирования, и предпочтение отдавали клонам с более высоким содержанием сиаловых кислот. В результате был отобран клон 28Х, обладающий лучшими ростовыми характеристиками, продуктивностью и гликозилированием. Удельная продуктивность клона 28Х составила 3,6 пг/клетку/день.

Оптимизация продуктивности клона-продуцента дарбэпоэтина.

Исследование ростовых характеристик клона 28х проводили в колбах в замкнутом объеме питательной среды (batch - режим). Динамика роста и продуктивности в таких условиях приведена на Рис. 1. Было показано, что максимальная клеточная плотность и продуктивность (70 мг/л) достигаются на 6-й день культивирования.

При анализе концентрации глюкозы в культуральной жидкости было показано, что она снижается до 0,6 г/л на 6 день культивирования, что является основной причиной гибели клеток.

—•— клеточная

9 плотность 50 £ рис ! Динамика

8 - "•--концентрация оп

дарбэпоэтинй/ 70 2 клеточной плотности и

продуктивности клона-продуцента дарбэпоэтина при культивировании

клеток в колбах в замкнутом объёме

ю

День культивирования

С целью повышения продуктивности выбранного клона было проведено сравнительное изучение влияния различных добавок, вносимых в процессе

о 1

чГ /Я л* <5- <

I Клеточная плотность, 0,1* млн/мл I Концентрации дарбэпоэтина, мг/л

- У Л»# . * .«v

Рис. 2. Влияние добавок, вносимых в питательную среду, на ростовые характеристики и продуктивность клона 28Х

культивирования, на максимальную клеточную плотность и концентрацию дарбэпоэтина (Рис. 2).

Добавки, среди которых были как индивидуальные вещества (глюкоза 5 г/л, аминокислоты 1 мМ) и их смеси, так и коммерческие подпитки от разных производителей, вносились в 6-луночные планшеты с культурой клона 28Х на О, 3 и 5 дни культивирования, а на 7 день измерялась концентрация дарбэпоэтина в среде. В результате было показано, что содержание глюкозы в среде является важнейшим фактором роста клеток, аминокислоты также обеспечивают некоторое улучшение характеристик культуры. Наиболее высокая клеточная плотность и концентрация дарбэпоэтина (увеличение в 2-3 раза по сравнению с контрольной культурой) наблюдались при внесении комплексных подпиток Efficient Feed А и В (Invitrogen ) и Xtreme Feed и PowerFeed А ( Lonza).

С целью определения оптимальной продолжительности цикла культивирования и выбора наиболее эффективной комплексной подпитки был проведён эксперимент, аналогичный предыдущему, в колбах объемом 125 мл. Исследовалось влияние периодического внесения комплексных подпиток на динамику клеточного роста и продуктивности при культивировании клона 28Х (Рис. 3). Подпитки добавлялись каждые 2 дня, длительность цикла А Б

С; 18 —контроль i —■—Eff.Feeci А

I 16 -

4 6

День культивирования

Рис. 3.

Динамика клеточной плотности

День культивирования

(А) и концентрации

дарбэпоэтина (Б) при культивировании клона-продуцента 28Х в колбах с

подпиткой

культивирования составила 11 дней, максимальная клеточная плотность и продуктивность были достигнуты с подпиткой PowerFeed А на 9 день культивирования.

В результате проведённых экспериментов в качестве подпитки была выбрана Power Feed A (Lonza,Швейцария). Для дальнейших экспериментов длительность цикла культивирования была ограничена 9 днями, поскольку дальнейшее продолжение процесса не приводило к увеличению концентрации целевого продукта, что, по-видимому, связано с его деградацией протеазами.

Оптимизация гликозилироваиия целевого продукта. Дарбэпоэтин является сильно гликозилирвоанным и сиалированным белком. Существует четкая взаимосвязь между количеством сиаловых кислот в молекуле дарбэпоэтина и его биологической активностью. Сиаловые кислоты экранируют остатки галактозы, благодаря чему снижается скорость его выведения через почки и увеличивается время выведения. Максимальное количество сиаловых кислот на молекулу дарбэпоэтина составляет 22, препарат-оригинатор Аранесп содержит изоформы №№ 17-22.

Стандарт

КЖ

Рис. 4. Сравнение состава изоформ дарбэпоэтина в КЖ и стандарта до оптимизации: А - методом изоэлектрического фокусирования, Б - методом капиллярного электрофореза аффинных элюатов (17-22 - порядковые номера высокогликозилированных изоформ).

Оценка содержания изоформ в полученном препарате дарбэпоэтина была проведена методами изоэлектрического фокусирования культуральной жидкости и капиллярного электрофореза элюатов после очистки белка на иммуноаффинном сорбенте (Рис. 4). Согласно данным капиллярного электрофореза в культуральной жидкости содержание изоформ 17-19 составило около 3% от общего количества изоформ дарбэпоэтина, а изоформы 20-22 полностью отсутствовали, что не позволяет получить из этой КЖ продукт должного качества.

С целью повышения содержания целевых изоформ 17-22 было изучено влияние различных добавок, которые выбирались согласно данным литературы о механизмах синтеза гликопротеинов: 10 мМ галактоза, 1 мМ уридин, 5 мМ 1М-ацетил-0-маннозамин, 1 мкМ МпС12, 5% смеси липидов (Lonza). Добавки вносились в среду на 0, 3 и 5 дни культивирования, на 9 день культивирования анализировали качество белкового продукта.

При сравнительном анализе доли высокосиалированных изоформ было А Б

Стандарт КЖ

Рис. 5. Сравнение состава изоформ дарбэпоэтина в КЖ и стандарта после оптимизации: А - методом изоэлектрического фокусирования, Б - методом капиллярного электрофореза аффинных элюатов (17-22 - порядковые номера высокогликозилированных изоформ)

показано, что наибольший эффект достигается при введении липидного компонента фирмы Ьопга. Согласно данным капиллярного электрофореза, содержание изоформ №№ 17-22 в культуральной жидкости достигло 19±4%. На рис. 5Б приведена электрофореграмма аффинного элюата в сравнении с препаратом Аранесп, на рис. 5А - результаты аналогичного анализа методом изоэлектрического фокусирования.

Таким образом, для увеличения выхода сиалированных изоформ в продукте был выбран липидный компонент Ьопга(Швейцария). В дальнейшем использовалась комбинированная подпитка РолуегРеес1 А с липидами, предлагаемая той же компанией и вносимая по такой же схеме, как и просто Ро\уегЕее<1 А.

Масштабирование технологии культивирования в биореакторе.

Масштабирование культивирования продуцента дарбэпоэтина проводилось в лабораторных биореакторах двух типов: с механической мешалкой (АррНкоп ВюВипсПе) и волнового типа на одноразовых мешках (АррНкоп АррНР1ех).

Принципиальные различия между ними обусловлены способом перемешивания среды культивирования и аэрации. Режим культивирования на волновом биореакторе является более щадящим по отношению к клеткам млекопитающих, так как отсутствует механическое воздействие со стороны лопастей мешалки и пузырьков газа, выходящего из барботёра.

Динамика роста и жизнеспособности клеток продуцента дарбэпоэтина в биореакторах перемешивающего и волнового типов приведены на Рис. 6. Во всех случаях использовалась среда Ро\уегСНО-2СО и подобранная ранее схема внесения подпитки Ро\уегРее<1 А с липидами.

Показано, что в биореакторе перемешивающего типа максимальная клеточная плотность не превышала 11 млн/мл, а в волновом биореакторе достигала 14 млн/мл. При этом в биореакторе перемешивающего типа жизнеспособность падала ниже 90% уже на 7-й день культивирования, в то время как в волновом биореакторе высокая жизнеспособность (больше 90%) сохраняется на протяжении всего цикла культивирования, кроме 12 дня.

На основании этих результатов для масштабирования процесса культивирования продуцента дарбэпоэтина был выбран биореактор волнового

типа на одноразовых мешках с рабочим объёмом 5 л. Поскольку в волновом биореакторе достигалась клеточная плотность несколько ниже, чем в колбах, были проведены дополнительные исследования параметров аэрации. В ходе экспериментов были подобраны оптимальные скорость качания платформы (20

А Б

120 100

80 --

60

/ 40

* 20

____ г 0

12 0 2 4 6 8 10 12

0 2 4 6 8 10

-♦-биореактор перемешивающего типа -♦-волновой биореактор

-»-волновой биореактор -•-биореактор перемешивающего типа

колба 125 мл -«-колба 125 мл

Рис. 6. Сравнение динамики роста клеточной линии 28Х (А) и её жизнеспособности (Б) при культивировании в биореакторах перемешивающего и волнового типов, а также колбах объемом 125 мл

Рис. 7. Динамика клеточного роста клеточной линии 28Х (А) и её продуктивности (Б) при культивировании в биореакторе волнового типа

до и после оптимизации аэрации

г а б s 10

—♦—до оптимизации аэрации -•-после оптимизации аэрации

2 л 6 з хо

-♦-до оптимизации аэрации -»-после оптимизации аэрации

раз/мин) и угол её наклона (12°) для того, чтобы обеспечить насыщение культуральной среды воздухом, достаточное для поддержания жизнедеятельности клеточной линии с плотностью до 20 млн/мл.

В результате оптимизации аэрации длительность цикла культивирования осталась на уровне 11 дней, при этом максимально достигнутая за цикл продукции клеточная плотность составила 16,4х106 клеток/мл, количество продуцируемого дарбэпоэтина - 176 мг/л, что на 33% выше, чем до оптимизации.

В проведенных экспериментах продуктивность процесса культивирования в одноразовых мешках была сопоставима с таковой для культивирования в колбах (166 мг/л). При этом объём культуральной жидкости возрастал на 2 порядка (5 л в мешке по сравнению с 30 мл в колбе). Исходя из вышесказанного, можно заключить, что культивирование новой линии клеток-продуцентов дарбэпоэтина хорошо поддаётся масштабированию в одноразовых мешках на качающейся платформе.

Параметры качества рекомбинантного дарбэпоэтина. С использованием разработанной технологии были получены 3 опытные серии рекомбинантного дарбэпоэтина, которые были проанализированы на идентичность, содержание изоформ и биологическую активность.

Идентичность определялась с помощью пептидного картирования и секвенирования К-концевой последовательности длиной 15 аминокислотных остатков. Была продемонстрирована полная идентичность полученной ГЛФ и препарата Аранесп по обоим показателям.

сравнении с препаратом Аранесп(Б).

С помощью капиллярного электрофореза (Рис. 8) было проанализировано содержание каждой из изоформ №17-22 в ГЛФ дарбэпоэтина в сравнении с препаратом Аранесп (таблица 2).

Таблица 2. Содержание изоформ в ГЛФ дарбэпоэтина, измеренное с помощью капиллярного электрофореза

изоформа содержание изоформы, %

спецификация ГЛФ Аранесп

17 0-5 0,27 2,96

18 1-17 4,92 8,90

19 10-34 22,64 23,55

20 30-42 37,74 30,53

21 11-38 29,46 26,02

22 0-10 4,96 8,04

Из таблицы 2 видно, что полученный дарбэпоэтин соответствует спецификации. Это соответствие подтверждается данными по его биологической активности in vivo (1,64 ± 0,14 МЕ/мг по сравнению с 1,59 МЕ/мг для препарата-оригинатора).

Таким образом, разработанная технология позволяет получать продукт, соответствующий спецификации для препарата дарбэпоэтина и обладающий сходной биологической активностью in vivo.

Полученный препарат успешно прошёл стадию доклинических исследований, показав сходные параметры эффективности и безопасности по сравнению с оригинатором.

Технологическая схема процесса культивирования клеток-продуцентов дарбэпоэтина 28Х. Технология культивирования включает в себя несколько основных этапов (рис. 9). Процесс культивирования начинается с размораживания пробирки рабочего банка клеток-продуцентов дарбэпоэтина. Клеточную массу подготавливают в колбах до количества, необходимого для засева биореактора, после чего вносят в одноразовый мешок биореактора волнового типа объемом 10 л в плотности 0,3 млн. клеток/мл. Культивируют

клетки с периодическим внесением подпиток по подобранной схеме. После окончания процесса культуральную жидкость двукратно центрифугируют (200 х g, 5 мин; 1000 х 10 мин) и отделяют супернатант, содержащий целевой белок. Супернатант передают на очистку хроматографическим методом с последующим приготовлением готовой лекарственной формы дарбэпоэтина.

Приготовление питательной среды 5 кг

Разморозка клеточной линии продуцента из рабочего банка

Внесение подпитки 1,25 кг

Культивирование в колбах

О

Культивирование в биореакторе волнового типа

Жизнеопоообносн, мтсс 80%, концешр

Передача К"Ж па стадию хромато графической очистки 5 кг

Рис. 9. Технологическая схема процесса культивирования продуцента дарбэпоэтина

выводы

1. Получен эукариотический клон-продуцент рекомбинантного дарбэпоэтина на основе суспензионных клеток СНО с удельной продуктивностью 3,6 пг/клетку/день.

2. Проведена оптимизация сред, состава и схемы внесения подпиток для культивирования продуцента дарбэпоэтина, позволившая достигнуть продуктивности 156 мг/л за счет увеличения продолжительности цикла культивирования с 6 до 11 дней.

3. Разработанная схема культивирования оптимизирована для повышения выхода целевых изоформ с помощью добавления липидной подпитки Ьопга.

4. Проведено масштабирование процесса культивирования до волнового биореактора объемом 10 л с сохранением продуктивности (176 мг/л против 166 мг/л в колбах).

5. Дарбэпоэтин, произведенный с использованием разработанной технологии культивирования, соответствует спецификации по ключевым параметрам качества: первичной структуре, содержанию высокосиалированных изоформ и биологической активности.

6. Препарат дарбэпоэтина успешно прошёл стадию доклинических исследований, показав сходные параметры эффективности и безопасности по сравнению с препаратом-оригинатором.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Клеточная культура-продуцент дарбэпоэтина была депонирована в ВКПМ (Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов) под номером Н-133 (дата депонирования -02.11.2012).

2. Данные, полученные в ходе исследований, включены в опытно-промышленный регламент на производство дарбэпоэтина субстанции раствора (№56882590-14-12)

3. Разработан проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию дарбэпоэтина.

4. Препарат дарбэпоэтина, созданный с применением разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО, успешно прошёл доклинические исследования.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Препарат, созданный на основе субстанции дарбэпоэтина, получаемой по разработанной технологии, является первым отечественным препаратом данного белка. Полученный препарат дарбэпоэтина не уступает по качеству оригинальному препарату, обладая при этом гораздо меньшей стоимостью, и рекомендуется для широкого применения в медицинской и ветеринарной практике.

2. Разработанная технология суспензионного культивирования отвечает всем современным требованиям качества, предъявляемым к биофармацевтическим препаратам на основе рекомбинантных белков. Данная технология рекомендуется к внедрению в серийное производство вместо технологий, основанных на адгезионном культивировании, как способствующая сокращению объема работ и трудозатрат.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Оптимизация технологии культивирования клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный дарбэпоэтин-альфа, в замкнутом объеме / A.A. Нурбаков, Н.В. Лобанова, И.Н. Савинова и др. // Биотехнология. - 2012. -№5.- С. 55-65.

2. Современные подходы к оптимизации процессов культивирования эукариотических клеток-продуцентов при производстве биофармацевтических препаратов / Н.В. Лобанова, A.A. Нурбаков, E.H. Сауткина и др. // Биотехнология. - 2013. - №1. - С. 8-25.

3. Влияние метилирования CpG-островков в составе генов, кодирующих эритропоэтин и его аналог, на уровень экспрессии в клетках СНО / Ю.А.Серегин, P.P. Шукуров, A.A. Нурбаков и др. // Естественные и технические науки. - 2013. - С. 98-102.

4. Оптимизация генетических конструкций для экспрессии дарбэпоэтина в клетках млекопитающих / P.P. Шукуров, Д. Г. Козлов, А.А. Нурбаков и др. // Биотехнология. - 2013. - №2. - С. 34-45.

5. Создание стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина-альфа на основе клеток СНО / P.P. Шукуров, Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков и др. // Биотехнология. - 2013. - №2. - С. 46-54.

6. Оптимизация профиля гликозилирования рекомбинантного интерферона-бета-1а при культивировании клеток СНО в биореакторе волнового типа / Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков, В.И. Аксенова и др. // Биотехнология. — 213. - №2. — С. 55-66

7. Hybrid promoters and codon optimization increase expression of recombinant darbepoetin in CHO cells / R. Shukurov, A. Nourbakov, K. Kazachenko et al. // Abstracts of the 15th European Congress on Biotechnology. - 2012. - New biotechnology. - Vol. 29. - N. 5. - P. S72.

8. Оптимизация технологии культивирования эукариотического продуцента рекомбинантного интерферона-бета-1а в одноразовом биореакторе / Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков, И.Н.Трусова // Международная конференция «Биология - наука XXI века». - 2012. - Материалы конференции. - С. 495.

9. Оптимизация условий культивирования клеток СНО как ключевой этап создания технологии производства рекомбинантных белков медицинского назначения / Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков, P.P. Шукуров и др. // II Международная научно-практическая конференция «Биотехнология -перспективы развития». - 2012. - Тезисы конференции. - С. 24-26.

Подписано в печать:

11.11.2013

Заказ № 9067 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru